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    Bioch25 Sequencage Proteines

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    Le document décrit les étapes du séquençage des protéines, y compris la préparation de la protéine, le séquençage des chaînes polypeptidiques et la reconstitution de la séquence complète. Il contient de nombreux détails sur les méthodes utilisées à chaque étape.

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    protéines

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    sur 27

    plan

     Introduction
     Définition
     intérêt
     Détermination de la séquence en acides
    aminés
    I. Préparation de la protéine pour le
    séquençage:
    II. Séquençage des chaines polypeptidiques:
    III. Reconstitution de la séquence complète
    Introduction:
    Rôles des
    protéines

    structure

    La chaine
    Acides aminés
    polypeptidique

    séquençage
    Définition:
    La nature Le nombre L’ordre

    La stratégie de base

    Frederick Sanger 1953

    La première séquence:
    l’insuline
    Intérêt du séquençage:

    Comprendre le mécanisme d’action au


    niveau moléculaire

    Comparaison des séquences de


    protéines analogues//fonctionnement

    Clinique, diagnostique des mutations


    Détermination de la séquence en
    acides aminés :

    Préparation Séquençage Reconstitution


    de la des chaines de la structure
    protéine polypeptidi- complète
    pour le ques
    séquençage
    I. Préparation de la protéine
    pour le séquençage:
    1. Déterminer le nombre de chaines
    polypeptidiques: analyse des
    groupements terminaux

    2 types de
    Résidus N ch
    insuline terminaux polypep
    Phe et Gly en
    nombre =
    Identification des résidus Nterminaux:
     Méthode de Sanger(FDNB)
     Méthode des dansylaminoacides:
     Méthode d’Edman:
     Méthodes enzymatiques: exopeptidase ;
    aminopeptidase :

    hydrolysent séquentiellement les acides aminés


    depuis l’extrémité N-terminale d’un polypeptide
    Identification des résidus C terminaux:
     Hydrazinolyse:
    un polypeptide est traité par l’hydrazine
    anhydre à 90°C pendant 20 à 100 heures
    toutes les liaisons peptidiques sont rompues
    et tous les résidus sont transformés en
    hydrazides sauf le résidus C-terminale que
    l’on retrouve sous forme d’acide aminé libre
    façile à isoler et à identifier par
    chromatographie
    Identification des résidus C terminaux:
     Hydrazinplyse:
    un polypeptide est traité par l’hydrazine
    anhydre à90°C pendant 20 à 100 heures
    toutes les liaisons peptidiques sont rompues
    et tous les résidus sont transformés en
    hydrazides sauf le résidus C-terminale que
    l’on retrouve sous forme d’acide aminé libre
    facile à isoler et à identifier par
    chromatographie
     Méthode enzymatiques :
    carboxypeptidase
    2.Coupures des ponts disulfures:
    Réduction par le 2-mercaptoethanol:
    3. Séparation purification des chaines
    polypeptidiques

    Urée
    Milieu acide ou
    Ion
    basique,
    Guanidinium
    C saline élevée,
    SDS
    T° élevée

    chromatographie
    4. Détermination de la composition
    en acides aminés:

    Hydrolyse des
    liaisons Analyse qualitative
    peptidiques et quantitative;
    chromatographie
    Hydrolyse des liaisons peptidiques:

    Hcl 6M Trp
    Hydrolyse Hydrolyse
    100-120°C Hydrolyse
    Gln Glu
    acide base enzymatique
    24H Asn Asp
    NaOH
    hydrolyse 2-4M Cys Ser
    basique 100°C Thr Arg
    4-8H
    un mélange
    Hydrolyse déterminati de
    enzymatiqu on de: peptidase;
    e Trp Gln pronase[1]
    (streptomyces
    Asn griséus)
    II. séquençage des chaines
    polypeptidiques:

    1. Réaction d’hydrolyse spécifique:

    2. Séparation purification des fragments:

    3. Détermination de la séquence en AA des


    fragments:
     Réaction d’hydrolyse spécifique:

    Bromure de les fragments <40-


    cyanogène: 100AA ayant
    après Met

    N-
    Bromosuccinimide
    HOBr:après Tyr
    hydrolysésTryen petits
    fragments

    HydroxylamineNH2
    OH: hydrolyse les
    liaisons Asn-Gly
    hydrolyse spécifique
    chimique,enz
     Réaction d’hydrolyse spécifique
     Séparation purification des
    fragments:

    Dénaturant :
    Urée , SDS HPLC
    Support de Phase inverse
    CHromato
    Détermination de la séquence en AA des
    fragments:

    les petits
    fragments

    cycles
    répétés
    (Edman)

    dispositif
    automatiq
    Reconstitution de la séquence
    complète :

    Mise en ordre des fragments


    LABORATOIRE DE BIOCHIMIE
    CHU CNE

    Dr. BENDJAZIA
     MCB. ALLOUI. AS
    2016

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