CCM CPG HPLC

Chromatographie sur Couche Mince
3.Chromatographie sur couche mince
3.1.Définition
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes
d’adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le
long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de
matière plastique ou d’aluminium.
Après que l’échantillonait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une
vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.La figure2.1 représente les
principaux éléments d’une séparation CCM.
3.2. Appareillage
La cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre de forme variable ;

fermé par un couvercle étanche.
La phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre
adsorbant est fixé sur une plaque de verre ou une feuille de matière plastique ou
d’aluminium à l’aide d’un liant comme le sulfate de calcium hydraté, l’amidon ou polymère
organique.
L’échantillon : environ 1 l de solution diluée (2 à 5% de mélange à analyser) déposé en un
point repère au-dessus de la surface de l’éluant.
L’éluant : un solvant pur ou un mélange, il migre lentement le long de la plaque en
entrainant les composants de l’échantillon.
21
(a)
(b)
Couvercle
Cuve
Atmosphère saturée en
vapeur de solvant
(c)
Phase mobile
Fig.3.1 (a) Cuve chromatographique (b) Plaque CCM

(c)Schéma d’un montage CCM
3.3. Adsorbants
Les adsorbants employés en CCM sont : le gel de silice, l’alumine et la cellulose. Ils sont
utilisés dans une granulométrieplus grande en chromatographie sur colonne. La taille des
grains, leur surface spécifique, le volume des pores, leur diamètre et la répartition
granulométrique définissent les propriétés des matériaux utilisés. Pour la nano-CCM, la
taille des particules est de l’ordre de 4 m et celle des pores de 6 nm.
22
3.4.L’éluant
L’éluant peut être composé d’un solvant unique ou d’un mélange de solvants ; il ne doit pas
être ni trop polaire (entraînant les composants) ni trop apolaire (empêchant leur migration).
Les solvants sont caractérisés par leur différence de polarité et leur non miscibilité.
A l’aide d’une micropipette ou d’un tube capillaire, on dépose une goutte de chaque
solution sur une plaque, chacune séparée de l’autre d’environ 1 cm. L’éluant qui aura
entraîné le soluté à une distance proche de la moitié de la plaque sera considéré comme bon
éluant.
Deux facteurs interviennent lors de l’interaction entre l’éluant et le soluté.
La solubilité : on doit être en mesure de dissoudre le soluté dans l’éluant pour que
la migration se fasse.
La polarité de l’éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre
3.5. Dépôt de l’échantillon
De faible quantité de l’échantillon dissous dans un solvant volatil, qui n’est pas forcément
le même que l’éluant. On trace sur la plaque à 1 cm du bord inférieur un très fin trait au
crayon de papier qui servira à repérer les dépôts ; on veillera surtout à ne pas abîmer la
surface de la plaque. L’échantillon est déposé ensuite à l’aide de micropipette ou de tube
capillaire en un point sur le trait. Les produits non volatils sont aisément analysables ; les
composants de l’échantillon sont volatils : aldéhydes, cétones aliphatiques ou aromatiques,
acides monocarboxyliques, amines primaires ou secondaires ; nécessaire de les
chromatographies sous forme de sels.
3.6. Développement de la plaque
La plaque préparée est introduite en position verticale dans la cuve et l’éluant qui
enrecouvre le fond monte par capillarité, entraînant à des vitesses différentes les
23
constituants à séparer. Lorsque le niveau atteint par le solvant est d’environ 1 cm de

l’extrémité supérieure,la plaque est retirée de la cuve.
On peut utiliser une chromatographie bidimensionnelle dans le cas où le mélange
contient des solutés de polarités voisines : sur le même support, on réalise une première
chromatographie à l’aide d’un système de solvants, puis une deuxième à l’aide d’un second
système de solvants, dans une direction perpendiculaire à la première.
3.7.Révélation
Lorsque les composants de l’échantillon à analyser sont colorés, leur séparation est
facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire on doit rendre les taches visibles
par un procédé de révélation les taches sont ensuite cerclées au crayon. Les méthodes
usuelles de révélation sont les suivantes :
A l’œil nu : si le produit est coloré

Radiation UV : en exposant la plaque à une source de radiation UV, certains
composés apparaissent sous formes de tache brillantes.
Fluorescence: si un indicateur de fluorescence est incorporé à l’adsorbant ; la
plaque entière devient fluorescentelorsqu’elle est soumise à radiation UV. Les
composés sont révélés sous forme de tachessombres.
Iode : l’iode réagit avec un grand nombre de composé organique en formant des
complexes jaunes. La révélation est réalisée en mettant la plaque, préalablement
séchée en présence de quelque cristaux d’iode dans un récipient; fermé ensuite pour
saturé de vapeur.
Atomisation : elle consiste à pulvériser un réactif sur la plaque ; ce qui entraîne une
destruction ou une altération permanente des composés.
3.8. Paramètre de séparation
Chaque substance est caractérisée par sa mobilité appelée rapport frontal (Fig. 2.3).
Le rapport frontal ou rétention frontale (Rf)de chaque composé est défini par le rapport :
24
= y= 0 1
x : distance parcourue par le composé (mesure au centre de la tache)

y: distance parcourue par le front de solvant
Front de solvant
y
x
Ligne de dépôt
Fig.2.3. Plaque CCM : calcul du rapport frontal
Le Rfd’une substance est une constante et constitue une des caractéristiques physiques. On
peut donc se servir de cette valeur pour identifier une substance inconnue. Lorsque la
polarité de l’éluant augmente, le Rf augmente.
3.9. Efficacité d’une plaque CCM
L’efficacité N d’une plaque CCM et la hauteur H de plateau théorique pour un composé est
donné par les relations :
N = 16 etH =
La résolution est exprimée parla relation:R = 2
w est le diamètre de spot

Le facteur de rétention k’ d’un composé est relié aux distances de migration sur la plaque.
1
′= −1
25
Applications
La CCM présente plusieurs applications ; elle permet le contrôle aisé et rapide de la pureté
d’un composé organique, le suivi de la réaction chimique ou d’un fractionnement
chromatographique sur colonne et la recherche du meilleur solvant, avant d’entamer une
séparation sur colonne classique. Elle permet également la purification de petites quantités
de produit (jusqu’à 100 mg). La bande qui contient le produit purifié est grattée, puis la
silice est extraite avec un solvant.
Le succès de ce mode de chromatographie est dû notamment à la facilité de sa mise en
œuvre et à la possibilité de son emploi dans le domaine analytique que dans le domaine
préparatif.
Exercices
Exercice 3.1
Un échantillon contenant deux composés A et B est séparé par CCM. Au bout de 15 min de
développement, le front du solvant est à 8,3cm du départ, le composé A à 7,5cm et le
composé B à 2,3cm. Calculer le Rf des deux composés.
Exercice 3.2
On réalise la chromatographie de trois encres. Une encre noire, notée A, une encre verte,
notée B et une encre bleue, notée C. Le chromatogramme obtenu est donné ci-dessous.
1. En analysant le chromatogramme que pouvez-vous dire sur les encres testées?

2. Déterminer le rapport frontal de la tache correspondant à l'encre C.
26
A B C
Exercice 3.3
Un échantillon contient deux composés A et B séparé par CCM sur de la silice. Après
migration, la révélation conduit à deux taches. La migration du front de solvant dans cette
expérience est de 6 cm. Calculer :
a) Calculer Rf, N et H pour chacun des composés.
b) Calculer le facteur de résolution entre les deux composés A et B.
Sachant que : xA= 31 mm et wA= 1,5 mm
xB= 26 mm et wB= 2,2 mm
Exercice 3.4
On a réalisé la chromatographie de deux échantillons et d’une référence. L’exploitation du
chromatogramme a fourni les résultats suivants : - Front du solvant H= 8,0 cm - échantillon
A : deux taches situées à 3,0 cm et 4,0 cm de la ligne de base - échantillon B une tache
située à 5,0 cm de la ligne de base - référence le menthol M : Rf = 0,5
a) La chromatographie a-t-elle mis en évidence des espèces chimiques pures
b) Les échantillons A et B renferme-t-il du menthol ?
27
Chromatographie en Phase Gazeuse
Chapitre IV
Chromatographie en phase gazeuse
I.Définition
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique de séparation applicable

aux composés gazeux ou susceptible d’être volatilisés par élévation de température sans
décomposition (dont la masse moléculaire MM300) ; les constituants peuvent différer par
leur nature et leur volatilité.La séparation exige des quantités de l’ordre de mg seulement ;
parfois même de g.
On distingue selon la phase stationnaire:
Chromatographie de partage : La chromatographie gaz-liquide : la phase

stationnaire est un liquide immobilisé sur un support solide par imprégnation ou par
greffage.
Chromatographie d’adsorption : La chromatographie gaz-solide : la phase
stationnaire est un solide poreux, réservé à l’analyse de mélanges de gaz ou de
liquides à bas points d’ébullition.
II. Principe de la technique et appareillage
En CPG la phase mobile est un gaz, ce fluide traverse une colonne renfermant des granulés
poreux qui constitue la phase stationnaire. Lorsque un échantillon à analyser est injecté et
vaporisé ; ces constituants sont entrainés à des vitesses inégales par la phase mobile, à la
sortie de la colonne se trouve un détecteur relié à un enregistreur. L’appareillage employé
pour effectuer la séparation est un chromatographe dont la figure 1 présente
schématiquement les principaux éléments.
28
Micro
Injecteur Débitmètre
Diviseur de
flux Détecteur
(a)
Bonbonne
de gaz vecteur
Four
(b)
Fig.1 (a)et (b) schéma et photo d’un appareil de chromatographie gaz
29
II.1. Gaz vecteur
L’élution est assurée par un flux de gaz inerte appelé gaz vecteur ou porteur (phase
mobile).Le gaz vecteur doit être pur, inerte (il ne doit pas réagir avec les constituants du
mélange à séparer) et le moins miscible possible avec la phase stationnaire. L’hélium est le
gaz porteur le plus courant, bien que l’on utilise aussi l’argon, l’azote et l’hydrogène.Le
choix du gaz vecteur est conditionné par l'efficacité de la séparation et la sensibilité du
détecteur.
Catharomètre : N2, H2, He

Capture d’électron : N2ou H2
ionisation de flamme :N2
Il n’y a pas d’interaction entre le soluté et la phase mobile en CPG.
II.2. Injecteur
Le système d’injection permet l’introduction de l’échantillon dans le chromatographe, par

l’intermédiaire d’une micro-seringue dont la capacité varie habituellement de 1 à 10L. Le
système d'injection joue plusieurs rôles, que l'échantillon se trouve sous forme solide,
liquide ou gazeux:
Rôle d'interface qui permet d'introduire l'échantillon dans le chromatographe

Rôle de système de vaporisation (dans le cas d'un échantillon liquide ou solide)
Rôle d'organe de transfert dans la colonne chromatographique.
Il y’à plusieurs mode d’injections
1. Injection par vaporisation directe
L'introduction du mélange se fait par l'intermédiaire d'une microseringue dont le volume

varie généralement de 1 à 10L etdont l’aiguille a un diamètre de l’ordre de 0,15 mm à
travers un diaphragme, ou septum, en élastomère dans une chambre à vaporisation
instantanée située au sommet de la colonne. La chambre d’injection est habituellement
30
maintenue à environ 50°C au-dessus du point d’ébullition du constituant le moins volatil de

l’échantillon.Ce système est conçu pour les colonnes remplies.
2. Injection « split/splitless »
Les systèmes d’injection pour colonnes capillaires sont:
les diviseurs d’entrée ou splitter (split)

le splitless
Il s’agit d’injecteurs pouvant fonctionner suivant deux modes, avec ou sans division (encore
appelés split ou splitless).
En mode split, le gaz vecteur arrive avec un grand débit dans la chambre de vaporisation ;
une vanne de fuite sépare le courant gazeux en deux parties dont la plus petite est la seule à
pénétrer dans la colonne. Seulement 1% de l’échantillon injecté passe réellement sur la
colonne. L’autre partie (99%) s’échappe par un système de fuite. Ce mode est utilisé dans
le cas des colonnes capillaires à faible débit.
L’inconvénient de ce mode d’injection est l’évaporation sélective des composés les plus
volatils avec modification de la composition réelle de l’échantillon injecté.
Le mode splitlessla solution injectée est volatilisé puis entraîner dans les premières spires
de la colonne capillaire où elle se condense.L’injecteur est ensuite balayé par le gaz
vecteur qui élimine l’excès de solvant. Ce procédé est réservé aux échantillons très dilués.
II.3. Four
Le four est une enceinte thermostatée dans laquelle se trouve la colonne possédant un
système de ventillation. Au lieu de maintenir la température constante on peut l’astreindre à
suivre une loi de variation donnée, généralement linéaire, pour obtenir une chromatographie à
température programmée.
31
II.4. Colonne
On distingue trois types de colonnes.
a)Colonneremplie (à garnissage)
Existant depuis les débuts de la CPG, elles sont faites avec des tubes spiralés le plus souvent
en acier ou plus rarement en verre, de diamètre intérieur de 2 à 6 mm, ont une longueur
comprise entre 1 et 3 m et sont enroulées sous forme hélicoïdale. Elles sont remplies d'un
support poreux, inerte et stable à température élevée, imprégné de 5 à 20% de phase
stationnaire (Fig.3 et 4).
Le support le plus utilisé est la terre de diatomées (silicates fossiles).
Support poreux
Tube
Fig.3 Colonnes remplies
Fig.4Photo colonnes remplies a) Cuivre2m x 6,4 mm;

b) Aluminium 6m x1cm c) Verre 2m x 0,25d.e
32
b)Colonne capillaire
Les colonnes capillaires ont un diamètre interne variant entre 0,05 et 0,35 mm et une
longueur comprise entre 10 et 50 m enroulés on spirale. Elles sont revêtues d’une couche de
polymère ou d’un filmd’aluminium et sont enroulées sur un support métallique cylindrique
léger, en forme de cage. Il n'y a alors pas de remplissage: la phase stationnaire ou l'adsorbant
est déposée ou greffée sur la paroi interne de la colonne (sur la figure 5 on observe la phase
stationnaire déposée sur le métal). La faible quantité de phase stationnaire permet des
analyses rapides mais impose l'injection d'une quantité très faible d'échantillon1g.
Revêtement de polyimide
Silice fondu
Phase stationnaire
Fig.5 photo, schéma d’une colonne capillaire et microphotographie électronique à

balayage de son extrémité
c)Colonne semi-capillaire
Elles sont constituées d’un tube de silice de 0,53 mm de diamètre interne et ont une longueur
variant de 5 à 50 m. Elles remplacent, à l’heure actuelle, les colonnes à remplissage sur les
chromatographes anciens, tout en conservant les mêmes injecteurs et détecteurs. Elle supporte
l’injection d’une quantité plus grande d’échantillon qu’une colonne capillaire mais la
résolution est moins bonne (plus le diamètre d’une colonne est faible, meilleure est la
résolution). La colonne, enroulée sous forme hélicoïdale, est reliée à l'injecteur à l'une de ses
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extrémités et au détecteur à l'autre.
II.5. Phase stationnaire
Les phases stationnaires les plus courantes, classées par ordre de polarité croissante et leurs
noms commerciaux sont :
Phases apolaires100% méthyle silicone
CH3
Si O
CH3
n
SE-30 (30 à 350°C) n=15000-35000
OV-1 (100 à 350°C) n=40000-50000
OV-101 (0 à 350°C) n= 400
Le SE-30, l’OV-1 et OV-101, diméthyle siloxanes,se différencient par leur nombre de

groupement diméthylesilyle. L’OV-101 en possédant moins, a une température d’utilisation
la plus basse.
Méthyl-phényl ou compositions diverses
CH3
Si O
R
n
Avec R = phényl, vinyl, cyanopropyl, cyanoéthyl
SE-52, OV-73 respectivement 5% et 5% phényl
SE-54, OV-73 5% phényl, 1% vinyl
OV-1701 7% phényl, 7% cyanopropyl
Le pourcentage donne dans chaque cas la fraction de groupements méthyle remplacés par le
groupement indiqué sur le squelette polysiloxanes. Pour le SE-52 le 5%
34
polydiméthylphénylsiloxane a un cycle phényle lié à 5% des atomes de silicium du polymère.
Phases peu polaires
L’OV-7 et l’OV-17 méthylephényle silicone, sont de polarité moyenne
OV-7 20% phényl, 80% vinyl
OV-17 50% phényl, 50% vinyl
Phases polaires
Ce sont des dérivés de glycols, utilisés pour séparer les molécules de forte polarité
OV-275 (50 à 225°C), 100% cyanopropyl silicone
Les polyéthylènes glycols (Carbowax 20M)
H2 H2
HO C C O H
Polyethylène glycol
Exemple
Un mélange d’heptane, propanol-1 et pentanol sont élués dans cet ordre lorsqu’on utilise
une phase stationnaire polaire telle que le Carbowax. Cet ordre est inversé quand on utilise
une phase stationnaire non polaire telle que le polydiméthylsiloxane.
1. Phase stationnaire polaire
Substance Propanol-1 Pentanol Heptane

Point d’ébullition 97 137 98
Ordre de sortie 2 3 1
35
2. Phase stationnaire apolaire
Substance Propanol-1 Pentanol Heptane

Point d’ébullition 98 126 97
Ordre de sortie 2 1 3
II.6. Les systèmes de détecteurs
- Quelques définitions
Limite de détection (LD) :est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal bruit
au moins égal à 3.
Limite de quantification (LQ) : est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal
bruit au moins égal à 10.
Domaine de linéarité (LL) : domaine dans lequel la réponse du détecteur est directement
proportionnelle à la concentration.
Sensibilité : capacité d’un détecteur à répondre à de faibles variations de concentration ou

de masse.
- Caractéristiques d’un détecteur idéal
Bonne sensibilitéla sensibilité des détecteurs actuels sont comprises enter (10-8 et 10-15 g
soluté/s).
Bonne stabilité et reproductibilité.
Réponse linéaire sur plusieurs décades de concentrations.
Domaine de température de fonctionnement compris entre la température ambiante et

aumoins 400°C.
Une préservation de l’intégrité de l’échantillon
36
II.6.1 Détecteur à conductivité thermique (DCT) ou catharomètre
Le DCT est le détecteur le plus répandu aux débuts de la chromatographie en phase

gazeuse, c’est un appareil à réponse universelle, mais relativement peu sensible. Il est fondé
sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur emporté par le gaz vecteur pur et le
flux de chaleur emporté par le gaz vecteur chargé des molécules de soluté. Ces flux de
chaleurs sont produits par des thermistances, parcourues par un courant continu de tension
fixe, dans une enceinte thermostatée avec précision.Les thermistances sont montées en pont
de Wheastone et celui-ci permet de suivre l’évolution du courant en fonction de la variation
des résistances consécutive aux variations de température autour des filaments. Un
galvanomètre ou un potentiomètre enregistreur suivent le courant dans le pont. Le
catharomètre présente l'avantage de ne pas détruire les substances analysée. Mais son
principal inconvénient provient de sa faible sensibilité (de l’ordre du microgramme).
II.6.2.Détecteur à ionisation de flamme (DIF)
C'est le détecteur le plus utilisé en CPG, il est spécifique aux composés carbonés
saufHCHO et HCOOH.La phase mobile pénètre dans un petit brûleur dont la flamme est
alimentée par un mélange d’H2 et d’air. La combustion des composés organiques élués
produit des ionset des électrons qui sont collectés au moyen de deux électrodes. Le courant
très faible qui en résulte est transformé en une tension qui est enregistrée, le passage du
courant indique la présence d’un soluté.L’aire du pic obtenu est proportionnelle à la masse
et non à la concentration.L’avantage de ce détecteur est que les variations de débit de la
phase mobile ont peu d’influence sur la réponse et il présente l’inconvénient de détruire
l’échantillon au cours de l’étape de combustion.
II.6.3. La spectrométrie de masse
Le spectromètre de masse est un des détecteurs les plus puissants pour la chromatographie
gazeuse. On appelle GC-MS (Gaz Chromatography-Mass Spectroscopy) la combinaison de
la chromatographie gazeuse et de la spectrométrie de masse. Un spectromètre de masse
mesure le rapport masse sur charge (m/z) des ions qui ont été produits à partir de
l’échantillon par une source d’ionisation qui est assez énergétique pour briser des liaisons
37
chimiquesdans les molécules de l’échantillon et forme beaucoup de fragments ; qui sont

très utiles pour identifierl’espèce moléculaire qui entre dans le spectromètre de masse à
partie du spectre de fragmentation ou par comparaison avec bibliothèque de spectre (Fig.2).
Fig.2 Chromatogramme GC-MS d’un mélange contenant plusieurs produits
II.6.4. Autres détecteurs
Il existe d'autres types de détecteurs, comme le détecteur thermoioniquespécifique des

composés azotés et phosphorés, celui à capture d'électrons (DCE) particulièrement sensible
aux composés halogénés et celui à photométrie de flamme spécifique des composés
contenant du soufre et du phosphore (excitation des éléments par de la lumière à λ
caractéristiques ; détecteur qui émet respectivement à 526 nm pour P et 394 nm pour S).
II.7. Optimisation de séparation
Plusieurs facteursinfluence la séparation d’un mélange analysé par CPG:
II.7.1. La température
Généralement, les composés les plus volatils sont les plus rapidement entraînés ; du fait leur
tension de vapeur plus élevée. Cependant, si la température de la colonne est trop élevée,
38
l'équilibre des composants ne peut s'établir dans chaque phase et les pics apparaissent presque
tous en même temps. D’autre part, si la température est trop basse ; la vitesse est lente et la
diffusion importante et le temps de rétention devient trop long. Lorsque l'écart entre les points
d'ébullition des constituants du mélange à séparer est grand, il est souvent préférable
d'augmenter la température du four.
II.7.2. Le débit du gaz vecteur
Le débit du gaz vecteur doit laisser le temps pour que les constituants du mélange puissent
s'équilibrer entre les deux phases mobile et stationnaire. Si le débit est trop rapide, la
séparation des pics est médiocre et s’il est trop lent, les pics perdent leur finesse par suite
d'une diffusion excessive des molécules dans le gaz vecteur. La courbe de Van Deemter
établie expérimentalement pour chaque colonne et chaque composé permet de définir la
valeur optimale de la vitesse de la phase mobile : uopt= /
Quand le débit est bien réglé, on a intérêt à augmenter la température du four pour améliorer
la finesse des pics.
II.7.3 La longueur de la colonne
De façon générale, on accroît l'efficacité de la séparation en augmentant la longueur de la

colonne mais ceci se fait au détriment de la finesse des pics (toute augmentation se traduit par
un nombre de plateaux N supérieur). De plus, la longueur des colonnes est limitée par le fait
qu'une colonne trop longue exige une trop forte pression du gaz vecteur.
II.7.4. La nature de la phase stationnaire
Le liquide qui constitue la phase stationnaire est, selon les cas, un hydrocarbure ramifié tel
que le squalane de polarité nulle, un polyalkylsiloxane peu polaire, un polyéther polaire ou un
polyester très polaire.La dissymétrie des pics ou les temps de rétention trop élevés sont le
reflet de phénomènes d’adsorption ou d’affinité trop importante des composés vis-à-vis la
phase stationnaire.
39
II.7.5. Précaution générale
l’échantillon à analyser doit toujours avoir subi un traitement initial (minimum) de

purification : élimination de l’eau et des particules en suspension.
la nature de la phase stationnairequi se trouve dans le four doit être contrôlée. Ne
jamais utiliser la colonne en dehors des limites de températures indiquées par le
fabricant
la seringue doit être rincée plusieurs fois avec l’échantillon avant l’injection
l’aiguille au moment de son introduction à travers le septum de l’injecteurde ne pas
être courber
le septum doit être changé régulièrement (toutes les 50 injections environ)
le mélange doit être injectédès que l’aiguille se trouve enfoncée.
40
Chromatographie Liquide Haute Performance
Chapitre V
1. La chromatographie liquide haute performance
5.1. Introduction
La chromatographie liquide haute performance appelé CLHP est une technique

instrumentale qui permet de séparer les composants d’un mélange non volatile,
thermosensible, de polarité élevée afin de les identifier et les quantifier. Elle met en œuvre,
selon la nature de la phase stationnaire, des phénomènes de partage, d’adsorption,
d’échange d’ions ou d’exclusion. Son développement très rapide, à partir de 1970, réside
dans le fait qu’elle n’a pas les inconvénients de la chromatographie liquide classique ; cette
dernière a toujours été peu utilisée, en raison de la lenteur de la séparation ; de l’absence de
détecteur qui aurait permis de suivre facilement le développement de chromatogramme et la
quantité considérable d’échantillon nécessaire.
5.2. Appareillage
Un appareil CLHP (Fig.1.1) comporte différents modules: un réservoir contenant la phase

mobile, un système de pompage, un injecteur, une colonne, un détecteur à travers lesquels
un liquide entraîne les substances d’un mélange à séparer et un système d’acquisition de
données. Il nécessite également un dispositif de dégazage. Les différents modules sont
reliés par des canalisations courtes et de très faible diamètre interne (0,1 mm).
41
Réservoirs de solvant Phase mobile
Dégazeur
Isocratique ou
Système de pompage
gradient d’élution
Injecteur Passeur automatique
Phase stationnaire
Colonne
Thermostat
Détecteurs Micro- Traitement de

ordinateur donnée
Collecteur de fraction
Fig.5.1Les composants d’un chromatographe liquide à haute performance
(AppareilDionex)
5.3. Réservoir de solvants
Pour l’éluant on emploi un vase clos pour éviter l’évaporation. Le solvant utilisé doit
nécessairement :
a) Maintenir la stabilité de la colonne
b) Etre compatible avec le détecteur
c) Solubiliser suffisamment l’échantillon et ne pas gêner sa récupération.
Il est recommandé de toujours employer des solvants traité spécifiquement pour CLHP. Ils
doivent être dégazé et filtré avant usage sur filtre spécial (0,45 m). Le choix du solvant
constitue habituellement la partie la plus difficile de ce type de chromatographie. Il est
préférable de faire quelques essaies en CCM.
42
5.4. Dispositif de dégazage
Durant le pompage, dans la chambre de mélange ou dans la colonne elle-même, si les

solvants ne sont pas dégazés, l’air dissout dans le liquidesoumis à de forte pression, forme
des bulles à l’intérieur du système, c’est là un inconvénient majeur pour le fonctionnement
de la plupart des détecteurs en particulier ceux qui utilisent des propriétés optiques. En
règle générale, plus le liquide est polaire, plus la tendance de l’air à se dissoudre est forte. Il
convient donc d’éliminer au maximum l’azote et l’oxygène qui peuvent être présents.Le
dégazage de la phase mobile se fait par barbotage d’hélium, par ultrasons ou par un
dégazeur.
5.5. Pompe
La pompe d’un chromatographe a pour rôle d’assurer l’écoulement de la phase mobile dans
la colonne. Tout appareil CLHP comporte au moins une pompe en mode isocratique (éluant
de composition fixe tout au long de l’analyse donc la phase mobile peut être préalablement
préparée et disposée dans un seul réservoir) ou en gradient d’élution (éluant de composition
variable).L’élution gradué lors de la séparation de mélanges complexes permet, en
modifiant la composition de l’éluant, d’optimiser les facteurs de capacité et de réduire les
temps d’analyse.Les pompes les plus utilisées sont les pompes de types piston avec
lesquelles les débits sont constants, la pression peut atteindre environ 500 bars.
(a)
Phase mobile Pompe Injecteur
Phase mobile A PompeA

(b)
Chambre de mélange Injecteur
Phase mobile B PompeB
Fig.5.2Représentation schématique d’un système de pompage
(a) mode isocratique(b) mode gradient d’élution

43
5.6. Injecteur
L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne doit se faire à l’aide une
vanne (boucle d’échantillonnage) : on introduit d’abord l’échantillon dans une boucle de
volume connu (position chargement ou Load)après rotation de la vanne de 60° d’un levier
qui permet d’inverser le sens de circulation dans la boucle (position Inject), la phase mobile
entraîne l’échantillon en tête de la colonnele volume injecté est constant, cela permet donc
de travailler en étalonnage externe pour une analyse quantitative.Le volume prélevé avec la
seringue est donc toujours largement supérieur à celui de la boucle. Aujourd’hui on utilise
des injecteurs automatiques.
Phase mobile Phase mobile
2 6 2 1
1 Vers la colonne 6 Vers la colonne
31 15 1 1 1
1 4
3
451
1 1 1
Effluent 1 1
Injection
Boucle
Boucle
(a)(b)
Fig.5.3Injecteur à boucle
(a) Remplissage de la boucle (b) Injection dans la boucle
44
5.7. Colonne
Les colonnes CLHP sont généralement courtes et droites en acier inoxydable se caractérise
par leur géométrie (diamètre intérieur de 4 mm et une longueur de 5 à 30 cm) et par la
nature des phases qu’elles contiennent (Figure 1.4). Elles doivent capables de résister aux
fortes pressions. Le débit de la phase mobile ne peut dépasser quelques mL/min. Ces
colonnes ont l’avantage de la rapidité de l’analyse, consomment moins de solvant et
conduisent à une meilleure résolution de l’analyse. Dans la plupart des analyses une pré-
colonne ou colonne de garde qui ne diffère de la colonne analytique que par sa très faible
longueur (1 à 2 cmpour une colonne de 25 cm) permet de protéger la colonne et d’en
augmenter la durée de fonctionnement.
Fig.5.4Colonne CLHP
5.7.1Les thermostats des colonnes
La plupart des appareils commerciaux récents sont équipés de dispositifs de régulations de

la température ; qui la contrôle de la température ambiante jusqu’à 150°C (Fig.1.5). On
obtient souvent de meilleurs chromatogrammes en maintenant la température constante à
quelquesdixièmes de degrés Celsius.
45
Fig.1.5Colonne dans un thermostat
5.8. Détecteurs
5.8.1. Photomètre UV-Visible
Le détecteur UV-Visible mesure l’absorption de la lumière par le produit à la sortie de la

colonne et opère à longueur d’onde constante, celle-ci ayant été fixée par l’operateur. Pour
que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que:
Le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d’onde accessible à
l’appareil, et que son coefficient d’absorption soit suffisamment grand
La phase mobile n’absorbe pas la lumière à la longueur d’onde choisie par
l’opérateur.
Ce détecteur détecte seulement les changements dans le soluté donc on peut l’utiliser dans
l’analyse par gradient d’élution. Le détecteur est facile à opérer et ne détériore pas
l’échantillon. Il y’a plusieurs types de détecteurs :
Détecteur à fixe : vapeur de Hg (254 nm)
Détecteur à  variable
Détecteur à barrettes de diodes (DAD) : la cellule de mesure est éclairée par une
source polychromatique ; gamme de 190 à 800 nm permettant l’enregistrement
tridimensionnel absorbance-temps-longueurs d’onde. Ce type de détecteur permet
de sélectionner la longueur d’onde optimale de détecteur pour chaque soluté.
46
5.8.2 Réfractomètre différentiel
Il mesure la variation de l’indice de réfraction entre la phase mobile contenant le soluté et la

phase mobile pure correspondant à la référence.La sensibilité optimale correspond à un
maximum d’écart entre les indices de réfraction des composants de l’échantillon et de la
phase mobile. Un composant dont l’indice est voisin de celui de la phase mobile est alors
pratiquement indétectable. Son utilisation est moins répondue que celle du détecteur à UV
à cause de sa plus faible sensibilité.
5.8.3Détecteur fluorimétrique
Il mesure l’énergie de fluorescence d’un soluté excité par une radiation ultraviolette.
L’émission de lumière est mesurée à angle droit du faisceau d’excitation. Ce procédé sert
pour les composés fluorescents ou les dérivés fluorescents de certains composés. Ce mode
dedétection est plus sélectif et plus sensible de tous les détecteurs optiques à condition que
les composés présentent une fluorescence, qu’elle soit naturelle ou obtenue par formation
de dérivés.
5.8.4 Détecteur électrochimique
Cette méthode de détection ne s’adresse qu’à la détection de molécule douée de propriétés

oxydoréduction. Son principe repose sur la mesure du courant qui circule dans une cellule
d’électrolyse lors de l’oxydation ou de la réduction du soluté contenu dans la phase mobile.
Sur ce principe, on peut utiliser deux méthodes de mesures :
a) Soit effectuer une électrolyse partielle à potentiel fixe sur une fraction constante de
soluté et mesurer l’intensité du courant (détecteurs ampérométriques).
b) Soit réaliser l’électrolyse totale du soluté lors de son passage dans la cellule et
mesurer la quantité de courant (détecteurs coulométriques).
47
Les échantillons à détecter doivent pouvoir s’oxyder ou se réduire à un potentiel

suffisamment faible pour ne pas provoquer l’électrolyse de la phase mobile, d’autre part la
phase mobile ne doit contenir ni O2 en solution, ni contaminant métallique, ni halogénures
qui donneraient un courant résiduel et donc un bruit de fond et une dérive de la ligne de
base.
5.8.5 Détecteur par spectroscopie de masse
La chromatographie liquide couplée à la spectroscopie de masse (LC-MS) est une

technique d’analyse qui permet d’identifier clairement un composé grâce à son rapport
masse molaire/charge (m/z).
5.9. Interactions moléculaire entre phase mobile et soluté
Les interactions soluté-phase mobile correspond essentiellementà l’établissement

d’interactions diélectriques, de liaisons de type hydrogène ou de Van der Waals.
5.10. Force éluant et polarité
La polarité d’un échantillon et d’un solvant est la tendance de ces deux composés à
interagir fortement par polarité. Les composés polaires interagissent très fortement les uns
avec les autres. Pour les composés polaires :
Plus la phase mobile sera polaire, plus elle va entraîner les solutés
Plus la phase mobile sera apolaire, moins elle va entraîner les solutés
Pour les composés moins polaires :

Plus la phase mobile sera polaire, moins elle va entraîner les solutés
Applications
La CLHP est utilisée pour séparer et doser des espèces diverses d’analytes: inorganiques,
organiques et biologiques
48
49

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Chromatographie sur Couche Mince

3.Chromatographie sur couche mince

La cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre de forme variable ;

Fig.3.1 (a) Cuve chromatographique (b) Plaque CCM

3.5. Dépôt de l’échantillon

3.6. Développement de la plaque

constituants à séparer. Lorsque le niveau atteint par le solvant est d’environ 1 cm de

A l’œil nu : si le produit est coloré

3.8. Paramètre de séparation

x : distance parcourue par le composé (mesure au centre de la tache)

Fig.2.3. Plaque CCM : calcul du rapport frontal

3.9. Efficacité d’une plaque CCM

La résolution est exprimée parla relation:R = 2

w est le diamètre de spot

1. En analysant le chromatogramme que pouvez-vous dire sur les encres testées?

a) La chromatographie a-t-elle mis en évidence des espèces chimiques pures

b) Les échantillons A et B renferme-t-il du menthol ?

Chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique de séparation applicable

On distingue selon la phase stationnaire:

Chromatographie de partage : La chromatographie gaz-liquide : la phase

II. Principe de la technique et appareillage

Fig.1 (a)et (b) schéma et photo d’un appareil de chromatographie gaz

II.1. Gaz vecteur

Catharomètre : N2, H2, He

Il n’y a pas d’interaction entre le soluté et la phase mobile en CPG.

Le système d’injection permet l’introduction de l’échantillon dans le chromatographe, par

Rôle d'interface qui permet d'introduire l'échantillon dans le chromatographe

Il y’à plusieurs mode d’injections

1. Injection par vaporisation directe

L'introduction du mélange se fait par l'intermédiaire d'une microseringue dont le volume

maintenue à environ 50°C au-dessus du point d’ébullition du constituant le moins volatil de

Les systèmes d’injection pour colonnes capillaires sont:

les diviseurs d’entrée ou splitter (split)

On distingue trois types de colonnes.

Fig.3 Colonnes remplies

Fig.4Photo colonnes remplies a) Cuivre2m x 6,4 mm;

Fig.5 photo, schéma d’une colonne capillaire et microphotographie électronique à

extrémités et au détecteur à l'autre.

II.5. Phase stationnaire

Phases apolaires100% méthyle silicone

SE-30 (30 à 350°C) n=15000-35000

OV-1 (100 à 350°C) n=40000-50000

OV-101 (0 à 350°C) n= 400

Le SE-30, l’OV-1 et OV-101, diméthyle siloxanes,se différencient par leur nombre de

Méthyl-phényl ou compositions diverses

Avec R = phényl, vinyl, cyanopropyl, cyanoéthyl

SE-52, OV-73 respectivement 5% et 5% phényl

SE-54, OV-73 5% phényl, 1% vinyl

OV-1701 7% phényl, 7% cyanopropyl

polydiméthylphénylsiloxane a un cycle phényle lié à 5% des atomes de silicium du polymère.

Phases peu polaires

L’OV-7 et l’OV-17 méthylephényle silicone, sont de polarité moyenne

OV-7 20% phényl, 80% vinyl

OV-17 50% phényl, 50% vinyl

Les polyéthylènes glycols (Carbowax 20M)

1. Phase stationnaire polaire

Substance Propanol-1 Pentanol Heptane

2. Phase stationnaire apolaire