INSTITUIÇÃO DE ENSINO SUPERIOR DE CACOAL – FANORTE

CURSO SUPERIOR DE BIOMEDICINA

TÂNIA MARA MARTINS TARIFA

RELATÓRIO DO ESTÁGIO SUPERVISIONADO III

CACOAL – RO
2020
 TÂNIA MARA MARTINS TARIFA

RELATÓRIO DO ESTÁGIO SUPERVISIONADO III

Relatório de estágio curricular

supervisionado apresentado a Instituição de
Ensino Superior de Cacoal – FANORTE,
como requisito de avaliação para obtenção
do título em Bacharel em Biomedicina.

Local do estágio: Instituição de Ensino

Superior-FANORTE.

Supervisor no local do estágio: Prof.Me. Maria

Laís Devólio.

Coordenador de Estágio: Prof.

Dr. Vinicius Sato.

CACOAL – RO
2020
 TÂNIA MARA MARTINS TARIFA

RELATÓRIO DO ESTÁGIO SUPERVISIONADO III

Relatório do Estágio Curricular Supervisionado II apresentado em de

de a Coordenação de Biomedicina da Instituição de
Ensino Superior de Cacoal – FANORTE, como requisito parcial para obtenção
do título de Bacharel em Biomedicina e aprovado em sua forma final.

Prof. Dr. Vinicius Antonio Hiroaki Sato

Coordenador do Curso de Biomedicina

BANCA EXAMINADORA

Nome e Titulação
Instituição de Ensino Superior de Cacoal - FANORTE

Nome e Titulação
Instituição de Ensino Superior de Cacoal - FANORTE

Nome e Titulação
Instituição de Ensino Superior de Cacoal - FANORTE

CACOAL – RO
2020
AGRADECIMENTOS
Epígrafe
 RESUMO

Palavras-chave:
 ABSTRACT

Keywords:
LISTA DE ABEVIATURAS
 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Nenhuma entrada de índice de ilustrações foi encontrada.

 LISTA DE TABELAS

Nenhuma entrada de índice de ilustrações foi encontrada.

 13

1 INTRODUÇÃO
A microbiologia é um campo da biologia que tem como principal objetivo estudar
e compreender como se comportam e funcionam microrganismos como fungos,
bactérias e vírus. Para que isso seja possível, os pesquisadores da área
geralmente precisam fazer com que esses organismos se desenvolvam e
cresçam dentro de um ambiente seguro e totalmente controlável.

1.1 OBJETIVOS GERAIS

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 14

2 SETOR DA MICROBIOLOGIA

O setor de microbiologia realiza exames como cultura de urina, orofaringe e outras

secreções. Esses exames balizam o diagnóstico de doenças infecciosas
relacionadas, por exemplo, à atividade bacteriana nociva no organismo.

2.1 MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura são insumos preparados em laboratórios que fornecem os

nutrientes para o crescimento e desenvolvimento de microrganismos (como
bactérias e fungos) fora do seu habitat natural. Existe uma variedade enorme
destes meios e são utilizados para análises laboratoriais e estudos científicos em
diversas áreas, principalmente em alimentos, água, cosméticos e microbiologia
clínica.

Diferentes microrganismos possuem diferentes necessidades, por isso o meio de

cultura é adaptado para satisfazer essas necessidades, utilizando nutrientes
específicos dependendo do microrganismo de interesse. Além desses fatores,
deve ser levado em conta o pH e a quantidade de oxigênio ou mesmo a sua
ausência.

O crescimento dos micro-organismos nos diferentes meios de cultura utilizados

fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer
o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano
esperado para cada material.

2.1.1 MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO

2.1.2 ÁGAR MACCONKEY (MC)

Meio seletivo destinado para o crescimento de bactérias Gram-negativo e

diferencial para a utilização de fermentadores de lactose. Tem em seu composto
substâncias que deve inibir o crescimento de micro-organismos Gram-positivo.

O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos

especialmente enterococos e estafilococos. A concentração de sais de bile é
relativamente baixa em comparação com outros meios, por isso não é tão seletivo
para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS. Como exceção,
eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus.
 15

PROCEDIMENTOS

• Suspender 51,5 gramas de meio ágar base para 1000 ml de água destilada;

• Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

• Aquecer sob agitação até fundir o ágar completamente;

• Esterilizar em autoclave 15 minutos á 121 °C;

• Colocar fita de auto-clave;

• Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis;

• Deixar em temperatura ambiente até resfriar;

• Fazer controle de qualidade: Incubar as placas de Petri a 37 °C por 24 à 48

horas ( ideal para crescimento de bactérias). Se houver crescimento houve
contaminação, jogar a placa fora;

• Se não houver contaminação, embalar as placas com plástico PVC

transparente e guardar em geladeira;

INOCULAÇÃO

• Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas;

• Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas;

INTERPRETAÇÃO

• Cor original do meio: rosa avermelhado. .

• Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose. Crescimento de bacilos

Gram negativos.

• Colônias incolores: não fermentadoras de lactose. Não há crescimento de

cocos Gram positivos.

• Lactose positiva – coloração avermelhada;

• Lactose negativa – coloração inalterada;

 16
Figura 1: Ágar Macconkey

Fonte: https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn%3AANd9GcT-
qj6UwFNtQvdmgwF5JirwAdLwDKW0vDxRiKEuoV7x0-UWe7yQ

2.1.2 ÁGAR SANGUE (AS)

Meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos
Gram-negativo e Gram-positivo, além de fungos filamentosos (bolores) e
leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos. Usado para
o isolamento de microrganismos não fastidiosos.

O meio de Ágar sangue, usando uma base rica com utilização de sangue, oferece
ótimas condições de crescimento a maioria dos microrganismos.

A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de hemólise

nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado na
prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.).

PROCEDIMENTOS

• Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho: 5 ‫ ـ‬ml para cada 100 ml de meio

base;

• Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

• Esterilizar em autoclave;

• Esfriar a base à +/- 50ºC;

• Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de

 17
base;

• Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas;

• Distribuir em placas de Petri de 90 mm de diâmetro;

• Deixar em temperatura ambiente até resfriar;

• Fazer controle de qualidade: Incubar as placas de Petri a 37 °C por 24 à 48

horas ( ideal para crescimento de bactérias). Se houver crescimento houve
contaminação, jogar a placa fora;

• Se não houver contaminação, embalar as placas com plástico PVC

transparente e guardar em geladeira;

INOCULAÇÃO

• Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento;

• No final da semeadura, picar o meio com a alça para verificar hemólise em

profundidade;

• Incubar à 35ºC 24 horas;

INTERPRETAÇÃO

• Cor original do meio: vermelho.

• Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias

semeadas (lise total dos eritrócitos).

• Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas

(lise parcial dos eritrócitos).

• Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias

(eritrócitos permanecem íntegros).

RECOMENDAÇÕES

Não usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor
muito escura, dificultando o estudo de hemólise;

Não usar sangue humano, pois alguns microrganismos não apresentam hemólise;

Não adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemácias rompem-se,

dificultando o estude de hemólise; Por ser um meio rico, o crescimento a partir de
materiais biológicos em geral costuma ser abundante, sempre que necessário,
isolar a colônia em estudo para os procedimentos de identificação, para não correr
 18
o risco de trabalhar com cepas misturadas.

Figura 2 : Àgar Sangue

Fonte: https://www.labnetwork.com.br/wordpress/wp-
content/uploads/2015/08/placadepetri_freerange.jpg

2.1.3 ÁGAR CHOCOLATE (AC)

Meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias
aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao
crescimento dos microaerófilos. O ágar chocolate é um meio enriquecido e não
seletivo para cultivo de bactérias sensíveis e exigentes. Pode-se observar halos
esverdeados com colônias alfa-hemolíticas.

À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em

temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e
hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos
exigentes.

Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria

spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.

PRINCÍPIO

O meio contém nutrientes nitrogenados na forma de caseína e peptonas de carne,

tampão de fosfato para manter o pH e amido de milho, que neutraliza os ácidos
graxos tóxicos que podem estar presente no agar. A hemoglobina fornece fator X
(hemin) e o aquecimento libera o fator V (nicotinamida adenina dinucleotide NAD)
para o desenvolvimento das espécies de Haemophilus spp.
 19
O enriquecimento fornece uma maior concentração dos fatores V e X, além de
vitaminas, aminoácidos, co-enzimas, dextrose, íon férrico e outros fatores que
melhoram a recuperação de microrganimos fastidiosos.

PROCEDIMENTOS

• Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

• Esterilizar em autoclave;

• Esfriar a base à temperatura de aproximadamente 80ºC;

• Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 mL de base;

• Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias e o meio apresentar uma

cor castanho escuro (chocolate);

• Distribuir em placas de Petri de 90 mm de diâmetro.

• Fazer controle de qualidade: Incubar as placas de Petri a 37 °C por 24 à 48

horas ( ideal para crescimento de bactérias). Se houver crescimento houve
contaminação, jogar a placa fora;

• Se não houver contaminação, embalar as placas com plástico PVC

transparente e guardar em geladeira;

INOCULAÇÃO

• Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento;

• Incubar a 35ºC por 24 horas.

INTERPRETAÇÃO

• Cor original do meio: castanho escuro (chocolate).

• Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo

de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp.
• Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo
de Haemophilus spp.

Figura 3 : Ágar Chocolate

 20

Fonte: https://lh3.ggpht.com/-
ZvGxBYqSkJ8/Tr7EWhEO0wI/AAAAAAAAEBg/k3eRymnK3gE/Haemophilus%252520sp.culture%
252520on%252520chocolate%252520agar%25255B1%25255D.jpg?imgmax=800

2.1.4 ÁGAR SALMONELA-SHIGELLA (SS)

O Agar Salmonella Shigella (SS) é um meio de cultura altamente seletivo para o

isolamento de Salmonella spp. e algumas espécies de Shigella , em amostras de
fezes, alimentos e água, é diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea)
e produção de H2S (coloração negra).

Os microrganismos gram-positivos e os coliformes são inibidos por componentes

(sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram
positivos. A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o
microrganismo é lactose positiva (bactérias que fermentam a lactose produzem
ácido que na presença do indicador vermelho neutro resultando na formação de
colônias de cor rosa), e bactérias que não fermentam a lactose formam colônias
transparentes. Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S
evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.

PROCEDIMENTOS

• Suspender 60 gramas do meio em 1000 ml de água destilada;

• Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

• Aquecer o meio até fundir o ágar;

• Não autoclavar, pois a alta temperatura degrada o açúcar contido no meio;

 21
• Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis;

• Deixar em temperatura ambiente até resfriar;

• Fazer controle de qualidade: Incubar as placas de Petri a 37 °C por 24 à 48

horas ( ideal para crescimento de bactérias). Se houver crescimento houve
contaminação, jogar a placa fora;

• Se não houver contaminação, embalar as placas com plástico PVC

transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C.

INOCULAÇÃO

• Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas;

• Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas;

INTERPRETAÇÃO

• Cor original do meio: vermelho alaranjado.

• Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de

Salmonella.

• Colônias incolores: suspeita de Shigella spp.

• Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella

spp.

• As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores.

• As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.

Figura 4 : Ágar Salmonela-Shigella, suspeita de Salmonella.

 22

Fonte: https://encrypted-
tbn0.gstatic.com/images?q=tbn%3AANd9GcTVRwAfzcbeVHN8CehvDi2UPwnJyW-
GRygH7hPgrldaNEKTplXd

2.1.5 ÁGAR CLED- CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT

Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras

urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. Isolar e
quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.

Meio de cultura nutritivo, não seletivo e diferencial destinado a cultura de urina.

Este meio de cultura promove o crescimento de agentes patogênicos e
contaminantes urinários e reduz a formação de swarming (véu) de espécies de
Proteus spp., devido a baixa concentração de eletrólitos.

PROCEDIMENTOS

• Suspenda 36 g do meio em um litro de água purificada.

• Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

• Aqueça com agitação frequente e deixe ferver por um minuto para dissolver
completamente o meio;

• Esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos;

• Resfriar à +/- 50°C e distribuir de 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm

estéreis;

• Deixar em temperatura ambiente até resfriar.

• Fazer controle de qualidade: Incubar as placas de Petri a 37 °C por 24 à 48

horas ( ideal para crescimento de bactérias). Se houver crescimento houve
 23
contaminação, jogar a placa fora;

• Se não houver contaminação, embalar as placas com plástico PVC

transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C;

INOCULAÇÃO

• Utilizar técnica de semeadura quantitativa.

INTERPRETAÇÃO

• Cor original do meio: azul claro.

• Colônias lactose positiva: cor amarela.

• Colônias lactose negativa: cor azul.

Figura 5 : Ágar Cled

Fonte:https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fmicroimunoliga.blogspot.c
om%2F2018%2F10%2Festagio-em-microbiologia-clinica-

2.1.6 ÁGAR MUELLER HINTON (MH)

Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de
crescimento para as principais bactérias. Meio utilizado para a realização do teste
de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em
disco e E-test para enterobactérias, não fermentadores, Staphylococcus,
Enterococcus sp. A finalidade do método consiste em testar se a bactéria em
análise é sensivel a determinado antibiótico.

PROCEDIMENTOS
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• Suspender 36,1 gramas de meio para 1000 ml de água destilada;

• Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

• Acertar o pH (7,2 – 7,4);

• Retirar da autoclave e medir novamente o pH;

• Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm;.

• Deixar esfriar em temperatura ambiente;

• Fazer controle de qualidade: Incubar as placas de Petri a 37 °C por 24 à 48

horas ( ideal para crescimento de bactérias). Se houver crescimento houve
contaminação, jogar a placa fora;

• Se não houver contaminação, embalar as placas com plástico PVC

transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C;

INOCULAÇÃO

• Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo

TSB na escala 0,5 Mac Farland;

• Embeber o “swab” na suspensão, comprimí-lo na parede do tubo (para

eliminar o excesso) e semear na placa;

• Acrescentar os discos a serem testados;

• Incubar a placa de acordo com instruções do NCCLS para a bactéria a ser

testada.

INTERPRETAÇÃO

• Cor original do meio: amarelo palha.

• A zona do diâmetro é particular para cada droga e organismo, sendo
comparado com diâmetros padronizados pelo NCCLS, que determina cada
microrganismo sendo sensível, intermediário ou resistente.

Figura 6: Antibiograma
 25

Fonte:
https://2.bp.blogspot.com/IeZrGhDdbeY/WErp3kcFZRI/AAAAAAAAPXY/FhZXsrMDCR894
jCwqN8_MGZ5Z9FUN330ACLcB/s1600/Teste%2Bde%2BSensibilidade%2Baos%2BAnti
microbianos.png

2.1.7 TÉCNICAS DE SEMEADURA

As técnicas de semeadura em laboratório de microbiologia consistem justamente
em métodos pelo qual se transfere pequenas quantidades de microrganismos para
um meio de cultura em que o material a ser analisado será semeado, ou seja: é
preparado um ambiente perfeito para que determinado microrganismo presente em
uma amostra de material cresça e se desenvolva para análise posterior.

As técnicas de semeadura empregadas em uma análise mudam de acordo com o

tipo do meio de cultura e microrganismo que será estudado.

Entre as técnicas de semeadura em microbiologia mais utilizadas, podemos citar

a de esgotamento e a quantitativa.

Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, são utilizadas
as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não
contaminação de materiais, meios e culturas.

2.1.8 SEMEADURAS EM MEIOS SÓLIDOS EM TUBOS

Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag,

partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do
meio).

Objetivo: obtenção de intensa massa de microrganismos.

 26

Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha

reta, com cuidado de não ferir o Agar, partindo da base para a
extremidade do bizel (superfície inclinada do meio).

Objetivo: obtenção de pequena massa de microorganismos.

Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar.

Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou
até o fundo deste.

Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em

algumas técnicas.

Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no

centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até
2/3 do tubo ou até o fundo deste.

Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em

algumas técnicas.

2.1.9 SEMEADURA POR ESGOTAMENTO

Na semeadura por esgotamento a suspensão bacteriana (que é o líquido com o

microrganismo) é espalhada de forma aleatória em toda a placa, até que todo o
material seja utilizado. Esta técnica é utilizada para obtenção de colônias isoladas,
sem recarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do
material.
 27
Figura 7: Técnica semeadura por esgotamento

Fonte:
https://encryptedtbn0.gstatic.com/images?q=tbn%3AANd9GcSxQd1j8WxjgLRfpcurLstlA1In5O7pr
4DUTF8aqdvNnIDCje5z

Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma

alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça
bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes
e a inoculação pode ser feita de 2 tipos:
• 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-
zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a
metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante.
• 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar
2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo
quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.

Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não

tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as
colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar
a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria.

2.1.10 SEMEADURA QUANTITATIVA

Esta técnica é a da alça calibrada estéril, na qual este acessório é mergulhado na

suspensão do microrganismo e, depois, utilizado para espalhar a amostra na placa
de cultura. Há, ainda, a aplicação das técnicas de semeadura por meio da
incubação — em que os meios de cultura com o material são colocados em
 28
uma estufa para cultura com temperatura controlada.

O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de

material e a contagem do número de UFC (unidades formadoras de colônias)
obtidas após a incubação.
• Homogeneizar a amostra de urina (Primeira micção - jato médio), ou
qualquer outra amostra líquida que se queira quantificar os micro-
organismos. Não centrifugar.

• Imergir a alça calibrada de 0,001 mL (1 µL) na urina de forma vertical, ou

alça de 0,01mL (10 µL) em outras amostras. Observar se preencheu todo
o espaço do aro com urina. Observar se não ficou bolhas no líquido que
preenche o aro.

• Semear primeiro em placa de ágar CLED (não seletivo), imergir novamente

a alça na urina e em seguida semear a placa de ágar MacConkey (seletivo)
/ Em caso de urina de gestante adicionar uma placa de ágar Sangue e
semear primeiro este meio, não esquecer de fazer as picadas com alça
para evidenciar hemólise.

INTERPRETAÇÃO
• Alça de 1 microlitro - 1 colônia = 1.000 ou 103 UFC/mL.
• Alça de 10 microlitros - 1 colônia = 100 ou 102 UFC/mL.

Em sua execução a alça bacteriológica é introduzida em uma amostra de urina

bem homogeneizada, fazendo-se movimentos para baixo e para cima no sentido
vertical. A alça carregada é então utilizada para inocular cada meio de cultura,
fazendo-se, inicialmente, uma linha reta no centro da placa e completando-se o
espalhamento com uma série de passagens em um ângulo de 90º, através da linha
original. Importante item de controle de qualidade é utilizar alças calibradas
periodicamente aferidas ou, quando possível, alças descartáveis.

Figura 8: Técnica quantitativa

 29

Fonte:https://encrypted-
tbn0.gstatic.com/images?q=tbn%3AANd9GcRJ1XascBrKx_v_2r3oau0HSlETVfEMdklOfprBs3LO2
mDV7W9o

2.1.11 FLAMBAGEM DE ALÇA BACTERIOLÓGICA

A flambagem da alça bacteriológica durante a manipulação do material biológico

ou na transferência de massa bacteriana (raspado de colônias) deve ser feita
através de chama, (bico de bulsen) que deve estar entre o manipulador e a alça.
Recomenda-se esgotar a alça num frasco contendo álcool a 95% e areia. Quando
se trabalha com Mycobacterium tuberculosis é recomendável o emprego de fenol
a 0,5% ou hipoclorito a 0,5% e areia, flambando-se a alça em seguida.

2.1.12 COLORAÇÃO DE GRAM

A coloração de Gram é usada para classificar bactérias com base no tamanho,

morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratório de
microbiologia clínica é um teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes
infecciosos, sendo também utilizado para avaliar a qualidade da amostra clínica
analisada.

As interpretações dos esfregaços corados pelo Gram envolvem considerações

relacionadas com as características da coloração, tamanho, forma e agrupamento
das células. Estas características podem ser influenciadas por vários fatores,
incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubação e
a presença de substâncias inibidoras.

Não se pode deixar de destacar que a coloração de Gram somente será um

recurso rápido e útil quando for corretamente realizada (do ponto de vista técnico)
e interpretada por profissionais experientes.
 30
COLORAÇÃO

• Após feito o esfregaço iniciar a coloração;

• Cobrir a área com a solução de cristal-violeta por cerca de um minuto.

• Decantar o cristal-violeta e lavar suavemente com a própria solução de

iodo ou água da torneira. Lavagem excessiva nesta etapa pode causar
a retirada do cristal violeta das células Gram-positivas.

• Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de um

minuto.

• Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona (1:1), até que o

solvente escorra incolor. Alternar com água corrente (jato fraco). O
tempo usualmente utilizado nesta etapa é de cerca de 10 segundos.
Lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta
das células Gram-positivas, assim como, a pouca descoloração pode
resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma
tonalidade azulada nas bactérias Gram-negativas.

• Cobrir o esfregaço com a solução de safranina (ou Fucsina básica 0.1%

a 0.2%), por, cerca de 30 segundos.

• Lavar com água corrente.

• Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um

papel de filtro limpo;

• Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;

• Leia em objetiva de imersão (100 X).

As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração

violeta enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo,
portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina) e se apresentam róseas.

Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve

nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a
coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente
realizada e interpretada.
 31

Figura 9: Método de coloração de gram.

Fonte: https://3.bp.blogspot.com/-NZhfHKIprAw/V35r0TeKWWI/AAAAAAAALrg/tU9UVQbl0-
QDPfsIZT_Kl_IYyx7u1WOowCLcB/s1600/Colora%25C3%25A7%25C3%25A3o%2Bde%2BGram.
png

2.1.13 MEIOS PARA IDENTIFICAÇÃO

2.1.14 TESTE DA DNASE

O teste de DNase é usado para detectar a degradação do Ácido
Desoxirribonucleico (DNA), contido no meio de cultura, por bactérias que possuem
uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease, responsável pela reação. A
enzima quebra o DNA em subunidades compostas de nucleotídeos.

O teste é útil para diferenciar Serratia do gênero Enterobacter; Staphylococcus

aureus de estafilococos coagulase – negativa e Moraxella catarrhalis de espécies
de Neisseria.

Ao utilizarmos o meio de DNase Test Agar, devemos acrescentar uma quantidade

de HCl a 1N para revelar a atividade enzimática. Uma zona clara em volta da
colônia indica reação positiva. Caso não haja atividade dessa enzima o HCL
reagirá com o ácido nucléico intacto, formando um precipitado.

Este teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, (DNAse test
agar) obtido comercialmente.

• Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%; o

 32
meio adquire uma coloração azul intensa;

• Incubar a 35°C por 24 horas;

• Uma coloração rósea característica ao redor das colônias produtoras de

DNAse indica a positividade da prova. Mod V - 5 O meio adicionado com
corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da
amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando
que se retorne à placa original onde nem sempre as colônias estão bem
isoladas.

Figura 10: Placa ágar dnase com azul toluidina

Fonte: https://plastlabor.com.br/wp-content/uploads/2019/11/PL001070-1-800x650.jpg

2.1.15 TESTE DA COAGULASE EM LÂMINA

A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator
aglutinante) “clumping factor” na superfície da parede celular, que reage com o
fibrinogênio do plasma causando a coagulação do mesmo.

• Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina;

• Emulsionar uma colônia isolada a ser testada;

• Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plástico ou

madeira;

• Observar se há aglutinação em 10 segundos;

• Não se pode executar este teste a partir de um ágar com grande

concentração de sal como ágar manito;
 33

2.1.16 TESTE DA COAGULASE EM TUBO

É utilizado para distinguir espécies patogênicas de Staphylococcus de espécies de

espécies não patogênicas, sendo um bom indicador da patogenicidade S.aureus.

Este teste baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator
plasmático formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio formando a
fibrina. O teste é melhor efetuado se:

• Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia
suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma;

• Incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria;

• A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de

ensaio a 90 graus da vertical. Um método alternativo é a emulsificação
desta mesma colônia suspeita em um 0,5 plasma e incubado da mesma
forma. Qualquer coágulo indica uma prova positiva, porém não confundir
com precipitados ou floculação. O melhor plasma a ser usado é o de coelho
com EDTA, não devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de
sangue.

• A ausência de coagulação após 24 horas de incubação é uma prova

negativa.
Figura 11: Teste coagulase

Fonte:
https://slideplayer.com.br/slide/5975188/19/images/12/Identifica%C3%A7%C3%A3o+Prova+da+c
oagulase+A+%E2%80%93+Em+tubo.jpg
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REFERÊNCIAS

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content/uploads/2019/06/BIPLACA-CLED.pdf . Acesso em: 13-03-2020;

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http://www.tiraojaleco.com.br/2016/12/teste-de-sensibilidade-aos.html. Acesso em : 13-
03-2020;

Técnicas de semeadura. Disponível em:

https://microimunoliga.blogspot.com/2016/08/pratica-6.html. Acesso em: 14-03-2020;

Oplustil, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Procedimentos Básicos
em Microbiologia Clínica, 3ª Ed. Sarvier, São Paulo, SP, 2010.

STAINIER, R.Y.; DOUDOROFF, M. & ADELBERG, E, Metodos de coloraciones, In:

Microbiologia. 2º ed.Madrid,1977, Aguilar S. de ediciones.

GRISHT, N.R., 1995. Manual de Segurança para Laboratório. Eitora Santos , São Paulo,
133p

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ed. Washington D.C., 1985, American Society for Microbiology

Toledo. M.R.F., Fontes, C.F. and Trabulsi, L.R. MILi: um meio para a realização dos
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Microbiologia Clínica, Sarvier, São Paulo, 2000.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS