Ana NGarcia

Instituto de Biologia Molecular
Variantes genéticas associadas à

Miocardiopatia Hipertrófica -
Interpretação do seu significado clínico
através de revisão bibliográfica e
ferramentas computacionais
Ana Beatriz Nogueira Garcia
Junho’2018
Instituto de Biologia Molecular
Variantes genéticas associadas à

Miocardiopatia Hipertrófica -
Interpretação do seu significado clínico
através de revisão bibliográfica e
ferramentas computacionais
Ana Beatriz Nogueira Garcia
Orientado por:
Prof.ª Doutora Maria do Carmo Fonseca
Junho’2018 2
Resumo
A Miocardiopatia Hipertrófica é definida por um aumento da espessura do ventrículo

esquerdo, não explicada por alterações da carga. Trata-se da doença cardiovascular
hereditária mais comum, bem como a principal causa de morte súbita cardíaca nos
jovens e atletas. Com o advento das tecnologias de sequenciação genética de nova
geração tem sido possível identificar elevado número de variantes genéticas,
possivelmente associadas à doença. O presente trabalho teve como objetivo rever em
termos de significado clínico (efeito benigno ou patogénico) algumas destas variantes.
A partir da base de dados “ClinVar”, foram selecionadas variantes de genes do

sarcómero previamente classificadas como patogénicas (89) ou benignas (111).
Relativamente a estas foi realizada uma revisão da literatura – a partir da qual lhes foi
atribuída uma classificação segundo as linhas orientadoras propostas pelo “American
College of Medical Genetics and Genomics” - e ainda efectuada uma análise por
diferentes ferramentas computacionais de significado clínico.
Com base na revisão desenvolvida, apenas foi possível atribuir significado clínico a
30% das variantes incluídas no estudo. As restantes foram classificadas como sendo de
significado incerto. As ferramentas computacionais apresentam sensibilidade e
especificidade médias na ordem dos 60%, apresentando assim considerável taxa de
falsos negativos e falsos positivos.
Os resultados obtidos demonstram que a interpretação clínica das variantes genéticas

identificadas por sequenciação constitui um desafio, sendo necessária a realização de
mais estudos, particularmente familiares e funcionais, que contribuam para a sua melhor
caracterização. As ferramentas computacionais podem constituir uma mais-valia na
selecção de variantes a estudar, sobretudo quando apresentam elevada sensibilidade e
especificidade.
Palavras-Chave: Miocardiopatia Hipertrófica; Sequenciação de Nova Geração;

Variantes genéticas de significado incerto; Ferramentas computacionais de predição
i
Abstract
Hypertrophic cardiomyopathy is defined by the presence of increased left ventricular

wall thickness that is not solely explained by abnormal loading conditions. It is the most
common familial genetic disease of the heart, as well as the most common cause of
sudden cardiac death in young people and athletes. The advent of next-generation
sequencing (NGS) technologies has allowed the identification of a large number of
genetic variants, possibly associated with the disease. The aim of this study was to
review the clinical significance (benign or pathogenic effect) of some of these variants.
Sarcomere genetic variants previously associated with HCM and classified as

pathogenic (89) or benign (111) were selected from the “ClinVar” database. A manual
curation of the literature, followed by application of “American College of Medical
Genetic and Genomics” guidelines, and computational predictive programs analyses
was performed.
Based on the review developed, it was only possible to attribute clinical significance to
30% of the variants included in the study. The remainders were classified as of
uncertain significance. Computational tools present average sensitivity and specificity
in the order of 60%, thus presenting a considerable rate of false negatives and false
positives.
The results obtained in this study show that determining the clinical validity of NGS
results is challenging. Additional studies are needed, namely functional and familial co-
segregation studies. Computational tools are an added value in the process, especially
when they have high sensitivity and specificity.
Key Words: Hypertrophic Cardiomyopathy; Next-generation Sequencing; Genetic

variants of uncertain significance; Computational prediction tools
ii
“ O Trabalho Final exprime a opinião do autor e não da FML”
iii
Abreviaturas
ACGS – “Association for Clinical Genetic Science”
ACMG – “American College of Medical Genetics and Genomics”
ACTC1 – Alfa-actina cardíaca
ACTN2 – Alfa-actinina 2
B – Benign
ExAC – “Exome Agregation Consortium”
ILK – Cinase ligada à integrina
JPH2 – Junctofilina
LMNA – Laminina A/C
M – Moderate
MCH – Miocardiopatia Hipertrófica
MYBPC3 – Proteína C que liga a miosina
MYH6 – Cadeia pesada da miosina 6
MYH7 – Isoforma beta da cadeia pesada da miosina
MYL2 – Cadeia leve reguladora da miosina
MYL3 – Cadeia leve essencial da miosina
MYLK2 – Cinase da cadeia leve da miosina 2
MYOZ2 – Miosenina 2
NEXN – Nexilina
NGS – Next Generation Sequencing
P - Pathogenic
P’ - Supporting
iv
PDLIM3 – Domínio PDZ e LIM 3
PRKAG2 – Subunidade-gama da AMP cinase 2
S - Strong
TCAP – Teletonina
TNNC1 – Troponina C cardíaca
TNNI3 – Troponina I cardíaca
TNNT2 – Troponina T cardíaca
TPM1 – Alfa-tropomiosina
TTN – Titina
v
Índice
Introdução ......................................................................................................................... 1
Material e Métodos ........................................................................................................... 4
Seleção de variantes associadas à MCH ....................................................................... 4
Revisão da Literatura .................................................................................................... 4
Aplicação dos critérios de classificação propostos pelo ACMG .................................. 4
Análise in silico............................................................................................................. 4
Resultados......................................................................................................................... 6
Classificação de acordo com as linhas orientadoras do ACMG ................................... 6
Variantes Patogénicas ............................................................................................... 9
Variantes Benignas .................................................................................................. 15
Análise in silico........................................................................................................... 22
Discussão ........................................................................................................................ 24
Agradecimentos .............................................................................................................. 28
Bibliografia ..................................................................................................................... 29
Anexos ............................................................................................................................ 51
vi
Introdução
A MCH é a doença cardiovascular hereditária mais comum e afeta indivíduos de

[1]
diferentes etnias, raças e culturas, em virtualmente todo o mundo. A sua prevalência
foi inicialmente estimada em 1 para 500 na população geral, tendo mais recentemente
sido sugerida uma prevalência de 1 para
200. [2]
Caracteriza-se por um aumento da espessura

do ventrículo esquerdo, na ausência de outra
doença cardiovascular capaz de produzir
similar magnitude de hipertrofia, como
sendo Hipertensão Arterial ou Doença
Valvular Primária (Figura 1).[3] Trata-se de
uma doença extremamente complexa
devido à heterogeneidade da apresentação
clínica, diferentes fenótipos, um grande
número de mutações causais e um largo
Figura 1. Ecocardiograma de Doente com
espectro de complicações associadas.[4, 5] MCH. Este ecocardiograma evidencia
hipertrofia assimétrica do septo
A doença é causada por mutações nos genes interventricular. Adaptado de HARRISON’S
Principles of Internal Medicine, 19th Edition (2015)
codificadores dos componentes do
sarcómero e transmitida de forma autossómica dominante. [4, 6–10]
Os genes do
sarcómero mais frequentemente mutados são os seguintes: MYH7, MYBPC3, TNNT2,
[11]
TNNI3, TPM1, MYL2, MYL3 e ACTC1. Contudo, cerca de 50% dos indivíduos com
diagnóstico clínico de MCH não tem mutação causal identificada. [12, 13]
A maioria dos doentes são assintomáticos, podendo, contudo, apresentar manifestações

clínicas da MCH que incluem dispneia, dor torácica, palpitações e síncope, que estão
relacionadas com o desenvolvimento de disfunção diastólica, obstrução do trato de saída
do ventrículo esquerdo, isquémia, fibrilhação auricular e alterações da microcirculação
[4, 14, 15]
coronária. Está associada a um aumento do risco de morte súbita, insuficiência
cardíaca e eventos trombo-embólicos, constituindo a principal causa de morte súbita
cardíaca nos jovens e atletas.[16–18]
1
Os achados físicos encontrados prendem-se com o movimento sistólico anterior dos
folhetos da válvula mitral que conduz à obstrução do trato de saída do ventrículo
esquerdo e compreendem pulso arterial com dois picos sistólicos, sopro de ejecção
sistólico que aumenta de intensidade com manobras que reduzem o volume ventricular e
sinais de insuficiência mitral quando esta está presente.[4]
O eletrocardiograma pode ser normal, mas na maioria dos doentes evidencia hipertrofia
ventricular esquerda, alterações do segmento ST, da onda T e/ou ondas Q patológicas.
[19][20]
O diagnóstico é estabelecido pela identificação de um aumento da espessura do

miocárdio do ventrículo esquerdo – superior ou igual a 15 mm em adultos ou superior a
dois desvios padrão da média prevista em crianças – através de exame imagiológico
(ecocardiograma, ressonância magnética ou tomografia computorizada). [4]
Recomenda-se o aconselhamento genético a todos os indivíduos com a doença e, se

possível, um rastreio familiar em cascata. A identificação de uma mutação causal
facilita o diagnóstico pré-sintomático dos membros da família, bem como a vigilância
clínica e o aconselhamento reprodutivo. [21]
A NGS permite determinar num único ensaio a sequência de moléculas de ácido

desoxirribonucleico com mais de 1 milhão de pares de bases. Esta tecnologia veio
revolucionar a investigação na área da genética bem como a sua aplicação em contexto
clínico, uma vez que permite a análise de múltiplos genes (e no limite a totalidade do
genoma) com uma precisão semelhante aos métodos de sequenciação convencionais,
acrescentando o benefício da economia de custos e tempo. [22, 23]
A MCH, devido ao elevado número de genes e mutações associadas, foi uma das
entidades clínicas cuja investigação mais beneficiou com a introdução das novas
tecnologias de sequenciação. [24, 25]
Contudo, analisar um grande número de genes conduz à identificação de muitas

variantes genéticas raras de significado incerto, que constituem um desafio no momento
da sua interpretação clínica. [25–27]
O presente trabalho teve como objetivo rever a classificação em termos de significado

clínico (efeito benigno ou patogénico) de variantes genéticas associadas à MCH,
2
combinando para esse efeito uma análise da literatura publicada com uma análise
computacional utilizando ferramentas de previsão. Com os resultados obtidos pretende-
se contribuir para o complexo processo que decorre entre a identificação laboratorial de
uma variante genética e a compreensão das suas repercussões clínicas a nível do
indivíduo que dela é portador.
3
Material e Métodos
Seleção de variantes associadas à MCH
As variantes a analisar foram selecionadas a partir da “ClinVar”

[28]
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) , uma base de dados de variantes genéticas
para a qual contribuem diversos laboratórios, reportando variantes identificadas em
indivíduos estudados e sua relação com patologia. A aplicação de filtros pré-definidos
nesta base permitiu constituir dois grupos de variantes associadas à MCH: patogénicas e
benignas, assim previamente classificadas por múltiplos autores ou por um painel de
especialistas e sem conflitos na interpretação. No primeiro grupo foram incluídas
variantes do tipo “missense” e “splice site” localizadas em 8 genes sarcoméricos
frequentemente associados à MCH. No segundo grupo foram consideradas variantes do
tipo “missense”, “splice site”, “intronic” e “5’-UTR” localizadas em 19 genes do
sarcómero.
Revisão da Literatura
Todos os artigos publicados na base “PubMed”

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) com referência a cada uma das variantes
selecionadas foram analisados, no sentido de recolher toda a informação pertinente para
a sua classificação de acordo com as linhas orientadoras publicadas pelo ACMG em
2015.[29] Nomeadamente, foram tidos em conta estudos funcionais in vivo/in vitro,
estudos de co-segregação familiar, descrição de variantes de novo.
Aplicação dos critérios de classificação propostos pelo ACMG
Os critérios de classificação de variantes publicados pelo ACMG em 2015 e

suplementados pela ACGS em 2017[30] foram aplicados a todas as variantes
selecionadas.
Análise in silico
As variantes selecionadas foram analisadas por diferentes tipos de ferramentas

computacionais preditivas de significado clínico de variantes genéticas, tendo sido
utilizados thresholds (Th) sugeridos na literatura.
4
A análise foi realizada por programas que se baseiam essencialmente na conservação
entre espécies (“GERP++RS” – Th 4.4[31], “SIFT” – Th 0.05[31], “SiPhy” – Th 12.17[31],
“Mutation Assessor” – Th 1.935[31], “GWAVA” – Th 0.4[11]), na função da proteína
(“PolyPhen-2” – Th 0.5[31], “FATHMM_coding” – Th 0.5[31], “FATHMM_noncoding”
– Th 0.5[32], “PROVEAN” – Th 2.5[31]), nos mecanismos de splicing (“SPIDEX” – Th
5[11]) ou que combinam os resultados individuais de múltiplas ferramentas, reunindo
assim diferentes características preditivas (“CADD” – Th 15[32], “DANN” – Th 0.9[33],
“Genomiser” – Th 0.6[11]).
5
Resultados
Classificação de acordo com as linhas orientadoras do ACMG
Atendendo à evidência de patogenicidade / benignidade transmitida pelos diferentes

critérios de classificação, estes são agrupados em quatro categorias: very strong, strong ,
moderate e supporting.
Os critérios baseados em variantes para além das selecionadas (troca para o mesmo
aminoácido que outra variante previamente estabelecida como patogénica,
independentemente do nucleótido alterado – PS1- e/ou alteração de um aminoácido na
mesma posição que outra variante determinada como patogénica – PM5) foram
aplicados de acordo com a descrição e classificação apresentada na base de dados
“ClinVar”.
A partir dos artigos científicos com referência a cada variante em causa, publicados na
base “PubMed”, foi recolhida a informação que fundamenta a atribuição dos critérios
relativos aos seguintes aspectos:
- Variantes descritas como de novo, quer casos em que os testes de identidade foram
realizados (PS2) quer naqueles em que a maternidade e paternidade são assumidas
(PM6).
- Estudos familiares que demonstram a co-segregação da variante e da doença entre os

elementos da família. A atribuição dos níveis de evidência de patogenicidade –
“strong”, “moderate”, “supporting”- foi realizada como sugerido por Jarvik e
Browning (2016)[34], tendo sido, portanto, calculada a probabilidade da variante estar
presente num indivíduo fenotipicamente afetado por mero acaso, em detrimento da co-
segregação. Esta probabilidade é N = (1/2) m, em que m é o número de meioses da
variante de interesse dentro da(s) família(s) estudada(s). Evidência “strong”,
“moderate” ou “supporting” é atribuída quando N ≤ 1/32, ≤ 1/16 ou ≤1/8 (uma única
família estudada) ou N ≤1/16, ≤1/8 ou ≤1/4 (mais que uma família estudada),
respetivamente.
- Estudos funcionais in vivo/in vitro que indicam que a variante tem um efeito deletério
no gene ou no seu produto (PS3).
6
Os critérios associados à prevalência das variantes na população geral foram atribuídos
em concordância com a base ExAC (http://exac.broadinstitute.org/), que agrega dados
de uma grande variedade de projectos de sequenciação. O facto de determinada variante
não estar descrita nesta base constitui critério de patogenicidade (PM2). A frequência
máxima expectável na população para um alelo causador de MCH foi calculada como
indicado por Whiffin et al (2016)[35]:
Frequência alélica máxima expectável na população = prevalência × contribuição

alélica máxima × (1 / penetrância)
A prevalência da MCH na população geral é estimada em cerca de 1 para 500. Estudos

genéticos de larga escala relativos à doença indicam que a maior proporção de casos é
atribuída à variante missense MYBPC3 c. 1504 C>T (p. Arg502Trp), encontrada em
104/6179 casos (1.7 %, Intervalo de Confiança 95% 1.4-2.0%).[36, 37] O limite superior
desta proporção é então considerado a contribuição alélica máxima para a CMH.
Assumindo uma penetrância de 50% como descrito previamente [38], a frequência alélica
máxima expectável para a CMH é:
1/500 × 1/2 (divisão da prevalência por indivíduo pelo número de cromossomas por
indivíduo) × 0.02 ×1/0.5 = 4 × 10 - 5
Este valor é admitido como frequência máxima expectável para qualquer variante
causadora de MCH e, quando inferior à frequência da variante apresentada na base
ExAC, é considerado como critério de benignidade (BS1).
A avaliação do número de variantes missense benignas associadas a determinado gene

teve em conta o “score Z” da base ExAC, tal como sugerido por Lek et al (2016),[39, 40]
que representa uma medida da tolerância dos genes à variação (scores negativos
indicam maior número de variantes benignas e vice-versa). Admite-se que variantes
missense em genes que apresentam um reduzido número de variantes funcionais,
tenham maior probabilidade de ser deletérias. Scores superiores ou iguais a 3
constituem critério de patogenicidade (PP’2).
Quando determinado fenótipo patológico é altamente específico para os genes nos quais
são identificadas variantes considera-se este um argumento a favor de patogenicidade
7
(PP’4). Uma vez que a doença em estudo é a MCH e foram selecionadas variantes dos
genes que codificam proteínas do sarcómero, este critério foi atribuído a todas elas.
Os critérios cuja aplicação requer análise in silico não foram contemplados nesta fase.
Por fim, as variantes foram classificadas em pathogenic, likely pathogenic, benign,

likely benign e uncertain significance de acordo com a combinação de critérios indicada
pelo ACMG (Tabela 1).
Tabela 1. Regras para Combinação de Critérios de Classificação de Variantes

1. 1 PVS e[(≥ 1 PS) ou (≥ 2 PM) ou (1 PM + 1 PP’) ou (≥ 2 PP’)]
ou
Pathogenic 2. ≥ 2 PS
ou
3. 1 PS e [(≥ 3 PM) ou (2 PM + ≥ 2 PP’) ou (1 PM + ≥ 4 PP’)]
1. PVS e 1 PM
ou
2. 1 PS e [(1-2 PM) ou (≥ 2 PP’)]
ou
Likely Pathogenic 3. ≥ 3PM
ou
4. 2 PM e ≥ 2 PP’
ou
5. 1 PM e ≥ 4PP’
1. BVS
Benign ou
2. ≥ 2 BS
1. 1 BS e 1 BP’
Likely Benign ou
2. ≥ 2 BP’
1. A conjugação de critérios acima descrita não se verifica.
Uncertain Significance ou
2. Os critérios de patogenicidade e benignidade são contraditórios.
PVS, Pathogenic Very Strong; PM, Pathogenic Moderate; PP’ Pathogenic Supporting; PS, Pathogenic Strong; BVS,
Benign Very Strong; BS, Benign Strong; BP’, Benign Supporting
8
Variantes Patogénicas
Neste grupo foram incluídas 89 variantes dos genes MYBPC3 (34), MYH7 (22), TNNT2
(10), TNNI3 (13), TPM1 (3), MYL2 (3), MYL3 (3) e ACTC1 (1), das quais 62 missense e
27 splice site (Figura 2).
TPM1
TNNT2
TNNI3
Genes
MYL3
MYL2 Missense
MYH7 Splice Site
MYBPC3
ACTC1
0 10 20 30 40
Número de variantes
Figura 2. Variantes Patogénicas. Distribuição das variantes previamente classificadas como

patogénicas incluídas na análise por gene e tipo. Cada linha do gráfico representa o número de
variantes missense e splice site do respetivo gene.
Após aplicação dos critérios de classificação ACMG, tal como explicitado

anteriormente, foi atribuída a classificação de pathogenic a 29 variantes (33%), 27
(31%) foram classificadas como likely pathogenic e 33 (37%) como uncertain
significance, sendo que nesta última categoria estão inseridas maioritariamente variantes
splice site (19) (Tabela 2 e Figura 3).
9
Tabela 2. Classificação das Variantes Patogénicas Selecionadas de Acordo com os
Critérios ACMG
Frequência
Estudos Estudos na Classificação
Gene Identificação da Variante Outros Critérios
Nº Familiares Funcionais População Final
(ExAC)
Score Z = 5.2 PP’2
1 ACTC1 c.301G>A (p.Glu101Lys) ECS: PStrong PS3 0.00001 Pathogenic
PP’4
Likely
2 c.2374T>C(p.Trp792Arg) SECS PS3 PM2 PP’4
Pathogenic
Uncertain
3 c.2308G>A(p.Asp770Asn) SECS ND 0.00001 PP’4
Significance
4 c.1624G>C(p.Glu542Gln) ECS: PStrong PS3 0.00003 PP’4 Pathogenic
Likely
5 c.1505G>A(p.Arg502Gln) ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
PM5
6 c.1484G>A (p.Arg495Gln) ECS: PStrong PS3 0.00001 Pathogenic
PP’4
PM5 Uncertain
7 c.1483C>G (p.Arg495Gly) SECS ND PM2
PP’4 Significance
8 c.772G>A(p.Glu258Lys) ECS: PStrong PS3 0.00004 PP’4 Pathogenic
PM5 Likely
9 c.655G>T(p.Val219Phe) SECS PS3 0.00001
PP’4 Pathogenic
PM5 Likely
10 c.655G>C (p.Val219Leu) SECS PS3 PM2
PP’4 Pathogenic
Uncertain
11 c.3815-1G>A SECS ND PM2 PP’4
Significance
Likely
12 c.3627+1G>A ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
Uncertain
13 c.3491-2A>T SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
14 c.3331-2A>C SECS ND PM2 PP’4
Significance
Likely
15 c.3330+2T>G SECS PS3 PM2 PP’4
Pathogenic
Uncertain
16 c.3190+2T>G SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
17 c.3190+1G>A SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
18 MYBPC3 c.2309-2A>G SECS ND PM2 PP’4
Significance
Likely
19 c.2308+1G>T ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
20 c.2308+1G>A ECS: PStrong PS3 PM2 PP’4 Pathogenic
21 c.1928-2A>G ECS: PStrong PS3 PM2 PP’4 Pathogenic
Uncertain
Significance
10
Uncertain
23 c.1624+2T>C SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
Significance
Uncertain
25 c.1351+2T>C SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
Significance
Uncertain
27 c.1227-2A>G SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
28 c.1090+1G>T SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
Significance
Likely
30 c.927-2A>G ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
Uncertain
31 c.821+1G>C SECS ND PM2 PP’4
Significance
Uncertain
32 c.821+1G>A ECS: PStrong ND 0.00004 PP’4
Significance
Likely
33 c.772+1G>A ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
Uncertain
Significance
Uncertain
35 c.26-2A>G SECS ND PM2 PP’4
Significance
PM5
36 c.5134C>T (p.Arg1712Trp) ECS: PStrong ND PM2 Pathogenic
Score Z= 6.54 PP’2
PP’4
PM5
37 c.4498C>T (p.Arg1500Trp) SECS PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
Score Z= 6.54 PP’2 Likely
38 c.4135G>A (p.Ala1379Thr) ECS: PStrong ND PM2
PP’4 Pathogenic
Score Z= 6.54 PP’2 Uncertain
39 c.3346G>A (p.Glu1116Lys) SECS ND PM2
PP’4 Significance
PM5 Likely
40 c.2788G>A (p.Glu930Lys) SECS ND PM2
Score Z= 6.54 PP’2 Pathogenic
PP’4
PS2 [41, 42]
41 MYH7 c.2770G>A (p.Glu924Lys) SECS PS3 PM2 Pathogenic

PP’4
42 c.2710C>T (p.Arg904Cys) ECS: PStrong ND 0.00001
PP’4 Pathogenic
43 c.2389G>A (p.Ala797Thr) ECS: PStrong ND 0.00003
PP’4 Pathogenic
PS1 Likely
44 c.2302G>A (p.Gly768Arg) SECS ND PM2
PP’4
PS1
45 c.2221G>A (p.Gly741Arg) SECS ND PM2 Pathogenic
PM5
PM5 Likely
46 c.2191C>T (p.Pro731Ser) SECS ND PM2
PP’4
PP’4
11
PM5
47 c.1987C>T (p.Arg663Cys) SECS PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
48 c.1954A>G (p.Arg652Gly) ECS: PStrong ND 0.00001
PP’4 Significance
49 c.1816G>A (p.Val606Met) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
50 c.1012G>A (p.Val338Met) SECS ND PM2
PP’4 Significance
51 c.842G>C (p.Arg281Thr) SECS ND PM2
PP’4 Significance
52 c.767G>A (p.Gly256Glu) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
PM6[43, 44]
53 c.746G>A (p.Arg249Gln) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
54 c.740T>G (p.Phe247Cys) SECS ND PM2
PP’4 Significance
55 c.596C>T (p.Ala199Val) SECS ND PM2
PP’4 Significance
PS2[41] Likely
56 c.438G>T (p.Lys146Asn) SECS ND PM2
PP’4 Uncertain
Significance
Uncertain
58 c.173G>A (p.Arg58Gln) SECS PS3 0.00001 PP’4
Significance
59 MYL2 c.64G>A (p.Glu22Lys) ECS: PStrong PS3 0.00001 PP’4 Pathogenic
Likely
60 c.403-1G>C SECS PS3 0.00003 PP’4
Pathogenic
PM5
61 c.445A>G (p.Met149Val) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
Likely
62 MYL3 c.281G>A (p.Arg94His) ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
63 c.170C>G (p.Ala57Gly) ECS: PStrong PS3 0.00020 PP’4 Pathogenic
Likely
64 c.611G>A (p.Arg204His) SECS PS3 PM2 PP’4
Pathogenic
PM6[45]
65 c.575G>A (p.Arg192His) SECS PS3 PM2 Pathogenic
PM5
PP’4 Likely
66 c.557G>A (p.Arg186Gln) ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
[46]
PM6 Uncertain
67 TNNI3 c.544G>A (p.Glu182Lys) SECS ND PM2
PP’4 Significance
PS2[47] Likely
68 c.509G>A (p.Arg170Gln) SECS ND PM2
PM5 Pathogenic
PP’4
PM5 Uncertain
69 c.508C>T (p.Arg170Trp) SECS ND PM2
PP’4 Significance
PM5
70 c.485G>A (p.Arg162Gln) ECS: PStrong PS3 0.00003 Pathogenic
PP’4
12
Likely
71 c.470C>T (p.Ala157Val) ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
PM5 Likely
72 c.434G>A (p.Arg145Gln) SECS PS3 0.00003
PP’4 Pathogenic
PM5
73 c.433C>T (p.Arg145Trp) ECS: PStrong PS3 0.00001 Pathogenic
PP’4
PM5
74 c.433C>G (p.Arg145Gly) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
Likely
75 c.422G>A (p.Arg141Gln) ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
Uncertain
76 c.407G>A (p.Arg136Gln) SECS ND 0.00001 PP’4
Significance
ECS: Likely
77 c.536C>T (p.Ser179Phe) PS3 PM2 PP’4
PSupporting Pathogenic
PM5
78 c.517C>T (p.Arg173Trp) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
PM5
79 c.421C>T (p.Arg141Trp) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PM6 [48]
PP’4 Likely
80 c.388C>T (p.Arg130Cys) SECS PS3 PM2 PP’4
Pathogenic
PM5 Uncertain
81 c.281G>A (p.Arg94His) SECS ND PM2
PP’4 significance
TNNT2
PM5 Uncertain
82 c.280C>T (p.Arg94Cys) SECS ND PM2
PP’4 Significance
PS2 [41]
83 c.275G>A (p.Arg92Gln) SECS PS3 PM2 Pathogenic
PM5
PP’4
84 c.304C>T (p.Arg102Trp) ECS: PStrong PS3 0.00001 PP’4 Pathogenic
Likely
85 c.244G>A (p.Gly82Arg) ECS: PStrong ND PM2 PP’4
Pathogenic
86 c.236T>A (p.Ile79Asn) ECS: PStrong PS3 PM2 PP’4 Pathogenic

87 c.284T>C (p.Val95Ala) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
88 TPM1 c.523G>A(p.Asp175Asn) ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
89 c.688G>A(p.Asp230Asn ECS: PStrong PS3 PM2 Pathogenic
PP’4
ECS, Evidência de co-segregação; ND, Não documentado; SECS, Sem evidência de co-segregação P, Pathogenic; S, Strong; M,
Moderate, P’ Supporting;
13
35
30
Número de Variantes
25
Pathogenic
20
Likely Pathogenic
15
Uncertain Significance
10 Estudos Funcionais
5 Estudos Familiares
0
Missense Splice Site
Tipo de Variante
Figura 3. Classificação das Variantes Patogénicas. Distribuição das variantes patogénicas missense
(esquerda) e splice site (direita) tendo em conta a sua classificação de acordo com as linhas
orientadoras do ACMG – pathogenic, likely pathogenic e uncertain significance – e a existência de
estudos funcionais ou familiares a suportar a sua patogenicidade.
A corroborar a sua patogenicidade, 37 variantes (42%) têm estudos funcionais que

demonstram que a alteração conduz a um efeito prejudicial no gene ou no seu produto.
Os estudos funcionais evidenciam essencialmente alteração dos mecanismos de
splicing,[49, 50]da síntese e da integridade da proteína,[49, 51, 60, 52–59]bem como modificação da
cinética do cálcio, da atividade da ATPase e da interação entre os miofilamentos.[61, 62, 71–80,
63, 81–90, 64, 91–100, 65, 101–110,
Verificou-se ainda alteração da força máxima gerada, com
66–70]
comprometimento do relaxamento muscular.[71, 104, 111–114](Vide Tabela 1 em anexo)
Relativamente a 39 variantes (43%) foram realizados estudos familiares em que se

verifica a co-segregação da doença com a variante em múltiplos membros da família
(Vide Tabela 2 em anexo). [43, 44, 117–126, 45, 127–136, 50, 137–146, 73, 147–156, 76, 157–162, 103, 110, 115, 116]
A maioria das variantes (78%) não está listada no ExAC, constituindo assim um critério
de patogenicidade.
14
Variantes Benignas
Neste grupo foram integradas 111 variantes dos genes ACTN2 (7), ILK (1), JPH2 (3),
LMNA (2), MYBPC3 (9), MYH6 (19), MYH7 (7), MYL2 (2), MYL3 (1), MYLK2 (7),
MYOZ2 (1), NEXN (1), PDLIM3 (3), PRKAG2 (3), TCAP (2), TNNC1 (1), TNNI3 (2),
TNNT2 (4), TTN (36), das quais 69 missense, 38 splice site, 3 5’-UTR e 1 intronic.
(Figura 4)
TTN
TNNT2
TNNI3
TNNC1
TCAP
PRKAG2
PDLIM3
NEXN
MYOZ2
Genes
Missense
MYLK2
Splice Site
MYL3
MYL2 5'-UTR
MYH7 Intronic
MYH6
MYBPC3
LMNA
JPH2
ILK
ACTN2
0 10 20 30 40
Número de variantes
Figura 3. Variantes Benignas. Distribuição das variantes previamente classificadas como benignas
incluídas na análise por gene e tipo. Cada linha do gráfico representa o número de variantes missense,
splice site, 5’- UTR e intronic do respetivo gene.
A frequência na população de quase todas estas variantes é superior à frequência alélica

máxima expectável para a MCH (4.0 x 10 -5) [35]
, constituindo este facto um critério de
benignidade (BS1) (Tabela 3). Apenas uma destas variantes não cumpre esta condição
(assinalada com * na Tabela 3).
15
Contudo, na revisão da literatura efectuada, não estão descritos estudos funcionais ou
familiares que suportem o seu comportamento benigno.
Somente para duas destas variantes estão publicados um estudo funcional e um estudo
familiar que, em vez de um comportamento benigno, sustentam um efeito patogénico.
Estudo funcional revelou que a proteína variante TNNI3 Pro82Ser compromete a
cooperação entre os miofilamentos e induz disfunção diastólica. [164] Acerca da variante
MYH7 Ala26Val foi realizado um estudo familiar envolvendo 37 indivíduos
pertencentes à mesma família, tendo-se identificado que 9 elementos apresentam a
variante, dos quais 4 têm características clínicas de MCH e 28 não expressam a variante,
nem fenótipo de MCH.[163]Estes dados fundamentam a co-segregação da variante e do
fenótipo, de nível strong.
Assim sendo, todas as variantes deste grupo foram classificadas como uncertain
significance.
16
Tabela 3. Classificação das Variantes Benignas Selecionadas de Acordo com os
Critérios ACMG
Estudos Frequência na Identificada
Gene Identificação da Variante
Familiares/ População em doente Classificação Final
Nº
Funcionais (ExAC) com MCH
1 c.-22C>T ND 0.02615 - Uncertain Significance
2 c.536+10C>T ND 0.00130 - Uncertain Significance
3 c.877-8C>G ND 0.7753 - Uncertain Significance
4 ACTN2 c.1298C>T (p.Ser433Leu) ND 0.00080 - Uncertain Significance
5 c.1423G>A (p.Asp475Asn) ND 0.00723 - Uncertain Significance
6 c.1810A>G (p.Met604Val) ND 0.00585 - Uncertain Significance
7 c.2367+8A>G ND 0.00016 - Uncertain Significance
8 ILK c.435A>C (p.Arg145Ser) ND 0.00078 - Uncertain Significance
9 c.1289-7C>T ND 0.01251 - Uncertain Significance
10 JPH2 c.380-6C>T ND 0.00414 - Uncertain Significance
12 c.810+13G>T ND 0.01681 - Uncertain Significance

LMNA
13 c.811-13T>A ND 0.00235 - Uncertain Significance
14 c.3004C>T (p.Arg1002Trp) ND 0.00067 - Uncertain Significance
16 c.2498C>T (p.Ala833Val) ND 0.00222 - Uncertain Significance
17 c.1790+7G>A ND 0.000602 Sim [165] Uncertain Significance
18 MYBPC3 c.1564G>A (p.Ala522Thr) ND 0.00039 Sim [166, 167] Uncertain Significance
19 c.1144C>T (p.Arg382Trp) ND 0.00422 Sim [168] Uncertain Significance
20 c.977G>A (p.Arg326Gln) ND 0.00551 Sim[168–171] Uncertain Significance
21 c.706A>G (p.Ser236Gly) ND 0.10790 Sim[168–170, 172] Uncertain Significance
22 c.472G>A (p.Val158Met) ND 0.09043 Sim [169, 172] Uncertain Significance
17
23 c.4838T>C (p.Val1613Ala) ND 0.01463 - Uncertain Significance
24 c.4778A>T (p.Gln1593Leu) ND 0.01470 - Uncertain Significance
27 c.4359+8A>C ND 0.00082 - Uncertain Significance
31 c.3883G>C (p.Glu1295Gln) r ND 0.00325 - Uncertain Significance
32 c.3388G>A (p.Ala1130Thr) ND 0.10033 - Uncertain Significance

MYH6
33 c.3302T>C (p.Val1101Ala) ND 0.34610 - Uncertain Significance
34 c.2890G>T (p.Ala964Ser) ND 0.00048 - Uncertain Significance
35 c.2806G>T (p.Ala936Ser) ND 0.00239 - Uncertain Significance
36 c.2579G>A (p.Arg860His) ND 0.00166 - Uncertain Significance
37 c.2071G>A (p.Val691Ile) ND 0.00079 - Uncertain Significance
38 c.1132G>A (p.Gly378Ser) ND 0.00088 - Uncertain Significance
39 c.800-11A>G ND 0.7565 - Uncertain Significance
Doente com
40 c.622G>A (p.Asp208Asn) ND 0.00550 cardiomiopatia não Uncertain Significance
[173]
especificada.
41 c.166G>A (p.Gly56Arg) ND 0.06980 Sim[174] Uncertain Significance
44 MYH7 c.3770A>G (p.Asn1257Ser) ND 0.00031 - Uncertain Significance
45 c.2923-18G>A ND 0.01523 - Uncertain Significance
46 c.2679+7C>T ND 0.00003 * - Uncertain Significance
18
47 c.2162+4G>A ND 0.00081 - Uncertain Significance
48 c.77C>T (p.Ala26Val) ECS: Strong 0.00057 Sim [163, 175–177] Uncertain Significance

MYL2
51 MYL3 c.559+6C>T ND 0.00020 Sim[7] Uncertain Significance
52 c.-67T>C ND 0.05390 - Uncertain Significance
53 c.266G>A(p.Gly89Asp) ND 0.00402 - Uncertain Significance
54 c.508G>A (p.Glu170Lys) ND 0.00061 - Uncertain Significance
55 MYLK2 c.1082+11G>A ND 0.02061 - Uncertain Significance
56 c.1295+4C>A ND 0.00064 - Uncertain Significance
57 c.1710+15A>G ND 0.07943 - Uncertain Significance
59 MYOZ2 c.29A>C (p.Gln10Pro) ND 0.00270 - Uncertain Significance
60 NEXN c.733G>A (p.Gly245Arg) ND 0.18459 - Uncertain Significance
61 c.734C>T (p.Thr245Ile) ND 0.01721 - Uncertain Significance
62 PDLIM3 c.379G>A (p.Val127Met) ND 0.00911 - Uncertain Significance
63 c.29C>T (p.Pro10Leu) ND 0.00086 - Uncertain Significance
65 PRKAG2 c.59G>T (p.Ser20Ile) ND 0.00648 - Uncertain Significance
66 c.-26C>T ND 0.17431 - Uncertain Significance
67 c.191C>T (p.Ser64Leu) ND 0.00111 - Uncertain Significance

TCAP
68 c.316C>T (p.Arg106Cys) ND 0.01958 Sim [147] Uncertain Significance
69 TNNC1 c.203-5C>T ND 0.00046 - Uncertain Significance
70 TNNI3 c.244C>T (p.Pro82Ser) PS3 0.00169 Sim [178, 179] Uncertain Significance
19
72 c.758A>G (p.Lys253Arg) ND 0.05073 Sim [169, 180] Uncertain Significance

TNNT2
76 c.33340+10T>C ND 0.00244 - Uncertain Significance
77 c.28916G>A (p.Arg9639Lys) ND 0.01241 - Uncertain Significance
79 c.27832A>G (p.Ile9278Val) ND 0.35364 - Uncertain Significance
80 c.27220G>A (p.Glu9074Lys) ND 0.01456 - Uncertain Significance
81 c.28313G>A (p.Arg9438Gln) ND 0.04512 - Uncertain Significance
82 c.21894G>T (p.Gln7298His) ND 0.03971 - Uncertain Significance
83 c.25398T>A (p.Asp8466Glu) ND 0.01122 - Uncertain Significance

TTN
84 c.25274G>A (p.Ser8425Asn) ND 0.17836 - Uncertain Significance
85 c.25064C>A (p.Ala8355Glu) ND 0.30877 - Uncertain Significance
86 c.24431A>C (p.Glu8144Ala) ND 0.17633 - Uncertain Significance
87 c.19445C>T (p.Ser6482Leu) ND 0.00668 - Uncertain Significance
88 c.22384G>C (p.Asp7462His) ND 0.17861 - Uncertain Significance
89
c.17312C>T (p.Ala5771Val) ND 0.01645 - Uncertain Significance
90 c.19204A>G (p.Met6402Val) ND 0.00488 - Uncertain Significance
91 c.15272A>G (p.Asp5091Gly) ND 0.00296 - Uncertain Significance
20
95 .9781G>A (p.Val3261Met) ND 0.19510 - Uncertain Significance
TTN
96 c.9461A>G (p.Lys3154Arg) ND 0.06589 - Uncertain Significance
98 c.7830G>C (p.Met2610Ile) ND 0.07135 - Uncertain Significance
99 c.7174G>A (p.Gly2392Ser) ND 0.06532 - Uncertain Significance
100 c.6727G>T (p.Asp2243Tyr) ND 0.00272 - Uncertain Significance
101 c.5231C>T (p.Pro1744Leu) ND 0.00634 - Uncertain Significance
102 c.3601A>G (p.Lys1201Glu) ND 0.49980 - Uncertain Significance
103 c.2432C>T (p.Thr811Ile) ND 0.16907 - Uncertain Significance
107 c.1079G>C (p.Arg360Thr) ND 0.00620 - Uncertain Significance
108 c.1003G>A (p.Val335Met) ND 0.00391 - Uncertain Significance
109 c.982C>T (p.Arg328Cys) ND 0.12379 - Uncertain Significance
111 c.178G>T (p.Asp60Tyr) ND 0.01389 - Uncertain Significance
ECS, Evidência de co-segregação; ND, Não documentado
21
Análise in silico
A performance das diferentes ferramentas computacionais de predição de significado

clínico de variantes genéticas foi avaliada comparando a sua interpretação, isto é se
priorizam como potencialmente patogénica determinada variante ou não, com a
classificação atribuída de acordo com a plataforma “ClinVar” (Figura 4).
Figura 4. Performance das ferramentas computacionais de predição por variante. Cada linha corresponde a uma
variante. Cada coluna corresponde a uma ferramenta computacional, estando representadas aquelas com melhor
desempenho para as variantes exónicas (esquerda) e para as intrónicas (direita). As colunas vermelhas correspondem a
variantes priorizadas e as azuis a variantes não priorizadas, pelos respetivos programas. O resultado de uma
ferramenta ideal seria igual ao da coluna “GroundTruth”, que representa a classificação atribuída de acordo com a
base “ClinVar” e na qual as variantes classificadas como patogénicas estão representadas a vermelho e as classificadas
como benignas a azul.
Neste sentido, foi calculada a proporção de variantes que são erradamente classificadas
como patogénicas (taxa de falsos positivos), a proporção de variantes que são
erradamente classificadas como benignas (taxa de falsos negativos), a proporção de
variantes patogénicas que são classificadas como tal (sensibilidade) e a proporção de
variantes benignas que são classificadas como tal (especificidade) para cada um dos
programas (Tabela 4).
22
Tabela 4. Performance das diferentes ferramentas computacionais de predição
Ferramentas Verdadeiros Falsos Falsos Verdadeiros Taxa de Taxa de Sensibilidade Especificidade

Positivos Negativos Positivos Negativos Falsos Falsos (%) (%)
Computacionais
Positivos (%) Negativos
(%)
GERP++RS 58 31 47 64 42.3 34.8 65.2 57.7
SIFT 54 35 29 82 26.1 39.3 60.7 73.9
PolyPhen-2 49 40 22 89 19.8 44.9 55.1 80.2
Mutation Assessor 49 40 18 93 16.2 44.9 55.1 83.8
FATHMM_coding 58 31 53 58 47.7 34.8 65.2 52.3
FATHMM_noncoding 26 63 10 101 9.0 70.8 29.2 91.0
SPIDEX 20 69 0 111 0 77.6 22.4 100
CADD 89 0 54 57 48.6 0 100 51.4
PROVEAN 89 0 111 0 100 0 100 0
DANN 89 0 49 62 44.1 0 100 55.9
GWAVA 28 61 53 58 47.7 68.5 31.5 52.3
SiPhy 67 22 40 71 36.0 24.7 75.3 64.0
Genomiser 89 0 84 27 75.7 0 100 24.3
23
Discussão
As novas tecnologias de sequenciação genética têm revolucionado tanto a prática clínica

como a investigação de muitas patologias, em particular da MCH, com potencial em
contexto preventivo e diagnóstico. Contudo, o crescente acesso à sequenciação genética
implica novos desafios inerentes à validação clínica das variantes genéticas
identificadas. [22, 181]
A classificação manual, ou seja, aquela com base na literatura científica disponível e

sem recurso a ferramentas computacionais, das variantes consideradas não se mostrou
uniformemente concordante com aquela atribuída previamente por múltiplos autores ou
painel de especialistas e sem conflitos de interpretação, de acordo com a base
“ClinVar”.
Das 89 variantes previamente classificadas como patogénicas, 56 (63%) foram

classificadas como pathogenic ou likely pathogenic e 33 (37%) receberam a
classificação de uncertain significance. O grupo de variantes classificadas como
pathogenic ou likely pathogenic é em grande parte constituído por variantes missense
(48), ao passo que as variantes classificadas como uncertain significance são
maioritariamente splice site (19). Tal diferença prende-se com o facto de existir um
maior número de variantes missense para as quais foram realizados estudos funcionais
in vitro/in vivo ou estudos de co-segregação familiar. Cerca de 70 % das variantes
missense têm estudos funcionais ou familiares a suportar a sua patogenicidade, ao passo
que apenas para 9 (33%) das variantes splice site revistas estão publicados tais estudos.
Estas últimas têm vindo a ser classificadas como patogénicas com base
fundamentalmente em programadas computacionais preditores de significado clínico de
variantes genéticas, não contemplados nesta classificação manual.
Algumas variantes incluídas para as quais foram realizados estudos familiares que
mostram co-segregação da variante com a doença (MCH) com forte nível de evidência
ou estudos funcionais que revelam um efeito deletério ao nível do gene ou do seu
produto são, ainda assim, classificadas como uncertain significance. Isto acontece pois
os critérios de patogenicidade referentes a estes dois grupos de estudos não são
considerados suficientemente fortes pelo sistema de classificação para, na ausência de
outros critérios, permitirem a classificação da variante numa categoria de
24
patogenicidade. Apesar disto, em termos clínicos, é diferente interpretar variantes
classificadas como de significado incerto para as quais existem estudos funcionais ou
familiares ou para as quais não foi realizada nenhuma investigação semelhante.
Outro aspecto importante na atribuição de critérios de patogenicidade prende-se com a

valorização dos diferentes estudos funcionais. Estes são uma poderosa ferramenta
indicadora do efeito patogénico de uma variante, mas nem todos os estudos funcionais
predizem com a mesma segurança um possível efeito deletério no gene ou na função da
proteína que este codifica. A validade dos estudos funcionais deve considerar o quanto
estes reflectem o ambiente biológico sendo que estudos realizados em tecidos obtidos a
partir de biópsias de doentes ou modelos animais fornecem geralmente melhor
evidência que estudos in vitro.[29] Do mesmo modo, a reprodutibilidade e a robustez dos
estudos tem também impacto na confiança relativamente ao critério de patogenicidade
que estes sustentam. No entanto, esta distinção não é tida em conta no momento da
classificação das variantes. Apesar das linhas orientadoras propostas pela “ACMG”
reforçarem o facto de que esta informação deve ser cuidadosamente avaliada e que
apenas devem ser tidos em conta estudos funcionais corretamente desenvolvidos, não há
discriminação em termos de nível de evidência no que aos estudos funcionais diz
respeito. Tal diferenciação seria importante, à semelhança do que foi proposto pelo
ACGS para os estudos familiares, em que é atribuído um nível de evidência de co-
segregação de acordo com o número de meioses identificado.
Todas as variantes previamente classificadas como benignas na base “ClinVar” foram

categorizadas neste estudo como uncertain significance, uma vez que não existem
estudos funcionais, familiares ou casos relevantes descritos que permitam atribuir uma
classificação diferente desta. O único critério atribuído que suporta o comportamento
benigno destas variantes diz respeito à sua frequência na população descrita na
plataforma ExAC, que é superior à proporção máxima de casos de MCH atribuída a
determinado alelo. Na verdade, para duas destas variantes até estão descritos estudos
funcionais e familiares que orientam a sua interpretação clínica no sentido da
patogenicidade, reforçando a incerteza do seu significado.
Assim sendo, a classificação das variantes deve ser transmitida aos clínicos juntamente
com toda a informação disponível e as ressalvas inerentes, a fim de potenciar o rigor da
sua interpretação. [23]
25
Relativamente à performance das diferentes ferramentas computacionais aplicadas
verifica-se que estas têm uma sensibilidade média de aproximadamente 66% e
especificidade de aproximadamente 61%. Estas ferramentas são, portanto, capazes de
identificar como patogénicas a maior parte das variantes que de facto o são, mas em
muitos casos não as identificam a todas, deixando algumas por priorizar. Por outro lado,
sobretudo as ferramentas que apresentaram uma maior sensibilidade, têm associadas
elevadas taxas de falsos positivos, o que significa que priorizam erradamente variantes
como sendo patogénicas, condicionando uma investigação diagnóstica mais morosa e,
em última análise, podendo comprometer o sucesso diagnóstico. Quanto à
especificidade dos programas computacionais, estes classificam a maior parte das
variantes benignas como não sendo responsáveis pela doença. Contudo, têm uma taxa
de falsos negativos média de 34% o que significa que certas variantes são erradamente
classificadas como benignas.
Estes resultados demonstram que embora os programas computacionais tenham um

enorme potencial no auxílio da interpretação das variantes genéticas identificadas, para
que possamos confiar nos seus resultados exigem aperfeiçoamento. [31, 32]
A revisão da literatura disponível acerca de cada uma das variantes e posterior

atribuição de critérios de classificação constitui um método rigoroso, mas moroso e que
está dependente da prévia identificação da variante e realização de estudos relacionados
com o seu significado clínico. É neste sentido que os programas computacionais de
predição se apresentam como uma mais-valia para o processo, especialmente quando
conseguem reunir elevada sensibilidade e especificidade.
A perspectiva futura é de que estes dois métodos se complementem, a fim de oferecer

aos indivíduos portadores de determinada variante genética uma interpretação rigorosa e
segura do seu significado.
Em contexto clínico, o recurso a NGS levanta outro desafio relacionado com questões
éticas[22], em particular o problema dos achados acidentais, isto, é a identificação de
variantes que indicam elevada probabilidade de presença ou risco de patologia não
relacionada com a indicação clínica que motivou a sequenciação. Um assunto de debate
é até que ponto a informação obtida por NGS deve ser transmitida aos doentes.
26
Concluindo, com o advento das novas tecnologias de sequenciação surgem novos
desafios para os quais os clínicos devem estar preparados para gerir. A fim de tomar as
melhores decisões preventivas, diagnósticas e terapêuticas para os doentes, os clínicos
devem conhecer as indicações para a sequenciação do exoma/genoma e confirmar os
seus resultados através da revisão da literatura disponível, integrando toda a informação
com a história e características de cada doente em particular.
27
Agradecimentos
Agradeço à Professora Carmo Fonseca pela orientação, apoio e disponibilidade

prestados, que tornaram possível a realização deste Trabalho Final de Mestrado.
Reconheço também todo o auxílio e esclarecimentos dados pela Marta Ribeiro

(Estudante do Programa Doutoral intitulado “Identification of novel noncoding genetic
variants with functional impact in hypertrophic cardiomyopathy”, Instituto de Medicina
Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa), pela Joana Tavares
(Especialista em Bioinformática, GenoMed) e pela Dra. Marta Amorim (Geneticista
Clínica, GenoMed).
28
Bibliografia
1. Maron, B.J., Rowin, E.J. and Maron, M.S. (2018) Global Burden of Hypertrophic
Cardiomyopathy. JACC: Heart Failure, 6, 376–378.
2. Semsarian, C., Ingles, J., Maron, M.S. and Maron, B.J. (2015) New perspectives on
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50
Anexos
51
Tabela 1. Descrição dos Estudos Funcionais Utilizados como Fundamento de Patogenicidade das Variantes Selecionadas
Variante
Características e Principais Conclusões
Nº
1 Estudo funcional in vitro demonstrou que a proteína variante reduz a afinidade da miosina para a actina e diminui a força gerada. [61]
Estudos realizados a partir de amostras de tecido cardíaco de doentes com MCH portadores da variante evidenciaram níveis aumentados de proteínas dos miofilamentos, em comparação
2
com tecido cardíaco de doentes saudáveis, sugerindo assim um efeito deletério do péptido. [51]
4 Estudos in vitro revelaram que a variante altera o último nucleótido do exão, que constitui parte do local de splicing, resultando num transcrito aberrante.[49, 50]
Análise quantitativa dos níveis de transcritos e de proteínas do sarcómero em amostras de tecido miocárdico de doentes com MCH e portadores da variante revelou um aumento da
6
expressão do gene MYBPC3 relativamente aos controlos e que o péptido mutante é predominantemente expresso relativamente ao wild-type (62-69% do MYBPC3 total). [52]
Estudo in vitro revelou que a variante induz alteração da carga de superfície do domínio C-1 da proteína, conduzindo a uma modificação da sua integridade estrutural e interacções
8 electrostáticas.[53] Foi ainda constatado uma redução da atividade do sistema ubiquitina-proteossoma em tecido cardíaco de doentes com MCH e portadores da variante, comparativamente
com as amostras controlo. (49,50)
9 Estudoin vitro mostrou que a variante conduz a omissão do exão 6, alteração esta que é expectável conduzir a uma proteína anormal ou a total ausência da mesma. [49]
10 Estudo in vitro mostrou que a variante conduz a omissão do exão 6, alteração esta que é expectável conduzir a uma proteína anormal ou a total ausência da mesma. [49]
Análise de tecido cardíaco de doentes com MCH (incluindo portadores da variante em causa) revelou um aumento da quantidade total de mRNA MYBPC3 relativamente a amostras
15 controlo. Os autores presumem que tal alteração se deve a um mecanismo de compensação da instabilidade gerada pelo transcrito variante de modo a manter níveis normais de proteína
MYBPC3 íntegra. [52]
Análise do cDNA identificado em linfócitos de doentes com MCH portadores da variante mostrou que esta conduz a destruição do local de splicing ao nível do intrão 23, resultando
20
numa proteína truncada.[50]
21 Estudo in vitro demonstrou que esta variante conduz a alteração do splicing e a introdução de um codão stop prematuro.[123]
37 Estudo in vitro revelou que a variante causa uma diminuição da estabilidade termodinâmica com impacto funcional na proteína resultante, em comparação com a wild-type.[56]
41 Estudo in vitro revelou que a proteína variante reduz drasticamente as interações com o domínio regulador do proteína codificada pelo gene MYBPC3.[57]
Análise de 43 amostras de tecido cardíaco de doentes com variantes nos genes do sarcómero (um dos doentes com a variante MYH7 – Arg663Cys) revelou uma diminuição significativa
47
da força máxima gerada pelos cardiomiócitos, em comparação com amostras de miocárdio controlo. [111]
Estudo de motilidade in vitro revelou que a proteína variante move os filamentos de actina mais lentamente, em comparação com a proteína wild-type.[62]
Análise de proteínas MYH7 wild-type e variantes, expressas em células de insectos, revelou que a proteína variante MYH7 – Val606Met afeta minimamente a translocação da actina, bem
49 como a atividade de ATPase da miosina. [63, 64]
Estudos realizados em amostras de miectomia de doentes portadores da variante mostraram que a proteína MYH7-Val606Met produz maior velocidade de deslizamento que a proteína
wild-type.[65]
Estudo de motilidade in vitro revelou que a proteína variante move os filamentos de actina mais lentamente, em comparação com a proteína wild-type.[62]
Análise histoquímica de biópsias do músculo solhar de doentes com MCH e gene MYH7 variante (1 doente com variante MYH7 -Gly256Glu) revelou a presença de doença do núcleo
52
central (DNC) do músculo esquelético, levando os autores a concluir que uma parte dos doentes com MCH e variantes no gene MYH7 tenham DNC.[66]
Estudos in vitro mostraram que a proteína variante MYH7 – Arg246Gln conduz a uma diminuição da translocação da actina, associada a menor atividade ATPase, em comparação com a
53
proteína wild-type.[63, 64]
52
58 Estudos in vitro revelaram que a proteína variante MYL2 -Arg58Gln altera substancialmente as propriedade de ligação ao cálcio, em comparação com a proteína wild-type.[67, 68]
Estudos in vitro mostraram que a proteína variante MYL2 – Glu22Lys está associada a alteração das propriedades de ligação ao cálcio das miofibrilas e a défice no relaxamento
muscular.[67, 69–72]
59
Análise histopatológica de ratinhos transgénicos MYL2 – Glu22Lys demostrou aumento das dimensões do septo interventricular e dos músculos papilares em comparação com os wild-
type.[71]
Estudo funcional realizado a partir de mRNA revelou que esta alteração conduz a uma variante frameshift e substituição dos últimos 32 codões por outros 20, com consequente alteração
60
do domínio C-terminal da proteína. [58]
61 Estudo de motilidade in vitro demonstrou que a proteína variante MYL3- Met149Val está associada a uma translocação dos filamentos de actina mais rápida que a miosina wild-type. [73]
Estudos in vivo e in vitro revelaram que a proteína variante está associada a um aumento da sensibilidade ao cálcio, induz uma menor afinidade para a cadeia pesada da miosina e diminui
63 a força máxima por secção muscular, em comparação com a proteína wild-type. O coração de ratinhos transgénicos para esta variante apresenta maior grau de fibrose e hipertrofia que os
wild-type. [74, 75]
64 Estudo funcional demonstrou que a proteína variante resulta numa diminuição da interação entre a troponina cardíaca I e as troponinas cardíacas C e T. [76]
Estudos in vitro revelaram que a proteína variante TNNI3 – Arg192His sensibiliza os filamentos finos ao cálcio. [77–79]
65 Foi desenvolvido estudo in vivo através de ratinhos transgénicos expressando TNNI3-Arg193His. As imagens de ecografia cardíaca mostraram alterações no relaxamento do miocárdio.
Não foi evidenciada hipertrofia ou dilatação ventricular significativa nas amostras de tecido cardíaco recolhidas. [112]
70 Estudo in vitro revelou que a proteína variante está associada a uma redução significativa nas interações funcionais com a troponina cardíaca C.[76]
72 Estudo in vitro mostrou que a proteína variante conduz a um aumento da sensibilidade da contração muscular cardíaca ao cálcio. [80]
Estudos in vitro revelaram que as fibras constituídas por proteínas variantes apresentam um aumento tanto da força máxima dependente de cálcio, como da atividade ATPase, em
73
comparação com wild-type. Foi ainda evidenciado um aumento da sensibilidade ao cálcio, tanto para o desenvolvimento da força como da atividade ATP ase. [79, 81, 82]
74 Múltiplos estudos funcionais revelaram que a proteína variante está associada a um aumento da afinidade dos filamentos finos para o cálcio. [78, 83–89]
Foi realizado um estudo funcional em que proteínas TNNT variantes foram incorporadas em fibras de tecido muscular cardíaco suíno, em conjunto com troponinas cardíacas I e T wild-
77 type. O desenvolvimento de força isométrica dependente de cálcio nestas fibras foi medido, tendo-se verificado que a proteína variante TNNT-Ser179Phe altera as propriedades
contrácteis das fibras cardíacas e aumenta a sensibilidade do desenvolvimento da força ao cálcio em comparação com as proteínas wild-type..[90]
Estudos experimentais mostraram que cardiomiócitos desenvolvidos a partir de células estaminais pluripotentes, provenientes de doentes da mesma família com Miocardiopatia Dilatada
(MCD) e portadores da variante, exibem alteração da cinética do cálcio, diminuição da contractilidade e proteína sarcomérica α-actinina anormal, em comparação com cardiomiócitos de
78
indivíduos controlo pertencentes à mesma família.
Estudo in vitro revelou que a proteína variante está associada a alteração da cinética do cálcio nos filamentos finos. [91]
Múltiplos estudos funcionais sugerem que a proteína variante afeta a dinâmica da contractilidade do músculo cardíaco, diminuindo a sensibilidade da activação ao cálcio, reduzindo a
79
afinidade da ligação do complexo troponina ao cálcio, e/ou aumentando o ratio de dissociação do cálcio dos filamentos finos. [77, 88, 91–95]
Foi realizado um estudo funcional em que proteínas TNNT variantes foram incorporadas em fibras de tecido muscular cardíaco suíno, em conjunto com troponinas cardíacas I e T wild-
80 type. O desenvolvimento de força isométrica dependente de cálcio nestas fibras foi medido, tendo-se verificado que a proteína variante TNNT-Arg130Cys altera as propriedades
contrácteis das fibras cardíacas e aumenta a sensibilidade do desenvolvimento da força ao cálcio, em comparação com as proteínas wild-type.(56)
Estudos funcionais demonstraram que várias substituições entre os codões 91 e 110 da proteína TNNT2, incluindo a Arg92Gln, comprometem as funções da troponina T dependentes da
83
tropomiosina. Estudos experimentais revelaram ainda que esta alteração resulta num aumento da sensibilidade do desenvolvimento de força ao cálcio. [77, 98, 99, 182, 183]
Estudo funcional in vitro revelou que a proteína variante reduz a interação entre TNNT e a tropomiosina, alterando a relação do cálcio com os filamentos finos.[96–98]
84 Foi realizado um estudo funcional em que proteínas TNNT variantes foram incorporadas em fibras de tecido muscular cardíaco suíno, em conjunto com troponinas cardíacas I e T wild-
type. O desenvolvimento de força isométrica dependente de cálcio nestas fibras foi medido, tendo-se verificado que a proteína variante TNNT-Arg102Trp altera as propriedades
53
contrácteis das fibras cardíacas e aumenta a sensibilidade do desenvolvimento da força ao cálcio, em comparação com as proteínas wild-type.[90]
Estudo funcional in vivo no qual foi desenvolvido um modelo de ratinho transgénico TNNT-Arg102Trp revelou que a consequente proteína variante altera as propriedades dinâmicas e
bioquímicas da troponina T cardíaca e que estas alterações conduzem a activação precoce de vias de sinalização que regulam o crescimento das células musculares. Os autores concluem
que, em última instância, tal pode conduzir a remodeling cardiovascular patogénico. [59]
Troponinas T, I e C cardíacas humanas wild-type e troponina T variantes associadas à MCH (incluindo TNNT2- Ile79Asn) foram expressas por Eschrichiacoli, posteriormente purificadas
e incorporadas em miofibrilas cardíacas de coelhos. A sensibilidade da atividade ATPase ao cálcio das miofibrilas destas preparações foi medida, tendo-se verificado um aumento
86 associado à proteína variante TNNT-Ile79Asn. [99]
Foi ainda desenvolvido um estudo funcional in vivo em que a performance cardíaca de ratinhos transgénicos expressando TNNT – Ile 79Asn humana e TNNT – wild-type humana foi
comparada. Medições in vivo indicaram que a função sistólica de base é superior nos ratinhos expressando TNNT – Ile79Asn. [113, 114]
Estudos funcionais in vitro revelaram que a proteína variante está associada a um aumento da sensibilidade ao cálcio, bem como a uma diminuição da atividade ATPase, da velocidade
87 máxima de deslizamento dos filamentos e da tensão máxima dependente de cálcio. Foi ainda evidenciado que a proteína variante apresenta menor conteúdo α-helicoidal e estrutura mais
desorganizada que a wild-type. [100–103]
Estudo in vivo utilizando ratinhos transgénicos expressando TPM1-Asp175Asn no coração adulto revelou comprometimento tanto da contração como do relaxamento cardíacos. [104]
88 Múltiplos estudos in vitro demonstraram que a proteína variante induz alteração nos mecanismos de activação dos filamentos finos, com redução da afinidade da tropomiosina para a
actina.[100, 102, 104–109]
89 Estudo in vitro mostrou que a proteína variante tem um efeito inibitório major na função do sarcómero, em comparação com a proteína wild-type.[110]
54
Tabela 2.Descrição dos Estudos Familiares Utilizados como Fundamento de Patogenicidade das
Variantes Selecionadas
Variante
Nº
Número de Famílias e Indivíduos Estudados Nº de Famílias e Indivíduos Estudados
Nº
Estudados 134 indivíduos, pertencentes a 8 famílias

não relacionadas:[115–117] Estudados 18 indivíduos, pertencentes a 2 famílias não
1 65 G+; F+/ 2 G+; F-/ 67 G-; F- 4 relacionadas:[50]
A positividade do fenótipo refere-se a características clínicas 6 G+; F+/ 1 G+; F-/ 11 G+; F-
de MCH, defeitos do septo interventricular ou ventrículo
esquerdo não-compactado
Estudados 29 indivíduos, pertencentes a 2 famílias não Estudados 13 indivíduos, pertencentes a 2 famílias não
5 relacionadas:[118] 6 relacionadas:[118, 119]
9 G+; F+/ 6 G+; F-/ 14 G-; F- 5 G+; F+/ 3 G+; F-/ 5 G-; F-
Estudados 18 indivíduos, pertencentes a 2 famílias não

Estudados 9 indivíduos pertencentes à mesma família: [121]
8 relacionadas:[120][118] 12
5 G+; F+/ 2 G+; F-/ 2 G-; F-
9 G+; F+/ 1 G+; F-/ 8 G-; F-
Estudados 15 indivíduos, pertencentes a mesma Estudados 23 indivíduos, pertencentes a 2 famílias não

19 família:[121] 20 relacionadas:[50, 122]
5 G+; F+/ 2 G+; F-/ 8 G-; F- 7 G+; F+/ 5 G+; F-/ 11 G-; F-
Estudados 8 indivíduos, pertencentes à mesma família: Estudados 47 indivíduos, pertencentes a 3 famílias não
[123]
21 30 relacionadas: [121, 122]
3 G+; F+/ 1 G+; F-/ 4 G-; F- 13 G+; F+/ 9 G+; F-/ 25 G-; F-
Estudados 9 indivíduos, pertencentes à mesma família: Estudados 8 individuos, pertencentes à mesma família:
[121] [123]
32 33
5 G+; F+/ 2 G+; F-/ 2 G-; F- 3 G+; F+/ 1 G+; F-/ 4 G-; F-
Estudados 13 indivíduos, pertencentes à mesma Estudados 25 indivíduos, pertencentes a 3 famílias não

36 família: [125] 38 relacionadas: [124]
3 G+; F+/ 4 G+; F-/ 6 G-; F- 15 G+; F+/ 0 G+; F-/ 10 G-; F-

relacionadas: [126] Estudados 75 indivíduos, pertencentes a 7 famílias não
42 10 G+; F+/ 0 G+; F-/ 5 G-; F- 43 relacionadas: [127, 128]
A positividade do fenótipo refere-se a características clínicas 10 G+; F+/ 23 G+; F-/ 32 G-; F-
de MCH ou Miocardiopatia Dilatada (CMD).

48 família:[134] 49 relacionadas:[43, 129–133]
4 G+; F+/ 2 G+; F-/ 0 G-; F- 30 G+; F+/ 3 G+; F-/ 38 G-; F-
52 família:[135] 53 relacionadas:[44, 136, 137]
22 G+; F+/ 17 G+; F-/ 106 G-; F- 18 G+; F+/ 8 G+; F-/ 51 G-; F-

Estudados 34 indivíduos, pertencetes à mesma família: [73]
59 relacionadas:[138, 139] 61
13 G+; F+/ 0 G+; F-/ 21 G-; F-
4 G+; F+/ 3 G+; F-/ 5 G-; F-
55
62 relacionadas:[140] 63 relacionadas: [141, 142]
8 G+; F+/ 0 G+; F-/ 3 G-; F- 10 G+; F+/ 15 G+; F-/ 31 G-; F-
66 relacionadas:[143–145] 70 relacionadas: [76, 144, 146]
12 G+; F+/ 9 G+; F-/ 19 G-; F- 9 G+; F+/ 14 G+; F-/ 7 G-; F-

Estudados 22 indivíduos, pertencentes a 4 famílias não relacionadas:[45, 144, 147, 148]
71 relacionadas:[144, 149] 73 14 G+; F+/ 17 G+; F-/ 16 G-; F-
A positividade do fenótipo refere-se a características clínicas de
7 G+; F+/ 8 G+; F-/ 7 G-; F- MCH ou Cardiomiopatia Restritiva (CMR)

74 família:[150] 75 relacionadas:[144, 149]
4 G+; F+/ 0 G+; F-/ 8 G-; F- 4 G+; F+/ 6 G+; F-/ 8 G-; F-
Estudados 8 indivíduos, pertencentes à mesma família: Estudados 39 indivíduos, pertencentes a 3 famílias não
[153]
77 78 relacionadas:[151, 152]
3 G+; F+/ 4 G+; F-/ 1 G-; F- 22 G+; F+/ 0 G+; F-/ 17 G-; F-

79 família: [154] 84 relacionadas: [155–157]
14 G+; F+/ 6 G+; F-/ 43 G-; F- 18 G+; F+/ 16 G+; F-/ 29 G-; F-
Estudados 19 indivíduos, pertencentes à mesma família:

[158]
Estudados 6 indivíduos, pertencentes à mesma
85 família:[159] 86 9 G+; F+/ 0 G+; F-/ 10 G-; F-
3 G+; F+/ 0 G+; F-/ 3 G-; F- A positividade do fenótipo refere-se a características clínicas de
MCH, CMD ou CMR.

87 família: [103] 88 relacionadas: [160–162]
14 G+; F+/ 0 G+; F-/ 42 G-; F- 55 G+; F+/ 5 G+; F-/ 39 G-; F-
Estudados 39 indivíduos, pertencentes à mesma

89 família: [110]
15 G+; F+/ 4 G+; F-/ 10 G-; F-
G+, Genótipo positivo, isto é, portadores da variante genética em causa; G-, Genótipo negativo, isto é, não expressam a
variante em causa. F+, Fenótipo positivo para MCH (e/ou outra cardiomiopatia quando especificado na tabela). F- Fenótipo
negative, isto é, sem características clínicas de MCH.
56

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Variantes genéticas associadas à

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A Miocardiopatia Hipertrófica é definida por um aumento da espessura do ventrículo

A partir da base de dados “ClinVar”, foram selecionadas variantes de genes do

Os resultados obtidos demonstram que a interpretação clínica das variantes genéticas

Palavras-Chave: Miocardiopatia Hipertrófica; Sequenciação de Nova Geração;

Hypertrophic cardiomyopathy is defined by the presence of increased left ventricular

Sarcomere genetic variants previously associated with HCM and classified as

Key Words: Hypertrophic Cardiomyopathy; Next-generation Sequencing; Genetic

ACGS – “Association for Clinical Genetic Science”

ACMG – “American College of Medical Genetics and Genomics”

ACTC1 – Alfa-actina cardíaca

ExAC – “Exome Agregation Consortium”

ILK – Cinase ligada à integrina

LMNA – Laminina A/C

MCH – Miocardiopatia Hipertrófica

MYBPC3 – Proteína C que liga a miosina

MYH6 – Cadeia pesada da miosina 6

MYH7 – Isoforma beta da cadeia pesada da miosina

MYL2 – Cadeia leve reguladora da miosina

MYL3 – Cadeia leve essencial da miosina

MYLK2 – Cinase da cadeia leve da miosina 2

NGS – Next Generation Sequencing

PRKAG2 – Subunidade-gama da AMP cinase 2

TNNC1 – Troponina C cardíaca

TNNI3 – Troponina I cardíaca

TNNT2 – Troponina T cardíaca

Material e Métodos ........................................................................................................... 4

Seleção de variantes associadas à MCH ....................................................................... 4

Revisão da Literatura .................................................................................................... 4

Aplicação dos critérios de classificação propostos pelo ACMG .................................. 4

Classificação de acordo com as linhas orientadoras do ACMG ................................... 6

Variantes Patogénicas ............................................................................................... 9

Variantes Benignas .................................................................................................. 15

A MCH é a doença cardiovascular hereditária mais comum e afeta indivíduos de

Caracteriza-se por um aumento da espessura

A maioria dos doentes são assintomáticos, podendo, contudo, apresentar manifestações

O diagnóstico é estabelecido pela identificação de um aumento da espessura do

Recomenda-se o aconselhamento genético a todos os indivíduos com a doença e, se

A NGS permite determinar num único ensaio a sequência de moléculas de ácido

Contudo, analisar um grande número de genes conduz à identificação de muitas

O presente trabalho teve como objetivo rever a classificação em termos de significado

Seleção de variantes associadas à MCH

As variantes a analisar foram selecionadas a partir da “ClinVar”

Todos os artigos publicados na base “PubMed”

Aplicação dos critérios de classificação propostos pelo ACMG

Os critérios de classificação de variantes publicados pelo ACMG em 2015 e

As variantes selecionadas foram analisadas por diferentes tipos de ferramentas

Classificação de acordo com as linhas orientadoras do ACMG

Atendendo à evidência de patogenicidade / benignidade transmitida pelos diferentes

- Estudos familiares que demonstram a co-segregação da variante e da doença entre os

Frequência alélica máxima expectável na população = prevalência × contribuição

A prevalência da MCH na população geral é estimada em cerca de 1 para 500. Estudos

A avaliação do número de variantes missense benignas associadas a determinado gene

Por fim, as variantes foram classificadas em pathogenic, likely pathogenic, benign,

Tabela 1. Regras para Combinação de Critérios de Classificação de Variantes

Figura 2. Variantes Patogénicas. Distribuição das variantes previamente classificadas como