2012 Pean 2982 DD

Effets des polluants organiques persistants sur le
comportement des poissons

Samuel Péan
To cite this version:

Samuel Péan. Effets des polluants organiques persistants sur le comportement des poissons. Sciences
agricoles. Université de La Rochelle, 2012. Français. �NNT : 2012LAROS359�. �tel-00818410�
HAL Id: tel-00818410

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UNIVERSITÉ DE LA ROCHELLE
Effets des polluants organiques persistants

sur le comportement des poissons
ÉCOLE DOCTORALE Gay LUSSAC

LABORATOIRE IFREMER – Ressources Halieutiques de La Rochelle
THÈSE présentée par :

Samuel PÉAN
Soutenue le : 13 mars 2012
Pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université de La Rochelle
Discipline : Biologie de l’Environnement, des Populations, Écologie
JURY :
Agnès BARDONNET Directrice de recherche, INRA, Rapporteur

Magalie BAUDRIMONT Professeur, Université Bordeaux I, Rapporteur
Marie-Laure BÉGOUT Cadre de recherche, IFREMER, Directrice de thèse
Xavier COUSIN Chargé de recherche, INRA, Responsable scientifique
Véronique LOIZEAU Cadre de recherche, IFREMER
Pierre MIRAMAND Professeur, Université de La Rochelle
Illustrations couverture & inter-chapitres :
Bastien PÉAN
www.bastienpean.com
UNIVERSITÉ DE LA ROCHELLE
Effets des polluants organiques persistants

sur le comportement des poissons
ÉCOLE DOCTORALE Gay LUSSAC

LABORATOIRE IFREMER – Ressources Halieutiques de La Rochelle
THÈSE présentée par :

Samuel PÉAN
soutenance prévue le : 13 mars 2012
pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université de La Rochelle
Discipline : Biologie de l’Environnement, des Populations, Écologie
JURY :
Agnès BARDONNET Directrice de recherche, INRA, Rapporteur

Magalie BAUDRIMONT Professeur, Université Bordeaux I, Rapporteur
Marie-Laure BÉGOUT Cadre de recherche, IFREMER, Directrice de thèse
Xavier COUSIN Chargé de recherche, INRA, Responsable scientifique
Véronique LOIZEAU Cadre de recherche, IFREMER
Pierre MIRAMAND Professeur, Université de La Rochelle
石の上にも三年
Avant-propos
Cette thèse a été co-financée par l’Ifremer et la région Poitou-Charente (2008-2011).
Elle s’intègre dans deux projets nationaux qui ont assuré son soutien financier :
ANR VMC SoleBEMOL
Le programme SoleBEMOL (Sole Bioaccumulation Écotoxicologie MOdeLisation) a

pour principal objectif d’étudier chez des juvéniles de sole le devenir et les effets biolo-
giques des contaminants chimiques de l’individu à la population.
Le premier objectif est d’étudier la bioaccumulation et la biotransformation de trois
familles de contaminants organiques (PCB, HAP et PBDE) chez la sole provenant de trois
zones de nourricerie (Seine, Vilaine, et Pertuis). Les niveaux et profils de contamination
seront comparés à ceux du sédiment et confrontés aux indices biologiques de la sole. Les
effets spécifiques d’une substance sont très difficiles à dissocier dans le milieu naturel. La
description et la compréhension des processus responsables du devenir des contaminants
nécessitent que la phase d’acquisition des données in situ soit complétée par une approche
expérimentale en milieu contrôlé.
Le deuxième objectif est donc de mettre en oeuvre une stratégie expérimentale afin
d’étudier les mécanismes d’accumulation, de biotransformation et de toxicité de ces conta-
minants. Les effets de l’exposition seront appréhendés en terme de génotoxicité et au
niveau physiologique. Le dernier objectif est de proposer un modèle sur le devenir des
contaminants dans les soles qui prenne en compte leurs effets. Un modèle de type DEB
sera développé en intégrant un volet contaminant (DEB-Tox).
Enfin, ce travail se fixe également pour objectif de quantifier la dépendance des popu-
lations de poissons qui exploitent des nourriceries côtières et estuariennes à ces habitats
et à leur qualité, c’est-à-dire d’analyser le lien entre ces milieux essentiels à leur cycle de
vie, les perturbations subies par les juvéniles sur ces habitats et les capacités de renouvel-
lement des populations.
C’est dans le cadre du deuxième objectif qu’interviennent mes travaux de thèse.
EC2O Citrix CNRS INSU Génération POP
Le programme Génération POP consiste quant à lui à exposer dans un premier temps
des embryons de poissons zèbre à des HAP par sédiment contact afin de caractériser les
effets immédiats (embryotoxicité et développement précoces). Dans un second temps, des
poissons zèbre adultes seront contaminés par voie alimentaire à des PCB afin d’identifier
d’éventuels effets sur la physiologie, la croissance, la reproduction, la génotoxicité, la
tumorigenèse mais aussi le comportement. Le programme Génération POP prévoit aussi
d’identifier les effets transgénérationnels.
Mes travaux de thèse portent à la fois sur l’étude des poissons contaminés par voie
orale et la mesure d’éventuels effets transgénérationnels.
i
ii
Remerciements
Comme tout travail de recherche, ces trois années de thèse n’auraient pas été possibles
sans la contribution de certaines personnes, que je tenais à remercier.
Mes premiers remerciements vont à Marie-Laure Bégout et Xavier Cousin, qui m’ont
encadré pendant mon stage de M2 et ces trois ans de thèse. Merci de m’avoir fait confiance
et de m’avoir donné les moyens d’aborder cette problématique de thèse selon ma propre
personnalité. Merci de m’avoir permis de rencontrer différents chercheurs au gré de dif-
férents congrès. Merci enfin pour m’avoir laissé jeter un œil sur d’autres problématiques,
cela m’a permis d’en apprendre d’autant plus sur mon propre sujet et pourra m’être bien
utile pour la suite...
Je tiens aussi à remercier les membres du jury pour avoir accepté d’évaluer mon travail :
Agnès Bardonnet, Magalie Baudrimont, les rapporteurs de cette thèse, Véronique Loizeau
et Pierre Miramand, ainsi que les membres de mes deux comités de thèse : Alain Ghysen,
Paco Bustamante, Christel Lefrançois, Patrick Prunet et Violaine Colson, qui m’ont tous
ensemble permis de progresser.
Au sein du laboratoire Ifremer de L’Houmeau, je tiens à remercier Philippe-Jacques
Hatt et Jean Prou, chefs de Station successifs, ainsi que Gérard Biais, Responsable de
l’Unité Halieutique Gascogne Sud et du Laboratoire Ressources Halieutiques, pour m’avoir
accueilli.
Je remercie aussi Didier Leguay, Michel Prineau, Laura Lyphout et Lilian Ducci, nos
super techniciens de choc qui ont assuré le maintien des structures d’élevage et/ou la
réalisation des bacs/salles d’expérimentation.
Un grand merci à Marie-Élise Schwartz et Tarek Daouk, les « colocs » de labo sans
qui ces trois ans de thèse n’auraient pas eu la même saveur (en tout cas pas celle du
poulet-patates au chocolat !).
Un grand merci à David Benhaïm, pour avoir grandement enrichi ma culture scienti-
fique et pour les grandes sessions débats sur les variables Ethovision. Merci aussi pour
tous tes conseils et ton soutien !
Mille mercis à Christel Lefrançois, pour m’avoir donner goût à la recherche (et à la
Méditerranée !) lors de mon stage de M1. Merci pour m’avoir conseillé pendant ces trois
années de thèse, au-delà des comités de thèse.
Merci à Marcella Cannas, pour ces moments « sole » inoubliables !
Merci à Véronique Loizeau et Anne-Marie Le Guellec du Laboratoire Ifremer de Brest,
pour nous avoir fourni en granulés contaminés en toute circonstance, et pour avoir assurer
l’analyse chimique de nos petits poissons.
iii
Merci à mes stagiaires, qui ont réussi à supporter le rythme, qui ont mis les mains dans
le poisson et qui se sont abimés les yeux tout autant que moi sur les vidéos : Anne-Lise
Mayeras, Mathieu Besson et Pierre Poitevin.
Pour l’ambiance générale et l’aide ponctuelle, merci aux "nouvelles recrues" : Claire
Rocancourt (surtout pour tes envois de liens), Julie Lucas, Prescilla Perrichon et Sébastien
Ferrari. Merci aussi à Pauline Cajeri, Cécile Curti, Fabien Aubert (Sarthe libre !).
Merci à tous les anonymes qui postent des conseils sur leurs blogs ou les forum, que
ce soit pour le logiciel ImageJ (qui m’a permis de me mettre VRAIMENT à l’analyse
d’image) ou le logiciel LATEX (qui m’a permis de rédiger ce manuscrit sans souci !). Merci
aussi aux internautes qui ont pris la peine de me contacter depuis mon site internet et avec
qui j’ai pu échanger des techniques et des conseils !
Merci à mes parents, mon frère (fais chauffer le pad, j’arrive !), ainsi que tout le reste de
ma famille, pour leur soutien à toute épreuve et pour avoir accepté mes (trop) nombreuses
absences. Merci d’avoir soutenu mes choix et d’avoir supporter mon stress pendant ces
dernières années.
iv
Table des matières
Introduction générale 1
1 L’éthologie : la science du comportement 3

1.1 Qu’est-ce que le comportement ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 La naissance de l’éthologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3 L’étude du comportement par l’analyse vidéo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2 Comprendre la pollution 12
2.4 Qu’est-ce que la pollution ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.5 Les disciplines de la toxicologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.5.1 La toxicologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.5.2 Minamata : un exemple concret des limites de la connaissance . . . . . . . . . . . 14
2.5.3 De la toxicologie à l’écotoxicologie : un changement progressif . . . . . . . . . . 16
3 Les PCB 19
3.6 Description et historique de production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.7 Règlementations relatives aux PCB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.8 Les PCB dans l’environnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.8.1 Généralités sur la biodisponibilité, la bioaccumulation et la bioamplification . . . . 22
3.8.2 Le suivi des PCB dans l’environnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.9 Influence des PCB sur la physiologie et le comportement des poissons . . . . . . . . . . . 27
3.9.1 Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.9.2 Effets des PCB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4 Présentation de la thèse 32
4.10 Description et intérêt éthologique des espèces étudiées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.10.1 La sole commune Solea solea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.10.2 Le poisson zèbre Danio rerio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.11 Objectifs de la thèse et présentation du manuscrit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Partie I Présentation de la méthodologie et des outils mis en place 43
Chapitre 1 Le video tracking 45
1.1 Les outils existants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
1.2 Présentation de la solution retenue : Ethovision XT® (Noldus, The Netherlands) . . . . . . 50
1.2.1 Les options de base . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
1.2.2 L’utilisation des zones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
1.2.3 Le choix de la méthode de détection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
1.3 Le calcul des variables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
1.4 Les avantages et limitations du video tracking et leurs prises en compte dans les méthodes
d’analyse retenues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
1.4.1 Avantages et limitations du video tracking automatique . . . . . . . . . . . . . . . 54
1.4.2 Les méthodes choisies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
1.5 Mise en place du matériel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
1.6 Mise en place du protocole de challenge lumineux pour les larves de poisson zèbre . . . . 65
1.6.1 Bref état de l’art . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
1.6.2 Matériel mis en place . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
1.6.3 Mise en place du protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
1.6.4 Conclusion et description du protocole retenu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Chapitre 2 Présentation du logiciel ODRec (Observational Data Recorder) et du plugin Heatmap

From Stack pour le logiciel ImageJ 73
2.1 ODRec : logiciel gratuit et open source de codage de séquences comportementales . . . . 75
2.1.1 Description du programme ODRec . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
2.1.2 Utilisation du logiciel ODRec . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
2.1.3 Illustration des données obtenues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
2.2 HeatMap From Stack : plugin pour le logiciel ImageJ servant à l’analyse de la répartition
spatiale en groupe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
2.2.1 Principe de fonctionnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
2.2.2 Pré-requis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
2.2.3 Lancement du plugin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
2.2.4 Résultats obtenus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Chapitre 3 Electronic individual identification of zebrafish using RFID tags 85

3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.2.1 Fish and tag insertion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.2.2 Feeding regime and Growth monitoring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3.2.3 Spawning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.2.4 Behavior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.2.5 Statistical tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.3 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.3.1 Evaluation of tagging procedure success . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.3.2 Growth rate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3.3.3 Spawning characteristics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
3.3.4 Swimming behavior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
vi
Partie II Effets des PCB sur le comportement des poissons 103
Chapitre 4 Effets des PCB sur le comportement de la sole commune, Solea solea 105
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
4.2 Matériel et méthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.2.1 Matériel biologique et contamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.2.2 Acquisition des données . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
4.3 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
4.3.1 Phase de contamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
4.3.2 Phase de décontamination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
4.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
4.5 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Chapitre 5 Long-term food-exposure to PCB mixtures induces behavioural disruptions in zebra-

fish 135
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
5.2 Materials and methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
5.2.1 Rearing conditions and PCB exposure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
5.2.2 Behavioural experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
5.2.3 Data recording and analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
5.2.4 Measured variables and statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
5.3 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
5.3.1 Background colour preference . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
5.3.2 T-maze exploration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
5.3.3 24-h swimming activity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
5.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
5.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
Chapitre 6 Zebrafish as a model of hyperactivity transmission to offspring after parental PCB

exposure 155
6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
6.1.1 Rearing conditions and PCB exposure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
6.1.2 Behavioural experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
6.1.3 Data recording and analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
6.1.4 Measured variables and statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
6.2 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
6.2.1 Sudden dark challenge in larvae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
6.2.2 24-h swimming activity – horizontal movements . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
6.2.3 24-h swimming activity – vertical movements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
6.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
6.4 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
vii
Discussion générale 177
Références bibliographiques 189
Annexes 213
Annexe A Figure originale Slobodkin et Rapoport (1974) 215
Annexe B Poster International Flatfish Symposium 2011 216
Annexe C Fiche technique Nonatec 217
Annexe D Système de couleur Munsell 218
Annexe E Détail des dosages chimiques de PCB dans les muscles de soles après 30 et 60 jours de
contamination 219
Annexe F Publications et actes de congrès 220
viii
Liste des figures
1 Les différentes relations comportementales qui peuvent lier un individu aux individus de
son espèce, d’autres espèces ou à son environnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2 Représentation schématique des quatre questions de Tinbergen et des relations entre elles . 8
3 Représentation des mouvements ondulatoires des nageoires de la raie obtenue par chrono-
photographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
4 Chronologie (non-exhaustive) des publications sur les avancées de l’analyse vidéo dans le
domaine de l’éthologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
5 Devenir des substances toxiques dans l’organisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
6 Mère japonaise donnant le bain à son fils, victime de la pollution au mercure de la ville de
Minamata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
7 Composantes et enjeux de l’écotoxicologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
8 Représentation schématique du champ d’étude des différentes disciplines appliquées à la
toxicologie en fonction du niveau de complexité du vivant et du temps . . . . . . . . . . . 18
9 Structure chimique des polychlorobyphényles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
10 Toxicité relative des dioxines, furanes et PCB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
11 Principaux types de pyramides des concentrations selon la valeur du facteur de transfert (Ft ) 23
12 Bioamplification des PCB : l’exemple des les Grands Lacs canadiens . . . . . . . . . . . . 24
13 Estimation de la distribution globale des PCB dans l’atmosphère . . . . . . . . . . . . . . 24
14 Concentrations médianes de la somme de 13 congénères de PCBs mesurées dans des billes
de plastique du littoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
15 Cartographie du CB-153 sur le littoral français entre 2003 et 2007 . . . . . . . . . . . . . 26
16 Représentation schématique et simplifiée des réponses à une perturbation environnementale 28
17 Photo de la sole commune, Solea solea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
18 Répartition mondiale de la sole commune Solea solea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
19 Cycle de vie de la sole commune, Solea solea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
20 Photo du poisson zèbre, Danio rerio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
21 Répartition géographique du poisson zèbre Danio rerio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
22 Cycle de vie du poisson zèbre, Danio rerio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
23 Illustration du traitement d’image par soustraction statique pour ne laisser que les objets à
détecter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
24 Illustration de l’interprétation de déplacements en 3D dans le plan bidimensionnel d’une
caméra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
25 Les trajectoires possibles des poissons et les erreurs d’interprétations fréquentes des logi-
ciels de video tracking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
26 Exemple d’échange d’identités entre deux poissons par le module Social interaction du
logiciel Ethovision utilisé sans marque externe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
27 Illustration d’un cas théorique d’erreur de la variation inter-individuelle de la distance par-
courue due à une inversion d’identité des individus suivis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
28 Dispositif mis en place par Beeuwkes et al. (2008) pour analyser la trajectoire d’un individu
en trois dimensions et commercialisé sous le nom de Track3D (Spitzen et al., 2008) . . . . 60
29 Dispositif mis en place par Delcourt et al. (2011) pour analyser la trajectoire de quatre
individus simultanément en trois dimensions à l’aide de marques de couleur . . . . . . . . 61
30 Représentation schématique du dispositif expérimental d’acquisition vidéo . . . . . . . . . 63
31 Fonctionnement du filtre Visible block / IR pass . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
32 Distance parcourue pendant 5 minutes dans le noir (infra-rouge) en fonction de l’heure de
la journée, MacPhail et al. (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
33 Distance parcourue pendant 10 minutes pendant une série d’extinctions et d’allumage d’éclai-
rage par phases de 10 min, MacPhail et al. (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
34 Photo de la boîte à lumière mise en place pour l’analyse du comportement locomoteur des
larves de poisson zèbre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
35 Locomotion moyenne de larves de poissons zèbres (5 dpf) avant, pendant et après une série
d’alternances de phases de 5 min d’obscurité (infra-rouge) et de lumière . . . . . . . . . . 68
36 Locomotion moyenne de larves de poissons zèbres (5 dpf) avant, pendant et après une pé-
riode de 5 min d’obscurité (infra-rouge) et de lumière . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
37 Aperçu de l’interface du logiciel ODRec . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
38 Graphique et tableau obtenus après traitement d’une vidéo avec le logiciel ODRec . . . . . 80
39 Aperçu des deux fenêtres successives de l’interface du plugin pour ImageJ Heatmap From
Stack . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
40 Aperçu des résultats obtenus par le plugin pour ImageJ Heatmap From Stack . . . . . . . . 84
41 Photo d’un poisson zèbre et d’une marque NONATEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
®
91
42 Suivi de la survie des poissons zèbres marqués et du succès du marquage au cours du temps 95
43 Suivi de la croissance de poissons zèbres non marqués et marqués au cours du temps . . . 97
44 Activité de nage de poissons zèbres marqués et non marqués lors d’un challeng en T-maze 99
45 Montage expérimental pour la mesure de l’activité de nage pendant 23 h . . . . . . . . . . 114
46 Détail de l’expérience d’homochromie pour les 26 premiers jours de décontamination des
soles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
47 Données biométriques des soles pendant les 60 j de contamination aux PCB . . . . . . . . 119
48 Dosages chimiques dans les muscles de sole après 30 et 60 j de contamination aux PCB . . 120
49 Valeurs de champ chromatique des soles pendant les 60 j de contamination aux PCB obte-
nues à partir d’une gamme de Munsell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
50 Distance parcourue pendant 23 h par les soles après 30 et 60 j de contamination alimentaire
aux PCB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
51 Pourcentages de soles enfouies après 30 j de contamination aux PCB . . . . . . . . . . . . 125
52 Temps de mobilité (pour les soles non enfouies et enfouies), d’enfouissement et de latence
avant enfouissement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
53 Valeurs de Munsell de soles soumises à des environnements clairs ou sombres après 60 j de
contamination aux PCB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
54 Résultats obtenus après une première expérience de contamination sur 30 j . . . . . . . . . 132
x
55 Schéma du T-maze utilisé pour mesurer les capacités exploratoire des poissons zèbres . . . 143
56 Test de préférence de couleur de fond en fonction du régime de contamination . . . . . . . 146
57 Activité de nage mesurée dans la zone peu profonde durant le test de T-maze . . . . . . . . 147
58 Activité de nage mesurée dans la zone profonde durant le test de T-maze . . . . . . . . . . 148
59 Variables locomotrices mesurées pendant le test d’activité pendant 24h . . . . . . . . . . . 149
60 Activité de nage de larves issues de géniteurs contaminés lors d’un challenge lumineux . . 165
61 Distance travelled according to period of the day during the 24-h swimming activity test . 167
62 Répartition verticale pendant le test de nage de 24 h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
63 Nombre de passages entre les sections verticales pendant le test de nage de 24 h . . . . . . 169
64 Temps passé dans le fond du bac pendant le test de nage de 24 h . . . . . . . . . . . . . . 170
65 Représentation schématique et simplifiée des événements suivant une perturbation environ-
nementale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
66 Poster présenté au congrès International Flatfish Symposium en 2011 . . . . . . . . . . . 216
67 Fiche technique de micro-tags RFID de la marque Nonatec utilisés pour le marquage indi-
viduel des poissons zèbre et des soles communes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
68 Système de couleur Munsell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218
69 Détail des dosages chimiques de PCB dans les muscles de soles après 30 et 60 j de conta-
mination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219
xi
xii
Liste des tableaux
1 Comparaison des principales solutions logicielles de video tracking automatiques existantes 49

2 Nombre et croissance des poissons zèbres non marqués et marqués selon leur sexe . . . . . 95
3 Nombre de poissons zèbres marqués et leur croissance selon leur sexe et leur poids initial . 98
4 Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données biométriques des soles conta-
minées aux PCB pendant 60 j . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
5 Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données chimique des soles contami-
nées aux PCB pendant 30 et 60 j . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6 Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des valeurs des champs chromatiques des
soles contaminées au PCB pendant 60 j . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
7 Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données d’activité de nage pendant
23 h des soles contaminées aux PCB pendant 30 puis 60 j . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
8 Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données du challenge d’enfouisse-
ment pendant 30 s sur des soles contaminées au PCB pendant 30 j . . . . . . . . . . . . . 125
9 Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données du test d’homochromie pen-
dant 26 j sur des soles après une contamination aux PCB pendant 67 j . . . . . . . . . . . 128
10 Taux de succès et latéralité du test T-maze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
11 Results of the comparison between treatments (Solvent, PCB-medium and PCB-high) using
Kruskal-Wallis test within period and between treatments for the 24-h swimming activity -
vertical movements. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
Introduction générale
Les travaux de thèse rapportés dans ce manuscrit portent sur les effets des PCB sur le
comportement des poissons en se basant sur l’étude de deux espèces : l’une marine, la
sole commune (Solea solea), l’autre d’eau douce, le poisson zèbre (Danio rerio).
Ces travaux de thèse font appel à différentes notions, que ce soit en rapport avec l’étude
du comportement, des polluants ou des espèces utilisés pendant ces travaux, qui peuvent
trouver des définitions différentes en fonction des auteurs considérés. Cette introduction
générale permettra donc de redéfinir ces notions dans le cadre de cette étude puis de mettre
en relation les principaux concepts de l’éthologie avec ceux de l’écotoxicologie afin de
mettre en avant le potentiel de l’étude des effets des polluants par l’analyse comportemen-
tale.
1 L’éthologie : la science du comportement
1.1 Qu’est-ce que le comportement ?

L’observation du comportement animal est une démarche naturaliste très ancienne.
Mais si l’observation reste quelque chose de simple, définir ce qu’est ou n’est pas un
comportement, ce qui le constitue et qui (ou quoi) peut être à même de se comporter, peut
s’avérer être un exercice assez difficile. En effet, de nombreuses définitions existent sans
que les auteurs ne parviennent à s’entendre sur une définition unique (Levitis et al., 2009).
À l’inverse, de nombreux ouvrages entrent directement dans les techniques d’analyse du
comportement sans même en donner la définition. Certaines d’entre elles sont néanmoins
intéressantes :
Par « comportement » j’entends tous les mouvements produits par un

animal dans son entier.
Tinbergen (1951)
Le comportement est ce que fait un animal.
Lehner (1979)
Le comportement implique des interactions entre la machinerie d’un

animal, ses os, ses muscles, son système nerveux, etc. et son milieu ex-
terne tels que la nourriture, ses ennemis et son milieu social.
Hall et Halliday (1998)
3
Samuel PÉAN – Effets des polluants organiques persistants sur le comportement des poissons.
B.F. Skinner et D.O. Hebb [...] ont défini le comportement comme étant :
tous les procédés observables par lesquels un animal répond à un chan-
gement de perception de son état interne ou de son milieu externe.
Barnard (2004)
Les comportements sont les actions et réactions d’une personne ou d’un

animal en réponse à une stimulation interne ou externe.
Gong et Xiang (2011)
Les définitions de Tinbergen (1951) et Barnard (2004) décrivent toutes deux le compor-
tement comme étant observable et excluent donc toutes les formes de communication in-
visible, comme par exemple les communications acoustiques ou chimiques. De plus dans
ces cinq définitions, l’individu est à la fois l’échelle minimale et maximale : le compor-
tement d’un groupe de plusieurs individus est donc lui aussi exclu, alors qu’il est admis
que le déplacement synchronisé de poissons en banc ou d’oiseaux en volée puisse être
considéré comme unité d’analyse (Allman, 2009).
Alors que les comportementalistes ont pour habitude de mettre des mots sur des ac-
tions, le terme « comportement » semble quant à lui faire partie des choses que l’on re-
connait quand on le voit mais qu’il nous est difficile de définir. Levitis et al. (2009) ont
tenté de prendre le problème à l’envers en intégrant l’ensemble des sujets étudiés par les
comportementalistes pour en faire une définition plus intégrative :
Le comportement est : l’ensemble des réponses coordonnées en interne

(action ou inaction) d’organismes vivants (individus ou groupes) aux
stimulations internes et/ou externes, excluant les réponses plus facile-
ment comprises comme des changements liés au développement.
Levitis et al. (2009)
Un comportement est donc une interaction d’êtres vivants entre eux ou leur milieu
(Fig. 1). Il peut apparaître, changer, ou être inhibé suite à un changement d’état phy-
siologique, un changement dans l’environnement ou à cause d’une nouvelle interaction
sociale. Puisque le comportement est une action, son occurrence peut être perçue (par au
moins un des sens) quand il se produit (Miltenberger, 2006). Les comportementalistes
ont pour objectif de pouvoir à la fois décrire et mesurer les comportements, mais aussi
de pouvoir les expliquer et les prévoir. En effet, un grand nombre de réactions comporte-
mentales sont à la fois répétables et prévisibles (Bell et al., 2009). Depuis les premières
observations des naturalistes sur le comportement animal, il a été établi qu’un compor-
tement était initialement composé de mouvements musculaires formant des successions
d’actions complexes pouvant être classées dans des unités reconnaissables à plusieurs
4
Individus d’autres espècess
Communication, prédation,
Environnement
territorialité
Communication, prédation,
territorialité
Recherche de nourriture, Reproduction, dominance,
exploration territorialité
Individu
IIndi id
du
d
Recherche de nourriture,
exploration, migration Individus de la même espèce
(population)
Figure 1 – Les différentes relations comportementales qui peuvent lier un in-

dividu aux individus de son espèce, d’autres espèces ou à son environnement.
reprises, et donc mesurables (Barnard, 2004). Ce sont les unités comportementales qui
sont généralement enregistrées lors d’une étude. Ceci permet à la fois de comptabiliser et
de distinguer les comportements :
– interrompus : seules les premières unités comportementales sont réalisées ;
– mal réalisés : absence ou répétitions anormales d’unités ou de groupes d’unités ;
– bien réalisés : bon nombre d’unités réalisées dans le bon ordre.
D’une manière générale, une succession d’unités comportementales est appelée une
séquence comportementale, qu’il s’agisse de l’accomplissement d’une partie d’un com-
portement, d’un comportement en entier ou de plusieurs comportements successifs.
Ainsi, une unité comportementale peut avoir une ou plusieurs dimensions mesurables,
qui sont sa fréquence, sa durée et son intensité (Lehner, 1979; Miltenberger, 2006).
1.2 La naissance de l’éthologie
D’une manière générale, l’éthologie est le nom donné à l’étude du comportement.

L’origine du mot est grec, et vient de l’association du terme ἦθος (ethos) qui signifie « ca-
ractère », « état d’âme », « disposition psychique » et λόγος (logos) qui signifie « raison »,
5
« science ». Passer de la simple observation des animaux dans leur milieu à l’explication
de l’origine et de l’évolution d’un comportement a demandé un certain nombre d’étapes et
l’établissement de règles et concepts. La première de ces étapes importantes s’est déroulée
entre le xviie et le xviiie siècle : durant cette période, se sont affrontés les aristotéliciens,
les cartésiens et les sensationnalistes au sujet des origines du comportement (Richards,
1979). Selon les aristotéliciens, le comportement était un instinct fonction de l’âme de
l’animal, que le Créateur leur avait insufflé pour préserver l’individu et sa progéniture.
Descartes, quant à lui, refusait l’idée que les animaux avaient une âme et que leurs actions
pouvaient résulter d’une quelconque cognition primitive. Selon lui, les animaux n’étaient
que des machines, réalisant des actions qui venaient telles quelles, sans aucune forme de
réflexion. Les aristotéliciens et les cartésiens pensaient que les animaux n’avaient aucune
forme de raison ou d’intelligence, et qu’ils étaient seulement dirigés par l’instinct (Ri-
chards, 1979). Les sensationnalistes ont quant à eux développé un courant de pensée basé
sur l’établissement des comportements par l’apprentissage au cours de la vie de l’individu.
Dans la continuité de ce dernier mouvement de pensée, Lamarck (1809) a été l’un des
premiers à vouloir expliquer l’agissement des animaux qu’il observait.
Or, les besoins des animaux qui possèdent un système nerveux, étant,
pour chacun, selon l’organisation de ces corps vivants :
1. de prendre telle sorte de nourriture ;
2. de se livrer à la fécondation sexuelle que sollicitent en eux cer-
taines sensations ;
3. de fuir la douleur ;
4. de chercher le plaisir ou le bien-être.
Ils contractent, pour satisfaire à ces besoins, diverses sortes d’habi-
tudes, qui se transforment, en eux, en autant de penchants, auxquels
ils ne peuvent résister, et qu’ils ne peuvent changer eux-mêmes. De
là, l’origine de leurs actions habituelles, et de leurs inclinations par-
ticulières, auxquelles on a donné le nom d’instinct. Ce penchant des
animaux à la conservation des habitudes et au renouvellement des ac-
tions qui en proviennent, étant une fois acquis, se propage ensuite dans
les individus, par la voie de la reproduction ou de la génération, qui
conserve l’organisation et la disposition des parties dans leur état ob-
tenu ; en sorte que ce même penchant existe déjà dans les nouveaux
individus, avant même qu’ils l’aient exercé. C’est ainsi que les mêmes
habitudes et le même instinct se perpétuent de générations en généra-
tions, dans les différentes espèces ou races d’animaux, sans offrir de
variation notable, tant qu’il ne survient pas de mutation dans les cir-
constances essentielles à la manière de vivre.
Lamarck (1809)
6
Le terme « éthologie » , dans le sens de « l’étude du comportement animal dans l’en-

vironnement naturel », est utilisé pour la première fois par le Français Geoffroy Saint-
Hilaire (1859) pour désigner les descriptions des moœurs des animaux telles qu’elles ont
été faites par Aristote, Buffon, Réaumur, G. Leroy ou Lamarck.
C’est à l’éthologie [...] qu’appartient l’étude des relations des êtres or-
ganisés dans la famille et la société, dans l’agrégat et la communauté.
Geoffroy Saint-Hilaire (1859)
Par la suite, la personne qui a grandement contribué à l’évolution de cette discipline

est Darwin. En effet, ce-dernier est considéré comme étant l’un des premiers comporte-
mentalistes modernes, d’une part par ses travaux d’observations lors de son voyage aux
îles Galápagos et d’autre part par son ouvrage « The Expression of the Emotions in Man
and Animals ». Plus que de simples observations, Darwin a su associer les notions de
comportement et de sélection naturelle, en introduisant le concept de sélection sexuelle
que l’on retrouve entre autre dans les mécanismes de spéciation.
Outre-Atlantique, c’est l’article de Wheeler de 1902 qui popularise le terme « etho-
logy » dans les pays anglophones.
En 1963, Tinbergen redéfinit l’éthologie comme étant « l’étude biologique du com-
portement » et propose une méthodologie s’articulant autours de quatre questions :
– quelles sont les causes immédiates du comportement ?
– quelle est sa valeur de survie ?
– comment s’est-il mis en place au cours de l’ontogenèse ?
– comment s’est-il mis en place au cours de la phylogenèse ?
Ces quatre questions sont à la fois une adaptation des trois questions majeures de la bio-
logie proposées par Huxley et des « quatre causes » d’Aristote. Cet article de Tinber-
gen a permis l’émergence d’une nouvelle discipline, l’écologie comportementale, qui se
différencie maintenant de l’éthologie cognitive en s’intéressant plus particulièrement au
comportement animal tel qu’on peut l’observer en milieu naturel ou en conditions expéri-
mentales maîtrisant la variation de certains facteurs environnementaux et qui est souvent
interprétée de manière évolutionniste (Fig. 2). En effet, l’expression d’un comportement
peut s’adapter voire évoluer, être inhibée ou disparaître, en fonction des facteurs environ-
nementaux. Ces changements ne se font pas aléatoirement : plus les coûts (en énergie et
en prise de risques) sont faibles et les bénéfices élevés, plus la valeur de survie du com-
portement est grande, au sens où elle optimise les chances de se reproduire. L’écologie
comportementale cherche donc à savoir dans quelle mesure les comportements liés à la
survie et à la reproduction dépendent de l’environnement.
7
Individu Population
Environnement
Adaptation
développemental
Mécanismes
Mécanismes
Valeur de
proximaux
Ontogénèse Gènes
survie
distaux
Cause Comportement Phylogénèse
Environnement Environnement
immédiat ancestral
Figure 2 – Représentation schématique des quatre questions de Tinbergen et

des relations entre elles. Modifiée de : Wikimedia Commons – Crédits W Pete
Welch.
Le caractère observable rend l’approche éthologique particulièrement intéressante. Daw-

kins (2007) rappelle que l’étude du comportement est non-invasive (car elle n’implique
pas d’altérer la peau) mais aussi potentiellement non-intrusive (car elle peut ne pas
perturber l’animal). Ceci permet aux études éthologiques d’être facilement combinées
à d’autres disciplines comme la physiologie.
D’un point de vue méthodologique, l’étude du comportement animal va nécessiter de

déterminer a priori le nombre d’individus à suivre, la période de temps d’observation,
la liste des unités comportementales à analyser et les variables descriptives adéquates à
enregistrer, ainsi qu’éventuellement le système de codage associé (Altmann, 1974). L’ob-
servation directe nécessite une méthodologie très précise et une grande rigueur mais ne
permet pas systématiquement de pouvoir enregistrer toutes les informations nécessaires.
C’est pour cela que l’éthologie moderne a rapidement sollicité les outils d’acquisition
vidéo dans un premier temps, puis les outils d’analyse numérique développés par la suite
avec l’émergence de l’informatique.
La section suivante présente un bref historique de l’utilisation des outils vidéos dans
l’étude du comportement animal.
8
1.3 L’étude du comportement par l’analyse vidéo

Les premières études du mouvement par séquence d’images ont été réalisées par le
physiologiste français Marey (1894) grâce à son invention permettant de prendre plu-
sieurs photographies dans un intervalle de temps très court (Fig. 3). Cette technique,
appelée la chronophotographie, a permis de détailler la physiologie du mouvement de
nombreuses espèces de vertébrés comme l’Homme, le cheval l’anguille, la raie ou d’in-
vertébrés comme la comatule. L’animal étant souvent fixé sur un support, cette première
approche était très orientée sur la physiologie du mouvement plus que sur le comporte-
ment en lui-même.
Figure 3 – Représentation des mouvements ondulatoires des nageoires de

la raie obtenue par chronophotographie, Marey (1894). A : Dispositif utilisé
pour fixer le poisson ; B : Vue de profil ; C : Vue de face.
Par la suite, ce sont les techniques d’enregistrement vidéographiques d’individus libres

qui ont permis les premières études comportementales utilisant un support de type film,
puis magnétique ou maintenant numérique. La démocratisation des outils d’enregistre-
9
ment vidéo et des ordinateurs (essentiellement due à la baisse relative de leurs coûts)
ont permis aux comportementalistes d’intégrer de plus en plus facilement ces outils en
éthologie (Dawkins, 2007, Fig. 4).
Les premières avancées ont été l’utilisation de l’enregistrement vidéo afin de pouvoir
réanalyser a posteriori les séquences comportementales et ainsi complèter et rendre les
données acquises plus précises (Candland et al., 1972; Patterson, 1977; Haimoff, 1981)
tout en respectant les méthodologies de Altmann (1974, voir p. 8). Par la suite, des pro-
grammes informatiques de codages d’observation comportementale en temps réel ont
fait leur apparition (Crossman et al., 1978; Flowers et Leger, 1982; Deni et al., 1983; Un-
win et Martin, 1987; Kahng et Iwata, 1998; Koch et Zumbach, 2002). Ces programmes
permettent par une action de l’utilisateur (pression d’une touche, clic de souris) de dé-
marrer l’identification du début et de la fin d’une variable descriptive d’une unité com-
portementale choisie. À la fin de l’encodage, le nombre d’actions de l’utilisateur pour
déclencher l’identification de chaque variable descriptive permet d’en connaître la durée
unitaire et la fréquence. C’est depuis les années 90 que des systèmes plus élaborés cou-
plant à la fois la vidéo et le codage comportemental ont pu faire leur apparition (Noldus,
1991; Tapp et Walden, 1993; Tapp et al., 1995; Ruusuvirta et al., 1996; Ottoni, 2000;
Japyasú et al., 2006; Hänninen et Pastell, 2009).
Dans le même temps, ont été développés des outils de video tracking automatiques
permettant l’analyse des trajectoires des individus filmés (Rudell, 1979; Livesey et Lep-
pard, 1981; Kawai, 1984; Olivo et Thompson, 1988; Ergener et Wellens, 1989; Derry et
Elliott, 1997; Hashimoto et al., 1999; Noldus et al., 2001; Suzuki et al., 2003; Kato et al.,
2004; Liang et al., 2004). Jusqu’alors, ces informations de trajectoires étaient uniquement
obtenues via des systèmes télémétriques (Gapenne et al., 1990) qui, contrairement à la ma-
jorité des systèmes de video tracking, nécessitent l’utilisation de marques électroniques
(internes ou externes) pouvant biaiser le comportement des individus enregistrés et non
adaptables aux petits individus (poisson zèbre, larves de poissons en général, insectes).
L’outil idéal permettrait d’obtenir automatiquement depuis une vidéo à la fois les don-
nées de tracking (distance parcourue, vitesse moyennes, zones explorées, ...) ainsi que
l’encodage des séquences comportementales. Ceci commence à se développer pour le
modèle souris mais n’existe pas encore pour le poisson. Une revue méthodologique de
différentes techniques de video tracking est présentée dans le Chapitre 1 : Le video tra-
cking, p. 47.
Après cette première partie faisant le point sur le comportement et son analyse par les
système vidéos, la seconde partie va quant à elle définir la notion de pollution, ainsi que
des moyens de l’étudier.
10
Utilisation d'enregistrementvidéo TappetWalden1993
Programmesinformatiquesdecodageentempsréel
Tappetal.1995
Programmesinformatiquesdecodagedepuisune vidéoenregistrée
Ruusuvirtaetal.1996
ProgrammesinformatiquesdevideoͲtracking
KahngetIwata1998
Cardlandetal.1972 Hashimotoetal.1999
Patterson1977 Ottoni2000
Crossmanetal.1978 Noldusetal.2001
Haimoff1981 KochetZumbach2002
FlowersetLeger1982 Suzukietal.2003
Deni 1983
Deni1983 Kato et al. 2004
Katoetal.2004
SpruijtetGispen1984 Liangetal.2004
UnwinetMartin1987 Japyasuetal.2006
Noldus1991 HanninenetPastel2009
1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 2015
Altman 1974 - Méthodologie d'échantillonage Barnard 2004 - Définition du comportement
1973 - Prix Nobel Lorenz-Timbergen-von Frisch Dawkins 2004 - "L'éthologie est non-invasive"
Figure 4 – Chronologie (non-exhaustive) des publications sur les avancées de l’analyse vidéo dans le domaine de l’éthologie.
11
2 Comprendre la pollution
2.4 Qu’est-ce que la pollution ?
Le terme de pollution est de plus en plus utilisé pour décrire des phénomènes bien dif-
férents. Dans le langage courant, une pollution peut être chimique, biologique, génétique,
sonore, visuelle, etc.
Dans un premier temps, il convient de distinguer les perturbations naturelles de l’en-

vironnent (éruptions volcaniques, tremblements de terre, raz-de-marées, etc.) des pertur-
bations d’origine humaine. Ce sont ces perturbations liées aux activités humaines qui
peuvent être à l’origine de pollutions.
Ainsi, l’une des premières définitions, à la fois moderne et scientifique, de la pollu-

tion est celle donnée par The Environmental Pollution Panel President’s Science Advi-
sory Committee (1965) :
La pollution est une modification défavorable du milieu naturel qui ap-

paraît en totalité ou en partie comme un sous produit de l’action hu-
maine, au travers d’effets directs ou indirects altérant les critères de ré-
partition des flux de l’énergie, des niveaux de radiation, de la constitu-
tion physico-chimique du milieu naturel et de l’abondance des espèces
vivantes. Ces modifications peuvent affecter l’Homme directement ou
au travers des ressources agricoles, en eau ou autres produits biolo-
giques. Elles peuvent aussi l’affecter en altérant les objets physiques
qu’il possède, les possibilités récréatives du milieu ou encore en enlai-
dissant la nature.
The Environmental Pollution Panel President’s Science

Advisory Committee (1965)
Selon Ramade (2007), cette définition mélange deux concepts différents :

– la pollution, qui va réellement altérer l’environnement et/ou la santé humaine ;
– la nuisance, qui consiste en une altération de l’environnent sans conséquence éco-
logique ou sanitaire (comme « l’enlaidissement de la nature »).
Il redéfinit donc la pollution comme suit :
12
Constitue une pollution toute modification anthropogénique d’un éco-

système se traduisant par un changement de concentration des consti-
tuants chimiques naturels, ou résultant de l’introduction de substances
chimiques artificielles ; toute perturbation du flux de l’énergie, de l’in-
tensité des rayonnements, de la circulation de la matière, ou encore
toute altération d’une biocœnose naturelle provoquée par l’introduc-
tion d’espèces exotiques invasives.
Ramade (2007)
Le terme « polluant » va quant à lui désigner l’agent responsable d’une pollution.

Les pollutions peuvent être classées de différentes manières, par exemple par la nature
de l’agent polluant (pollution biologique, physique ou chimique), par la nature du milieu
contaminé (pollution atmosphérique, continentale, aquatique), selon sa durée et/ou son
intensité (pollution aiguë ou chronique), etc. Il n’existe pas de classification parfaite et
tout reste une question de point de vue.
Les polluants chimiques peuvent eux aussi être différenciés par leur nature. Ainsi, il
est possible de distinguer deux types de polluants :
– ceux d’origine naturelle ; normalement présents en faible quantité dans l’environ-
nement (et donc inoffensifs, voire essentiels pour la vie) mais dont les concentrations
vont augmenter à cause des activités humaines, les rendant ainsi toxiques (comme
les métaux ou le CO2 , par exemple) ;
– ceux d’origine humaine ; non naturels, ils sont synthétisés par l’Homme et sont
appelés xénobiotiques car « ce sont des substances qui n’interviennent en aucun
cas dans la constitution de la matière vivante » (Ramade, 2007) et leur toxicité peut
s’exprimer à de très faibles doses.
Ce sont ces derniers qui sont les plus étudiés depuis quelques années. En effet, depuis
un siècle, de nombreuses nouvelles molécules sont créées chaque année et rapidement
produites à grande échelle. Leurs réels effets sur la santé et l’environnement sont parfois
connus bien plus tard. Dans ce manuscrit de thèse, les termes « pollution » et « polluant »
seront relatifs à des xénobiotiques.
2.5 Les disciplines de la toxicologie
2.5.1 La toxicologie
D’une manière générale, la toxicologie a pour objet « d’étudier les divers problèmes
propres aux toxiques tant sur le plan analytique, qu’au point de vue physiologique et
biochimique » (Ramade, 1977). Cette discipline est très ancienne : le premier document
13
écrit connu faisant référence à la toxicologie est celui du papyrus Ebers, dont l’origine
est estimée à 1500 av. J.-C. (Hodgson, 2010). Le terme vient quant à lui du grec τοξικός
(toxicos) qui signifie « poison » et λόγος (logos) qui signifie « raison », « science ».
Exposition à une substance

toxique
Entrée dans le corps

Ingestion Peau Inhalation
Absorption dans le flux sanguin et

distribution aux tissus et organes Substance
Métabolites
brute
Excrétion / Production
Toxicité Stockage
de gamètes
Métabolisme
Figure 5 – Devenir des substances toxiques dans l’organisme, d’après Hodg-

son (2010).
Cette discipline permet donc de comprendre le champ d’action des substances toxiques
sur le plan moléculaire, cellulaire, etc. jusqu’à l’individu en entier (Fig. 5). De plus, la
toxicologie est une discipline qui, historiquement, s’est surtout orientée sur l’étude à de
fortes doses de molécules très toxiques, le but de cette science étant la compréhension des
poisons et non la description de phénomènes environnementaux réalistes.
2.5.2 Minamata : un exemple concret des limites de la connaissance
Au début des années 50, dans la région de Minamata (située à l’Ouest de l’île de japo-
naise de Kyushu) une « épidémie » semble se répandre à grande vitesse sans explication.
Dans leur revue, Harada et Smith (1975) ont repris la chronologie des événements :
– dès 1950 : les poissons, coquillages, crustacés et algues de la baie de Minamata ont
commencé à périr ;
– 1952 : certains oiseaux ont commencé à tomber dans la mer en plein vol ;
– 1953 : les animaux domestiques comme les chiens, les chats et les cochons ont été
touchés ; leur comportement devenait anormal avant de mourir, particulièrement les
chats qui salivaient et se mettaient à tourbillonner sur place sans raison (maladie
appelée du « chat dansant » par les habitants) ;
14
– avril 1956 : une première victime est présentée à l’hôpital de Minamata, il s’agit
d’une fillette de 5 ans souffrant de troubles locomoteurs, troubles de la parole et
délires ;
– octobre 1956 : la « maladie du chat dansant » est reconnue comme étant en fait la
conséquence d’une pollution par des particules métalliques.
Le lien sera rapidement fait avec l’usine de Chisso (Chisso Corporation’s Minamata
factory), mais malgré tout l’usine continue de rejeter des effluents pouvant contenir à la
fois du manganèse, du thallium, de l’arsenic, du mercure, du sélénium, du cuivre ou du
plomb. Pendant plusieurs années, tous les polluants ont été étudiés un par un jusqu’à ce
que les médecins et scientifiques trouvent en 1959 (soit 9 ans après les premiers signes)
que l’origine venait d’une contamination par le mercure. Malgré les premiers signes in-
quiétants dès 1950 dans le milieu marin, aucune interdiction de pêche n’avait été pronon-
cée à l’époque.
Figure 6 – Mère japonaise donnant le bain à son fils, victime de la pollution

au mercure de la ville de Minamata. Photo : William Eugene Smith.
Les enfants nés durant le pic de contamination ont été gravement touchés et beaucoup
d’entre eux ont vu le jour avec de graves malformations (Fig. 6). De nos jours, la zone
est toujours contaminée (Yoshida, 2007; Nakata et al., 2008). Le gouvernement japonais
a officiellement reconnu en 2001 que 2 265 patients avaient été officiellement diagnos-
tiqués, parmi lesquels 1 558 périrent (Yoshida, 2007, http://www.env.go.jp/en/chemi/hs/
minamata2002/ch2.html). Minamata a été l’un des premiers drames de cette ampleur,
mais d’autres maladies furent reconnues, parfois bien plus tard, comme étant causées par
des polluants d’origine industrielle :
– la maladie d’Itai-itai reconnue officiellement comme étant une intoxication au cad-
mium en 1970 (Shiraishi, 1975) ; les rejets d’une mine d’argent ont pollué les rizières
15
dans le préfecture de Toyama au Japon ;

– la maladie de Yushō en 1968 au Japon, due à de fortes concentrations de PCB et
PCDF (polychlorodibenzo-furanes) contenus dans de l’huile de son de riz (Miyata
et al., 1989) ;
– la contamination aux PCB de Taiwan : à la fin des années 1980, 1843 cas ont été
recensés avec un pic de contamination situé de mars à juillet 1979, soit 10 ans après
Yushō (Hsu et al., 1985) ;
– une autre contamination aux PCB a eu lieu en Chine, à Yu-Cheng, entre 1991 et
1992 ;
– la contamination du porc à la dioxine en Irlande en 2008 (Heres et al., 2010).
Les cas de pollution de grande ampleur augmentant, la toxicologie a dû étendre son
champ de connaissance et de compétence afin de pouvoir expliquer, puis anticiper ces
phénomènes. La section suivante décrit l’évolution de cette discipline.
2.5.3 De la toxicologie à l’écotoxicologie : un changement progressif
La toxicologie manquant d’outils pour expliquer certains mécanismes, différentes dis-

ciplines sous-jacentes ont commencé à se développer afin de combler le manque de connais-
sance sur les polluants. En effet, la rémanence de certains sous-produits des activités hu-
maines dans l’environnement était souvent mal connue. Pire encore, certaines idées reçues
ont persisté pendant des années : par exemple, alors que la fragilité des écosystèmes aqua-
tiques d’eau douce était connue, le milieu marin a été quant à lui très longtemps considéré
comme très stable car bénéficiant du « pouvoir tampon des océans » (Waldichuk, 1978).
De ce fait, les rejets d’effluents toxiques voire l’enfouissement de déchets (y compris
radioactifs) dans le milieu marin ont été pratiqués pendant des années de manière com-
plètement légale.
La toxicologie environnementale (ou toxicologie de l’environnement), qui tentait de
percer depuis les années 30, s’est alors développée de manière plus importante. Celle-ci
place ses études expérimentales dans des conditions de concentrations qui se veulent réa-
listes par rapport aux situations existantes dans le milieu naturel, mais conserve l’individu
entier comme plus haut niveau d’organisation. La toxicologie environnementale s’appuie
sur les connaissances acquises par la toxicologie traditionnelle (comme par exemple la
chimie du composé étudié). Elle n’explique pas tout à l’échelle d’un écosystème, mais
permet de franchir certaines barrières écologiques et est donc une étape préalable indis-
pensable à toute approche écosystémique. De plus, la toxicologie environnementale étant
moins anthropocentrée, elle s’intéresse aussi à des phénomènes comme par exemple le
SO2 (dioxyde de souffre) qui peut devenir toxique pour les plantes.
Parallèlement à la mise en avant de la toxicologie environnementale s’est développée
16
une autre branche de la toxicologie : la toxicologie comportementale. Cette discipline

a pour but d’étudier les effets de substances toxiques sur le comportement. De par la dé-
finition même du comportement (voir section 1.1 Qu’est-ce que le comportement ? de
l’Introduction générale, p. 3), la toxicologie comportementale a permis un changement
d’échelle en plaçant l’individu comme unité d’étude et a ouvert la porte des interactions
intra- et inter-spécifiques. De plus, le comportement étant potentiellement facilement ob-
servable, cette approche permet d’établir la relation entre substances toxiques et symp-
tômes comportementaux, permettant ainsi d’avoir des éléments simples de diagnostic.
Au cours des années 70, la demande sociétale pour obtenir des réponses aux questions
environnementales est devenue de plus en plus forte. Dans le même temps, de nouveaux
outils comme la modélisation ont pu voir le jour et apporter leur contribution à l’étude
des mécanismes de transfert des polluants d’un niveau trophique à l’autre. L’intégration
de ces outils a donné lieu à la création de l’écotoxicologie (Fig 7). Ce terme, inventé par
le français René Truhaut en 1974 (Ramade, 1977), est une compression d’écologie et de
toxicologie.
Chimie
Écologie comportementale
Toxicologieenvironnementale
Écotoxicologie
Écosystèmes
Populations
humaines
Évaluation du
risque
Gestion de
l’environnement
Figure 7 – Composantes et enjeux de l’écotoxicologie, d’après Lam et al.

(1999).
L’écotoxicologie est définie comme la science dont l’objet est l’« étude des polluants
toxiques à l’échelle d’un écosystème » (Ramade, 1977) et même « à celle de la biosphère
tout entière » (Ramade, 1992). Pour ce faire, l’écotoxicologie se repose à la fois sur les
connaissances acquises en chimie, mathématiques, écologie et en toxicologie. La nais-
sance de l’écotoxicologie n’a pas pour autant fait disparaître les autres disciplines de la
toxicologie : au contraire des études préalables à différentes échelles sont nécessaires pour
aborder la dimension complexe d’un écosystème.
17
Ainsi, pour connaître les effets potentiels d’une nouvelle molécule dont on ignore tout
à l’échelle d’un écosystème tout entier, il est nécessaire d’aborder tout d’abord l’approche
chimique, toxicologique, toxicologique environnementale et comportementale, puis éco-
toxicologique (Fig. 8). Chacun de ces éléments est indispensable car ensemble ils ap-
portent des réponses de l’échelle moléculaire à celle de la biosphère afin de pouvoir à la
fois expliquer les causes d’une pollution, et d’anticiper les effets potentiels à venir.
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Années
Mois
Jours / semaines
Heures / jours
Minutes
Figure 8 – Représentation schématique du champ d’étude des différentes dis-

ciplines issues de la toxicologie en fonction du niveau de complexité du vi-
vant et du temps, d’après Munkittrick et McCarty (1995) et Adams et Greeley
(2000).
Les travaux de cette thèse se situent dans le domaine de la toxicologie comportemen-

tale, en utilisant des doses rencontrées dans l’environnement. Parmi l’ensemble des pol-
luants existants, ces travaux de thèse se sont focalisés sur les PCB. La section suivante
porte sur la description de ces molécules polluantes, ainsi que sur leurs effets connus sur
les êtres vivants.
18
3 Les PCB
3.6 Description et historique de production
Les polychlorobiphényles (PCB) sont des composés aromatiques organochlorés syn-

thétisés industriellement. De par leur structure, il existe 209 dérivés théoriques, renfer-
mant 1 à 10 atomes de chlore en différentes positions (INRS, 2007, Figure 9). Chacun de
ces dérivés est appelé un congénère.
Figure 9 – Structure chimique des polychlorobyphényles. Source : Wikimedia

Commons (http://commons.wikimedia.org/).
Leur solubilité dans l’eau est extrêmement faible (0.007 à 5.9 mg.L-1 ) mais ils sont
solubles dans les huiles et la plupart des solvants organiques (INRS, 2007). Cette solubi-
lité augmente cependant avec la température et le nombre d’atome de chlore en position
ortho (Huang et Hong, 2002). De même, leur stabilité thermique augmente en fonction du
nombre d’atomes de chlore (HSPH, 2001).
Les propriétés chimiques de ces composés varient en fonction de leur degré de chlo-
ration : les mélanges à faible chloration sont fluides et incolores, alors que ceux à forte
chloration sont plus visqueux (Safe, 1993). Ces molécules ont été massivement utilisées
comme lubrifiant, pour la fabrication des transformateurs électriques, condensateurs, sub-
sectionneurs de puissance, ou comme isolants dans des environnements à très haute ten-
sion (THT) en raison de leur relative ininflammabilité et de leurs excellentes caractéris-
tiques diélectriques (ils étaient alors mélangés à des chlorobenzènes). Ils ont aussi été
utilisés comme fluides caloporteurs (dans les environnements à risque d’incendie, dont
les navires transportant des carburants), comme fluides hydrauliques dans des environne-
ments à risque ou à contraintes thermiques (mines..), dans les moteurs de pompe, fours à
micro-ondes, ou comme additifs d’huiles ou de produits de soudures, dans certains adhé-
sifs, peintures et jusque dans des papiers autocopiants. C’est pour ces propriétés qu’ils ont
19
été massivement produits et inclus dans des mélanges tels que l’Aroclor (Monsanto Che-
mical Company, État-Unis), le Clophen (Bayer, Allemagne), le Kanechlor (Kanegafuchi
- Monsanto Chemical Company, Japon), le Santotherm (Mitsubishi, Japon), le Phenoclor
et le Pyralène (Prodolec, France), ou le Fenclor (Caifaro, Italie), etc. jusqu’au milieu des
années 80 (Ballschmiter et Zell, 1980; Safe, 1993; Takasuga et al., 2006).
3.7 Règlementations relatives aux PCB
A partir des années 70, leur toxicité environnementale a été reconnue par le « Toxic
Substances Control Act » (TSCA, 1976), et le dosage puis le devenir des PCB dans l’en-
vironnement ont commencé à être suivis (Helle et al., 1976; Letz, 1983; Jaouen-Madoulet
et al., 2000).
Parmi les 209 congénères théoriques, McFarland et Clarke (1989) en ont retenus 36
potentiellement toxiques. En effet, la toxicité peut considérablement varier d’un congé-
nère à l’autre en fonction du nombre et de la position des substitutions. Parmi les PCB les
plus toxiques, on distingue le groupe des dioxin-like qui, comme leur nom l’indique, vont
avoir un structure et des effets proches de ceux de la dioxine (Metcalfe et Metcalfe, 1997,
Figure 10).
Parmi le groupe des dioxin-like, les congénères ayant des atomes de chlore en positon
meta ou para, sans chlore en position ortho (dits PCB non-ortho substitués) ou avec un
seul atome de chlore en position ortho sont les plus toxiques (Metcalfe et Metcalfe, 1997,
Fig. 10).
À cause de leur composition et de leur grande rémanence dans l’environnement, ils ont
été classés parmi les polluants organiques persistants (POP). Certains travaux ont permis
d’établir des seuils de concentration quant aux normes industrielles (Brown et al., 1994;
Chovancová et al., 2011) ou à la consommation de produits issus de la pêche (Pompa
et al., 2003; Turyk et al., 2006; Weintraub et Birnbaum, 2008; Harris et Jones, 2008;
Gewurtz et al., 2011) voire en aquaculture (Berntssen et al., 2005; Pinto et al., 2008).
Au niveau européen, les textes qui ont mené à l’interdiction des PCB sont :
– la convention de Genève 1979 sur la pollution atmosphérique transfrontalière à
longue distance, ratifiée entre 34 états membres, mais ne prenant pas encore en
compte ce type de pollution ;
– la convention d’Århus de 1998 (UNECE, adopted 25 June 1998), durant laquelle un
protocole à la convention de Genève de 1979 a été ratifié entre les 39 états membres ;
ce texte interdit la production et l’utilisation de 16 types de POP (dont les PCB) mais
n’est entré en vigueur qu’en 2003 ;
20
Dioxines Cl Cl
O
Cl O Cl
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxine ; TEF*= 1
Furanes Cl
Cl O Cl
Cl Cl
2,3,4,7,8-pentachlorodibenzofurane ; TEF*= 0.3
T
o PCB Cl Cl
x
i Cl Cl
c
i Cl
t 3,3’,4,4’,5-pentachlorobiphenyle (CB-126) ; TEF*= 0.1
é
Congénères de PCB avec les TEF* respectifs
Non-orthosubstitués
CB-77=0.0001, CB-81=0.00003, CB-169=0.03, CB-126=0.1
Dioxin-like
Mono-orthosubstitués
(CB-105, 114, 118, 123, 156, 157, 167, 189) = 0.00003
Di-orthosubstitués CB-170, 180 TEF non connu

Non dioxin-like
Nombre d’atomes
de chlore
Pas de TEF
* TEF = Toxic Equivalent Factor

Facteur d’équivalence de toxicité par rapport à la dioxine (=1)
Figure 10 – Toxicité relative des dioxines, furanes et PCB d’après les valeurs
données par Van den Berg et al. (2006). Seuls les congénères les plus toxiques
sont représentés à titre d’exemple.
21
3.8 Les PCB dans l’environnement
3.8.1 Généralités sur la biodisponibilité, la bioaccumulation et la bio-

amplification
L’estimation ou le calcul de la concentration d’une substance dans un milieu (air, eau

et sédiment), qu’elle soit essentielle ou toxique, n’apporte aucune information réelle sur
le fait qu’elle pourra être absorbée ou non par les organismes vivants. La biodisponibilité
d’une substance en général (et donc d’un polluant en particulier), est la fraction de la
quantité totale présente dans l’environnement qui peut être prélevée du milieu par un
organisme et être transférée, stockée et métabolisée par ce dernier (Ramade, 2007). Ce
n’est que si cette substance est biodisponible qu’elle pourra avoir une influence sur les
individus puis éventuellement dans l’équilibre d’un écosystème.
Le terme de bioaccumulation (ou bioconcentration) désigne le processus permettant

aux organismes vivants d’absorber et de concentrer certains éléments rares de l’environ-
nement (Ramade, 2007). Ce processus est indispensable pour leur survie dans le cas de
substances chimiques tels que les oligoéléments utiles, mais peut aussi se produire dans le
cas de molécules chimiques toxiques. La bioaccumulation se mesure en calculant le rap-
port de concentration d’un élément dans un organisme par rapport à sa concentration dans
le biotope. Ce rapport est appelé le facteur de concentration (Fc ). Pour les organismes
aquatiques pélagiques, il se calcule en prenant en compte à la fois l’apport du milieu (voie
transtégumetaire et transbranchiale) et l’apport alimentaire :
h i
C p + Ca
Fc = avec : C p , quantité de polluants absorbée par contact avec l’eau
[eau]
Ca , quantité de polluants absorbée par la nourriture
Pour les individus au mode de vie benthique, la concentration de polluant mesuré à la

surface du sédiment peut être considérée dans le calcul et ajoutée à celle de l’eau (Ramade,
2007). Lorsque ce rapport est supérieur à 1, il y a bioaccumulation de l’élément. C’est ce
qui est observé dans le cas des PCB : leur caractère lipophile et leur faible métabolisation
les rendent facilement bioaccumulables.
Un autre facteur important à considérer est le facteur de transfert (Ft ) qui permet
de calculer le rapport de concentration entre un niveau trophique donné n+1 et celui du
niveau inférieur n de ses proies.
[NT n+1 ]
Ft = avec : NT , niveau trophique réel de l’organisme
[NT n ]
22
Le calcul de ce rapport peut s’avérer complexe lorsqu’il s’agit d’espèces omnivores et

nécessite une bonne connaissance du réseau trophique considéré (Ramade, 2007). Lorsque
ce rapport est supérieur à 1, il y a bioamplification (appelée aussi biomagnification, Fig.
11).
Pyramide des Pyramide des concentrations

biomasses
V
IV
III
II
I
A. Ft < 1 : B. Ft = 1 : A. Ft > 1 :
Diminution de SIMPLE TRANSFERT Augmentation de
concentration concentration
DÉCROISSANCE BIOAMPLIFICATION
Figure 11 – Principaux types de pyramides des concentrations selon la valeur

du facteur de transfert (Ft , d’après Ramade, 1977).
En plus d’être bioaccumulables, les PCB sont bioamplifiables : leur concentration aug-
mente donc tout au long des réseaux trophiques (Fig. 12).
3.8.2 Le suivi des PCB dans l’environnement
Les PCB sont présents dans tous les compartiments de la biosphère, et une grande par-
tie des êtres vivants y sont exposés (Safe, 1993; Van den Berg et al., 2006). Cependant, le
milieu aquatique en général (et marin en particulier, Fig. 13) est beaucoup plus contaminé
que les autres.
De nombreuses études ont montré que les populations humaines les plus contaminées
aux PCB étaient celles qui consommaient le plus de poissons (Schwartz et al., 1983; Men-
dola et al., 1995; Grimvall et al., 1997; Hanrahan et al., 1999; Weintraub et Birnbaum,
2008; Gobas et Arnot, 2010; Chovancová et al., 2011; Fromberg et al., 2011). En effet,
comme pour de nombreux autres polluants, les PCB vont passer des continents à l’hy-
drosphère (Ramade, 1977; Rice et al., 2002), s’adsorber sur des particules en suspension
puis sédimenter lorsque que le courant ne permet plus de les transporter (dans les lacs,
les mers ou les océans Hiraizumi et al., 1979). Le milieu aquatique (et le milieu marin
23
Figure 12 – Bioamplification des PCB : l’exemple des Grands Lacs canadiens,

Campbell et Reece (2009).
Mers et océans
(eau, biota et sédiments)
79.9 %
Atmosphère
0.3 %
Eaux douces (eau,

Continents
biota et sédiments)
1%
18.8 %
Figure 13 – Estimation de la distribution globale des PCB dans l’atmosphère,

Rice et al. (2002).
24
en particulier) est donc un lieu privilégié pour le piégeage des PCB et leur concentra-
tion y est particulièrement suivie dans de nombreux pays (Duinker et Hillebrand, 1983;
Guzzella et al., 2005; Oliveira Ribeiro et al., 2008; Pinto et al., 2008; Gobas et Arnot,
2010). Ce suivi est généralement assuré en prélevant des individus ou du sédiment d’un
milieu donné. Les techniques d’évaluation de l’état de contamination d’un milieu étant
différentes d’un pays à l’autre, la cartographie des concentrations mondiales des PCB
n’est pas réalisable. Il existe cependant de nouvelles techniques originales pour évaluer la
toxicité potentielle de certains sites : une équipe de l’Université d’Agriculture et de Tech-
nologie de Tokyo à mis en place une technique d’évaluation de la quantité de PCB piégée
dans les résidus de plastique du littoral japonais (Mato et al., 2001). Étant donné que
des billes de plastiques sont présentes dans la majorité des sédiments côtiers mondiaux et
facilement transportables, cette équipe a pu utiliser cette technique à plus grande échelle
afin d’estimer les différences de contamination qui pouvait exister entre les différents pays
du globe (Ogata et al., 2009, Fig. 14). Il apparaît sur cette carte que les plus importantes
quantités de PCB sont mesurées dans les zones les plus fortement industrialisées.
Figure 14 – Concentrations médianes de la somme de 13 congénères de PCBs

(CB-66, 101, 110, 149, 118, 105, 153, 138, 128, 187, 180, 170, 206, valeurs
exprimées en ng.g-1 ) mesurées dans des billes de plastique du littoral (Ogata
et al., 2009).
En France, c’est le ROCCH 1 (ex-RNO 2 ) qui permet de suivre la concentration en-

vironnementale de nombreuses molécules, dont les PCB, dans les bivalves depuis 1979
(Claisse, 1989).
1. Réseau d’Observation de la Contamination CHimique du milieu marin
2. Réseau National d’Observation de la qualité du milieu marin
25
Figure 15 – Cartographie des PCB sur le littoral français entre 2003 et 2007.
Source : Ifremer Environnement, d’après les données du ROCCH. Les sym-
boles rouge représentent la concentration de CB-153 mesurée dans les moules
et les symboles bleu représentent la concentration de CB-153 mesurée dans
les huîtres. Les disques représentent des taux de concentration de la médiane
locale respectivement égaux à : 0 à 2 fois, 2 à 4 fois, 4 à 6 fois et plus de 6
fois la médiane nationale (20.9 µg.kg1 ).
Sur le littoral français, c’est essentiellement la baie de Seine qui est touchée par la
contamination aux PCB (plus de six fois la concentration médiane nationale). La pointe
de la Bretagne ainsi que le bassin d’Arcachon sont aussi touchés, mais dans une moindre
mesure (concentrations égales à deux à quatre fois la médiane nationale). En Méditerra-
née, la frange littorale entre Montpellier et Marseille est légèrement impactée par cette
pollution (concentrations égales à deux à quatre fois la concentration médiane nationale)
alors que Toulon semble plus touchée (plus de 6 fois la médiane nationale).
Les zones les plus industrialisées (comme la baie de Seine) présentent les quantités de
PCB les plus importantes. Dans le cas des pertuis Charentais, un rapport récent montre
que les PCB sont bien présents dans les sédiments, même s’ils ont été retrouvés en faibles
quantités par rapport à l’ensemble du littoral français : leur quantité est comparable à celle
de l’estuaire de la Vilaine (c’est-à-dire 8 à 12 fois moins que dans l’estuaire de Seine Biais
et al., 2010). Les taux de PCB retrouvés dans les soles sont eux aussi comparables à ceux
26
retrouvés dans celle de l’estuaire de la Vilaine, avec toutefois un profil de contamination

plus élevés chez les individus du pertuis d’Antioche par rapport à ceux du pertuis Breton
(Biais et al., 2010).
3.9 Influence des PCB sur la physiologie et le comporte-

ment des poissons
3.9.1 Généralités
Les poissons sont des animaux poïkilothermes, et donc par définition dépendants de
la température, mais aussi d’autres conditions environnementales telles que la salinité, le
pH, l’oxygène dissous, etc. Toute perturbation environnementale peut donc jouer un rôle
important dans l’équilibre physiologique des poissons (Scott et Sloman, 2004). La Fig. 16
montre la succession d’étapes et les différentes échelles de réponse d’un organisme à une
perturbation environnementale.
La réponse comportementale peut intervenir soit directement après la perception de la
perturbation par un centre nerveux (par exemple lors de la réponse de fuite d’un poisson
dès qu’un oiseau touche la surface de l’eau), soit au moment de la réponse physiologique
(par exemple, l’augmentation de la locomotion lors d’un pic de cortisol). Slobodkin et
Rapoport (1974, figure originale présentée en Fig. 65, Annexe A, p. 215) placent le com-
portement comme premier niveau de réponse avant la physiologie. Cependant, il ne peut
y avoir de comportement en réponse à une perturbation sans sa perception, et c’est ce que
montre la partie de droite de la Fig. 16 (tirée de Scott et Sloman, 2004). Le comporte-
ment à en effet la particularité de pouvoir exprimer différents types de réponse, allant du
réflexe (en lien direct avec le système nerveux, comme la réponse de fuite), à une réponse
très intégrée, résultant d’une réelle stratégie (comme la migration ou la parade nuptiale).
Le système nerveux, la physiologie et le comportement forment donc un ensemble dans
lequel il existe de nombreuses passerelles.
D’un côté, le comportement joue un rôle essentiel car il peut à tout moment rompre
la cascade de réactions présentée en Fig. 16. En effet, en présence d’une perturbation en-
vironnementale distante, une stratégie comportementale essentielle est l’évitement. Si le
danger n’a pas pu être anticipé (car trop soudain ou non perceptible à distance) il reste la
possibilité de choisir la fuite. Ces deux stratégies comportementales (évitement et fuite)
sont des éléments essentiels dans la survie d’un individu car elles permettent de potentiel-
lement retrouver l’état environnemental initial auquel l’individu est adapté. Les individus
les plus à même d’éviter ou de fuir le danger pourront survivre plus facilement et assurer
la survie de l’espèce (comportement à haute valeur de survie, selon Tinbergen, 1963).
27
28
Perturbation
environnementale
Système nerveux| COMPORTEMENT

Perception
Physiologie | COMPORTEMENT sensorielle
Acclimatation physiologique
Réponse individuelle
Centre
Changement de taux de mortalité nerveux
Système nerveux
RÉPONSE
Changements sélectifs de la mortalité COMPORTEMENTALE
et de la fécondité
Réponse physiologique Fuite,
secondaire évitement,
migration,
Réponse populationnelle
Changements génétiques profonds Hormonale, alimentation,
métabolique, interactions sociales,
×Instant de la Temps Ö cardiorespiratoire, reproduction,
etc. etc.
Physiologie
perturbation
environnementale
Figure 16 – Représentation schématique et simplifiée des réponses à une perturbation environnementale ; adapté de Slobodkin et
Rapoport (1974) et Scott et Sloman (2004)
D’un autre côté, la capacité de réaliser la réponse comportementale appropriée dé-

pend de l’état physiologique de l’individu : une réponse telle que la fuite ou l’évitement
engendre des coûts métaboliques que seuls les individus dans un état physiologique adé-
quat, c’est-à-dire ayant une réserve d’énergie à allouer à cette activité, peuvent assurer
(Domenici et al., 2007; Claireaux et Lefrançois, 2007).
Dans le cas d’une faible perturbation environnementale, la stratégie la moins coûteuse
consiste à rester dans l’environnement perturbé, afin de s’acclimater. Suite à l’acclimata-
tion physiologique, la stratégie comportementale peut être modifiée, comme par exemple
réduire les activités coûteuses en énergie telles que la recherche de nourriture ou la repro-
duction quand les conditions de température ou d’oxygène sont moins favorables.
Dans le cas de substances chimiques présentes dans l’environnement (comme les pol-
luants), les questions de fuite et d’évitement sont plus complexes. En effet, beaucoup
d’entre elles ne sont pas perceptibles par les organismes vivants et la cascade de réactions
physiologiques en réponse au xénobiotique va démarrer. La balance physiologique va être
déséquilibrée et les capacités physiologiques et comportementales vont être toutes deux
modifiées (Scott et Sloman, 2004). À défaut d’avoir pu percevoir la substance responsable
de son changement d’état, l’individu peut aussi réagir à ce déséquilibre, ce « changement
de perception de son état interne » décrit par Barnard (2004), et le compenser avec une
réponse comportementale appropriée, voire une stratégie alternative d’urgence (Elliott
et al., 2007).
Or, toute perturbation physiologique et/ou comportementale peut avoir des répercu-
tions importantes sur les fonctions locomotrices (Little et Finger, 1990; Schmidt et al.,
2005), alimentaires (Jørgensen et al., 1999), reproductrices (Örn et al., 1998; Daouk et al.,
2011) et sociales (Ward et al., 2002; Nakayama et al., 2005a), ce qui peut compromettre la
survie des individus et donc des populations. Mais ce changement d’échelle des individus
aux populations (puis aux communautés) reste encore difficile à établir en écotoxicologie
(Hinton et al., 2005) et l’étude du comportement pourrait en être l’une des clés en passant
de l’unité « individu » au « groupe ».
3.9.2 Effets des PCB
Lorsqu’ils sont présents dans un organisme, les PCB sont présents dans tous les tissus,
mais leur quantité est plus importante dans ceux contenant relativement plus de lipides
et selon les congénères (certains sont métabolisables) le transport et le stockage dans
les organes diffèrent (Boon et Duinker, 1985; Monosson et al., 2003). Une fois dans le
cytoplasme, vont se fixer au récepteur Aryl hydrocarbone (Ah). L’association dioxine-Ah
va ensuite entrer dans le noyau cellulaire et induire une production anormale de protéines :
ce phénomène constitue la réponse toxique.
29
Chez les poissons, les PCB ont un effet :

– négatif sur la maturation des oocytes (Örn et al., 1998; Monosson et al., 1994; Khan
et Thomas, 2006; Foekema et al., 2008; Daouk et al., 2011)
– négatif sur la fonction hépatique (Celander et Förlin, 1995; Örn et al., 1998)
– négatif sur la fonction rénale (Blom et Förlin, 1997; Quabius et al., 1997)
– négatif sur la synthèse de cortisol (Quabius et al., 1997)
– perturbateur du système endocrinien (Buckman et al., 2007)
Des résultats similaires ont été obtenus chez le rat (Collins et Capen, 1980; Parkinson
et al., 1980; Holene et al., 1998; Hany et al., 1999; Crofton et al., 2000; Cocchi et al.,
2009; Colciago et al., 2009) les primates (Collins et Capen, 1980; Ahmad et al., 2003;
Baldridge et al., 2003) et l’Homme (Fromberg et al., 2011; Schell et al., 2008).
Concernant la croissance, les résultats divergent. En effet, alors que Bengtsson (1980)
et Lyche et al. (2010) ont montré une augmentation du poids, qu’ils expliquent par une al-
tération du système endocrinien, Örn et al. (1998) ont montré une diminution significative
chez les groupes de poissons zèbres contaminés alors que Daouk et al. (2011) n’ont pas
montré de variation de poids entre les groupes. De même, une récente revue sur les pertur-
bateurs endocriniens responsables d’obésité chez l’Homme (Tang-Péronard et al., 2011)
explique que les PCB peuvent jouer un rôle sous certaines conditions, telles que le type de
congénère, la dose, la durée et le moment de l’exposition. Dans tous les cas, les troubles
de surpoids, s’ils apparaissent, semblent être plus prononcés chez les femelles/femmes
(Bengtsson, 1980; Tang-Péronard et al., 2011).
Lors des stades précoces, les PCB :

– provoquent des malformations (Billsson et al., 1998; Olsson et al., 1999) ;
– perturbent la cardiogénèse (endocarde et myocarde, Grimes et al., 2008) ;
– augmentent la mortalité (Billsson et al., 1998; Foekema et al., 2008; Olsson et al.,
1999; Westerlund et al., 2000).
Les PCBs semblent perturber le fonctionnement du système nerveux chez les poissons,
mais pas sa structure (Grimes et al., 2008). Ces résultats concordent avec des études faites
sur de jeunes enfants, où les PCB ont montré un effet sur les capacités mentales entre deux
et quatre semaines mais pas sur le développement moteur ou la mémorisation à sept mois
(Winneke et al., 1998).
L’étude des effets d’une contamination aux PCB sur un comportement donné est en-
core rare. Chez les poissons, il a cependant été mis en évidence que les PCB altéraient le
comportement natatoire (Triebskorn et al., 1997; Nakayama et al., 2004; Schmidt et al.,
2005) et la formation en banc (Nakayama et al., 2005a). Les résultats de cette dernière
étude montrent clairement un effet des PCB sur la nage en groupe de medaka (chez des
groupes de six individus contaminés ou des groupes mélangés composés de trois indivi-
30
dus contaminés et trois individus non contaminés) et les hypothèses des auteurs sur cette
différence seraient :
– un comportement hyperactif ;
– une altération du système latéral et/ou visuel menant à une mauvaise cohésion des
individus contaminés dans le groupe.
La première hypothèse concorde avec les premiers travaux de cette équipe (Nakayama
et al., 2004) ainsi que d’autres notamment chez le rat (Bushnell et Rice, 1999; Holene
et al., 1998; Berger et al., 2001; Vitalone et al., 2008) et l’Homme (Chen et al., 1994; Ba-
nerjee et al., 2007). La seconde hypothèse n’a quant à elle été confirmée par aucune autre
étude. De plus, une altération de la nage en banc est trop souvent associée à une altération
du système visuel et/ou latéral alors qu’un grand nombre d’autres facteurs peuvent jouer
sur ce comportement en groupe, allant du parasitisme (Barber et al., 2000), aux relations
inter-individuelles (individus familiers ou non) (Barber et Wright, 2001; Frommen et al.,
2007) ou la communication chimique (Keenleyside, 1955; Brown et Smith, 1994; Ward
et al., 2002). Dans l’étude de Nakayama et al. (2005a), l’hypothèse d’une hyperactivité
des poissons contaminés permettrait d’expliquer l’altération du comportement en groupe
et semble être l’hypothèse la plus plausible à retenir. Bien que l’effet hyperactif des PCB
ait été démontré chez plusieurs espèces, les mécanismes physiologiques menant à cet état
ne sont pas encore connus (Banerjee et al., 2007; Holene et al., 1998), mais semble s’exa-
cerber en présence de contaminants métalliques tels que le mercure ou l’étain (Grandjean
et al., 2001; Schmidt et al., 2005) et vraisemblablement impliquer la voie dopaminergique.
Ces travaux de thèse vont chercher à identifier les effets des PCB après une contami-
nation par voie alimentaire chez deux espèces de poisson : la sole commune et le poisson
zèbre. La partie suivante présente les deux espèces ainsi que les comportements potentiel-
lement intéressants à analyser dans le cas d’une étude toxicologique.
31
4 Présentation de la thèse
4.10 Description et intérêt éthologique des espèces étu-

diées
4.10.1 La sole commune Solea solea
4.10.1.1 Historique et généralités à propos de la sole commune
Figure 17 – Photo de la sole commune, Solea solea. Source : Biopix – Photo :

JC Schou.
La sole commune (Solea solea, Linnaeus, 1758, Fig. 17) est un téléostéen appartenant
à l’ordre des Pleuronectiformes et à la famille des Soléidées. Elle est présente essentielle-
ment sur les côtes atlantiques européennes et nord-africaines ainsi qu’en Méditerranée
(Cabral et Costa, 1999, Fig. 18). Comme la plupart des poissons plats, c’est une espèce
benthique (qui vit au fond de la masse d’eau) qui préfère les zones côtières estuariennes
aux fonds sableux ou vaseux (Koutsikopoulos et al., 1989; Rogers, 1992; Le Pape et al.,
2003). Elle représente un intérêt économique majeur dans le Golfe de Gascogne (Amara
et al., 1998; Gilliers et al., 2006).
La sole est une espèce migratrice qui effectue essentiellement ses déplacements entre
les frayères et les nourriceries au niveau du plateau continental, préférentiellement en
zones estuariennes dans certaines zones géographiques (Greer Walker et Emerson, 1990;
Rijnsdorp et al., 1992).
32
Figure 18 – Répartition mondiale de la sole commune Solea solea. Source du

fond de carte : Wikimedia Commons – Crédits du fond de carte : Brianski /
Sources des données : Fish Base.
De nos jours, les études scientifiques effectuées sur cette espèce concernent des ques-
tions relatives à la gestion des stocks (Dorel et al., 1991; Amara et al., 1994, 2000; De Pon-
tual et al., 2000) mais aussi les problèmes relatifs à son élevage aquacole (Howell, 1997;
Imsland et al., 2003; Cañavate et al., 2006; Reig et al., 2010). Même si certaines études
ont été faites concernant le statut toxicologique de cette espèce largement consommée
(Boon et al., 1984; Boon et Duinker, 1985; Budzinski et al., 2004; Costa et al., 2008; Ba-
rhoumi et al., 2009; Costa et al., 2009), seuls quelques travaux récents se sont concentrés
sur les implications concrètes des polluants sur sa physiologie ou sa morphologie (Clai-
reaux et al., 2004; Davoodi et Claireaux, 2007; Eichinger et al., 2010; Foekema et al.,
2008; Wessel et al., 2010). Aucun article ne traite des effets des PCB sur le comportement
de la sole. Pourtant, les espèces au mode de vie benthique, comme la sole, vivent bien
souvent au contact de sédiments contaminés, même faiblement dans le cas des pertuis
Charentais (Biais et al., 2010), et peuvent présenter des taux de contaminations souvent
supérieurs à ceux des autres espèces (Schafer et al., 1982; Cossa et al., 1992; Moles et
Norcross, 1995; Loizeau et Abarnou, 1994; Eichinger et al., 2010).
4.10.1.2 Le développement et les différents comportements naturels de la sole
Comme l’ensemble des Pleuronectiformes, la sole est un poisson qui va subir un apla-
tissement dit « secondaire » : c’est après une métamorphose et la migration de l’œil gauche
que le poisson va prendre cette forme. Le cycle de vie de la sole dépend de nombreux fac-
teurs et peut donc considérablement varier d’une zone géographique à une autre (Amara
et al., 2000). En effet, les conditions environnementales et climatiques influent à la fois sur
les périodes de reproduction et la qualité des pontes (Koutsikopoulos et Lacroix, 1992).
33
Dans le golfe de Gascogne, la fraie peut se produire de janvier à avril, et se passe aux
alentours de 50 à 100 m de profondeur dans des zones situées à 50 ou 75 km du littoral
(Koutsikopoulos et al., 1989). La saisonnalité de la reproduction présente un gradient Sud
/ Nord, de janvier dans le Sud du golfe de Gascogne à avril jusqu’à la Pointe de Bretagne
(Arbault et al., 1986).
Les jeunes larves vont tout d’abord être pélagiques (c’est-à-dire vivre dans la colonne
d’eau) et dériver pendant un à deux mois vers le littoral pour rejoindre des zones de nour-
ricerie où elles resteront au moins deux ans (Koutsikopoulos et al., 1989), les conditions
de température, salinité et de nutriments y étant optimales pour leur développement. C’est
pendant la migration de la zone de frayère à la nourricerie que va se produire la métamor-
phose. Celle-ci dure en moyenne dix jours, mais le commencement est plus déterminé par
la taille des individus (entre 7 et 10 mm) que par leur âge (Amara et al., 2000).
Figure 19 – Cycle de vie de la sole commune, Solea solea, d’après Durieux

(2007). G0 : soles de moins d’un an ; G1 : soles âgées de un an ; G2 : soles
âgées de deux ans ; G3+ : soles âgées de trois ans ou plus.
Du point de vue de l’éthologie, différents aspects comportementaux sont intéressants.

Le premier est son activité locomotrice. En effet, cette espèce présente naturellement une
activité locomotrice et alimentaire essentiellement nocturne qui peut cependant être épi-
sodiquement diurne lorsque les opportunités de marées sont plus propices le jour (Kruuk,
1963; Champalbert et Castelbon, 1989). Cette stratégie alimentaire implique une faible
sollicitation du système visuel chez la sole pour la prédation, en sollicitant plutôt la ché-
moréception et la mécanoréception (de Groot et al., 1969; Batty et Hoyt, 1995). En effet,
chez la sole, le développement du système olfactif se produit très tôt (Appelbaum et al.,
1983) et la sole possède de très nombreux neuromastes sur la ligne latérale sur les deux
faces : ceux de la face oculée serviront principalement à la détection de prédateurs alors
34
que ceux de la face aveugle permettront la détection des proies (Appelbaum et Schemmel,
1983; Harvey et al., 1992). Ces deux systèmes sont donc particulièrement développés
chez la sole, alors que le système visuel est généralement considéré comme peu perfor-
mant dans la détection des proies et des prédateurs, à cause notamment de la faible taille
des yeux de ce poisson par rapport à sa taille ainsi que leur position (Batty et Hoyt, 1995).
Un deuxième point particulièrement intéressant est l’étude des capacités cryptiques.

En effet, la sole est un poisson qui adopte une stratégie mimétique avec son environne-
ment en jouant sur deux paramètres (Ellis et al., 1997) : l’enfouissement et la variation
de pigmentation. L’enfouissement consiste en un mouvement coordonné des nageoires
dorsales et anales permettant à la sole de créer un courant d’aspiration qui va la recouvrir
d’une fine couche de sédiment, ne laissant apparaître que ses yeux, sa nageoire pectorale
et sa bouche. Concernant la variation de pigmentation, celle-ci est possible grâce à des
mécanismes bien distincts. Bien qu’il soit peu performant pour la prédation (qui donc
principalement est nocturne), le système visuel semble donc être plus sollicité en journée
pour la détection globale de l’environnement (ce qui demande de moindres capacités vi-
suelles), et l’adaptation de la pigmentation en fonction des perceptions visuelles. En effet,
la face oculée des poissons plats possède des chromatophores qui peuvent se spécialiser
en différents type de cellules (Bolker et Hill, 2000; Burton, 2002) :
– les mélanophores, qui vont produire la tyrosine kinase, l’enzyme responsable de la

production de mélanine et donc de pigments noirs ;
– les xanthophores et les erythrophores, qui produisent des pigments jaune-orange à
partir de composés caroténoïdes ;
– les iridiophores, qui apparaissent blancs ou argentés car les inclusions de guanine
disperse la lumière (ce sont eux qui composent la couleur de la face aveugle).
Il y a deux niveaux de réponse lors d’un changement de couleur chez un poisson plat :
le premier est rapide, par l’orientation des chromatophores, le second est plus lent, par
synthèse de pigments pour s’assombrir ou arrêt de synthèse pour s’éclaircir (Ellis et al.,
1997).
Ces deux comportements, enfouissement et changement de couleur, vont naturelle-

ment lui permettre d’échapper aux prédateurs et peuvent être suivis en expérimentation
en laboratoire (Ellis et al., 1997).
Le dernier point, plus complexe à mettre en place, est le suivi de la reproduction. En

effet, Baynes et al. (1994) ont décrit les séquences comportementales qui composaient la
reproduction des soles. Cependant, ces travaux de thèses ne se sont focalisés que sur les
réponses des juvéniles.
35
4.10.2 Le poisson zèbre Danio rerio
4.10.2.1 Historique et généralités à propos du poisson zèbre
Le poisson zèbre (Fig. 20) est un poisson originaire du Gange connu des occidentaux
par sa description par Hamilton en 1822. C’est un téléostéen appartenant à l’ordre des
Cypriniformes et à la famille des cyprinidées.
Figure 20 – Photo du poisson zèbre, Danio rerio. Source : Wikimedia Com-

mons – Photo : Azul.
La distribution naturelle du poisson zèbre est essentiellement dans les pays situés au-
tour du Gange, c’est-à-dire l’Inde, le Népal, le Bangladesh et la Birmanie (Engeszer et al.,
2007b; Spence et al., 2008, Figure 21). Ce petit poisson tropical, qui peut atteindre 4 cm
à l’âge adulte vit dans les eaux des rizières (d’où son nom Danio, qui vient du bengali
Dahni qui signifie « de champs de riz ») dont la température peut varier entre 6 et 38 °C
en fonction de la saison (Spence et al., 2008).
Le poisson zèbre a tout d’abord été très populaire en aquariophilie en tant que poisson
d’ornement, notamment pour sa robustesse et sa facilité d’élevage qui ont fait que son
cycle de vie a rapidement été maîtrisé (Spence et al., 2008). À ce premier avantage se sont
ajoutés d’autres, qui ont permis à cette espèce d’émerger dans le milieu de la recherche
biomédicale (Spence et al., 2008; Engeszer et al., 2007b; Spence, 2011) :
– un cycle de vie court (mâture sexuellement à l’âge de trois mois en conditions opti-
males) ;
– un développement rapide (éclosion entre 48 et 72 hpf 1 environ) ;
– des œufs transparents ;
– une femelle peut pondre plusieurs centaines d’œufs par ponte (une ponte par semaine
pendant au moins un an) ;
– pas de saisonnalité pour la reproduction (quand ils sont maintenus entre 26 et 28 ° C) ;
Pour maintenir un élevage dans de bonnes conditions et obtenir des pontes toute l’an-
née, il est cependant nécessaire de respecter un certain nombre d’exigences de l’espèce,
1. hpf : heures post-fécondation.
36
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$ %
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Figure 21 – Répartition géographique du poisson zèbre Danio rerio ; les

points bleus représentent les emplacements où l’espèce a été recensée. Source
du fond de carte : Wikimedia Commons – Crédits fonds de carte : Brianski
(monde) et Uwe Dedering (Inde) / Sources des données : Spence et al., 2008.
que ce soit en termes de température, photopériode, qualité d’eau, densité d’élevage, etc.
Cependant, ces paramètres sont assez simples à respecter et peuvent être satisfaits pour
des coûts d’élevage peu élevés comparés à d’autres espèces (Spence et al., 2008).
En 1996, le résultat de travaux conjoints de plusieurs équipes ont été publiés dans
un numéro spécial du journal Development contenant 37 articles décrivant plusieurs cen-
taines de mutations obtenues chez le Danio rerio (pour revue Haffter et al., 1996). Dans
le même temps, l’établissement de la carte génétique du poisson zèbre a été entreprise
(Postlethwait et al., 1994; Shimoda et al., 1999). Suite aux possibilités offertes par ce
vertébré, de nombreux domaines ont alors adopté cette espèce comme modèle, comme
par exemple la physiologie (pour revue Briggs, 2002), la neurophysiologie (Fleisch et
Neuhauss, 2006; Fetcho et al., 2008), le comportement (Gerlai, 2003; Miklósi et Andrew,
37
2006), ou se servent de cette espèce comme modèle de vertébré pour la recherche médi-
cale (Dooley et Zon, 2000; Lieschke et Currie, 2007). C’est donc naturellement que cette
espèce est maintenant couramment utilisée en toxicologie et neurotoxicologie disciplines
auxquelles le poisson zèbre apporte à la fois des caractéristiques biologiques et des outils
adaptés à la caractérisation de mécanismes moléculaires (Gerlai et al., 2000; Linney et al.,
2004; Zon et Peterson, 2005; Deo et MacRae, 2010; Mathur et Guo, 2010).
4.10.2.2 Cycle de vie du poisson zèbre et études comportementales
L’un des grands atouts du poisson zèbre est la rapidité de son développement et son
cycle de vie relativement court en général (Fig. 22). En effet, placé à 28 °C, un embryon
aura atteint le stade 1024 cellules en trois heures, puis le stade sphère quatre heures après
la fécondation. Après 16 hpf, le stade 14 somites est atteint et à 24 hpf le plan corporel est
déjà établi. À 48 hpf, l’oeuf est prêt à éclore. Comme celui-ci est parfaitement transparent,
l’ensemble de ces étapes peuvent être contrôlées et suivies par simple observation à la
loupe binoculaire ou au microscope optique (Hill et al., 2005). Ceci permet d’observer
les éventuels retards de développement ou malformations sans altérer l’intégrité physique
de l’embryon, et donc sa survie (Hill et al., 2005). Entre 48 et 72 hpf, l’œuf éclot et
l’embryon devient une larve nageuse qui, jusqu’à 120 hpf, ne vit que sur ses réserves
vitellines (Parichy et al., 2009). Ce n’est qu’à partir de 120 hpf que la bouche va s’ouvrir,
ce qui permettra le début de l’alimentation exogène.
Même si les réserves vitellines permettent aux larves de survivre pendant 13 jours en
moyenne sans s’alimenter (Örn et al., 1998), pour pouvoir croître et continuer de se déve-
lopper correctement, la larve va devoir se nourrir rapidement. Ceci nécessite de pouvoir
se déplacer de manière orientée vers la proie et la capturer, ce qui implique d’avoir un
système sensoriel fonctionnel.
D’une manière générale, les premiers neurones se forment autours de 16 hpf (Metcalfe
et al., 1990). Le système visuel va quant à lui se développer autour de 72 hpf (Easter
et Nicola, 1996). À cet âge là, les larves vont déjà s’orienter en fonction de la lumière
(Fleisch et Neuhauss, 2006). Cependant, les mouvements oculaires ainsi que la rétine ne
vont réellement se mettre en place qu’entre 96 et 120 hpf, avec une vision identique à
celle de l’adulte à 120 hpf (Easter et Nicola, 1997; Fleisch et Neuhauss, 2006). Ainsi, une
réponse comportementale à un stimulus visuel simple (comme un changement de lumière)
peut être mis en place dès 72 hpf (Easter et Nicola, 1997; Fleisch et Neuhauss, 2006).
Le système olfactif commence à se mettre en place entre 17 et 18 hpf, est connecté au

système nerveux à 22 hpf et l’ouverture du nez se fait à 32 hpf (Whitlock et Westerfield,
2000). Enfin, les cellules de Mauthner (indispensables pour les réponses anti-prédateur par
38
30 minutes
post-fécondation
Adulte
Clivage
Stade sphère
0 2
90
Larve nageuse
4
Heures après
fécondation Stade de bouclier ou
Cellule pigmentée 2 6 écusson
Jours après (vue en coupe)
fécondation
8
1 Gastrulation
Éclosion et épibolie
16
Plan corporel établi 75% épibolie

Majorité des organes (vue en coupe)
(ou leurs ébauches) visibles
Organogénèse
Stade 14
somites
Figure 22 – Cycle de vie du poisson zèbre, Danio rerio, traduit de Wolpert

et al. (1997).
stimulation mécano-acoustique) ainsi que le système auditif sont respectivement fonction-

nels au quatrième jour (96 hpf, Eaton et Farley, 1973) et cinquième jour de développement
(120 hpf, Zeddies et Fay, 2005). Au moment de l’ouverture de la bouche au cinquième
jour, l’ensemble des systèmes visuels, olfactifs, auditifs, ainsi que les cellules de Mauthner
sont donc normalement parfaitement fonctionnels. Des tests de réponse comportementale
à des stimuli visuels, mécano-acoustiques ou olfactifs peuvent donc être mis en place
à cet âge afin de vérifier l’intégrité des systèmes sensoriels. Ces tests peuvent être par
exemple un suivi de la modification de la locomotion, qui deveint coordonnées à 120 hpf
(Ali et al., 2011), en réponse à un stimulus ou encore un suivi du comportement alimen-
taire. La ligne latérale va quant à elle se mettre en place entre le deuxième jour (48 hpf),
à partir duquel des tests de réaction comportementale (réponse de fuite) peuvent être mis
en place en touchant directement la ligne latérale (Abe et al., 2011), et le 22e jour (Müller
et van Leeuwen, 2004). Une fois fonctionnelle, c’est la ligne latérale qui permettra (avec
le système visuel) d’assurer une bonne cohésion lors de la nage en groupe ou en banc
polarisé.
La rythmicité circadienne (par exemple l’activité locomotrice) n’est robuste qu’au bout
de 10 à 15 jours après fécondation, mais la mise en place commence dès les 96 premières
39
heures de développement : une absence de lumière ou une lumière constante à 14 hpf

induit des arythmies (Pando et Sassone-Corsi, 2002). Au-delà de 15 jours, des expériences
plus complexes d’étude des rythmes locomoteurs ou alimentaires sont donc envisageables
et ont été décrits par del Pozo et al. (2011).
À partir de trois mois, les juvéniles de poissons zèbre sont matures sexuellement et
donc capables de se reproduire. La reproduction chez le poisson zèbre est aussi un com-
portement intéressant car elle est composée de dix étapes successives qui doivent toutes
être accomplies pour assurer le succès reproducteur (pour revue, Darrow et Harris, 2004).
Darrow et Harris (2004) précisent cependant que ce comportement est très complexe à
détailler car les étapes sont très rapides. Les rythmes reproducteurs ont quant à eux été
décrits. Les pics de reproduction ont lieu 3 h après l’allumage des lumières Blanco-Vives
et Sánchez-Vázquez (2009).
De nombreux tests ont aussi été adaptés d’expériences réalisées sur les souris, par
exemple l’utilisation de bassins expérimentaux en forme de T pour effectuer des tests
de choix (Champagne et al., 2010). Ces bassins peuvent servir à tester le comportement
exploratoire des individus ou servir de tests de cognition en répétant les passages pour
chaque individu. En effet, juvéniles et adultes de poissons zèbre sont capables de mémoire
associative (Sison et Gerlai, 2010; Gould, 2011). Il est ainsi possible de mettre en place
des tests d’apprentissage en associant une zone spatiale à une récompense alimentaire
(Ninkovic et Bally-Cuif, 2006), ou une couleur à une récompense (Colwill et al., 2005).
Ces tests peuvent s’avérer utiles pour mesurer une altération du système nerveux central.
4.11 Objectifs de la thèse et présentation du manuscrit
Les objectifs de cette thèse sont d’utiliser l’étude de plusieurs comportements afin
d’analyser les effets des PCB sur des juvéniles de sole et des adultes de poissons zèbres
contaminés par voie trophique, ainsi que sur des larves et des adultes de poissons zèbre
contaminés par voie maternelle. Les questions auxquelles cette thèse devra répondre sont
donc :
– Quels sont les outils à mettre en place ?
– Existe-t-il un effet des PCB sur le comportement de juvéniles de soles et d’adultes
de poissons zèbre contaminés à doses environnementales par voie trophique ?
– Existe-t-il un effet transgénérationnel des PCB ? Observe-t-on des effets des PCB
chez une génération fille de poissons zèbres issue de géniteurs contaminés ?
Pour répondre à ces différentes questions, plusieurs études ont été menées tout au long
de cette thèse, en se basant sur l’étude de différentes variables comportementales adaptées
40
au modèle considéré. Les différentes études présentées dans ce manuscrit ont été divisées
en deux parties distinctes, selon le plan suivant :
– la Première partie vise à détailler les techniques utilisées, ainsi que les outils et
protocoles mis en place, selon la structure suivante :
1. le Chapitre 1 présente les différentes solutions logicielles de video tracking
existantes et détaille le fonctionnement du logiciel Ethovision utilisé pendant
cette thèse ;
2. le Chapitre 2 détaille le fonctionnement du logiciel ODRec (Observational
Data RECorder) conçu pendant cette thèse pour le codage de variables com-
portementales à partir de vidéos, ainsi que de HeatMap From Stack, un plugin
pour le logiciel ImageJ mis en place au cours de cette thèse permettant l’ana-
lyse de la répartition spatiale d’individus en groupe ;
3. le Chapitre 3 présente la technique de marquage par nano-tags RFID pour le
poisson zèbre, et qui a par la suite aussi été utilisé pour la sole commune ;
– la Deuxième partie vise à analyser les effets des PCB sur le comportement de la
sole commune et du poisson zèbre grâce aux outils présentés dans la première partie,
selon la structure suivante :
1. le Chapitre 4 présente les différentes expériences réalisées pour évaluer les
effets des PCB sur le modèle sole commune après 30 et 60 j de contamina-
tion. Les variables comportementales étudiées pendant ces expériences sont
l’activité de nage pendant 23 h, la réponse à un challenge d’enfouissement
sur fond sableux, ainsi que les capacités d’homochromie sur fonds clairs ou
sombres. D’autres variables ont été mesurées comme le poids, le taux de crois-
sance spécifique, l’indice de condition de Fulton, ainsi que la concentration en
PCB mesurée dans le muscle ;
2. le Chapitre 5 porte sur les effets des PCB sur le comportement locomoteur
(activité de nage pendant 23 h et exploration) et sur un challenge de choix de
couleur de fond sur une première génération de poisson zèbre contaminée par
voie alimentaire pendant 250 j ;
3. le Chapitre 6 se focalise sur les effets en seconde génération d’une conta-
mination aux PCB, en étudiant le comportement de larves de poissons zèbres
issues des géniteurs contaminés testés dans le Chapitre 5. La locomotion de ces
larves contaminées par voie maternelle a été suivie lors d’un challenge lumi-
neux (dont la mise en place est détaillée dans la Première Partie). Ces poissons
ont été élevés à l’aliment commercial non contaminé, puis testés à nouveau
au stade adulte, le comportement locomoteur a été suivi pendant 24 h en vue
zénithale, ainsi qu’en vue frontale afin d’étudier leur répartition horizontale et
verticale.
41
Enfin les parties Discussion générale et Conclusions et perspectives présenteront une

synthèse de l’ensemble des résultats obtenus, en les replaçant dans le contexte écologique
actuel.
42
Première partie
Présentation de la méthodologie et
des outils mis en place
Chapitre 1
Le video tracking
Partie I – Présentation de la méthodologie et des outils mis en place
L’objectif de ce chapitre n’est pas d’entrer dans les détails complexes du fonctionne-
ment des logiciels de video tracking automatiques, mais de présenter de manière simple
(mais néanmoins complète) les solutions existantes ainsi que celle retenue : le logiciel
Ethovision XT® (Noldus, The Netherlands). Cette présentation permettra au lecteur de
voir les possibilités ainsi que les contraintes techniques liées au video tracking, afin de de
mieux comprendre le choix de certaines expériences de ces travaux de thèse.
1.1 Les outils existants

Différents logiciels permettent de « suivre » un objet en mouvement. Ce suivi consiste
en fait à identifier les objets d’intérêt, puis calculer et enregistrer leurs coordonnées pour
chaque image d’une vidéo pour obtenir des mesures de distance parcourue, vitesse, etc.
Ces logiciels n’ont cependant pas tous les mêmes possibilités, les mêmes coûts, le même
fonctionnement. La première des choses qu’il convient de distinguer est l’automatisation.
En effet, il existe des logiciels qui permettent de réaliser le suivi d’objet de différentes ma-
nières :
– manuelle : l’observateur devra lui-même cliquer sur les objets à suivre. Le logiciel
permettra quant à lui de collecter les coordonnées sous forme de tableau. De nos
jours, ces logiciels sont bien souvent gratuits (par exemple, le plugin 1 Manual Track
du logiciel ImageJ, tous deux gratuits et open source 2 ) ;
– automatique : grâce à différents algorithmes de traitement de l’image, le logiciel
va pouvoir isoler et déterminer les coordonnées des objets dans l’image de manière
autonome. Il existe deux types de logiciels de video tracking automatiques :
1. ceux dits single-object : ils sont capables de suivre un seul objet par arène 3 ;
2. ceux dits multi-object : ils sont capables de suivre plusieurs objets par arène ;
Au-delà du coût et de la capacité à pouvoir suivre un ou plusieurs individus, d’autres
notions peuvent aussi être importantes pour l’utilisateur du point de vue de l’ergonomie
du logiciel. Par exemple :
– le logiciel nécessite-t-il une formation importante pour la mise en place / l’utilisa-
tion ?
– l’utilisateur peut-il manuellement corriger les tracking en cas d’erreur du logiciel ?
– le logiciel permet-il d’effectuer un suivi d’individu en temps réel ? Seulement depuis
une vidéo enregistrée ? Les deux ?
1. Module d’extension logiciel qui complète un logiciel hôte pour lui apporter de nouvelles fonctionna-
lités
2. Désignation qui s’applique aux logiciels dont la licence respecte des critères précisément établis par
l’Open Source Initiative, c’est-à-dire la possibilité de libre redistribution, d’accès au code source et aux
travaux dérivés
3. Une arène est un espace délimité, fini, d’où les individus suivis ne peuvent pas sortir, comme un
aquarium par exemple.
47
– les données obtenues sont-elles de simples coordonnées brutes ? Des coordonnées

calibrées (c’est-à-dire exprimées dans une unité métrique et non en pixels) ? Des
variables déjà calculées (vitesse, distance parcourue, etc.) ?
Le Tab. 1 résume les possibilités de différentes solutions testées durant ces trois ans
de thèse. D’une manière générale, un grand nombre d’entre elles nécessite une certaine
maîtrise avant de parvenir à des résultats concluants.
48
Tableau 1 – Comparaison des principales solutions logicielles de video tracking automatiques existantes.
Single- ou Acquisition Corrections Gratuit ou

Nom Société et lien internet Données exportées
multi-object en temps réel manuelles payant1
Ethovision Noldus Multi-object Oui Oui Variables calculées Payant
Danio Track Loligo Multi-object Oui Non Variables calculées Payant
WINAnalyse Micromak Multi-object Non Oui Coordonnées calibrées Payant
Labtrack BioRAS Multi-object Non Non Coordonnées calibrées Payant
2
Videotrack Viewpoint Single-object Oui Non Coordonnées calibrées Payant
École Fédérale
SwissTrack Multi-object Non Non Données calibrées Gratuit
Polytechnique de Lausanne
Biotracking Georgia Tech BORG Lab Multi-object Non Non Données calibrées Gratuit
Wayne Rasband, National
ImageJ 3 Multi-object Non Non Coordonnées calibrées Gratuit
Institute of Health
California Institute or
CTrax Multi-object Non Oui5 Coordonnées calibrées Gratuit5
Technology4
1
Comme la plupart de ces logiciels ont des prix variables en fonction des options choisies à l’achat, les prix ne seront pas indiqués dans ce document.
2
Permet cependant de suivre simultanément plusieurs arènes contenant chacune un individu.
3
Les plugins ImageJ permettant de suivre des individus sont Mtrack2 (Nico Stuurman, Vale Lab, University of California, San Francisco), Multi-
tracker (Jeffrey Kuhn, University of Texas, Austin), ObjectTracker (Wayne Rasband, National Institut of Health) et ParticuleTracker (Guy Levy
et Janick Cardinale, MOSAIC Group, ETH Zurich).
4
Kristin Branson, Alice Robie, John Bender, Michael Dickinson, Pietro Perona.
5
La correction des trajectoires est possible grâce à FixErrors Matlab GUI qui nécessite une version de Matlab (payant) équivalente ou supérieure
à 2008a. Une licence pour Matlab Image Processing Toolbox et Matlab Statistics Toolbox sont aussi nécessaires. La correction manuelle ne
fonctionne que partiellement sur les équivalents gratuits de Matlab.
49
Pour ceux qui ne disposent pas de possibilité de corriger le tracking obtenu automa-
tiquement, il est nécessaire en cas de problème d’affiner les réglages et de recommencer
l’analyse intégralement, ce qui peut, à la longue, représenter une perte de temps.
1.2 Présentation de la solution retenue : Ethovision XT®

(Noldus, The Netherlands)
Ethovision XT est un logiciel qui permet à la base de ne suivre qu’un seul individu
(single-object). Cependant, il est possible d’acheter différents modules complémentaires
qui pourront permettre par exemple :
– de suivre plusieurs arènes en même temps (jusqu’à 96, module Multiple arenas) ;
– de suivre théoriquement jusqu’à 16 individus simultanément par arène à condition
qu’ils soient identifiés d’une marque de couleur visible sur l’image (module Social
interaction) ;
– de suivre plusieurs individus en trois dimensions (à l’aide de deux caméras synchro-
nisées) ;
– d’obtenir plusieurs points par individus (par exemple un point pour la tête et un
point pour la queue ou le centre de masse) afin de calculer l’orientation de l’individu
(module Multiple body points).
La présentation qui suit concerne la version XT 7.1 du logiciel Ethovision avec les
modules Multiple arenas, qui permet de suivre plusieurs arènes simultanément, et Social
interaction, qui permet de suivre plusieurs individus situés dans la même arène (théori-
quement jusqu’à 16). Ces deux modules sont cumulatifs : il est donc possible de suivre
simultanément plusieurs arènes contenant chacune plusieurs individus.
1.2.1 Les options de base
Le choix du nombre d’arènes Dans Ethovision, une arène est une surface qui va être
analysée de manière indépendante. Il est possible d’en définir d’une à cent par vidéo, et
de les analyser de manière indépendante et simultanée. Ainsi, il est possible par exemple
de filmer plusieurs aquariums simultanément et de définir chacun d’eux comme étant une
arène, de même avec une plaque de 96 puits où chacun des puits contient une larve de
poisson.
Le choix du nombre d’individus à suivre par arènes Chaque arène peut contenir de
un à seize individus maximum. Cependant, pour être suivis, les individus doivent être mar-
50
qués individuellement. Cette option est plus largement discutée dans la partie 1.4.1 Avan-
tages et limitations du video tracking automatique, p. 54.
Le choix du centre de masse Plusieurs possibilités s’offrent à l’utilisateur pour la prise

en compte du centre de masse des individus suivis :
– par le centre de masse de la surface détectée : il s’agit d’un calcul du barycentre de
la surface détectée par le logiciel.
– par une marque de couleur placée sur l’individu : lorsque les individus ont été mar-
qués, la marque peut servir de centre de masse.
Le choix de la source d’image Plusieurs options sont là aussi sélectionnables concer-

nant la source de l’analyse :
– analyse en temps réel (live tracking) : en reliant la caméra directement à un ordina-
teur muni d’Ethovision, il est possible d’obtenir un tracking en temps réel.
– analyse en temps réel tout en sauvegardant la vidéo : comme précédemment, mais
en plus de l’analyse une vidéo est sauvegardée, ce qui permet de re-visualiser les
données du tracking et d’être en mesure de corriger les éventuelles erreurs manuel-
lement, voire de ré-effectuer une analyse complète en modifiant les paramètres.
– analyse depuis une vidéo préalablement enregistrée, que ce soit par Ethovision ou
un autre logiciel.
1.2.2 L’utilisation des zones
Il est possible de sub-diviser une arène en différentes zones d’intérêt. La détermination

des zones se fait de manière très simple en utilisant des outils de dessins classiques :
cercles, rectangles, segments etc. Ceci va permettre de calculer les différentes variables
(temps de présence, vitesse moyenne, temps d’immobilité, nombre d’entrées, de sorties,
etc.) pour chaque zone et donc d’affiner l’analyse spatiale. Il est aussi possible de créer des
zones cachées (Hidden zones) qui permettront d’indiquer au logiciel les zones de refuge :
lorsque l’individu disparait autour de cette zone, c’est qu’il se trouve dans le refuge (ceci
permet d’éviter que le logiciel ne cherche en vain l’individu sur l’écran en créant des
artéfacts d’analyse).
1.2.3 Le choix de la méthode de détection
Ethovision dispose de plusieurs méthodes permettant d’isoler le ou les individus à

suivre sur la vidéo.
51
Détection par niveaux de gris (Gray scaling) La vidéo est convertie en monochrome et
l’utilisateur va pouvoir sélectionner un seuil de niveau de gris minimal et un seuil maximal
correspondant à l’individu à suivre. Cette technique n’est utilisable que si l’individu à
suivre et le fond de l’image sont très contrastés et demande qu’aucun autre élément de la
vidéo ne soit d’une couleur située dans la gamme de gris sélectionnée pour enregistrer les
déplacements de l’individu.
Détection par soustraction statique du fond (Static substraction) Le logiciel va utili-

ser une image de référence sans le ou les individus à suivre. Ensuite, pour chaque image
de la vidéo à analyser, il va soustraire l’image de référence à l’image actuelle : les pixels
qui sont différents de l’image de référence sont considérés comme étant l’objet à suivre
(Fig. 23).
Figure 23 – Illustration du traitement d’image par soustraction statique pour

ne laisser que les objets à détecter.
Une fois les sujets isolés, il est possible d’affiner la détection en jouant sur différents
paramètres :
– les niveaux de gris : en ajustant les valeurs de niveau de gris il est par exemple
possible d’éliminer les ombres des individus ;
– la taille maximale / minimale des individus à suivre : permet d’éliminer certaines
particules qui peuvent être présentes dans l’eau et mobiles (et donc potentiellement
détectables par le logiciel) comme les fèces par exemple. Ceci peut aussi permettre
d’éliminer le bruit de fond dû à la compression numérique et/ou à un mauvais éclai-
rage qui peut former une sorte de neige sur la vidéo qui peut altérer la qualité du
tracking ;
L’avantage de cette technique est qu’elle est beaucoup plus discriminante que la dé-
tection par niveau de gris. L’inconvénient majeur est que toute différence entre l’image
à analyser et l’image de référence sera détectée comme étant l’individu à suivre. Ainsi,
52
le bac d’expérimentation et la caméra doivent être parfaitement stables. De même, toute

bulle ou particule dans l’eau (comme des fèces par exemple) peuvent être détectés comme
un individu à suivre).
Détection par soustraction dynamique (Dynamic substraction) Cette méthode est ba-
sée sur la précédente (la soustraction statique), mais avec cette technique, l’image de ré-
férence va être constamment mise à jour par rapport aux précédentes images. Ceci est
particulièrement pratique dans le cas où l’environnement n’est pas statique (bulles, cou-
rant, etc.) et permet ainsi de retirer les éléments mobiles de la vidéo qui ne sont pas des
individus à suivre. Cependant, dans le cas où les individus resteraient trop longtemps
immobiles (ce qui peut arriver avec les soles, par exemple) ceux-ci vont peu à peu être
considérés comme faisant partie du fond et ne plus être détectés.
Détection par différenciation (Differencing) Cette méthode est une autre forme de dé-
tection dynamique, mais le rafraichissement de l’image de référence se fait sur l’ensemble
des images de la vidéo, avec un coefficient de pondération plus fort sur les dernières
images. Le problème des individus immobiles pendant une longue période de temps per-
siste cependant.
1.3 Le calcul des variables
Il est possible de choisir différentes variables comme : le temps de mobilité, la vi-

tesse, la distance parcourue, la vitesse angulaire, la sinuosité du déplacement, etc. Une
fois les variables d’intérêt sélectionnées, elles sont par défaut calculées pour la totalité
du temps d’expérimentation et pour toute l’arène. En utilisant un système graphique et
intuitif de boîtes, il est possible de demander au logiciel d’affiner le calcul pour obtenir
les valeurs moyennes des variables sélectionnées par zones et/ou par intervalles de temps
personnalisés, en plus de l’analyse globale. Ethovision permet donc d’obtenir des résul-
tats sub-divisés dans l’espace et dans le temps, à condition de paramétrer correctement
l’analyse que l’on veut réaliser.
53
1.4 Les avantages et limitations du video tracking et leurs

prises en compte dans les méthodes d’analyse rete-
nues
1.4.1 Avantages et limitations du video tracking automatique
Par définition, l’un des premiers avantages du video tracking automatique est son au-
tomatisation. Lorsqu’un logiciel de ce type est stable, bien maîtrisé, utilisé correctement
(c’est-à-dire en accord avec la philosophie de sa conception) et que des moyens matériels
ont été mis en œuvre pour assurer une bonne qualité d’acquisition vidéo, celui-ci permet-
tra un gain de temps considérable et une qualité d’analyse proche de la perfection sur les
paramètres choisis. Cependant, le moindre écart, que ce soit au niveau du paramétrage ou
de la qualité de la source peut avoir des conséquences non négligeables sur la qualité des
données obtenues, et donc remettre en cause les conclusions d’une étude toute entière.
Les paramètres à contrôler impérativement au niveau de la prise de vue sont les sui-
vants :
– la caméra doit avoir une résolution permettant de discerner correctement les indivi-
dus à suivre (taille supérieure à 2 pixels) ;
– la compression numérique utilisée pour l’enregistrement doit permettre de conserver
la bonne qualité d’acquisition de la caméra ;
– l’objectif utilisé doit déformer le moins possible l’image afin limiter toute approxi-
mation des distances lorsque les individus se déplacent sur les bords de l’image ;
– de même, les vues en perspective, trois quarts ou autre contre-plongée renforcent
l’approximation des distances en fonction de la position de l’individu ;
– la caméra, la source d’éclairage (qu’elle soit infra-rouge ou visible) ainsi que les
bacs d’expérimentation ne doivent idéalement pas être déplacés d’un enregistrement
à l’autre pour éviter d’avoir à reparamétrer systématiquement la zone d’étude, la
calibration des distances, l’image de référence, etc. ;
– idéalement, le fond de l’image doit être au le plus homogène possible, et les in-
dividus à suivre ne doivent pas paraître plus sombres que le fond à un endroit de
l’écran puis plus clairs que le fond à un autre (la détection se faisant généralement
par contraste) ;
– la source lumineuse (quelle soit infra-rouge ou visible) doit être suffisante pour li-
miter le bruit de fond qui peut apparaître en cas de sous-éclairage et qui peut créer
un pseudo-mouvement du centre de masse d’individus pourtant immobiles ;
– aucune variation de la qualité d’image ne doit apparaître au long de la vidéo, que
ce soit au niveau de la source lumineuse (quelle soit infra-rouge ou visible) ou de la
54
caméra (comme de la buée qui se forme sur l’objectif dans des salles trop humides) ;
– aucun autre objet ou ombre ne doit être en mouvement dans la zone d’étude autre
que l’individu à suivre : les systèmes de bullage ou les circuits d’eau qui pourraient
créer des bulles à la surface de l’eau doivent donc être coupés le temps de l’expéri-
mentation ou alors limités (en injectant par exemple l’oxygène directement dans un
flux d’eau, qui va lui-même être injecté sous la surface de l’eau afin d’éviter toute
turbulence) ;
– la salle où sont réalisés les enregistrements doit idéalement être dédiée à cette unique
fonction, isolée de toute perturbation et doit avoir des systèmes indépendants de
thermorégulation et d’éclairage.
Lorsque l’ensemble de ces paramètres sont correctement respectés, les vidéos peuvent
généralement être analysées sans grande difficulté par la majorité des logiciels de video
tracking automatiques.
Un autre paramètre important à prendre en compte est le fait que les poissons évoluent
naturellement en trois dimensions, mais l’enregistrement vidéo à partir d’une seule caméra
ne permet quant à lui de ne prendre en compte que deux de ces trois dimensions (Fig. 24).
Distance parcourue réelle (en
Caméra en trois dimensions)
vue zénithale
Composantes de la trajectoire
prises en compte (axe X et Y)
Composante de la trajectoire
non prise en compte (axe Z)
2D Y
X
Z
Z
Z
X
Y
Trajectoire parallèle au plan de la Trajectoire non parallèle au plan de
caméra : Pas d’approximation la caméra : Approximation
Figure 24 – Illustration de l’interprétation de déplacements en 3D dans le plan

bidimensionnel d’une caméra.
Dans des conditions d’élevage traditionnelles, la profondeur des bassins ne permet
55
pas aux individus de nager selon une trajectoire parfaitement verticale, mais les poissons
peuvent tout de même nager en avançant « vers le haut » ou « vers le bas » (2.5D). Ainsi,
en plaçant la caméra au-dessus du bassin (vue zénithale), l’approximation se fera sur la
composante verticale, qui est naturellement plus limitée. Ensuite, pour restreindre encore
plus l’approximation sur l’axe vertical, il est préférable de diminuer la hauteur d’eau dans
les bassins d’expérimentation, ce qui permet dans le même temps d’augmenter le rapport
surface-volume, facilitant ainsi les échanges gazeux entre l’air et l’eau. Il est de cette façon
possible de garder des bonnes conditions d’oxygénation de l’eau sans avoir à recourir à
un système de bullage qui pourrait perturber l’analyse.
D’une manière générale, les nécessités techniques doivent aussi s’adapter aux besoins
de l’espèce étudiée pour arriver à une situation de compromis, qui permet à la fois d’as-
surer des conditions les moins stressantes possibles pour les individus suivis et une qua-
lité d’analyse optimale. L’analyse automatique des trajectoires d’individus isolés est donc
quelque chose de tout à fait réalisable et les résultats obtenus de nos jours sont très sa-
tisfaisants. Cependant, la transition de l’analyse individuelle à celle du groupe n’est pas
encore complètement assurée sur le modèle poisson.
Lorsque l’on veut suivre plusieurs poissons en même temps, même en limitant le ni-
veau d’eau, ceux-ci vont pouvoir se croiser parfaitement. Les erreurs d’échange d’identité
en cas de croisement des individus sont communes à tous les logiciels permettant de faire
du multi-object tracking sans marquage qui ont pu être testés durant ces trois années de
thèse (Tab. 1). Les erreurs d’interprétation couramment observées par les logiciels sont
illustrées en Fig. 25. Peu d’entre eux proposent de pouvoir corriger manuellement l’iden-
tité des individus.
De son côté, Ethovision possède le module Social interaction qui permet de suivre
plusieurs individus dans une même arène. Pour éviter toute confusion en cas de croise-
ment, les concepteurs ont pensé à une méthode simple : mettre une marque de couleur sur
chaque individu afin de retrouver sans erreur « qui est qui » après chaque croisement.
La limitation est fixée à 16 individus. Cependant, cette limite est très théorique car elle
suppose de trouver 16 couleurs parfaitement distinguables sur la vidéo, ce qui est loin
d’être une chose aisée. Ce logiciel étant à la base conçu pour analyser le comportement
des souris, il suffit de mettre une tâche de couleur sur le dos des individus de cette es-
pèce pour les identifier et donc ce type de marquage n’implique pas d’altération de la
locomotion. Chez le poisson cependant, marquer les individus avec de la couleur est plus
complexe. En effet, ceci implique soit d’injecter de l’encre sous la peau (ce qui peut ame-
ner à la formation de kystes puis de rejet) ou alors de suturer une perle de couleur sur leur
dos. Le marquage par une perle de couleur de 0.8 g suturée au niveau de la nageoire dor-
sale a été effectué par Jadot et al. (2005) sur de relativement gros poissons (Sarpa salpa,
56
Figure 25 – Les trajectoires possibles des poissons et les erreurs d’interpréta-

tions des logiciels de video tracking, d’après Delcourt et al. (2009). Les traits
verts représentent les trajectoires réelles, les traits rouges représentent les er-
reurs couramment observées dans les logiciels de video tracking multi-object.
22.3 ± 2.85 cm). Ce marquage a nécessité une anesthésie (2-phenoxy-éthanol, 0,2 ml.l-1 )
ainsi qu’une période de 36 h de récupération et seuls deux poissons en même temps ont
été filmés. De même, Ylieff et Poncin (2003) ont mesuré la nage en groupe de trois indi-
vidus en utilisant le marquage perle chez la castagnole (Chromis chromis) ou en utilisant
les différences de couleurs inter-individuelles naturelles chez le poisson rouge (Caras-
sius auratus, rouge ou blanc). Dans le cas de petits poissons comme le poisson zèbre, il
semble cependant difficile d’obtenir un marquage non traumatisant et suffisamment vi-
sible à la caméra pour que les individus soient correctement discriminés par le logiciel :
l’utilisation d’encre ou de perles trop petites ne permettrait pas une bonne discrimination
à l’image, alors qu’une perle trop grosse pourrait altérer la locomotion, qui est pourtant
le critère qui devait initialement être étudié. De plus, les poissons sont très sensibles à la
couleur de leurs congénères (Gerlai et al., 2009) : l’utilisation de marques de couleur peut
donc potentiellement altérer le comportement social, ce qui encore une fois est un pro-
blème lorsque le but premier de l’expérience était d’observer la locomotion en groupe. En
effet, les conséquences comportementales du marquage par perle de couleur sur le com-
portement locomoteur ou social des individus n’a pas été testé par Ylieff et Poncin (2003)
ou Jadot et al. (2005).
Ethovision permet maintenant d’utiliser le module Social interaction sans l’utilisation
57
de marques externes. Ce mode est encore expérimental et régulièrement, lorsque des indi-
vidus de même taille se croisent, se touchent ou simplement sont trop près l’un de l’autre,
le logiciel perd l’identité des poissons. L’exemple donné en Fig. 26 montre clairement un
cas d’échange d’identité entre deux individus.
Figure 26 – Exemple d’échange d’identités entre deux poissons par le module

Social interaction du logiciel Ethovision utilisé sans marque externe. A et
B : Les deux poissons sont tout d’abord correctement détectés (individu 1 en
rouge et individu 2 en jaune). C : Ils sont ensuite confondus comme un seul
individu au moment où ils se croisent (individu 1 en rouge, individu 2 perdu
en gris). D : Le logiciel reconnaît bien deux individus, mais leurs identités
ont été échangées par rapport au début de la séquence analysée (individu 1
en jaune et individu 2 en rouge). Extrait provenant d’une vidéo d’exercice
fournie par Noldus.
Comme précisé précédemment, ce mode est expérimental et la philosophie de Noldus

vis-à-vis de l’utilisation du module Social Interaction est d’utiliser des marques de couleur
externes pour éviter ce type d’erreurs. Cependant, comme cette option est maintenant
disponible pour tout utilisateur, il paraît nécessaire de la discuter afin d’éviter toute erreur
d’analyse.
Tout d’abord, les échanges d’identité n’altèrent en aucun cas une partie des variables
analysées, comme la présence ou non dans une zone ou encore la distance inter-individuelle
moyenne. De même, dans le cas ou l’étude se base sur la différence de comportement d’un
groupe appartenant à une condition donnée par rapport à un groupe d’une autre condition,
l’étude de la distance parcourue par groupe reste une variable valable, même s’il y a eu
par moment des échanges d’identité entre individus.
La limite apparaît lorsque l’on s’intéresse aux variables individuelles, et surtout à leurs
variations. La Fig. 27 illustre un cas théorique très simple : dans le cas où deux individus
sont suivis, si l’un est quasiment immobile pendant l’ensemble de la séquence analysée,
et l’autre est au contraire très mobile et croise son congénère régulièrement, provoquant
58
une ou plusieurs situations d’échange d’identités, les moyennes de distance parcourue ne

diffèrent pas avec l’erreur induite par les inversions d’identité, mais les variations asso-
ciées sont différentes (les échanges d’identité gommant la variation individuelle naturelle).
Cette altération par rapport à la situation réelle est un vrai problème pour le calcul statis-
tique.
35
Individu A Individu B Moyenne
31
30
Distance en cm (± erreur-type)
25
20
17
16 16
15
15
10
5
1
0
Distance parcourue réelle Distance parcourue calculée par le
logiciel (après un ou plusieurs échanges
d'identités entre les individus)
Figure 27 – Illustration d’un cas théorique d’erreur de la variation inter-

individuelle de la distance parcourue due à une inversion d’identité des in-
dividus suivis.
Ethovision propose dans son menu d’édition (Track Editor) de pouvoir corriger ma-
nuellement l’identité des individus. Cette correction peut cependant être très lourde à
mettre en place car elle nécessite de revisualiser chacune des vidéos et de vérifier chaque
croisement.
Afin de limiter les erreurs d’identification lors de l’utilisation du module Social inter-
action sans utiliser de marques externes, il convient donc :
– de n’utiliser que deux (maximum trois) individus simultanément ;
– de prendre des individus de taille bien différentes et d’enregistrer la taille de chaque
individu dans les paramètres de détection ; cependant, tout comme l’utilisation de
marques externes, l’utilisation d’individus de tailles différentes peut elle aussi biaiser
les relations sociales.
Même avec de très bons logiciels, capables de prendre en compte les trajectoires in-
dividuelles avant et après croisement afin de retrouver l’identité des individus, il restera
toujours très difficile d’obtenir des résultats fiables à cause des limitations de la représen-
tation en deux dimensions. Pour palier à ceci, un premier système a été mis en place par
59
Beeuwkes et al. (2008) afin de pouvoir filmer le vol de moustiques (qui ont eux aussi un
déplacement très complexe dans les trois dimensions). Ce système utilise deux caméras
différentes dont les axes forment un angle de 40°. Un module Ethovision supplémentaire a
été mis en place (maintenant commercialisé sous le nom de Track3D, Spitzen et al. 2008).
Le dispositif mis en place est représenté en Fig. 28.
Figure 28 – Dispositif mis en place par Beeuwkes et al. (2008) pour analyser
la trajectoire d’un individu en trois dimensions et commercialisé sous le nom
de Track3D (Spitzen et al., 2008). Les deux caméras sont placés selon un
angle de 40°.
Un dispositif similaire a été mis en place par Delcourt et al. (2011) afin d’analyser les
trajectoires de quatre poissons simultanément avec des marques de couleur (Fig. 29). Bien
que ces systèmes soient encore relativement confidentiels, l’utilisation de deux caméras
donne pour l’instant des résultats très fiables (Beeuwkes et al., 2008; Spitzen et al., 2008;
Delcourt et al., 2011). À terme, c’est certainement par cette approche qu’il sera possible
de réaliser des video tracking de plusieurs individus non marqués en limitant les risques
d’inversion d’identité.
Obtenir une analyse de type video tracking automatique sur des groupes d’individus
non marqués permettrait d’obtenir des moyennes individuelles de distances, vitesses, mo-
bilités, etc. Cependant, d’autres paramètres peuvent être extraits pour l’analyse de la nage
en groupe sans qu’il soit nécessaire d’identifier les individus tout au long de l’analyse.
Ces variables sont :
– la répartition des individus ;
– la distance inter-individuelle pour chaque image donnée.
60
La section 2.2 HeatMap From Stack : plugin pour le logiciel ImageJ servant à l’analyse
de la répartition spatiale en groupe, p.80 du Chapitre 2 présente l’une de ces techniques
d’analyse.
Figure 29 – Dispositif mis en place par Delcourt et al. (2011) pour analyser
la trajectoire de quatre individus simultanément en trois dimensions à l’aide
de marques de couleur. Les marques étant des VIE fluorescentes, l’éclairage
utilisé est une lampe U.V.. Les deux caméras sont placées selon un angle de
90°.
1.4.2 Les méthodes choisies
Bien qu’elle soit a priori plus exigeante, la méthode de soustraction statique est celle
qui a été retenue pour l’ensemble des analyses effectuées. En effet, avec l’algorithme de
soustraction dynamique, les individus immobiles depuis trop longtemps avaient tendance
à être perdus de l’analyse car « imprimés » sur l’image de référence au fur et à mesure
du temps. La caméra a été solidement fixée au plafond afin d’éviter tout décalage ou
mouvement pendant l’analyse ou entre la capture de l’image de référence et celle de la
vidéo à analyser. Avant chaque début d’analyse, l’image de référence a été capturée par le
logiciel avant de placer les individus à suivre. Pour éviter la perte de l’image de référence
(soit par une mauvaise manipulation, soit par une erreur menant à la corruption du fichier
d’analyse), une courte vidéo de quelques secondes du dispositif sans les individus à suivre
a été systématiquement prise afin de pouvoir ré-extraire facilement une image de référence
a posteriori en cas de problème.
61
1.5 Mise en place du matériel
Afin d’obtenir des conditions d’acquisition optimales, une salle a été dédiée aux ex-
périmentations comportementales vidéo. Cette salle est située dans un sous-sol dans un
endroit peu passant du laboratoire, dispose d’une isolation phonique et thermique, et ne
dispose d’aucune fenêtre. L’éclairage et la température sont donc ajustés en fonction des
besoins expérimentaux. Cette salle a été équipée initialement d’une caméra couleur Pa-
nasonic CCTV WV-CL920A, d’un plancher infra-rouge (Noldus, The Netherlands) et de
spots halogènes (Philips 80 W, Fig. 30-A). Pour éviter que les bacs expérimentaux ne
reposent directement sur le plancher infra-rouge, un support en PVC expansé 1 et poly-
méthacrylate de méthyle 2 transparent a été construit : le plancher infra-rouge glisse sous
ce support et diffuse les rayons infra-rouge au travers de la plaque de polyméthacrylate
de méthyle transparent. Le système est étanche et peut contenir jusqu’à 200 l pour servir
directement de bac expérimental pour les gros poissons, sans risquer d’altérer le système
infra-rouge.
Les équipements ont peu à peu évolués afin d’obtenir des conditions optimales. Le
changement notable est l’achat d’une caméra monochrome Ikegami. En effet, les camé-
ras monochromes sont beaucoup plus sensibles aux rayonnements proches infra-rouge
que les caméras couleurs. La caméra couleur Panasonic CCTV WV-CL920A a donc été
remplacée par une caméra monochrome Ikegami ICD-48E munie d’un filtre Fujinon 2.7-
13.5 mm (F1.3 CS).
En plus de la camera, a été acheté un filtre dit Visible block / Infra-red pass (The Ima-
ging Source, Ref. 092) qui permet de ne laisser passer que les rayonnements au-delà de
700 nm (proche infra-rouge). Les éclairages halogènes émettant beaucoup dans l’infra-
rouge (et donc n’étant pas occultés par le filtre), ont eux aussi été changés au profit de
spots à diodes (Philips MASTER LEDspot PAR 38 - 2700 K, 16 W). En plus d’être plus
économiques et d’avoir une durée de vie plus longue, ces spots n’émettent pas de rayon-
nement dans l’infra-rouge (Fig. 31). Ces spots sont dits Warm white : contrairement à
des spots à diodes classiques qui ont tendance à donner une lumière bleuâtre, ces spots
ont un premier pic d’émission dans le spectre de couleur bleu, et un second pic plus im-
portant dans le spectre de couleur jaune-orangé, ce qui leur confère une température de
couleur équivalente à celle de lampes à halogènes (2700 K, Fig. 31), plus conforme avec
l’éclairage de la salle d’élevage.
L’élimination de la lumière visible des spots par le filtre pour ne garder que l’éclai-
rage provenant du plancher infra-rouge permet avant tout de s’affranchir des problèmes
1. Commercialisé sous le nom de Komacel ou Komatex.
2. Cette matière est un thermoplastique transparent aux rayons infra-rouge. Elle est commercialisée sous
différents noms comme Plexiglas, Altuglas, Lucite, Optix (Plaskolite), Crystalite ou Perspex.
62
A B
2009-2010 Depuis 2011
PC PC
Noldus Noldus
Caméra couleur Caméra monochrome

Panasonic Ikegami
Spots Spots Spots à Spots à
halogènes halogènes diodes diodes
Filtre
Journée Nuit Journée Nuit
Plancher infra-rouge Plancher infra-rouge
Figure 30 – Représentation schématique du dispositif expérimental d’acqui-

sition vidéo ; A : en 2009-2010, pendant la journée, seuls les spots halogènes
permettent à la caméra couleur Panasonic de filmer les poissons ; la nuit, les
spots sont éteints et c’est le plancher infra-rouge qui permet de voir les pois-
sons sur la vidéo ; B : depuis 2011, un filtre a été placé sur la caméra mo-
nochrome Ikegami permettant d’éliminer le rayonnement des spots à diodes ;
de jour comme de nuit, seul l’éclairage par le plancher infra-rouge permet
de filmer les individus, l’éclairage à diodes servant uniquement à assurer la
photopériode des poissons.
d’ombres, de reflets et de réglages de niveaux de gris. En effet, pour les expériences faites
le jour, la source d’éclairage était avant uniquement celle des spots halogènes, qui pou-
vaient créer à la fois une ombre projetée des individus dans le fond de leurs bacs ou encore
des reflets de lumière à la surface de l’eau. Les reflets de lumière pouvaient apparaître lors-
qu’un individu se déplaçait très rapidement, créant des ondulations à la surface de l’eau
qui reflétaient la lumière des spots lumineux. Ces reflets ondulant avec l’eau et n’étant
pas présents dans l’image de référence, ils pouvaient être considérés comme l’individu à
suivre. Ces deux problèmes potentiels (ombres et reflets) pouvaient être corrigés en ajus-
tant correctement Ethovision, mais les réglages devaient parfois être très fins et précis pour
obtenir un résultat satisfaisant. Avec le nouveau dispositif, le fait de placer les individus à
suivre entre la source lumineuse unique (le plancher infra-rouge) et la caméra (Fig. 30-B)
permet de beaucoup mieux faire ressortir les individus à suivre par contraste, sans risque
d’ombre ou de reflet : même un individu blanc apparaîtra de couleur sombre à l’image (par
« ombre chinoise »). Ceci permet de garder des réglages Ethovision équivalents pour tous
63
Bloqué par le filtre

re Non Bloqué par le filtre
Plancher
infra-rouge
Spots à diodes
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
Ultra-
violet Spectre visible Infra-rouge
Longueurs d’ondes (nm)
Figure 31 – Fonctionnement du filtre Visible block / IR pass. Le filtre bloque

tout rayonnement émis dans des longueurs d’ondes visibles (< 700 nm, donc
celui des spots à diodes) et laisse passer les rayonnements à partir du proche
infra-rouge (> 700 nm, donc celui émis par le placher infra-rouge).
les individus, peu importe leur couleur. De plus, avant la mise en place de ce dispositif, il
était nécessaire d’utiliser des réglages de contrastes et luminosité spécifiques pour le jour
et d’autres pour la nuit, et donc d’être présent pour changer ces réglages manuellement au
moment de chaque extinction ou allumage des spots (22h30 et 8h30 pour les expériences
sur le poisson zèbre, 21h00 et 9h00 pour la sole). Depuis, il est possible de filmer en
continu car l’allumage et l’extinction des spots n’ont aucun effet sur les réglages de l’ac-
quisition vidéo. Au-delà du confort de l’expérimentateur, ceci a surtout permis d’obtenir
des fichiers enregistrés en continu (le changement de réglages demandait une interruption
de quelques secondes). Cependant, comme le changement de lumière n’est plus visible à
l’image, il convient de vérifier régulièrement si l’horloge réglant la photopériode est tou-
jours fonctionnelle et bien synchrone avec le dispositif d’enregistrement.
En plus de la salle d’expérimentation dédiée aux juvéniles et adultes, un autre dispo-

sitif a été mis en place spécifiquement pour l’analyse du comportement locomoteur des
larves de poissons zèbres. Ce dispositif, ainsi que le protocole mis en place pour son bon
fonctionnement, sont présentés dans la section suivante.
64
1.6 Mise en place du protocole de challenge lumineux pour

les larves de poisson zèbre
1.6.1 Bref état de l’art
De nombreuses études se basent sur l’étude du comportement locomoteur du poisson

zèbre où de sa mise en place (Granato et al., 1996; Drapeau et al., 2002; Brustein et al.,
2003; Watkins et al., 2004; Winter et al., 2008a,b; MacPhail et al., 2009; Irons et al.,
2010; Zellner et al., in press). Certaines approches se sont montrées novatrices, comme
Prober et al. (2006) et Blin et al. (2008) utilisant les plaques multi-puits pour enregis-
trer le comportement locomoteur de plusieurs individus en même temps ou MacPhail
et al. (2009). Cependant, aucun challenge précis permettant de diagnostiquer rapidement
un grand nombre d’individus n’existe encore. La notion de challenge peut potentielle-
ment renforcer les différences entre deux conditions, en laissant apparaître des différen-
ciation dans l’acclimatation ou la récupération. Dans le cas d’analyse automatique par
video tracking, un changement brutal de lumière n’induira qu’une courte perturbation
pendant quelque images. L’utilisation de la lumière comme stresseur permet d’avoir un
stimulus facilement répétable et stable d’une expérience à l’autre. Cependant, comme le
montre la Fig. 32 (MacPhail et al., 2009), bien que le challenge soit identique pour chaque
changements lumineux, la réponse comportementale, quant à elle, varie et est plus forte
sur les premiers tests puis la réponse diminue dans le temps.
Cette figure pose cependant la question suivante : la réponse diminue-t-elle à cause
de l’heure de la journée ou à cause de la multiplicité des test ? Un autre test réalisé par
(MacPhail et al., 2009) est présenté en Fig. 33 avec des périodes d’obscurité de 10 min
toutes les 10 min. Contrairement aux résultats de la figure 32, l’activité dans la première
phase d’obscurité est beaucoup plus faible que dans les suivantes.
La mise en place d’un protocole de challenge lumineux nécessite donc certains tests
préliminaires afin de s’assurer de la stabilité du protocole. Cette étude a donc pour but
de présenter un protocole court, stable et répétable utilisant les variations de lumière afin
d’induire une réponse locomotrice chez des larves de poissons zèbre.
1.6.2 Matériel mis en place
Une boîte à lumières permettant de filmer des plaques multi-puits a été construite au
sein de notre laboratoire (Fig. 34).
Cette boîte se trouve dans une salle dont la fenêtre a été condamnée afin de permettre
de contrôler au mieux les changements lumineux. L’ensemble de la salle est chauffé à 28
65
Figure 32 – Distance parcourue pendant 5 minutes dans le noir (infra-rouge)

en fonction de l’heure de la journée, MacPhail et al. (2009). Les données
sont présentées sont des moyennes ± erreurs-type pendant les 5 minutes de
challenge dans le noir réalisés toutes les 30 minutes. Les lettres représentent
les différences statistiques.
Figure 33 – Distance parcourue pendant 10 minutes pendant une série d’ex-

tinctions et d’allumage d’éclairage par phases de 10 min, MacPhail et al.
(2009). Les données sont présentées sont des moyennes ± erreurs-type ob-
tenues toutes les 2 min.
°C et les expérimentations se déroulent lumière éteinte. De son côté, la boîte ferme de

manière hermétique de façon à éviter tout apport de lumière non contrôlé (par exemple dû
à l’écran de l’ordinateur servant à la capture vidéo).
66
Figure 34 – Photo de la boîte à lumière mise en place pour l’analyse du com-

portement locomoteur des larves de poissons zèbres. Le dispositif permet de
filmer une plaque multi-puits et d’appliquer des stress lumineux en alternant
lumière visible et lumière infra-rouge grâce à un interrupteur.
Basée sur le système mis en place pour les adultes, cette boîte possède un socle en
Plexiglas diffusant qui peut être éclairé soit par de la lumière visible (spot à diode clas-
sique) soit par des rayons infra-rouges. Le changement d’une source lumineuse à l’autre
se fait par un interrupteur. Bien que l’éclairage par diodes ne dégage pas de chaleur, le
culot des spots de lumière visible ou infra-rouge ont tendance à chauffer (car ils sont com-
posés de résistances), tout comme le boîtier de la caméra. C’est pour cette raison qu’ils
ont été placés en dehors de l’enceinte hermétique, afin d’éviter que la température n’aug-
mente dans la boîte pendant les tests. La caméra a été placée à une hauteur permettant à
la fois d’obtenir une bonne résolution d’image (pour que les larves soient correctement
détectées par le logiciel Ethovision) et une faible distorsion sur les bords de la plaque.
Pour éviter que les larves ne puissent se voir d’un puits à l’autre, les premières plaques
24 puits transparentes utilisées ont été modifiées afin que chaque larve soit visuellement
isolé des autres, puis d’autres plaques 24 puits en plastique blanc opaque ou seul le fond
est transparent ont été achetées. Tout comme dans l’étude de MacPhail et al. (2009), les
larves ont été testé à 5 dpf . La veille de l’expérience, les larves sont sorties de l’enceinte
thermostatée (28°C, photopériode 14 :10) et transférées de leur boîte de Petri à la plaque
24 puits et retourne dans l’enceinte thermostatée pour la nuit. Le jour de l’expérience,
chaque plaque est transférée 1 h avant le début de l’enregistrement dans la salle d’expé-
rimentation pour être placée sur un plateau lumineux qui pour une heure d’acclimatation.
67
Dans un premier temps, le nombre de changements lumineux ainsi que leur durée ont
été réduits ; en gardant les 5 min de stress (comme utilisé en Fig. 32) afin d’avoir une
expérience rapide. Les poissons étant soumis à une photopériode dès les premiers stades
(l’enceinte thermostatée possédant son propre cycle de lumière), il semble plus logique de
commencer par une première période de lumière (servant de d’auto-contrôle pour chaque
lot de larve) puis d’induire ensuite le ou les changements lumineux vers l’obscurité. De
même, finir par une phase lumineuse permettrait de contrôler si l’activité locomotrice
revient à son niveau initial.
1.6.3 Mise en place du protocole
La première expérience qui a été réalisée a consisté à alterner 5 min d’obscurité toutes
les 5 min (Fig. 35).
14
Distance parcourune en cm pour 30 s
12
(moyenne ± erreur-type)
10
0
-1:30:00 00:00:00 00:55:00 2:30:00
Temps (hh:mm:ss)
Figure 35 – Locomotion moyenne de larves de poissons zèbres (5 dpf) avant,

pendant et après une série d’alternance de phases de 5 min d’obscurité (infra-
rouge) et de lumière. Les rectangles grisés représentent les périodes de 5 min
d’obscurité filmées par infra-rouge, les lignes grises l’erreur type.
La Fig. 35 montre dans un premier temps que l’activité pendant l’heure et demi qui
précède la première phase d’obscurité est relativement stable et homogène (entre 4 et
6 cm parcourus chaque 30 s). Ensuite, les niveaux d’activité atteints pendant les phases
d’obscurité sont supérieurs à l’heure et demi d’activité d’auto-contrôle. Cependant, au
fur et à mesure des phases d’obscurité, la variation augmente de plus en plus (et ce dès
la deuxième phase d’obscurité). De plus, après la dernière phase d’obscurité, l’activité
68
locomotrice augmente très fortement pour atteindre des valeurs supérieures à 10 cm pour
30 s. Une heure et demi après la dernière phase d’obscurité, l’activité locomotrice n’a
toujours pas retrouvé son niveau de base et varie très fortement.
Cela signifie qu’une succession trop importante d’alternances de phases de lumière

et d’obscurité perturbe de manière importante l’activité locomotrice. Cette conséquence
peut avoir des répercutions importantes, notamment si les poissons doivent être utilisés les
jours suivants pour d’autres tests : il faut donc considérer que ce type de test peut induire
une dépense énergétique importante au cinquième jour, ce qui doit être à considérer.
Un deuxième test a été réalisé afin de savoir à la fois si l’activité locomotrice pou-
vait varier entre le matin, le début d’après-midi et la fin d’après midi, et aussi montrer
les conséquences d’une seule phase lumineuse sur l’activité locomotrice comparée à un
groupe contrôle qui ne subit pas de stress lumineux (Fig. 36).
La Fig. 36A montre que le niveau d’activité atteint pendant la phase d’obscurité est bien
supérieur au niveau de base. Après la phase d’obscurité l’activité locomotrice remonte peu
à peu pendant 30 min sans pour autant devenir plus importante que les niveaux observés
avant le stress, contrairement à ce qui a pu être observés lorsque les phases d’obscurité
ont été multipliées (Fig. 35).
La Fig. 36B montre les moyennes d’activités des groupes Contrôle et Stress par demi-
heures. Une ANOVA factorielle a été réalisée avec le moment de la journée (bloc A, B ou
C) et la condition (Contrôle ou Stress) comme facteurs fixes. Il en résulte qu’il n’existe pas
d’effet du facteur condition (F=0.321, p=0.571, df=1, N=5754), ce qui signifie qu’avant
le stress lumineux (blocs A & B), les groupes Contrôle et Stress avaient bien un niveau
d’activité comparables, et qu’après le test (bloc C) le groupe Stress a bien retrouvé un
niveau d’activité comparable au groupe Contrôle, qui n’a pas subi le stress lumineux.
Il existe cependant bien un effet du moment de la journée (F=15.995, p>0.00001, df=2,

N=5754). Bien qu’elle varie au cours, l’activité locomotrice moyenne ne passe pas du
simple au double d’un moment à l’autre de la journée.
1.6.4 Conclusion et description du protocole retenu
L’activité locomotrice de larves de poisson zèbre varie peu chez les groupes qui ne
subissent pas de stress lumineux. La variation de l’activité observée par MacPhail et al.
(2009) au cour de la journée semble donc être essentiellement due à la multiplicité des
stress lumineux. De la même manière, avec la répétition des stress, nous avons remarqué
à la fois une augmentation de l’amplitude de l’activité locomotrice, ainsi qu’une tendance
à la baisse dans le temps, mais surtout une augmentation importante de la variation asso-
69
ciée. Cette augmentation de la variation avec la multiplicité des tests peut masquer une
différence entre deux conditions et cette méthode ne semble donc pas être appropriée.
En appliquant un seul stress lumineux, les larves retrouvent rapidement une activité
comparable à des larves n’ayant pas subi de stress lumineux. Le protocole choisi est donc
le suivant :
– le soir du 4e jour post-fécondation, les larves sont placées dans des plaques multi-
puits aux parois opaques afin d’éviter qu’elle ne se voit ;
– au 5e jour, les larves sont transférée dans la salle d’expérimentation (préalablement
chauffée et éteinte) 2 h avant le début de l’expérience et placé sur un premier support
lumineux afin qu’elles s’acclimatent à la lumière venant d’un plancher ; un intervalle
de 20 min est laissé entre le transfert de chaque plaque : le test durant 15 min, ceci
permet d’avoir le temps d’intervertir les plaques et d’avoir le même temps d’accli-
matation pour chaque individu testé ;
– au moment du test, la plaque est délicatement posée dans la boîte lumineuse, l’en-
ceinte est fermée et l’enregistrement vidéo commence ;
– à 5 min, l’éclairage visible est éteint et les larves ne sont filmées que grâce à la
source infra-rouge ;
– à 10 min, la lumière visible est rallumée ;
– à 15 min, la vidéo est arrêtée.
70
12 Contrôle
A Bloc A Bloc B Stress lumineux
Erreur-Type
Bloc C
10
Distance parcourune en cm
8
0
12 Contrôle
Stress lumineux
Erreur-Type
10
Distance parcourune en cm
0
-5:00:00 -4:00:00 0:00:00 3:15:00
-1:00:00
Temps (hh:mm:ss)
5 Contrôle
B Stress
4
Distance parcourue en cm
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Bloc A Bloc B Bloc C
Figure 36 – Locomotion moyenne de larves de poissons zèbres (5 dpf) avant,

pendant et après une période de 5 min d’obscurité (infra-rouge) et de lumière.
A : Représentation de l’activité locomotrice des larves témoins (couleur bleue,
pas de stress lumineux) et de larves subissant le challenge lumineux (couleur
rouge). Le rectangle noir représente les périodes de 5 min d’obscurité filmées
par infra-rouge, le lignes pointillées l’erreur type. B : Moyennes par demi-
heures de l’activité locomotrice des larves témoins (couleur bleue, pas de
stress lumineux) et de larves subissant le challenge lumineux (couleur rouge).
71
Chapitre 2
Présentation du logiciel ODRec (Observational

Data Recorder) et du plugin Heatmap From Stack
pour le logiciel ImageJ
Pour mener certains des travaux à réaliser ou cours de cette thèse, différents outils in-
formatiques spécifiques ont dû être mis en place. Ce chapitre vise à présenter deux de ces
outils : l’application ODRec (Observational Data Recorder), logiciel permettant le co-
dage de séquences comportementales, et Heatmap From Stack, un plugin pour le logiciel
ImageJ servant à analyser la répartition spatiale de groupes d’individus à partir de vidéos
trasformées en séquences d’images. Ces deux logiciels sont téléchargeables sur le site
www.samuelpean.com. Différents résultats obtenus par le logiciel ODRec sont présentés
dans ce manuscrit. Le plugin pour ImageJ Heatmap From Stack a quant à lui été réalisé
dans le but d’analyser des séquences de nage en groupe acquises en 2009. Ces séquences
concernent des groupes de 6 poissons filmés pendant 2h30 pour 2 conditions de poissons
non contaminés et 2 conditions de poissons contaminés aux PCB pendant 250 jours. Cette
analyse de la répartition spatiale devait être complémentaire à l’analyse de la distance
inter-individuelle moyenne, obtenue par video tracking. Cependant, l’ensemble des logi-
ciels de video tracking présentés au début de cette partie ont échoué dans le traitement
de ces vidéos et l’analyse manuelle n’a pu être mise en place pendant cette thèse au vue
du temps considérable qu’il faudrait pour dépouiller toutes les vidéos (12 vidéos – 3 par
condition – de 2h30 chacune avec 6 individus sur chaque image). Heatmap From Stack
étant néanmoins fonctionnel, utilisé dans d’autres expériences (Poster en Fig. 66, Annexe
B, p. 216) et répondant en partie aux problèmes de video tracking multi-objets soulevés
plus tôt, son fonctionnement sera brièvement détaillé dans ce chapitre.
2.1 ODRec : logiciel gratuit et open source de codage de

séquences comportementales
Comme présenté dans l’introduction générale (voir section 1.2 La naissance de l’étho-
logie, p.5), l’approche par l’étude du comportement est potentiellement non-invasive et
non-intrusive (Dawkins, 2007). Ceci est d’autant plus vrai dans le cas où l’acquisition des
séquences comportementales ne se fait pas par observation directe (où la présence même
de l’observateur pourrait biaiser l’analyse, Martin et Bateson 1993) mais par enregistre-
ment vidéo. Les vidéos acquises doivent ensuite être traitées afin d’en extraire les temps
de début et de fin des séquences comportementales, selon un système de codage (Altmann,
1974).
Un bon logiciel de codage de séquences comportementales doit donc être capable d’as-
socier des noms aux différentes séquences d’intérêt, et doit aussi être capable d’en enre-
gistrer les temps de début et de fin. De plus, pour bénéficier pleinement des avantages de
l’enregistrement vidéo, l’utilisateur doit être capable de mettre la vidéo en pause, d’avan-
cer ou de revenir en arrière, ou encore d’en changer la vitesse de lecture en l’accélérant
75
ou le diminuant.
Différents logiciels existent, mais peu sont longuement maintenus à jour. Leur fonc-
tionnement n’était pas des plus adapté par rapport aux besoins de nos analyses Hetrick
et al. (1991); Tapp et Walden (1993); Tapp et al. (1995); Hänninen et Pastell (2009), ou
leur coût était très élevé par rapport à l’utilisation que nous allions en faire (The Observer,
Noldus, Noldus, 1991; Noldus et al., 2000).
2.1.1 Description du programme ODRec
Le programme ODRec est écrit en Visual Basic® , et basé sur les librairies du Lecteur
Windows Media® . Les librairies dont dépend le programme sont compatibles avec toutes
les versions du Lecteur Windows Media® des versions 7 à 11. L’utilisation de ces librairies
permet au programme ODRec de pouvoir lire tous les formats vidéo qu’est capable de
lire le Lecteur Windows Media® . Ce programme a été testé sur toutes les versions de
Windows® suivante : 98 SE, 2000 Pro, XP, Vista and 7.
Le but de ce logiciel est de fournir à l’utilisateur une interface simple et agréable,
composée d’une seule fenêtre pour pouvoir gérer à la fois :
– les séquences comportementales à coder ;
– le contrôle de la vidéo.
ODRec se base sur la pression des touches du clavier pour déclencher l’enregistrement
des séquences comportementales. Ils est possible d’enregistrer à la fois des comporte-
ments ou des évènements externes :
– les séquences comportementales longues, dont le début et la fin sont parfaitement
distincts, et pour lesquelles l’utilisateur appliquera une pression de touche pour le
début et une seconde pour la fin ;
– les comportements rapides ou les évènements courts, qui ne nécessitent qu’une seule
pression de touche pour capturer le moment de leur réalisation.
Le logiciel permet à la fois d’obtenir à la fois la capture la durée d’un comportement,
son rythme et sa fréquence.
Un autre des points importants est qu’ODRec ne nécessite aucune installation préa-
lable. Il est donc possible de le copier sur une clé USB et de l’exécuter sur n’importe quel
ordinateur fonctionnant sous Windows® , que l’utilisateur ait les privilèges administrateur
ou non. L’interface a aussi été pensée pour être compatible avec les écrans de faible réso-
lution (1024x800 pixels, comme ceux des netbooks) mais aussi étirable, afin de pouvoir
agrandir la fenêtre vidéo au maximum sur les ordinateurs possédant une résolution plus
importante. Pour le moment, seulement neuf types de séquence comportementale sont
configurables. Cette limite est essentiellement esthétique, par rapport au placement des
76
Figure 37 – Aperçu de l’interface du logiciel ODRec.
boutons, mais n’est absolument pas une limite technique. Cependant, l’ajout d’un trop
grand nombre de séquences comportementales dans ce type d’analyse peut être source
d’erreur et différents auteurs préconisent d’en limiter le nombre (Altmann, 1974; Martin
et Bateson, 1993).
2.1.2 Utilisation du logiciel ODRec
ODRec est réellement orienté sur la simplicité pour l’utilisateur. Pour lancer une ana-
lyse, l’utilisateur devra suivre différentes étapes. Tant que chaque étape n’est pas réalisée
correctement, les étapes suivantes resteront grisées, et donc non cliquables pour l’utilisa-
teur.
Étape 1 : Ouvrir un fichier La première étape consiste à cliquer sur le bouton ’Open a
video file’ et à sélectionner le fichier vidéo à analyser.
Étape 2 : Attribution des touches et acquisition Une fois qu’un fichier vidéo a été
choisi, le premier type de séquence comportementale est prêt à être configuré. Quand
l’utilisateur clique sur le champ de texte, une fenêtre s’ouvre demandant de choisir la
77
touche qui sera attribuée au déclenchement de l’enregistrement de cette unité comporte-

mentale. Cette touche peut être n’importe quelle lettre ou chiffre d’un clavier standard (de
type « AZERTY » ou « QWERTY »). L’unité comportementale doit ensuite être nommée
(les espaces et les caractères spéciaux dits non latins sont acceptés). Ensuite, si la case
Start-Stop est cochée, la première pression sur la touche attribuée lancera la capture du
début de la séquence comportementale et la deuxième pression en marquera la fin. Si cette
case n’est pas cochée, chaque pression sera enregistré indépendamment, ce qui permet de
pouvoir enregistrer les comportements soudains ou des évènements brefs de la vidéo. Le
dernier paramètre configurable est la couleur qui sera attribuée à cette séquence / évène-
ment dans le graphique final. Une fois que les paramètres obligatoires (touche du clavier et
nom) sont configurés, la deuxième unité comportementale devient à son tour configurable
et ainsi de suite jusqu’à la dernière (il est possible de passer à l’étape suivante sans pour
autant avoir neuf séquences enregistrées). Une fois que toute cette étape est correctement
réalisée, il est possible de sauvegarder l’ensemble de ces paramètres dans un fichier de
modèle en cliquant sur Save as model. Ce fichier modèle pourra être ouvert lors de l’étude
d’une autre vidéo au tout début de l’étape 2, afin d’éviter à l’utilisateur de devoir réaliser
à nouveau toute cette étape pour chaque vidéo.
Il est alors possible de commencer l’enregistrement des séquences comportementales.

La vidéo peut alors être démarrée. Il est possible, en fonction du format du conteneur de
la vidéo (*.AVI, *.MPG, *.WMV, etc.) ou du codec 1 d’accélérer la vitesse de lecture du
fichier vidéo. L’enregistrement des débuts et des fins des séquences comportementales se
fait par la capture du temps de lecture du fichier vidéo au moment où l’utilisateur presse
une touche. Ceci peut être effectué indépendamment de la vitesse de lecture du fichier vi-
déo. Ainsi, pour les séquences très lentes, le fichier vidéo peut être lu en vitesse accélérée
sans altération de la capture des séquences. À l’inverse, les séquences comportementales
rapides ou les évènements furtifs peuvent être acquis à une vitesse réduite de lecture,
voire avec le fichier vidéo mis en pause et un défilement en image par image. De même,
aucune contrainte n’existe quant à l’ordre d’acquisition des séquences. Une séquence à
la fin de la vidéo peut être acquise au début de l’analyse, sans empêcher l’enregistrement
des séquences précédentes plus tard.
Deux dispositifs ont été mis en place afin d’éviter les erreurs de manipulation :
– il est impossible d’avoir un temps de fin de séquence situé plus tôt que le temps de
début ; un message d’erreur apparaît pour prévenir l’utilisateur, en lui rappelant quel
était le temps choisi comme début ;
– lorsque deux parties de la même séquence se chevauchent, un message apparaît pour
1. mot-valise signifiant compression-décompression. Un codec permet de compresser un flux vidéo afin

d’en réduire le volume (tout en gardant l’information principale), puis de le décompresser en temps réel lors
de la lecture.
78
proposer à l’utilisateur de les fusionner ;
Étape 3 : Définir la plage de temps étudiée [Optionnel] Si l’intégralité de la vidéo

est a analyser, cette étape peut être omise. Mais dans le cas où l’ensemble de la vidéo n’a
pas à être étudié, il est possible de spécifier le temps qui a servi de début d’analyse ainsi
que le temps de fin en cliquant sur les boutons Start xx :xx :xx et Stop xx :xx :xx. Ceci
permet à la fois de retrouver le temps total d’analyse (qui sera différent du temps de la
vidéo) ainsi que de pouvoir vérifier plus tard si l’analyse a été bien réalisée en retrouvant
le temps de début. En cas d’erreur, cette étape peut être annulée en cliquant sur le bouton
Reset. Cette étape peut être effectuée avant, pendant ou après l’acquisition des séquences
comportementales.
Étape 4 : Sauvegarde des données ODrec propose d’enregistrer les données sous dif-
férents formats. Le premier est sous forme de graphique (éthogramme au format Bitmap).
L’abscisse est normalisée en fonction du temps de la vidéo ou de l’extrait choisi en étape
3. Le second moyen est une sauvegarde des valeurs sous forme de tableau enregistré au
format standard *.CSV (Comma-separated values). Il s’agit en fait d’un fichier texte dont
les valeurs sont séparées par des virgules. Ce type de fichier est dit standard car il est auto-
matiquement reconnu par l’ensemble des logiciels dits « tableurs ». Le premières versions
du logiciel permettaient d’enregistrer directement les fichiers au format Excel *.XLS avec
un certains nombre de calculs déjà effectués. Cependant, en fonction de la version de
Microsoft Excel installée sur l’ordinateur de l’utilisateur, cette étape pouvait échouer. Le
format *.CSV n’est quant à lui dépendant d’aucune librairie externe et est plus stable.
2.1.3 Illustration des données obtenues
Dans cette section, l’exemple choisi est celui d’un challenge d’enfouissement de 30 s
d’une sole sur un fond sableux. Comme la vidéo était plus longue que la séquence ana-
lysée, celle-ci a été raccourcie pour ne commencer qu’à partir du moment ou la sole est
placée dans le bac expérimental et se termine 30 s plus tard. Dans cet exemple, les temps
passés à nager et à s’enfouir sont capturés en tant que séquences comportementales (case
Start-Stop cochée) et l’instant où la sole est au maximum enfouie (par rapport au reste de
la vidéo) est capturé comme évènement (case Start-Stop non cochée). Les résultats sont
affichés en Fig. 38.
79
Figure 38 – Graphique et tableau obtenus après traitement d’une vidéo avec

le logiciel ODRec.
Un fois ouvert avec un tableur, le fichier *.CSV (38), permet de retrouver quelle partie
de la vidéo a été analysée (Start Time en cellule B1 et Stop Time en cellule B2). Ensuite,
les séquences comportementales sont réparties selon les colonnes. Les séquences définies
par un temps de départ et de fin sont réparties sur deux colonnes. La fréquence d’un
comportement est donc mesurable par le nombre de lignes et la durée moyenne elle aussi
calculable par la différence entre le temps Stop et le temps Start pour chaque ligne.
2.2 HeatMap From Stack : plugin pour le logiciel Ima-

geJ servant à l’analyse de la répartition spatiale en
groupe
Comme montré précédemment (voir section 1.4.1 Avantages et limitations du video

tracking automatique, p.54), analyser automatiquement des vidéos de groupes d’indivi-
dus peut s’avérer difficile par les techniques de video tracking, qui demandent une dis-
tinction parfaite de l’identité des individus sur l’ensemble de la vidéo. Cependant, une
partie de l’information peut néanmoins être extraite de ces vidéos, indépendamment de la
reconnaissance individuelle. Une de ces approches est l’analyse de la répartition spatiale
des individus tout au long de la vidéo. Un premier outils (appelé SEE_FISH) a été mis
80
en place au sein du laboratoire pendant la thèse de Sandie Millot (Lebon, 2007; Millot,
2008), mais celui-ci n’était pas utilisable pour nos expériences (acquisition d’image dif-
férente, densité d’individus trop faible dans notre cas, etc.). L’adapation de cette méthode
d’analyse dans notre cas a été rendue possible au travers d’un logiciel d’analyse d’image
gratuit et open source appelé ImageJ. En plus d’être facilement modifiable par l’ajout de
modules complémentaires, le logiciel ImageJ a aussi pour avantage d’être écrit en Java, et
donc utilisable sur n’importe quel système d’exploitation (Linux, MacOS ou Windows).
2.2.1 Principe de fonctionnement
Le logiciel va analyser les pixels de chaque image à la recherche des valeurs de gris
définies par l’utilisateur. Le score de chaque pixel (en fonction de sa position x,y) est
incrémenté pour chaque image où sa valeur de gris correspond à la plage d’intérêt. À la
fin de la séquence d’image, un graphique permet de visualiser les pixels qui ont obtenu
le plus grand score, et donc les zones où les individus ont passé le plus de temps. En
plus du graphique, l’image va être subdivisée en sous-parties de dimensions égales selon
le nombre défini par l’utilisateur. Un tableau présentant le nombre de pixels d’intérêt
comptés par sous-parties est présenté, ainsi que d’autres statistiques (telles que le score
maximal atteint, le nombre total de pixels comptés, etc.).
2.2.2 Pré-requis
L’utilisation du plugin nécessite tout d’abord d’avoir le logiciel ImageJ d’installé. De

même, il faut que la vidéo soit convertie en séquence d’images. Ceci est possible en pas-
sant par le logiciel gratuit VirtualDub (tutoriel vidéo disponible dans la section How to
convert a video file to image sequence ? du site www.samuelpean.com). La séquence
d’image doit ensuite être ouverte dans le logiciel ImageJ (File > Import > Image se-
quence) et convertie en 8- ou 16-bit (Image > Type).
Pour obtenir un meilleur résultat, il est conseillé de supprimer le fond pour l’ensemble
de la séquence d’image pour ne garder que les individus à suivre. Ceci est facilement
réalisable par soustraction à l’ensemble de la séquence d’une image ne comportant pas
les individus. Si toutefois la vidéo ne comporte pas d’images où les individus sont ab-
sents, un autre plugin, appelé Image Stack Merger Plus a été mis en place afin de pouvoir
reconstituer une image de fond à partir d’une séquence d’image comportant des indivi-
dus mobiles. Cet autre plugin et un tutoriel expliquant son fonctionnement se trouvent
également sur le site www.samuelpean.com.
Le plugin peut être démarré depuis le menu Plugins.
81
2.2.3 Lancement du plugin
Au lancement du plugin, différentes options s’offrent à l’utilisateur, réparties sur deux

boîtes de dialogue (Figs. 39). La première option configurable est la plage de gris à
prendre en compte dans l’analyse. En effet, la gamme de couleur des individus doit être
différente de celle du fond de l’image. La plage entrée dans le logiciel doit inclure la cou-
leur des individus tout en excluant la couleur du fond. La deuxième option permet d’entrer
les coordonnées de la zone étudiée, dans le cas ou l’arène explorable par les individus ne
couvrait pas l’ensemble de l’image. Ensuite, il est possible de déterminer le nombre de
sous-divisions de la zone d’étude.
Figure 39 – Aperçu des deux fenêtres successives de l’interface du plugin

pour ImageJ Heatmap From Stack
Les options suivantes permettent en premier lieu de donner un nom à l’analyse et de

régler le rayon du flou gaussien appliqué sur le graphique final. L’option Coeff permet
d’augmenter ou diminuer tous les scores selon la valeur indiquée en pourcents au moment
de la réalisation du graphique. L’option Calculation method propose différentes méthodes
de calcul concernant le rendu du graphique final. Il est en effet possible de pondérer le
nombre de pixels en fonction :
82
– du nombre total d’images (méthode dite « absolue ») : avec cette méthode, un pixel
apparaîtra avec un score maximal sur le graphique si et seulement si la plage de
gris d’intérêt est détecté durant toute la durée de la séquence et donc sur toutes les
images ; cette méthode est recommandée pour les études réalisées avec un grand
nombre d’individus ;
– du nombre maximal atteint (méthode dite « relative ») : avec cette méthode, le pixel
qui a atteint le plus grand score apparaîtra avec un score maximal sur le graphique ;
cette méthode est recommandée pour les études réalisées avec un faible nombre
d’individus placé dans une grande zone d’étude ; ATTENTION : étant donné que
cette méthode est relative, il est déconseillé de comparer les graphiques obtenus
d’une série d’image à l’autre sans préciser les scores maximaux respectifs.
Pour chacune de ces deux méthodes, une transformation logarithmique peut-être ap-
pliquée au moment de l’affichage du graphique afin d’éliminer les valeurs les plus faibles,
correspondant au bruit de fond.
L’ensemble de ces réglages (rayon du flou gaussien, coefficient, méthode de calcul re-
lative ou absolue, transformation logarithmique) ne concerne que l’affichage du graphique
et non le calcul des valeurs données dans le tableau de comptage et la fenêtre des statis-
tiques. Il s’agit là uniquement de réglage esthétique par rapport au choix de représentation.
Les dernières options concernent l’affichage ou non des statistiques et le paramétrage de
la barre de calibration.
2.2.4 Résultats obtenus
Les résultats obtenus se composent de trois fenêtres (Fig. 40) :

– le graphique, selon les paramètres choisis par l’utilisateur ;
– le tableau montrant le nombre de pixels comptés par zones (défini par la position de
la grille et son nombre de sous-divisions) ;
– la fenêtre récapitulative, qui permet de connaître les statistiques (nombre de pixel
comptés au total, score maximal obtenu, etc.) ainsi qu’un rappel des paramètres
utilisés pour cette analyse ;
Dans le cas de l’exemple illustré en Fig. 40, le tableau indique que la zone la plus
utilisée est celle est C3 (en bas à droite sur le graphique) avec un score de 36 087 pixels
comptés, et celle la moins utilisée est la zone B2 (en haut au centre sur le graphique)
avec un score de 130 pixels comptés. La fenêtre de statistiques indique, entre autre, que
la surface de l’arène explorée est de 18.4%.
Figure 40 – Aperçu des résultats obtenus par le plugin pour ImageJ Heatmap
From Stack.
84
Chapitre 3
Electronic individual identification of zebrafish

using RFID tags
Xavier COUSIN
Tarek DAOUK
Samuel PÉAN
Laura LYPHOUT
Marie-Élise SCHWARTZ
Marie-Laure BÉGOUT
Manuscrit soumis à Nature Methods

Résumé
Bien que l’utilisation de marques électroniques de type PIT-tags soit courante chez
les poissons, elle n’est souvent possible que pour des individus de plus de 60 mm, et
inapplicable dans le cas d’individus dont la taille est inférieure à 30 mm, comme le poisson
zèbre. Pour la première fois, nous avons utilisé des micro-tags RFID (NONATEC® ) afin
d’identifier individuellement des juvéniles de poissons zèbres (taile 16-42 mm, poids 138-
776 mg). Les marques ont été insérées dans la cavité intra-péritonéale puis différentes
variables ont été suivies telles que les taux de survie, de perte de tag, de croissance et de
reproduction, ainsi que le comportement exploratoire. À la fois de forts taux de survie (de
82 % à 5.5 mois après le marquage) et une faible perte de marque (11 %) ont été atteints.
Le plus petit individu ayant survécu au marquage pesait 178 mg, et le taux de succès
de relecture de la marque de la classe de taille moyenne (350-450 mg, 26 mm) était de
73 %. Aucun effet négatif sur la croissance ou la reproduction n’a été observé. De même,
l’étude du comportement exploratoire n’a montré aucune différence entre les individus
non marqués et ceux marqués depuis deux mois. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent
que cette méthode de marquage est tout à fait appropriée pour les modèles de petite taille
comme le poisson zèbre.
Au vu du fort taux de succès de marquage par micro-marques RFID chez les juvéniles
de poissons zèbres, ainsi que son faible impact sur la survie, la croissance et le com-
portement exploratoire, cette technique a été utilisée sur les juvéniles de soles lors des
expériences de contamination aux PCB par voie alimentaire (Chapitre 4, p. 107).
L’utilisation de marques électroniques individuelles permet en effet d’obtenir un suivi
individuel pendant une longue durée, et ainsi d’avoir l’historique de croissance d’un in-
dividu. Ceci est un atout majeur dans le cas de l’étude d’une contamination par voie
alimentaire.
87
Electronic individual identification of zebrafish

using RFID tags
Xavier Cousin, Tarek Daouk, Samuel Péan, Laura Lyphout, Marie-Élise Schwartz,
Marie-Laure Bégout
Abstract: Although individual electronic tagging using PIT-tags is established, it is mainly

for fish > 60 mm length and unsuitable for fish < 30 mm, like zebrafish. We used RFID
micro-tags (NONATEC® ) to individually identify juvenile zebrafish (size 16-42 mm, mass
138-776 mg) for the first time, and studied the effects of intracoelomic implantation on
survival and tag loss, growth, spawning and exploratory behavior. Both high survival
(82 % 5.5 mo after tagging) and low tag loss (11 %) were achieved. The smallest surviving
fish weighed 178 mg, and success in tag reading was 73 % for the size class 350-450 mg
(26 mm). No negative effects on growth were observed and some tagged fish spawned. No
significant differences in behavioral responses could be detected between tagged fish and
untagged controls after two months. Overall, results suggest the tagging method is highly
suitable for fish as small as zebrafish juveniles.
Keywords: swimming activity, generation, ADHD, organic pollutant effects, video

analysis
3.1 Introduction
In recent years, the zebrafish, Danio rerio, has become a widely used model for verte-
brate genetics and developmental biology. Several thousand mutants and transgenic lines
have been produced and laboratories commonly rear several of these lines simultaneously.
In most cases, these fish cannot be distinguished by eye, meaning that fish from different
lines must be kept in different tanks. From a practical viewpoint, this requires laborato-
ries to manage large rearing facilities housing several hundred tanks, which is both costly
and time-consuming in terms of husbandry (Sire et al., 2000). Moreover, rearing prob-
lems may occur in zebrafish if populations are small because this interferes with shoaling
behavior, especially as shoaling in this species has been shown to increase significantly
with age (Buske et Gerlai, 2011). Furthermore, because small fish such as zebrafish (<=
30 mm SL) are not aggressive and do not fight when kept in groups, it would be possible
to keep numerous similar-sized specimens in a single tank, leading to a drastic reduc-
tion in tank numbers. However, recognizing individual fish is impossible unless they can
be tagged individually. This problem also applies to other small species (e.g., medaka,
guppy) and to juveniles of larger species. The ability to recognize individuals within a
large population of similar-sized congeners has long been regarded as useful, notably for
89
fisheries research (e.g., growth rate estimations), ecology (e.g., migration) and population
dynamics studies. It is also the case in experiments when one needs to identify specific
lines that have no external phenotypes (e.g., mutant or transgenic lines) or to monitor the
same individuals over a long time period (e.g., multiple challenges in behavioral analysis,
or monitoring of growth or spawning).
Since the end of the nineteenth century, when the first successful mass marking of
fish was reported, various techniques have been developed to tag or mark teleosts. These
methods now include several ways of tagging relatively large individuals with different
types of external or internal tags, and marks made of a diversity of materials, as well as
genetic and chemical markers (Jakobsson, 1970; Parker et al., 1990). For small animals,
however, few efficient solutions are available and the situation is even more complicated
for fish due to their living medium and skin/scales, which preclude the use of external
tagging methods such as conventional painting. Overall, although a wide range of tech-
niques is now available to tag or mark fish (Bégout et al., 2012), they are either difficult to
apply to small specimens or the marks are liable to disappear progressively, as is the case
with fin ablation. One alternative method with a high marking success rate is scale regen-
eration following precise removal of a number of scales in a known position (Sire et al.,
2000), but this method requires careful observation of the scale pattern under a dissecting
microscope and long periods of fish handling, which are hardly compatible with studies
that require frequent handling. Subcutaneous ink or acrylic paint injection has also been
successful for long-lasting readability on aquatic animals (Herbinger et al., 1990), as have
visible implant (VI) elastomer or alphanumeric tags (NMT, WA, USA), which have been
reported to be successfully used with small aquatic animals (e.g., shrimps Dinh et al.,
in press; Brown et al., 2003; Imbert et al., 2007; Jensen et al., 2008; Pillai et al., 2009).
These tags are inserted under the skin, which needs to be as transparent as possible be-
cause the alphanumeric code has to be read through it. In our experience, however, none
of these tagging methods was successful with zebrafish: paint tags faded away and VI
tags were lost after two to three weeks.
Internal, solid tags have been used as an alternative to external tagging for some time
(Buckley et Blankenship, 1990), and more recently small electronic tags (Passive Inte-
grated Transponder, PIT) have been injected into the body cavity in several fish species
as monitoring systems and individual identification (Prentice et al., 1990; Baras et al.,
2000). The smallest PIT tags are approximately 12 mm long, 2 mm diameter, 95 mg in
mass, making them unsuitable for use on specimens less than 60 mm (Baras et al., 2000),
but new products are also appearing such as the ’tiny’ version of the PIT tag (8 mm long,
1.4 mm in diameter but still 34 mg). A very recent product, which has been used to doc-
ument behavior in insects (ants Moreau et al., 2011 and bees (Decourtye et al., 2011))
is the RFID micro-tag. These tags are suitable for zebrafish size but have not, to our
90
knowledge, ever been used on fish. In the present study we tested RFID glass micro-tags
(NONATEC® , Fig. 41) to individually identify juvenile zebrafish and evaluated the effects
of intracoelomic implantation on both routine endpoints, such as survival, tag retention
and growth, and sublethal effects, such as those on spawning and exploratory swimming
behavior. Our study is the first use of these tags for this application and advances research
on the surgical implantation of electronic tags in fish, as recommended in the literature
(Cooke et al., 2011).
3.2 Methods
3.2.1 Fish and tag insertion
A batch of 6-week-old juvenile zebrafish, Danio rerio, was bought from a fish sup-
plier (Elevage de La Grande Rivière, Calluire, France) and acclimated to our facilities
for two months before experimentation. Radio frequency identification glass microtags
(RFID NONATEC® , Lutronics Luxembourg) are a new generation of tags that operate at
a high frequency (13.56 MHz), allowing the identification of very small individuals using
a laboratory bench arm reader on fish under anesthesia. NONATEC® tags are 1 mm in
diameter and 6 mm in length, with a mass of 10 mg (Fig. 41). For tag insertion, fish
were put under mild anesthesia using 50 µl/100 ml Ethyl-p-aminobenzoate (Benzocaine,
Sigma: E1501-100G), made from a stock solution consisting of 5 g Benzocaïne dissolved
in 50 ml 100 % ethanol. To minimize handling duration, anaesthesia was performed on
batches of 10 fish. The glass microtags were cleaned and stored in 70 % ethanol prior to
utilization and optimal aseptic conditions were maintained by cleaning the bench and all
instruments with 70 % ethanol.
Figure 41: Picture of a zebrafish and a RFID NONATEC® glass tag; diameter
1 mm, length 6 mm, mass 10 mg.
After about 30 s anesthesia induction, fish were measured for mass (to the nearest mg)
91
and length (to the nearest mm) and then placed sideways on the bench. Intracoelomic im-
plantation was then performed by piercing a hole in the abdominal cavity using a 22G nee-
dle, taking care only to pierce the body wall muscle and not to insert the needle too far
into the cavity so as to avoid damaging any organs. A tag was then transferred from 70 %
ethanol to sterile physiologic serum (9 g/l NaCl) for rinsing, picked up with Dumont n°3
forceps and inserted into the abdominal cavity through the hole made earlier, where it
was pushed until it was fully inside (see video in Supp Mat). The whole procedure was
routinely performed within 30 s and care was taken to limit the time the fish was out of
the water to improve experimental success. Fish were then transferred to a tank of clean
water for recovery from anesthesia and handling, and allowed 10-15 min resting before
being returned to their rearing tanks (20 l glass tanks in a zebra rack). Fish death and tag
loss were monitored by daily tank inspection.
Two tagging experiments were conducted: in the first (Exp. 1, 71-days duration),
98 fish were tagged and 34 were used as controls (initial mean mass (±SD) 361±117 mg,
within the range 139-712 mg). Tagged fish were put into three tanks in groups with sim-
ilar mean mass and coefficient of variation of mass, control fish were placed in one tank.
For the second experiment (Exp. 2, 167-days duration), 140 fish were tagged and 343
were used as controls (initial mean mass of 420±125 mg, within the range 138-776±mg).
Tagged fish were divided between 6 tanks and control fish between 14 tanks. We used a
comparative approach between the two treatments (control untagged vs. tagged fish) to
compare the variables detailed below.
3.2.2 Feeding regime and Growth monitoring
Fish were fed on dried feed (TetraMin® PRO Tropical Crisps), milled for better quan-
tification of the ration, which was set at 1.5 % of wet body mass. Every fortnight, bio-
metric measurements were taken according to a standard protocol: fish were fasted the
preceding day, anaesthetized as described above, measured for mass (to the nearest mg)
and length (to the nearest mm) and put to recover in fresh clean water before being re-
turned to their respective tanks. During the biometry measurements, tags were read using
an arm reader (Lutronics, Luxembourg) connected to a computer, and corresponding mass
and length were recorded in a spreadsheet. Occasional tag failure or loss was noted.
Specific growth rate (SGR) was calculated as the mass increase between biometry di-
vided by the time interval between them (days) and expressed in %. For tagged fish, SGR
was calculated at the individual level whereas for untagged fish it was calculated at the
group level using mean mass.
92
(ln M2 − ln M1 )
S GR M (%) = 100 · where: M1 is fish mass at date 1
T
M2 is fish mass at date 2
T is date 2 – date 1, in days
ln is natural log
3.2.3 Spawning
To evaluate spawning ability, couples were set up in spawning boxes every 2 weeks
over two months, starting 1 mo after tagging. Eggs were collected in the morning and
fish tag identities recorded. To evaluate reproductive characteristics, eggs were counted
and sorted, unfertilized eggs were counted and removed, and the remaining eggs left to
develop.
3.2.4 Behavior
We used swimming behavior as an integrated indicator to evaluate the possible influ-

ence of tagging on fish. Control tagged and untagged fish were subjected to an exploratory
assay in which fish were put in the start arm of a T-maze, slightly adapted from Ninkovic
et Bally-Cuif (2006), in order to monitor swimming characteristics (distance travelled
and temporal space use) in either: i) a shallow area, which was 5 cm in water depth,
composed of the start arm (46 cm long), the arm leading to the deep area (’correct arm’)
and the ’wrong arm’, in the opposite direction to the deep area (total length of these two
arms was 66 cm) or ii) a deep area, which was 10 cm in water depth, 23 cm wide and
23 cm long, had marbles and plastic grass and was considered a favorable zone (Ninkovic
et Bally-Cuif, 2006). Fish were placed individually in a 1-L tank in the experiment room
the day before the recording. For each trial, a single fish was removed from its tank and
placed in the start area of the longest arm of the T-maze; then exploration activity was
immediately recorded for 3 min. All runs were accomplished in one day (10h-19h) and
20 fish were screened per treatment (control untagged vs. tagged fish in sequence). This
experiment was conducted 2 months after tagging.
Videos were recorded with an analog camera (Panasonic CCTV WV-CL920A) linked
to a PC with an acquisition card. Track extraction and analysis were then performed with
Ethovision XT software (Noldus, The Netherlands), images were acquired at 25 frames
per second and extracted data nested every 30 s for saving.
93
The variables chosen to evaluate behavioral performances were as follows:

– time spent (in s) by a fish in the different zones of the T-maze ;
– velocity (in cm.s-1 ): the distance moved by the centre point of the individual fish per
unit time between two consecutive X-Y coordinates acquired. Mean and SEM were
calculated for each fish and each zone. Data reported here are of velocity in shallow
zone.
3.2.5 Statistical tests
Data were statistically tested using Statistica 9.0 (Statsoft, USA). For each variable, a
Shapiro-Wilk test was performed to check the normality, and a Bartlett’s test to check the
homoscedasticity. As normality and homoscedasticity rules were not respected, Mann-
Whitney-U or Kruskal-Wallis tests were used (Zar, 1999), followed by multiple com-
parison rank tests. For survival and growth related variables (mass and SGR) we used
Kruskall-Wallis tests to analyze sex and treatments effects. To refine our analyses, we
made a class analysis of survival, body mass and SGR in relation to mass at tagging
and sex for live tagged fish kept until 167 days post tagging. To this end, we made 100
mg interval classes and used a Kruskall-Wallis test followed by Dunn’s post-hoc tests to
compare body mass gain and SGR within sex and between classes.
For each swimming variables (time spent in each zone, velocity in the shallow zone),
Mann-Whitney-U tests were performed to compare results between the two treatments
(control untagged vs. tagged fish). All statistical analyses were carried out at a 95 % level
of significance.
3.3 Results
3.3.1 Evaluation of tagging procedure success
Two batches of fish originating from the same initial batch were tagged in two suc-
cessive experiments (Exp. 1: 98 tagged fish studied for 71 days, Exp. 2: 140 tagged
fish studied for 167 days). Experiment 1 was a pilot experiment to evaluate suitability
of tag size and insertion procedure. During the entire duration of the experiments, fish
death and/or tag loss were monitored daily (Tab. 2), with survival and tagging success,
expressed as the number of tagged fish remaining over time and as the percentage of tag
retention in relation to sex and fish mass at tagging (Fig. 42).
94
Table 2: Fish number and growth for untagged control and tagged fish and
according to sex. For untagged control and tagged fish of each sex, the
first group of rows gives survival in numbers and percentages relative to ini-
tial number of fish in each column. The second group of rows gives mass
(mean±SEM) on the post-tagging biometry measurement days (Biom1, 5 and
8). The third series of rows gives specific growth rates between biometry mea-
surement days 1 and 5 (SGR1) and 5 and 8 (SGR2). There was no significant
difference between control untagged and tagged fish.
Female Male
Untagged Tagged Untagged Tagged
Initial numbers 216 91 127 49
Dead fish (running sum; (percentage relative to initial number))
Biom 5 41 (19.0%) 4 (4.4%) 13 (10.2%) 5 (10.2%)
Biom 8 59 (27.3%) 15 (16.5%) 29 (22.3%) 10 (20.4%)
Body mass (mg; mean±SEM)
Biom 1 521.1±10.6 533.7±13.7 406.9±8.1 423.0±11.3
Biom 5 714.1±15.6 734.8±18.7 512.8±10.2 485.0±14.0
Biom 8 914.8±20.1 958.3±25.8 564.2±14.6 581.6±16.2
Specific growth rates (from mean mass; (calculated from individual values mean±SEM))
SGR1 0.50 0.51 (0.41±0.03) 0.37 0.22 (0.22±0.04)
SGR2 0.44 0.47 (0.49±0.04) 0.17 0.32 (0.26±0.04)
Figure 42: Monitoring of survival and tagging success over time. A: Survival
rate of untagged control and tagged fish (mean±SEM). No significant differ-
ence was observed. B: Tagging success was evaluated as the number of fish
in which the tag could be read. Failure to obtain a reading was usually due to
tag loss but, in a few cases, a tag that could not be read at one biometry mea-
surement session was readable at the next. It should be noted that most tag
loss occurred before the first biometry measurement (13 days after tagging).
95
In the first experiment, some fish death and tag loss occurred, mainly during the first
three weeks following tag insertion. After two months there had been a total of 15 fish
deaths (15 %) and 28 tags lost or not successfully read (28 %). The smallest surviving fish
was 178 mg at tagging. Over the 71 days, survival rate of tagged fish (85 %) was higher
than that of control fish (58 %).
For the second experiment, performed later on, we used an improved method in or-
der to shorten the insertion procedure as much as possible and thus limit the period
out of water and stress caused. The tagging procedure took around thirty seconds (see
Methods section). In this experiment, 140 fish were tagged. The improved methodology
and use of slightly heavier fish allowed fish death to be limited to 25 (17.9 %) and tags
lost/unreadable to 15 (10.7 %) after 167 days (5.5 mo) (Fig. 42). Survival rate of tagged
fish (82 %) was higher than that of control fish (74 %) and no significant effect of sex was
observed (survival of tagged fish was 83.5 % for females and 79.6 % for males vs. 72.6 %
and 77.1 % for control untagged females and males respectively, Tab. 2).
The analysis of survival in relation to mass at tagging and sex showed that there was a
trend for a decrease in mortality with increasing initial mass and that this was independent
of sex (Tab. 3). A survival of 82 % was obtained for fish from the 350-450 mg mass class.
3.3.2 Growth rate
Mass and length measurements were taken at fortnightly intervals in order to monitor
the possible negative effects of tagging on fish growth (Fig. 43).
No significant difference in growth was observed between treatments (control untagged
vs. tagged fish, Tab. 2). Females were heavier than males in both treatments and this dif-
ference increased over time as their gonads matured. This male/female difference was
particularly clear for the specific growth rates (SGR), which were higher for females than
for males. For control untagged fish, SGR could only be calculated based on mean growth.
The same calculation was performed for tagged fish, at the individual level (Tab. 2). Val-
ues obtained could not be compared directly using a statistical test, but it appeared that
SGR of individual tagged fish were very probably no different from the mean SGR of the
untagged controls.
The actual SGR calculated from individual weight is also indicated for tagged fish and
some differences can be noticed with the value calculated based on mean mass.
In order to further characterize growth of fish depending on their initial mass, we took
the opportunity to monitor fish individually over time, which allowed us to calculate body
growth and SGR for each sex and for each fish in the same mass-at-tagging classes as
defined in Tab. 3 and Methods section. For each sex, mean mass followed the initial
96
Figure 43: Growth monitoring of control untagged (pale symbols) and tagged
fish (dark symbols) over 6 months. Fish growth was monitored for the two
months before tagging in order to detect possible deviations of growth rate
after tagging. After tagging, weight of control untagged fish and tagged fish
are shown for every biometry measurement point and no significant difference
can be observed (mean ± SEM). Biometry measurement points 1, 5 and 8 (13,
76 and 132 days after tagging, respectively), which are given in tables 1 and
2, are indicated by arrows.
grouping but differences between classes diminished gradually. In addition, variation in

mass within any one class increased with time, as illustrated by SEM increase. SGR
appeared inversely correlated to initial mass but this relationship was only significant for
SGR1 of males, due to the very large variation of the other calculated SGR values.
3.3.3 Spawning characteristics
Although fish were handled frequently, spawns were obtained over the course of this
experiment. Starting 1 mo after tagging, in fortnightly trials made over two months, we
obtained 11 spawns involving 5 different males and 4 different females for Exp. 1 and
20 spawns involving 10 different males and 11 different females for Exp. 2. A similar low
number of spawns was obtained with untagged control fish. In all cases, fertilization rate
and larval survival were similar to usual levels.
97
98
Table 3: Tagged fish numbers and growth according to sex and initial mass. Tagged fish were grouped by sex and mass classes at
tagging of 100 mg, except the largest class for female, which ranges from 651 to 850 mg. The first group of rows gives success
in tag reading in numbers and percentages relative to initial numbers of fish in each class (differences include both dead fish and
failure to read tags). The second group of rows gives mass (mean±SEM) at the post-tagging biometry measurement days (Biom)
1, 5 and 8. The third series of rows indicates specific growth rates (mean±SEM) between biometry measurement days 1 and 5
(SGR1) and 5 and 8 (SGR2). In the Statistical group rows (Stat.group) different letters indicate significant differences between
classes, by sex, according to a Kruskall-Wallis test followed by a Dunns post-hoc test; p<0.05.
Female Male
Weight class (mg) 0-250 251-350 351-450 451-550 551-650 651-850 251-350 351-450 451-550
Initial numbers 3 13 29 21 18 7 15 27 7
Success in tag reading (number of fish read (percentage of initial number))
Biom5 2 (66.7%) 9 (69.2%) 27 (93.1%) 21 (100%) 18 (100%) 6 (85.7%) 15 (100%) 24 (88.9%) 7 (100%)
Biom8 2 (66.7%) 7 (53.8%) 24 (82.8%) 19 (90.5%) 14 (77.8%) 6 (85.7%) 10 (66.7%) 17 (63%) 17 (100%)
Body mass (mg; mean±SEM)
Biom1 269.3±20.3 393.3±21.9 482.8±9.0 554.8±12.5 645.1±13.4 770.1±42.1 352±9.8 438.5±5.6 547.2±14.1
Stat. group a a ab bc c c a b b
Biom5 412.3±77.6 533.8±34.9 632.3±23.3 752±31.5 799.1±30.7 1004±42.9 417.1±23.1 510.4±16.8 595.2±25.6
Stat. group ab a ab bc c c a b b
Biom8 706 ±110 711.3±65.4 876.8±58.9 979.4±51.6 1014±50.5 1146±75.6 545.6±21.7 596.7±24.6 646.2±19.8
Stat. group ab b ab ab a a a a a
Specific growth rates (mean±SEM)
SGR1 0.7±0.3 0.47±0.12 0.44±0.05 0.49±0.04 0.29±0.04 0.31±0.08 0.35±0.02 0.23±0.04 0.13±0.03
Stat. group a a a a a a a ab b
SGR2 0.96±0.29 0.52±0.16 0.6±0.04 0.41±0.08 0.42±0.06 0.32±0.07 0.3±0.09 0.27±0.05 0.15±0.06
Stat. group a a a a a a a a a
3.3.4 Swimming behavior
a b
120 14
Untagged
Tagged 12
100
Time spent in the different zones (s)
Velocity in shallow area (cm.s-1)

10
80
8
60
6
40
4
20
2
0
0
Start Arm Wrong Arm Correct Arm Deep Area
Untagged Tagged
Figure 44: Swimming activity observed in a T-maze challenge. A: Fish were

introduced in the start arm and had to swim through the correct arm to reach
the deep area which is supposedly the preferable one (Ninkovic et Bally-Cuif,
2006). The other three areas are straight and shallow. Time spent in the
deep area was longer than that spent in the other three areas. No significant
difference could be observed between control untagged and tagged fish in
any of the zones (mean±SEM; Mann-Whitney-U Start Arm =153, p>0.77; MW-
U Wrong Arm =124, p=0.23; MW-U Correct Arm =159, p=0.94; MW-U Deep area =119,
p=0.17) ; B: Swimming velocity in the shallow areas was no different be-
tween control untagged and tagged fish (mean±SEM; Mann-Whitney-U=157,
p=0.87).
Behavior is now recognized as an integrative indicator of both organism stress response

and physiological alterations (Champagne et al., 2010; Steenbergen et al., 2011). Two
months after tagging, we compared swimming activity of tagged fish with untagged con-
trol fish using an exploratory challenge in a T-maze. This challenge is usually used to
measure anxiety and exploration (Ninkovic et Bally-Cuif, 2006) as well as swimming
characteristics themselves. No significant modifications were observed for the variables
measured (Fig. 44): fish from both treatments used the different zones of the T-maze
equally and swimming velocities in the shallow area were similar.
3.4 Discussion
Method choice As described in the introduction, there are several reasons for which tag-
ging a fish could be useful, and requirements may differ depending on specific needs. For
short-term use, e.g., for repetition of a challenge with individualized fish within a week,
99
external tags such as paints can be used, even though this might become complicated if a
large number of fish was used. External tagging can also potentially pose problems if the
challenge involves social interaction, which may be biased due to mark visibility itself.
For long-term experiments, a long-lasting tagging method is required, which precludes
painting techniques. Internal electronic tagging is the ideal choice in such cases but, as
mentioned above, this has so far been limited to fish above 60 mm in length and 1.67 g in
weight (Baras et al., 2000).
Over the course of our projects at our laboratory for which long-lasting tagging was
required, we have tried several tagging techniques. Our experience has shown that scale
painting and under-skin paint (acrylic) or elastomer injections were not successful, color
faded away or injected elastomers were rejected within two weeks of tagging. The same
problems occurred with VI alphanumeric tags, even when the tags were cut to make them
smaller. As we had practical experience of implanting internal transponder tags in larger
fish than zebrafish, we searched for small RFID tags because they make it possible to
work simultaneously with a large number of code combinations and provide a long-lasting
form of tagging. Nonatec® tags were available embedded in resin or in glass. Although
the resin tags offered the advantage of being lighter than the glass ones, they had sharp
edges and were rapidly lost following intracoelomic implantation. We therefore focused
our experiments on Nonatec® glass tags.
Tagging success and effects Surgery was adequate for tagging zebrafish, as the mortal-
ity of tagged fish was actually lower than that of control untagged fish and was within the
range of usual mortality reported for long-term experiments on zebrafish. The overall tag-
ging success in the improved-method experiment after 5.5 mo of tagging was above 82 %
for fish survival, among which 11 % lost their tag or had a tag that became unreadable. In
the tagging literature, one can often find references to tag size following a recommended
ratio of tag mass to fish mass in air limited to 2 % (Winter, 1983). If this "2 %" rule is
applied, the recommended lower threshold for zebrafish tagging should be 500 mg. In our
experiment, the lightest surviving tagged fish had an initial mass of 178 mg in Exp. 1 and
190 mg in Exp. 2, giving tag to fish mass ratios of 5.6 % and 5.3 %, respectively, which
are largely above the recommended ratio (Claireaux et Lefrançois, 1998). However, this
“2 %” rule has been successfully challenged by several authors who demonstrated that
high tag ratios can be used without causing substantial biases in the long run (Claireaux et
Lefrançois, 1998; Brown et al., 1999; Baras et al., 2000). Our findings also agree with this
principle, as they show no alteration in feed intake or equilibrium. Furthermore, during the
first couple of months following tagging, the smallest fish showed catch-up growth (high
SGR) although their tag ratio was still high and hence all initial mass classes exceeded
500 mg after two months. There was, however, a clear increase in success with heavier
100
initial mass at tagging, with a success probability over 73 % for fish in 350-450 mg class
range.
None of the variables tested in the longer experiment showed deviation between treat-
ments, control untagged vs. tagged fish. We were able to obtain only a small number
of spawns for tagged and untagged fish, which was probably due to the combination of
two causes: frequent handling under anesthesia at fortnightly interval and restrictively
low food levels. Analysis of the swimming activity in a T-maze indicated that swimming
ability as measured two months after tagging was not modified by tagging and that tag-
ging did not induce modification of behavioral traits that could have been interpreted as
enforced anxiety (Champagne et al., 2010).
Possible developments of the techniques We have demonstrated that fish as small as

200 mg can survive after the insertion of a 10 mg glass tag. This represents a great
decrease in the lower limit for fish to be tagged compared with other tags available on the
market and therefore creates the possibility of tagging very young individuals of larger
fish species in order to conduct long-term life history monitoring, as well as providing a
means of tagging small model species such as zebrafish. However, because of the short
reading distance of the arm reader (1 cm) and its functioning mode, some occasional tag
reading failures were noted that could not be distinguished from tag loss unless the tag
was read at the following session. Also, if frequent monitoring is required as fish grow
(e.g., for biometry measurements, challenges) and when working with juvenile of large
fish, an additional tagging should be done later on, using regular PIT tags (e.g., when fish
are above 5-10 g depending on the species), so as to avoid losing the signal.
An automated identification portal at specific check-points would make an excellent

research tool for behavioral challenge monitoring in fish, like the equipment already de-
veloped for insects (Decourtye et al., 2011; Moreau et al., 2011), but this would require
the arm reader to be waterproof, and improving the detection range and speed, which are
currently the weak points because they require a close positioning of the fish for reading.
In conclusion, we have demonstrated that long-term tagging of small fish such as ze-
brafish is now possible using small RFID glass tags. The tagging procedure is simple and
fast. None of the tested variables indicated an adverse effect of the tagging procedure or
of the tag itself on the long term.
101
Acknowledgements
This work was performed with the financial support of CNRS-INSU (EC2CO Généra-
tionPOP). County of Charente Maritime and Poitou-Charentes funds supported Tarek
Daouk, Samuel Péan and Marie-Élise Schwartz during their PhD along with Ifremer and
INRA. We also thank Helen McCombie-Boudry for editing the English of this manuscript.
Author contributions
Xavier Cousin, Samuel Péan and Marie-Laure Bégout conceived and designed experi-
ments. Xavier Cousin, Tarek Daouk, Samuel Péan, Laura Lyphout, Marie-Élise Schwartz
and Marie-Laure Bégout performed the experiments. Xavier Cousin, Samuel Péan and
Marie-Laure Bégout analyzed the data. Xavier Cousin and Marie-Laure Bégout wrote the
manuscript and sought funding.
102
Deuxième partie
Effets des PCB sur le comportement
des poissons
Chapitre 4
Effets des PCB sur le comportement de la sole

commune, Solea solea
Samuel PÉAN
Pierre POITEVIN
Didier LEGUAY
Anne-Lise MAYERAS
Mathieu BESSON
Sébastien FERRARI
Lilian DUCCI
Lucette JOASSARD
Claire ROCANCOURT
Véronique LOIZEAU
Marie-Laure BÉGOUT
Manuscrit en préparation
Partie II – Effets des PCB sur le comportement des poissons
Résumé
Durant cette étude, des juvéniles de sole d’âge G0 ont été contaminés par voie ali-
mentaire aux PCB pendant 67 jours, en utilisant des mélanges et des doses réalistes par
rapport aux conditions environnementales. Les tests chimiques réalisés à 31 et 67 j ont
montré que les taux de contamination correspondaient aux concentrations espérées. Du-
rant les 67 jours de contamination, différents traits comportementaux ont été suivis tels
que l’activité de nage pendant 23 h ainsi que l’enfouissement. Le test d’activité de nage
pendant 23 h a montré que le groupe moyennement contaminé présentait une prostration
importante à 30 j, ce qui n’a pas été retrouvé à 60 j. Le groupe le plus fortement conta-
miné a présenté quant à lui une moins bonne adaptation à ce nouvel environnement à 30 et
60 j, avec une activité très élevée pendant les premières heures du test. Le challenge d’en-
fouissement pendant 30 s réalisé à 30 j n’a montré aucune différence significative entre
les conditions pour aucune des variables étudiées (nombre d’individus enfouis, temps de
mobilité, durée de l’enfouissement, temps de latence avant l’enfouissement). La couleur
mesurée à 31 et 67 jours n’a pas montré de différences significatives. Pendant les 26 pre-
miers jours de décontamination, la moitié des individus ont été placés dans un environne-
ment clair pendant 13 j, puis un environnement sombre pendant les 13 j suivants ; l’autre
moitié des effectifs a été placé d’abord dans l’environnement sombre, puis dans le clair.
Le suivi de la couleur de ces individus a montré que les individus contaminés avaient
des difficultés à s’assombrir. Les variables physiologiques telles que le poids, l’indice de
condition de Fulton ou le SGR n’ont montré aucune différence entre les conditions, ou
des différences qui ne pouvait pas être expliquées par le niveau de contamination. Ces
résultats démontrant une altération des comportements locomoteurs et cryptiques seront
discutés en rapport avec les conséquences écologiques que cela implique pour l’espèce.
Cette première étude montre qu’une contamination aux PCB chez la sole, à des doses
réalistes par rapport aux concentrations rencontrées dans l’environnement, induit des ef-
fets à 30 et 60 j sur le comportement locomoteur, ainsi que sur les capacités de mimétisme
pendant les 26 jours suivant la fin de la contamination. L’utilisation de ces différents
challenges a permis de montrer des réponses différentielles selon les niveaux de contami-
nation.
107
4.1 Introduction
Les zones côtières, bien que restreintes et instables, représentent un espace d’échanges
d’intérêt écologique majeur entre les territoires marins et terrestres. Les zones estua-
riennes en sont un exemple particulier, où les fleuves et rivières vont enrichir le milieu
marin en nutriments. Ces apports d’origine terrestre constituent un enjeu biologique pour
de nombreuses espèces marines, qui vont y établir leurs zones de nourricerie. Certaines
de ces espèces peuvent avoir un intérêt économique majeur : c’est le cas de la sole. Le
caractère déterminant de ces zones pour la survie et la croissance de ces juvéniles permet
de considérer la dégradation des milieux côtiers comme une des causes majeures de di-
minution du recrutement (et donc de la taille des populations marines) en liens avec ces
habitats (Morin et al., 2006).
Les nourriceries sont des zones géographiques limitées où se concentrent les juvéniles
de nombreuses espèces de poissons pour s’y nourrir et grandir pendant leur(s) première(s)
année(s) d’existence (Beck et al., 2001). Selon ces auteurs, un habitat peut être considéré
comme une nourricerie si sa contribution à la production d’individus est supérieure à
celles des autres habitats. Les pertuis Charentais, l’estuaire de la Loire et de la Gironde,
forment les plus importantes nourriceries de la côte atlantique, en termes de surfaces po-
tentiellement disponibles et de densité de juvéniles observés, en particulier pour la sole
Le Pape et al. (2003). Elles représentent alors un habitat essentiel pour cette espèce, dans
le sens où celui-ci est nécessaire à la réalisation complète de son cycle de vie. Les per-
tuis Charentais ont une superficie d’environ 1300 km2 , dont 343 km2 de vasières situées
à moins de 5 m de profondeur. Ils sont aussi très proches d’une frayère importante pour
la sole, celle de Rochebonne (Arbault et al., 1986). La conjonction de ces deux éléments
favorise probablement la colonisation des juvéniles.
Cependant, depuis le début du XXe siècle, l’industrialisation a conduit à la production
de milliers de substances chimiques pouvant à tout moment être libérées dans l’environ-
nement. Jusqu’à ces dernières années, ces produits ont été mis sur le marché et utilisés en
grande quantité alors que leurs effets à long terme sur l’environnement et les organismes
vivants n’ont été révélés que plus tardivement. Parmi ces substances, les polluants orga-
niques persistants (POP) connaissent un regain d’intérêt à cause de la récente réévalua-
tion de leur toxicité (neurotoxiques, perturbateurs endocriniens ; van der Oost et al. 2003).
Ces matières sont chimiquement stables, faiblement biodégradables et lipophiles, ce qui
leur confère un fort potentiel bio-accumulateur. Parmi les POP, les polychlorobiphényles
(PCB) sont sans doute les molécules les plus connues. Ces composés aromatiques organo-
chlorés exclusivement d’origine anthropique ont été synthétisés pour la première fois en
1881, puis produits industriellement à partir de 1929 par la société MONSANTO HSPH
(2001). Ils ont été utilisés massivement entre les années 1950 et 1970 et cela pour leurs
109
propriétés suivantes :
– un faible point de volatilité ;
– une bonne résistance au feu ;
– une faible solubilité dans l’eau ;
– une haute solubilité dans les solvants organiques ;
– une bonne stabilité dans le temps, sans aucune détérioration due à l’utilisation.
Depuis 1987, la réglementation française a décrété l’arrêt total de la production, de la
vente et de l’utilisation des PCB (décret n°87-59 du 02/02/87). Cependant, ces composés
ayant une demi-vie excédant 100 ans (Ramade, 1992), leur présence dans l’environnement
reste un vrai problème : leur rémanence dans les sols, ou plus ponctuellement, le déverse-
ment sauvage d’appareils contenant des PCB sont autant de sources de contamination pour
le milieu naturel. Cela se vérifie d’autant plus en zones estuariennes et péri-estuariennes,
fortement soumises aux apports d’eau douce à forte teneur en matières organiques poten-
tiellement polluées. Une fois introduits dans l’environnement, les PCB sont stockés dans
tous les compartiments de l’écosystème. Les organismes vivants peuvent être contami-
nés : i) par simple contact avec un milieu pollué (voie cutanée et/ou respiratoire) ; ii) par
l’ingestion de proies contaminées (voie trophique) ; iii) parfois les deux à la fois. Cette
contamination débute par le passage des polluants à travers la membrane des cellules
par diffusion, ils s’installent ensuite dans leur vacuole, s’accumulant dans les organismes
planctoniques. Ces êtres vivants sont ensuite consommés par les prédateurs qui vont ac-
cumuler les PCB dans les lipides, le foie, les branchies, le cerveau et les muscles. Peu
métabolisables, leur concentration va augmenter à mesure que l’on monte dans les ni-
veaux trophiques. On peut alors parler, en plus de bioaccumulation, de bioamplification
(Ramade, 1992), les plus fortes concentrations étant relevées chez les grands prédateurs.
Ces polluants ont des effets délétères sur la physiologie, la reproduction, la croissance
et le système immunitaire de nombreux organismes (Holene et al., 1998; Crofton et al.,
2000; Safe, 2005; Zimmer et al., 2009; Schell et Gallo, 2010), autant de phénomènes pou-
vant potentiellement intervenir dans le déclin de certaines populations naturelles. En plus
de cet aspect écologique, il semble important de s’interroger sur la consommation de pro-
duits d’origine aquatique par les Hommes. Cela semble particulièrement important quand
on connaît les conséquences des PCB sur la santé humaine. En effet, ils sont promoteurs
dans les processus cancérigènes, peuvent entraîner une dégradation des systèmes immu-
nitaire et endocrinien, des tumeurs cutanées, hépatiques et digestives, des dérèglements
enzymatiques, des troubles oculaires et respiratoires etc. (Carpenter, 2006) ainsi que le
syndrome d’ADHD chez l’enfant (« attention deficit / hyperactivity disorder », Eubig
et al., 2010).
Il est donc nécessaire de trouver des indicateurs écologiques témoignant de la qualité
du milieu. C’est ce qu’a entreprit l’Union Européenne en mettant en place la directive
110
Habitat (92/43/EC), la directive cadre sur l’eau (2000/60/EC) et le programme de gestion

intégrée de la zone côtière. C’est dans ce contexte que s’inscrivait le programme SOLE-
Bémol-pop dont l’objectif était de comprendre l’effet des polluants organiques persistants
(PCB, HAP 1 , PBDE 2 ), d’origine anthropique, sur les performances écologiques des po-
pulations naturelles de sole commune.
Au cours de cette étude, les expériences menées en laboratoire ont permis de béné-
ficier de conditions contrôlées sans interaction avec d’autres composantes biotiques ou
abiotiques de l’environnement afin d’étudier l’effet de l’exposition aux PCB sur de nom-
breux aspects physiologiques et biochimiques, mais aussi sur le comportement des soles
juvéniles. Si un grand nombre d’études a démontré l’effet des PCB sur la physiologie
des poissons Collins et al. (1977); Örn et al. (1998); Schmidt et al. (2005); Nakayama
et al. (2005a); Lerner et al. (2007); Daouk et al. (2011), très peu se sont concentrées sur
le comportement. Pourtant, le répertoire comportemental est l’une des caractéristiques
que l’individu modifie en réponse à une cascade métabolique « silencieuse ». L’objectif
de cette étude est de définir l’effet de l’exposition aux PCB sur les comportements anti-
prédateur et locomoteur des juvéniles de sole commune. Pour échapper aux prédateurs, les
soles utilisent différentes stratégies telles que l’enfouissement et le camouflage. Le com-
portement locomoteur est pour sa part essentiel quant au choix d’habitat (exploration) et
à la recherche de proies. Réaliser correctement ces deux comportements peut entre autre
conférer de bonnes performances écologiques individuelles, ce qui offre un avantage en
terme de survie.
4.2 Matériel et méthodes
4.2.1 Matériel biologique et contamination
Les individus testés ont été importés au stade œuf de la ferme aquacole Solea-BV
(Pays-Bas) et ont ensuite été élevés pendant 10 mois du centre Ifremer de Brest. Ils ont
été ensuite transférés sur la plate-forme expérimentale de la station Ifremer de L’Hou-
meau. Les individus au début de l’expérience pesaient en moyenne 17 g. Les soles ont été
marquées individuellement à l’aide de puces RFID 3 de la marque Nonatec® (Lutronic,
Luxembourg ; voir Chapitre 3, p. 87 & Fig. 67, Annexe C, p.217), insérées en sous-cutané
dans la partie antérieure de la face aveugle.
Aucune sole testée ne souffrait d’albinisme, n’était borgne ou sénestre de manière à ne
1. Hydrocarbures aromatiques polycycliques
2. Polybromodiphényléther
3. Radio frequency identification
111
pas créer de biais dans nos résultats. Les poissons testés ont été élevés par groupes de 50
individus dans des bassins sub-carrés de 450 litres.
Quatre lots de poissons homogènes en nombre et en poids moyens ont été constitués
lors de la première biométrie (D0), puis les soles ont été exposées aux PCB par voie
alimentaire pendant 67 j. Quatre types de granulés ont été préparés au sein du centre
Ifremer de Brest :
– témoin (Plain), aliment commercial non contaminé ;

– solvant (Solvent) ;
– solvant + PCB à dose moyenne (PCB medium)
– solvant + PCB à plus forte dose (PCB high)
Étant donné que l’inclusion des PCB dans l’aliment ne peut se faire qu’en ajoutant un
solvant (isooctane), la condition Solvent contient la même dose d’isooctane que le groupe
PCB high.
Un mélange de quatre congénères de PCB a été fabriqué : le CB-105, le CB-118, le

CB-149 et le CB-153. Les concentrations ciblées par conditions sont les suivantes :
– pour la condition PCB medium : CB-105 : 80 ng.g-1 , CB-118 : 150 ng.g-1 , CB-149 :
150 ng.g-1 , CB-153 : 300 ng.g-1 , soit un total de ΣCB=680 ng.g-1 ;
– pour la condition PCB high : CB-105 : 300 ng.g-1 , CB-118 : 580 ng.g-1 , CB-149 :
450 ng.g-1 , CB-153 : 1000 ng.g-1 , soit un total de ΣCB=2330 ng.g-1 ;
Ces concentrations correspondent toutes les deux à des doses environnementales mesurées
dans la chair de soles prélevées respectivement dans les estuaires de la Loire et de la Seine,
et la distribution des congénères de PCB est proportionnelle à celle trouvée en milieu
naturel. Les animaux ont été nourris suivant un taux journalier de 1% de leur biomasse
(ajusté à chaque biométrie). Cette ration a été répartie sur trois à cinq repas par jour (entre
9 h et 18 h) en fonction de la motivation des poissons à s’alimenter.
Les bassins contenant les individus dont l’alimentation était contaminée par des PCB
ont été isolés et possédaient leur propre système de filtration et de thermorégulation. Les
bassins des deux autres conditions étaient connectés au circuit général, lui aussi fermé et
thermorégulé. Les soles ont été soumises à une photopériode de 12 h de jour et 12 h de
nuit. L’eau a été maintenue à une température de 19°C et une salinité d’environ 30 % pour
l’ensemble des bacs. Un suivi des taux de nitrate, nitrite et ammonium a été effectué
régulièrement afin de contrôler la qualité de l’eau ainsi qu’une purge de 20 à 30 % de
l’eau des bacs pour assurer de bonnes conditions d’élevage.
112
4.2.2 Acquisition des données
4.2.2.1 Phase de contamination
Données biométriques et chromatiques Le marquage a permis de faire un suivi indi-

viduel précis pour les mesures biométriques et comportementales. Durant les 60 premiers
jours, l’ensemble des poissons ont été pesés et mesurés (longueur standard) à cinq reprises
(D0, D15, D31, D48, D67) et leur couleur a été vérifiée au cours de trois d’entre elles (D0,
D31, D67) en comparant la couleur des soles à une gamme de Munsell (table 2.5Y, El-
lis et al. 1997). Cette gamme permet de décomposer une couleur selon trois paramètres
(Fig. 68, Annexe D, p. 218) : sa luminosité (Value), sa nuance (Hue) et sa pureté (Chroma)
. Seule la Value a été mesurée Pour chaque biométrie, les poissons ont été anesthésiés avec
de l’eugénol à une faible dose (0.01 mL.L-1 ) pour une simple sédation. Les données de
poids et de taille ont permis le calcul de différents indices. Le premier est le taux de crois-
sance spécifique (S GR M %), calculé selon la formule suivante :

ln M f − ln Mi
S GR M (%) = 100 · avec : M f , masse finale en g
T
Mi , masse initiale en g
T , temps en j
Le second est l’indice de condition de Fulton (K), calculé comme suit :
M
F = 100 · avec : M, masse en g
L3
L, longueur standard en cm
Dosages chimiques Lors des biométries à D31 et D67, 15 individus ont été sacrifiés afin
d’effectuer des dosages chimiques : 3 individus de la condition Plain, 2 de la condition
Solvent et 5 pour chacune des conditions PCB medium et PCB high.
Les prélèvements ont été effectués sur des individus sélectionnés selon leur SGRM (%)
en prenant soin de prélever pour chaque condition un individu dans la moyenne, un indi-
vidu au niveau le plus bas, un au plus haut et les deux derniers ont été choisis aléatoire-
ment, ceci dans le but de mettre en évidence les variations de contamination qu’il pouvait
exister au sein d’un groupe en lien avec la croissance (la contamination étant alimentaire
dans notre cas). Les dosages de PCB ont été effectués sur des échantillons de muscles se-
lon le protocole de Eichinger et al. (2010) par Véronique Loizeau (Ifremer LBCO, Brest).
Expérience nage 23 h Pour cette expérience les poissons ont été placés dans une salle
totalement isolée de toute source de lumière extérieure et soumis à une photopériode de
113
12 heures de jour et 12 heures de nuit, synchronisée avec celle de la salle d’élevage.

Cette salle est équipée de trois projecteurs à LED de 16 W chacun éclairant de manière
homogène la zone expérimentale durant les heures de jour, d’un plancher infra-rouge
(Noldus, Pays-Bas) placé sous les bacs expérimentaux et d’une caméra équipée d’un filtre
permettant d’éliminer la lumière visible. Le filtre placé sur la caméra ne laissant passer que
la lumière du plancher-infra rouge, les projecteurs de lumière visible servent uniquement
à assurer la photophase.
Noldus
PC
Visible Visible
light light
IR pass /
visible block filter
Day Night
conditions conditions
Infra-red light
Figure 45 – Montage expérimental pour la mesure de l’activité de nage pen-

dant 23 h chez des soles d’âge 0 contaminées pendant 30 et 60 j. Les poissons
sont détectés grâce au plancher infrarouge ; la lumière visible est éliminée
grâce à un filtre placé sur la caméra.
Les poissons ont été filmés par groupes de huit individus (deux individus par condi-
tion) répartis aléatoirement chacun dans un aquarium en verre (matière transparente aux
infrarouges) de 20 x 40 x 30 cm (Fig. 45). Les parois extérieures de chaque aquarium ont
été occultées afin d’empêcher les individus de se voir. La hauteur d’eau dans les aqua-
riums était de 7.5 cm afin d’optimiser les échanges gazeux air/eau et de limiter les biais
liés à la profondeur (la caméra ne prenant en compte les déplacements que sur 2 dimen-
sions). Chaque session durait 23 h, avec un début d’enregistrement à 12 h (au moment
où les poissons étaient placés dans les bacs d’expérimentation) et une fin le lendemain à
11 h. Durant l’heure séparant chaque session, les poissons ont été extraits des aquariums,
114
l’eau de chaque bac a été changée, puis à 12 h de nouveaux poissons ont été placés aléa-
toirement sans acclimatation dans les huit arènes (après vérification de leur marque afin
d’éviter qu’un individu ne passe deux fois). Entre les jours 27 et 33, puis entre les jours
57 et 63, six sessions ont été effectuées pour porter à 12 le nombre d’individus enregistrés
par condition. Les positions des aquariums, des éclairages (visibles et infrarouges) ainsi
que de la caméra restent inchangées afin d’éviter les variations de détection d’un jour sur
l’autre par le logiciel d’analyse d’image. Les vidéos ainsi obtenues sont à la fois enregis-
trées sur le disque dur et les trajectoires individuelles sont traitées en temps réel par le
logiciel Ethovision® (Noldus, Pays-Bas).
Expérience d’enfouissement Cette expérience consiste en un challenge d’enfouisse-

ment de 30 s dans un aquarium contenant un fond de sable (100 à 300 µm de diamètre,
Durieux et al. 2010). Vingt quatre heures avant le début de l’expérience ce même sable a
été passé au four à 400°C pour limiter au maximum les risques d’apport d’agents patho-
gènes dans l’élevage. Trente soles par condition ont été testées lors de cette expérience à
D30 et D60. Les résultats à D60 étant encore en cours d’analyse, seuls ceux de D30 seront
présentés dans ce manuscrit. Chaque poisson est placé pendant 30 s dans un aquarium de
20 litres contenant une couche de 2 cm de sable, disposée de manière homogène sur le
fond. L’arène de test est soumise à des conditions constantes de lumière et une caméra
fixée au-dessus de l’aquarium a permis de filmer les soles durant toute la durée du test.
Les vidéos ont été enregistrées directement sur ordinateur, puis analysées manuellement,
à l’aide du logiciel ODRec (http://www.samuelpean.com).
4.2.2.2 Phase de décontamination
Après 67 jours de contamination alimentaire aux PCB, les individus des conditions
Solvent, PCB medium et PCB high ont été conservés et nourris à l’aliment commercial
(Plain) pendant 40 j supplémentaires. Pendant les 26 premiers jours de la décontamina-
tion (annotés D’0 et D’26), les soles ont été soumises à des environnements de couleurs
différentes (claires et sombres) afin de solliciter leurs capacités d’adaptation chromatique.
Homochromie Six bacs d’élevage ont été aménagés pour accueillir des cuves de cou-
leur. Trois d’entre eux ont été équipés de cuves blanches, et les trois autres de cuves noires.
Les cuves ont été perforées afin d’altérer le moins possible l’hydrodynamisme des bacs.
Pendant les 13 premiers jours, les effectifs de chaque condition ont été divisés en deux
groupes, l’un étant placé dans un environnement sombre, l’autre dans un environnement
clair (Fig. 46). Au 13e j, les individus préalablement soumis à un environnement claire ont
été transférés dans les bacs sombres, et inversement. Les soles sont restées 13 j de plus
115
dans cet environnement. Durant les 3 premiers jours de chaque adaptation à la nouvelle
couleur d’environnement (au moment où la valeur de champ chromatique évolue le plus
rapidement Ellis et al. 1997), les valeurs chromatiques ont été relevées quotidiennement,
puis tous les 2 à 3 j afin de limiter le stress des poissons dû à la manipulation.
Données biométriques Les poissons ont été pesés et mesurés afin de calculer leurs taux
de croissance et les indices de condition aux jour D’0 et D’26.
Solvent
Solvent PCB medium
PCB medium PCB high
PCB high D’0
D’13 D’13
D’26
Figure 46 – Détail de l’expérience d’homochromie pour les 26 premiers jours
de décontamination des soles : pendant 13 j la moitié des individus de chaque
condition (Solvent, PCB medium et PCB high) est placée sur fond clair et
l’autre moitié sur fond sombre. Au 13e j, les poissons sont placés dans l’envi-
ronnement de l’autre couleur pendant encore 13 j.
Analyse de données Les variables utilisées pour l’ensemble des expériences sont les
suivantes :
1. Pour les données biométriques : le poids, le taux de croissance spécifique, l’indice

de condition de Fulton ;
2. Pour les données chimiques, la concentration en ng.g-1 de poids sec.
116
3. Pour les données chromatiques, les valeurs obtenues par comparaison avec le para-
mètre Value d’une gamme de Munsell (table 2.5Y) ;
4. Pour les données de video tracking, la distance parcourue toute les 30 min a été
analysées par blocs de 3 h ;
5. Pour les données d’enfouissement :
– la proportion d’individus qui se sont enfouis ;
– le temps de mobilité, calculé séparément pour les individus enfouis et non en-
fouis ;
– la durée de l’enfouissement ;
– la temps passé entre le début du challenge et la fin de l’enfouissement (appelé
latence avant enfouissement) ;
Les données ont été statistiquement testées à l’aide du logiciel Statistica 9.0 (Statsoft,
USA). Pour le nombre d’individus ayant répondu au challenge d’enfouissement à 30 jours,
un test de Khi2 a été réalisé afin de vérifier si le nombre d’individus enfouis et non enfouis
étaient statistiquement équivalents.
Pour chacune des autres variables, un test de Shapiro-Wilk a été réalisé afin de tester la
normalité des données, suivi d’un test de Bartlett pour tester leur homoscédasticité. Ces
deux tests n’étant pas satisfaits, des tests de Mann-Whitney ont été réalisés pour comparer
les différences entre les jours de la mesure (D30, D60) au sein de chaque condition, et des
tests de Kruskal-Wallis (Zar, 1999), suivis de test de comparaisons de rang multiples, ont
été réalisés pour comparer les résultats entre les quatre traitements (Plain, Solvent, PCB
medium et PCB high) pour chaque point de mesure (D30, D60).
Pour les données d’activité de nage sur 23 h, les distances parcourues obtenues toutes
les 30 min ont été regroupées par bloc de 3 h pour le premier jour et la nuit, puis un bloc
de 2 h pour le deuxième jour. Au sein de chaque période (8 au total), les tests de Kruskal-
Wallis ont été utilisés pour comparer les distances parcourues entre chaque traitement.
Les analyses statistiques ont été réalisées avec une significativité de 95%.
4.3 Résultats
4.3.1 Phase de contamination
4.3.1.1 Données biométriques
Pour chacune des dates de mesure, les poids ne présentent pas de différences statis-
tiques significatives entre les conditions (Fig. 47A ; Tab. 4) sur l’ensemble des 67 jours de
contamination. Les taux de croissance spécifique S GR M (%) présentent quant à eux une
117
différence statistique significative au dernier point de mesure, c’est-à-dire à D67, pour

lequel les individus des conditions Solvent et PCB high présentent un taux de croissance
journalier significativement plus élevé que la condition Plain. Les individus de la condi-
tion PCB high présentent aussi un taux de croissance plus élevé que ceux de la condition
PCB medium. L’indice de condition de Fulton montre une différence à D0 de la contami-
nation entre les individus de la condition Plain et ceux de la condition PCB medium.
Table 4 – Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données bio-
métriques des soles contaminées aux PCB pendant 60 j présentées en Fig. 47.
Les valeurs en gras représentent les différences statistiques significatives entre
les quatre conditions Plain, Solvent, PCB medium et PCB high
Variable Jour / période Résultat du test (ddl, N) Valeur de p

Poids D0 K-W : H(3, 164) =7.247 0.064
D14 K-W : H(3, 164) =5.320 0.150
D31 K-W : H(3, 164) =4.445 0.217
D48 K-W : H(3, 164) =1.416 0.702
D67 K-W : H(3, 164) =0.625 0.891
S GR M (%) D0-D14 K-W : H(3, 164) =2.296 0.513
D14-D31 K-W : H(3, 164) =4.401 0.221
D31-D48 K-W : H(3, 164) =7.299 0.063
D48-D67 K-W : H(3, 164) =24.603 <0.001
Indice de D0 K-W : H(3, 164) =12.631 0.005
Fulton D14 K-W : H(3, 164) =4.560 0.207
D31 K-W : H(3, 164) =1.105 0.776
D48 K-W : H(3, 164) =0.300 0.960
D67 K-W : H(3, 164) =3.414 0.332
118
30 Plain Solvent PCB medium PCB high

A NS
25 NS
NS NS
20 NS
Weight in g
15
10
0
D0 D14 D31 D48 D67
1.2
B NS
1
NS c
Specific Growth Rate (SGR) in %
bc
0.8
ab
0.6 a
0.4
NS
0.2
-0.2
D0-D14 D14-D31 D31-D48 D48-D67
1.6
C
NS NS
1.4 a NS
NS
ab b ab
1.2
Fulton index (K)
0.8
0.6
0.4
0.2
0
D0 D14 D31 D48 D67
Figure 47 – Données biométriques des soles pendant les 60 j de contamination

aux PCB. A : Poids en g ; B : Taux de croissance spécifique S GR M (%) ; C :
Indice de condition de Fulton. Les données exprimées sont des moyennes
± erreur-type. Les lettres représentent les différences statistiques (Kruskal-
Wallis) avec NS pour les différences non-significatives.
119
4.3.1.2 Dosages chimiques
1200 D30 D60

Concentration in ng.g-1 of dry weight
1000
*
800
*
600
400
200
0
Plain-Solvent PCB medium PCB high
Figure 48 – Dosages chimiques dans les muscles de sole après 30 et 60 j de

contamination aux PCB. Les données représentées sont des moyennes±erreur
type. Les astérisques représentent les différences significatives entre les condi-
tions.
Les profils de contamination montrent que les individus de la condition Plain n’étaient
pas différents de ceux de la condition Solvent à D30 (M-W : Z1,11 =0.436, p=0.662) et à
D60 (M-W : Z1,11 =-0.289, p=0.773), les effectifs de ces deux conditions ont été regroupés
(détail des congénères en Fig. 69, Annexe E, p.219). Au sein de chaque condition (Plain–
Solvent, PCB medium et PCB high), les différences de concentration entre D30 et D60 ne
sont pas significatives (Fig. 48 ; Tab. 5). Au sein de chaque date (D30, D60), la condition
Plain–Solvent est dans les deux cas significativement inférieure à la condition PCB high.
120
Table 5 – Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données

chimique des soles contaminées aux PCB pendant 30 et 60 j présentées en
Fig. 48. Les valeurs en gras représentent les différences statistiques significa-
tives entre les trois conditions Plain–Solvent, PCB medium et PCB high.
Effet Label Résultat du test (ddl, N) Valeur de p

Jour Plain–Solvent M-W : Z(1, 11) =0.000 1.000
PCB medium M-W : Z(1, 10) =1.464 0.144
PCB high M-W : Z(1, 10) =1.671 0.095
Condition D30 K-W : H(2, 15) =12.500 <0.002
D60 K-W : H(2, 15) =12.922 <0.002
4.3.1.3 Valeurs de champ chromatique
Les valeurs de Munsell correspondant au champ chromatique des soles pendant les 67 j
de contamination ne montrent aucune différence significative entre les différents groupes
de contamination (Fig. 49 & Tab. 6).
6
NS
5 NS
NS
4
Munsell value
0
D0 D31 D67
Figure 49 – Valeurs de champ chromatique des soles pendant les 60 j de

contamination aux PCB obtenues à partir d’une gamme de Munsell. Les don-
nées exprimées sont des moyennes ± erreur-type. Les lettres représentent les
différences statistiques (Kruskal-Wallis) avec NS pour les différences non-
significatives.
121
Table 6 – Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des valeurs des
champs chromatiques des soles contaminées au PCB pendant 60 j présentées
en Fig. 49. Les valeurs en gras représentent les différences statistiques signi-
ficatives.
Jour Résultat du test (ddl, N) Valeur de p

D0 K-W : H(3, 164) =1.654 0.647
D31 K-W : H(3, 164) =5.581 0.134
D67 K-W : H(3, 164) =5.841 0.120
4.3.1.4 Activité de nage pendant 23 h
Concernant la première partie de l’expérience, après 30 j de contamination (Fig. 50A ;

Tab. 7), pendant les premières heures du test (de 12 h à 18 h) les individus du groupe
PCB high présentent une activité locomotrice significativement plus élevée que les autres
conditions. Durant les 3 h suivantes (18 h à 21 h), les individus de la condition PCB high
présentent une activité significativement plus élevée que ceux de la condition PCB me-
dium. Pendant la nuit, entre 21 h et 6 h, les individus de la condition Solvent présentent
une activité significativement plus élevée que les autres (Fig. 50A ; Tab. 7). Durant l’en-
semble de la nuit (de 21 h à 9 h), les individus de la condition PCB medium ont quant à
eux une activité de nage significativement moins importante que les individus des autres
conditions. Lors de la reprise de la lumière (de 9 h à 11 h), seuls les individus de la condi-
tion Plain présentent une activité significativement plus importante que la condition PCB
medium.
Après 60 j de contamination (Fig. 50B ; Tab. 7), les individus de la condition Plain sont
significativement moins actifs que ceux des autres conditions entre 12 h et 18 h. Durant
l’ensemble de la nuit (de 21 h à 9 h), les individus de la condition Solvent ont une activité
significativement plus élevée que ceux des autres conditions, sauf pour la période 0 h-3 h
où les soles de la condition PCB high ont un niveau d’activité comparable. À la reprise de
la lumière (de 9 h à 11 h), seuls les individus de la condition Plain présentent une activité
significativement moins importante que les autres.
122
A 16000 Plain Solvent PCB medium

b
PCB high
b
Distance travelled in cm.30 min-1
a
12000
a
b
a a
a
a
8000 a
a ab
a
a
b bab
4000 c b
a b
c
aa c
a
a ab b
a ab a
0
16000 12h - 15h 15h - 18h 18h - 21h 21h - 0h 0h - 3h 3h - 6h 6h - 9h 9h - 11h
B
Distance travelled in cm.30 min-1
12000
8000
b b
b
b ab
a
4000 a a ac a aa b
a a b
c
b cbc a b
b b NS
a a b a
0
12h-15h 15h-18h 18h-21h 21h-0h 0h-3h 3h-6h 6h-9h 9h-11h
Figure 50 – Distance parcourue pendant 23 h par les soles après 30 et 60 j

de contamination alimentaire aux PCB. A : Distance parcourue après 30 j
de contamination ; B : Distance parcourue après 60 j de contamination. Les
barres noires sur l’axe des abscisses symbolisent les heures de nuit. Les don-
nées exprimées sont des moyennes ± erreur-type. Les lettres représentent les
différences statistiques (Kruskal-Wallis) avec NS pour les différences non-
significatives.
123
Table 7 – Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données d’ac-
tivité de nage pendant 23 h des soles contaminées aux PCB pendant 30 puis
60 j en Fig. 50. Les valeurs en gras représentent les différences statistiques
significatives.
Jour Période de la journée Résultat du test (ddl, N) Valeur de p

D30 12 h-15 h K-W : H(3, 288) =34.129 <0.001
15 h-18 h K-W : H(3, 288) =39.697 <0.001
18 h-21 h K-W : H(3, 288) =9.656 0.022
21 h-0 h K-W : H(3, 288) =41.330 <0.001
0 h-3 h K-W : H(3, 288) =99.786 <0.001
3 h-6 h K-W : H(3, 288) =96.446 <0.001
6 h-9 h K-W : H(3, 288) =46.685 <0.001
9 h-11 h K-W : H(3, 182) =8.849 <0.031
D60 12 h-15 h K-W : H(3, 276) =47.574 <0.001
15 h-18 h K-W : H(3, 276) =71.653 <0.001
18 h-21 h K-W : H(3, 276) =6.380 0.094
21 h-0 h K-W : H(3, 276) =46.881 <0.001
0 h-3 h K-W : H(3, 276) =25.101 <0.001
3 h-6 h K-W : H(3, 276) =27.951 <0.001
6 h-9 h K-W : H(3, 276) =33.182 <0.001
9 h-11 h K-W : H(3, 184) =38.926 <0.001
124
4.3.1.5 Challenge d’enfouissement sur fond sableux
Après 30 jours de contamination alimentaire, le nombre d’individus enfouis pendant

le challenge n’est pas significativement différent d’une condition à l’autre (Fig.51 ; test
de Khi2 , χ2 (ddl=3, N=8) = 4.907, p = 0.179). De même, pendant ce challenge, les temps
de mobilité des soles non enfouies ou enfouies, la durée de l’enfouissement ainsi que le
temps de latence entre le début du challenge et la fin de l’enfouissement, ne diffère pas
significativement entre les différentes conditions (Fig. 52 & Tab. 8).
70%
NS
60%
Porportion of burried individuals in %
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Plain Solvent PCB medium PCB high
Figure 51 – Pourcentages de soles enfouies après 31 jours de contamination

aux PCB. Les lettres représentent les différences statistiques (Khi2 ) avec NS
pour les différences non-significatives.
Table 8 – Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données du

challenge d’enfouissement pendant 30 s sur des soles contaminées au PCB
pendant 30 j présentées en Fig. 52. Les valeurs en gras représentent les diffé-
rences statistiques significatives.
Jour Période de la journée Résultat du test (ddl, N) Valeur de p

D30 Mobilité (ind. non enfouis) K-W : H(3, 55) =2.530 0.470
Mobilité (ind. enfouis) K-W : H(3, 62) =3.177 0.365
Durée enfouissement K-W : H(3, 62) =0.559 0.906
Latence enfouissement K-W : H(3, 62) =1.051 0.789
125

00:30
Burying fail Burying success
NS
00:20
Time (mm:ss)
NS
NS
00:10
NS
00:00
Time mobile Time mobile Burrying duration Burrying latency
Figure 52 – Temps de mobilité (pour les soles non enfouies et enfouies), d’en-
fouissement et de latence avant enfouissement. Les données exprimées sont
des moyennes ± erreur-type. Les lettres représentent les différences statis-
tiques (Kruskal-Wallis) avec NS pour les différences non-significatives.
4.3.2 Phase de décontamination
4.3.2.1 Données biométriques
Les poids mesurés entre le premier jour de décontamination (D’0) et le dernier jour
(D’26) ne montrent aucune différence significative entre les trois conditions (respective-
ment H(2, 33) =0.8124, p=0.666, et H(2, 33) =0.400, p=0.819), de même pour le S GR M (%)
(H(2, 33) =2.102, p=0.350).
4.3.2.2 Homochromie
Pendant l’expérience d’homochromie (Fig. 53 & Tab. 9), les résultats statistiques mon-
trent qu’à D’0 et D’2, les individus de la condition PCB high placés sur fond noir sont
significativement plus clairs que ceux de la condition Solvent. À D’3, toujours pour le
groupe sur fond noir, ce sont à la fois les individus des conditions PCB medium et PCB
high qui sont plus clairs que les individus Solvent. Pour le groupe d’individus ayant com-
mencé sur fond clair, aucune différence statistique ne se dégage sur la partie sur fond
blanc. En revanche, lorsque se groupe passe sur fond noir, les individus de la condition
PCB high sont significativement plus clairs que ceux de la condition Solvent et à D’26,
ce sont ceux de la condition PCB medium qui sont plus clairs que ceux de la condition
Solvent. Les différences statistiques données par le test de Kruskall-Wallis à D’14 sur
126
fond noir et à D’26 sur fond blanc ne se retrouvent pas dans les post-test de comparaisons
multiples.
8 Solvent Black Solvent White

PCB medium Black PCB medium White
PCB high Black PCB high White
Background colour
inversion (D13)
*
*
6
Munsell value
*
* * *
4 *
2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Time in days
Figure 53 – Valeurs de Munsell de soles soumises à des environnements clairs

ou sombres après 60 j de contamination aux PCB. Les astérisques identifient
les point de mesure pour lesquels des différences statistiques significatives ont
été observées.
127
128
Table 9 – Récapitulatif des tests statistiques réalisés à partir des données du test d’homochromie pendant 26 j sur des soles après
une contamination aux PCB pendant 67 j présentées en Fig. 53. B : blanc ; N : noir ; S : Solvent ; Pm : PCB medium ; Ph :PCB
high. Les valeurs en gras représentent les différences statistiques significatives.
Jour Lot B>N Résultat du test (ddl, N) Valeur de p Post-test Lot N>B Résultat du test (ddl, N) Valeur de p Post-test
D’0 B K-W : H(2, 33) =10.092 0.064 – Noir K-W : H(2, 39) =18.240 <0.001 Ph>S
D’1 B K-W : H(2, 33) =4.000 0.135 – N K-W : H(2, 39) =2.594 0.273 –
D’2 B K-W : H(2, 33) =2.556 0.279 – N K-W : H(2, 39) =13.309 0.001 Ph>S
D’3 B K-W : H(2, 32) =0.939 0.625 – N K-W : H(2, 39) =23.218 <0.001 Ph & Pm > S
D’6 B K-W : H(2, 32) =1.354 0.508 – N K-W : H(2, 39) =5.355 0.068 –
D’8 B K-W : H(2, 32) =0.939 0.625 – N K-W : H(2, 39) =1.045 0.593 –
D’10 B K-W : H(2, 32) =0.422 0.810 – N K-W : H(2, 39) =4.777 0.091 –
D’13 B-N K-W : H(2, 32) =3.444 0.179 – N-B K-W : H(2, 39) =2.474 0.290 –
D’14 N K-W : H(2, 33) =7.206 0.027 – B K-W : H(2, 39) =4.638 0.098 –
D’15 N K-W : H(2, 33) =1.684 0.431 – B K-W : H(2, 39) =6.244 0.044 –
D’16 N K-W : H(2, 32) =5.541 0.063 – B K-W : H(2, 39) =2.051 0.358 –
D’19 N K-W : H(2, 32) =10.780 0.005 Ph>S B K-W : H(2, 39) =2.051 0.358 –
D’21 N K-W : H(2, 33) =4.303 0.116 – B K-W : H(2, 39) =2.576 0.275 –
D’23 N K-W : H(2, 32) =4.281 0.118 – B K-W : H(2, 39) =0.913 0.633 –
D’26 N K-W : H(2, 32) =16.022 <0.001 Pm>S B K-W : H(2, 39) =7.064 0.029 –
4.4 Discussion
Les variables biométriques mesurées (poids, S GR M (%), indice de Fulton) permettent
dans un premier temps d’affirmer que les PCB n’ont pas produit d’effets sur la croissance
des individus, et, dans un second temps, permettent de confirmer que les conditions restent
bien comparables entre elles en terme de poids et de taille pour les expérience suivantes.
Concernant le taux de croissance spécifique journalier, la baisse importante mesurée entre
les jours D14 et D31 pour l’ensemble des conditions s’explique par un traitement lié à une
pathologie contractée durant cette période. La pathologie a particulièrement touché les
individus de la condition Solvent mais toutes les conditions ont reçu le même traitement
(2 h de balnéation dans de l’OTC à 0.02 g.L-1 tous les 2 jours pendant 10 j). Suite au
traitement, l’ensemble des conditions montre un taux de croissance journalier faible, mais
néanmoins positif. Le taux de croissance journalier de périodes suivantes (D31-D48 et
D48-D67) est comparable à celui obtenu avant la pathologie (D0-D14), ce qui montre une
bonne récupération.
Les résultats des analyses chimiques montrent que les individus contaminés par voie
alimentaire (PCB medium et PCB high) présentent bien une contamination aux PCB plus
importante que les individus des conditions Plain et Solvent. Toutefois, les individus des
conditions Plain et Solvent présentent tout de même des concentrations en PCB dans le
muscle aux jours 31 et 67, sans qu’il y ait pour autant d’augmentation entre ces deux
points. Des analyses chimiques complémentaires ont été réalisées sur ces deux conditions
afin d’expliquer l’origine de ce bruit de fond. Ces analyses ont montré que le profil de
concentration des congénères retrouvés dans le muscle des individus de ces deux condi-
tions était différents de celui des congénères présents dans les granulés. L’origine de ce
bruit de fond pourrait donc être lié aux la structures d’élevage en elle-mêmes. Les pro-
fils de concentration observés entre conditions ou entre congénères au sein d’une même
condition correspondent bien aux profils de concentration attendus : la condition PCB me-
dium possède bien un niveau de concentration intermédiaire situé entre celui des groupes
Plain / Solvent et PCB high.
L’augmentation de concentration des congénères entre les jours 31 et 67 n’est cepen-
dant pas linéaire, et ne suit pas l’augmentation de la croissance dans un système en condi-
tions constantes de température (19° C). Cette cinétique de contamination est comparable
à celle obtenue par Eichinger et al. (2010) sur des soles de même âge, contaminées avec
le même aliment et le même mélange de PCB. Elle peut s’expliquer par la mise en place
de mécanismes de détoxification au delà de 30 jours de contamination. Les plus faibles
valeurs mesurées par Eichinger et al. (2010) autour de 30 et 60 jours de contamination
comparées aux nôtres peuvent s’expliquer par le taux de croissance particulièrement élevé
des soles durant notre expérience.
129
D’une manière générale, la contamination mesurée dans les soles durant cette expé-
rience correspond à la contamination attendue au moment de la fabrication des aliments.
Les mesures chromatiques effectuées pendant la contamination n’ont montré aucune
différence significative entre les conditions à aucune des dates de mesure.
Concernant les expériences de locomotion, l’ensemble des conditions présente une ac-
tivité plus élevée la nuit que le jour. Ceci confirme le caractère nocturne des soles (Kruuk,
1963), y compris en situation d’élevage, c’est-à-dire sans pression de prédation ainsi qu’un
nourrissage forcé le jour. De plus, l’ensemble des conditions présente une activité plus éle-
vée au jour 30 qu’au jour 60. Ceci peut s’expliquer par le traitement lié à la pathologie,
qui a pu augmenter la recherche alimentaire (suite à un déficit de croissance) ou influer
directement sur l’activité. Une hypothèse alternative, ou cumulative, serait qu’avec leur
croissance, l’arène est devenue plus réduite, ce qui aurait pu renforcer l’effet confinement
et réduire l’activité locomotrice. Lors des deux tests, les individus de la condition Solvent
présentent une activité anormalement élevée, particulièrement lors du premier test. Ceci
peut être aussi attribué à la maladie qui les a touché. Pour cette raison, l’interprétation des
résultats de cette expérience se basera plutôt sur les différences entre les conditions PCB
medium et PCB high et la condition Plain.
Lors du premier test au 30e jour, la condition PCB high présente une activité signifi-
cativement plus élevée que les autres durant les 6 premières heures du test (de 12 à 18 h)
qui peut être expliquée par un temps d’adaptation plus long au nouvel environnement et
une récupération altérée suite au stress lié au transfert du bac d’élevage à celui d’expéri-
mentation. Lors du deuxième test à 60 j, ceci se produit à nouveau, avec les conditions
PCB medium et PCB high qui présentent une activité significativement plus élevée que la
condition Plain.
La condition PCB medium est significativement moins active pendant l’ensemble de la
nuit (de 21 h à 9 h) du test à 30 j. Cette différence ne se retrouve pas lors du deuxième
test. Ceci peut s’expliquer par deux raisons :
– la première étant que les soles ont eu une croissance importante (50% en moyenne)
et avaient donc moins d’espace dans l’enceinte à D67 qu’à D31 ;
– la deuxième étant que la perte de croissance engendrée par le traitement lié à la
pathologie peut augmenter l’activité locomotrice pour la recherche d’aliments ;
À D30, il y a une moins bonne acclimatation de la condition PCB high et une prostra-
tion renforcée de la condition PCB medium lors du premier test. Alors que le problème
d’adaptation reste visible sur les 6 premières heures du test à 60 j (cette fois-ci pour les
deux conditions contaminées), la plus faible activité nocturne des PCB medium n’est plus
significative.
Les challenges d’enfouissement après 30 j de contamination sur 30 s n’ont quant à eux
130
montré aucune différence significative entre les conditions.
Pendant la phase de décontamination, le test d’homochromie réalisé pendant 26 jours

a montré une moins bonne adaptation des conditions PCB medium et PCB high chez
les individus disposés sur un fond sombre. Ces résultats ont été retrouvés à la fin du
test chez les individus ayant été préalablement placés sur fond sombre. La différence
entre les conditions observées entre le dernier jour de la phase de contamination (D67)
et le premier jour de la phase de décontamination (D’0) s’explique par le fait que les lots
constitués à D’0 constituent un sous-échantillonnage de D67. De plus, le manipulateur est
resté le même pour les points D0, D31, D67, mais c’est une autre personne qui a réalisé
les mesures de D’0 à D’67.
Les individus contaminés semblent donc s’adapter plus facilement aux fonds de cou-
leur clairs qu’à ceux de couleur sombre. Une première hypothèse expliquant cette diffi-
culté à changer de couleur serait une moins bonne perception visuelle, mais aucune étude
jusqu’à présent n’a mis en évidence d’effet des PCB sur la vision, auquel cas le problème
aurait dû se présenter aussi lors du passage sur fond clair, ce qui n’est pas arrivé. L’expli-
cation la plus plausible serait liée au fait que l’assombrissement des soles se fait à court
terme par dilatation des chromatophores puis par synthès de pigment, contrairement à
l’éclaircissement Burton (2002). Cette synthèse représentant un coût métabolique et donc
un état physiologique correct ce qui pourrait ne pas être le cas chez les soles contaminées,
dont une partie de l’énergie métabolique est allouée à la détoxification.
L’altération de l’activité locomotrice et des capacités des soles à s’assombrir avait déjà
été mise en évidence dans une première étude menée en 2009 (Fig. 54) sur un nombre
d’individus moindre et dans des conditions d’élevage différentes (individus placés par
groupes de 8 dans des aquarium de 60 L). Cette expérience avaient montré une baisse
significative du comportement exploratoire des soles de la condition la plus contaminée
(« PCB fort », équivalente à la condition PCB high de notre expérience) après 30 jours de
contamination. De plus, une préférence plus importante des individus contaminés pour un
environnement sombre a été montré, bien que leur capacité à s’assombrir soit aussi altérée
lors de cette étude. Enfin, les individus contaminés avaient aussi montré des capacités une
altération des capacités d’enfouissement.
131
Samuel PÉAN – samuel.pean@ifremer.fr
Effets des polluants organiques sur le

comportement des poissons VMC / SoleBEMoL
Étude présentée :
Effets des PCB sur le comportement de la sole
Samuel PÉAN1, Anne-Lise MAYERAS1, Véronique LOIZEAU2, Marie-Laure BÉGOUT1
1 – IFREMER, place Gaby Coll BP 5, 17137 L’Houmeau - FRANCE
2 – IFREMER, Z.I. Pointe du Diable BP 70, 29280 Plouzané - FRANCE
Que sont les PCB ? Pourquoi étudier le comportement ? Pourquoi choisir la sole ?
Les PCB sont des polluants dits « organiques », créés par L’étude du comportement est une approche non invasive La sole commune Solea solea est une espèce d’intérêt
l’Homme, très stables dans l’environnement (demi-vie de et non destructrice, qui permet d’obtenir une grande économique. C’est une espèce benthique (=« qui vit au
2700 ans). Ces composés hydrophobes sont très quantité d’information par simple observation. fond »). Cette espèce est donc très exposée aux
présents dans les sédiments marins et s’accumulent dans L’utilisation d’outils informatiques (comme les logiciels sédiments contaminés.
les organismes vivants. d’analyse d’images) permet d’obtenir des données de
plus en plus précises.
Voici les expériences qui ont été menées sur des soles juvéniles, après 30 jours de contamination aux PCB par voie alimentaire. Quatre groupes ont été constitués, en fonction de
leurs aliments : Témoin : aliment commercial standard, non contaminé; Solvant : aliment contenant uniquement du solvant (isooctane), nécessaire pour intégré les PCB dans
l’aliment; PCBfaible : aliment contenant du solvant et une faible dose de PCB; PCBfort : aliment contenant du solvant et une forte dose de PCB (équivalent à la concentration observée
en Baie de Seine).
COMPORTEMENT EXPLORATOIRE 3000
Distance parcourue en moyenne après 2h

ab
Aliment Pas d’aliment
Cette expérience a pour but de suivre l’évolution d’un b
(en cm ; ± erreur-type)
ab
poisson dans un labyrinthe (fig.1) pendant 2h grâce à une 2000
caméra et un logiciel de détection de mouvements (Noldus
Ethovision).
c
1000
Plusieurs variables ont été analysées (temps pour atteindre
la zone d’alimentation, temps de mobilité, etc..). Le plus
représentatif d’entre eux est la distance parcourue moyenne
0
Départ (fig.2) qui montre que le groupe PCBfort se déplace
Témoin Solvant PCB Faible PCB Fort
significativement moins que les autres.
Figure 1 : Labyrinthe utilisé pour le comportement Traitement
exploratoire. Figure 2 : Distance parcourue moyenne (en cm) . Les lettres représentent les
différences entre traitements (Kruskal-Wallis – p< 0.05 –Dunns post-test)
100 1
CHOIX DE COULEUR DE FOND
Coefficient de dispersion moyen (± erreur-

Pourcentage moyen du groupe sur l’aire
Pendant 2h, cinq soles sont filmées sur un substrat bicolore 80 c 0.8
b
(noir vs blanc ; fig.3). Les vidéos sont traitées par le plugin
noire (± erreur-type)
a b
MTrack du logiciel ImageJ (tracking manuel). Ceci permet 60 c
a
0.6
type)
d’obtenir les coordonnées de chaque individu, et donc de
calculer leur position exacte dans le bac ainsi que la distance 40 a 0.4
qui les sépare les uns des autres. a
20 0.2
Le niveau de contamination n’explique pas la variation du
coefficient de dispersion (fig.4). En revanche, plus le niveau 0 0
0 Témoin 1 Solvant 2 PCB Faible 3 PCB Fort 4
de contamination augmente, plus les individus passe du
Traitement
Figure 3 : Bac expérimental pour l’étude du choix de temps en zone noire (fig.4).
Figure 4 : Pourcentage du groupe sur fond noir et coefficient de dispersion.
couleur de fond.
Les lettres représentent les différences entre traitements (Kruskal-Wallis –
p< 0.05 –Dunns post-test)
6.5
CAPACITÉS CRYPTIQUES ET ENFOUISSEMENT Environnement NOIR Environnement BLANC
Durant 13 jours, les soles sont placées dans un
environnement noir (fig.5). Régulièrement, leur 5.5
PCB Fort
pigmentation est comparée à une gamme de

Valeur de Munsell
Valeur de Munsell
Munsell® (table 2.5Y). Immédiatement après, un
4.5
challenge d’enfouissement dans du sable noir est Témoin
13 jours dans un environnement noir effectué. Les 13 jours suivants, elles sont placées dans
Challenge d’enfouissement sur
sable noir (30 sec)
un environnement blanc, et challengées dans du sable 3.5
clair.
2.5
Les résultats montrent qu’en terme de cinétique de
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
pigmentation (fig.6), le groupe PCBfort se pigmente Temps en jours
Valeur de Munsel
plus difficilement que le groupe Témoin en Figure 6 : Evolution de la valeur de Munsell® moyenne (table 2.5Y)
environnement noir et se dépigmente plus facilement
sur environnement blanc. Environnement BLANC Environnement NOIR
13 jours dans un environnement blanc Challenge d’enfouissement sur Au niveau des capacités d’enfouissement (fig.7), le
sable blanc (30 sec) 100% a b a b
groupe PCBfort met significativement plus de temps à
Figure 5 : Protocole expérimental suivi pour l’analyse des capacités
cryptiques s’enfouir que le groupe Témoin. 80%
Temps avant
Pourcentage d'individus
l'enfouissement
>30s
60%
20s - 30s
CONCLUSION
10s - 20s
En conclusion une exposition à une forte dose de PCB : i) diminue la distance parcourue lors de l’exploration d’un 40% 0s - 10s
nouveau milieu (fig.2) ; ii) diminue les capacités de pigmentation (fig.6) et d’enfouissement (fig.7) et iii)
augmente la préférence pour les milieux de couleur noire (fig.4). 20%
Les individus contaminés préfèrent les couleurs sombres mais ont une pigmentation plus claire : ces deux
0%
résultats peuvent s’expliquer par le stress métabolique dû aux phénomènes de décontamination. Témoin PCB Fort Témoin PCB Fort
Traitement
A cause de leurs capacités cryptiques réduites, les individus contaminés peuvent donc être plus facilement Figure 7 : Proportions d’individus pour chaque classe de latence
visibles par leurs prédateurs, ce qui peut avoir des conséquences négatives quant à la survie de la population. d’enfouissement en fonction de la couleur de fond. Les lettres représentent
les différences entre traitements et environnements (Test de Khi²)
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier Didier LEGUAY et Michel PRINEAU, sans qui l’aménagement de la salle d’expérimentation n’aurait pas été possible.
Figure 54 – Résultats obtenus après une première expérience de contamina-

tion sur 30 j. Poster présenté dans le cadre de la Journée des Doctorants de
l’Université de La Rochelle en 2010.
132
4.5 Conclusions
Cette étude a montré une différence significative du temps d’adaptation d’individus
contaminés aux PCB à un nouvel environnement après 30 et 60 j de contamination. Pen-
dant la nuit, les individus contaminés à dose intermédiaire (PCB medium) ont montré
une prostration importante après 30 j de contamination, vraisemblablement renforcée par
le stress induit par le traitement médicamenteux appliqué à l’ensemble des conditions
entre 30 et 60 j. Les individus contaminés ont aussi montré de plus grandes difficultés
à s’assombrir lors du challenge sur fond noir, sans pour autant rencontrer de problème
pour s’éclaircir. Aucune différence significative n’a été montrée dans cette étude quant à
un effet des PCB sur le poids, le taux de croissance, l’indice de condition ou encore les
capacités d’enfouissement mesurées à 30 jours.
D’une manière générale, l’altération du comportement locomoteur ainsi que des ca-
pacités cryptiques par les PCB peut avoir des conséquences écologiques importantes. En
effet, concernant la locomotion, une activité réduite aura pour conséquences de diminuer
la recherche alimentaire, alors qu’une capacité d’adaptation chromatique limitée pourra
augmenter la vulnérabilité des soles vis-à-vis des prédateurs.
133
Chapitre 5
Long-term food-exposure to PCB mixtures induces

behavioural disruptions in zebrafish
Samuel PÉAN
Tarek DAOUK
Laura LYPHOUT
Didier LEGUAY
Véronique LOIZEAU
Xavier COUSIN
Marie-Laure BÉGOUT
Manuscrit soumis à Aquatic Toxicology

Résumé
Les poissons zèbres utilisés dans cette étude ont été préalablement contaminés pendant
250 jours par voie alimentaire aux PCB, en utilisant des doses et des mélanges exis-
tants dans l’environnement. Différents traits comportementaux ont été étudiés, tels que le
choix de la couleur de fond, l’exploration lors d’un challenge en T-maze ou encore l’ac-
tivité de nage pendant 24 h. Les individus appartenant à la condition la plus contaminée
(équivalente à celle trouvée en baie de Seine) ont montré une augmentation de l’activité
locomotrice en fin de nuit. Les poissons appartenant à la condition de contamination inter-
médiaire ont montré une altération comportementale proche du syndrome d’hyperactivité
et de manque d’attention (ADHD) déjà observé chez des Hommes contaminés aux PCB.
Les potentielles conséquences écologiques de ces résultats sont discutées en lien avec les
questions de reproduction, de fitness populationnelle et de survie. Ces résultats montrent
que les poissons zèbres peuvent aussi servir comme modèle pour mieux comprendre les
mécanismes provoquant ces syndromes ADHD induits par les PCB chez l’Homme.
Cette étude sur une première génération de poisson zèbre a permis de mettre en place
un premier lot d’expériences permettant de détecter une altération comportementale liée
à une contamination aux PCB. D’un point de vue méthodologique, les expériences basées
sur le suivi de la locomotion par video tracking sont adaptées pour mesurer une altération
comportementale liée aux PCB.
137
Long-term food-exposure to PCB mixtures induces

behavioural disruptions in zebrafish
Samuel Péan, Tarek Daouk, Laura Lyphout, Véronique Loizeau, Xavier Cousin,
Marie-Laure Bégout
Abstract: Use of polychlorinated biphenyls (PCBs) has been banned for several decades
but these compounds are still present in the environment and can be transferred up through
the trophic chain, including to humans. Field analyses and experimental exposures have
established links between PCB exposure and alterations in animal physiology and behaviour.
In the present study, several behavioural traits were monitored after long-term exposure
of zebrafish to a PCB mixture mimicking known environmental contamination levels and
congener composition. Fish exposed to the highest dose (equivalent to that found in the Seine
Estuary) displayed an increased swimming activity during the period at the end of the night.
Fish exposed to an intermediate dose (equivalent to that found in the Loire estuary) displayed
behavioural disruption analogous to hyperactivity that showed some similarities to a human
behavioural deficit syndrome known as attention deficit / hyperactivity disorder (ADHD),
which can be observed in humans after exposure to PCBs. Potential ecological consequences
are discussed with regard to reproduction, fitness and survival. These findings suggest
that zebrafish could also serve as a model to better understand mechanisms underpinning
behavioural disruptions and potentially be used to screen for drugs to alleviate PCB-induced
ADHD in humans.
Keywords: background colour preference, exploration, swimming activity, organic

pollutant effects, video analysis.
5.1 Introduction
Polychlorinated biphenyls (PCBs) are synthetic molecules composed of a biphenyl nu-

cleus with chlorine at any or all of the 10 available sites (McFarland et Clarke, 1989). The
ortho, meta, and para positions are important in determining the chemical properties of
PCB, such as non-flammability, hydrophobic quality and chemical stability. The useful-
ness of these properties led PCBs to be used for a wide range of applications from the
1930s onwards (Breivik et al., 2002; Beyer et Biziuk, 2009). However, as their toxicity
became recognised, PCBs were progressively banned in most developed countries dur-
ing the 1980s (Letz, 1983). Nevertheless, due to their massive production, extensive use
and environmental persistence, these compounds had accumulated in many ecosystems
all over the world, including those of aquatic environments, where they were trapped in
the sediments. Contaminations continue to occur because PCBs can be transferred from
the sediment to the lower trophic levels of an ecosystem and then to the higher ones. They
can also be released when sediments are re-suspended as a consequence of human activ-
139
ities (e.g., trawling or dredging) or natural events (floods). The long biological half-life
and high liposolubility of PCBs can lead to their bioaccumulation and biomagnification
through food chains over a wide range of trophic levels, leading to a potential risk for high
trophic level predators (Fisk et al., 1998; Borgå et al., 2001; Fisk et al., 2001; Nfon et
Cousins, 2006). For human and fish populations, dietary intake, especially the consump-
tion of marine organisms, is considered one of the most important sources of exposure to
PCBs (Johansen et al., 1996; Muir et al., 2003; Nyman et al., 2002; Pompa et al., 2003).
Consequently, many recommendations have been published by local or national agencies
to limit human consumption of fish and shellfish in coastal or freshwater water bodies.
Data from epidemiologic studies and from the field have suggested that exposure to
PCBs may have adverse effects on the physiology of animals, including humans. Ex-
perimental exposures have been performed in recent decades in order to understand PCB
toxicity and its underlying mechanisms. These analyses have demonstrated alteration of
reproductive, hepatic, renal and endocrine functions in animal models and humans (Ho-
lene et al., 1998; Crofton et al., 2000; Safe, 2005; Zimmer et al., 2009; Schell et Gallo,
2010). The use of model fish species, such as medaka or zebrafish, for ecotoxicology
studies has developed rapidly over the last decade (Spitsbergen et Kent, 2003; Hill et al.,
2005; Hinton et al., 2005). These models demonstrated several alterations in physiology
after PCB exposure, including changes to development and reproduction (Billsson et al.,
1998; Örn et al., 1998; Grimes et al., 2008; Lyche et al., 2010; Nakayama et al., 2005b;
Daouk et al., 2011; Nakayama et al., 2011).
Quantitative behaviour analysis is now considered to be a good indicator of organism

stress response. It can be used to test a wide set of chemical stressors in pharmacol-
ogy, toxicology and ecotoxicology testing and the use of fish models in this context is
now widely accepted (Creton, 2009; Champagne et al., 2010; Norton et Bally-Cuif, 2010;
Steenbergen et al., 2011). Furthermore, in the particular context of ecotoxicology, indi-
vidual responses are situated at the interface between ecological relevance and the under-
standing of toxicity mechanisms, making individual behaviour a particularly relevant and
integrative indicator of pollutant effects (Scherer, 1992; Linney et al., 2004; Hinton et al.,
2005; Blechinger et al., 2007; MacPhail et al., 2009).
Several studies have demonstrated that exposure to PCBs can modify certain behavioural
traits in animals and humans (Berger et al., 2001; Rice, 2000; Eubig et al., 2010; Sagiv
et al., 2010). More recently, acute exposure to PCBs has been demonstrated to modify
behaviour in fish (Lerner et al., 2007; Nakayama et al., 2004, 2005a; Schmidt et al., 2005).
In this study, we wanted to use contamination conditions as close as possible to envi-

ronmental situations to identify behavioural effects of long term exposure to PCB mixtures
through diet. For this purpose, zebrafish were fed contaminated diets over more than 8
140
months, using PCB mixtures similar in doses and composition to those measured in Euro-
pean coastal molluscs. Several behavioural tests (background colour preference, T-maze
exploration and swimming activity over 24 h) were used to assess exploratory and lo-
comotion behaviour, which are essential components of fish behaviour in the wild (e.g.,
searching for food and congeners, predator avoidance, etc.) and are indicative of the type
of behavioural disruption that may be observed in humans.
5.2 Materials and methods
5.2.1 Rearing conditions and PCB exposure
The present behavioural experiments were part of a larger trial, described in full by
Daouk et al. (2011). Wild type zebrafish (Danio rerio) were bought at 6 weeks of age
from a provider dedicated to breeding zebrafish especially for ecotoxicology experiments
(Elevage de la grande rivière, Calluire, France). Exposure began 2 weeks later. These fish
were maintained and exposed to a PCBs mixture in Ifremer research station L’Houmeau
France, under standard conditions: water and room temperature were kept between 26-
28 ◦ C and the photoperiod was 10 h dark and 14 h light. Water was obtained after a
mix of reverse osmosis treated water and tap water, both being filtered beforehand with
dust and charcoal filters, to obtain a pH of 7.5 ± 0.5 and a conductivity of 300 ± 50
µS.cm-1 . Ammonia, nitrites, and nitrates were monitored daily for 2 months then weekly
and remained within recommended ranges (Lawrence, 2007). The fish were raised in a
flow-through system made of 20 identical 10 l tanks in a rack. Water was automatically
changed every hour leading to an exchange rate of 4L.day-1 .tank-1 . Contaminated water
was collected and treated with activated charcoal before being discharged in a sewer. This
study was conducted under the approval of the Animal Care Committee of France under
the official licence of M.-L. Bégout (17-010). Commercial food (Neo supra, pellet-size
1400 µm), obtained from Le Gouessant (France), consisted of a formulated feed contain-
ing 58% crude protein and 13% crude fat. Spiked food was prepared by batch to avoid
deterioration and by slowly adding a solution in iso-octane of known amounts of thirteen
congeners, (AccuStandard Inc., New Haven, USA, purity above 98%) to food pellets in
order to prepare diets. PCBs mixtures are composed of the seven indicator PCB con-
geners (CB-28, CB-52, CB-101, CB-118, CB-138, CB-153, CB-180), and a few others
to describe a larger range of chlorination from 3 to 8 chlorine atoms (CB-105, CB-132,
CB-149, CB-156, CB-170, CB-194). Two diets were prepared: PCB-medium and PCB-
high for which cumulated congeners concentrations were respectively 514.8 ng.g-1 2302
ng.g-1 , respectively (Daouk et al., 2011). These concentrations correspond to the one
141
monitored in medium and highly contaminated sites (respectively Loire and Seine estu-
aries; data from French coastal chemical contamination survey network – ROCCH). The
control food exposed only to solvent is further referred as Solvent whereas the unmodified
food is referred to as Plain. We used the Plain food to exemplify potential deviation from
untreated situations that could be due to solvent or spiking procedures. More details about
doses of each congener are available in Daouk et al. (2011).
5.2.2 Behavioural experiments
Behavioural experiments were performed after 250 d of contamination and were done
in a dedicated room, kept at 27 ± 1 ◦ C with a 14:10 light:dark photoperiod synchronized
with the rearing room in order to minimize unwanted correlated effects. Daylight was
started at 8:30 and there were no twilight periods. Only females were used for the back-
ground colour preference and T-Maze exploration tests. For the 24-h swimming activity
test, 6 females and 6 males were used per treatment to evaluate a possible sex-effect on
daily activity.
Background colour preference During this experiment, fish were individually placed
in a 3 l (24.5 x 15 x 13.5 cm, Aquabox® 3, AQUA SCHWARTZ GmbH, Göttingen,
Germany) filled with the water used in the system. These tanks were divided equally
into two parts: one with white bottom and walls, exposed to light, and one with black
bottom and walls, kept in shadow. Twelve fish were tested per treatment. Recording
sessions lasted 10 min and 4 tanks were recorded during each session (one fish from
each treatment). Between each session, the water in each tank was changed, and relative
position of the fish from the different treatments was changed at random.
T-maze exploration This experiment was adapted from Ninkovic et Bally-Cuif (2006).
The T-maze was built with four arms (Fig. 55A). For each trial, one of the long arms was
blocked with a removable partition and the other was used as start area, permitting half of
a treatment (N=6) to be tested in the deep area on the left and half of a treatment (N=6)
in deep area on the right (Fig. 55B), thus testing for laterality bias.
The T-maze was subdivided in 2 areas:

– the deep area, which was 10 cm in water depth, 23 cm wide and 23 cm long and
which had black walls, marbles, plastic grass and an opaque plastic tube that could
be used as a shelter; this area was considered a favourable zone (Ninkovic et Bally-
Cuif, 2006) ;
142
Figure 55: Scheme of the T-maze used to measure exploratory ability of ze-
brafish. The deeper area has black walls represented in grey. A: 3-D view.
All dimensions are given in centimetres. B: View from above. Stars represent
the start areas for the right (R) or left (L) sides. Dotted lines represent the
removable partition used to block the arm in front of the start area. The letter
by the partition indicates the one inserted when the deep area is on the left or
the right.
– the shallow area, which was 5 cm in water depth, composed of the start arm (46 cm
long), the arm leading to the deep area and the wrong arm, in the opposite direction
to the deep area (total length of these two arms was 66 cm).
Fish were placed individually in a 1 L tank in the experiment room the day before the
experiment. For each trial, a single fish was removed from its tank and placed in the start
area of the longest arm of the T-maze and exploration activity was immediately recorded
for 5 min.
24h swimming activity For each session, fish from each treatment were placed ran-
domly (to avoid tank position and session bias) in the same 3 L tanks as used for the
background colour preference tests, filled with 1.5 L of system water. The 12 tanks (4
treatments with 3 fish each) were isolated from neighbouring tanks by opaque walls. The
whole set-up was placed on top of an infrared apparatus (IR floor 1x1 m, Noldus, The
Netherlands). During the day, the room was lit with 2 halogen spotlights (Philips 80 W).
During the night, the spotlights were turned off and infrared light from the floor was used
to allow recordings of fish movements. Fish were placed in their tanks at 18:00 the day
before the experiment, for one night of acclimatization. Recording started the next day at
12:30 and lasted 24 h. Four sessions were conducted, giving a total of 12 fish tested per
treatment. The water was changed after each session.
143
5.2.3 Data recording and analysis
Videos for the T-maze and the 24-h swimming activity experiments were recorded with
an analog camera (Panasonic CCTV WV-CL920A) linked to a PC with an acquisition
card. Track extraction and analysis were then performed with Ethovision 6.1 software
(Noldus, The Netherlands). Data were acquired by Ethovision at 25 frames per second
and extracted data nested every 30 s for saving.
As the background colour preference videos were uneven, automatic video tracking
analysis was not possible. Thus, videos were acquired in the same way as above but
analysed manually using the "Observational Data Recorder (ODRec)" freeware (Samuel
Péan, http://www.samuelpean.com/odrec).
5.2.4 Measured variables and statistical analysis
The variables chosen to evaluate behavioural performances were the following:

– time spent (in s) by a fish over the black or white area in the background colour
preference test and number of passages between the two areas;
– Velocity (in cm.s-1 ): the distance moved by the centre point of the individual fish per
unit time between two consecutive X-Y coordinates acquired;
– time mobile (in s): the total duration of movement of the fish expressed as proportion
of time mobile (%) for each 30-s interval;
– binary coding for reaching the deep area: 0 (failure) and 1 (success);
– time to reach deep area (in s): the time between the beginning of the trial and the
first entry in the deep area.
– distance moved (in cm): the distance travelled by the centre point of the subject
between two consecutive X-Y coordinates acquired, nested over 30 s intervals and
then summed over a 30 min period for the 24 h experiment;
Data were statistically tested using Statistica 9.0 (Statsoft, United States of Amer-
ica). For each variable, Shapiro-Wilk test was performed first to check the normality
and followed by a Bartlett’s test to check the homoscedasticity. When normality and ho-
moscedasticity rules were respected, t-test or ANOVA was chosen, else Mann-Whitney
or Kruskal-Wallis tests (Zar, 1999), followed by multiple comparisons rank tests were
performed to compare resulting varaibles between the four groups (Plain, Solvent, PCB-
medium, PCB-high). For the 24h swimming activity experiment, transition periods in-
duced an exacerbated pattern; it was thus necessary to analyse these 30 min "Light-off"
and "Light-on" periods separately. Remaining day and night periods were divided into
blocks of 6 or 7 30 min period (for day 1: D1-1 to D1-3, for night: N1-1 to N1-3 and,
finally, D2-1). Within each period (of which there were 10 in total), Kruskall-Wallis tests
144
were used to compare the distances moved (summed per 30 min) between the different
treatments. All statistical analyses were carried out at a 95% level of significance.
5.3 Results
The experiments assessed some behavioural responses of zebrafish exposed to two

levels of a PCB mixture (PCB-medium and PCB-high) via a spiked diet at two levels,
compared with a control treatment containing solvent (Solvent) alone and a fourth group
of fish fed an unaltered diet (Plain). This approach made it possible to detect differ-
ences caused by the solvent alone. No mortality occurred during the course of the be-
havioural experiments. Fish weight and length were not significantly different between
treatment groups (weight: 750±75.3 mg, KW(3,144) =1.624, p=0.654; length: 2.1±0.3 cm,
KW(3, 144) =0.023, p=0.991).
5.3.1 Background colour preference
Fish from all treatments spent more than 65% of the time in the black area (Fig. 56A).
However, the Kruskall-Wallis test showed a significant treatment effect (KW(3,48) =17.069,
p<0.01) and post-hoc multiple comparisons showed that PCB-medium fish spent signifi-
cantly less time in the black area (6.98±0.35 min) than fish from Solvent (9.15±0.20 min)
and PCB-high (8.6±0.37 min) treatments. PCB-medium fish also showed a significantly
higher number of passages from one zone to the other, corresponding to double that of fish
from the Solvent treatment (85.2±9.51 versus 41.3±5.28; KW(3,48)=11.804, p=0.0081;
Fig. 56B). The number of passages for fish from other treatments was intermediate and
in this latter case, Solvent treatment differed from Plain treatment and this is the only
occurrence of such a difference between Solvent and Plain fish.
5.3.2 T-maze exploration
The first part of the T-maze results focuses on the shallow area and, therefore, concerns
all the fish.
The mean velocity was significantly different between treatments (KW=19.895, p<0.01,
df=3, N=48, Fig. 57A). Multiple comparison post-hoc tests showed that velocity for the
PCB-medium fish was significantly higher (21.2±2.7 cm.s-1 ) than for Solvent (9.8±1.2
cm.s-1 ), Plain (8.3±1.3 cm.s-1 ) and PCB-high (10.6±1.2 cm.s-1 ) fish. For the proportion of
time the fish were mobile in the shallow area, the Kruskal-Wallis test with multiple com-
parison rank tests indicated a significant difference between treatments (KW(3,48)=12.961,
145
Figure 56: Background colour preference test in relation to diet contamina-

tion. A: Time spent in each area during the 10 min of the test; B: Num-
ber of passages between the areas with different backgrounds during the test
(mean±S.E.M..; different letters indicate significant differences among treat-
ments; p<0.01; n=12). Dark bars represent the dark areas, pale bars the light
area.
p < 0.01, Fig. 57B), with PCB-medium fish being significantly more mobile (80.9±5.1%)
than fish in other treatments (42% to 55%). The second part of the analysis focused on the
deeper area and, therefore, only concerned fish that reached this area. The number of fish
that reached the deep area (left, right and total) is presented in Tab. 10. The number of
individuals reaching the deep area was significantly higher in the PCB-medium treatment:
12 fish out of the 12 tested, compared with 4 to 8 out of 12 for the other treatments. A
laterality bias was only observed for fish from the Solvent treatment: indeed the four fish
that reached the deep area did so when it was located on the left arm (Mann-Whitney-U;
p=0.024).
Data on fish that reached the deep area were analysed further, irrespective of their
lateral position (left or right). Recordings of time until the first entry into the deeper
146
Figure 57: Swimming activity measured in the shallow area during the T-
maze test. A: Velocity measured in the shallow area. B: Proportion of time
mobile (mean±S.E.M.; different letters indicate significant differences among
treatments; p<0.01; n=12).
Table 10: Success rate and laterality in the T-maze test. Number of individu-
als (out of 12 tested) that reached the deep area, depending on its position in
relation to the start area. Bold print indicates statistical significance for the lat-
erality bias. Different letters indicate significant differences among treatments
(p<0.01).
Treatment Fish reaching deep area Deep area on Deep area on Laterality bias
(over 12 fish tested) the left the right (p-value)
Plain 5a 2 3 0.640
Solvent 4a 4 0 0.024
PCB-medium 12b 6 6 1.000
PCB-high 8a 5 3 0.378
Total 29 17 12
area (Fig. 58A) indicated that fish from PCB-medium treatment reached the deep area
significantly faster than any other fish, including those in the Solvent treatment (28.7±9.4 s
and 110±50 s, respectively; KW(3,29)=10.362, p<0.02). The time spent in the deep area
was not significantly different between treatments (KW(3,29) =5.486, p=0.139; Fig. 58B).
5.3.3 24-h swimming activity
Constant monitoring of swimming activity over 24-h allowed several periods to be

identified that were characterised by specific behavioural patterns according to day/night
and light changes. In our system, light change was abrupt and provoked an intense in-
crease in swimming activity (distance travelled; Fig. 59A) both at lights off (22:30) and
lights on (8:30). Apart from these periods, distance travelled showed relatively low vari-
ation within day or night periods or between days and night periods (Fig.59A), and no
sex effect was observed on distance travelled. No difference was observed between treat-
147
Figure 58: Swimming activity measured in the deep area during the T-maze
test. A: Latency to reach the deep area ; B: Total time spent in the deep
area (mean±S.E.M.; different letters indicate significant differences among
treatments; p<0.02; sample size depends on the number of fish that reached
deep area for each treatment: Plain n=5, Solvent n=5, PCB-medium n=12,
PCB-high n=8).
ments during day periods or during light regime changes. Some differences did appear
during the night periods, with a significant increase in distance travelled for PCB-high
fish compared with the Solvent treatment for periods N1-2 (KW(3, 48) =8.843, p=0.0314),
and N1-3((KW(3, 48) =15.11, p=0.0017; Fig.59B).
5.4 Discussion
Our results demonstrate that chronic exposure of fish to diets spiked with mixtures of
PCBs can alter behavioural traits such as environment choice, exploration and swimming
activity. Behavioural alterations were observed in all tests (background colour preference,
T-maze and 24-h swimming activity) on fish that had been fed for 8 months on diets
148
Figure 59: Locomotor variables measured during the 24-h swimming activity
test. A: Locomotor activity during the different periods studied. For the sake
of clarity, only mean distance is shown. The different periods are indicated
under the locomotor activity curves using the same colour scheme as in Fig.
5B. B: Distance travelled for each period and each treatment. The grayscale
rule above the bars indicates the light status / period of the day (mean±S.E.M;
*p<0.05; **p<0.01; n=12; L. off: Light off; L. on: Light on).
containing PCBs: PCB-medium, containing a total PCB concentration of 515 ng.g-1 and
PCB-high, containing 2302 ng.g-1 . Differential alterations could also be observed between
the treatments.
The results can be interpreted in different ways: first, in the light of anticipatory and
rhythmic activity and, second, as responses to a challenging situation. Dose response,
ecological relevance and potential impact on human health are further discussed below.
An increase in swimming activity followed by a decrease was observed in all treat-

ments at the end of the night, which can be interpreted as an anticipation of the forth-
coming light change (Aranda et al., 2001). However, for PCB-high fish, the anticipation
process and swimming activity were modified in two ways. First, the onset of anticipatory
activity appeared more pronounced, as demonstrated by a significantly higher increase in
the distance travelled during the night period immediately preceding the turning on of
the light, i.e., 3 hours in advance. Second, for these fish, we also observed sustained
149
activity in the middle of the night. This could be due to a modification of the circadian
rhythm that may only occur at high doses, since such an alternation was not noted for the
PCB-medium fish. A modification of the circadian rhythm has already been reported both
in vitro and in vivo after exposure to dioxin, and involves regulation of circadian genes
by AhR (Pesonen et al., 2000; Garrett et Gasiewicz, 2006; Mukai et al., 2008; Shimba
et Watabe, 2009; McIntosh et al., 2010; Xu et Zon, 2010; Tischkau et al., 2011). The
mixture used here contains no classic dioxin-like compounds (i.e., dioxin-like non-ortho
planar congeners such as CB-77, CB-126 or CB-169) but did contain some mono-ortho
substituted congeners (CB-105, CB-118 and CB-156) that, despite being less coplanar,
are also referred to as dioxin-like and which bind AhR, albeit with a lower affinity than
coplanar congeners (Jensen et al., 2010). In this context, it is noteworthy that a previous
study detected differential expression of the clock gene in a microarray analysis of the
brain of rat exposed to Aroclor 1254 (Sazonova et al., 2011).
In challenging situations (background colour preference and T-maze) and with no ac-
climatization period, particular behavioural disruption was observed in fish exposed to the
PCB-medium diet. All changes observed suggested that overall activity was increased in
the challenged fish. Indeed, in all these tests, deviation from the Solvent treatment results
can be linked to an increase in swimming activity. In the case of the background colour
preference test, the preferred background colour was the dark one, which is in agreement
with previous reports (Ninkovic et Bally-Cuif, 2006; Serra et al., 1999) but is also known
to fluctuate depending on light levels and previous conditioning of the fish (Stephenson
et al., 2011). PCB-medium fish spent however less time in this area compared with the
others and this could be linked to an increased number of zone changes. For this latter
variable, Plain did differ from Solvent fish and showed a high number of zone changes
but still preferred to stay on the black background colour. It is the only variable highlight-
ing a differential response between Plain and Solvent and we have no direct explanation
but this point calls for further attention. For the T-maze challenge, fish were introduced
into a novel environment which is supposedly felt to be unsafe due to the shallow water
and high walls defining a straight corridor. In addition to providing information on the
exploratory ability of the fish, recordings of swimming characteristics during exploration
gave indications of the way fish coped with this novel environment. Behaviour of PCB-
medium fish in the shallow area of the T-maze deviated from that of all other fish, with
an increase of velocity (doubled) associated with an increase in the proportion of time
mobile. This shortened the time needed to reach the deep area, which was supposedly an
area more favourable for the fish than the shallow corridors. Thus, behavioural responses
measured in the shallow area also supported the idea that PCB-medium fish over-reacted
under challenging conditions. This activity increase evokes the link now clearly estab-
lished between PCB exposure and a human behavioural deficit known as attention deficit
150
/ hyperactivity disorder (ADHD, Eubig et al., 2010). The link between PCB exposure and
ADHD has been established after epidemiologic studies on children (Sagiv et al., 2010)
and after many studies using mammal models (Holene et al., 1998; Rice, 2000; Colciago
et al., 2009; Eubig et al., 2010; Vitalone et al., 2010). To our knowledge, there is a scarce
number of report of hyperactivity induced by exposure of fish to PCB (Nakayama et al.,
2005a; Schmidt et al., 2005). They showed effects at the individual level with higher night
swimming activity in carp (Aroclor 1254 in solution at 10 µg L-1 ) and effects at the group
level in medaka with disruption of schooling behaviour for 25 µg.g-1 and 100 µg.g-1 food
spiked with Kanechlor-400, which represent 10- to 100-fold higher doses than those in
the present study. The convergence between our results and the literature highlights the
needs for further experimentation using low doses.
When comparing the main behavioural responses observed in fish from the PCB-
medium and PCB-high treatments, although contamination of fish themselves measured in
a parallel study is in agreement with PCB concentration in each diet (Daouk et al., 2011),
there was no reinforcement of the measured effects with increased dose, suggesting the
absence of a dose-response relationship. This absence of dose-response effect was also
observed for fertilization rate of these fish, which was equally lowered by 25%, as well
as for follicle maturation rates in PCB-medium and PCB-high exposed fish (Daouk et al.,
2011). A non-monotonic type of relationship between dose and response after exposure to
a xenobiotic is not new. Several mechanisms, which may work alone or in combination,
have been proposed to explain this particularity; these include hormesis (improvement of
a function/factor at low dose but a degradation at higher dose), a threshold above which a
defensive strategy is triggered physiological adaptation at low dose but detrimental effects
at higher doses and intra-population variation in dose response (Calabrese et Baldwin,
2003; Conolly et al., 2005; Conolly et Lutz, 2004). The fact that behavioural disruptions
observed in this study reveal induction of hyperactivity in fish fed the PCB-medium diet
and perhaps a rhythm disruption in fish fed with PCB-high diet suggests that the underly-
ing mechanisms are different. Additional studies are currently being performed in order
to understand the respective roles of mono-ortho substituted congeners and other con-
geners in greater detail. Research will also be made for molecular clues about possible
mechanisms of action.
The PCB mixtures used here are representative of situations occurring in European
coastal areas, both in terms of congener mixtures and concentrations used, and are thus
ecologically relevant, as discussed in (Daouk et al., 2011). More specifically, the PCB-
medium diet is representative of a mildly contaminated estuary such as Loire estuary,
while PCB-high corresponds to PCB contamination found in highly contaminated areas
such as the Seine estuary. From an ecological point of view, this indicates that alteration
of some behavioural traits observed in this study may affect fish living in these areas.
151
Indeed, behavioural disruptions observed for the PCB-medium and PCB-high treatments
could have adverse effects on fish at individual or population levels. For instance, hyper-
active response in challenging conditions (increase of stay in a light zone and number of
zone changes in the background colour preference challenge, and increase of speed and
time mobile in the T-maze) could be associated with a higher probability of being captured
by a predator (Scott et Sloman, 2004; Sloman et Wilson, 2005; Brooks et al., 2009). This
adverse effect could be amplified by the decrease in schooling behaviour, as observed in
medaka after acute exposure to PCB mixtures (Nakayama et al., 2005a), since this be-
haviour has a protective effect for individuals (Scott et Sloman, 2004). In addition and
independently of any cost that could be caused by detoxication processes, hyperactive
behaviour could also have a negative influence on energy budget and hence, end of the
night hyperactivity could reflect intensive food searching behaviour as feeding behaviour
has been earlier demonstrated to increase toward the end of the night (del Pozo et al.,
2011). These or other negative consequences could occur in relation to rhythm disrup-
tion or decrease in resting time, like that observed after fish were fed the PCB-high diet.
It is well known that behavioural and physiological processes are mainly rhythmic and
synchronized by specific pacemakers and del Pozo et al. (2011) gave results supporting
the concept of multioscillatory control of circadian rhythmicity in zebrafish. Correct syn-
chronization with light conditions ensures that individual fish are spatially and temporally
synchronized with the availability of natural resources (Schmidt et al., 2005). Therefore,
a phase shift in activity due to xenobiotic stress, as reported here and also demonstrated
in carp (Schmidt et al., 2005), may be of great ecological relevance. Further, the rhythm
disruption observed could also have consequences at the population level through the
desynchronisation of reproductive behaviour, which could partly account for the decrease
in fertilization rate observed for these fish (Daouk et al., 2011).
Finally, behaviour disruption observed for fish in the PCB-medium treatment is remi-
niscent of ADHD phenotypes observed in humans. It is, therefore, possible that zebrafish
exposed to environmental PCB mixtures through diet could also serve as a model in or-
der to 1) better understand mechanisms underlying ADHD appearance in humans and 2)
serve as tool to develop strategies to relieve disorders in humans (e.g., for drug screening).
In both cases, further analyses should be conducted in this context to evaluate mechanis-
tic relationship suspected between PCB, ADHD and neurotransmitter concentration (e.g.
dopamine and serotonin, Berg et al. 2011; Boix et al. 2011).
5.5 Conclusion
Our data indicate that long-term exposure of zebrafish to a diet spiked with a PCB
mixture akin to that found in mildly contaminated areas, induced behavioural disruption
152
(hyperactivity) that resembled ADHD syndromes observed in humans following PCB ex-
posure. At the higher dose of the two tested, the only disruption observed was an increase
in nocturnal activity, but both levels of contamination may have ecological consequences
due to energy budget imbalances or increased predation risks. It is also possible that
changes in nocturnal activity are related to a general desynchronisation that, in turn, could
impair reproductive behaviour and hence have a large impact at the population level.
Since the hyperactivity observed in fish fed the PCB-medium diet shares some simi-
larities with ADHD syndrome observed in humans after exposure to PCBs, it should be
possible to use this model to better understand the underlying mechanisms. With respect
to this point, we are currently performing some experiments in which exposure is per-
formed through diet from the first meal onwards. It should also be possible to use this fish
model to screen for drugs to alleviate PCB-induced ADHD in humans.
Acknowledgments
This study was supported by Ifremer and Région Poitou-Charentes (PhD fellowship for
Samuel Péan), by the Conseil Général de Charente Maritime (PhD fellowship for Tarek
Daouk) and EC2CO-Cytrix (grant GénérationPOP to Xavier Cousin).
153
Chapitre 6
Zebrafish as a model of hyperactivity transmission

to offspring after parental PCB exposure
Samuel PÉAN
Caroline VIGNET
Laura LYPHOUT
Tarek DAOUK
Didier LEGUAY
Véronique LOIZEAU
Xavier COUSIN
Marie-Laure BÉGOUT
Manuscrit en préparation
Résumé
Comme expliqué dans la Partie Introduction Générale (voir section 3 Les PCB, p. 19) la
forte liposolubilité des PCB rend ces molécules bioaccumulables. En conséquence, il y a
un transfert maternel des PCB au moment de la constitution des réserves vitellines, riches
en lipides. Dans cette étude, nous avons examiné le comportement de poissons zèbres
issus de parents contaminés aux PCB pendant 350 jours par voie alimentaire (dont les
protocoles de contamination et les résultats des tests comportementaux ont été présentés
dans le Chapitre 5, p. 137). Un premier challenge comportemental a été réalisé au stade
larvaire et d’autres ont été effectués plus tard, au stade adulte. Les groupes de poissons
issus des géniteurs contaminés ont montré une activité de nage élevée au stade larvaire.
Cette altération a été retrouvée chez ces poissons au stade adulte, associée à une utilisa-
tion moindre du fond des aquariums et un grand nombre d’aller-retours entre le fond des
bacs et la surface. Ceci peut-être expliqué par une perte de comportement anti-prédateur
(la zone de fond des bacs étant généralement considérée comme une zone refuge) et/ou
une perte d’inhibition comportementale. Ces altérations comportementales correspondent
au syndrome d’hyperactivité et de manque d’attention (ADHD), déjà observé chez des
enfants ou des animaux esposés aux PCB in utero ou quelques temps après la naissance.
Ces résultats permettent à la fois de montrer que l’utilisation du poisson zèbre dans des
expériences longues (24 h) plutôt que de courts challenge permet de mieux comprendre
certaines altérations comportementales.
Dans cette étude, nous avons utilisé le protocole de challenge lumineux dont la mise
en place a été décrite en première partie (voir Chapitre 1, p. 65). Les PCB transmis aux
embryons par voie maternelle ont bien des conséquences importantes sur le comporte-
ment des poissons. D’un point de vue méthodologique, l’étude de la locomotion par video
tracking s’est encore montrée adaptée dans le cas d’altérations comportementales liées
aux PCB, que ce soit dans le cas d’un challenge rapide au stade larvaire ou en effectuant
des expériences de 24 h chez les adultes.
157
Zebrafish as a model of hyperactivity transmission

to offspring after parental PCB exposure
Samuel Péan, Caroline Vignet, Laura Lyphout, Tarek Daouk, Didier Leguay, Véronique
Loizeau, Xavier Cousin, Marie-Laure Bégout
Abstract: It is well known that the long biological half-life and high liposolubility of
PCBs can lead to their bioaccumulation and biomagnification through food chains over
a wide range of trophic levels, leading to a potential risk for high trophic level predators
including humans. Further, their binding with lipids, underpins a demonstrated maternal
transfer to eggs in fish. In this context and since field analyses and experimental exposures
have established links between PCB exposure and alterations in animal physiology and
behaviour directly contaminated; we, in the present study, have examined the effects in F1
zebrafish issued from adult exposed during a year through diets to PCBs mixtures at two
doses mimicking known environmental contamination levels and congener composition. The
highest dose was equivalent to that found in the Seine Estuary and the intermediate dose was
equivalent to that found in the Loire estuary. Several behavioural traits were monitored both
in 5 days old larvae and in adults reared under standard conditions. Behavioural phenotypes
observed in descendants of fish exposed to PCBs diet, were an increased in activity in larvae
which was maintained in adults. In adults, this was associated with a decrease in tank bottom
section occupancy and with an increase in the number of zone transition which may be due
to a loosening of homebase behaviour and/or a loss of behavioural inhibition. In all cases,
these phenotypes observed in PCBs groups can be related to the behavioural syndrome
observed in children or animal models submitted to in utero or perinatal exposure to PCBs,
the attention deficit / hyperactivity disorder. These findings call for more experiments using
zebrafish model and rather long (24-h) than short term experiments to better understand
mechanisms underpinning behavioural disruptions for both human health endpoints and
ecological relevance in terms of individual fitness and survival.
Keywords: swimming activity, generation, ADHD, organic pollutant effects, video

analysis
6.1 Introduction
Polychlorinated biphenyls (PCBs) constitute a family of 209 congeners depending on

the combinatorial arrangement of 10 possible chlorine substitutions on a biphenyl nu-
cleus (McFarland et Clarke, 1989). Because of their properties (e.g. high dielectric con-
stants, non-flammability, hydrophobic quality and chemical stability) PCBs in mixtures
were abundantly used in a wide range of applications from the 1930s onwards (Beyer et
Biziuk, 2009; Breivik et al., 2002). After their toxicity became recognised, PCBs were
159
progressively banned in most developed countries during the 1980s (Letz, 1983). How-
ever, because of hydrophobic properties and chemical stability, PCBs are very persistent
and have accumulated in the environment. More specifically, in aquatic environments
PCBs are stored in sediments and entered the trophic chain through microbial and bottom-
feeders uptake. Constant mobilisation of sediment due to human or natural activity further
induces de novo contamination.
The long biological half-life and high liposolubility of PCBs can lead to their bioac-
cumulation and biomagnification through food chains over a wide range of trophic levels,
leading to a potential risk for high trophic level predators (Fisk et al., 1998, 2001; Borgå
et al., 2001; Nfon et Cousins, 2006). For human and fish populations, dietary intake, es-
pecially the consumption of aquatic organisms, is considered one of the most important
sources of exposure to PCBs (Johansen et al., 1996; Muir et al., 2003; Nyman et al., 2002;
Pompa et al., 2003). Consequently, many recommendations have been published by local
or national agencies to limit human consumption of fish and shellfish in impacted coastal
or freshwater water bodies.
Data from epidemiologic studies and from the field have suggested that exposure to
PCBs may have adverse effects on the physiology of animals, including humans. Ex-
perimental exposures have been performed in recent decades in order to understand PCB
toxicity and its underlying mechanisms. These analyses have demonstrated alteration of
reproductive, hepatic, renal and endocrine functions in animal models and humans (Ho-
lene et al., 1998; Crofton et al., 2000; Safe, 2005; Zimmer et al., 2009; Schell et Gallo,
2010).
The use of model fish species, such as medaka or zebrafish, for ecotoxicology studies
has developed rapidly over the last decade (Spitsbergen et Kent, 2003; Hill et al., 2005;
Hinton et al., 2005). These models demonstrated several alterations in physiology after
PCB exposure, including changes to development and reproduction (Billsson et al., 1998;
Örn et al., 1998; Nakayama et al., 2005b; Grimes et al., 2008; Lyche et al., 2010; Daouk
et al., 2011; Nakayama et al., 2011).
Several studies have demonstrated that exposure to PCBs can modify certain behavioural
traits in animals and humans (Rice, 2000; Berger et al., 2001; Eubig et al., 2010; Sagiv
et al., 2010). More recently, acute exposure to PCBs has been demonstrated to modify be-
haviour in fish (Lerner et al., 2007; Nakayama et al., 2004, 2005a; Schmidt et al., 2005).
Finally, we have demonstrated that chronic exposure to PCBs using mixtures occurring
in European coastal areas was able to provoke behavioural disruption in adult zebrafish in
a manner evoking a human behavioural deficit known as attention deficit / hyperactivity
disorder (ADHD, Eubig et al., 2010, Chapitre 5, p. 137). The link between PCB expo-
sure and ADHD has been established after epidemiologic studies on children (Sagiv et al.,
160
2010) and after many studies using mammal models (Holene et al., 1998; Colciago et al.,
2009; Rice, 2000; Eubig et al., 2010; Vitalone et al., 2010). In mammals, embryo de-
velopment takes place within mother uterus and under constant feeding through placenta
there is thus a potential chronic exposure of fetuses to PCBs through blood exchanges.
Fish develop ex utero and in most cases are precocious animal, which means that there is
no caretaking of the young. Thus, young behavior is not directly influenced by mother
behavior. Further, we and others have demonstrated that, in fish, PCBs can be transmitted
from the mother to eggs (Bodiguel et al., 2009; Daouk et al., 2011).
In the present work, we intended to evaluate behavioural disruption that may be ob-
served in descendants of fish exposed to PCBs mixtures encountered in European coastal
areas. To this end, we used a comparative approach and worked at both a very young and
an adult stage of zebrafish issued from three groups of parents (two PCBs doses and one
Solvent control). We monitored swimming activity levels in 5 days old larvae under a sud-
den dark challenge context following a slightly modified protocol from Ali et al. (2011)
extensively used to make behavioural profiling in zebrafish larvae exposed to diverse com-
pounds. In adults, we recorded horizontal movements in a 24-h experiment, and special
attention was also devoted to vertical movement recorded over another 24-h experiment
since following Levin et al. (2007) we know that the choice of position (bottom vs. upper
levels) was considered as an index of anxiety, quite similar to the position choice of closed
vs. open arms in the elevated plus maze and positions near the wall (thigmotaxis) vs. the
center of an open field with rodents.
6.1.1 Rearing conditions and PCB exposure
The present behavioural experiments done on offspring (F1) of contaminated fish which
were part of a larger trial, described in full by Daouk et al. (2011) and were a follow up of a
study on first generation contaminated adults (F0, Chapitre 5, p. 137). Wild type zebrafish
(Danio rerio) were bought at 6 weeks of age from a breeder specialised in supplying ze-
brafish (Élevage de la Grande Rivière, Calluire, France). Exposure began 2 weeks later.
The fish were maintained and exposed to a PCB mixture at the Ifremer research station
in L’Houmeau France, under standard conditions: water and room temperature were kept
between 26-28°C and the photoperiod was 10 h dark: 14 h light. The water used in the
rearing system and during tests was a mixture of water treated by reverse-osmosis and
tap water, both of which had been filtered beforehand through dust and charcoal filters, to
obtain a pH of 7.5±0.5 and a conductivity of 300±50 µS.cm-1 . Ammonia, nitrites, and ni-
trates and remained within recommended ranges (Lawrence, 2007). The fish were raised
in a flow-through system made of 20 identical 10-L tanks in a rack. A portion of the water
was changed automatically every hour, leading to a replacement rate of 4 L.day-1 .tank-1 .
161
Contaminated water was collected and treated with activated charcoal before being dis-
charged into a sewer. This study was conducted under the approval of the Animal Care
Committee of France under the official licence of M.-L. Bégout (17-010). Commercial
food (Neo supra, pellet-size 1400 µm), obtained from Le Gouessant (France), consisted
of a formulated feed containing 58% crude protein and 13% crude fat. Spiked food was
prepared by slowly adding a solution containing known amounts of thirteen congeners
in iso-octane (AccuStandard Inc., New Haven, USA, purity above 98%) to food pellets.
Diets were prepared in small batches to avoid deterioration. PCB mixtures were com-
posed of the seven indicator PCB congeners (CB-28, CB-52, CB-101, CB-118, CB-138,
CB-153, CB-180), and a number of others added to cover a larger range of chlorina-
tion from 3 to 8 chlorine atoms (CB-105, CB-132, CB-149, CB-156, CB-170, CB-194).
Two diets were prepared: "PCB-medium" and "PCB-high", for which the cumulated con-
gener concentrations were 515 ng.g-1 and 2302 ng.g-1 , respectively (Daouk et al., 2011).
These concentrations correspond to ones recorded in medium and highly contaminated
sites (Loire and Seine estuaries, respectively; data from French coastal chemical contam-
ination survey network – ROCCH). The control food exposed only to solvent is hereafter
referred to as "Solvent". More details about doses of each congener are available in Daouk
et al. (2011).
After 350 days of contamination of F0 adults, offspring hereafter called F1 fish, were
obtained by crossing male and female from the same cited treatments (Solvent, PCB-
medium and PCB-high). Three larvae batches (N=30) issued from 3 spawns obtained
from 3 different pairs were immediately used to monitor behavioural responses to a sudden
dark change. Other larvae batches were reared under normal conditions in the facility
using the same food as described above but plain, until adulthood when they underwent
behavioural tests.
6.1.2 Behavioural experiments
Behavioural experiments were performed in 5 days old larvae and in adults in a dedi-
cated room, kept at 27±1°C with a 14:10 light: dark photoperiod synchronized with the
rearing room in order to minimize unwanted correlated effects. Daylight was started at
8:30 and there were no twilight periods. Due to their small size, adult sex could not be
determined but in a former experiment no sex effect was noticed for F0 fish (Chapitre 5,
p.137).
Sudden dark challenge in larvae Zebrafish larvae were challenged individually at

5 days post fertilisation (dpf) in a sudden dark (5 min light off) challenge and video
recording were made over 3 periods of 5 min each (before (Light on-1), during (Light
162
off) and after light off (Light on-2)). At 17h00 the day before the challenge, single larvae
were installed in a 24 well-plate (Krystal 24, opaque (white) clear bottom micro-plate),
visually isolated from each other and in a mixed design (larvae from all treatment were
studied at the same time to avoid any trial effect), they were kept overnight in the incuba-
tor. The following day, two hour before the challenge, done between 14h-18h (to target
the most stable activity period in zebrafish larvae as shown by MacPhail et al., 2009), the
well-plate was transferred to the video acquisition room and placed on top of sized-match
infrared floor which allowed filming of the larvae under both light and dark conditions.
A three way switch permitted to film either under light or dark but constantly with IR
lighting. The all apparatus was within a lightproof and temperature controlled box. The
dependant measure was the distance travelled recorded for 90 larvae per treatment (Sol-
vent, PCB-medium and PCB-high).
24-h swimming activity For each session, fish from each treatment were placed ran-
domly (to avoid tank position and session bias) in 3-L tanks (24.5x15x13.5 cm, AquaBox®3,
AQUA SCHWARZ GmbH, Göttingen, Germany) filled with 1.5 L of system water. The
12 tanks (3 treatments with 4 fish each) were isolated from neighbouring tanks by opaque
walls. Fish were placed in their tanks at 18:00 the day before the experiment, for one
night of acclimatization. Recording started the next day at 12:30 and lasted 24 h. The
water was changed after each session.
Two filming sessions were conducted: for one the camera was placed above the tanks
which were on top of an infrared apparatus (IR floor 1x1 m, Noldus, The Netherlands)
to monitor horizontal movements (top view); and for the other the camera was placed in
front of the tanks (side view, tanks being placed on a 4 levels shelf in front of the IR floor)
to record vertical movement. During the day, the room was lit with 2 halogen spotlights
(Philips 80 W). During the night, the spotlights were turned off and infrared light from
the floor was used to allow recordings of fish movements. A total of 14 fish per treatment
were filmed in top view and 9 fish per treatment in side view; the dependent measures
were respectively swimming path length and time spent in each third of the tank section
horizontally and number of passages between sections.
6.1.3 Data recording and analysis
Videos for the sudden dark change challenge in larvae were recorded using a camera
(Imaging Sources DMK31AU03 and lens Fujinon 1.4-12.5 mm) positioned 45 cm above
the well-plate. Videos for the 24-h swimming activity experiments were recorded with an
analog camera (Ikegami ICD-48E and Fujinon lens 2.7-13.5 mm) linked to a PC with an
acquisition card.
163
For both experiments, track extraction and analysis were then performed with Etho-
vision 7.1 software (Noldus, The Netherlands). Data were acquired by Ethovision at
25 frames per second and extracted data nested for saving every 30-s for larvae or 30-min
for adults.
6.1.4 Measured variables and statistical analysis
The variables chosen to evaluate behavioural performances were as follows:
– distance moved (in cm): the distance travelled by the centre point of the subject
between two consecutive X-Y coordinates acquired, were summed over a 5 or 30-
min period for the larvae sudden dark challenge or the 24-h experiment respectively ;
– time spent per 30-min period (in s) by a fish in the upper, mid or bottom section in
the 24-h swimming experiment filmed in side view ;
– number of passages per 30-min period between the upper and mid section and be-
tween mid and bottom section.
Data were statistically tested using Statistica 9.0 (Statsoft, USA). For each variable, a
Shapiro-Wilk test was performed to check the normality, and a Bartlett’s test to check the
homoscedasticity. The distance travelled by larvae was compared using repeated measures
ANOVA with treatment as the within-subjects factor (Solvent, PCB-medium, PCB-high)
and period (Light on-1, Light off and Light on-2) as between-subjects factors followed by
Newman-Keuls multiple comparisons test.
As normality and homoscedasticity rules were not respected for the 24-h experiment,
Mann-Whitney-U or Kruskal-Wallis tests (Zar, 1999), followed by multiple comparison
rank tests, were performed to compare results between the three treatments (Solvent,
PCB-medium, PCB-high). For the 24-h swimming activity experiment, transition peri-
ods induced an exacerbated pattern; it was thus necessary to analyse these 30-min "Light
off" and "Light on" periods immediately following the light change separately. Remain-
ing day and night periods were divided into blocks of 6 or 7 30-min period (for day 1:
D1-1 to D1-3, for night: N1-1 to N1-3 and, finally, D2-1). Within each period (of which
there were 10 in total), Kruskall-Wallis tests were used to compare the distances moved,
the number of passages between section and the time spent in the bottom section (each
summed per 30 min), between the different treatments. Distance moved during the hor-
izontal movement analysis was also compared between day-time vs. night-time period
excluding the transition half-hour period using Mann-Whitney and multiple comparisons
tests. All statistical analyses were carried out at a 95% level of significance.
164
6.2 Results
The experiments assessed some behavioural responses of zebrafish exposed to two lev-
els of a PCB mixture (PCB-medium and PCB-high) via a spiked diet at two levels, com-
pared with a control treatment containing solvent (Solvent) alone. A former study did not
show major differences between Solvent and a plain diet, therefore, only Solvent was used
as a control treatment. No mortality occurred during the course of the behavioural exper-
iments. Fish weight and length were not significantly different between treatment groups
(for the 24-h experiment filmed in top view: weight: 320.6±55.7 mg, KW(2, 54) =2.065,
p=0.356; length: 2.62±0.02 cm, KW(2, 54) =2.537, p=0.281; and for the side view ex-
periment: weight: 335.7±52.7 mg, KW(2, 27) =1.019, p=0.600; length: 2.64±0.09 cm,
KW(2, 27) =4.560, p=0.458).
6.2.1 Sudden dark challenge in larvae
Fish from all treatments showed a similar response pattern to the sudden dark challenge
context: swimming activity increased by 1.4 to 1.9 fold between the first 5-min period and
the dark period (Fig. 60).
100
b
b
Distance travelled (cm/ 5 min)
a
b b
b
50
a
a
a
0
Light Light Light
on - 1 off on - 2
Figure 60: Swimming activity is increased in larvae from contaminated gen-

itors. Distance travelled by 5 days old larvae in 5 minute-bouts with light on
or off as indicated in the greyscale rule below the bars (mean±S.E.M; differ-
ent letters indicate significant differences between treatments (Solvent, PCB-
medium and PCB-high; n=90 per treatment).
165
Thereafter, when light came on again, distance travelled decreased and overall reached
values below the ones observed during the first Light on-1. There was a significant treat-
ment effect (ANOVAR (F (6, 502)=18.67, p<0.001) with Newman-Keuls post hoc test):
during Light on-1, Solvent fish swam less than contaminated fish and during Light off,
the same significant treatment effect was observed with a similar pattern. Finally, dur-
ing Light on-2, PCB-medium fish showed the highest distance travelled and PCB-high
reached similar levels as Solvent F1 fish.
6.2.2 24-h swimming activity – horizontal movements
Constant monitoring of swimming activity over 24-h allowed several periods to be

identified that were characterised by specific behavioural patterns according to day/night
and light changes. In our system, light change was abrupt and provoked an intense in-
crease in swimming activity (distance travelled; Fig. 61A) both at lights off (22:30) and
lights on (8:30). Apart from these periods, distance travelled showed a slight decreased
from D1-1 to D1-3 and relatively low variation at night (Fig. 61A).
Treatment effects were significant during each day-time period and one night period
(N1-2). During the first day, the same pattern was observed for D1-1, D1-2 and D1-3
with a significant increase in distance travelled for PCB-high fish compared with the Sol-
vent treatment (for D1-1 KW(2, 294) =7.546, p=0.023; for D1-2 KW(2, 294) =9.400, p=0.009
and for D1-3 KW(2, 252) =8.329, p=0.015; Fig. 61A). No difference was observed between
treatments during light regime changes. At mid-night, PCB-medium fish showed the high-
est distance travelled (for N1-2 KW(2, 252) =10.194, p=0.006). In the following morning,
PCB-high fish swam at the highest level (for D2-1 KW(2, 294) =37.704, p=0.001). When
comparing only the photophase and the dark phase within treatment Fig. 61B, the diur-
nal nature of the swimming activity was confirmed for each treatment hereby showing no
overall rhythmic activity disruption.
166
8000
Solvent A
PCB-medium
6000 PCB-high
Distance travelled (cm/30 min)
b
4000
a ab b
b
ab b ab
a a
a a
2000 b
a a
0
D1-1 D1-2 D1-3 L. off N1-1 N1-2 N1-3 L. on D2-1
Day 1 Light off Night Light on Day 2
a B
3000
a
Distance travelled (cm/30 min)
a
b
2000 b b
1000
0
Day Night Day Night Day Night
Solvent PCB-medium PCB-high
Figure 61: Distance travelled according to period of the day during the 24-h
swimming activity test. A. Distance travelled (mean±S.E.M) by adult ze-
brafish for each period of the day and B. Distance travelled (mean±S.E.M)
during the photophase and the dark phase for each treatment (Solvent, PCB-
medium and PCB-high, n=14 per treatment, different letters indicate signifi-
cant differences between treatments and within period (A) or within treatment
and between day vs. night (B)). The greyscale rule below the graph indicates
the light status and period of the day, L. off: Light off; L. on: Light on.
167
6.2.3 24-h swimming activity – vertical movements
Vertical positioning of the fish filmed over 24-h showed an overall marked daily change
with fish shifting from occupying mostly the bottom and mid sections during the pho-
tophase to a upper section preference during the night (Fig. 62).
100%
Solvent
75%
50%
25%
Proportion of time spent in the different zones
0%
Day 1 Night Day 2
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47
100%
PCB-medium
75%
50%
25%
0%
Day 1 Night Day 2
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47
100%
Upper section PCB-high
75%
Mid section
50%
Bottom section
25%
0%
1 3 5 7 9Day
11 113 15 17 19 21 23 25 27Night
29 31 33 35 37 39 41Day 2 47
43 45
Figure 62: Vertical space occupancy during the 24-h swimming activity test.
Relative proportion of time (%) spent in the bottom, mid and upper section
of a 3-L tank for adult zebrafish from the three treatments (Solvent, PCB-
medium and PCB-high, n=9 per treatment). The greyscale rule below the
graph indicates photoperiod; L. off: Light off; L. on: Light on.
168
Such marked positioning alternation was observed using the proxy of the number of
passages between sections: the highest number of zone transition was observed at the end
of the night and during light on (Fig. 63).
250
Solvent Up-middle transition - A
PCB-medium
200
PCB-high
Number of passages
150
ab
100 c
b a ac b
c b b
b b b
50 a a
a
a ab b a
a
c
0
A B C D E F G H I
250
Solvent Middle-bottom transition - B
PCB-medium
200
PCB-high
Number of passages
150
100
b
ab b
ab b ab
a a
50
a
aba b
0
A B C D E F G H I
Figure 63: Number of passages between sections during the 24-h swimming
activity test. A. Number of passages between upper and mid section of the
tank and B. Passages between mid and bottom section of the tank for each pe-
riod and each treatment (Solvent, PCB-medium and PCB-high, n=9 per treat-
ment; mean±S.E.M; different letters indicate significant differences between
treatments and within period). The greyscale rule below the graph indicates
photoperiod; L. off: Light off; L. on: Light on.
The number of passages between the upper and mid section showed significant treat-
ment effects within each period except the light off and light on periods (Tab. 11a). During
day 1, contaminated fish showed a significantly higher transition activity and PCB-high
fish showed the highest number of passages during D1-1 and D1-2 (Fig. 63A). A similar
169
pattern and level of activity was also observed the next morning during D2-1 showing
a similar profile to D1-3. During the night, PCB-high fish showed a lower number of
passages than PCB-medium but not always different with that observed for Solvent fish.
The number of passages between the mid and bottom section showed a significant treat-
ment effect during day 1 and in the middle of the night (N1-2, Fig. 63B, Tab. 11). The
number of passage between up and middle zone during the night is constantly higher than
between middle and bottom zone and increase along the night. Finally albeit not always
significant, number of up/middle transition of PCB-medium fish is higher than for Solvent
and PCB-high fish which is consistent with the increase of residence duration in the mid-
dle zone apparent in Fig. 62. Contaminated fish showed the highest number of passages
during D1-1 and D1-2 with however no difference between PCB-medium and PCB-high
treatment. During D1-3, only PCB-medium fish were significantly more active than the
other treatment. During N1-2, PCB-high fish displayed a significantly lower level than
PCB-medium which however did not differ from Solvent.
1800
Solvent
a
a
PCB-medium a
Time spent in the bottom section (s)
a
a
b
b PCB-high b
1200
b b c
c c ab
b
600
ab a b
0
A B C D E F G H I
Figure 64: Time spent in the bottom section during the 24-h swimming activ-
ity test for each period and each treatment (Solvent, PCB-medium and PCB-
high, n=9 per treatment (mean±S.E.M; different letters indicates significant
differences between treatments and within period. The greyscale rule below
the graph indicates the light status and period of the day L. off: Light off; L.
on: Light on.
When focusing on the time spent in the bottom zone only (Fig. 64), we observed signif-
icant treatment effects for almost all period except light off and N1-1 and N1-3 (Tab. 11b).
During the day, contaminated fish showed a significantly lower occupancy of the bottom
section than Solvent fish and PCB-high were at the lowest level for D1-1, D1-2 and D2-
1 and at a similar level to PCB-medium fish during D1-3. At light on only PCB-high
170
Table 11: Results of the comparison between treatments (Solvent, PCB-

medium and PCB-high) using Kruskal-Wallis test within period and between
treatments for the 24-h swimming activity - vertical movements.
Variable Period K-W statistics (ddl, N) p value

Number of passages between upper and mid sections D1-1 H(2, 189) =55.69 <0.001
D1-2 H(2, 189) =64.11 <0.001
D1-3 H(2, 162) =19.97 <0.001
L. off H(2, 27) =1.04 0.593
N1-1 H(2, 189) =7.59 0.022
N1-2 H(2, 189) =41.56 <0.001
N1-3 H(2, 162) =7.65 0.022
L. on H(2, 27) =4.13 0.126
D2-1 H(2, 162) =22.69 <0.001
Number of passages between mid and bottom sections D1-1 H(2, 189) =17.18 <0.001
D1-2 H(2, 189) =45.17 <0.001
D1-3 H(2, 162) =9.41 0.009
L. off H(2, 27) =2.94 0.229
N1-1 H(2, 189) =2.11 0.347
N1-2 H(2, 189) =16.65 <0.001
N1-3 H(2, 162) =5.43 0.066
L. on H(2, 27) =1.42 0.491
D2-1 H(2, 162) =5.30 0.070
Time spent in the bottom section D1-1 H(2, 189) =64.54 <0.001
D1-2 H(2, 189) =71.58 <0.001
D1-3 H(2, 162) =27.87 <0.001
L. off H(2, 27) =4.22 0.121
N1-1 H(2, 189) =0.16 0.919
N1-2 H(2, 189) =8.08 0.017
N1-3 H(2, 162) =1.05 0.598
L. on H(2, 27) =7.37 0.025
D2-1 H(2, 162) =40.92 <0.001
171
significantly differed from Solvent fish with again the lowest occupancy of the bottom
section. During the night, differences were only observed around midnight (N1-2) and
only PCB-medium and PCB-high differed from each other.
6.3 Discussion
Our results demonstrate that chronic exposure of fish to diets spiked with mixtures of
PCBs can alter behavioural traits in unexposed descendants both at a very early age (5 dpf
larvae) and later on when fish were adults. Behavioural alterations were observed in all
tests (sudden dark challenge and 24-h swimming activity) on fish issued from parents that
had been fed for one year on diets containing PCBs: PCB-medium, containing a total
PCB concentration of 515 ng.g-1 and PCB-high, containing 2302 ng.g-1 .
Depending on the stage considered and/or the level of PCBs in parents’ diet, differential
alterations were observed. In addition, the results correspond to different kind of situations
and can be interpreted first, as responses to a challenging situation in larvae and, second
for adults in the light of locomotor and vertical positioning rhythmic activity disruption.
As already pointed out by several authors, most organs of 5-day old larvae are de-
veloped (Kimmel et al., 1995; Rubinstein, 2003) and the larva already shows a complex
behavioral repertoire (Champagne et al., 2010; Rihel et al., 2010; Ali et al., 2011). In
addition, challenges performed at this age conform to ethical requirements (compliance
to 3R rule since test at this age and in this species are considered as in vitro; Strähle et al.,
in press). The challenge used to assess behaviour of larvae is considered as very robust
and it can be used to reveal more readily than any other tasks, defective brain function,
aberrant nervous system development and/or locomotor and visual defects caused by toxic
compounds (Ali et al., in press).
Alterations observed may be the consequence of several non-exclusive events: e.g.

developmental defects provoked by 1) exposure of embryo and larvae to PCBs after ma-
ternal transfer to the egg or 2) alteration of oocyte quality in response to maternal reaction
after its exposure to PCBs or finally epigenetic imprinting of gametes modifying devel-
opment and/or physiology. These different hypotheses are compatible with the fact that
alterations are observed at both larval and adult stages. Among acquired data, we only
have indication supporting hypothesis 1 since we have shown that dietary PCBs are in-
deed transferred to zebrafish eggs at 16.0 and 47.6 ng.g-1 fresh weight for PCB-medium
and PCB-high diets respectively (Daouk et al., 2011).
172
Synthesis of behavioural alterations and response to dose
Thus, after acclimation to the environment for two hour without disturbances, loco-
motor activity levels were stabilized and the first period of recording (5 min in duration,
Light on-1) reflected the basal activity. Here one can notice a hyperactivity of contam-
inated larvae reaching a slightly higher level in PCB-medium than PCB-high treatment,
following a biphasic concentration-response already described in F0 adults exposed to
PCBs (Chapitre 5, p. 137). Thereafter, differences remained over the sudden dark chal-
lenge context phase (of equal duration). Finally, during the Light on-2 phase, the profile
is similar to a biphasic concentration-response profile with a stimulation of activity at in-
termediate contamination level followed by suppression for PCB-high F1 fish.
Using the experimental protocol of a 24-h swimming activity recording preceded by an

overnight acclimation period, we clearly targeted the measure of spontaneous locomotion
activity in the horizontal and vertical planes.
What we observed for the distance travelled as measured in the top-view recordings
is an overall significant diurnal swimming activity similar to the pattern described with
another method by del Pozo et al. (2011) with difference between day and night activity
levels being exacerbated for PCB-high fish. In further details, high responses to light tran-
sition period were observed whatever the treatment considered and during light phases in
particular, treatment effects were significant. A monotonic concentration response within
each day period was significant, however less marked than the one observed in larvae
since here PCB-medium F1 fish did not significantly differ from Solvent treatment F1 fish.
Such absence of classical dose response as already been shown for several molecules. It
has been, for example, demonstrated in a large scale analysis of zebrafish behavioral re-
sponse to chemicals (Ali et al., in press). This has also been reported in the particular case
of PCBs (Aluru et al., 2004; Boix et al., 2011; Ulbrich et Stahlmann, 2004) and underlines
the need for more systematic dose-response behavioral screening using PCBs.
Concerning vertical positioning of fish, we observed a marked pattern with Solvent

F1 fish staying in close association with the bottom during most of the photophase and
showing a clear overnight surface positioning. For contaminated F1 fish we noted both a
significant lesser use of the bottom section during the day (monotonic suppression over
doses) and a greater number of passages between sections reflecting a greater agitation of
the fish especially for PCB-high F1 fish in the afternoon (12-19h).
173
In the wild, zebrafish occupy the whole water column apparently without vertical dis-
tribution bias (Spence et al., 2006, 2008; Engeszer et al., 2007a). In tanks, it appears
from published data, that during sleeping periods zebrafish preferentially occupy tank top
layer but the authors did not performed detailed analysis of vertical distribution (Yoko-
gawa et al., 2007). Thus, to our knowledge, by recording this vertical positioning over
24-h, we documented for the first time this daily spontaneous shift in vertical positioning.
Several authors have used a protocol called novel diving tank test whereby they ex-
plore stress and anxiety in juvenile or adult zebrafish filming in a similar manner as us
(side view) but for 5 or 6 consecutive minutes usually during day-time (Levin et al., 2007;
Egan et al., 2009; Sackerman et al., 2010). They were able to demonstrate a clear sig-
nificant link between an increased use of lower section and an anxious or stressed state
(eventually induced by different known anxiogenic drugs e.g. caffeine or relieved by anx-
iolytic ones, e.g. fluoxetine or nicotine) and confirmed by cortisol assays (Levin et al.,
2007; Egan et al., 2009). In our set-up, and in view of our results, we could hypothesise
that PCBs contaminated F1 fish showed a suppression of stress and anxiety. This could be
the consequence of an increase in boldness and/or a disinhibition of cautious behaviour.
One interpretation of ecological relevance is that bottom seeking behaviour or the classi-
cal homebase formation in the bottom of the tank is an anti-predator strategy (Levin et al.,
2007; Stewart et al., 2010; Rosemberg et al., 2011) and in the case of F1 contaminated
fish it is significantly disturb and as such, descendant of contaminated fish could be more
prone to predation.
Night-time behavioural pattern has been describe by several authors working on sleep
or rest/wake profile in zebrafish for which sleep state is characterized by reversible periods
of immobility, increased arousal threshold and place preference (Zhdanova, 2006; Yoko-
gawa et al., 2007). The same authors also pointed out that zebrafish is a model of choice
for understanding the impact of sleep and sleep deprivation on cognitive functions and
performance in higher vertebrates as the species also respond to hypnotic drugs. Hence,
what we observed for F1 fish issued from contaminated parents during the night-time in-
cludes an increase in swimming levels for PCB-medium and only minor changes in their
vertical positioning, suggesting that contrary to F0 fish (Chapitre 5, p. 137), sleep features
were not markedly affected in F1 contaminated fish. Further studies should be conducted
to explore the cognitive functions and performances in these fish.
6.4 Conclusions
Finally, if we summarise behavioural phenotypes observed in descendants of fish ex-

posed to PCBs diet, we observed an increase in activity in larvae which is maintained
174
in adults. In adults, this is associated with a decrease in tank bottom section occupancy
and with an increase in the number of zone transition which may be due to a loosening of
homebase behaviour and/or a loss of behavioural inhibition. In all cases, these phenotypes
observed in PCBs groups can be related to the behavioural syndrome observed in children
or animal models submitted to in utero or perinatal exposure to PCBS, the attention deficit
/ hyperactivity disorder (ADHD, Holene et al., 1998; Rice, 2000; Colciago et al., 2009;
Eubig et al., 2010; Sagiv et al., 2010; Vitalone et al., 2010). The puzzling finding of our
study being that with our model, the ADHD seems to persist into adulthood.
Acknowledgments
This study was supported by Ifremer and Région Poitou-Charentes (PhD fellowship
for Samuel Péan and Caroline Vignet), by the Conseil Général de Charente Maritime
(PhD fellowship for Tarek Daouk) and EC2CO-Cytrix (grant GénérationPOP to Xavier
Cousin).
175
Discussion générale
Les objectifs de cette thèse étaient double :

1) D’un côté, de mettre en place des outils pertinents pour l’étude du comportement
du poisson zèbre et de la sole.
Pour cette partie, le choix s’est essentiellement porté sur l’analyse de la locomotion
chez le poisson zèbre, connu pour être une espèce mobile, et pour la sole, plus placide,
l’étude de la locomotion a été complémentaire à d’autres critères plus appropriés à cette
espèce, comme les capacités cryptiques (chromie et enfouissement). L’utilisation du logi-
ciel de video tracking Ethovision XT (Noldus, Pays-Bas) sur de longues durées s’est avé-
rée fiable et facile à réaliser. Des tests courts en situation de challenge ont été complétés
par d’autres plus longs, sur 23 ou 24 h, afin de mesurer pour les premiers des différences
dans les capacités de récupération et/ou d’adaptation à un nouvel environnement et pour
les seconds des différences dans l’activité locomotrice en général.
2) D’un autre côté, d’évaluer, avec ces outils, l’existence d’effets d’une contamina-
tion alimentaire aux PCB sur le comportement de la sole et du poisson zèbre, ainsi que
d’éventuels effets transgénérationnels chez cette dernière espèce.
Pour atteindre ce second objectif, différents groupes de poissons ont été constitués
en fonction de leur régime alimentaire (aliments non contaminés ou contaminés) et leur
comportement a été étudié après 30 et 60 jours de contamination pour les soles (locomo-
tion, enfouissement puis capacité chromatique pendant 26 jours de décontamination), et
250 jours pour les poissons zèbres (locomotion pendant 24 h, challenge en T-maze ou en
bac noir et blanc). Une première génération fille de poissons zèbres issue des géniteurs
contaminés a été obtenue et testée à 5 jours (challenge lumineux) puis au stade adulte
(activité de nage horizontale puis verticale pendant 24 h).
Les apports majeurs de ces travaux ayant permis d’atteindre ces deux objectifs sont
synthétisés et discutés ici.
Pertinence des outils choisis

Du point de vue logiciel, la facilité d’acquisition des données par les méthodes auto-
matiques de video tracking (lorsque les contraintes techniques indispensables sont parfai-
tement respectées) ont permis un gain de temps pour le calcul des variables individuelles,
mais leur traitement final a cependant requis dans notre cas la manipulation de volumes de
données importants, contrairement à une acquisition semi-automatique ou manuelle (par
exemple avec ODRec) pour laquelle le temps d’acquisition des données sera plus long que
leur traitement final. Cependant, la qualité et la quantité des données obtenues par l’ana-
lyse automatique, par rapport à une acquisition plus manuelle, permettent de conclure que
179
du point de vue méthodologique, les analyses automatiques sont à favoriser. Lorsque les
analyses automatiques n’ont pas été possibles, comme dans le cas des changements de
zones fond noir-fond blanc de la première génération de poissons zèbres contaminés, où
les individus n’étaient pas détectables sur la zone sombre, ou pour l’analyse des vidéos
d’enfouissement des soles, l’utilisation du logiciel ODRec a permis de faciliter considéra-
blement l’acquisition des séquences comportementales (mobilité ou enfouissement pour
les soles) ou des évènements (changement de zone pour les poissons zèbres, "est enfoui"
pour les soles).
Du point de vue matériel, l’utilisation de rétro-éclairage par rayonnement infra-rouge
a permis d’enregistrer le comportement des poissons durant la nuit, en leur assurant une
obscurité parfaite. Grâce à cette technique, des expériences de video tracking sur 23 ou
24 h ont pu être envisagées. Utilisé de jour, avec un filtre placé devant la caméra pour
bloquer les rayonnements visibles, le rétro-éclairage infra-rouge permet de s’affranchir de
tout reflet à la surface de l’eau ou de toute ombre dans le fond des bacs, facilitant ainsi
considérablement les réglages pour l’analyse vidéo. De plus, cette technique a permis de
mettre en place des challenges lumineux chez des larves de poisson zèbre, en développant
un test comportemental très court (15 min pour suivre 20 individus en même temps) réa-
lisable très tôt dans la vie de l’animal (5 jours).
Sur ces deux premiers points, une partie des outils mis en place durant cette thèse ont
d’ores et déjà été adaptés et transposés pour l’étude des effets potentiels d’autres polluants
(thèse de Caroline Vignet), ou d’autres problématiques relatives à l’aquaculture (thèses de
David Benhaïm et de Sébastien Ferrari) ou à l’analyse des effets du marquage des pois-
sons (travaux de Ewan Hunter).
Du point de vue méthodologique, une fois résolues les difficultés techniques pour
réaliser des enregistrements de l’activité sur plus de 23 h, l’utilisation de challenges courts
en complément permet d’aborder différents aspects comportementaux :
– les challenges (enfouissement des soles, choix de couleur de fond, T-maze, challenge
lumineux chez le poisson zèbre) vont révéler des problèmes relatifs à l’adaptation
à une situation nouvelle, bien souvent en situation de stress due au transfert dans le
bac d’expérimentation ;
– les expériences longues réalisées après acclimatation (comme les suivis de nage sur
24 h chez le poisson zèbre) vont quant à elles révéler des problèmes d’activité plus
globaux, qui ne peuvent pas être directement reliés à l’adaptation à l’environnement,
mais davantage à des facteurs intrinsèques (état physiologique, chronobiologique,
180
etc.) ;
– les expériences longues réalisées sans acclimatation (comme l’étude de la nage pen-
dant 23 h chez la sole) vont permettre de mesurer dans un premier temps l’adaptation
au nouvel environnement suite au stress de transfert, mais aussi de mesurer la récu-
pération ;
Ces trois approches méthodologiques sont complémentaires et n’apportent pas la même
information, mais permettent ensemble de comprendre de manière plus fine les altérations
comportementales liées à une mauvaise gestion du stress de celles plus profondes, liées à
une perturbation globale de l’activité de l’individu.
Les limites
Certaines limites ont été rencontrées durant cette thèse, notamment au niveau du traite-
ment des vidéo. En effet, le video tracking n’est pas une solution à toutes les situations. Si
cette méthode est parfaitement fonctionnelle dans le cas de l’étude de la nage individuelle,
des améliorations sont à apporter pour le suivi d’individus en groupe sans marquage, qui
est pour le moment trop imprécis pour être totalement exploité. L’analyse du comporte-
ment en groupe sera vraisemblablement une des étapes importantes à franchir dans l’ana-
lyse d’image. En effet, dans le cas de l’analyse en groupe, avant même d’en arriver au
video tracking, qui nécessite de connaître l’identité de chaque individu sur chaque image
afin de reconstituer sa trajectoire depuis le début, un simple outil capable de donner la po-
sition des individus sur l’image pour calculer les distances interindividuelles pourrait être
une première étape à franchir. Pour le moment, certains logiciels le proposent en partie
(notamment des logiciels gratuits comme ImageJ, qui possèdent cette option nativement),
mais ils ne permettent pas de pondérer les points quand les individus sont confondus en un
seul amas de pixels. Une première approche pourrait donc être d’effectuer une première
analyse automatique des "tâches" visibles à l’écran (c’est-à-dire les individus) à laquelle
s’ajouterait une correction manuelle pour toutes les images pour lesquelles certains indi-
vidus n’ont pas été détectés (car confondus avec d’autres) afin d’obtenir les coordonnées
de chacun des individus et de calculer le centre de masse exact du groupe. L’approche
alternative proposée par Heatmap From Stack permet d’obtenir une autre information,
à savoir la répartition moyenne des individus dans l’arène d’étude, mais bien que cette
information soit un bon complément à l’analyse des distances interindividuelles, utilisée
seule elle devient trop faible car peu explicative.
Ces limites ont eu pour conséquences l’impossibilité technique de traiter les vidéos
réalisées à partir de groupes d’individus non marqués pendant cette thèse. Cependant,
des solutions sont encore envisageables et d’une manière générale, la solution, une fois
trouvée, demandera certainement un temps d’analyse assez long. Mais au vu de la rapidité
181
de l’analyse individuelle, l’analyse en groupe, même plus fastidieuse, sera à envisager, car
au même titre que le challenge apporte une information différente de l’expérience longue
réalisée après acclimatation, l’analyse du comportement en groupe sera un complément
intéressant à celle du comportement individuel.
Caractérisations des effets des PCB
Il est difficile de comparer les résultats d’une étude à une autre, étant donné qu’en
plus des variations de conditions d’élevage (qui peuvent en elles-mêmes apporter une
variation), vont se rajouter les variations liées au nombre de congénères de PCB choisis,
leurs proportions relatives et totales, leur mode et leur temps d’exposition qui sont autant
de facteurs qui vont avoir une influence sur les effets mesurés.
D’autres paramètres, beaucoup plus biologiques, peuvent aussi influer sur les résultats,
comme le stade de développement auquel va s’appliquer la contamination, l’état métabo-
lique des individus contaminés, leur sexe ou encore leur espèce.
Le but de cette discussion n’est donc pas de strictement comparer les résultats obte-
nus pendant cette thèse aux autres travaux mais plutôt de les resituer dans un contexte
écologique.
D’une manière générale, les protocoles ont été adaptés en fonction de chaque espèce.
Ainsi, pour le poisson zèbre, qui est une espèce très mobile, les stratégies de tests compor-
tementaux se sont focalisées sur l’étude de la locomotion (nage 24 h) ou sur des challenges
induisant une variation du comportement locomoteur (challenge lumineux, T-maze, choix
de couleur de fond). L’âge des poissons a aussi été pris en compte en utilisant des tests
plus longs et plus complexes chez les adultes, et plus rapides et plus simples chez les
larves. Concernant la sole, plus placide, le comportement locomoteur a été suivi pendant
23 h sans acclimatation afin de pouvoir à la fois mesurer une situation de challenge, puis
l’activité normale après récupération. En dehors de l’activité de nage, le challenge court
(30 s) était basé sur le comportement d’enfouissement, qui est propre aux poissons plats,
et le test d’homochromie a été réalisé sur deux périodes consécutives de 13 jours, afin de
prendre en compte le temps nécessaire à une bonne adaptation chromatique (Ellis et al.,
1997).
Les tests se sont volontairement portés sur différents aspects comportementaux afin
de pouvoir plus facilement mettre en évidence d’éventuels effets des PCB, sans a priori.
182
Suivi des variables physiologiques
Le suivi des variables physiologiques pendant les 60 jours de contamination des soles
n’a montré aucune différence expliquée par le traitement, que ce soit pour le poids, l’indice
de condition de Fulton ou le taux de croissance journalier. Ces résultats confirment ceux
préalablement trouvés par Eichinger et al. (2010). Chez le poisson zèbre, le suivi de ces
variables, réalisé dans le cadre de la thèse de Tarek Daouk, n’a montré aucune différence
significative pendant l’ensemble de la contamination (Daouk et al., 2011). Concernant les
travaux de Bengtsson (1980) et Lyche et al. (2010) ayant montré une augmentation signi-
ficatif du poids des individus contaminés, les premiers utilisaient un mélange commercial
de PCB (Clophen A50) et les seconds se servaient d’un mélange PCB / PBDE / DDT. Örn
et al. (1998), qui ont quant à eux montré une baisse de poids, utilisaient un mélange de
20 congénères de PCB, notamment des dioxin-like dont le CB-126 et CB-169, dans des
doses plus importantes que les nôtres (jusqu’à ΣPCB=8 µg.g-1 ).
Ces variations de protocoles peuvent expliquer les variations des effets constatés sur le
poids.
Les variations comportementales en situation de challenge
Chez la sole, le suivi de l’activité de nage a commencé sans acclimatation, donc en

situation de challenge. Pendant les premières heures de ce test, la condition la plus for-
tement contaminée (PCB high) a montré une activité locomotrice significativement plus
élevée. Lors du challenge d’enfouissement sur fond sableux, aucune différence signifi-
cative n’a été trouvé entre les conditions. En revanche, le suivi de la chromie pendant
les 26 jours suivant la fin de la contamination a montré des capacités d’assombrissement
amoindries.
Chez le poisson zèbre, lors de challenge de choix de couleur de fond, les individus du
groupe PCB medium ont significativement moins utilisé l’arène sombre que les indivi-
dus des groupes Solvent et PCB high. Lors du challenge en T-maze, ces mêmes individus
(condition PCB medium) ont montré une vitesse de nage et une mobilité plus forte que
les individus des autres conditions, ainsi qu’un nombre d’individus atteignant la zone de
confort plus élevé pour une latence moyenne pour atteindre cette zone significativement
plus faible que pour les autres conditions. Enfin, chez la génération F1 de poissons zèbres,
issue de géniteurs contaminés, la situation de challenge lumineux a montré une activité
locomotrice plus élevée chez les larves des conditions PCB medium et PCB high avant
et pendant la phase d’obscurité. Au retour de la lumière, seuls les individus de la condi-
tion PCB medium ont montré une activité locomotrice très nettement supérieure à celle
mesurée pour les autres.
183
Il semblerait donc que pour les deux espèces considérées, les situations de challenge
provoquent des réactions comportementales exacerbées chez les individus contaminés
aux PCB. Cette différence s’exprime par une activité de nage plus soutenue. Cette alté-
ration se retrouve chez la génération fille de poissons zèbres contaminés.
Les variations comportementales en dehors des situations de challenge
Chez la sole, après l’habituation à l’environnement de test pour l’étude de l’activité sur
23 h, les individus de la condition PCB medium ont montré une activité significativement
moins élevée pendant la nuit. Durant le test d’homochromie, les individus contaminés ont
montré plus de difficultés à s’assombrir.
Chez le poisson zèbre, les individus de la condition PCB high ont montré une activité
locomotrice pendant le deuxième tiers de la nuit significativement plus élevé que celle
des individus de la condition Solvent. Lors de la dernière partie de la nuit, les individus
de la condition PCB high ont été significativement plus actifs que ceux des conditions
Plain et Solvent. Chez la génération de poissons zèbres issue de géniteurs contaminés,
l’activité de nage horizontale a été significativement plus élevée pour les individus de la
condition PCB high sur l’ensemble des heures de jour et pour la condition PCB medium
pour le milieu de la nuit. Au niveau de l’activité de nage verticale, l’expérience a montré
que la répartition verticale des poissons contaminées était différente de celle des poissons
Solvent et que cela était associé à une augmentation du nombre de changement de zones.
Il semblerait donc que chez ces deux espèces, la contamination entraine également
des modifications de comportement (en particulier d’activité) en l’absence de contrainte.
Implications écologiques des effets des PCB
L’altération des capacités d’adaptation chez les individus contaminés aux PCB chez les
deux espèces ainsi que l’altération de leur activité en dehors des situations de challenge
peuvent avoir des conséquences non négligeables sur leur survie en milieu naturel. En
effet, l’augmentation de l’activité observée chez les individus contaminés pendant l’habi-
tuation au nouvel environnement pourrait avoir des conséquences négatives :
– en milieu naturel, les individus sont régulièrement en situation de challenge, que
ce soit à cause de changements de facteurs abiotiques ou à cause d’une pression
de prédation ; si, pour une raison quelconque, la réponse n’est pas appropriée à la
perturbation, où si cette réponse est disproportionnée, la survie de l’individu peut
être remise en question ;
184
– le fait que cette différence d’adaptation se traduise par une augmentation de l’activité
locomotrice (parfois pendant plusieurs heures dans le cas de la sole) implique une
dépense énergétique supplémentaire, qui peut avoir des conséquences importantes
ultérieurement (en cas de deuxième challenge consécutif par exemple).
Chez la génération F1 de poissons zèbres, la présence des polluants dans le vitellus
(Bodiguel et al., 2009; Daouk et al., 2011) entraine une exposition immédiate des em-
bryons au polluant. L’augmentation d’activité importante remarquée induit une dépense
d’énergie non négligeable dès les premiers jours de vie chez ces individus. Dans le milieu
naturel, une telle augmentation d’activité, accentuée par une situation de challenge, aura
forcément des répercussions.
Au niveau de l’activité globale en dehors des situations de challenge, on retrouve aussi

une altération de la locomotion dans le sens de l’augmentation de l’activité chez le poisson
zèbre et dans le sens d’une diminution chez la sole. Ces deux espèces étant différentes,
leurs stratégies comportementales le sont aussi : le poisson zèbre est une espèce mo-
bile, la sole est plus placide. Chez une espèce mobile, une perturbation de l’état interne
(comme lors d’une contamination aux PCB dans notre cas) va potentiellement induire
une diminution du bien-être, ce qui peut se traduire par une augmentation de l’activité.
Il ne semble pas contradictoire qu’une même perturbation, chez une espèce plus encline
à l’immobilisme, augmente le comportement de prostration. La notion d’hyperactivité ou
de syndrome d’ADHD induits par certaines substances (comme c’est le cas pour les PCB ;
Holene et al., 1998; Bushnell et Rice, 1999; Nakayama et al., 2004, 2005a; Banerjee et al.,
2007; Eubig et al., 2010) serait donc à replacer dans le contexte de l’espèce. La plupart
(voire la totalité) des espèces sur lesquelles portent des études sur les effets des polluants
sont des espèces réputées mobiles (comme par exemple l’Homme, le singe, la souris ou le
poisson zèbre). L’utilisation de ces modèles permet d’obtenir des tests comportementaux
qui peuvent être relativement courts en temps, mais l’interprétation des résultats risque
de n’être valable que pour des espèces à la stratégie comportementale similaire. En plus
d’être placide, la sole est un animal nocturne (Kruuk, 1963). Ce deuxième aspect est très
important car les protocoles mis en place ont permis de prendre en compte cet aspect, et
cette baisse d’activité pendant la nuit représente une altération comportementale impor-
tante pour cette espèce.
La mauvaise capacité des soles contaminées à s’assombrir est là aussi un double pro-
blème, car les individus seront potentiellement à la fois :
– plus facilement visibles des prédateurs ;
– plus facilement visibles de leur proies, et donc deviennent de moins bons prédateurs.
185
Ces deux points peuvent eux aussi être décisifs : au niveau de la survie, être visible des
prédateurs est un risque qui peut avoir des conséquences à très court terme, tandis qu’être
un mauvais prédateur aura des conséquences à plus ou moins long terme. En général,
l’environnement préférentiel des soles est très vaseux et donc sombre. Cette difficulté
devient donc encore plus problématique lorsqu’on la resitue dans un contexte écologique,
comme par exemple la baie de Seine, où le taux de contamination des poissons aux PCB
est très élevé.
D’un point de vue strictement éthologique, si l’on considère que les individus non
contaminés sont en situation d’équilibre dans leurs réalisations comportementales, les
différences observées chez les individus contaminés peuvent être mises en relation avec
les quatre questions de Tinbergen (1963) :
– la cause immédiate du comportement : les augmentations d’activités observées chez
les individus contaminés en réponse aux challenges soit : i) n’ont pas de sens straté-
giques en termes de comportement mais constituent l’aspect visible d’une altération
physiologique et/ou d’une dérégulation ; ii) font partie d’une stratégie comportemen-
tale alternative d’urgence (Elliott et al., 2007) qui n’est pas forcément efficace à nos
yeux mais qui résulte d’un inconfort physiologique ;
– sa valeur de survie : les individus contaminés présentent des comportements qui
pourraient potentiellement les mettre en danger, que ce soit au niveau énergétique
avec des dépenses non justifiées ou alors au niveau mimétique pour la sole, plus
facilement visible des proies et de prédateurs ;
– son ontogénèse : les larves de poissons zèbres issues de géniteurs contaminés ont
montré un comportement locomoteur hyperactif dès le 5e jour, et ce comportement
a été ensuite retrouvé chez les mêmes individus devenus adultes ;
– sa phylogénèse : les larves puis les adultes de la génération F1 analysés lors ce
travail ont été directement exposés aux PCB contenus dans les œufs au cours de leur
embryogenèse, il n’est donc pas possible avec les données disponibles de statuer sur
le caractère héréditaire des effets observés (par épigenèse par exemple).
Perspectives
Maintenant qu’un premier lot de tests comportementaux est correctement maîtrisé au

sein de notre équipe, des études comportementales supplémentaires pourraient être en-
visagées dans le cas d’étude des effets de polluants organiques. Dans un premier temps,
186
des tests d’apprentissage permettraient de vérifier si les doses de polluants utilisées n’en-
gendrent pas de troubles de la mémoire (symptôme du syndrome d’ADHD).
Des tests de nage en groupe pourraient apporter des informations complémentaires
intéressantes (aux niveaux de la cohésion du groupe en nage libre ou de la prise de déci-
sion collective en labyrinthe) en sortant de l’échelle individuelle. Cependant, un certain
nombre de progrès techniques restent encore à faire pour être en mesure de suivre plu-
sieurs individus sans marquage par video tracking.
Des études complémentaires au suivi du comportement seraient à envisager pour les
futurs travaux. Une approche chronobiologique pourrait notamment permettre de mieux
expliquer les différences observées lors des expériences de nage de 23 et 24 h, par exemple
en laissant les individus exprimer leurs rythmes librement pendant 72 h en lumière ou ab-
sence de lumière continue. Ces études peuvent être complétées par des analyses de taux
d’hypocrétine, ou encore l’étude de l’expression de gènes clock. Pour les effets transgé-
nérationnels, des études sur plusieurs générations (jusqu’à F3) permettraient de savoir si,
en plus des polluants, des phénomènes épigénétiques sont responsables de la transmission
des effets d’une génération à l’autre.
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Zon, L. I. et Peterson, R. T. (2005). In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug
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212
Annexes
Annexes
Annexe A – Figure originale Slobodkin et Rapo-

port (1974)
Figure 65 – Représentation schématique et simplifiée des événements suivant

une perturbation environnementale (Slobodkin et Rapoport, 1974).
215
Annexe B – Poster International Flatfish Sympo-

sium 2011
IMPACTS OF TAGGING ON THE COMMON SOLE, SOLEA SOLEA L.

Ewan Hunter¹, Samuel Péan² & Marie-Laure Bégout²
¹Cefas, Pakefield Road, Lowestoft, Suffolk, NR33 0HT, United Kingdom
²IFREMER, Place Gaby Coll, BP 07, 17137 L' Houmeau, France
Introduction
1. Tagging studies are often interpreted either ignoring tag effects, or assumimg that the tags deployed do not affect the
survival, growth or behaviour of the tagged fish. Here the common sole, Solea solea L., is used as a model to experimentally
examine the impacts of tagging using electronic data storage tags (DSTs).
Methods
2. We followed the growth and physical stature of wild-caught and aquaculture-
reared sole maintained under common-garden conditions in tanks. Sole tagged with
PIT-tags only (“controls”) were compared with individuals tagged either internally
(intracoelomically) (Fig.1) or externally with “dummy” Cefas G5 DSTs over a period
Fig.2
of 4 months.
3. Approximately 0, 1 and 2 months after tagging, each individual was transferred to a 0.8 m2 featureless
arena, and was filmed over 23 h (Fig.2). Behaviour during this time was analysed using Ethovision X.T.
7.0 (Noldus, The Netherlands) behaviour analysis software and HeatMap from stack ImageJ plugin Fig.1
(source samuelpean.com).
T, n = 5 1, n = 4 2, n = 5
Results
4. Internal tagging required C T 1 2
selection of larger fish (Fig.3,

T, n = 5 1, n = 3 2, n = 3
aquaculture derived fish denoted
by dashed line ). Our “controls”
therefore were not true controls,
but were the smallest fish with
poor condition, which did not C T 1 2
survive beyond the second T, n = 5 1, n = 3 2, n = 3

filming (Feb/Mar 2010). A
second group of fresh controls
were filmed in May 2010 (Fig.4,
upper right hand panel). C T 1 2
Figure3 growth (first column) and Figure 4 activity of control, external and
internally tagged sole, at time of capture (C, Fig 3 only), immediately after
tagging (T) and 1 and 2 months after. Black bar indicates hours of darkness.
5. The results demonstrate no clear immediate or long-term
behavioural impacts of tagging on sole (Fig.4). High levels of mortality
(control fish in particular) made it difficult to discriminate differences
between treatments and a seasonal trend for increased activity,
confirmed by the results from a second control group (Fig.4). All
groups exhibited high levels of thigmotaxy (Fig.5), with fish remaining
in close proximity to the tank perimeter during day and night (Fig.6).
Daytime levels of thigmotaxy did however decline during the final
filming session.
Conclusions Fig.6
6. The wild-caught sole used here experienced high levels of mortality over the time course of the experiment as a result of
both pathogen and parasite infections. However externally and internally tagged fish were no more vulnerable than sole tagged
only with PIT tags. As internal tagging resulted in no clear detrimental physical or behavioural impact, we conclude that intra-
peritoneal tagging is an appropriate technique for studying the behaviour of wild and cultured free-swimming sole .
Acknowledgments : This work was funded by the Department for Environment, Food and Rural Affairs
(UK) and l’Institut Français de Recherche pour l‘Exploitation de la Mer and Région Poitou-Charentes
(France). We wish to thank Sébastien Ferrari and Xavier Cousin for their help with data treatment.
Figure 66 – Poster présenté au congrès International Flatfish Symposium en

2011.
216
Annexes
Annexe C – Fiche technique Nonatec

LUTRONIC INTERNATIONAL
TECHNICAL FEATURES
GENERAL
kSize: 1mm dia * 6 mm long

kWeight: 7,15 mg
kOperating frequency: 13,56 MHz
kNeedle diameter: 18 G (1,2 mm)
PERFORMANCES
kSmallest biocompatible transponder worldwide (patented technology),

kAutomatic recognition
kMemory: 512 bits
kRewriting: to 10 000 times
SECURITY
kUnique and Universal Identification Number

kNon traumatic injection
ENVIRONMENTAL
kBiocompatible glass tube

kChemical resistance :
Water immersion IP68: 20°C, 24h under 1m
Alcohol, ammoniac… immersion: 20°C, 100h
kMechanical robustness :
vibration IEC 68.2.6: 6g, 14… 200Hz, 3 axis, 8H per axis
- Shock: IEC 68.2.27: 30g, 18ms, 3 axis, 1084 times per axis
kThermal characteristics :
Storage temperature -40°C to + 90°C (+ 120°C for total 100 hours)
Operating temperature: -40°C to 85°C
For USA please contact:

Mr Eric GUERVIN
North America Sales Manager
salesusa@nonatec.net
For Europe please contact:
Mr Ken TURRELL
European Sales Manager
LUTRONIC
I N T E R N A T I O N A L
ken.turrell@lutronic.eu
or please contact:
M. Mathieu RATARD
mathieu.ratard@lutronic.eu
www.nonatec.net
Figure 67 – Fiche technique de micro-tags RFID de la marque Nonatec utili-

sés pour le marquage individuel des poissons zèbre et des soles communes.
217
Annexe D – Système de couleur Munsell
Figure 68 – Système de couleur Munsell. L’axe vertical représente la lumi-

nosité (Value), le cercle représente la nuance (Hue) et le plan horizontal re-
présente la pureté de la couleur (Chroma). Source : Wikimedia Commons
Wikimedia Commons – Jacob Rus .
218
Annexes
Annexe E – Détail des dosages chimiques de PCB

dans les muscles de soles après 30 et 60 jours de
contamination
CB-105 CB-118 CB-149 CB-153

A 450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
450 CB-105 CB-118 CB-149 CB-153
B
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Figure 69 – Détail des dosages chimiques de PCB dans les muscles de soles
après 30 et 60 j de contamination. A : Dosage après 30 j ; B : Dosage après
60 j.
219
Annexe F – Publications et actes de congrès
Publications
Benhaïm D., Bégout M.-L., Péan S., Manca M., Prunet P., Chatain B. (In preparation).
Impact of plant-based diet on behavioural and physiological traits in sea bass (Di-
centrarchus labrax).
Cousin X., Daouk T., Péan S., Lyphout L., Schwartz, M.-É., Bégout M.-L. (Submitted).
Electronic individual identification of zebrafish using RFID tags. Nature Methods.
Péan S., Daouk T., Lyphout L., Leguay D., Loizeau V., Cousin X., Bégout M.-L. (Sub-
mitted). Long-term food-exposure to PCB mixtures induces behavioural disruptions
in zebrafish. Aquatic Toxicology.
Benhaïm D., Péan S., Lucas G., Blanc N., Chatain B., Bégout M.-L. (Submitted). Beha-
vioural responses in wild caught and domesticated juvenile sea bass (Dicentrarchus
labrax) : captivity and aging interplay.Animal Behaviour.
Benhaïm D., Bégout M.-L., Péan S., Brisset B., Leguay D., Chatain B. (2012). Effect of
fasting on self-feeding activity in juvenile Sea bass (Dicentrarchus labrax). Applied
Animal Behaviour, Volume 136, Issue 1, 15 January 2012, Pages 63-73.
Benhaïm D., Péan S., Brisset B., Leguay D., Bégout M.-L., Chatain B. (2011). Effect of
size grading on Sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles self-feeding behaviour,
social structure and culture performances. Aquatic Living Resources, Volume 24,
Issue 04, October 2011, Pages 391-402.
Millot S., Péan S., Chatain B., Bégout M.-L. (2011). Self-feeding behaviour changes in-
duced by a first and a second generation of domestication or selection for growth in
the European sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquatic Living Resources, Volume
24, Issue 01, January 2011, Pages 53-61.
Millot S., Péan S., Leguay D., Vergnet A., Chatain B., Bégout M.-L. (2010). Evalua-
tion of behavioral changes induced by a first step of domestication or selection for
growth in the European sea bass (Dicentrarchus labrax) : A self-feeding approach
under repeated acute stress. Aquaculture, Volume 306, Issues 1-4, 15 August 2010,
Pages 211-217.
Communications orales
Péan S., Daouk T., Vignet C., Loizeau V., Cousin X., Bégout M.-L. (2012). Long-term
food-exposure to PCB mixtures induces behavioural disruptions in adult zebrafish
220
Annexes
and their offspring. Annual Symposium of the Fisheries Society of the British Isles,
Norwich, United Kingdom – July 9-13, 2012.
Péan S., Daouk T., Besson M., Loizeau V., Cousin X., Bégout M.-L. (2010). Effects of
PCBs on zebrafish behaviour. 9th International Congress on the Biology of Fish,
Barcelona, Spain – July 5-9, 2010.
Lyphout L., Péan S., Schwartz M-É., Daouk T., Bégout M.-L., Cousin X. (2009). Indivi-
dual identification of zebrafish using Nonatec RFID tags. 1st Meeting on Emerging
Technologies in Zebrafish, Bilbao, Spain – November 25-26, 2009.
Millot S., Péan S., Mayeras A.-L., Labbé L., Dupont-Nivet M., Bégout M.-L. (2009).
Fish personality as a measure of phenotypic plasticity in rainbow trout clones. In-
ternational Ethological Conference, Rennes, France – August 19-24, 2009.
Millot S., Péan S., Bégout M.-L., Chatain B. (2009). Chronic and acute stress effects on
feeding behaviour and growth performances of different European sea bass strain
(Dicentrarchus labrax). Wellfish meeting, COST 867, Isafjordur, Iceland – June 15-
28, 2009.
Péan S., Millot S., Bégout M-L., Chatain B. (2009). Acute and chronic stress effects on
feeding behaviour and growth performance in different strains of European sea bass
(Dicentrarchus labrax). Quatrièmes Rencontre de l’Ichtyologie en France, Paris,
France – March 24-27, 2009.
Lefrançois C., Luna Acosta A., Millot S., Péan S., Bégout M-L., Domenici P. (2008).
Swimming performance and aerobic metabolic scope in domesticated strains of Eu-
ropean sea bass, Dicentrarchus labrax. International Congress on the Biology of
Fish, Portland, USA, July 28 – August 1, 2008.
Posters
Hunter E., Péan S., Bégout M.L. (2011). Impacts of tagging on the common sole, Solea
solea. Eighth International Flatfish Symposium, IJmuiden, The Netherlands – No-
vember 5-11, 2011.
Dupont-Nivet M., Prunet P., Bégout M.-L., Pellegrini P., Khaw H.L., Millot S., Péan S.,
Aupérin B., Valotaire C., Rolland J., Kerneis T., Goardon L., Quillet E. (2010). Ge-
netics of adaptation in rainbow trout : A multidisciplinary approach. Aquaculture
Europe, Porto, Portugal – October 5-8, 2010.
Péan S., Daouk T., Mayeras A.-L., Besson M., Loizeau V., Cousin X., Bégout M.-L.
(2010). From model to fisheries species : Behavioural studies to reveal the poten-
tial effects of contaminant on fish population. ICES Annual Science Conference,
Nantes, France – September 20-24, 2010.
221
Péan S., Daouk T., Cousin X., Bégout M.-L. (2010). A contribution from Zebrafish
behavioural ecologists. EuFishBioMed meeting, COST BM0804, London, United-
Kingdom – September 8-9, 2009.
Péan S., Mayeras A.-L., Loizeau V., Bégout M.-L. (2010). Effects of organic pollutants
on common sole behavior. PhD Students Meeting La Rochelle, France – April 29,
2010.
Péan S., Mayeras A.-L., Loizeau V., Bégout M.-L. (2009). Do PCBs affect fish beha-
viour ? International Ethological Conference, Rennes, France – August 19-24, 2009.
222
Effets des polluants organiques persistants sur le comportement des
poissons
Résumé :
Les PCB (polychlorobiphényles) sont des molécules connues pour leur longue demi-vie et leur forte liposo-
lubilité qui conduisent à une bioaccumulation et une bioamplification dans les réseaux trophiques, menant à
un potentiel risque pour les prédateurs de haut niveau tel que l’Homme. De plus, il a été démontré que leur
affinité avec les composés lipidiques conduisaient à une transmission de la femelle à l’œuf chez les poissons.
Dans ce contexte, et comme d’autres travaux ont déjà montré des effets des PCB sur la physiologie et le
comportement d’animaux contaminés de différentes façons, nous avons observé les effets de ces molécules
chez deux espèces, la sole commune et le poisson zèbre. La contamination a été réalisée via l’alimentation
avec deux mélanges de PCB et deux concentrations qui correspondent à des situations environnementales,
en termes de dose ou de choix et de proportion des congénères retenus. La dose la plus haute est
équivalente à celle mesurée dans de la chair de molusques en baie de Seine et la dose intermédiaire à
celle mesurée en estuaire de Loire. Les soles contaminées ont montré une diminution du niveau d’activité
locomoteur après 30 jours (j) de contamination et une altération des capacités cryptiques après 60 j de
contamination. Les poissons zèbre contaminés ont montré une augmentation de l’activité locomotrice après
250 j de contamination. La génération issue de cette génération de poisson zèbre contaminée a elle aussi
montré une augmentation de l’activité locomotrice au stade larvaire et adulte. Chez les adultes, cela s’est
traduit par une diminution de l’utilisation de la zone de fond des bacs et une augmentation du nombre
de transition de zones, ce qui s’explique par une perte d’inhibition comportementale. Dans les deux cas,
les phénotypes comportementaux observés chez les groupes PCB sont associés à une altération de la
locomotion dans le sens d’une baisse d’activité pour une espèce placide comme la sole et dans le sens de
l’augmentation pour une espèce mobile comme le poisson zèbre.
Mots clés : Écotoxicologie, éthologie, PCB, Solea solea, Danio rerio, video tracking
Effects of persitent organic pollutants on fish behaviour

Abstract :
Because of their long biological half-life and high liposolubility, PCBs (polychlorinated biphenyls) are bioac-
cumulated and biomagnified through food chains over a wide range of trophic levels, leading to a potential
risk for high trophic level predators including humans. Further, due to their binding with lipids, a demonstrated
maternal transfer to eggs exists in fish. In this context, and since field analyses and experimental exposures
have established links between PCBs exposure and alterations in physiology and behaviour of contaminated
animals, we have examined the effects in both common sole and zebrafish species exposed through diets
to two PCBs mixtures at two doses mimicking known environmental contamination levels and congener
composition. The highest dose was equivalent to that found in molluscs flesh in the Seine Estuary and
the intermediate dose was equivalent to that found in the Loire estuary. Contaminated soles showed a
decreased locomotor activity level after 30 days (d) of contamination and altered cryptic abilities after 60
d of contamination. Contaminated zebrafish showed an increased locomotor activity level after 250 d of
contamination. The offspring obtained from this contaminated generation of zebrafish showed an increase in
swimming activity in larvae which was maintained in adults. In adults, this was associated with a decrease
in tank bottom section occupancy and with an increase in the number of zone transition which may be due
to a loosening of homebase behaviour and/or a loss of behavioural inhibition. In both cases, behavioural
phenotypes observed in PCBs groups can be related to a disruption in locomotion activity towards decreased
levels for a placid species like common sole and increased levels for a mobile species like zebrafish.
Keywords : Ecotoxicologie, ethology, PCB, Solea solea, Danio rerio, video tracking
IFREMER - Ressources Halieutiques de La Rochelle
Place Gaby Coll
17137 L’HOUMEAU

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Effets des polluants organiques persistants sur le

comportement des poissons

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Effets des polluants organiques persistants

ÉCOLE DOCTORALE Gay LUSSAC

THÈSE présentée par :

Agnès BARDONNET Directrice de recherche, INRA, Rapporteur

Effets des polluants organiques persistants

ÉCOLE DOCTORALE Gay LUSSAC

THÈSE présentée par :

Agnès BARDONNET Directrice de recherche, INRA, Rapporteur

ANR VMC SoleBEMOL

Le programme SoleBEMOL (Sole Bioaccumulation Écotoxicologie MOdeLisation) a

EC2O Citrix CNRS INSU Génération POP

1 L’éthologie : la science du comportement 3

Chapitre 2 Présentation du logiciel ODRec (Observational Data Recorder) et du plugin Heatmap

Chapitre 3 Electronic individual identification of zebrafish using RFID tags 85

Chapitre 5 Long-term food-exposure to PCB mixtures induces behavioural disruptions in zebra-

Chapitre 6 Zebrafish as a model of hyperactivity transmission to offspring after parental PCB

Références bibliographiques 189

Annexe B Poster International Flatfish Symposium 2011 216

Annexe C Fiche technique Nonatec 217

Annexe D Système de couleur Munsell 218

Annexe F Publications et actes de congrès 220

1 Comparaison des principales solutions logicielles de video tracking automatiques existantes 49

1 L’éthologie : la science du comportement

1.1 Qu’est-ce que le comportement ?

Par « comportement » j’entends tous les mouvements produits par un

Le comportement est ce que fait un animal.

Le comportement implique des interactions entre la machinerie d’un

Hall et Halliday (1998)

Les comportements sont les actions et réactions d’une personne ou d’un

Gong et Xiang (2011)

Le comportement est : l’ensemble des réponses coordonnées en interne

Levitis et al. (2009)

Individus d’autres espècess

Figure 1 – Les diﬀérentes relations comportementales qui peuvent lier un in-

1.2 La naissance de l’éthologie

D’une manière générale, l’éthologie est le nom donné à l’étude du comportement.

Le terme « éthologie » , dans le sens de « l’étude du comportement animal dans l’en-

Geoffroy Saint-Hilaire (1859)

Par la suite, la personne qui a grandement contribué à l’évolution de cette discipline

Figure 2 – Représentation schématique des quatre questions de Tinbergen et

Le caractère observable rend l’approche éthologique particulièrement intéressante. Daw-

D’un point de vue méthodologique, l’étude du comportement animal va nécessiter de

1.3 L’étude du comportement par l’analyse vidéo

Figure 3 – Représentation des mouvements ondulatoires des nageoires de

Par la suite, ce sont les techniques d’enregistrement vidéographiques d’individus libres

Altman 1974 - Méthodologie d'échantillonage Barnard 2004 - Définition du comportement

2.4 Qu’est-ce que la pollution ?

Dans un premier temps, il convient de distinguer les perturbations naturelles de l’en-

Ainsi, l’une des premières définitions, à la fois moderne et scientifique, de la pollu-

La pollution est une modification défavorable du milieu naturel qui ap-

The Environmental Pollution Panel President’s Science

Selon Ramade (2007), cette définition mélange deux concepts diﬀérents :

Constitue une pollution toute modification anthropogénique d’un éco-

Le terme « polluant » va quant à lui désigner l’agent responsable d’une pollution.