Cultivo in Vitro de Plantas

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Cultivo in vitro de plantas

4ª edição
L. Pedro Barrueto Cid

Editor Técnico
Embrapa
Brasília, DF
2015
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Parque Estação Biológica
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Biotecnologia
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editoração eletrônica e tratamento de imagens: Júlio César da Silva Delfino,
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book: Francisco Regis Ferreira Lopes, Alexandre Abrantes Cotta de Mello,
Leandro Sousa Fazio Capa: Carlos Eduardo Felice Barbeiro Ilustração da capa:
zigóticos de café tratados com tetrazólio – L. Pedro Barrueto Cid Tradução dos
capítulos 3 e 5: L. Pedro Barrue to Cid
1ª edição
1ª impressão (2010): 1.000 exemplares
2ª edição
E-book (2012)
3ª edição
1ª impressão (2014): 1.000 exemplares
4ª edição
E-book (2015)
Todos os direitos reservados.
Para uso exclusivo de #NOME#. A reprodução não autorizada desta publicação,
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Embrapa Informação Tecnológica
Cultivo in vitro de plantas / L. Pedro Barrueto Cid, editor técnico. – 4. ed. –

Brasília, DF : Embrapa, 2015.
E-book. : il. color.
E-book, no formato ePub, convertido do livro impresso.

SBN 978-85-7035-406-8
1. Cultura in vitro. 2. Cultura de tecido. 3. Micropropagação. I. Cid, L. Pedro

Barrueto. II. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
CDD 581.0724
© Embrapa 2015
Autores
Ana Cristina Miranda Brasileiro Engenheira-florestal, Ph.D.
em Biologia Molecular e Celular Vegetal, pesquisadora da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
Don J. Durzan
Fisiólogo de plantas, Ph.D. em Metabolismo do Nitrogênio, professor da
University of California, Davis, Califórnia, EUA Eurico Eduardo Pinto de Lemos
Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Biotecnologia, professor da Universidade
Federal de Alagoas, Maceió, AL
Francisco J. L. Aragão
Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Biologia Molecular e Celular, pesquisador da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
Frederico Henrique da Silva Costa Engenheiro-agrônomo,

doutor em Agronomia, professor da Universidade Federal do
Acre (Ufac), Rio Branco, AC
João Batista Teixeira

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Biologia de Plantas, pesquisador da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
Jonny Everson Scherwinski-Pereira Engenheiro-agrônomo,

Ph.D. em Agronomia, pesquisador da Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

Biólogo, Ph.D. em Ciências, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Brasília, DF
Leonardo Soriano
Engenheiro-florestal, mestre em Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Piracicaba,
SP
Maria Cristina Rocha Cordeiro

Biomédica, Ph.D. em Ciências, pesquisadora da Embrapa Cerrados, Brasília, DF
Miguel Jordan Zimmermann

Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Agronomia, professor da Escola de
Biotecnologia, Universidad Mayor, Santiago, Chile
Apresentação
A cultura de tecidos hoje no Brasil é uma realidade não
apenas em muitos laboratórios acadêmicos, senão
também em empresas privadas, bem articuladas
comercialmente e relacionadas com culturas de
importância econômica, tais como: cana-de-açúcar, flores,
eucaliptos e pinheiros.
A literatura internacional sobre a matéria informa-nos de
que a cultura de tecidos de planta, ou micropropagação,
movimenta bilhões de dólares em todo o mundo,
notadamente na Alemanha, na Holanda, na Inglaterra, na
Índia, nos EUA, e em outros países. Assim, esse método
tem aquecido os mercados e vem promovendo a criação
de novos laboratórios, empregos, tecnologias e patentes.
Além disso, a micropropagação tem fortalecido novos
paradigmas por meio do uso da biologia molecular, com
vistas na obtenção de plantas mais resistentes,
produtivas, aromáticas ou coloridas, dentro de uma visão
mais moderna e dinâmica do agronegócio internacional.
Ademais, no mundo acadêmico, a cultura de tecidos,
desde muito tempo, tem dado suporte a muitas e
diferentes linhas de pesquisa envolvendo inúmeras teses
de pós-graduação nas áreas da genética, da fisiologia de
plantas, da fitopatologia, da fitotecnia, etc. Mais tarde,
esses conhecimentos constituíram o arcabouço de muitos
avanços tecnológicos, como a descoberta das citocininas,
dos protoplastos, dos haploides, a limpeza clonal, o
aprimoramento de meios nutritivos, o uso de biorreatores,
os protocolos de micropropagação, etc.
No Brasil, a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
apresenta-se não somente como um centro de referência
nacional e internacional nessa área, mas também como
um centro pioneiro com foco na biotecnologia agrária e
florestal. Por isso, ela não poderia deixar de patrocinar um
livro a respeito desse assunto, que envolve os aspectos
mais importantes da cultura de tecidos. Para tanto, foram
convidados especialistas destacados dessa área do
conhecimento.
Todos os participantes desta obra esperam que este livro
tenha boa acolhida entre os profissionais e os estudantes
dessa disciplina, o que representará um grande estímulo
para nós, bem como uma grande recompensa pelo
esforço desenvolvido.

Editor Técnico
Prefácio
Satisfaz-nos, profundamente, lançar a segunda edição do
livro Cultivo in vitro de plantas, em função da boa
acolhida que teve a primeira edição e seu rápido
esgotamento de livraria, fato este que ultrapassou nossas
expectativas de demanda.
Nossa obra foi um esforço didático e profissional em prol
da informação simples e efetiva para estudantes e
professores ligados à área de biotecnologia botânica e
agronômica deste País-continente, que ainda tem fronteira
agrícola por desbravar.
Já estamos iniciando o terceiro milênio, e, cada vez mais,
a imprensa inunda nossos ouvidos com conceitos como
economia verde, desenvolvimento sustentável, clonagem
de plantas, resistência a pragas e enfermidades, a fim de
cobrar inovação, produtividade e eficiência no âmbito do
agronegócio nacional, para produzir e exportar alimentos
com valor agregado, questão esta que a Embrapa não
perde de vista.
Dessa forma, e sem pretender esgotar o tema, nosso livro
apresenta uma variedade de tecnologias na área
biotecnológica de plantas, inclusive com um capítulo novo
sobre protoplastos, justamente para um melhor aporte a
nossos leitores interessados.
Finalmente, esperamos que esta edição, que a Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia tão apropriadamente
ajudou a germinar, seja tão bem-vinda como a anterior,
para que possa fortalecer o espírito de todos os
participantes desta obra, no sentido de que o esforço
realizado não foi em vão.
Editor Técnico
CAPÍTULO 1
Explante, meio nutritivo,

luz e temperatura
Do ponto de vista biológico, os organismos vivos reprodu‐

zem-se sexual ou assexuadamente. No primeiro caso, a
variabilidade genética e a evolução são favorecidas; no
segundo, isso não acontece.
Nas plantas superiores, a reprodução assexuada pode
ocorrer por meio de vários processos, tais como: o
enraizamento de estacas, a enxertia, a apomixia e a
micropropagação.
Do ponto de vista comercial, é interessante que cultivares
de importância agronômica sejam propagadas
assexuadamente, pois esse tipo de propagação resulta em
plantas uniformes quanto ao seu fenótipo (crescimento,
floração, frutificação, etc.). Isso decorre do fato de que
essas plantas são altamente selecionadas para
características desejadas (alta produção, resistência a
doenças, etc).
Por via sexual, a conservação dessas características
poderia ser obtida por endogamia, ou seja, pelo
cruzamento entre indivíduos relacionados pela sua
ascendência ou com eles mesmos. Porém, nem todas as
plantas de importância agronômica podem cruzar-se por
meio da autofecundação, e, mesmo que isso fosse
possível, deve-se considerar o problema da depressão
endogâmica, ou seja, a perda de vigor, que resulta em
tamanho reduzido das plantas, albinismo, susceptibilidade
a doenças, etc. Ademais, ainda que as plantas possam
retrocruzar, muitas vezes carregam uma herança
indesejável que deve ser posteriormente retirada (VALOIS
et al., 1996). Por isso, a via clonal é uma alternativa para
que se fixem características de importância agronômica e
comercial, a partir do cruzamento entre híbridos
interespecíficos por meio da genética clássica. Contudo, é
sabido que o enraizamento de estacas via clonal, por
exemplo, apesar de ser uma importante ferramenta de
propagação assexuada, dificulta a produção em grandes
quantidades. Além disso, a capacidade de indução de
raízes adventícias, importante para o processo, diminui
com a idade da planta doadora de estacas.
A enxertia, por sua vez, é uma prática comercial realizada
em algumas culturas, tais como a seringueira, o limoeiro,
entre outros. No entanto, em nível comercial, essa técnica
é uma prática cara e laboriosa, além de oferecer risco de
incompatibilidade entre enxerto e porta-enxerto. Além
disso, existe a possibilidade de transmissão mecânica de
vírus, fato que ocorre, por exemplo, com o vírus fanleaf,
que, no caso da videira, é passado à planta pelo
nematoide Xiphinema index (BAVARESCO; WALKER,
1994). Por essas razões, o uso da enxertia é
desencorajado em muitos casos. Já a apomixia não deixa
de ser um modelo interessante do ponto de vista clonal;
no entanto, na prática, não há exemplos concretos a
propagar.
Assim, a micropropagação, ou propagação in vitro, mesmo
sendo uma prática dispendiosa em termos de mão de
obra, de laboratório e de equipamentos, oferece uma
melhor relação custo-benefício, pois permite produzir, em
escala comercial, material uniforme e selecionado, bem
como realizar pesquisas de apoio às diferentes áreas da
biologia, como a genética, a fitopatologia e a fisiologia
vegetal.
Notadamente, a micropropagação in vitro de plantas
anuais ou perenes possibilitou que houvesse avanços no
campo do melhoramento por meio da transformação de
plantas, ou seja, permitiu a ocorrência de rearranjos
genéticos no material vegetal, sob condições in vitro, os
quais, por meio exclusivo do melhoramento tradicional,
seriam muito demorados e caros. Assim, a cultura de
tecidos de plantas in vitro, como técnica, permite o
aumento da produção e causa menos danos ambientais,
por isso contribui para que os laboratórios e os países que
a adotam tenham mais vantagens competitivas. Em
países como a Alemanha, a Índia, a Holanda e os EUA,
entre outros, a cultura de tecidos aplicada à floricultura,
por exemplo, gera bilhões de dólares anualmente e,
consequentemente, aumenta a oferta de empregos, além
de gerar novas demandas por genótipos, rápida
multiplicação clonal, plantas livres de doenças e
independência de fatores sazonais (GOVIL; GUPTA, 1997;
WINKELMANN; GEIER, 2006).
A micropropagação requer a análise de alguns
parâmetros, tais como explante, assepsia, meio nutritivo,
etc., os quais são importantes na compreensão do
trabalho in vitro.
Explante
A cultura de tecidos de plantas é um termo que exprime o
conceito de que uma ampla gama de tipos de tecidos da
planta pode ser cultivada, sob condições assépticas e in
vitro, visando micropropagação, melhoramento,
armazenamento ou limpeza clonal. A micropropagação é
um termo usado exclusivamente para referir-se à
propagação in vitro a partir de alguma parte específica da
planta – chamada explante –, baseada na capacidade
morfogenética e totipotencial das células (VASIL;
HILDEBRANDT, 1965).
Qualquer parte separada da planta destinada ao uso in
vitro denomina-se explante. A lista de possíveis explantes
é longa e variada, e os seguintes exemplos podem ser
citados: fragmentos de raízes, hipocótilos, epicótilos,
cotilédones, flores e folhas. Além desses, grãos de pólen,
embriões, óvulos, nós, gemas axilares ou apicais também
podem ser usados como explantes.
A escolha do explante poderá ser influenciada por vários
fatores, tais como: disponibilidade de material, nível de
contaminação, juvenilidade do tecido e estação do ano.
Nem todos os explantes reagem da mesma forma a uma
determinada condição in vitro. Dessa forma, em
Saussurea obvallata (planta medicinal e ornamental),
verificou-se que os explantes foliares reagiram mais
satisfatoriamente que raízes, hipocótilo e cotilédones, em
termos de indução de calos e de organogênese (DHAR;
JOSHI, 2005).
Os requerimentos nutricionais também poderão variar
conforme o explante. Assim, pólen, embriões, bulbilhos,
entre outros, poderão ter suas próprias exigências. Da
mesma forma, o nível morfológico do explante também
poderá influir nesse processo, já que, se o material inicial
for um fragmento foliar, para virar calo, deverá
desdiferenciar-se. Uma vez na forma de calo, esse
fragmento deverá rediferenciar-se produzindo embriões
somáticos ou gemas adventícias. Tudo isso ocorre de
acordo com requerimentos nutritivos e hormonais
particulares, seja adicionando alguns ingredientes seja
reduzindo outros, pois a morfogênese, em um caso ou em
outro, passará de células vacuoladas parenquimatosas do
calo para células mais totipotentes ou embriogênicas,
com núcleo proeminente, denso citoplasma, pequenos
vacúolos e intensa síntese de RNA. Esse aspecto
nutricional será abordado um pouco mais adiante.
A viabilidade do explante também é um aspecto vital a
ser considerado, já que muitos embriões, especialmente
de sementes recalcitrantes (da seringueira, do café, etc.),
podem estar em condições não viáveis para seu uso in
vitro. Nesse caso, o cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC),
ou simplesmente tetrazólio, é usado como auxiliar para
detectar rapidamente a viabilidade do material. O
tetrazólio produz uma coloração avermelhada quando o
tecido está viável. Notadamente, essa coloração é muito
nítida no ápice radicular e apical dos embriões. Em uma
semente do tamanho do feijão, não é necessária a
utilização de lupa para que se observe a coloração
vermelha que demonstra viabilidade. No entanto, em
sementes de orquídea e de eucalipto, em vista de seu
pequeno tamanho, o uso de microscópio estereoscópico
faz-se necessário (Figura 1).
Figura 1. Sementes de orquídea (Oncidium phimatochilum)
submetidas ao teste do tetrazólio (0,1% por 24 horas em
temperatura de laboratório) para avaliação de sua viabilidade após
algum tempo de armazenamento em refrigerador.
Foto: L. Pedro Barrueto Cid
O trabalho com embriões tem dado origem a uma linha

importante de pesquisa, como é o caso do resgate de
embriões imaturos derivados de cruzamentos
interespecifícos, com o objetivo de obter genótipos novos
e superiores (LIU et al., 2007).
Assepsia
Historicamente, este conceito foi desenvolvido a partir do
século 19 em trabalhos pioneiros do médico húngaro
Ignácio Semmelweis, do inglês Joseph Lister e do francês
Louis Pasteur. Antisséptico é qualquer substância ou
agente capaz de inibir ou combater microrganismos ou
patógenos. Imbuído dessa ideia, Semmelweis usou as
propriedades antissépticas do cloro (água de cloro) como
profilático, para reduzir a morte nos hospitais por febre
puerperal que, na ocasião, alcançava índices alarmantes,
e preconizou a lavação das mãos e dos instrumentos com
esse tipo de composto. Já Lister e Pasteur envolveram-se
mais com a ideia global de microrganismos do ar como
causadores de infecções e de doenças. Em termos
profiláticos, Lister usou o ácidocarbólico, e Pasteur
desenvolveu a técnica que ficou conhecida como
pasteurização. Mais tarde, em 1878, Kock, na Alemanha,
reconheceu a utilidade do vapor quente para esterilizar
instrumentos.
A desinfestação, ou seja, a remoção de contaminantes
existentes na superfície do explante oriundo de material
de campo ou de casa de vegetação, é um passo inevitável
na cultura in vitro. Pode ser alta ou baixa, controlável ou
não, constituída por fungos ou bactérias. As
contaminações por vírus já são mais difíceis de
diagnosticar.
No geral, o procedimento da assepsia começa com a
limpeza da câmara de fluxo laminar com álcool 70%. Após
a imersão em álcool 95%, o bisturi e as pinças que forem
utilizados em processo de excisão devem ser flambados.
Os discos de papel-filtro e as placas de Petri de vidro,
assim como a vidraria em geral, precisam ser esterilizados
em autoclave por 20 minutos, a 121 ºC e em pressão de
uma atmosfera.
A assepsia dos explantes é frequentemente realizada por
meio de alvejantes comerciais à base de cloro, embora
diferentes substâncias possam ser utilizadas para essa
finalidade. O teor de cloro ativo desses alvejantes varia de
2,0% a 2,5% e, geralmente, sua fonte é o hipoclorito de
sódio (NaOCl), embora incluam também hidróxido e
carbonato de sódio, sem especificar sua concentração, o
que é uma limitação, ainda que não crítica. O NaOCl
poderá ser também encontrado em uma formulação mais
concentrada (10% a 12%), porém com menos outros
produtos misturados. Nesse caso, dada a alta
concentração, o produto deverá ser usado numa forma
mais diluída. Outra formulação comercial para a assepsia
dos explantes é o hipoclorito de cálcio (CaOCl2) a 7%
(p/v), contudo, nesse caso, é necessário previamente
filtrar o produto.
Em sua aplicação prática, o delineamento experimental do
uso do hipoclorito pode ser simples e reduzido a uma
concentração em que há vários tempos de imersão, como
por exemplo, 0,0; 5,0; 10; 15; 20 minutos, etc. É
conveniente que, durante esse tempo, os explantes
fiquem sob agitação e que o hipoclorito contenha também
algumas gotas de Tween 20 para facilitar a ação
superficial do desinfetante. Depois desse tratamento, os
explantes devem ser lavados com água esterilizada para
que o hipoclorito residual seja removido.
Mesmo tomando todas as providências de uma assepsia
rotineira, às vezes não é possível contornar
completamente a contaminação por esta ter uma base
endógena (Figura 2).
Figura 2. Estacas de café oriundas de casa de vegetação,

submetidas à assepsia com hipoclorito de sódio e colocadas para
brotar em vermiculita, em condições de laboratório. Durante o
período, as estacas foram cobertas com saco plástico transparente e
o substrato umedecido periodicamente. Apesar da assepsia, as
estacas foram contaminadas. Enquanto a estaca está verde, a
aparição de fungo é retardada, porém, uma vez marrom, o fungo
alastra-se rapidamente na estaca. Trata-se provavelmente de uma
contaminação de origem endógena.
Em geral, por serem oxidantes enérgicos, além de

facilmente removíveis pela água de lavagem, os
hipocloritos são bastante utilizados na assepsia superficial
dos explantes. Contudo, durante sua manipulação, é
necessário evitar seu contato com a pele ou sua inalação,
para diminuir o risco de irritações nas mãos ou na mucosa
bronquial. Além de sua efetividade como agentes
desinfetantes, os hipocloritos têm sido citados como
estimulantes da germinação, em virtude de sua
capacidade de estimular a atividade da α-amilase, ou,
ainda, pelo fato de promoverem a quebra da dormência
(KANEKO; MOROHASHI, 2003; MIYOSHI; MII, 1998).
O cloreto de mercúrio (HgCl2) também é um desinfetante
enérgico e tem sido utilizado com sucesso na assepsia
externa de explantes oriundos do campo. É solúvel em
água e, normalmente, usado na concentração de 0,1%
(p/v), por um ou dois minutos. Depois desse tratamento,
os explantes devem ser lavados com água esterilizada
abundante antes de serem inoculados no meio nutritivo.
Mesmo assim, em alguns casos, como em embriões de
café, por exemplo, esse produto mostrou-se tóxico, já que,
logo após o tratamento ou depois de inoculados no meio
nutritivo, tornaram-se marrons, o que evidencia intensa
oxidação. Um alerta importante sobre esse produto é o
fato de ele ser extremamente tóxico para o ser humano,
por isso precauções devem ser tomadas a fim de evitar
contato do produto com a pele. Além disso, seu descarte
pela pia nunca deve ser feito no laboratório.
No combate à contaminação endógena dos explantes,
procedimentos alternativos na cultura de tecidos também
têm sido utilizados, como, por exemplo, o uso de água
quente em bulbos e em gemas axilares de plantas
lenhosas com resultados bastante importantes (LANGENS-
GERRITS et al., 1998). Em outros casos, a assepsia
convencional à base de cloro não apresentou resultados
satisfatórios, de forma que foi necessário lançar mão de
fungicidas e de antibióticos. Nesse caso, os rizomas foram
lavados previamente com água de torneira e depois
submetidos a diferentes concentrações e marcas de
fungicidas. Em seguida, ficaram sob agitação por um
período de até 48 horas e, depois, foram transferidos para
meios de cultura apropriados. Semelhante tratamento
feito também com antibióticos permitiu contornar
satisfatoriamente a contaminação (KRITZINGER et al.,
1998). Com relação ao fungicida Benlate, a experiência
prática também tem sido satisfatória. Por exemplo,
quando nós de mandioca (Manihot esculenta Crantz)
colhidos no campo foram tratados primeiramente com
hipoclorito de sódio 2,0% – depois com Benlate e Claforam
0,1% por 30 minutos – e, em seguida, foram inoculados
em meio de cultura, a contaminação dos explantes foi
reduzida.
O uso do Claforam (cefotaxima sódica), um antibiótico de
amplo espectro, tem mostrado bons resultados, além de
apresentar como vantagem adicional o fato de ser mais
específico para o metabolismo da bactéria do que da
planta. Assim, observou-se que a quantidade de 100 ppm
desse antibiótico foi eficaz para contornar a contaminação
bacteriana e não afetou a germinação nem o crescimento
de plântulas de aipo, de berinjela, de cebola e de tomate
(BARRUETO CID; DURZAN, 2003).
A literatura a respeito de cultura de tecidos oferece um
amplo leque de antibióticos, tais como: sulfato de
estreptomicina, timetina, canamicina, norfloxacina,
ciprofloxacino, carbelicilina, rifampicina, tetraciclinas, etc.
Estes podem ser usados separadamente ou em
combinações. O problema principal a respeito desses
antibióticos é a dúvida quanto ao fato de eles serem ou
não sistêmicos no tecido da planta. Algumas experiências
realizadas com sulfato de estreptomicina indicam que eles
não são sistêmicos (ROMEIRO, 1995), portanto testes
experimentais são necessários para delimitar melhor sua
faixa de ação na cultura de tecidos.
Embora a contaminação bacteriana seja frequentemente
encontrada nas culturas in vitro, é necessário ter certa
precaução para não confundi-la com leveduras, pois, em
ambas, o formato da colônia é muito parecido (Figura 3).
Figura 3. Leveduras (Saccharomyces boulardii) visualizadas em uma
placa de Petri. Por se tratar de um fungo imperfeito, a colônia é mais
parecida com uma colônia de bactérias do que com a de um fungo
filamentoso, podendo, então, ser confundida com uma contaminação
bacteriana.
A contaminação na cultura de tecidos pode ser o maior

obstáculo para o estabelecimento e a propagação de
clones, por isso existe um verdadeiro arsenal de
substâncias para enfrentar o problema. Por exemplo, o
Plant Preservative Mixture (PPM) é um biocida também
listado nesse arsenal. Ele é estável em alta temperatura,
no entanto possui um espectro amplo de componentes
(metilisotiazolinona, cloreto de magnésio, nitrato de
magnésio, benzoato de sódio e sorbato de potássio) que
podem afetar o ciclo de Krebs e o transporte da cadeia de
elétrons. Assim, a dosagem e a espécie usadas são
questões muito importantes que precisam ser
consideradas (COMPTON; KOCH, 2001).
Outro problema relacionado com o explante é a oxidação
fenólica. No entanto, esse item será abordado mais
adiante.
Meio nutritivo
A técnica da micropropagação ocupa um lugar chave na
chamada “segunda revolução verde”, na qual o rearranjo
gênico manual (DNA recombinante) está sendo usado
para melhorar a qualidade dos produtos agrícolas.
Nessa perspectiva, os meios nutritivos e a sua
composição operam o “milagre” da vida, ou seja, a
conversão dos explantes em plântulas e das plântulas em
mudas, as quais têm o caráter clonal embutido em sua
natureza e, por isso, possuem caráter de genótipo
superior. São muitos os fatores que estão envolvidos em
um protocolo eficiente de regeneração: tipo de meio
básico de cultura, seguido do suplemento de reguladores
de crescimento, concentração de sacarose, iluminação,
explante, etc. (ZHANG et al., 2003). Se o meio nutritivo
falhar, ou não for adequado em virtude de alguns de seus
ingredientes, a obtenção de clones falha. Portanto, o
conhecimento a respeito do meio nutritivo é da máxima
importância.
Os ingredientes tradicionais de um meio nutritivo são:
compostos inorgânicos, orgânicos, inertes e complexas
substâncias naturais.
Os sais inorgânicos proveem os macronutrientes (cálcio,
magnésio, enxofre, potássio, fósforo e nitrogênio) e os
micronutrientes (zinco, ferro, cobre, manganês, cloro,
molibdênio e boro). Outros elementos, como selênio,
níquel e silício, não têm requerimento universal entre as
plantas; por isso, não são considerados essenciais, ou
seja, na sua ausência, as plantas podem crescer e
desenvolver-se normalmente.
As plantas são concentradoras naturais de minerais
(cálcio, fósforo, potássio, ferro, etc.) nos seus tecidos,
especialmente em seus frutos, sementes e bulbos. No
caso do selênio, por exemplo, existem plantas indicadoras
desse elemento (Astragalus pectinatus), porque crescem
em lugares em que a concentração desse elemento no
solo é muito alta, como é o caso de algumas regiões
áridas ou semiáridas (STADTMAN, 1974).
Em geral, as plantas retiram do solo altas concentrações
de elementos essenciais, por isso a agricultura requer
altas doses de adubo. De igual modo, a cultura de tecidos
necessita incluir tais elementos no meio nutritivo. No caso
do bulbo da cebola, por exemplo, a quantidade de
macroelementos e de microelementos extraídos do solo é
ilustrativa. As quantidades de macroelementos extraídos
são: 69,7 kg ha-1 de N; 14,50 kg ha-1 de P; 57,09 kg ha-1
de K; 24,67 kg ha-1 de Ca; 4,47 kg ha-1 de Mg. Por sua
vez, os microelementos são: 749,23 g ha-1 de Fe; 265,76 g
ha-1 de Zn; 150,26 g ha-1 de B; 30,18 g ha-1 de Cu
(VIDIGAL et al., 2002).
A água também forma parte do grupo de inorgânicos, e
não poderia ser diferente já que, como solvente universal,
por ter caráter bipolar, ela é indispensável para dissolver
os sais e formar uma solução. É interessante que, apesar
de a água ser um dipolo, não é uma substância iônica por
excelência, visto que se dissocia muito pouco: 1 x 10-7 M.
Ou seja, em cada 10 milhões de moléculas de água, uma
está ionizada a 25 oC. No entanto,
pH = - log [ H+] ⇒ - log (1x 10-7)
demonstra que o pH da água pura, em teoria, é 7 (pH =
7), portanto é neutra. Quando se trata de cultura de
tecidos, a água usada não deve ser retirada diretamente
da torneira, porque esta contém muitos sais. Em vez
disso, deve-se utilizar água destilada, ou bidestilada, ou
ainda água deionizada (ultrapura). São necessários alguns
cuidados no que diz respeito ao seu armazenamento, para
evitar que ela não reaja com as paredes do container,
portanto esses recipientes devem ser de boa qualidade, e
recipientes de vidro ou plástico comum não devem ser
utilizados para essa finalidade. Nessa mesma linha de
raciocínio, deve-se evitar a carbonatação da água, o que
pode acontecer em recipientes abertos.
Existem várias formulações de meios nutritivos, entre os
quais estão: o meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962); o
WPM (LLOYD; McCOWN, 1980); o B5 (GAMBORG et al.,
1968); e o SP (BARRUETO CID, 2005). A escolha de um
desses meios, em geral, é baseada na literatura, na
experiência com cada espécie vegetal ou por tentativa e
erro. Ademais, quando se tratar de requerimentos
nutricionais específicos, vai depender da espécie ou do
explante. Por exemplo, a germinação do pólen in vitro
poderá incluir boro e cálcio em maior concentração,
enquanto a indução de brotos a partir de um calo poderá
exigir menos nitrato de amônia (PIERIK, 1987). Todavia,
nos testes de avaliação de tolerância de algum genótipo,
ambos poderão exigir a presença de NaCl ou de alumínio
(BASU et al., 1997; GANDONOU et al., 2006), o que não é
usual em qualquer meio nutritivo para planta.
A seguir, serão destacados os ingredientes dos meios
nutritivos mais importantes para a cultura de tecidos.
Sacarose
A presença deste tipo de composto é essencial para o
crescimento das plantas, visto que a fotossíntese da
planta, ou do explante, é limitada. A sacarose é um dos
carboidratos mais usados na preparação de meios
nutritivos. Sua concentração mais usual varia de 2% a 3%;
no entanto, ocasionalmente, ela pode ser usada em
concentrações maiores, de até 6%, como no caso de
embriões, na indução de bulbilhos de alho ou na
tuberização em raízes de mandioca. Além disso, a
sacarose é parcialmente hidrolisada na sua passagem
pela autoclave em glicose e em frutose. Nessa reação, o
pH, ou ainda o carvão ativado, que também é
frequentemente utilizado, podem ser importantes fatores,
e a glicose ou a frutose raramente são incluídas nos
meios. Na autoclave, o açúcar pode ainda experimentar a
reação de Maillard, que dá ao meio uma coloração
amarelo-escura, que varia de intensidade conforme a
magnitude do fenômeno. Trata-se de uma reação entre
açúcares e peptídeos, forçada pela alta temperatura. Do
ponto de vista químico, essa reação é diferente da
caramelização, que é outro exemplo de browning, em que
apenas açúcares participam. Essa reação é altamente
complexa, além de ser indesejável na cultura de tecidos.
Ela ocorre quando os açúcares são aquecidos acima de
seu ponto de fusão, o que leva à formação do 5-
hidroximetil-furfuralaldeído.
Vitaminas
As vitaminas usadas na cultura de tecidos pertencem ao
grupo das hidrossolúveis ou grupo B. Esse grupo é
constituído pelas seguintes vitaminas: B1 (tiamina), B2
(riboflavina), B6 (piridoxina), ácido pantotênico, ácido
nicotínico (niacina), ácido fólico, ácido ascórbico, biotina e
cobalamina. Desse elenco, a tiamina, o ácido nicotínico e
a piridoxina são encontrados na maioria dos meios
nutritivos. A biotina e o ácido pantotênico, no entanto, são
de uso mais restrito.
Em geral, as vitaminas atuam como um fator não proteico
dentro de enzimas, coenzimas, além de serem cruciais
para que essas enzimas possam catalisar reações
importantes dentro do metabolismo primário da célula.
Assim, por exemplo, a tiamina atua na descarboxilação de
α-cetoácidos; a piridoxina, na transferência de grupos
aminos; o ácido nicotínico, em reações de óxido-redução;
a biotina, na transferência de CO2; o ácido pantotênico, na
transferência de grupos acila, entre outros (LEHNINGER,
1988).
As vitaminas do grupo das lipossolúveis, tais como as
vitaminas A, D, E e K, não são usadas. Não se tem
conhecimento, por exemplo, de que a vitamina A participe
de alguma reação dentro da planta. Ela se origina a partir
dos betacarotenos, os quais são de origem isoprenoide,
isto é, derivados do isopreno, um hidrocarboneto com
cinco carbonos chamado também de 2-metilbutadieno.
As vitaminas E, K e D também são de origem isoprenoide,
porém a vitamina D possui um caráter mais esteroidal. Os
esteroides são moléculas complexas relacionadas ao
colesterol.
Pelo fato de as vitaminas serem sintetizadas pela planta,
fica a dúvida em relação a seu requerimento pelo
explante. Contudo, do ponto de vista fisiológico, não há
como saber se um explante em particular (raiz, hipocótilo,
etc) teria ou não a capacidade de sintetizar tiamina, ou se
essa capacidade ficaria restrita a outros órgãos que
poderiam exportar esse tipo de metabólito. Por exemplo, a
capacidade de produzir tiamina varia conforme as
espécies. Assim, nos frutos, a goiaba-vermelha e a
graviola podem ter muito mais tiamina do que no mamão
maduro e na manga. A inclusão de algumas vitaminas ao
meio nutritivo parte dos seguintes pressupostos: o
explante, por definição, é uma parte separada da planta;
e, na planta, a produção de vitaminas é diferente nos
órgãos. Portanto, a inclusão das vitaminas no meio
nutritivo torna-se necessária para nutrir o explante.
Inositol
Este composto orgânico de baixo peso molecular (180 g),
e solúvel em água, é rotineiramente usado na preparação
de meios. Em muitos casos, tem um efeito benéfico e não
se conhecem respostas inibitórias ou essenciais nas
concentrações utilizadas (50 mg L-1 a 100 mg L-1).
Hormônios
Os hormônios são biomoléculas produzidas pela planta,
cuja finalidade é induzir respostas fisiológicas, tais como
indução de raízes, indução de brotos, alongamento de
entrenós, etc.
A interação do hormônio com a membrana celular está
sob intensa pesquisa, cujo objetivo é conhecer melhor as
características do receptor (números de domínios, tipo de
inserção na membrana celular, relação com a proteína G,
ubiquitinação, etc.), bem como canalizar o estímulo ou o
sinal até o núcleo das células-alvo (WOODWARD; BARTEL,
2005).
Nas plantas, existem vários tipos de hormônios, tais
como: as auxinas, as citocininas, as giberélicas, o etileno,
o ácido abscísico e o ácido jasmônico.
De um modo geral, as moléculas que têm seu efeito
parecido com o dos hormônios são denominadas
reguladores de crescimento (RC). A diferença é que os
hormônios não são sintéticos, ou seja, são produzidos
pelas plantas. Incluem-se nos RC o Picloram, a
Benzilaminopurina, o TDZ, entre outros.
Os RCs e os hormônios atuam em baixíssimas
concentrações, na ordem de mg (miligramas) ou µM
(micromolares), isto é, 10-6 molar.
É oportuno frisar que:
1 molar = 1 mol L-1 = 1 M
1 milimolar = 0,001 mol L-1 = 1 mM
1 micromolar = 0,000001 mol L-1 = 1 µM
(Um mol de qualquer substância orgânica tem o mesmo número de moléculas
por volume.)
Na cultura de tecidos, as auxinas e as citocininas, em

formas naturais ou sintéticas (RC), fazem parte do grupo
de hormônios mais frequentemente usados. As giberélicas
são usadas ocasionalmente, enquanto o etileno e o ácido
abscísico são de uso muito raro.
Auxinas
As auxinas, em seu significado etimológico, exprimem a
ideia de crescimento, ou seja, desencadeiam vários
processos fisiológicos, entre os quais está a formação do
fruto (PANDOLFINI et al., 2007). Entre as auxinas
hormonais, o ácido 3-indolacético (AIA) é o mais
conhecido. Foi isolado pela primeira vez em 1934 na urina
de mulheres grávidas. Alguns anos depois, na mesma
década, foi isolado em leveduras e em culturas de
Rhizopus suinus. Em 1946, foi extraído de grãos de milho
imaturos e, posteriormente, de muitas outras plantas
(HOPKINS, 1999).
Na cultura de tecidos, as auxinas são frequentemente
usadas na indução de calos a partir de um explante e no
enraizamento a partir de brotos. São exemplos de
auxinas: o AIA (PM 175,2); o ácido indolbutírico (PM
203,2); o ácido naftalenoacético (PM 186,2); o 2,4-
diclorofenoxiacético (PM 221,0); e o Picloram ou ácido 4-
amino-3,5,6-tricloro-picolínico (PM 241,5). Alguns RCs têm
uma posição ambígua, pois atuam como auxina ou como
citocinina. Esse é o caso do Tidiazuron ou TDZ [1-fenil-3-
(1,2,3-tiadiazol-5-il) ureia].
A concentração usada depende da finalidade, que pode
ser, por exemplo, a indução de calo ou o enraizamento.
Em geral, na indução de calos, a concentração é maior,
porém isso também depende do tipo de composto usado.
Assim, o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e o
Picloram são mais potentes como auxina que o ácido 3-
indolacético (AIA) e o ácido naftalenoacético (ANA).
A indução de calos em alho foi alcançada por meio de
uma mistura de 2,4-D e de Picloram, na ordem de 5 µM
cada (BARRUETO CID et al., 1994). No entanto, em café, o
Picloram foi usado sozinho, na ordem de 4 µM (BARRUETO
CID et al., 2004). Para o enraizamento de brotos de
eucalipto, utilizaram-se 2,5 µM de ácido indolbutírico (AIB)
(BARRUETO CID, et al., 1999). Todavia, na indução de
calos, quando o carvão ativado estiver presente no meio
nutritivo básico, a concentração de auxina ainda é mais
elevada, podendo chegar a 100 mg L-1 (REYNOLDS;
MURASHIGE, 1979). Isso ocorre porque o carvão ativado
tem propriedades adsorventes (MOHAMED-YASSEEN,
2001).
As auxinas se comportam como ácidos fracos e não são
solúveis em água, por isso um aspecto importante em
relação a elas é a necessidade de que sejam dissolvidas
para serem incorporadas ao meio. Na prática, elas se
dissolvem bem em meio básico (KOH ou NaOH 0,1 N ou
1,0 N). É recomendável trabalhar com soluções estoques
guardadas no refrigerador e, a partir daí, usá-las para a
preparação do meio básico. Essas soluções estoques
devem manter-se livres de quaisquer impurezas, portanto
devem apresentar-se transparentes e límpidas. O TDZ é
um pouco refratário e, uma vez dissolvido, após alguns
dias, volta a cristalizar-se. Por isso, é recomendável
prepará-lo e, em seguida, estocá-lo em freezer,
mantendo-o congelado. O TDZ, embora seja um derivado
da ureia, também pode agir como citocinina.
Citocininas
As citocininas pertencem a um grupo de substâncias que
promovem a divisão celular, e sua origem está
relacionada com a adenina. Historicamente, o
descobrimento das citocininas está ligado ao DNA
autoclavado de esperma do arenque. As citocininas na
cultura de tecidos, em geral, são usadas para promover a
indução de brotos adventícios a partir de calos ou para
induzir multibrotação a partir de gemas axilares ou apicais
(BARRUETO CID et al., 1994); no entanto, podem inibir a
indução de raízes em plântulas. De um ponto de vista
mais fisiológico, elas inibem a senescência foliar e a
dominância apical.
Considerando-se o aspecto químico, as citocininas são
compostas por um anel adenílico e por uma cadeia lateral
isoprenoide, a qual se origina a partir do ácido
mevalônico, e, depois, converte para isopentenil
pirofosfato (∆3 -iPP). Este último, por sua vez, converte-se
em dimetilalil-pirofosfato (∆2 -iPP ou DMAP). Existem
outras derivações do ∆3 -iPP, a saber: o geranil pirofosfato,
que dá origem aos monoterpenos (mentol); o farnesil
pirofosfato, que origina os sesquiterpenos (ác. abscísico);
e o geranilgeranil pirofosfato, que origina os diterpenos
(como giberelinas) ou os tetraterpenos (como
carotenoides).
Entre as citocininas naturais, encontram-se a zeatina
(ZEA) e o isopentenil adenina (IPA) ({9R-5’P} IPA) (Figura
4). Entre as citocininas sintéticas, destacam-se a cinetina
(CIN) (6-furfurilaminopurina) e a 6-benzilaminopurina
(BAP). Nesse caso, a cadeia lateral isoprenoide foi
substituída por um anel cíclico de caráter furfural
(cinetina) ou benzênico (6-benzilaminopurina).
Figura 4. Estrutura química das citocininas. (A) ribotil-zeatina; (B)

ribotil-isopenteniladenina.
O sulfato de adenina é um composto púrico com efeito

benéfico sobre o crescimento e desenvolvimento de
embriões e de gemas adventícias e oferece a vantagem
de ser solúvel em água. Foi introduzido no campo da
cultura de tecidos no laboratório de Skoog, com o objetivo
de induzir a organogênese a partir de medula de fumo
(SKOOG; TSUI, 1948), ou a embriogênese somática (VIBHA
et al., 2009).
O TDZ também pode agir como citocinina, mas ele é um
derivado da ureia. Há relatos que informam a capacidade
do TDZ, como citocinina, para indução de brotos
adventícios (BARRUETO CID et al.,1997; THENGANE et al.,
2001).
As citocininas são bases fracas, isto é, podem ser
dissolvidas a partir de ácido clorídrico 1 N ou 0,1 N. Com a
aplicação de uma pequena quantidade desse ácido as
citocininas se dissolvem. Em seguida, completa-se o
volume com água. Após transferir a solução do béquer,
onde foi preparada, para um frasco de 50 mL, ela deve ser
guardada no refrigerador, não necessariamente no
freezer.
Giberelinas
As giberelinas (AG) são hormônios de natureza
diterpenoide (C-20), originadas do geranilgeranil
pirofosfato. Estão relacionadas, notadamente, com o
crescimento caulinar das plantas e com a produção de a-
amilase em sementes de gramíneas.
As giberelinas são um grupo vasto de compostos, que
hoje chegam a uma quantidade de aproximadamente 120.
No entanto, na cultura de tecidos, a mais usada é a AG3
(PM 384,5 g). Mesmo assim, seu uso na cultura de tecidos
é restrito e está relacionado com o alongamento de brotos
(BARRUETO CID, 1999).
Etileno
O etileno (C2H4) é um hormônio de caráter gasoso capaz
de influenciar a morfogênese das plantas em muitos
aspectos (KUMAR et al., 1998). Não é frequentemente
usado na cultura de tecidos, porém pode ser produzido
pelo explante.
No tecido, pode promover efeitos indesejáveis, tais como:
oxidação fenólica, queda foliar, hiperhidricidade
(vitrificação). Portanto, afeta negativamente as duas
maiores vias de regeneração de plantas: a organogênese
e a embriogênese somática. Contudo, o etileno também
pode favorecer esse tipo de morfogênese (HATANAKA et
al., 1995; KUMAR et al., 1998).
O metabolismo e a fisiologia do etileno foram
desenvolvidos tanto a partir das pesquisas relacionadas
com duas enzimas de sua rota metabólica – a ACC sintase
e a ACC oxidase (MCKEON et al., 1995) – quanto com o
uso de inibidores de sua síntese, tais como: a aminoetoxi-
vinil-glicina (AVG), o ácido salicílico, o cloreto de cobalto
(CoCl2), etc.; além de inibidores de sua ação, tais como: o
nitrato de prata (AgNO3), o tiossulfato de prata (Ag2S2O3),
o CO2 e o 2,5-norbornadieno. Essas pesquisas visavam
melhorar a performance da regeneração, como em
Brassica campestri (CHI; PUA, 1989). Por sua vez, o uso de
cefotaxima, de cefalosporina e de inibidores do etileno
melhorou o potencial regenerativo de calos de Pennisetum
americanum (PIUS et al., 1993). Nessa mesma linha de
trabalho, é oportuno mencionar o incremento da
regeneração de plântulas por inibição da ACC oxidase, por
meio da construção antisense em plantas transgênicas de
Brassica juncea (PUA; LEE, 1995), por meio da qual foi
possível verificar o papel regulatório do etileno na
organogênese.
Finalmente, é bom lembrar que as auxinas, em geral, têm
a propriedade de induzir síntese de etileno em muitas
espécies. Em cultura de tecidos, usam-se frequentemente
auxinas na fase de indução de calos, porém é bom ter em
mente que elas poderão estimular a síntese de etileno e,
com isso, oxidar o explante ou o calo ou, até mesmo,
inibir a embriogênese somática, fato que ocorreu em
Daucus carota, por meio do uso de ethefon (TISSERAT;
MURASHIGE, 1977).
O ethefon, ou ácido 2-cloroetilfosfônico, é um composto
que, em pH alcalino, libera etileno. Em escala comercial,
por exemplo, é usado pelos produtores de abacaxi
(Ananas comosus) para antecipar e uniformizar a floração.
Na seringueira (Hevea brasiliensis), o ethefon é utilizado
para aumentar a produção de látex.
Ácido abscísico (AAB)

O ácido abscísico (AAB) é um sesquiterpeno (C15) que, nas
plantas em geral, está relacionado à dormência, ao
estresse hídrico, ao fechamento de estômatos, etc. Dessa
forma, cumpre muitas funções na planta (HIRAYAMA;
SHINOZAKI, 2007; SEO; KOSHIBA, 2002). No entanto, na
cultura de tecidos, não tem sido usado frequentemente
como hormônio vegetal. Ao ser utilizado dessa forma,
observa-se um efeito importante na fase embrionária, o
que impede tanto a germinação precoce de embriões
zigóticos (NAIDU; SREENIVASAN, 2004) quanto a
embriogênese somática (LEMUS, 2005), e, ainda, a
poliembriogênese (DURZAN et al., 1994).
Brassinosteroides (BRs)
Os brassinosteroides, ou brassinas, são hormônios
vegetais de mesma natureza dos fitoesteroides
polioxigenados e são dotados de atividade reguladora de
crescimento vegetal (ZULLO; ADAM, 2002). Entre esses
fitoesteroides, cabe mencionar o sitosterol e o
campesterol, os quais foram descobertos, nas décadas de
1970 e de 1980, no pólen de algumas plantas, como por
exemplo, da espécie Brassica napus. Os BRs
caracterizam-se por sua capacidade de promover
alongamento no eixo caulinar da planta e promover a
formação de traqueídes, por exemplo, neste caso, em
Zinnia elegans sob condições in vitro.
A partir da técnica de isolamento e de purificação, desco‐
briram-se brassinas em muitas famílias de plantas, entre
as quais as crucíferas, as leguminosas, as fagáceas, as
rutáceas, etc. Sua presença já foi verificada em 27
famílias de plantas superiores (SASSE, 2003).
Em geral, os efeitos das brassinas não têm sido muito
relatados na cultura de tecidos, porém alguns esparsos
trabalhos que mostram estimular a regeneração têm sido
publicados (LU et al., 2003; SASAKI, 2002).
Triacontanol
Outro composto de caráter hormonal, mencionado com
pouca frequência na cultura de tecidos é o triacontanol
(TRIA). Tal composto é um álcool de 30 carbonos {CH3
(CH2)28 CH2OH} e é um componente natural da cutícula de
alfafa e de outras plantas. Algumas publicações relatam
umh efeito positivo na regeneração de plantas in vitro
(REDDY et al., 2002; TANTOS et al., 2001).
Ácido jasmônico
O ácido jasmônico, seu metil-éster e derivados estão
amplamente distribuídos no reino vegetal. São
sintetizados a partir do ácido linolênico e desempenham
papéis importantes no desenvolvimento das plantas e nas
respostas destas aos estresses ambientais (PEÑA CORTÉS,
2000). O uso desses compostos não tem sido
frequentemente relatado na literatura sobre cultura de
tecidos. Seu efeito parece mais indireto sobre a
organogênese, porém apresenta uma ação mais direta
sobre a produção de metabólitos secundários, como o
diterpenoide paclitaxel (taxol), ou em calos induzidos por
Picloram (FURMANOWA et al., 1997).
Misturas complexas
Com respeito a outros ingredientes que podem estar
presentes no meio nutritivo, vale a pena mencionar
alguns de estrutura complexa, tais como o hidrolisado de
caseína, (50 mg L-1 a 500 mg L-1), a água de coco (5% a
20% v/v), o extrato de malte (400 mg L-1 a 500 mg L-1), o
extrato de levedura (100 mg L-1 a 500 mg L-1) e a banana
passada no liquificador (10% a 50% v/v), etc. Alguns,
como a água do fruto do coqueiro, podem ser
esterilizados por filtração e depois adicionados ao meio já
autoclavado. Esse tipo de ingrediente, com quantidade e
composição não conhecidas (aminoácidos, sais, vitaminas,
elementos minerais, etc.), é usado para complementar os
meios nutritivos normais quando estes falham em
produzir os resultados esperados.
Ágar
O ágar é um polissacarídeo de alto peso molecular usado
na cultura de tecidos para dar suporte a explantes e a
plantas mantidas in vitro. O ágar oferece a vantagem de
ser solúvel em água, além de fundir-se a 100 oC e de
permanecer semissólido à temperatura ambiente.
Ademais, é um produto relativamente inerte e pode
conter impurezas orgânicas e inorgânicas, entre as quais
estão o sódio e o cloro (SCHOLTEN; PIERIK, 1998). Por isso,
às vezes é necessário lavá-lo com água antes de utilizá-lo.
Pode ser usado numa faixa de concentração que varia de
0,5% a 0,7%, embora, na faixa de 0,5% a 0,6%, o
explante acomode-se melhor. Também existem registros
de uso em concentrações mais altas, como 1,1%, com o
objetivo de evitar vitrificação do material. Nesse caso,
porém, a regeneração foi afetada (DEBERGH, 1983).
A concentração tem sua importância porque, em níveis
mais altos, ela pode afetar a disponibilidade e a difusão
dos ingredientes. Além disso, existe a possibilidade de
ocorrer um efeito osmótico. O pH é um fator que pode
afetar a estabilidade do ágar gelificado. Em valores de 4
ou abaixo de 4, sua solidificação é dificultada, ou
impossibilitada.
O ágar pode ser substituído pelo Gelrite, que é um
polissacarídeo obtido de bactérias, altamente puro e
transparente quando solidificado. Sua consistência (gel
strength) no meio de cultura está relacionada à
concentração de cátions, como cálcio e magnésio. A faixa
de concentração a ser usada na preparação de meios
pode variar de 0,15% a 0,25%.
Uma alternativa para o uso de agentes gelificantes, como
o ágar e o Gelrite, são as pontes de papel ou suportes de
espuma de plástico, usados em meios líquidos; embora o
uso de amido de milho também tenha sido relatado
(BARRUETO CID et al., 1994).
Carvão ativado (CA)

O carvão ativado tem sido incorporado ao meio nutritivo
para melhorar o crescimento ou promover a
organogênese de uma ampla variedade de espécies (PAN;
STADEN, 1998). Seu efeito tem sido atribuído à sua
capacidade de adsorção de substâncias inibidoras
liberadas pelo tecido (fenóis) e pelo meio (5-
hidroximetilfurfural), após sua passagem pela autoclave.
Contudo, nessa adsorção, vitaminas e hormônios também
pode ser retidos. Como já foi mencionado no item que
trata das auxinas, íons como cobre e zinco também
podem ser retidos em alta proporção (WINKLE et al.,
2003). Outro detalhe prático é que, durante a
autoclavagem, o CA pode estimular a hidrólise da
sacarose e promover a formação de glicose e de frutose,
mas esse fenômeno ocorre mais frequentemente em
concentrações mais altas de carvão (DRUART; WULF,
1993). Contudo, há indicações de que o pH do meio seja
um fator decisivo nessa hidrólise, já que, em meios
tamponados (pH = 5,5, por exemplo), tal hidrólise foi
reduzida (WANN et al., 1997). No entanto, a realidade é
que, nos laboratórios, os meios tamponados são
raramente usados. Uma das razões para isso é a presença
dos componentes adicionais que entram na composição
desses tampões. Normalmente, a concentração de CA
varia de 0,1% a 0,3%, e é adicionado ao meio cujo pH foi
previamente ajustado para 5,7 ou 5,8. Depois de o meio
ser autoclavado, é conveniente agitar os tubos ou frascos
que contêm o CA para que haja uma melhor distribuição.
Embora, às vezes, essa prática não seja realizada, não
tem sido observado efeito negativo no crescimento do
material.
Pelo fato de o CA possuir distintas fontes de origem
(madeira, casca de coco, etc.), alguns laboratórios, às
vezes, costumam tratá-los com água deionizada antes
que seja adicionado ao meio. Esse procedimento visa
reduzir possíveis componentes inibitórios.
Luz
Em um laboratório de cultura de tecidos, é necessário
cuidar da energia radiante para promover um bom
desenvolvimento de culturas in vitro.
Em relação à luz, existem três características principais
que devem ser observadas: fotoperíodo, irradiância e
composição espectral. O fotoperíodo necessita ser
previamente ajustado para 12/12, 14/10 ou 16/8 (relação
de horas de luz/escuro) (MORINI et al., 1991).
Normalmente, os tubos fluorescentes comuns são usados
como fontes luminosas. Eles são mais eficientes que as
lâmpadas incandescentes, embora sejam mais caros.
Além disso, as lâmpadas fluorescentes perdem menos
energia na forma de calor.
É necessário colocar de três a cinco lâmpadas no teto das
prateleiras dos armários metálicos que são usados. O vão
entre as prateleiras deve ser de aproximadamente 50 cm.
Nessas condições, geralmente a irradiância no nível das
placas ou tubos de ensaio é de aproximadamente 30 µmol
m-2 s-1. Essa é uma quantidade de energia suficiente para
os requerimentos normais de carbono das plantas, já que
a outra parte é complementada pela sacarose do meio
nutritivo. A energia que é emitida nessa irradiância deve
conter radiação fotossinteticamente ativa (PAR, em
inglês), correspondente à faixa de 400 nm a 700 nm
(nanômetros), que são os comprimentos mais efetivos
para a fotossíntese.
A questão da composição espectral está relacionada à
característica dos tubos fluorescentes que serão usados,
ou seja, de sódio ou de mercúrio. A descarga elétrica, em
síntese, passa através das partículas de vapor que estão
dentro dos tubos e causam emissão de luz branca com
predominância de algum tipo de comprimento de onda:
alaranjada, no caso do sódio, e azulada, no caso do
mercúrio.
A luz é uma forma de energia radiante e resulta da
superposição de campos magnéticos elétricos que se
propagam como ondas ou como “partículas” ou fótons. Os
fótons têm diferentes valores de energia. Assim, os fótons
da região ultravioleta são mais energéticos que os da
região vermelha (Tabela 1). Um mol de fótons de qualquer
comprimento de onda tem 6,023 x1023 fótons.
Tabela 1. Comparação entre o conteúdo energético de

três comprimentos de ondas.
Comprimento de onda (λ) Energia (KJ mol-1)
UV (280 nm) 471
Azul (425 nm) 274
Vermelho (640 nm) 181
Para fins de cultura de tecidos, as unidades de iluminação

lux e foot-candles1 são atualmente pouco utilizadas.
Prefere-se usar medidas de energia como a irradiância,
por exemplo, pelo fato de ser uma unidade que se
relaciona mais com a energia que com a sensibilidade do
olho humano.
A irradiância expressa a ideia de energia incidindo sobre
uma superfície. Suas unidades são W m-2 e Joule m-2 s-1, e
ambas são equivalentes, embora a segunda inclua a
dimensão de tempo. Para essa finalidade, não é
aconselhável o uso das unidades de energia erg ou
caloria.
A irradiância também pode ser expressa em termos de
moles de fótons por metro quadrado por segundo (mol m-
2s-1),que também recebe o nome de Einstein m-2 s-1. Um
Einstein representa uma quantidade muito grande de
fótons (6,0 x1023), por isso utiliza-se o µEinstein ou µmol
m-2 s-1.
Embora a intensidade luminosa e a irradiância sejam, às
vezes, consideradas equivalentes, elas representam
conceitos distintos. A intensidade exprime a ideia de
emissão luminosa de uma fonte, e não necessariamente o
fluxo de fótons ou a densidade de fótons
fotossinteticamente importantes para a planta (PAR).
Para se ter uma ideia dos valores da irradiância, basta
lembrar que, no topo da atmosfera, ou seja, onde não há
nuvens, há aproximadamente 1.400 J m-2 s-1 ou W m-2 e
2.000 µE m-2 s-1. No entanto, depois que a luz atravessa
as nuvens, esse valor pode cair para aproximadamente
400 µEm-2s-1.
Com respeito ao laboratório, é conveniente conhecer a
irradiância das lâmpadas, tanto por uma questão do ponto
de compensação luminosa quanto para evitar
aquecimento. Contudo, conforme já foi mencionado
anteriormente, aproximadamente 30 ± 10 µmoles m-2 s-1
podem ser apropriados. Para evitar aquecimento da sala
pelos reatores das lâmpadas é conveniente colocá-los fora
da sala de cultura.
Com respeito aos efeitos da composição espectral sobre a
morfogênese, os resultados têm sido variados. A luz da
região azul pode estimular um tipo de organogênese
(raiz/brotos) e a luz vermelha, outro.
Temperatura
A temperatura é um fator ambiental que regula o
crescimento das plantas. Esse controle ocorre de
diferentes maneiras e depende do tipo de planta, ou seja,
se ela é de clima temperado ou tropical. No entanto, no
que diz respeito às culturas in vitro, essas diferenças são
minimizadas, pois as condições experimentais são
padronizadas nos laboratórios.
No laboratório de cultura de tecidos, é conveniente que a
temperatura seja mantida o mais estável possível. Em
geral, a faixa de temperatura a ser usada pode variar
entre 23 °C e 27 °C, portanto é necessário dispor de um
sistema de refrigeração com controle automático de
temperatura, justamente para reduzir ao mínimo essas
variações de temperatura entre o dia e a noite. Ademais,
embora não seja frequente, existem laboratórios que
usam temperaturas diferentes durante o dia e a noite: 26
°C e 20 °C, respectivamente.
A uniformidade da temperatura dentro da sala de cultura
constitui um dos princípios básicos da experimentação – o
controle local –, que garante um tratamento térmico
semelhante ao do material dentro das unidades
experimentais ou das parcelas durante a experimentação,
visando sua maior precisão. O controle local não somente
deve ficar restrito à temperatura senão também à
irradiância nas prateleiras. Os outros dois princípios
básicos da experimentação são a repetição e a
casualização.
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CAPÍTULO 2
Oxidação fenólica,
vitrificação e variação
somaclonal
A micropropagação de plantas tem-se convertido em uma

tradicional técnica para clonar plantas com fins
experimentais ou comerciais. Contudo, essa técnica
apresenta problemas, como é o caso da contaminação,
mencionada no capítulo 1. Somando-se a isso, três outros
problemas podem ocorrer durante a cultura in vitro, quais
sejam: a oxidação fenólica, a vitrificação e a variação
somaclonal.
A oxidação fenólica
A oxidação fenólica, responsável pela cor marrom do
explante, é um fenômeno frequente em frutas
climatéricas, como a banana, a manga e a maçã. Porém,
em frutas não climatéricas, como o morango, o limão e a
uva, não se observou o problema.
O pardeamento é atribuído à polifenoloxidase (PPO), uma
enzima cobre dependente, que catalisa a reação de orto-
difenóis (ácido clorogênico), por exemplo, para orto-
diquinonas, as quais, ao se polimerizarem, dão a cor
escura ou parda aos produtos (Figura 1) (MAYER, 1987).
Sabe-se que tal reação é desencadeada no processo de
senescência ou por injúria dos tecidos. Contudo, a
fisiologia da enzima é um enigma e, do ponto de vista
genético, parece ser codificada por dois genes (ZHOU et
al., 2003), cuja transcrição e regulação são a chave para
sua expressão e entendimento. Por isso também, o gene
que codifica a PPO tem sido clonado com o objetivo de
avaliar o efeito da baixa temperatura na pós-colheita de
abacaxi.
Figura 1. Células de banana em suspensão. À esquerda, elas estão
completamente oxidadas; à direita, seu aspecto é normal. Ambas
estavam em similares condições experimentais.
Foto: Kazumitsu Matsumoto
A PPO é uma enzima que está presente tanto em

plastídios da raiz, do hipocótilo e do fruto, quanto nos
cloroplastos do mesófilo. No entanto, reações
histoquímicas não têm mostrado atividade nos
cloroplastos de células-guarda ou de células da bainha em
plantas C4. Do ponto de vista bioquímico, seus substratos
são os orto-difenóis, como já mencionado, que estão
presentes no vacúolo. Quando, por alguma razão externa
(um ferimento, por exemplo) ou interna (um processo de
apoptose, por exemplo), a enzima entra em contato com o
substrato, em presença de oxigênio, ocorre a formação e
a polimerização de quinonas (VAUGHN; DUKE, 1984). Não
se sabe ainda se essa reação está envolvida em
resistência à doença.
Na cultura de tecidos, o corte do explante com bisturi
desencadeia a oxidação fenólica. Notadamente, ela ocorre
frequentemente em plantas perenes, como eucalipto,
manga, banana, etc. Porém, em plantas não perenes,
como o Anthurium de jardim, esse fenômeno também
pode estar presente em até mesmo 50% dos explantes
(CHEN et al., 1997). Pode ocorrer também em Strelitzia
reginae, cujos explantes apresentam alto nível de
oxidação fenólica, o que inviabiliza qualquer tentativa de
micropropagação sem o uso de antioxidantes (ZIV;
HALEVY, 1983).
Para enfrentar esse grave problema de produção de fenóis
por parte do tecido, tem-se apelado para um leque amplo
de artifícios (THOMAS; RAVINDRA, 1997), entre os quais
pode ser citada a adição de carvão ativado e de PVP
(polivinilpirrolidona). Este último existe em diversos pesos
moleculares.
O carvão ativado constitui uma boa alternativa tanto por
sua propriedade adsorvente, no caso dos exsudados
fenólicos liberados para o meio, quanto, talvez, por sua
capacidade de fixar o cobre. Nesse caso, o carvão ativado
torna a PPO inativa. No caso do PVP, sua propriedade de
captar elétrons é sua principal vantagem.
O PVP pode ser usado também na forma insolúvel. Nesse
caso, o produto é comercialmente conhecido como
Polyclar T (peso molecular 40.000), e, antes de ser
inoculado, o explante deve permanecer em agitação, por
algum tempo, em meio líquido em presença de Polyclar T.
Existem outros produtos que podem prevenir a oxidação
fenólica, a saber: o ácido cítrico, o ácido ascórbico, a L-
cisteína, os sulfitos e os metabissulfitos de sódio, a tiureia,
o ácido tartárico, o ácido salicildroxâmico, o ditiotreitol
(DTT) e a bentonita (argila) (THIS, 2007). Alguns produtos
não são incluídos no meio nutritivo, e o explante é
submerso por algum tempo em uma placa de Petri, ou em
um béquer, na câmara de fluxo laminar. A concentração
de tais produtos deve ser previamente avaliada. No caso
do DTT, verificou-se que, na concentração de 0,1%, houve
uma diminuição da oxidação fenólica, bem como uma
melhora da embriogênese somática de Pinus patula
(MALABADI; STADEN, 2005).
Os possíveis mecanismos de ação estariam relacionados
ou com uma ação quelante do produto (aprisionamento
do cobre da enzima) – como é o caso do ácido cítrico, da
tiureia, etc. – ou com a captura do oxigênio molecular –
como é o caso do ácido ascórbico. Além disso, a exposição
do explante a esses ácidos também seria responsável por
tornar o pH da enzima menos apropriado, considerando-se
que o pH ótimo está na faixa de 6 a 7.
Além das alternativas já citadas, as seguintes ações
também podem ser executadas: trocar o meio mais
frequentemente, manter o explante no escuro, reduzir o
tamanho da lesão, usar temporariamente um meio com
pH mais baixo (4,8), usar ágar mais purificado com menor
teor de cobre, pesquisar tecidos menos susceptíveis à
oxidação e usar pontes de papel. Também há evidências
de que altas concentrações de 2,4-D reduziriam a síntese
de fenóis. No entanto, nesse esquema, as citocininas
teriam um efeito contrário, e a peroxidase teria um
importante papel (SHAH et al., 1976).
Vitrificação ou hiper-hidricidade
A vitrificação (Figura 2) é uma desordem fisiológica e
morfológica (KEVERS et al., 2004), que, no momento da
propagação in vitro, pode afetar tanto plantas herbáceas
como lenhosas. Não é um fenômeno frequente, e depende
muito das condições in vitro para que ocorra e se
expresse em diferentes graus (PEREZ TORNERO et al.,
2001).
Figura 2. Plântulas de mamão obtidas com aproximadamente 1 µM
de BAP (A). Brotos vitrificados de mamão obtidos com 10 µM BAP (B).
Em ambos os casos, foi usado meio SP.
Fotos: L. Pedro Barrueto Cid
Uma planta vitrificada apresenta as seguintes

características: desenvolvimento insuficiente, folhas
quebradiças e translúcidas, estômatos anormais, pouco
desenvolvimento do domo apical, primórdios foliares
alongados, grandes espaços intercelulares na região do
corpo subapical das gemas, incompleta conexão vascular
entre primórdios foliares e câmbio vascular, xilema menos
lignificado e mesófilo com tecido paliçádico e esponjoso
não bem estruturado. Em resumo, as plantas não têm
valor comercial (DEBERGH et al., 1981; VIEITEZ et al.,
1985).
Entre as causas responsáveis pela vitrificação, estão a
alta concentração de citocinina e a alta umidade relativa
nos tubos de ensaio ou nas placas de Petri. Também há
evidências de que o cloro, a amônia e o etileno estejam
envolvidos nesse processo (ZIV, 1991).
Existem plantas que possuem pouca tendência a
apresentar o fenômeno, tais como o abacaxi e as
orquídeas. Outras plantas, como o café, o mamão, a
mandioca, o cravo e o pêssego, são susceptíveis à
vitrificação quando expostas a altas concentrações de
citocinina ou meios líquidos. Portanto, esses fatores
devem ser monitorados atentamente por ocasião do seu
cultivo in vitro.
Não existem muitas evidências diretas que comprovem
que a temperatura seja um possível fator desencadeante
do processo. No entanto, há evidências indiretas, já que a
umidade relativa no interior dos tubos ou nas placas é
afetada pela temperatura do ambiente. Esse fator
favorece a condensação do vapor de água nas paredes
dos tubos ou das placas, por isso alguns autores têm
aumentado a concentração do ágar a fim de diminuir a
vaporização da água (DEBERGH et al., 1981).
Da mesma forma que ocorre com a temperatura,
tampouco existem evidências fortes de que os radicais
livres atuem como estimulantes desse processo, embora
seja possível suspeitar de sua participação. Essa
suposição existe porque a vitrificação é um desarranjo
metabólico e, em decorrência disso, é possível que os
elétrons da fotólise da água, em vez de serem
encaminhados para os fotossistemas I e ll, saiam dos
“trilhos” e estimulem a formação de superóxido (O.2).
Consequentemente, isso afetaria a estrutura normal das
células – suas membranas celulares, a síntese de clorofila,
a estrutura enzimática, etc. E esses sintomas são todos
característicos da vitrificação.
Variação somaclonal
A cultura de tecidos oferece diferentes modalidades de
metodologias, tais como: indução de calos, indução de
gemas adventícias, células em suspensão, cultura de
protoplastos, etc. Porém, em todas essas modalidades,
existe o risco de ocorrer variação genética nas células ou
nas plantas regeneradas. Tal fenômeno, na literatura
sobre cultura de tecidos, denomina-se variação
somaclonal. O termo somaclone exprime a ideia de
qualquer planta originada sob condições in vitro (LARKIN;
SCOWCROFT, 1981). O termo mutação é utilizado quando
a causa dessa variação é conhecida e hereditária. Quando
a causa não está determinada ou não é conhecida, o
termo variante é usado.
Além disso, pode ocorrer a variação fenotípica, mas esta
pode não ser hereditária, se a transmissão não acontecer
durante a meiose. Nesse caso, trata-se de uma variação
de natureza transitória, denominada variação epigenética.
Uma possível causa relacionada a esse fenômeno é a
metilação do DNA no nível de 5-metil deoxicitosina (5-
mdC), que pode ocorrer pela influência de alguns fatores
(ambiente, idade da cultura in vitro, etc.), bem como pela
ação da variação somaclonal no genoma da planta
(VALLEDOR et al., 2007).
A variação somaclonal induzida ou espontânea deve ser
rastreada em várias gerações das plantas propagadas por
sementes, a partir de R0 (planta obtida in vitro), e deve
continuar em R1, R2, R3, seja em casa de vegetação seja
em campo. Se, já na R1, não existir mais tal variação,
conclui-se que se trata de uma variação epigenética. Por
exemplo, por uma questão de microambiente, uma planta
in vitro (R0) pode conter diferentes números e formas de
estômatos, de espessura de cutícula, de morfologia, etc.;
porém, se depois, na casa de vegetação, esses fatores se
estabilizarem, trata-se de um fenômeno epigenético.
Somando-se a isso, no que diz respeito à não manutenção
de uma característica na geração R1, pode-se afirmar que
a autopolinização de R0, ou seja, o processo sexual, serve
como peneira (screening) contra a variação somaclonal,
oferecendo, assim, uma resistência à mudança em virtude
de uma homeostase gênica (CUSTERS et al., 1990).
A variação genética ou somaclonal ocorre menos
frequentemente quando as plantas obtidas são originadas
de gemas nodais ou axilares. No entanto, o risco aumenta
quando as plantas são adventícias, ou seja, originam-se
por meio de calo, de suspensão celular, de protoplastos e
de embriogênese somática. Não se trata, porém, de um
fenômeno previsível. Em Pisum sativum, por exemplo, a
análise de calos de quatro genótipos, após 45 dias,
mostrou uma altíssima proporção de calos diploides em
relação aos triploides, tetraploides, octoploides e
aneuploides, e parte da explicação relacionada com essa
variação foi atribuída aos reguladores de crescimento
(KUMAR; MATHUR, 2004). Ademais, calos haploides de
gérbera (Gerbera jamesonii) oriundos de óvulos foram
capazes de regenerar majoritariamente plântulas
haploides (80%), e, em menores proporções, plantas
diploides (15%) e plantas mixoploides (4%) (MIYOSHI;
ASAKURA, 1996).
Como mencionado anteriormente, a variação somaclonal
existe, mas não é automática nem inevitável. Em Vitis
vinifera, por exemplo, plantas regeneradas a partir de
folhas via embriogênese somática apresentaram apenas
2,5% de variação somaclonal (tetraploides), sendo o
restante diploide, conforme mostrou a contagem de
cromossomos (KUSOVA et al., 1997).
Parece que o genótipo também tem sua importância, já
que cultivares de uma mesma espécie – Dieffenbachia
(Araceae) – apresentaram diferentes taxas de variação
somaclonal (SHEN et al., 2007). A variabilidade do
somaclone pode ter mais probabilidades de ocorrer se o
explante não for inicialmente diploide. Sabe-se que, na
planta, nem todos os tecidos são rigorosamente diploides.
Por exemplo, o parênquima cortical da raiz ou mesmo as
células da endoderme apresentam frequentemente
tetraploidia ou octoploidia (STREET; ÖPIX, 1970). Ademais,
é conhecida a natureza poliploide de cultivos
agronomicamente importantes, como a batata, o trigo, a
banana, a mandioca, a cana-de-açúcar, etc. Contudo, do
ponto de vista da cultura de tecidos, tal característica
(poliploidia) pode favorecer a instabilidade genética dos
calos ou do material regenerado. Tal situação pode ser
ainda mais agravada com o uso de altas concentrações de
BAP, como, por exemplo, 22 µM ou 67 µM, mesmo que as
plantas de banana tenham sido originadas de gemas
apicais (SHEPHERD; SANTOS, 1996; GIMENEZ et al.,
2001).
Em geral, os poliploides são originados de progenitores
geneticamente diferentes. Mesmo assim, na agricultura,
como já mencionado, existe uma gama ampla de
poliploides. Apesar da grande quantidade de poliploides
na agricultura, eles não são de fácil obtenção nem muito
viáveis na natureza. Assim, algumas plântulas originadas
de sementes em viveiros de Pinus elliottii apresentaram
crescimento raquítico e baixa fertilidade em virtude de
carregarem uma natural poliploidia (MERGEN, 1958). Com
isso, observou-se que plantas poliploides não são de fácil
equilíbrio ou balanço genético, ainda que sejam muito
propensas à evolução dentro de uma população
mendeliana, isto é, dentro de um grupo de indivíduos que
habitam em uma mesma área geográfica e que se
reproduzem entre si. Esse fato ocorre porque os
mecanismos de impedimento ou as barreiras naturais em
nível citológico (inibição do crescimento do tubo polínico,
despareamento de cromossomos, etc.) tornam-se
operantes, isolando o mutante de seu correspondente
biótipo. É interessante observar que as angiospermas, em
geral, apresentam mais tendência à poliploidia que as
gimnospermas. Nestas últimas, esse fenômeno é raro
(MERGEN, 1958).
Às vezes, nas células dos calos, especialmente após muito
tempo de cultivo, acontece endorreduplicação seguida de
mitose. Isso provoca a variação no número de
cromossomos e, consequentemente, a formação de
poliploides, ou seja, de células possuidoras de vários
complementos cromossômicos: YY⇒YYYYYY (células
triploides, tetraploides, octoploides, etc).
Na natureza, os poliploides podem ser autopoliploides ou
alopoliploides. No primeiro caso, os indivíduos surgem por
não redução meiótica na autofecundação. No segundo
caso, por não redução meiótica no cruzamento
interespecífico entre dois indivíduos com genomas
diferentes. Na agricultura, são exemplos de poliploides
(tetraploides): o café, derivado do cruzamento sem
redução meiótica entre duas espécies; o amendoim; a
alfafa; algumas espécies de banana, etc. São exemplos de
alopoliploides naturais: a mandioca, o algodão, o fumo, a
cana-de-açúcar, o trigo, a aveia, o morango, algumas
espécies de bananas, etc. No laboratório, podem-se
induzir artificialmente tetraploides por meio da colchicina,
que inibe a formação do fuso acromático durante a
anáfase e, consequentemente, promove a duplicação do
número de cromossomos da célula (EECKHAUT et al.,
2004; GU et al., 2005; EWALD et al., 2009).
No entanto, a poliploidia ou a aneuploidia (neste último
caso, o indivíduo pode ser 2n + 1 ou 2n - 1) não são
visivelmente notadas em calos. Além disso, quando
produzidas, observa-se uma falta de correlação positiva
entre poliploidia e/ou aneuploidia e o potencial
organogênico, o que representa uma séria dificuldade
para iniciar novos órgãos a partir do calo (STREET; ÖPIX,
1970; TAHA; FRANCIS, 1990).
Nem sempre a variação somaclonal pode acontecer por
macrodesarranjos cromossômicos (quebra do
cromossomo, inversão, aumentos nos complementos
cromossômicos ou diminuição). Às vezes, a mutação pode
ser bem mais pontual em nível de base do DNA. Por isso,
esse fato pode refletir-se em nível de aminoácidos, e as
células poderiam, então, ser deficitárias numa via
metabólica, ou seja, não podem crescer num meio
nutritivo básico porque a enzima de tal passo metabólico
estaria alterada ou ausente. Trata-se de linhas de células
auxotróficas, isto é, deficientes na síntese de um
determinado metabólito. Porém, quando esse metabólito
está presente no meio, a multiplicação celular é
reiniciada.
A variação somaclonal tem dado origem a uma estratégia
de seleção de mutantes. Nesse caso, as células que não
sofreram mutação são seletivamente mortas, porque elas,
pela sua necessidade de crescer e de se multiplicar,
incorporariam algum ingrediente tóxico para elas. Por
exemplo, se um análogo de aminoácido ou de base púrica
fosse colocado deliberadamente no meio, as células
auxotróficas detidas na sua multiplicação não
absorveriam tal composto. As células auxotróficas então
poderiam ser transferidas ou subcultivadas em outro meio
que contenha a presença de determinado composto
essencial para elas (aminoácido, vitamina, etc.).
Portanto, de acordo com a cultura de tecidos, seria
possível obter mecanismos de manipulação de variação
somaclonal visando a trabalhos em melhoramento de
plantas, e não trabalhos de micropropagação, porque esta
última é uma atividade conservativa. Baseando-se nesse
ponto de vista, a cultura de tecidos pode ser uma eficaz
aliada da genética. Como exemplo disso, é possível obter,
via variação somaclonal, plantas de milho que contenham
triptofano, que está normalmente ausente na zeína,
proteína que representa cerca de 35% do total de
proteínas do grão. Outro exemplo de como a variação
somaclonal pode produzir impacto na agricultura diz
respeito à diminuição ou à eliminação do período de frio,
requerido pela cenoura para florir, o que facilitaria sua
cultura em regiões mais tropicais.
Ainda dentro da linha de pesquisa da variação somaclonal
no campo da cultura in vitro, progênies de Capsicum
annum, oriundas de somaclones, foram avaliadas em
relação a várias características, tais como: altura da
planta, dias para florir, comprimento do fruto, peso de
fruto, cor do fruto, número de sementes, etc. A maior
variação foi encontrada na forma e na cor dos frutos,
sugerindo desse modo que a variação somaclonal desse
órgão poderia ser uma promissora linha de pesquisa,
embora, para os melhoristas do ramo, isso talvez não
fosse prioridade (ANU et al., 2004).
Uma linha de pesquisa a partir da variação somaclonal
espontânea dentro do marco experimental da cultura in
vitro pode ser muito demorada. Por isso, para que sejam
obtidos mutantes por uma via mais rápida, costuma-se
usar agentes mutagênicos, tais como etilmetanosulfonato
(EMS), UV, raios X ou gama, para favorecer a indução de
mutações (ARNOLD et al., 1998). Em Brassica napus, a
resistência a Sclerotinia sclerotiorum foi induzida via EMS,
e o ácido oxálico foi usado como repórter ou indicador da
resistência dos calos obtidos (LIU et al., 2005).
É oportuno ressaltar que nem toda variação somaclonal é
útil. Pode suceder que a variação esteja relacionada à
forma ou à borda da folha, ao comprimento do pecíolo,
etc. Além disso, nem toda variação é estável ou previsível.
Pode-se afirmar ainda que nem toda variação genética
dos somaclones está associada a um fenótipo. Em
bananas, isso tem sido observado frequentemente no
campo. Ademais, as diferenças nos padrões
isoenzimáticos muitas vezes não têm estado associadas a
mudanças morfológicas. Isso levanta a questão da
necessidade de se detectar com mais propriedade a
variação somaclonal (KLERK, 1990). Tal necessidade
provém do fato de que esse fenômeno gera muita
expectativa dentro da cultura de tecidos quando a palavra
de ordem é melhoramento (breeding), especialmente em
culturas altamente heterozigóticas, vinculadas a
programas de melhoramento, os quais visam melhorar a
resistência, como no caso de Fusarium oxysporum
(THAKUR et al. 2002), a produtividade ou o colorido das
flores (CHEN; HENNY, 2006).
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CAPÍTULO 3
Embriogênese somática
Miguel Jordan Zimmermannn
Definição, usos e limitações

A embriogênese somática (ES) é um exemplo substancial
da totipotencialidade da célula vegetal que pode implicar
na regeneração de uma planta inteira. Algumas células
somáticas podem tornar-se embriões e desenvolver-se
normalmente. Em outras palavras, corresponde ao início
da formação do embrião e ao seu desenvolvimento a
partir de células diferentes dos gametas que formam o
zigoto em um processo de reprodução normal. Por causa
desse potencial, as células vegetais podem ser utilizadas
em cultivo in vitro, o que permite a reprodução massiva
de muitas espécies de plantas com vistas em sua
conservação, desde que suas características genéticas
sejam respeitadas. Outras aplicações estão relacionadas
com o saneamento, a reprodução de plantas elites
providas de programas de melhoramento genético e a
reprodução de plantas transgênicas únicas constituídas
por produtos de transformação advindos da engenharia
genética.
O conhecimento dos requisitos necessários para o cultivo
in vitro, juntamente com as adaptações metodológicas,
permite cultivar células em biorreatores com produção
automatizada, e praticamente indefinida, de numerosas
espécies de plantas, bem como a obtenção de produtos
de seu metabolismo (IBARAKI; KURATA, 2001). Ao mesmo
tempo, é possível conservar esse material mediante a
criopreservação com a subsequente criação de bancos de
genes (GROUT; ROBERTS, 1995; WANG et al., 2004). Além
disso, os embriões maduros podem ser armazenados e
encapsulados em compostos como alginato, o que
conduze à geração de sementes sintéticas (REDENBAUGH,
1993; REDENBAUGH et al., 1988). Assim, o modelo que
embasa o entendimento do desenvolvimento
embriogênico é uma poderosa ferramenta para a
multiplicação e a geração de um grande número de
indivíduos geneticamente iguais.
Os primeiros resultados sobre a regeneração de embriões
somáticos foram escritos por Reinert (1958) e Steward et
al. (1958), os quais utilizaram tecidos de cenoura (Daucus
carota). Esse é um modelo experimental ainda muito
utilizado por sua alta eficiência, além de já ter sido
estabelecido para um grande número de espécies
herbáceas e lenhosas. Os embriões são estruturas
bipolares que contam com seus meristemas caulinares e
radiculares e, por sua vez, manifestam um sistema
vascular fechado. Isso significa que ele não está associado
ou conectado com células basais nas quais estão
assentados. Esse é o caso dos brotos produzidos por
organogênese (HACCIUS, 1978). Além do mais, as
proteínas específicas encontradas nos cotilédones de
embriões são diferentes das existentes nos brotos,
mesmo tendo sido originados do mesmo tecido (CROUCH,
1982). Entretanto, com relação aos embriões zigóticos
devem-se citar algumas particularidades do sistema de
geração de embriões somáticos conduzidos in vitro:
a. A indução da ES pode dar-se em diversos tecidos e
órgãos da planta; obviamente, cada órgão
representa um potencial morfogênico particular que
está presente em seus explantes, o qual é afetado
pelos seguintes aspectos: genótipo, grau e retenção
da juvenilidade versus amadurecimento;
determinação existente nos meristemas;
metabolismo oxidativo; condição fisiológica
estacional do material; estabilidade genética;
deterioração clonal; entre vários outros a serem
considerados (BONGA, 1982).
b. Em larga escala, como no caso dos biorreatores, é
produzida uma grande variabilidade morfológica de
embriões somáticos dentro de uma mesma
população, em virtude de problemas de
sincronização, tais como heterogeneidade entre as
plântulas, manifestação da variação clonal e
possíveis problemas em viveiro (BARRY-ETIENNE et
al., 2002). Em resumo, várias considerações, além
das mencionadas acima, devem ser levadas em
consideração as quais podem limitar severamente a
eficiência do processo em razão da formação de
anormalidades morfológicas das plantas e aspectos
advindos do desenvolvimento e da aclimatização
posterior dos embriões no viveiro.
c. O processo indutivo, que parte de uma única célula
somática (ou, em alguns casos, de uma célula
gamética denominada androgênese), implica o uso
de células totipotentes, as quais, durante sua
desdiferenciação, assumem uma rediferenciação ao
responderem mediante um estímulo, e ganham com
isso a condição de “competentes”. Competente
implica uma condição endógena permissiva para
chegar a constituir uma célula em um embrião
somático.
d. Embriões somáticos desenvolvidos não apresentam,
em geral, uma fase de amadurecimento e/ou de
dessecação imposta, como ocorre com embriões
zigóticos que podem germinar prematuramente.
Anatomicamente, a ES diferencia-se dos embriões
zigóticos, pois esses não evidenciam diferenciação
de endosperma. Além disso, há falta do
desenvolvimento do suspensor salvo, a menos que
se considerem umas poucas células vacuoladas
como resultado de uma divisão inicial de uma célula
somática (DODEMAN et al., 1997; QUIROZ-
FIGUEROA et al., 2006). As células vacuoladas
somente se colorem com Evans Blue,
diferentemente do conjunto pró-embrionário
globular, que adquire coloração vermelha com
acetocarmin (DURZAN, 1988; GUPTA; DURZAN,
1987), que é indicativo de uma ativa síntese de RNA
(SANTACRUZ RUVULCABA et al., 1998).
O fenômeno da ES, sob condições indutoras in vitro,
produz as mesmas etapas de desenvolvimento dos
embriões zigóticos como, por exemplo, os estágios de
desenvolvimento globular, de coração, e de torpedo;
constituindo mais tarde um estado de amadurecimento ou
cotiledonar em dicotiledôneas. Esses processos são
sequenciais e muito similares ao que acontece in vivo
durante a indução dos embriões zigóticos na planta, visto
que parece evidente que, não somente o zigoto como
também um conjunto de diferentes células somáticas,
sendo competentes, podem empreender uma mesma
ação sob condições ambientais artificiais, como possuir e
expressar, em comum, programas genéticos intrínsecos
que conduzem à formação de um embrião (ZIMMERMANN,
1993). Apesar do que foi dito anteriormente,
recentemente, tem-se assumido que o dito potencial é
limitado a um número reduzido de células capazes de
formar embriões somáticos (VOGEL, 2005), e que, além
disso, sua frequência é extremamente variável entre as
espécies. Isso depende, em parte, da idade do explante,
da sazonalidade, do genótipo, mas também de
requerimentos específicos como composição, nível
nutricional, agente gelificantes e fitorreguladores
presentes nos meios de cultivo (LITZ; GRAY, 1992; MOLINA
et al., 2002).
Fases e formas no
desenvolvimento de embriões
somáticos
Van Arnold et al. (2002) descreveram cinco etapas que
circunscrevem o processo, a saber: [...] a) iniciação de
cultivos embriogênicos, que implica o cultivo de um tecido
primário em um meio que contém reguladores de
crescimento, principalmente do tipo ‘auxina’, mas
também citocininas. b) proliferação de cultivos
embriogênicos, geralmente realizada em meios sólidos ou
líquidos, igualmente suplementados com reguladores de
crescimento; c) pré-amadurecimento de embriões
somáticos, realizada em meio sem reguladores de
crescimento com o objetivo de inibir a proliferação e
estimular a formação do embrião com início do
desenvolvimento precoce; d) amadurecimento dos
embriões somáticos, que se realiza mediante cultivo em
meio suplementado com AAB (ácido abscísico) e/ou sob
reduzido potencial osmótico e, e) desenvolvimento de
plântulas, que ocorre na ausência de reguladores de
crescimento. (VAN ARNOLD et al., 2002).
Em termos temporais, considerando-se o modelo de
cenoura (Daucus carota), que é uma das espécies mais
estudadas, o processo da embriogênese inicia-se com a
formação de um calo, que pode ocorrer em um período de
2 a 3 meses. Em continuidade, as células que são
advindas desse calo podem ser subcultivadas
seguidamente em meio líquido, na presença de 2,4-D, em
suspensão, e, posteriormente, elas são transferidas para
um meio fresco sem reguladores. Nessas condições,
embriões globulares deveriam ser visualizados após uma
semana, e os estágios que necessitam de um maior
desenvolvimento (coração e torpedo) somente podem ser
distinguidos a partir de 2 ou 3 semanas de cultivo (Figura
1). As condições de cultivo, apesar de mais conhecidas,
têm igual e grande relevância, visto que, por um lado, os
reguladores de crescimento são consumidos e, por outro
lado, o metabolismo celular implica grandes variações de
pH no meio. Normalmente, em cenoura, observa-se que
os pHs que se mantêm altos retêm a sequência do
desenvolvimento embrionário estabelecida em relação a
meios com pHs ácidos, os quais mantêm, ao contrário, as
células em estágios proliferativos (SMITH; KRIKORIAN,
1990). Muitas são as referências sobre os requerimentos
de cultivo e de meios nutritivos que utilizam meios
básicos, tais como: Murashige e Skoog (1962), Nitsch
(1969), Gamborg et al. (1968), entre outros. Em Reinert e
Yeoman (1982), é possível obter um manual geral de
laboratório que se refere à metodologia e a meios de
cultivo.
Figura 1. Vários estágios de desenvolvimento de embriões somá‐
ticos de Carica pubescens do tipo globular, coração e torpedo.
Foto: Miguel Jordan Zimmermann
Existem dois tipos de ES in vitro: direta e indireta. A forma

direta (ESD) implica a existência de células somáticas
competentes e/ou pré-embrionárias que são capazes de
empreender a via embriogênica do explante primário,
podendo constituir-se em embriões com pouca
reprogramação em relação à modalidade indireta (ESI). A
ESI derivada de células de um órgão implica, por sua vez,
em sucessivas desdiferenciações celulares e em
reorganização da sua fisiologia, de seu metabolismo e de
sua expressão gênica na constituição do embrião.
Experimentalmente, a ESI ocorre em duas grandes
etapas. Na primeira fase, somente células competentes
podem crescer em meios apropriados, os quais,
normalmente, estão suplementados por hormônios do tipo
“auxinas”; com os quais se formam centros
embriogênicos. Em outras palavras, implica inicialmente
em uma indução que tem como objetivo alcançar um
switching, a fim de modificar sua competência para a
expressão de embriões, passando então previamente por
uma fase não organizada e proliferativa de células
indiferenciadas (calo), sob uma condição que derivará em
centros embriogênicos. Essas porções podem distinguir-se
por uma síntese polarizada de DNA (KOMAMINE et al.,
2005). Em uma segunda fase, os centros embriogênicos
se proliferam de forma lenta, normalmente em meios sem
hormônios, e continuam com divisões celulares sucessivas
em distintas zonas do centro embriogênico, as quais
conduzem finalmente à formação de embriões cujos
estádios são: globular, de coração e torpedo. Finalizado o
estágio de torpedo, inicia-se uma fase de
amadurecimento, na qual, posteriormente, os embriões
tipicamente “germinam” (Figura 2) e dão origem a uma
“plântula” (AMMIRATO, 1983). Finalmente, é possível
definir, além disso, um tipo denominado de embriogênese
somática secundária (ESS) que consiste na formação,
geralmente direta, de novos embriões somáticos iniciados
a partir de outros embriões gerados anteriormente (Figura
3), os quais, em geral, se forem utilizados na fase de
embriogênese primária, podem ou não requerer
reguladores (JORDAN; VELOZO, 1996). Esse fenômeno
ocorre frequentemente em muitas espécies (em cítricos,
em café e em outros cultivos), e inicia-se a partir de
diversos tecidos e órgãos, tais como óvulos,
integumentos, células epidérmicas, pecíolos, entre outros.
Figura 2. Germinação de embrião de C. pubescens no estágio
cotiledonar.
Figura 3. Embriogênese secundária em C. pubescens.
Características de células
somáticas embriogênicas e
embriões
As características estruturais que representam as células
somáticas embriogênicas são relativamente mais simples
e muito mais conhecidas do que a definição dos
parâmetros moleculares que as constituem, os quais são
até hoje muito pouco conhecidos. O estudo das formas
precoces tem sido facilitado mediante técnicas especiais
de detecção, como imagens digitalizadas de contorno,
biovolume, perímetro e área de projeção embrionária, que
permitem distinguir entre os diferentes estágios de
desenvolvimento dos embriões. Além disso, possibilitam
sua separação de forma (CHI et al., 1994, 1996; VITS et
al., 1992; ZHANG et al., 1996).
Estruturalmente, as células embriogênicas são pequenas,
esféricas e agregadas, contêm um denso citoplasma e
vacúolos pequenos, e/ou contêm poucos vacúolos,
núcleos grandes com abundantes organelas e paredes
celulares grossas (ALY et al., 2002; FEHÉR et al., 2002;
HALPERIN, 1970; HALPERIN; JENSEN, 1967; NOMURA;
KOMAMINE, 1985). As células embriogênicas mostram, em
geral, acúmulo de amido e forte coloração com azul de
toluidina, o que indica um alto teor de proteínas
(PASTERNAK et al., 2002; YEUNG, 1995). Além disso, em
alguns casos, podem evidenciar “fenolização”, tornando-
se de cor escura como no caso de Coffea arabica (QUIROZ
FIGUEROA et al., 2006). A fase anterior de sua formação
correspondeu a células com grandes vacúolos que
empreenderam uma divisão celular desigual (JONG et al.,
1993) dando origem, assim, a uma célula embriogênica,
com citoplasma mais denso e/ou núcleo proeminente, e a
outra parenquimática. A divisão desigual indicada seria
explicada pelo condicionamento de um padrão eixo
apical-basal polar posterior, com uma expressão gênica
específica e diferente que controlaria a manutenção da
polaridade do embrião semelhante ao controle na
formação dos futuros meristemas apical e da raiz (TAIZ;
ZEIGER, 2006). Os embriões somáticos denotam
bipolaridade, assim como os embriões zigóticos, ao
possuir um polo radical e caulinar que dá origem a ambos
os órgãos ainda em condições in vitro. A polaridade deve
ser normalmente mantida e, em parte, com a eliminação
e/ou redução de 2,4-D do meio depois do estado pré-
globular, bem como com o aumento do estímulo elétrico
polar, favorece-se a embriogênese (FEHÉR et al., 2003).
Ademais, com o estabelecimento da polaridade, permite-
se ainda o fluxo de auxina na direção ao pólo radical pela
presença de carreadores do tipo PIN1 (GELDNER et al.,
2001; TAIZ; ZEIGER, 2006). Para a condição polar
embrional, postulou-se, além disso, a presença e a
distribuição de canais de cálcio (PETITPREZ et al., 2005;
VALLEE, 1997).
Fatores que controlam ou afetam

a morfogênese da ES
Precondicionamento
Sem corresponder a um fator limitante, o cultivo
preliminar do tecido ou do órgão materno, antes de
proceder à sua extração e ao cultivo do explante
definitivo, parece promover a resposta indutiva e
morfogênica posterior. O explante definitivo
aparentemente se estabelece pela via da “competência”
morfogênica. Por meio do precondicionamento, é possível
que ocorra uma resposta de brotação dos explantes que
pode resultar, por sua vez, em um rejuvenescimento.
Assim, foi observado que esse material pode gerar um
calo embriogênico competente (LITZ, 1988). Além disso,
essa competência é induzida em órgãos que antes não
expressavam essa condição. O precondicionamento
parece imprimir um efeito integral que envolve vários
fatores, incluindo a qualidade de luz, as características do
meio nutritivo e de fitormônios sobre o explante (LITZ,
1988; LITZ; GRAY, 1992). Para o café (Coffea arabica), o
precondicionamento efetivamente otimiza a ES
(SONDAHL; SHARP, 1977).
Estresse
Para a indução do processo, seja em monocotiledôneas
seja em dicotiledôneas, considerou-se necessário que
exista uma série de fatores, que corresponde a uma
situação de estresse celular, uma condição geral que pode
ocorrer por diversos fatores que envolvem a condição das
células em cultivo, bem como todas as condições de
cultivo in vitro. O estresse resulta em dano celular na
extração do explante. A inserção do explante em um meio
de cultivo diferente da planta mãe e a alta concentração
de alguns sais levam a um estresse osmótico. A indução
de mudanças endógenas do nível hormonal de auxinas e
citocininas, sem considerar a demanda ou presença de
hormônios próprios, podem provocar diversas reações
particulares. Por exemplo, Smith e Krikorian (1990)
conseguiram induzir a ES a partir de embriões zigóticos
danificados, em meios nutritivos livres de hormônios,
somente com a aplicação de NH4 como única fonte de
nitrogênio. Ademais, em um meio livre de auxina, o
peróxido de hidrogênio (H2O2) aparece como o fator causal
da indução da ES em calos de Lycium barbarum, em que
se detectou, além disso, a presença de novas proteínas
(entre 35~55 kDa). Ambas as respostas podiam, por sua
vez, ser revertidas mediante aplicação de cicloheximida e
actinomicina D (KAIRONG et al., 2002). Adicionalmente, a
presença de vários íons de metais pesados (CoCl2, NiCl2,
ZnCl2, e CdCl2) também pode levar a uma indução da ES
(KIYOSUE et al., 1990). Recentemente, Katou et al. (2007)
demonstraram que, frente a um dano mecânico ou ferida,
é induzida uma fosfatase MAPK que se liga à calmodulina
(CaM) – uma proteína que liga cálcio – que, por sua vez,
regula as atividades de outras cinases em regiões
danificadas, além de intervir na produção do processo
embriogênico (ANIL; RAO, 2000; JANSEN et al., 1990;
PERERA; ZIELINSKI, 1992; SANDERS et al., 1999). O cálcio,
por sua vez, afeta os canais de K+, e isso aparentemente
poderia provocar uma adaptação das células diante dos
altos níveis de Na+ (KASUKABE et al., 2006), uma
condição que ocorre durante o processo de desinfestação
do material, em que usualmente é utilizado hipoclorito de
Na. As poliaminas também poderiam ter um efeito
antiestresse, com um papel protetor em face da
salinidade que afeta a membrana plasmática (ROY et al.,
2005). Adicionalmente, as poliaminas induzem
rapidamente a formação de óxido nítrico ou ON (TUN et
al., 2006), que pode ativar vários efeitos, entre os quais o
de ser citoprotetor em vez de tóxico, uma vez que atua
como antioxidante, prevenindo, assim, a morte celular
programada (PCD). Por sua vez, a presença de sinais de
ON nas plantas poderia implicar também a ativação de
proteínas cinases e de outras enzimas por meio da
indução intracelular de cálcio (DE STEFANO et al., 2006;
NEILL et al., 2006). Recentemente, foi descrito que, em
tabaco, as lesões causam uma rápida ativação de várias
proteínas cinases, a saber: proteínas cinases ativadas pelo
mitógeno MAPKs; proteínas cinases relacionadas com
lesão (Wounding protein kinases – WIPK); proteínas
cinases ativadas por ácido salicílico (SIPK), que afeta
níveis de ácido jasmônico e de ácido salicílico (SEO et al.,
2007); hormônios que também poderiam estar
relacionados com as repostas indutivas da ES, pelo fato
de estimularem a síntese de H2O2 e/ou afetar os níveis de
etileno, os quais também podem promover ou inibir o
processo (LAMB; DIXON, 1997; QUIROZ FIGUEROA et al.,
2006).
Reguladores de crescimento
O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) é o principal e
mais eficiente regulador sintético indutor da ES descrito
na literatura. Deve ser utilizado por tempo indutivo
determinado, que varia de 3 a 7 dias, de acordo com a
espécie, e, logo após, retirado do meio de cultivo, na
presença ou não de outros reguladores. Sua função
primordial é a de induzir a ES. Além disso, tem o papel de
produzir um aumento dos níveis endógenos de auxina, ou
seja, do ácido indolacético (PASTERNAK et al., 2002).
Também conduz a funções do tipo fosforilação, que serão
indicadas mais adiante.
Hormônios do tipo auxina são essenciais para que se
alcance a fase de formação de massas celulares
proembriônicas (PEMS), bem como a de transição de
proembriões do estado globular para o de coração. As
auxinas levam à síntese de novos produtos gênicos, ainda
não estabelecidos na fase anterior. Aparentemente, a
partir da primeira divisão assimétrica que conduz a uma
condição polar, a presença de auxinas nessa fase é
fundamental para mediar um transporte polar e para
síntese de DNA (FUJIMURA; KOMAMINE, 1980). Juntamente
com a demanda por auxinas, ressalta-se igualmente a
importância da presença de citocininas (BAP ou TDZ)
combinadas ou seguidas com auxinas. Por exemplo, em
arroz, que não mostrava respostas depois da aplicação de
2,4-D, a adição posterior de TDZ e/ou BA permitiu tanto a
formação de embriões somáticos como também a de
brotos (GAIRI; RASHID, 2004). Similarmente, a citocinina
4-CPPU, N-(2-cloro-4-piridil)-N´-fenilureia, aparece como
indutora da ES e é administrada em uma larga faixa de
concentrações (FIORE et al., 2002). Além disso, vários
derivados da difenilureia também podem induzir a ES em
citros, alguns com maior eficiência do que em BAP (CARRA
et al., 2007).
Em geral, as células mais novas, além de serem as mais
competentes, são também as mais sensíveis à aplicação
de auxinas exógenas. Mesmo que as auxinas sejam
requeridas durante a proliferação das massas de células
proembriogênicas (derivadas de calos embriogênicos),
nem sempre a sua presença é indispensável para o
desenvolvimento de embriões somáticos como já foi
demonstrado em cenoura (VRIES et al., 1988a). A função
precoce da auxina é aparentemente a de reprogramar o
desenvolvimento das células que irão produzir a
embriogênese assexuada (DUDITS et al., 1991), de
maneira que se manifeste a expressão de células não
organizadas (DUDITS et al., 1995). Grosset et al. (1990),
Pasternak et al. (2002) e Fehér et al. (2003) indicam que a
presença de fitormônios pode ativar um processo de
fosforilação atribuído a proteínas cinases (MAPK), as
quais, em conjunto, conduzem tanto a uma resposta de
diferenciação, como a um efeito em nível de pós-indução
do embrião somático (ROITSCH, 1999; HIRT, 2000).
Durante o desenvolvimento dos embriões somáticos,
observou-se também um incremento da atividade da N-
acetilglutamato cinase (NAGK) – uma enzima do ciclo da
ornitina – que está relacionada ao aumento de alguns
aminoácidos, como arginina, glutamina e glutamato, nos
estágios globular e de torpedo (LOHMEIER; VOGEL et al.,
2005).
Além disso, foram relatadas também respostas
embriogênicas sem a presença de hormônios, apesar de
estarem relacionadas à inclusão de sacarose ou de
compostos que induzem estresse osmótico ao meio
(KAMADA et al., 1993), condição essa que conduz
geralmente à ESD. O AAB também tem sido considerado
um hormônio indutor da ES pelo fato de iniciar o processo
de formação embrionária pré-globular em células de
cenoura (NISHIWAKI et al., 2000) e em Nicotiana
plumbaginifolia (SENGER et al., 2001). Em cenoura, a
deficiência do hormônio provocou malformações, en‐
quanto sua adição posterior reverteu o processo
embriogênico para a normalidade (NISHIWAKI et al.,
2000). Ademais, existe maior evidência com respeito ao
requerimento do AAB na fase final de amadurecimento do
embrião somático, apesar do requerimento osmótico. Por
isso, devem-se empregar altas concentrações de
sacarose, maltose, dextranas ou polietilenoglicol (PEG), a
fim de aumentar o potencial osmótico, satisfazendo,
assim, a demanda por estresse hídrico (GUTIERREZ-
PESCE; RUGINI, 2004; LECOUTEUX et al., 1993;
STRICKLAND et al., 1987).
Aparentemente, o grupo das coníferas requer
concentrações muito mais altas de AAB do que as
angiospermas: cerca de 15 mg L-1 (Informação verbal)1.
Com o amadurecimento, o nível de AAB nos cotilédones
aumenta por causa do armazenamento de compostos de
reserva. Assim, a germinação é reprimida, o que leva a
tolerância à dessecação (THOMAS, 1993), que, pela
produção de proteínas do tipo LEA geradas pela presença
de AAB e pela expressão de genes induzidos por estresse
hídrico (DODEMAN et al., 1997), conduzem os embriões a
um certo estado de inatividade metabólica mesmo que
esse não seja o caso para todas as espécies. Segundo
Anandarajah e McKersie (1990), um incremento de
sacarose no meio também aumenta o vigor dos embriões
somáticos. Em alguns casos, a glutamina também parece
favorecer a síntese de proteínas de armazenamento dos
embriões somáticos durante o processo da dessecação
(LAI et al., 1992). Finalmente, para possibilitar uma rápida
germinação durante a fase final do desenvolvimento de
torpedo dos embriões somáticos, a aplicação de
reguladores de crescimento é geralmente requerida, uma
vez que existem trabalhos, por exemplo, mostrando o uso
de GA3 (ZLENKO et al., 2002). Em coníferas é frequente o
uso da glutamina e do hidrolisado de caseína.
As poliaminas (putrescina, cadaverina, espermidina e
espermina) são outros compostos de possível ação
hormonal, os quais têm sido indicados pelo fato de
estimularem a ES na presença de outros hormônios
(KAKKAR; SAWHNEY, 2002; KEVERS et al., 2002; LI;
BURRIT, 2003). Entre elas, a putrescina aparece como
tendo maior relevância em algumas espécies (BASTOLA;
MINOCHA, 1995; SAKHANOKHO et al., 2005). As
poliaminas têm dois ou mais grupos amino primários que
atuam como fatores de crescimento em células
eucarióticas. Sua função não está totalmente esclarecida,
mas assume-se que está relacionada com sinais de
transdução, como o fluxo de cálcio (THOMAS et al., 1993),
com proteína cinase (DATTA et al., 1987) e também com
reguladores de crescimento (TONON et al., 2001). Para
algumas poliaminas, em especial a espermidina, tem-se
atribuído também um papel antiestresse, que protege do
efeito de salinidade tanto a membrana plasmática quanto
a H-ATPase ligada a ela (ROY et al., 2005). Isso pode
ocorrer no final do processo na fase de dessecação.
Paralelamente, como se indicou antes, o AAB acumula-se
nos embriões zigóticos sob condições normais e provocam
um efeito de dessecação (ATTREE et al., 1995). O AAB
participa da última fase de formação do embrião, ou seja,
da maturação, por meio da produção de proteínas do tipo
LEA. Além disso, ele suprime a formação de embriões
secundários e aberrantes, sincroniza o cultivo e impede a
germinação precoce (AMMIRATO, 1983). Recentemente,
Steiner et al. (2007) relataram que, em Araucaria
angustifolia, as poliaminas por si só favorecem o
crescimento de embriões somáticos e, ao mesmo tempo,
a putrescina e a espermidina induzem um aumento dos
níveis endógenos de AIA e de AAB.
Genes e proteínas
Na maioria das espécies estudadas, muitos são os tipos
de células que podem chegar a ser embriogênicas. Isso
depende da sua capacidade de reprogramar a expressão
gênica (competentes) para assumirem diferentes
mudanças estruturais semelhantes aos embriões
zigóticos, em meios de cultivo sob determinadas
condições in vitro. Esse dado diz respeito aos programas e
aos graus de diferenciação celular em plantas (SULTAN,
2000). Durante a indução da ES e, em cada um dos
diferentes estágios de diferenciação embriogênicos
(globular, estado de coração e de torpedo), a expressão
gênica também varia, e esse é o padrão presente durante
o processo de desenvolvimento completo da planta
(ZIMMERMANN, 1993). Entretanto, deve-se considerar
também que, em cada fase do estágio do
desenvolvimento embriogênico, junto à síntese de novas
proteínas, ocorre, da mesma maneira, a eliminação de
polipeptídios de estágios anteriores, os quais, nesse
momento, são desnecessários (SALLANDROUZE et al.,
1999). Aparentemente, a transição da condição somática
para a embriogênese implica, em maior escala, o
silenciamento de genes quando comparada a sua
atividade ou expressão (QUIROZ FIGUEROA et al., 2002).
Durante todo o processo de embriogênese, recapitula-se
uma diferente expressão de genes, em que são ativadas
mudanças complexas, em nível estrutural, semelhantes
àquelas encontradas nos processos de formação dos
embriões zigóticos normais in vivo, tais como a síntese de
novos mRNA e proteínas. Vários genes que são ativados
e/ou expressos durante as diferentes etapas do processo
da ES têm sido recentemente caracterizados e
comparados aos fenômenos que ocorrem nas células não
embriogênicas. Além disso, a expressão de uma série de
genes vinculados à divisão celular e à formação de
membranas e de parede celular tem sido caracterizada.
De igual modo, os efeitos causados por mudanças e/ou
gradientes de metilação do DNA (ativados pela presença
de fitormônios) são específicos para o desenvolvimento da
ES. Particularmente, as auxinas naturais e sintéticas
afetam fortemente o nível da 5-metil-citosina no DNA em
células de cenoura, enquanto a aplicação de drogas
específicas, que induzem a hipometilação, inibe a ES (LO
SCHIAVO et al., 1989). Parece ainda que certo grau de
metilação no DNA (SANTOS; FEVEREIRO, 2002), bem
como a alteração nos níveis de fenóis solúveis de
proteínas e a atividade de peroxidases na parede celular
estão associados à indução da resposta embriogênica
(CAUSEVIC et al., 2005). No entanto, nem para o evento
inicial, vinculado à desdiferenciação celular é conhecido
claramente o papel da expressão de genes específicos,
uma vez que vários produtos codificados pelos genes
expressos correspondem a proteínas com diversas
funções. Apesar disso, recentemente foi descrito um gene
de expressão muito precoce, o C-ESE1 (Carrot Early
Somatic Embryogenesis), que ocorre nas células
primordiais do embrião somático após a retirada do
fitormônio (2,4-D) do meio. O C-ESE1 codifica uma
proteína com domínios de aglutinina e o lócus de glico-
proteínas, os quais se encontram associados com a
deposição de novos polissacarídeos nas paredes a serem
formadas nas células embriogênicas, assumindo um papel
de associação/comunicação célula-célula (TAKAHATA et
al., 2004). Esses genes expressos, possivelmente ligados
a oligossacarídeos, além de serem derivados da hidrólise
de paredes celulares, poderiam também atuar na
regulação da ES (MALINOWSKI; FILIPECKI, 2002).
Entre as principais enzimas, distingue-se a SERK, uma
proteína cinase receptora que contém domínios ricos em
leucina (LRR) e cuja expressão está relacionada à
interação com outras moléculas sinalizadoras (HECHT et
al., 2001), determinando assim a condição de células
competentes no processo da ES (FEHÉR et al., 2003;
NOLAN et al., 2003; SCHMIDT et al., 1997). Observou-se
que, em Daucus carota e em Dactilys glomerata, a única
célula capaz de expressar o gene SERK possui a
habilidade de gerar um embrião somático (SCHMIDT et al.,
1997; SOMLEVA et al., 2000). Segundo Thomas et al.
(2004), transcritos do gene SERK foram observados em
girassol muito precocemente durante os primeiros dois
dias de cultivo, e estão diretamente associados ao
desenvolvimento da competência para a iniciação da ES.
Em Ocotea, a expressão de SERK se evidencia depois de 7
dias de cultivo em agregados celulares que resultam em
embriogênicos quando são tratados com 2,4-D, mas não
se expressa em células não tratadas com esse regulador,
as quais tampouco derivam em embriogênicas (SANTA
CATARINA et al., 2004). Igualmente, uma alta expressão
de SERK foi observada em calo embriogênico de cacau
(Theobroma cacao) em seus estados iniciais. A diferença
está também no fato de que foram observados sinais mais
fracos, ou ausência de sinal, em outros órgãos (SANTOS et
al., 2005). A adição de auxinas e de citocininas, além de
favorecer a transcrição de SERK, conduz a uma maior e
complexa expressão de outros genes pela presença de
diversos mRNAs. Outras proteínas descritas são: as
proteínas associadas à parede, as relacionadas com
patógenos, as do tipo heat-shock do tipo globulinas, as
histonas, as proteínas ribossomais e, no final da fase de
desenvolvimento, aquelas relacionadas ao
armazenamento, juntamente com outras proteínas
embriogênicas (ECP31), as quais estão associadas à
dessecação e à tolerância à dessecação do embrião, como
é o caso das proteínas do tipo LEA (late embryogenesis
abundant proteins) (BABU et al., 2007; KIYOSUE et al.,
1992) indicam que as proteínas do gene HVA1,
relacionado ao grupo das proteínas LEA, conferem
tolerância à desidratação em arroz e protegem a
membrana plasmática. De igual forma, o gene C-LEC1 em
cenoura também está vinculado ao amadurecimento nos
embriões somáticos e zigóticos (YAZAWA, 2004). Entre
outras proteínas detectadas, pode-se mencionar as de
transferência de lipídeos (LPT), que possuem função de
transporte de fosfolipídios para várias organelas (KADER,
1996). Essas proteínas estão relacionadas igualmente às
defesas, à adaptação ao estresse hídrico e, além disso, à
regulação da expansão celular (DODEMAN et al., 1997),
que ocorre por efeito do grupo de alérgenos de pólen
relacionados tanto a proteínas do tipo expansinas
(COSGROVE et al, 1997) quanto à síntese e à deposição
de calose (DUBOIS et al., 1990). Vários outros fatores
estão vinculados ao desenvolvimento normal do embrião,
os quais medeiam sinais de transdução durante a
morfogênese. Podem ser citados, por exemplo, em
primeiro lugar, o Ca2+ vacuolar e a calmodulina; a
deficiência de Ca2+ provoca clara inibição da ES (ANIL;
RAO, 2000; JANSEN et al., 1990; PERERA; ZIELINSKI, 1992;
SANDERS et al., 1999). Segundo Mahalakshmi et al.
(2007), a resposta indutiva de 2,4-D sobre a ES em
Triticum aestivum parece ser mediada por cálcio, dado
que aplicações com quelantes sequestradores inibem
essa resposta. Esses autores indicam, além disso, uma
expressão variável de três genes regulados por cálcio,
entre os quais a proteína cinase dependente de
calmodulina, a proteína cinase dependente de cálcio e,
provavelmente, a proteína ligante de cálcio durante o
processo.
Compostos extracelulares
excretados para o meio de cultivo
Várias proteínas, além de arabinogalactanas (AGPs), têm
sido relacionadas à interação planta-patógeno e à
degradação de calose durante o desenvolvimento
(CHAPMAN et al., 2000). As AGPs possuem um alto
conteúdo de polissacarídeos (aproximadamente 90%
w/w), em que domina a galactose, a arabinose e, em
menor escala, o ácido glucurônico, junto a uma pequena
porção proteica, correspondente a 10% w/w (CLASSEN,
2007). Estão presentes em membranas e em paredes
celulares, e aparecem expressando-se amplamente na
etapa transitória do estado de torpedo e, por isso, são
essenciais para a ES de cenoura. Sua particularidade é o
fato de se encontrarem liberadas no meio de cultivo,
como sinais que precedem a reformação da parede (VAN
HENGEL et al., 2001). Particularmente, as AGPs agregadas
ao meio de cultivo de cenoura restauram o potencial
morfogênico de células que tinham perdido tal capacidade
(KREUGER; VAN HOLST, 1993).
A fitosulfokina (PSK) – um pequeno peptídeo sulfatado em
tirosina que atuaria como ligante extracelular nos
primeiros estágios de desdiferenciação celular, de
proliferação e de rediferenciação – é outro fator de
crescimento de ação promotora da ES em algumas
espécies. Seu papel é manter a capacidade de divisão
celular e o estado juvenil das células embriogênicas
(HANAI et al., 2000; IGASAKI et al., 2003; KOBAHASHI et
al., 1999). Sua ação indutora é muito potente e aumenta
em presença de polietilenoglicol (PEG), uma molécula que
também aparece como promotora da ES (ATTREE et al.,
1995; MARUYAMA et al., 2002). Além disso, a PSK aparece
vinculada de forma precoce ao estabelecimento da
polaridade, sinalizando e promovendo o desenvolvimento
das células embriogênicas (FEHÉR et al., 2003).
Outros sinais em forma de moléculas solúveis que podem
atuar sobre o controle da diferenciação durante a ES são
as endocitinases, os citin oligossacarídeos lipofílicos
(LCOs) e outras proteínas glicosiladas extracelulares
secretadas para o meio nutritivo (JONG et al., 1992; VRIES
et al., 1988b). É notável que meios condicionados usados
preliminarmente, os quais contêm alguns desses
componentes, têm demonstrado igualmente que podem
levar à indução de embriões somáticos (HARI, 1980). Os
LCOs têm sido encontrados nos meios condicionados de
cultivos embriogênicos de Picea abies (DYACHOK et al.,
2002).
Referências
ALY, M. A. M.; RATHINASABAPATHI, B.; KELLEY, K. Somatic embryogenesis in
perennial statice Limonium bellidifolium, Plumbaginaceae. Plant Cell, Tissue
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CAPÍTULO 4
Organogênese
Eurico Eduardo Pinto de Lemos
Um dos mais intrigantes mistérios da biologia diz respeito

à morfogênese nos tecidos vegetais. Muitos estudos têm
sido conduzidos por cientistas em todo o mundo tentando
compreender as razões genéticas, fisiológicas e
bioquímicas pelas quais as células e os tecidos vegetais,
em um dado momento, diferenciam-se para formar órgãos
com funções distintas daquelas a que estavam
anteriormente submetidas. Os estudos em cultura de
tecidos têm contribuído significativamente para esclarecer
algumas questões relativas ao tema, pela facilidade
metodológica na manipulação de nutrientes e de
reguladores de crescimento, no controle de luz e de
temperatura. Utilizando-se o cultivo in vitro pode-se
induzir experimentalmente a diferenciação de células e de
tecidos vegetais em embriões, em brotos, em raízes, em
folhas e em outras partes das plantas. Mais recentemente,
a biologia molecular tem esclarecido pontos importantes
da morfogênese, principalmente ao descobrir e isolar
genes de interesse e estudar indivíduos geneticamente
modificados deficientes em genes responsáveis por
etapas fundamentais da diferenciação dos tecidos.
Todavia, a compreensão desse fenômeno está apenas no
começo. O controle da organogênese nas plantas pode
trazer um grande impacto para a agricultura, sobretudo
com o direcionamento seletivo da produção de raízes, de
brotos, de flores e de frutos.
Organogênese direta versus

organogênese indireta
Novos órgãos vegetais, tais como brotos e raízes, podem
ser induzidos em tecidos nos quais antes eles não
existiam. Tais órgãos assim originados são chamados de
“adventícios”. A criação de uma nova organização celular
nos tecidos e o surgimento de novos órgãos, onde antes
eles não existiam, é chamada de morfogênese ou
organogênese. Assim, tecidos ou órgãos que possuem a
capacidade para morfogênese ou organogênese são
conhecidos como morfogênicos ou organogênicos.
Muitos trabalhos têm apresentado a possibilidade de se
obterem brotos (cauligênese), raízes (rizogênese),
embriões somáticos (embriogênese) e flores de forma
adventícia. A cauligênese, a rizogênese e a embriogênese
somática são os tipos de organogênese mais importantes
para a multiplicação vegetal. A morfogênese tem sido
observada em numerosas espécies de plantas cultivadas
in vitro, mas ainda não é possível apresentá-la como
fenômeno universal. Várias plantas e tecidos ainda são de
difícil manipulação in vitro e pouco ou nada respondem
aos estímulos e sinais aplicados, e, por isso, são
chamadas de recalcitrantes.
Meristemas são zonas de intensa divisão celular e
crescimento das plantas. São tecidos formados por células
pequenas, indiferenciadas, com núcleos grandes e
conteúdos citoplasmáticos densos. Morfogeneticamente
responsivos, os meristemas podem surgir
adventiciamente em uma das seguintes formas:
a. Diretamente de células diferenciadas de um tecido
vegetal sem a proliferação de calos;
b. Indiretamente de células indiferenciadas ou
desorganizadas (calos) ou ainda de culturas de
células em suspensão.
Essas formas são chamadas de organogênese direta
(Figura 1) e organogênese indireta (Figura 2),
respectivamente. Muitas vezes, não é possível fazer uma
clara distinção entre essas formas, uma vez que é comum
a ocorrência simultânea dos dois tipos de organogênese
em um mesmo tecido (explante).
Figura 1. Organogênese direta em explantes de hipocótilos de

Annona muricata.
Fotos: Eurico Eduardo Pinto de Lemos
Figura 2. Organogênese indireta a partir de segmentos foliares em

Hancornia speciosa. a) indução de calos; b) diferenciação de
meristemas caulinares; c) gemas emergindo da massa calosa; d)
detalhe de broto emergindo dos caules.
Células altamente especializadas em plantas intactas, no

seu ambiente natural, nunca mudarão do seu estado
diferenciado. Da mesma maneira, algumas células,
mesmo quando estimuladas artificialmente, nunca se
tornam morfogênicas, pois perderam a capacidade de se
rediferenciar e de formar tecidos. Ademais, células
diferenciadas que retêm a capacidade para se
rediferenciarem e formarem novos tipos de tecidos em
plantas intactas, ou que adquirem tal capacidade
mediante um estímulo apropriado, são chamadas de
competentes.
As células competentes possuem a habilidade de se
dividirem e seguirem a direção de um novo caminho de
desenvolvimento. Todavia, esse caminho pode ser
limitado, pois as células competentes para formar brotos
nem sempre são competentes para formar raízes, ou vice-
versa. A competência de uma célula pode não ser inata ou
pode não estar presente no momento em que ela é
excisada da planta, mas a competência pode ser induzida
in vitro em meios de cultura enriquecidos com
reguladores de crescimento.
A competência é, portanto, o primeiro estágio da célula no
caminho da morfogênese. O segundo estágio é aquele no
qual as células competentes passam à condição de
determinadas, ou seja, comprometidas a seguirem um
novo programa genético particular de desenvolvimento
morfogênico, por exemplo, seguir o caminho de raízes ou
de brotos. O último estágio é aquele em que as células ou
tecidos tornam-se morfologicamente diferenciadas de
acordo com o programa previamente assumido. Essa
programação pode ser observada tanto por via direta
quanto por via indireta. Em cultivos in vitro de explantes
de tecidos vegetais organizados (folhas, caules e raízes)
ou desorganizados (calos e cultura de células), os
reguladores de crescimento (hormônios vegetais) são os
principais agentes indutores dos estímulos na presença de
fatores nutricionais adequados.
O controle do tipo de organogênese depende do balanço
dos hormônios exógenos, mas somente na fase de
indução. Somente durante esse período, a composição
hormonal do meio é tida como crítica. Lakshmanan et al.
(1997) analisaram os estados de competência, indução e
diferenciação, associados à regeneração direta de brotos,
usando explantes foliares de Garcinia mangostana. Os
autores observaram que a citocinina 6-benziladenina (BA)
foi requerida durante o período de indução de 6 dias para
que células competentes entrassem num estado
determinado de cauligênese. Tem sido descrito que a BA
exógena, além de agir diretamente nas células vegetais,
pode agir também por meio do controle de acúmulo de
outras citocininas. Esse efeito positivo da aplicação
exógena de BA no acúmulo das citocininas 2-
isopenteniladenosina (2iP) e 2-isopenteniladenosina
ribosídica (2iPR) tem sido descrito para cauligênese de
explantes foliares de Petunia hybrida. Entretanto, o papel
do metabolismo endógeno desses hormônios ainda não
foi completamente definido para todos os eventos de
desenvolvimento in vitro (AUER et al., 1999).
A competência de uma célula ou tecido pode ser definida
do ponto de vista da planta ou da pessoa que a manipula.
Nem todas as células ou tecidos possuem a competência
para se diferenciarem, talvez porque tais células sejam
incapazes de responder ao sinal ou, ainda, porque a
pessoa que as manipula ainda não tenha descoberto o
estímulo adequado para tal.
Para alguns autores, os explantes necessitam adquirir
competência antes que se possa induzir a organogênese
de brotos. Prathanturarug et al. (2007) demonstraram que
explantes nodais ou internodais de Mallotus repandus
somente responderam positivamente à organogênese
após terem sido pré-incubados em meio MS, sem
reguladores de crescimento, por 14 ou 16 dias,
respectivamente, antes de serem transferidos para o meio
de indução que continha 4,44 μM de BA por 4 semanas.
Essa técnica de estabelecimento das culturas antes da
indução organogênica pode estar ligada ao
condicionamento osmótico ou nutricional dos tecidos e
parece ser uma alternativa interessante para tecidos
recalcitrantes (LEMOS; BAKER, 1998).
Os centros sensíveis à morfogênese de um determinado
tecido são apenas pequenas parcelas do seu número total
de células. Esse é um dos grandes mistérios da biologia e
não se sabe por que uma, e não outra célula, responde
positivamente a um dado sinal tornando-se competente.
Para alguns, apenas as células responsivas podem ser
consideradas competentes, ao passo que, para outros,
muitas células são capazes de responder aos estímulos
impostos, mas apenas as que primeiro responderam têm
a preferência para aceitar os metabólitos essenciais das
células vizinhas, o que reduz a possibilidade daquelas
seguirem o mesmo tipo de desenvolvimento. A resposta
de apenas algumas células do explante ao estímulo
indutor talvez possa ser explicada pela fase mais
apropriada do seu ciclo celular para a multiplicação
(LEMOS; BAKER, 1998).
Vários são os tipos de células que podem ser observados
em uma planta. Alguns tecidos contêm células que,
embora diferenciadas, mantêm-se íntegras e com todo o
seu conteúdo genético original. Tais células são ditas
totipotentes, pois, sob determinadas condições (estímulos
ou sinais), podem retornar à condição de célula-tronco
desdiferenciada ou meristemática. Células meristemá‐
ticas, parenquimatosas e epidérmicas são exemplos de
células totipotentes. Todavia, se a célula perde seu
complemento genético original (núcleo) durante a
diferenciação, então essa célula deixa de ser totipotente e
perde sua competência para responder a estímulos
organogênicos em cultura. Células do xilema e tricomas
são exemplos de células que perdem o núcleo e a
capacidade de responder a estímulos externos e são,
portanto, incapazes de reverterem à sua condição inicial
de totipotentes.
A organogênese e o balanço
hormonal
É de conhecimento geral, há mais de 50 anos, que as
auxinas podem induzir a formação de raízes em culturas
de tecidos. Esse fenômeno foi demonstrado no clássico
trabalho de Skoog e Miller (1957) no qual se observou que
a formação de brotos e raízes pode ser regulada pela
relação auxina/citocinina (Figura 3). Raízes são
rotineiramente induzidas em resposta à aplicação de
auxinas dentro de estratégias de regeneração de plantas,
de transformação e de enraizamento de estacas, mas
menos atenção tem sido dada ao estágio de morfogênese
(CALLIS, 2005). Sachs (1993) descreveu auxina como um
sinal correlativo que coordena tanto o desenvolvimento
com diferenciação vascular quanto outros processos de
desenvolvimento vegetal. Ao que tudo indica, o fluxo de
auxina é o determinante da canalização da diferenciação
de tecidos vasculares.
Figura 3. Relação entre auxina e citocinina em explantes internodais

de Annona muricata.
Fonte: adaptado de Skoog e Miller (1957).
A adição exógena de reguladores de crescimento ao meio

de cultura desencadeia uma alteração do balanço
hormonal endógeno dos tecidos dos explantes. A
adequada combinação de auxina e de citocinina exógena
pode interferir no balanço interno das citocininas
endógenas e desencadear uma resposta de indução de
novos meristemas de brotos. Mercier et al. (2003)
quantificaram os níveis endógenos de cinco citocininas
em segmentos foliares de abacaxizeiro e constataram que
a aplicação exógena de ANA (1 mg L-1) e de BA (2 mg L-1)
produziu o maior número de brotações na base de folhas
de abacaxizeiro, enquanto, na sua ausência, nenhum
broto era formado. O conteúdo hormonal presente na
porção basal das folhas foi positivamente correlacionado
com a resposta organogênica das culturas. A relação
auxina/citocinina endógena atingiu o ponto mais baixo no
terceiro dia, principalmente em virtude do forte
crescimento do nível de 2-isopenteniladenosina (2iP). Os
autores sugerem que a concentração endógena
aumentada de 2iP tenha desencadeado o sinal indutor da
resposta organogênica nas folhas do abacaxizeiro e que a
produção endógena de 2iP tenha sido regulada em
resposta à absorção dos reguladores de crescimento
adicionados ao meio.
A presença constante ou excessiva de citocininas e de
auxinas no meio de indução ou de multiplicação de brotos
pode desequilibrar exageradamente o balanço hormonal
endógeno dos explantes, além de inibir as respostas
desejadas. A indução de brotos em explantes nodais de
Pterocarpus marsupium, uma espécie de leguminosa
arbórea, somente foi possível por meio da utilização de
meio de cultura com 0,4 μM TDZ. Todavia, a presença
contínua de TDZ após a indução inibiu o alongamento dos
brotos, por isso foi necessária a transferência dos
explantes para outro meio com 5 μM BA (HUSAIN et al.,
2007).
O balanço hormonal endógeno dos explantes pode ser
também afetado pela osmolaridade do meio e pela fonte
de carbono disponível, como demonstrou Lemos e Baker
(1998). Eles compararam a reação de internódios de
graviola quando expostos a uma mesma combinação de
reguladores de crescimento (2 mg L-1 BA e 0,5 mg L-1
ANA) sob diferentes fontes de carbono (sacarose, glucose,
galactose e sorbitol). Eles observaram que internódios
submetidos a fontes de carbono prontamente
metabolizáveis (sacarose, glucose e galactose)
produziram apenas calos, mas explantes submetidos ao
sorbitol, um açúcar álcool não metabolizável pela
gravioleira, mantiveram-se vivos, mas sem aparente
resposta visível. Quando todos os explantes foram
transferidos para um novo meio sem reguladores de
crescimento e com sacarose, apenas aqueles induzidos
em sorbitol produziram brotações, todos os demais
continuaram a produzir apenas calos. Apenas o meio que
continha sorbitol foi capaz de promover a diferenciação de
células subepidérmicas em células meristemáticas e,
posteriormente, em brotos.
Naquele trabalho, Lemos e Baker (1998) observaram que
a primeira fase (competência) e a segunda fase
(determinação) da organogênese não envolveram
significativa proliferação celular. Dessa forma, a
morfogênese foi iniciada em determinadas células-alvo
sem a necessidade de uma fonte de carbono prontamente
metabolizável para os explantes. Os reguladores de
crescimento foram absorvidos do meio pelos explantes
que tiveram o seu balanço interno modificado, mas sem
apresentarem reações morfológicas exteriores
significativas, o que foi possível graças à falta de uma
fonte metabolizável de carbono para a produção de novas
células. Esse estado de “fome” dos explantes criou as
condições necessárias para “sensibilizar” as células-alvo e
torná-las responsivas quando transferidas de meio (Figura
4) (LEMOS; BAKER, 1998).
Figura 4. Organogênese em células subepidérmicas de internódios

de Annona muricata. (A) início da divisão celular em células
responsivas (círculo) uma semana após a indução; (B) formação de
meristemoides duas semanas após a indução; (C) gema apical
emerge na superfície apresentando primórdios foliares visíveis quatro
semanas após a indução.
Cauligênese
A organogênese em tecidos vegetais, cujo resultado
visível é a produção de novas gemas e brotos, é chamada
de cauligênese. Esse é um dos tipos mais comuns de
organogênese procurada em cultura de tecidos pela sua
grande aplicação na produção massal de mudas. Ela
ocorre em resposta à manipulação de reguladores de
crescimento exógenos aplicados ao meio de cultura.
Dependendo das forças de equilíbrio entre os níveis
endógenos e exógenos de hormônios aplicados, sobretudo
das citocininas e das auxinas, as respostas podem ser
cauligênese ou rizogênese.
Meristemas de brotos formados diretamente em tecidos
de explantes são frequentemente iniciados 48 horas após
o começo da divisão celular em cultura de tecidos. Cada
mitose preliminar é rapidamente seguida por novas
divisões no ciclo celular até que se formem os primórdios
meristemáticos. Esses primórdios aparecem de forma
aparentemente aleatória nos tecidos, mas observa-se que
posteriormente eles tendem a uma equidistância uns dos
outros. Algumas vezes, o novo núcleo meristemático
surge de um conjunto de células-mãe que se dividiram
dando origem a várias outras com o mesmo potencial, as
quais juntas formam um meristemoide. Outras vezes, a
origem do novo órgão é unicelular e pode ser confirmada
pela elevada incidência de plantas mutantes puras que
surgem de um tecido submetido a tratamento
mutagênico. Se as plantas fossem originadas de várias
células, então um grande número de quimeras poderia
aparecer.
Os meios de cultura e os reguladores de crescimento que
favorecem a rápida proliferação celular e a formação de
calos em um explante nem sempre são os mesmos que
conduzem a meristemas morfogênicos – que resultam na
formação de brotos ou de raízes. Calos mantidos
prolongadamente em um mesmo meio de cultura
terminam por produzir organogênese a partir de centros
meristemáticos ali formados. Caso sejam frequentemente
subcultivados, tais calos permanecem indiferenciados e
nunca chegam a formar órgãos. De forma oposta, alguns
calos somente produzem órgãos quando são removidos
do meio de indução e transferidos para meios de
regeneração com ou sem reguladores de crescimento
(LEMOS; BAKER, 1998).
Os meristemoides podem ser originários da
reprogramação de células desdiferenciadas dos calos ou,
mais comumente, de células que retêm a competência
para a morfogênese já existente no tecido original (Figura
5). Em alguns casos, tais brotos são, na verdade, parte de
embriões somáticos inadvertidamente induzidos na massa
calosa (GEORGE, 1993).
Figura 5. Cauligênese indireta em folhas jovens de Anthurium sp.
O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), regulador de

crescimento do grupo das auxinas, tem sido apontado por
inúmeros estudos como o mais efetivo indutor de calos
organogênicos em cultivos in vitro. Todavia, nem sempre
as culturas requerem a presença de 2,4-D para a iniciação
de calos. Por exemplo, em segmentos foliares de
Dieffenbachia sp., o 2,4-D não foi o único indutor de calos
organogênicos. Eles se formaram tanto na presença de
Tidiazuron (TDZ), a 5 μM, como na presença de 2,4-D, a 1
μM (SHEN et al., 2007). A ação do TDZ induzindo a
formação de calos e de brotos em várias espécies
vegetais foi constatada por vários autores (DATTA;
MAJUMDER, 2005; GURRIARAN et al., 1999; LANDI;
MEZZETTI, 2005; MITHILA et al., 2003). Diz-se que o TDZ
possui tanto atividade de citocinina como de auxina e
pode ser substituído in vitro por auxinas ou pela
combinação de auxinas e citocininas (SINGH et al., 2003),
ou ainda aumentar os níveis endógenos de auxinas
(HUTCHINSON et al., 1996).
As citocininas formam uma classe de hormônios de
plantas que possuem um papel central no ciclo celular e
influenciam numerosos programas de desenvolvimento.
Werner et al. (2003) observaram que as citocininas
regulam o número de divisões pelas quais as células
podem passar antes de deixarem o meristema. Portanto,
as citocininas estão diretamente envolvidas no controle
da passagem de células do estado proliferativo
indiferenciado (meristemáticas) para o estado
diferenciado fora do meristema.
Plantas geneticamente modificadas de Nicotiana e
Arabidopsis com reduzido conteúdo endógeno de
citocininas produziram brotos subdesenvolvidos,
meristemas apicais menores e apenas 3% a 4% de
produção de células foliares em relação às plantas
normais, o que indica uma necessidade absoluta desse
hormônio para a formação das gemas e para o
crescimento foliar. Em contraste, os meristemas das
raízes dessas plantas deficientes em citocininas eram
maiores e cresceram mais rapidamente e com mais raízes
laterais. Esses resultados sugerem que as citocininas
possuem papéis opostos para raízes e brotos (WERNER et
al., 2001). Esse fato é de grande importância na cultura
de tecidos vegetais, uma vez que o uso de elevadas
concentrações de citocininas para estimular as brotações
de gemas pode levar à inibição da indução ou à
paralisação do crescimento das raízes.
Trabalho realizado em arroz por Kurakawa et al. (2007)
mostrou que um gene específico, conhecido como Lonely
Guy (LOG), é requerido para manter a atividade
meristemática, e a perda da sua função causa terminação
prematura do meristema apical. O gene LOG codifica uma
enzima ativadora da citocinina que atua na parte final da
sua síntese. O gene LOG converte diretamente
nucleotídeos inativos de citocininas em formas de base
livre, as quais são biologicamente ativas pela ação da
fosforibohidrolase específica da citocinina. O LOG mRNA
está localizado especificamente nos meristemas apicais, o
que indica que a ativação das citocininas é feita naquele
ponto. Os autores propuseram a existência de uma
enzima ativadora da citocinina como um mecanismo
regulador da sua atividade.
Vários tipos de explantes têm sido propostos para a
organogênese ou embriogênese somática de plantas. Para
cana-de-açúcar, o uso de folhas jovens cortadas
transversalmente em anéis de 1 mm a 2 mm de largura
logo acima do meristema, até cerca de 8 cm de
comprimento, é um bom exemplo disso. Anéis cortados
nas porções mais próximas do meristema (até 4 cm)
apresentaram maiores percentagens de organogênese
direta do que as porções mais distais (entre 5 cm e 8 cm).
Isso mostra que a posição e a idade do tecido interferem
na capacidade de regenerar meristemas. O
posicionamento dos explantes no meio de cultura também
influenciou significativamente a organogênese. As
melhores respostas foram obtidas nos explantes dispostos
com a parte distal (de cabeça para baixo) em contato com
o meio (LAKSHMANAN et al., 2006).
Rizogênese
A indução de raízes por auxinas ainda não está muito bem
compreendida nos seus muitos aspectos, sobretudo no
aspecto molecular. Um interessante estudo conduzido por
Ludwig-Müller et al. (2005) distinguiu o papel de duas
auxinas ativas na planta, o ácido indol-3-butírico (AIB) e o
ácido indol-3-acético (AIA), sobre o AIA endógeno durante
a indução de raízes adventícias em segmentos de caule
de Arabidopsis. O AIB (10 μM) aplicado exogenamente, e
não o AIA, induziu eficientemente raízes adventícias. As
raízes foram inibidas pelo ácido 3,4,5-triiodobenzoico
(TIBA), um inibidor do transporte polar de auxina. Eles
sugeriram que o aparecimento das raízes adventícias
ocorreu pela interação entre o AIA endógeno e o AIB
exógeno. O AIA endógeno existente é transportado para a
base do segmento de caule e, assim, induz a formação de
raízes. Em segmentos de caule em que o transporte polar
foi inibido por TIBA, a formação de raízes não ocorre,
mesmo na presença de AIB.
A indução de raízes adventícias em explantes de caule e
de folhas tem ocorrido, na maioria das vezes, de forma
empírica, a partir da adição de auxinas ao meio de
cultura, o que altera a relação auxina/citocinina endógena
dos tecidos. Na presença da auxina no meio de cultura, é
comum o aparecimento de calos (não tanto quanto é
comum numa combinação auxina-citocinina), enquanto as
raízes aparecem logo após. Explantes foliares de
Medicago truncatula foram utilizados para investigar a
origem da indução de raízes pelas auxinas (ROSE et al.,
2006). Um exame histológico revelou camadas de células
calosas, que surgiram das nervuras foliares e, dentro
desse tecido, primórdios radiculares derivados de células
do floema junto com novo tecido vascular. Os autores
sugeriram que as células derivadas das nervuras eram do
tipo pró-cambiais e funcionavam como células
pluripotentes, com a propensão de formar meristemas
radiculares ou tecidos vasculares em resposta ao sinal da
auxina adicionada ao meio.
Raízes laterais e adventícias in vitro são formadas pós-
embrionicamente nas plantas por estímulos do ambiente
de cultivo. Entre os reguladores de crescimento do grupo
das auxinas, o AIB parece ser o mais responsivo em
termos de indução de raízes adventícias em estacas e em
explantes de culturas de tecidos (Figura 6). Desde a sua
descoberta, há mais de 50 anos, o AIB tem sido utilizado
em inúmeros experimentos, a maioria deles envolvendo
estudos de tentativa e erro para atingir as condições
ótimas de enraizamento de espécies vegetais. A maior
habilidade do AIB em promover raízes adventícias,
comparando-se ao AIA, tem sido atribuída à sua maior
estabilidade na solução e nos tecidos vegetais
(NORDSTRÖM et al., 1991).
A concentração efetiva do AIB em vários estudos foi
também dependente do pH do meio. Observou-se que, a
baixos valores de pH, são necessárias concentrações
menores de AIB para induzir raízes em estacas de
macieira (HARBAGE; STIMART, 1996). As diferenças entre
espécies fáceis e difíceis de enraizar ocorrem,
possivelmente, em virtude das diferenças no metabolismo
da auxina. Espécies difíceis de enraizar não são capazes
de hidrolisar conjugados de AIB nos pontos adequados
para o desenvolvimento das raízes adventícias (EPSTEIN;
LUDWIG-MÜLLER, 1993). Mas é possível induzir raízes em
tais espécies após a aplicação de um inibidor de
conjugação.
Figura 6. Rizogênese direta em explantes cotiledonares de

Hancornia speciosa (A) e de Annacardium occidentale (B), em meios
MS com 2 mg L-1 de AIB.
Para o enraizamento in vitro de explantes de Cotinus

coggygria – uma planta lenhosa ornamental –, o AIB a 10
μM mostrou ser o melhor tratamento, induzindo em 100%
o enraizamento, ou seja, houve menos calos basais e
enraizamento mais rápido do que com AIA e 2,4-D
sozinhos, ou em mistura. Nenhuma raiz formou-se com
2,4-D. Estudos histológicos revelaram um aumento na
atividade mitótica após 73 h em cultura, nas células do
parênquima cortical, entre os vasos de floema – como
sempre acontece em plantas lenhosas. Os tecidos
vasculares dos primórdios radiculares se conectaram aos
do explante antes mesmo da emergência das raízes que
ocorreu dez dias após a indução. A mistura de auxinas
promoveu apenas a formação de calos (METIVIER et al.,
2007).
Florescimento
Os meristemas fornecem novas células para que a planta
produza órgãos durante toda a sua vida, e sua atividade
contínua depende de genes reguladores que equilibram a
proliferação de células meristemáticas com as células
recrutadas para a organogênese. Durante o
desenvolvimento floral, esse balanço é modificado para
privilegiar a organogênese, o que causa a terminação do
meristema após produzir determinado número de órgãos
(SABLOWSKI, 2007).
A indução de flores in vitro é um fenômeno interessante
do ponto de vista científico, uma vez que pode trazer à luz
as melhores condições fisiológicas para que tal evento
ocorra na natureza. Os hormônios vegetais influenciam
vários processos do desenvolvimento, desde a
germinação das sementes até a produção de brotos, de
raízes e de flores. O importante papel da auxina na
indução floral e no desenvolvimento tem sido descrito em
vários trabalhos com ervilha (FRANKLIN et al., 2000),
Vigna radiata (AVENIDO; HAUTEA, 1990) e com Vigna
mungo (IGNACIMUTHU et al., 1997). No entanto, para
algumas espécies, a auxina ora não produz qualquer
efeito (RASTOGI; SAWHNEY, 1987) ora é inibidora
(DEATON et al., 1984) do desenvolvimento floral. Zhang
(2007) observou que a necessidade de auxina para o
florescimento in vitro de Perilla frutescens foi variável.
Entre as auxinas testadas, o AIB foi mais eficiente do que
o ANA e o AIA na indução de flores. A adição de 1 mg L-1
de AIB ao meio induziu a produção de raízes em 65,6% de
flores normais, de forma que algumas delas chegaram à
produção de frutos e de sementes viáveis. No entanto,
concentrações superiores a 2 mg L-1 de AIB não induziram
flores, mas calos. A presença de raízes foi fundamental
para a produção de flores in vitro de P. frutescens, o que
indicou que a formação das raízes tem um papel
importante nesse fenômeno. A presença de ANA ou de AIA
no meio melhorou a produção de raízes, mas foi
ineficiente para produzir flores in vitro.
A necessidade de citocinina para o crescimento de flores
tem sido descrito para mono e dicotiledôneas (WANG et
al., 2001; ZHONG et al., 1992; ZHOU et al., 2004). Zhang
(2007) observou que, quando todos os outros parâmetros
estavam nos níveis ótimos, a melhor concentração de BA
para a indução floral de P. frutescens foi de 1 mg L-1, na
qual 86,2% dos explantes produziram flores normais.
A concentração de sacarose também é um fator que pode
influenciar a organogênese de flores in vitro. A presença
de concentrações próximas de 30 g L-1, em geral são tidas
como apropriadas para a indução floral em batata (AL-
WAREH et al., 1989), e ginseng (LEE et al., 1989) e em
Vigna mungo (IGNACIMUTHU et al., 1997).
Composição dos meios de cultivo

para a organogênese
Uma grande variedade de protocolos de meios de cultivo
para o estabelecimento da organogênese e da
micropropagação é descrita na literatura. A maioria deles
envolve a estratégia do uso de meios semissólidos para
estabelecimento, indução, multiplicação e enraizamento
dos explantes.
Os sais (macro e micronutrientes) presentes no meio de
Murashige e Skoog (1962) – MS – são a base para a
preparação da maioria dos meios de cultivo para a
organogênese (LAKSHMANAN et al., 2006). Modificações
substanciais são, por vezes, necessárias dependendo da
variedade utilizada e do propósito do cultivo. Todavia,
devem-se conduzir com cuidado mudanças no perfil dos
sais do meio MS. Donato et al. (1999) evidenciaram que o
uso de fontes únicas de N orgânico (glutamina) ou
inorgânico (KNO3), ou a combinação dos dois, produziu
significativamente menos brotações em explantes de
cana-de-açúcar do que a mistura original de nitrato e
amônio do meio MS.
Uma alternativa para o uso de nitrogênio em meio de
cultura, proposta por Sobhakumari et al. (2004), é a
utilização de bactérias nitrificantes associadas a doses
reduzidas do elemento nas formulações tradicionais. A
inoculação de culturas líquidas in vitro de cana-de-açúcar,
var. Co 86032, com isolados das bactérias Azospirillum e
Methylobacterium, promoveu o aumento significativo na
produção de novos brotos e no alongamento de plantas
em cultivos in vitro, utilizando a 50% da dose padrão de N
do meio MS. Isso indicou que a utilização de
microrganismos fixadores de N pode reduzir os custos de
produção de mudas micropropagadas.
Variações na composição dos reguladores de crescimento
têm sido testadas em profusão. O fato de diferentes
variedades e/ou explantes responderem diferentemente à
multiplicação in vitro tem levado pesquisadores à
experimentação de vários tipos, combinações e
concentrações de reguladores de crescimento. Cheema e
Hussain (2004), por exemplo, testaram seis combinações
das citocininas benziladenina e cinetina em seis
variedades de cana-de-açúcar, e encontraram diferenças
significativas para as respostas genotípicas de
multiplicação e de comprimento de brotos e de raízes nas
diferentes formulações propostas.
A influência da luz foi estudada em interessante trabalho
de Garcia et al., (2007) com quatro diferentes variedades
de cana-de-açúcar brasileiras. Eles observaram que
explantes cultivados no escuro sob baixas concentrações
de Picloram ou de 2,4-D (4,0 µM e 4,5 µM,
respectivamente) apresentaram formação de calos a
partir do parênquima caulinar bem como massas pré-
embriogênicas derivadas de feixes da bainha do floema
de folhas imaturas. Embriões somáticos surgiram na
sequência após transferência das massas pré-
embriogênicas para o claro, em meio desprovido de
reguladores de crescimento. Já explantes cultivados sob
luz desde o início, e em elevadas concentrações de
Picloram e de 2,4-D (40 µM e 22,6 µM, respectivamente),
mostraram primeiramente organogênese direta, a partir
de camadas externas do parênquima do caule, seguida
pelo desenvolvimento de calos organogênicos.
Observaram-se também calos pré-embriogênicos a partir
de feixes da bainha do floema de folhas imaturas, mas
esses não derivaram em embriões viáveis.
O tipo e a concentração dos carboidratos no meio de
cultura têm influenciado a morfogênese de tecidos
vegetais. Os açúcares presentes na seiva do floema das
plantas têm sido positivamente relacionados com a
melhor fonte de carbono usada nos meios de cultura
(WELANDER et al., 1989). A sacarose é o açúcar mais
comum encontrado na seiva do floema da maioria das
plantas (ZIMMERMANN; ZIEGLER, 1975) e, não por acaso,
a principal fonte de carbono utilizada em culturas de
tecidos. Outros açúcares têm sido testados com variada
gama de respostas. A galactose é tida como tóxica para
tecidos vegetais em cultura, mas açúcares como a
rafinose e a estaquiose, que são galacto-oligosacarídeos
presentes em pequenas quantidades na seiva de
anonáceas, estimularam a rizogênese em explantes de
graviola (LEMOS; BLAKE, 1996).
Conclusão
A indução de estruturas organizadas adventícias, onde
antes elas não existiam, tem estimulado a hipótese da
totipotência em pelo menos parte de células maduras em
diferentes tecidos vegetais. Tais células, embora
completamente diferenciadas, quando submetidas a
estímulos ambientais adequados (induzidos ou não), são
sensibilizadas e podem alterar o seu ciclo celular. Nesse
caminho, iniciam uma viagem de volta a uma condição
meristemática já vivenciada anteriormente, a qual havia
sido perdida com a especialização dos tecidos. A
existência dessa memória genética remanescente nas
células tem sido estudada e provada empiricamente em
algumas plantas-modelos. A compreensão desse
fenômeno somente agora começa a ser desvendada. Pes‐
quisas moleculares têm isolado vários genes que são
indicados como candidatos-chave do controle da
morfogênese, sem os quais as células não exercitam tal
habilidade.
De uma forma geral, os sinais enviados para as células
são direta ou indiretamente hormonais. A existência de
receptores nas células, de natureza proteica ou não,
capazes de decodificar o estímulo e de desencadear as
alterações metabólicas necessárias para um novo
programa celular, ainda está por ser desvendado. Estudos
têm tentado demonstrar a totipotência universal das
células vegetais para a morfogênese. Embora
experimentos empíricos tenham demonstrado que células
vivas nucleadas são capazes de retomar a sua condição
meristemática inicial e se rediferenciarem em novos
órgãos, até o presente momento não foi possível prever
quando, onde e como esse fenômeno ocorrerá.
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CAPÍTULO 5
Poliembriogênese
Don J. Durzan
A poliembrogênese é um fenômeno que resulta da

clivagem de um embrião monozigótico (Monozygotic
Clevage Polyembryony – MCP) a partir de seus primeiros
estádios de desenvolvimento. Esse processo resulta,
então, em uma formação múltipla de embriões,
geneticamente iguais entre si e idênticos àqueles
originados via massa embrionária oriunda do suspensor
(Embryonal Suspensor Mass – ESM), durante o
desenvolvimento normal da semente.
Muitas plantas gimnospermas e angiospermas
apresentam potencial para poliembriogênese, porém ela é
mais comum nas primeiras, nas quais as sementes
apresentam vários embriões, dos quais apenas um será
ativado, enquanto os outros permanecem não
desenvolvidos na base da semente.
Entre as gimnospermas, as coníferas compreendem o
maior e mais antigo grupo de plantas (SPORNE, 1965).
Algumas chegam a viver mais de 5 mil anos (Pinus spp.),
enquanto outras são as plantas mais altas do planeta
(Sequoia, Fitzroya ). As coníferas apresentam grande
adaptação ao meio ambiente e podem viver em solos
ácidos, pobres em nitrogênio, além de ocupar áreas
montanhosas. Algumas são capazes de reter suas folhas
por um período de 20 a 30 anos, mantendo um padrão
fotossintético, mesmo durante muitos períodos de
estresse (FERGUNSON, 1968).
As coníferas são economicamente importantes, pois sua
madeira pode servir para distintos usos, tais como: na
construção civil, no aquecimento dos lares (combustível) e
na fabricação de papel. Do seu metabolismo secundário,
podem, ainda, ser extraídas drogas medicinais, incluindo
algumas com efeito anticancerígeno. Além disso, servem
de abrigo para a fauna silvestre. Contudo, a sombra da
extinção ameaça muitas delas, como, por exemplo, a
Fitzroya cupressoides, encontrada nos bosques frios do sul
do Chile.
Em geral, as populações naturais de coníferas são
autógamas e carregam um interessante background
genético. No entanto, produzem poucas sementes e de
qualidade duvidosa. Por esse motivo, a regeneração
natural de suas florestas é dificultada. Por isso, justifica-se
o desenvolvimento de métodos baseados na
poliembriogênese monozigótica via clivagem precoce do
embrião, que tem importância nos programas de
melhoramento e manutenção.
A formação de bancos de germoplasma, via
melhoramento clássico, tem sido importante no que
concerne ao estabelecimento de linhas de progênies e
parentais conhecidas e selecionadas. Porém, esse
processo é longo e demorado. Dessa forma, a presente
revisão mostrará a estratégia de manutenção dessas
plantas, por meio do resgate de embrião, a partir de ESM
com potencial poliembriogênico (MCP), a qual tem sido
decisiva para a multiplicação clonal de muitas coníferas
de importância econômica.
A MCP tem contribuído muito com a indústria florestal, já
que tem permitido testar uma gama de novos genótipos
no que diz respeito à plasticidade ambiental sob
diferentes terrenos e localizações, bem como a resistência
a doenças. Isso significa que, mesmo assim, são
necessários anos para que se avalie corretamente a
interação genótipo-ambiente, além do subsequente
estabelecimento de novos ciclos de plantios baseados em
material clonal cuidadosamente avaliado.
Os genótipos elite que mostram poliembriogênese podem
ser criopreservados em nitrogênio líquido, e seus
embriões podem ser conservados por anos, conforme as
necessidades dos programas de melhoramento. Então,
quando descongelados e cultivados in vitro, esses
embriões ainda continuam a regenerar mais clones via
clivagem e poliembriogênese.
Para a pesquisa científica, esse material clonal pode
prover uma excelente fonte de protoplastos totipotentes,
os quais podem ser usados para processos de fusão de
células e genomas de outros genótipos, visando explorar
um potencial industrial florestal.
A poliembriogênese é diferente de outros métodos de
micropropagação, nos quais os explantes são cortados de
diferentes partes da planta, tais como folhas, hipocótilos e
ápices, para originar clones via organogênese ou
embriogênese somática.
Apomixia e poliembrionia
Apomixia é a substituição da reprodução sexual por vários
tipos de reprodução assexual, nos quais não há fusão dos
gametas. As causas da apomixia e da poliembrionia são
geralmente atribuídas a um substrato comum (MOGIE,
1992). A poliembrionia é uma característica hereditária
controlada por um ou por mais genes recessivos, os quais
atuam juntos durante a recombinação.
Em biotecnologia, a apomixia visa fixar o vigor híbrido,
poupando tempo, trabalho e dinheiro no estabelecimento
de cultivares ou variedades. Contudo não é fácil
estabelecê-la.
A poliembronia foi reportada primeiramente por
Leeuwenhoek, em 1719, em sementes de Citrus. Em
1878, Strassburger estudou as origens adventícias desses
embriões e referiu-se a eles como “poliembronia
esporofítica”. Ademais, o resgate de ESM a partir de
sementes é inicialmente um produto da meiose e da
fertilização, isto é, da reprodução sexual, e suas células
têm a capacidade de reter seu potencial para gerar
múltiplos embriões geneticamente iguais por
poliembriogênese. A falta de uma adequada identificação
da poliembriogênese tem levado ao uso inadequado do
termo indução na literatura da embriogênese somática.
É importante entender a diferença entre MCP e simples
poliembrionia. Esta última poderia ser chamada mais
propriamente de poliembrionia polizigótica. Nesse caso,
múltiplos embriões são originados de zigotos diferentes, o
que os torna geneticamente diferentes. A poliembrionia
polizigótica é encontrada tanto em gimnospermas quanto
em angiospermas. Em Pinus spp., um simples óvulo pode
ter potencial para produzir de 1 a 200 embriões
geneticamente diferentes por poliembrionia polizigótica.
Totipotencialidade e morte celular

O zigoto é considerado totipotente, e o termo
totipotencialidade significa a capacidade que o zigoto
possui de diferenciar-se dando origem aos demais tecidos
da planta. F. C. Steward, trabalhando na Universidade de
Cornell, foi o primeiro a demonstrar a totipotencialidade a
partir de células em suspensão, oriundas da região
floemática de raízes de cenoura. As plantas resultantes
dessas células foram capazes de conservar a
totipotencialidade e passar suas características para as
outras gerações (STEWARD, 1968, 1975). Essa capacidade
do zigoto é singular e o distingue do resto das células
somáticas. Contudo, outras células podem ser
pluripotentes, unipotentes ou programadas para morrer
por apoptose (programmed cell death – PCD) (HAVEL;
DURZAN, 1996a, 1996b; 1999). A apoptose é importante
na formação da madeira, da megasporogênese e da
poliembriogênese, além de defender as plantas de pragas
e de doenças.
Modelos de desenvolvimento na
poliembriogênese
Diferentes modelos de poliembriogênese têm surgido em
coníferas, dos quais um está baseado no desenvolvimento
da semente em estádios ou em etapas iniciais, com ou
sem MCP, segundo foi formulado por Dogra (1979). É um
modelo complexo, derivado do desenvolvimento
morfológico de um proembrião, o qual apresenta células
embrionais primárias inferiores (pE) e superiores (pU),
como proposto por Doyle (1963). Nesse modelo, um
zigoto carente de núcleo é formado depois da fertilização,
o qual produz um proembrião primário que contém
embriões iniciais. Doyle e Looby (1939) observaram que,
no embrião primário, cada célula apresenta potencial para
ser um “embrião inicial”, além de possuir a capacidade de
autorregenerar-se. Embriões iniciais como esses dão
origem a embriões independentes com características
próprias, fato esse que foi negligenciado por um longo
período.
A capacidade de desenvolvimento dos proembriões num
estádio muito precoce depende do número variável de
mitoses anucleares (free-nuclear mitoses), do número de
embriões iniciais e dos fatores nutricionais do gametófito
feminino haploide, durante o processo de formação da
semente. A proembriogenia (ou proembrionia) envolve
todos os estádios que antecedem à elongação do
suspensor. Todas as etapas que ocorrem depois da
elongação do suspensor, mas antecedem o
estabelecimento do meristema radicular, são referidas
como embriogenia precoce (SINGH, 1978).
Conforme Dogra (1979), a morfogênese do embrião é
particionada ou dividida em uma camada terminal de
células embrionárias (E), em uma outra do suspensor (S) e
em uma terceira camada de células primárias superiores
(U). A camada de células do suspensor deriva da terceira
camada e se manifesta depois de divisões internas no
proembrião primário, isto é, a nutrição do embrião
processa-se por meio do suspensor, via citoplasma do
óvulo. Posteriormente, o embrião dominante e outros
produzidos por MCP são nutridos a partir da região de
erosão do gametófito feminino haploide. Mais tarde, essa
região será chamada também de endosperma.
Finalmente, embriogenia refere-se ao processo de
formação do embrião com seus cotilédones durante o
estabelecimento da semente.
Dogra (1967, 1979, 1984), baseando-se em dissecação e
em análise de raios X de sementes, também classificou o
desenvolvimento precoce do embrião em dois tipos. Um
tipo é representado por Picea, por Pseudosuga e por
outras coníferas, as quais não mostram MCP (Figura 1A).
Outro tipo é representado por Pinus spp., em que a MCP é
iniciada pela subdivisão de um zigoto, que resulta em um
grupo de embriões competentes e geneticamente iguais
(Figura 1B), os quais poderiam ou não tornar-se
independentes uns em relação aos outros (Figuras 2A e
2B).
Figura 1. Poliembriogênese. (A) Embrião não clivado de sementes de
Pseudosuga menziesii em meio semissólido. Esse embrião pode ser
multiplicado por MCP por meio de cultura líquida; (B) Embriões
juvenis, formados por ESM e por clivagem múltipla, oriundos de
sementes de abeto-da-noruega; (C) Embriões de Pinus lambertinana
cultivados em meio semissólido incrementam a produção de mais
embriões via MCP; (D) Cultura em suspensão em frascos do tipo
Nippled, com rotação de 1 rpm e em ambiente escuro, incrementa de
forma intensiva a poliembriogênese. A uniformidade dos embriões
juvenis pode ser alcançada por um procedimento denominado
gradiente de densidade; (E) Placa de Petri com embriões
poliembriogênicos em suspensão, formando parte de um
experimento com diferentes tratamentos, que visam à otimização do
seu desenvolvimento; (F) População uniforme de embriões
poliembriogênicos juvenis (iniciais), tingidos com carmim acético
(MCP) e azul de Evan (suspensor anucleado).
Fotos: Don J. Durzan
A MCP incrementa grandemente as chances de que uma

semente tenha ao menos um embrião sobrevivente. Na
maioria das vezes, em sementes, e por razões
nutricionais, somente um embrião dominante torna-se
bem-sucedido. O resto (ESM) permanece inibido na base
do embrião.
Figura 2. MCP e apoptose. (A) No abeto-da-noruega, as células
proembrionais são intensamente tingidas com carmim acético,
enquanto as células do suspensor (estrutura axiais) não apresentam
essa coloração; (B) Massa de células proembrionais clivadas
produziram três proembriões que ainda não se separaram
completamente; (C) Testes com Terminal Uridine Deoxynucleotidyl
Transferase, dUTP, Nick End Labeling (TUNEL) para apoptose
(avermelhado) detectam fragmentação do DNA no lugar inicial de
clivagem (asterisco). Núcleos não apoptóticos coloriram-se de azul
com 4’-6 diamidino-2-fenilindole (DAPI); (D) Os núcleos proembrionais
(azul com DAPI) diferenciam-se dos núcleos apoptóticos das células
que constituem o suspensor (avermelhados pela análise TUNEL); (E)
A microscopia ótica revela duas massas proembrionais não
separadas, com clivagem retardada; (F) A clivagem das massas
proembrionais no processo da poliembriogênese produz liberação de
óxido nítrico (ON), que é detectado por DAF-2DA-verde. O ON forma-
se nas camadas exteriores dos proembriões.
Fotos: Don J. Durzan
Jäger (1899) sugeriu uma forma de descobrir a

capacidade de formar embriões em Taxus baccata, bem
como de demonstrar experimentalmente tal situação.
Essa proposta encontrou suporte aproximadamente um
século depois, quando embriões resgatados de massas
embrionais do sistema embrião-suspensor foram
removidos desde seu confinamento na semente. Quando
isso ocorreu com o auxílio de cultura de células em
suspensão no abeto-da-noruega (Norway spruce),
embriões individuais oriundos dessas massas embrionais
foram vistos em constante clivagem, regenerando
embriões, enquanto as condições de cultura foram
mantidas (DURZAN et al., 1994; DURZAN; GUPTA, 1987;
GUPTA; DURZAN, 1986 a, 1986b;1987a, 1987b).
Segundo, Havel e Durzan (1996a, 1996b), a formação de
um suspensor anucleado ao longo de uma fileira axial de
células envolve apoptose (Figuras 2C e 2D). Nesse
processo, os núcleos das células na parte distal do eixo
tubular são fragmentados com liberação de nucléolos no
citoplasma. Produtos mucilaginosos são formados quando
as células do suspensor anucleado são alongadas, e, de
um modo geral, mucílagos são liberados frequentemente
no meio de cultura. Durante o crescimento, o
desenvolvimento e a diferenciação do embrião, o turnover
de proteínas regulatórias foi influenciado pela
ubiquitinação de aminoácidos em proteínas (DURZAN,
1988b, 1989b, 1996, 2006).
A multiplicidade de embriões via mecanismos ESMs é
ampla e variada no abeto-da-noruega e representa uma
resposta aos diferentes lugares geográficos em países
como a Finlândia. Por isso, quando colocados em meio de
cultura, esses embriões mostram diferentes padrões de
formação ESM, os quais vão depender de sua capacidade
genômica para promover a poliembriogênese, de acordo
com os diferentes ambientes onde essas sementes foram
coletadas (JOKINEN; DURZAN, 1994). Ademais, em Pinus
banksiana, uma influência do ambiente sobre o tamanho
e a composição bioquímica das sementes foi verificada
por meio de diferentes coletas tanto no Canadá como nos
Estados Unidos (DURZAN; CHALUPA, 1976). Por causa da
grande variabilidade genética e geográfica dessas
coníferas, nenhum meio de cultura poderia ser aplicado
indistintamente ou satisfatoriamente a todos os
genótipos.
Em 1985, quando Dogra visitou meu laboratório em Davis,
ele testemunhou como a produção de embriões via ESMs
em Pseudosuga menziesii, em abeto-da-noruega e em
Pinus taeda era a expressão da MCP em cultura de células
em suspensão (Figuras 1B e 1D). Isso claramente
demonstrou que tanto as espécies que apresentam
clivagem quanto as que não apresentam poderiam exibir
poliembriogênese quando o sistema embrião-suspensor e
os embriões juvenis são cultivados in vitro. Contudo, o
grau de poliembriogênese foi genótipo dependente e
influenciado pelas condições do meio, especialmente pela
presença de ácido abscísico.
Outro modelo de embriogênese baseado em embriões
imaturos do abeto-da-noruega foi desenvolvido nos
laboratórios de Sara Von Arnold e, mais tarde, foi utilizado
também por outros pesquisadores. Nesse caso,
proliferações de massas proembriogênicas (Proliferating
Proembryogenic Masses – PEMs) com células
meristemáticas foram iniciadas pela aplicação adequada
de auxina e citocinina no meio de cultura (HAKMAN et
al.,1985). Essas massas proembriogênicas se
multiplicaram por sucessivas mitoses acêntricas como se
tratasse de um processo predominante. No estádio PEM I,
pequenos agregados celulares são caracterizados por
compactas colônias de células com densos citoplasmas
(FILONOVA et al., 2000a, 2000b). Em PEM ll, esses
agregados celulares podem ter mais de um vacúolo.
Embora os estádios mais juvenis da proembriogenia não
possam ser definidos com precisão, os estádios
posteriores correspondem àqueles que acontecem no
curso normal da embriogenia zigótica. Em PEM lll,
agregados celulares apresentam-se alongados com
densos citoplasmas, porém mais soltos do que compactos
e com uma polaridade alterada. A remoção de
reguladores do crescimento ativa a formação de embriões
a partir de PEM lll. PEMs não derivam para embriogênese
somática a menos que PEM lll tenha sido alcançada. Cabe
assinalar que o ácido abscísico promove o ulterior
desenvolvimento dos embriões somáticos e favorecem o
passo da embriogênese tardia para formas mais maduras.
A passagem por meio dessa série de três estádios é
requerida para a transdiferenciação de células em
embriões somáticos, que é definida como a transição de
uma célula em estado diferenciado para outro.
Os três estádios da proembriogenia (PEM), de alguma
forma, emulam a embriogênese das angiospermas
(KOMAMINE et al.,1992; STEWARD, 1968, 1975), ainda
que elas representem diferentes histórias evolutivas e
filogenéticas diante das coníferas. O modelo da
proembriogenia foi mais tarde modificado para que
incluísse clivagem do embrião. Atualmente, diferentes
estratégias moleculares estão sendo desenvolvidas para
entender melhor essa problemática.
Convém salientar que alguns autores partilham da ideia
de que o meristema apical possui células especiais
capazes de iniciar órgãos, como é o caso das células-
tronco em animais (WEIGEL; JÜRGENS, 2002). No entanto,
os genes dessas células-tronco são expressos somente
em certas camadas do meristema.
As células-tronco do meristema apical não parecem fazer
parte das células meristemáticas em PEMs. Na verdade,
elas são consideradas pluripotentes, e são responsáveis
pela formação de novos órgãos, mais do que pela
formação de novos embriões (BHALLA; SINGH, 2006). Não
se sabe também como as células meristemáticas
relacionadas com PEM diferenciam-se a partir de embriões
juvenis ou iniciais. O fato é que diferentes modelos
explicam o desenvolvimento de embriões em coníferas, e
a poliembriogênese (MCP) adiciona ainda mais
complexidade e dúvidas à literatura da cultura de tecidos.
Embriogênese somática e
poliembriogênese em coníferas
A embriogênese somática foi induzida primeiramente em
embriões imaturos de Picea abies, abeto-da-noruega
(CHALUPA 1985, HAKMAN et al., 1985). Por sua vez, a
poliembriogênese somática, em termos de clivagem e de
sistema embrião-suspensor, foi primeiramente observada
em células em suspensão (DURZAN; GUPTA, 1987; GUPTA;
DURZAN, 1986a, 1986b, 1987a, 1987b,). Utilizaram-se
diferentes níveis de ácido abscísico nesses estudos com a
finalidade de separar embriões clivados e de recuperar
embriões individuais em espécies com ou sem clivagem
embrionária (BOULAY et al., 1988, DURZAN; GUPTA,
1988a, 1988b). Ademais, estudos sobre a suscetibilidade
do ácido abscísico e o desenvolvimento da expressão
genética no processo da maturação de embriões
somáticos têm sido conduzidos em Pinus taeda (VALES et
al., 2007).
Desde 1990 até 1995, a embriogênese somática e a MCP
de material diploide e haploide foram descritas em Larix
sp. (BONGA et al.,1995). Na maioria dos casos, o sucesso
foi alcançado com explantes de duas semanas de idade
após a fertilização (mês de junho). A embriogênese
somática de cotilédones foi também induzida com um
sucesso variável.
Para Psudosuga menziesii, a melhor época para induzir
satisfatoriamente células ESMs de sementes em
desenvolvimento do tipo não clivadas deu-se logo após a
fertilização (HONG et al.,1991). Da mesma forma, células
em ESMs foram obtidas e cultivadas sem maiores
problemas a partir de calos, e o material clonal obtido a
partir de células em suspensão foi satisfatoriamente
transferido para o solo (DURZAN, 1988a; DURZAN; GUPTA,
1987). Essa situação novamente provou o potencial
latente dos embriões iniciais em espécies cuja
poliembriogênese (MCP) não era conhecida. Sementes de
Pinus lambertiana (do tipo clivagem) com apenas um
embrião – bem desenvolvido –, quando armazenadas por
5 anos, apresentaram EMSs (sistema embrião-suspensor)
e foram capazes de originar não somente embriões mas
também plântulas sob condições in vitro (GUPTA;
DURZAN, 1986a).
As informações fornecidas até aqui foram uma breve
recapitulação histórica da poliembriogênese. Contudo, é
importante reconhecer que muitos outros pesquisadores
têm demonstrado esse fenômeno numa ampla variedade
de coníferas, por meio da utilização de diferentes métodos
de cultura. Assim sendo, uma ampla gama de
pesquisadores tem dado uma apreciável contribuição para
que seja possível compreender a poliembriogênese em
plantas lenhosas.
Especificidade de diagnósticos e
criopreservação de genótipos
A separação de células em suspensão por meio da
centrifugação e do fracionamento melhorou a geração de
linhagens celulares, de MCP e de maturação embrionária.
A reinoculação dessas células incrementou sua cultura e
permitiu que houvesse uniformidade e sincronização
durante sua produção em massa (Figuras 1D e 1E)
(DURZAN; CHALUPA, 1976). Ademais, a coloração dupla
com aceto, carmim e azul de Evans (Figura 1F) permitiu
visualizar bem as células proembrionais e diferenciá-las
das células do suspensor. Esse fato, igualmente, permitiu
avaliar a qualidade de ESMs depois da criopreservação
em nitrogênio líquido (GUPTA et al.,1987a). A
criopreservação tem sido repetida por outros autores por
meio do uso do modelo da proliferação de massas
proembriogênicas (PEM) e de suas consequentes
variações para o armazenamento de germoplasmas.
Antibióticos específicos para ubiquitina PCNA (proliferating
cell nuclear antigen) e para ensaios com TUNEL1 (nick end
labeling) foram usados para seguir o recâmbio das
proteínas regulatórias, a síntese de DNA, o ciclo celular e
a apoptose (DURZAN, 1996; DURZAN et al., 2006; HAVEL;
DURZAN, 1996a, 1999). Com todas essas técnicas, e com
a distribuição de proteínas nas camadas celulares axiais,
foi possível estabelecer um paralelo entre os diferentes
perfis de proteínas obtidos por gel de poliacrilamina
(DURZAN, 1996).
Ativas e mecanicamente estressadas, as células das
coníferas no meio de cultura rapidamente liberam ON, o
qual precede à produção de etileno (MAGALHÃES et al.,
2000) (Figuras 2C e 2F). O ON é um radical livre que
podze ter efeitos benéficos ou lesivos. Em baixos níveis,
pode reduzir o dano que as diferentes espécies de
oxigênio reativo podem causar. Em baixos níveis, ele
também participa do sistema de sinalização celular dentro
do âmbito da defesa da planta. Em altos níveis celulares,
o ON contribui para o envelhecimento, causa danos ao
DNA e leva à apoptose (MAGALHÃES et al., 2000;
PEDROSO et al., 2000). O ON é originado a partir da
arginina por meio de reação parcial no ciclo da ureia
(DURZAN; PEDROZO, 2002; DURZAN; STEWARD, 1983;
DURZAN et al., 2006). Por um lado, a arginina é também
precursora de guanidinas monossubstituídas, que são
inibidoras naturais da óxido nítrico sintase. Por outro lado,
ela está envolvida na síntese de ureia, de ornitina, de
agmatina, bem como na acumulação de prolina sob
condições de estresse.
Filonova et al. (2002) tem proposto que a morte celular
programada (programmed cell death – PCD) é o principal
mecanismo responsável pela eliminação competitiva de
embriões secundários em sementes poliembrionais. A PCD
é tida como um mecanismo importante que possibilita a
competição entre os vários embriões monozigóticos,
garantindo a sobrevivência de um só. Isso ocorre por meio
de um programa autocatalítico de autodestruição ainda
não definido.
Esse programa, que ainda não está definido, não explica
as várias outras formas de apoptose nem a poliembrionia
modificada em Pinus spp., na qual a tal eliminação não
acontece (SIMAK, 1973).
Com respeito à eliminação competitiva, o papel dos necro-
hormônios produzidos por células moribundas
(HABERLANDT, 1922; HAVEL; DURZAN, 1996a) e da
degeneração de núcleos remanescentes eliminados desde
a população de embriões ocorre em virtude de lesões ou
mutações somáticas. A apoptose contribui para a
formação de embriões apomíticos em células em
suspensão no abeto-da-noruega (BELL, 1994). Vale
considerar que as células apomíticas são reabsorvidas
durante a formação da megáspora, e essa reabsorção tem
sido considerada uma forma de canibalismo no processo
de propagação das coníferas, pois isso tende a reduzir o
número de indivíduos (HAIG, 1992). Ademais, com
respeito ao tamanho e à viabilidade das sementes,
importante informação tem sido reportada por Xiao et al
(2006a, 2006b).
Em Pinus taeda, um sistema de nove estádios baseado na
morfologia do embrião tem sido formulado para comparar
a expressão gênica em embriões zigótenos e somáticos.
Como exemplo pode-se citar a transcrição reversa que
ajudou a encontrar a cópia de um gene para
aquagliceroporina, o qual foi abundantemente expresso
no suspensor de embriões zigóticos e somáticos dessa
espécie (CIAVATTA et al., 2001). No entanto, sua fisiologia
permanece ignorada. Em virtude disso, ainda são
necessários mais esforços para melhorar critérios de
avaliação no tocante a características fenotípicas e
genéticas (DURZAN, 1989a).
Protoplastos e engenharia
genética
Depois de 15 semanas, uma população de dez
protoplastos oriunda do sistema embrião-suspensor
(ESM), em Pinus taeda, desenvolveu mais de cem
embriões somáticos (GUPTA; DURZAN, 1987a). Em
trabalhos subsequentes, protoplastos de embriões do
abeto-branco produziram plântulas (ATTREE et al.,1989).
Protoploastos originados de suspensão celular via ESMs
de Pseudosuga menziesii e de Pinus taeda foram usados
para introduzir genes com resistência a insetos via
eletroporação (GUPTA et al.,1988). Tentativas similares
têm sido realizadas com luciferase; entretanto, árvores
transformadas com genótipo estável não têm sido
obtidas.
Poliembronia em sementes e
fatores ambientais
Condições climáticas adversas podem induzir a morte
tardia do embrião e, consequentemente, ocasionar o
aparecimento de sementes não viáveis (DOGRA, 2001). As
condições climáticas severas no Ártico, notadamente na
Escandinávia e na Rússia, contribuem para um pobre
desenvolvimento da semente, porém esse fato pode
estimular a poliembrionia (SIMAK, 1973). O pobre
desenvolvimento está correlacionado tanto com a baixa
temperatura quanto com uma estação curta de
crescimento. As temperaturas baixíssimas estão
relacionadas de forma positiva com o fenômeno da
poliembronia. Os últimos estádios do desenvolvimento
são inibidos de modo que apenas um embrião consiga se
estabelecer. A falta de dominância entre os múltiplos
embriões foi considerada uma semelhança de
comportamento em relação ao ápice terminal e aos brotos
laterais nas árvores. Se o broto do meristema apical perde
a dominância, uma competição é desenvolvida em nível
de brotos colaterais para estabelecer uma nova liderança.
Na floresta natural, onde predomina o fenômeno da
autopolinização e sua respectiva carga genética, os genes
letais ou semiletais podem eliminar completamente
indivíduos originados por esse fenômeno. Sementes
vazias ou embriões imaturos são frequentemente
encontrados, assim sendo a poliembrionia pode
contrabalançar a excessiva perda por autofecundação.
Ademais, se algum embrião no óvulo, que se origina por
autofecundação, morrer por incompatibilidade, a semente
ainda tem o recurso de desenvolver algum outro embrião
por conceito de fertilização cruzada. Porém, esse
fenômeno é pouco frequente (HAGMAN, 1975).
Embriões haploides algumas vezes também podem ser
encontrados em sementes poliembriônicas (ILLIES, 1964;
SIMAK et al., 1968). Nesse caso, genes letais recessivos
são diretamente expressos no haploide; no entanto, os
embriões não sobrevivem. No material sobrevivente
remanescente haploide, a duplicação de cromossomos via
colchicina poderia oferecer embriões diploides, os quais
seriam depurados dos fatores letais.
Os diferentes genótipos também podem variar na sua
habilidade de liberar etileno em cultura (JOKINEN;
DURZAN, 1994). Altos níveis de etileno podem facilmente
afetar de forma negativa outras células genotípicas com
bom potencial morfogenético, caso elas se encontrem nas
mesmas condições de cultura daquelas células de alta
produção de etileno, a menos que a produção de etileno
seja removida por algum meio.
Protocolo para Pseudosuga

menziesii
Pinus taeda e Psudosuga menziesii são duas das mais
importantes coníferas encontradas nos Estados Unidos
tanto por sua capacidade de fornecer madeira quanto
pelo fato de fornecer polpa de celulose e papel. É
interessante o fato de que as sementes de Pseudosuga
menziesii não exibem MCP, mas podem realizá-la quando
proembriões são resgatados, cultivados e clonados por
meio de células em suspensão (DURZAN; GUPTA, 1987).
Esse processo, denominado poliembrogênese somática,
está protegido por meio de patente (DURZAN; GUPTA,
1988b) e encontra-se licenciado para uso pela empresa
Weyerhaeuser (EUA), uma das maiores do mundo em
matéria de indústria florestal. Outras tecnologias
adicionais sobre produção de embriões somáticos em
cultura líquida, em distribuição e em venda de sementes
manufaturadas estão também protegidas por patentes
pela mesma empresa, visto que essa é uma forma de
reduzir custos e incrementar a eficiência da propagação
clonal em massa (CARLSON et al., 1997; GUPTA et al.,
1991, 1993).
A Weyerhaeuser usa a tecnologia de biorreatores no
desenvolvimento e amadurecimento de embriões (Figura
3A) (TIMMIS, 1998). Nessa empresa, mais de 700
genótipos têm sido criopreservados em nitrogênio líquido.
Além disso, mais de 250 mil clones de uma ampla gama
de genótipos têm sido produzidos para testes de campo
(Figuras 3C e 3D). Dentro desse elenco de tecnologias,
cabe mencionar também a produção de sementes
sintéticas no abeto-da-noruega, para facilitar sua
manipulação e propagação clonal (Figura 3B).
Figura 3. (A) Embriões clonais de abeto-da-noruega produzidos por
MCP, em meio semissólido, apresentando cotilédones em
desenvolvimento; (B) Embriões de abeto encapsulados em um gel de
alginato. O material de encapsulamento não tem um caráter
nutricional; (C) Em casa de vegetação, o material clonal é submetido
à avaliação para que se observe seu ganho genético; (D) No campo
material clonal, em plena avaliação true-to type, para observar
variação somaclonal e potencial comercial.
Fotos: Don J. Durzan e Gupta
Ganhos genéticos em florestas
clonais
No tocante aos programas de melhoramento genético de
plantas lenhosas, a propagação vegetativa per si pode
dobrar, em curto espaço de tempo, os ganhos genéticos
(G) na silvicultura (TIMMIS et al.,1987). Além disso, ela
oferece economia de recursos ao evitar longos ciclos de
testes e de produção de sementes. Dentro do âmbito
genético, esses ganhos podem ser representados por G,
ou seja, pela variação genética total, que pode ser
desdobrada em variância aditiva (Va) e não aditiva. A Va é
também um coeficiente de melhoramento para a
população, mas, em se tratando de propagação por
semente, somente Va pode ser manipulada. Todavia, exis‐
tem outros componentes da variância genética total, que
são de caracteres específicos, a saber: variância
dominante (Vd), variância epistática (Vi), variância clonal
(Vclonal) e a variância fenotípica total para a população
clonal (Vpc). Em geral, a interação genótipo-tratamentos e
mudanças clonais (aberrações cromossômicas, por
exemplo) podem provocar importantes variações na
captura do ganho genético (PARK et al.,1993).
O potencial da cultura de tecidos em plantas lenhosas
pode ser apreciado por meio da empresa Weyerhaeuser
que, somente em 2005, plantou 36.892 clones de
Pseudosuga menziesii e 1.250 de Picea abies, todos
obtidos por embriogênese somática. No tocante a Pinus
taeda, foram colocados 27.866 clones, e 2.109 clones
elites foram estabelecidos em casa de vegetação, os
quais estavam prontos para serem transferidos para o
campo. Hoje a mesma empresa está em condições de
produzir cerca de 100 milhões de plântulas por ano das
espécies Pseudosuga menziesii e Pinus taeda.
Na Europa, clones produzidos por PEMs têm sido testados
no campo para abetos, pinheiro e outras coníferas
(HÖGBERG et al., 2003). No Norte e no Sul da América, no
Sudeste Asiático e na Nova Zelândia, várias indústrias
privadas e governamentais têm massificado a produção
clonal. Além disso, testes de campos têm sido iniciados
para avaliar a realidade econômica dessas florestas
clonais, visto que o custo de produção de uma muda
clonal é mais alto de que o de uma originada por
semente. Entretanto, é bom lembrar que a produtividade
do material clonal oferece um potencial produtivo mais
atraente, portanto a relação custo-benefício é mais
favorável.
Desafios futuros
Não se pode negar o tremendo impacto da cultura de
tecidos, bem como da embriogênese somática no campo
da agricultura e nos empreendimentos florestais.
Contudo, restam problemas biológicos subjacentes que
precisam ser esclarecidos, de modo que seja possível
controlar e manipular com mais precisão o processo
embriogenético, com o objetivo de melhorar a
mecanização e a automatização para que se obtenha uma
participação no mercado mais eficiente e competitiva. É
evidente que isso será alcançado com o maior progresso
das ciências básicas e das condições in vitro, nas quais os
sistemas clonais mais robustos e flexíveis sejam
desenhados dentro do âmbito do melhoramento florestal
de coníferas com vistas na adaptação a diferentes
ambientes.
Referências
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CAPÍTULO 6
Biorreatores para
produção de mudas em
larga escala
Biorreatores são equipamentos para cultivo sob regime de

imersão temporária ou permanente de células, de gemas,
de embriões ou de qualquer tipo de propágulo que possa
ser utilizado em cultura de tecidos de plantas. Os
biorreatores utilizam meio de cultura líquido, com
renovação do ar durante o cultivo e com o monitoramento
de um ou de mais parâmetros essenciais ao crescimento
do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido,
temperatura, concentração de íons, entre outros.
Os primeiros biorreatores para cultivo de células vegetais
consistiram em adaptações de equipamentos já existentes
no mercado – denominados fermentadores –, os quais
foram desenvolvidos para o cultivo de fungos e de
bactérias, tanto em escala experimental (de tamanho
pequeno), quanto em escala industrial (de médio e de
grande porte). Assim, os primeiros biorreatores testados
em plantas continuaram sendo chamados de
fermentadores, que foram adaptados para o cultivo de
células vegetais isoladas, de forma muito parecida com o
que era feito com fungos e bactérias.
Inicialmente, os fermentadores foram empregados com
pouca ou com nenhuma modificação no cultivo de células
vegetais. Para isso, pequenos ajustes foram feitos
basicamente na taxa de renovação de ar e na forma de
agitação das células. Biorreatores para cultivo de células
vegetais foram bastante estudados, principalmente na
década de 1980, e uma série de modelos específicos para
plantas foi desenvolvida.
Nas últimas décadas, biorreatores começaram a ser
utilizados para cultivo de embriões, de gemas e de
plântulas, com o objetivo de produzir mudas em larga
escala. Um dos primeiros relatos sobre o uso de
biorreatores na propagação vegetal foi feito por Takayama
e Misawa (1981), para micropropagação de begônia.
Nesse caso, os autores utilizaram segmentos de folhas
com gemas adventícias induzidas in vitro, seguindo
protocolos de cultivos desenvolvidos em meio gelificado.
O desenvolvimento das gemas foi avaliado em meio
líquido sob agitação em frascos de Erlenmeyers ou em
biorreatores com aeração forçada. Procedimentos
similares foram adaptados para outras espécies vegetais,
como, por exemplo, para embrião somático de café
(NORIEGA; SÖNDAHL, 1993) e para produção de
microtubérculo de batata (AKITA; TAKAYAMA, 1994).
Os biorreatores são utilizados igualmente para produção
de embriões somáticos (TAUTORUS et al., 1992; DENCHEV
et al., 1992) e de sementes sintéticas (ATTREE et al.,
1994; ONISHI et al., 1994). Essa metodologia exige
completo domínio sobre as fases de indução, de seleção e
de multiplicação de calos embriogênicos, bem como das
fases de diferenciação, de maturação e de germinação
dos embriões somáticos. Eventualmente, o
encapsulamento de embriões diferenciados, que dão
origem a sementes sintéticas, pode representar um passo
importante na obtenção de propágulos de alta qualidade
que possam ser eficientemente convertidos em plantas
tanto em biorreatores quanto em condições de casa de
vegetação.
Constituição básica dos

biorreatores
A constituição básica dos primeiros biorreatores usados
para cultura de embrião, de gemas e de hastes caulinares
para fins de micropropagação é fundamentalmente a
mesma dos fermentadores utilizados para cultivo de
células vegetais (TAKAYAMA; AKITA, 1994). Basicamente,
esses equipamentos apresentam os seguintes
componentes: frasco de cultivo; motor elétrico conectado
a um eixo que se estende até o interior do frasco, no qual
são encaixados uma ou mais hélices; bomba compressora
de ar; sensores de temperatura, de pH e de oxigênio
(TAKAYAMA; AKITA, 1994).
O frasco de cultura é desenhado de tal forma que permita
uma ótima aeração do meio de cultura, bem como uma
homogeneização satisfatória com um mínimo de dano
mecânico do material em cultivo. Os frascos podem ser
feitos de vidro, de aço inoxidável, de policarbonato, de
polipropileno ou de qualquer outro material que resista à
autoclavagem (temperatura de 121 °C por um período de
15 a 30 minutos). Frequentemente, o frasco de cultivo
apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta,
por onde circula água com temperatura predeterminada,
para controle da temperatura de cultivo (TAKAYAMA;
AKITA, 1994). O volume dos frascos normalmente varia de
1 L a 20 L, embora volumes menores como 250 mL e 500
mL e maiores (30 L ou, até mesmo, 300 L) já tenham sido
utilizados. Entretanto, a maioria dos frascos utilizados
está na faixa de 1 L a 4 L (TAKAYAMA; AKITA, 1994).
A homogeneização do meio de cultura e a aeração do
material em cultivo são feitas de diversas formas. A mais
comum é a injeção de um fluxo de ar a uma determinada
pressão, combinada com o movimento de uma hélice no
interior do frasco de cultivo (TAKAYAMA; AKITA, 1994). O
ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a
passar através de uma membrana com poros de 0,22 µm
a 0,44 µm de diâmetro.
Principais tipos de biorreatores
utilizados para cultivo de hastes
caulinares e de embriões
Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e
utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas,
de embriões e de plantas. Esses biorreatores são
classificados pelo tipo de agitação e pela construção do
frasco (TAKAYAMA; AKITA, 1994).
Biorreatores do tipo aerador agitador

(aeration agitation bioreactor)
Este tipo de biorreator é o mais parecido com os
fermentadores convencionais. A agitação é feita por meio
de hélices conectadas a um eixo giratório. É basicamente
utilizado para células e embriões somáticos (KESSEL;
CARR,1972; PREIL et al., 1988). A grande desvantagem
desse modelo de biorreator é o fato de que, para haver
uma boa homogeneização do meio, faz-se necessário que
a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas, o
que, em regra geral, causa dano mecânico acentuado ao
material em cultivo, principalmente em hastes e em
gemas.
Biorreator do tipo tambor rotatório

(roller drum bioreactor)
Neste tipo de biorreator, o frasco de cultivo gira
suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos,
que servem de apoio e também são responsáveis por
imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório.
Nesse modelo, o dano mecânico é mínimo e é adequado
ao cultivo de embriões e de plantas. Entretanto, o nível de
oxigenação só é adequado, quando se utilizam meios de
cultura com alta viscosidade (TANAKA et al., 1983).
Biorreator do tipo filtro rotatório (spin

filter bioreactor)
O biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro
conectado a um eixo central, por onde o meio de cultura é
descarregado (STYER, 1985). Esse elemento é
responsável tanto pela homogeneização como pela
aeração do material em cultivo. Esse tipo de biorreator
funciona satisfatoriamente bem para propagação via
embriogênese somática (WHEAT et al., 1986).
Biorreator do tipo borbulhamento (air

driven bioreactor)
O biorreator do tipo borbulhamento apresenta uma
constituição muito simples. A homogeneização do meio e
a aeração são feitas via borbulhamento de ar a partir do
fundo do frasco. Pode ser de dois tipos: aeração simples
ou coluna de bolha.
A relação altura-diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de
aeração simples. Se a relação for de 3 ou mais, o
biorreator é do tipo coluna de bolha. Esses modelos de
biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de
hastes caulinares, de bulbos, de cormos e de tubérculos
(TAKAYAMA; MISAWA, 1981; TAKAYAMA et al., 1991). Esse
tipo foi primeiramente desenvolvido e utilizado na
micropropagacão por Takayama e Misawa (1981).
Biorreator do tipo levantamento de ar

(air lift bioreactor)
O meio de cultura neste tipo de biorreator é movido de
baixo para cima, dentro de um tubo situado verticalmente
no interior do frasco, pelas bolhas de ar produzidas no
fundo do frasco de cultivo. Esse modelo apresenta bons
resultados, uma vez que há uma boa aeração e
homogeneização do meio de cultura e causa pouco dano
mecânico ao material em cultivo (PARK et al., 1989). A
única característica que difere esse biorreator do modelo
anterior é o fato de que o borbulhamento de ar é feito
dentro de um tubo centralizado no interior do frasco de
cultivo.
Biorreator do tipo fase gasosa (gaseous

phase bioreactor)
Este modelo é equipado com um suporte perfurado sobre
o qual o material em cultivo é posicionado. O meio de
cultura pulverizado sobre o material em cultivo é, em
seguida, drenado pela base de suporte e novamente
bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos
(USHIYAMA, 1984). Esse tipo de biorreator apresenta
excelentes resultados no cultivo de células, de tecidos e
de órgãos, porque não causa dano mecânico, nem
agitação via borbulhamento. O inconveniente desse
modelo é a não renovação do ar interno do frasco de
cultivo, o que pode ser contornado pela inclusão de um
sistema de aeração via injeção de ar estéril.
Biorretor de aeração por

membrana porosa ao oxigênio
(oxygen permeable membrane
aerator bioreactor)
O frasco de cultura deste tipo de biorreator contém uma
canalização fina em forma de espiral feita de material
poroso em relação ao oxigênio, que pode ser de teflon, de
silicone, de policarbonato ou de polipropileno, através do
qual o oxigênio passa para o meio de cultura. Esse modelo
de biorreator não apresenta problemas relacionados a
dano mecânico, uma vez que não há nenhum tipo de
agitação; entretanto, a homogeneização do meio de
cultura fica prejudicada (LUTTMAN et al., 1994).
Biorreator do tipo sobreaeração

(overlay aeration bioreactor)
Neste modelo, a aeração é feita por sopramento do ar
estéril sobre o meio de cultura. Eventualmente, esse tipo
de aeração pode ser combinado com agitação suave do
meio (ISHIBASHI et al., 1987). O modelo apresenta
deficiência na aeração, o que pode comprometer o
crescimento, sobretudo, de células e de tecidos.
Biorreator de imersão temporária

Em todos os modelos descritos anteriormente, com
exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização
do meio, o material em cultivo permanece continuamente
imerso no meio de cultura. Essa imersão contínua causa
problemas de hiper-hidratação dos tecidos, dos órgãos e
das plântulas. Dependendo da espécie e do tipo de meio
utilizado, a hiper-hidratação dos tecidos pode causar
distúrbios fisiológicos sérios, que irão afetar o crescimento
e o desenvolvimento do material em cultivo, fenômeno
conhecido por hiper-hidricidade.
Com o objetivo de eliminar ou minimizar esse problema,
desenvolveu-se um modelo de biorreator, chamado de
imersão temporária (ALVARD et al., 1993). Nesse tipo, o
meio de cultura permanece em contato com o explante
por um período predeterminado. Em seguida, o meio é
drenado, e o explante deixa de ficar em contato direto
com o meio de cultura.
O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) é
constituído de um frasco de dois compartimentos, um
superior e um inferior, os quais se encontram conectados
entre si por um tubo. O meio de cultura é colocado no
compartimento inferior, enquanto o material a ser
cultivado, no superior. O meio de cultura passa do
compartimento inferior para o superior pela injeção de ar
no compartimento inferior. Quando todo o meio passa
para o compartimento superior, ocorre borbulhamento e
aeração do meio em contato com o material em cultivo. O
ar é expelido através de um orifício na tampa do
compartimento superior. Após um período
preestabelecido, a pressão do ar no compartimento
inferior é aliviada e o meio retorna ao compartimento
inferior por gravidade, permanecendo aí até que o ciclo
recomece.
O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) foi
modificado no que se refere à construção, mas mantém
as mesmas características de funcionamento, dando
origem ao sistema de biorreator denominado RITA®
(TEISSON et al., 1995).
O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de

espécies vegetais, com diferentes tipos de explantes e
apresenta resultados muito bons (ALVARD et al., 1993;
CABASSON et al., 1997; ETIENNE et al., 1997; ETIENNE-
BARI et al., 1999; MCALISTER et al., 2005; TEISSON et al.,
1995).
Na realidade, o princípio da imersão temporária para
cultivo de células e de tecidos vegetais relativamente
grandes foi primeiramente descrito por Steward et al.
(1952), relatado por Harris e Mason (1983). Segundo
Harris e Mason (1983), Steward et al. (1952)
demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio
líquido não apresentavam crescimento satisfatório e
concluíram que o motivo era deficiência de oxigenação do
meio de cultura. Com o objetivo de contornar esse
problema, Steward et al. (1952) construíram um
equipamento que foi denominado de auxophyton, que
movimentava os frascos de cultura de forma rotacional
sobre uma roda, de tal forma que, em determinado
momento, os segmentos de raiz eram expostos ao ar e,
no momento seguinte, submersos no meio líquido. Com
isso, houve um aumento da matéria fresca de 38,1 mg em
meio gelificado para 98,6 mg em meio líquido no
auxophyton. Esses frascos apresentavam uma série de
mamilos (nipples), que permitiam a retenção do material
em cultivo, segmentos de raízes ou mesmo células, e,
consequentemente, o contato intermitente do material
com o meio de cultivo.
Posteriormente, um equipamento desenvolvido por Harris
e Mason (1983), para cultivo de explantes de uva em
meio líquido em frascos do tipo Erlenmeyer, apresentava
o mesmo princípio relatado por Steward et al. (1952).
Nesse equipamento, o frasco do tipo Erlenmeyer era
mudado automaticamente de posição a intervalos
predeterminados, de tal forma que, em certa posição, o
explante se encontrava submerso e, em outra posição,
não submerso. O estoque inicial de explantes era obtido
por meio do cultivo, por 28 dias, em meio gelificado com
ágar. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão
temporária, a produção de brotos foi sete vezes superior
ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com
ágar.
Tisserat e Vandercook (1985) desenvolveram um sistema
de cultivo em imersão temporária que consistia em uma
grande câmara de cultura, que era periodicamente cheia
de meio de cultura. Embora o controle da troca gasosa
fosse insatisfatório, esse método de cultivo por imersão
temporária mostrou ser igualmente muito superior aos
cultivos em meios gelificados.
Aitken-Christie e Jones (1987) utilizaram igualmente um
sistema de cultivo em imersão temporária na propagação
de Pinus. Nesse sistema, o meio nutritivo líquido era
colocado sobre o meio sólido em que estavam os
explantes. O meio permanecia em contato com o explante
por um período de 4 a 6 horas. Após esse período, o meio
era retirado por intermédio de uma bomba de vácuo. Esse
procedimento era repetido a cada semana.
Pouco tempo depois, Aitken-Chistie e Davies (1988)
desenvolveram um sistema semiautomático de cultivo
sob imersão temporária, no qual plântulas eram
cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado,
com adição e remoção automática e periódica do meio
líquido.
Simonton et al. (1991) desenvolveram um equipamento
automático de micropropagação, no qual o meio líquido
era injetado sobre as plântulas em cultivo, de acordo com
um esquema de tempo preestabelecido. Embora esse
sistema tenha apresentado um excelente desempenho
quanto ao preciso controle da exposição do explante ao
meio de cultura, alguns problemas foram identificados,
como o uso de frasco relativamente grande, de difícil
manuseio, além de alguns problemas de contaminação,
especialmente do tipo bacteriana.
Uma modificação mais recente do modelo de biorreator
de imersão temporária foi feita por Lorenzo et al. (1998)
para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar. O
mesmo modelo foi utilizado por Escalona et al. (1999)
para multiplicação de gemas de abacaxi. Esse sistema
utiliza dois frascos: um para cultivo do material vegetal e
outro para estocagem do meio de cultura.
Biorreator de imersão temporária

(modelo da Embrapa)
A participação da mão de obra no processo convencional
de micropropagação é da ordem de 60% a 70% do custo
final da muda. Grande parte do envolvimento dessa mão
de obra diz respeito principalmente à fase de
alongamento/enraizamento, em virtude do uso de grande
número de frascos, além da manipulação de cada
explante em capela de fluxo laminar, para subdivisão dos
agregados de gemas em segmentos menores o suficiente
para serem cultivados em frascos individuais.
Dessa forma, qualquer medida visando à redução do
envolvimento de mão de obra irá contribuir
significativamente para baixar o custo final da muda, o
que tornará o processo mais econômico. Com o intuito de
reduzir o número de frascos envolvidos no processo e de
eliminar a necessidade de manipulação dos agregados de
gemas e de multibrotos em capela de fluxo laminar e a
repicagem para os frascos de alongamento, desenvolveu-
se um biorreator de imersão temporária. Após ser
submetido ao Inpi para fins de patenteamento, esse
biorreator recebeu o código PI 0004185-8 em 28 de
agosto de 2000.
Vantagens do uso de biorreatores

em relação ao processo de
micropropagação convencional
O uso de biorreator de imersão temporária, sobretudo na
fase de alongamento/enraizamento, apresenta uma série
de vantagens em relação ao processo convencional, tais
como:
Uso de meio líquido, que permite melhor nutrição do

tecido, melhor taxa de crescimento, além de
acelerar o processo.
Emprego da imersão temporária, que propicia uma
renovação adequada do ar no interior do frasco de
cultivo e evita o contato permanente dos tecidos em
cultivo com o meio de cultura líquido, o que é
prejudicial.
Uso de frascos maiores, que podem chegar a
dezenas de litros. Com isso, os agregados de gemas
ou multibrotos não precisam ser subdivididos antes
de serem transferidos para o meio de
alongamento/enraizamento, o que reduz
significativamente o envolvimento de mão de obra e
também diminui os riscos de recontaminação
durante a manipulação dos explantes.
Menor risco de erro na etiquetagem, já que o
número de frascos manipulados é
consideravelmente menor.
Maior uniformidade das mudas ao final do processo.
Menor estresse gasoso e mecânico, com reflexos
positivos no crescimento e no vigor das mudas.
Melhor resposta morfogenética em decorrência das
melhores condições de cultivo.
Finalmente, em decorrência de todos esses fatores,
redução significativa da mão de obra, o que diminui
expressivamente os custos de produção.
Características do equipamento
características básicas são as seguintes:
Pode utilizar diferentes tipos de frascos, que variam

em
tamanho, formato, constituição, tipo de tampa,
transparência, etc.
A montagem é modular e comporta desde uma até
dezenas de pares de frascos.
Pode ser montado em diferentes ambientes, nos
quais haja variações no que diz respeito à
intensidade de luz, ao fotoperíodo e à temperatura.
Pode ser facilmente convertido para o
funcionamento no regime de imersão contínua,
quando necessário.
Oferece como opção o uso de uma fonte de ar
artificial com dosagens específicas de oxigênio, de
nitrogênio e de gás carbônico.
O cultivo de mudas de diferentes espécies depende
apenas do ajuste dos meios nutritivos, bem como do
intervalo de imersão.
Pode ser utilizado, igualmente, para a multiplicação
de bactérias e de fungos, desde que sejam feitas
pequenas modificações em termos de taxa de
aeração, de uso de misturas gasosas específicas e
de ajuste do meio de cultura.
Descrição do equipamento
Figura 1. Biorreator de imersão temporária desenvolvido pela
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, composto de cinco
prateleiras com oito pares de frascos cada. (A) Kit de biorreator com
40 pares de frascos; (B) Frasco de meio (esquerda) e frasco de cultivo
(direita); (C) Compressor de ar, filtros, válvulas solenoides e
temporizadores.
Fotos: João Batista Teixeira
O biorreator desenvolvido pela Embrapa Recursos Gené‐

ticos e Biotecnologia (Figura 1) é constituído pelos
seguintes equipamentos: frascos de armazenamento de
meio (Figura 1B, esquerda), frascos de cultivo (Figura 1B,
direita), filtro de ar com poros de 0,22 µm (Figura 1B),
válvulas solenoides, frasco de borbulhamento,
temporizadores, fonte de pressão positiva, filtro de ar/óleo
(Figura 1C).
Funcionamento do equipamento
O ar do tanque do compressor entra no sistema, passando
inicialmente pelo filtro de ar seco, para remover óleo e
partículas sólidas por meio da válvula solenoide
comandada pela programação do temporizador. O ar, em
seguida, passa pelo frasco de borbulhamento, que contém
água deionizada, para uma segunda filtragem e
umidificação do ar. Depois disso, o ar entra na
canalização, passa pelo filtro de esterilização e faz
pressão no interior dos frascos de meio de cultura. Com
isso, o meio é pressionado a passar para os frascos de
cultivo, o que resulta na imersão do material e na
renovação do ar no interior dos frascos. Após alguns
minutos, há inversão do fluxo de ar, e a pressão é
exercida nos frascos de cultivo. Com isso, o meio de
cultura retorna ao frasco de meio, completando o ciclo.
Depois de determinado intervalo de tempo
preestabelecido pela programação dos temporizadores, o
ciclo recomeça. Normalmente, o tempo de imersão é de
alguns minutos, o que é suficiente para a transferência
total do meio para o frasco de cultivo. Por sua vez, o
intervalo entre os períodos de imersão varia de 2 a 6
horas, dependendo da espécie e do material que está
sendo cultivado. O equipamento aqui descrito, além de
funcionar no sistema de imersão temporária, pode ser
adaptado para funcionar sob regime de imersão contínua.
O período de borbulhamento sob regime de imersão
contínua pode ser programado de acordo com a
necessidade do explante em cultivo.
Uso do biorreator na produção de

mudas de abacaxi
A produção de mudas de abacaxi pode ser conduzida em
frascos convencionais sem grandes problemas (TEIXEIRA
et al., 2001). Usa-se meio gelificado nas fases de
estabelecimento e de meio líquido, em camada fina, nos
meios de multiplicação e de alongamento/enraizamento.
Até a fase de multiplicação, o número de frascos
utilizados é relativamente pequeno. Por exemplo, para a
produção de mil mudas, o número de frascos (do tipo
frasco de maionese com 250 mL) até a fase de
multiplicação é da ordem de 10 a 20 unidades. Já para a
fase de alongamento/enraizamento, o número de frascos
pode subir para cem, considerando-se 10 mudas por
frasco ao final do processo. Muitas vezes, o número de
mudas por frasco é ainda menor, por isso faz-se
necessário um número maior de frascos, que pode chegar
a 150 unidades.
O uso de frascos pequenos na fase de
alongamento/enraizamento encarece substancialmente o
preço final da muda, em decorrência do envolvimento de
mão de obra para lavagem dos frascos, preparo de meio
de cultura e manipulação dos explantes em capela de
fluxo laminar de ar estéril. Já o uso de biorreator,
principalmente na fase de alongamento/enraizamento
(Figuras 2A e 2I), pode contribuir significativamente para
redução do uso de mão de obra. Para a fase de
alongamento/enraizamento, seriam necessários não mais
do que cinco frascos de biorreator, para produzir, ao final
do processo, algo em torno de mil mudas. Já em frascos
do tipo maionese de 250 mL, seriam necessários cerca de
cem frascos para produzir o mesmo número de mudas.
Além do mais, os multibrotos resultantes ao final da fase
de multiplicação não precisam ser subdivididos antes de
serem transferidos para a fase de
alongamento/enraizamento, como ocorre com o processo
convencional, resultando em economia de mão de obra.
O biorreator pode ser utilizado na fase de multiplicação.
Entretanto, como o equipamento tem um custo
relativamente alto, é desaconselhável o seu uso nessa
fase, para que o mesmo possa ser utilizado um maior
número de vezes durante o ano. A fase de
alongamento/enraizamento dura entre 45 e 60 dias, o que
permite o uso de um kit de biorreator por cinco a seis
ciclos de cultivo por ano.
Produção de mudas em um kit de

biorreator de 40 pares de frascos
Figura 2. Fase de alongamento/enraizamento conduzida em

biorreator de imersão temporária desenvolvido pela Embrapa. (A) e
(B) Vista geral dos frascos ao final da fase de
alongamento/enraizamento; (C) Unidade de cultivo representada pelo
frasco de meio e pelo frasco com os explantes; (D) Vista aproximada
das gemas alongadas antes da abertura dos frascos; (E) Aspecto das
mudas após o corte do frasco ao meio; (F) e (G) Aglomerado de
mudas após a retirada do frasco de cultivo; (H) Aspecto das mudas,
que apresentam comprimento entre 5 cm e 8 cm; (I) Separação do
aglomerado de mudas em tufos menores, para fins de aclimatação.
Fotos: João Batista Teixeira
Cada kit de biorreator semelhante ao da Figura 1A é

composto de 40 pares de frascos. Cada frasco de 5 L
produz, ao final de cada ciclo de
alongamento/enraizamento, de 100 a 200 mudas.
Portanto, para o cultivo de 40 frascos, são produzidas de 4
mil a 8 mil mudas ao final de cada ciclo. Considerando-se
que são cinco ciclos de cultivo por ano, o total produzido
por kit varia de 20 mil a 40 mil mudas.
Número necessário de gemas

para produção de 20 mil mudas
em biorreator
Cada plântula que entra no processo de produção deve
passar, no máximo, por cinco ciclos de multiplicação. Esse
é um limite prático para que se evite o aparecimento de
mudas fora do padrão varietal. A taxa de multiplicação no
período de um mês varia de três a quatro por gema. Em
cinco ciclos, cada plântula que entra no processo de
multiplicação vai dar origem a, no mínimo, 250 gemas. Já
para a produção de 20 mil mudas, serão necessárias, pelo
menos, 80 plântulas, ou seja, 16 plântulas por ciclo de
alongamento/enraizamento em biorreator. Dessa forma,
em vez de se trabalhar com 2 mil frascos do tipo
maionese de 250 mL, serão necessários apenas 40
frascos de biorreator, os quais serão utilizados em cinco
ciclos de cultivo por ano.
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CAPÍTULO 7
Conservação in vitro de recursos

genéticos de plantas: estratégias,
princípios e aplicações
Jonny Everson Scherwinski-Pereira
Frederico Henrique da Silva Costa
Os recursos genéticos vegetais podem ser conceituados como a fração

da biodiversidade vegetal, com previsão atual ou potencial de uso, que
representa uma fonte imensurável de variabilidade genética para ser
aplicada direta ou indiretamente na obtenção de produtos ou serviços.
Desse modo, os recursos genéticos vegetais compreendem as variedades
tradicionais (existentes em áreas menos influenciadas pelas variedades
exóticas), as variedades melhoradas (oriundas do melhoramento
genético), as linhas avançadas e as espécies nativas (aí incluídas os
parentes selvagens de espécies cultivadas). Tais materiais, além de
representarem uma fonte de variabilidade genética para a produção de
novas variedades que atendam as necessidades de produtores e de
consumidores, também são importantes por proverem segurança ao
meio ambiente, evitando que condições bióticas e abióticas possam
causar danos irreparáveis aos ecossistemas (FRALEIGH, 2006).
Todavia, apesar da importância desses recursos, grande parte vem sendo
destruída de modo irreversível, antes mesmo do seu pleno conhecimento
científico, acarretando, assim, a depredação dos ecossistemas e,
consequentemente, a erosão genética, com efeitos às vezes desastrosos
para o meio ambiente. Entre as principais causas da destruição dos
ecossistemas vegetais, estão a exploração predatória, a devastação
indiscriminada de florestas e sua conversão em áreas agrícolas, as quais
são resultados da industrialização, da urbanização e do desenvolvimento
econômico (RAZDAN, 2003).
Atualmente, a conservação dos recursos genéticos vegetais tem sido
tratada como prioritária em vários países, além de ser considerada como
elemento principal de qualquer estratégia que objetive assegurar o
suprimento de alimentos e o desenvolvimento do setor agrícola, desde
que associada à preservação de outros recursos naturais (WITHERS;
ENGELMANN, 1998). Isso porque, a disponibilidade de variabilidade
genética vegetal por meio dos diversos métodos de conservação
constitui um requerimento básico à continuidade de programas de
melhoramento clássicos e modernos (engenharia genética), essenciais ao
desenvolvimento de genótipos de elevada importância comercial.
Adicionalmente, essa disponibilidade provê uma fonte de compostos para
uso na indústria farmacêutica, na alimentação e na proteção das culturas
(PANIS; LAMBARDI, 2006). Além disso, no caso da introdução de novos
genótipos em substituição aos genótipos primitivos ou
convencionalmente cultivados, torna-se imprescindível a documentação
e a conservação destes últimos, uma vez que as variações climáticas e
os riscos naturalmente existentes também podem influenciar
negativamente o habitat natural das espécies e, dessa forma, acelerar o
processo de erosão genética dos recursos genéticos vegetais (RAZDAN,
2003).
Assim, desde os anos de 1970, grande número de raças primitivas e de
espécies silvestres de culturas cultivadas tem sido amostrado e
conservado em bancos ex situ, isto é, fora de seu habitat natural (PANIS;
LAMBARDI, 2006). Esse modo de conservação pertence ao importante
conjunto de atividades que compõem a gestão dos recursos fitogenéticos
(WITHERS; ENGELMANN, 1998). Entretanto, a manutenção desses
recursos sob condições de campo, ou mesmo em viveiros, por meio de
métodos convencionais de conservação, necessita normalmente de
extensas áreas e de mão de obra intensiva. Além disso, essas espécies
estão sob risco iminente de desaparecimento, em razão de fatores como:
adversidades ambientais, ataque de pragas e dificuldades de
multiplicação (NASSAR, 2003).
Como alternativa aos problemas da conservação convencional, novas e
diversas estratégias biotecnológicas, baseadas na cultura in vitro de
células, de tecidos e de órgãos vegetais, têm sido desenvolvidas e
aprimoradas. Tais técnicas, além de possuírem potencial para superar as
diversas limitações inerentes aos métodos convencionais de conservação
ex situ e in situ, facilitam também o intercâmbio de recursos genéticos
vegetais livres de pragas, que é um fator crucial, considerando-se a
interdependência de nações e de regiões do mundo em termos de acesso
aos recursos genéticos. Ademais, os progressos obtidos na área,
especialmente no que diz respeito a sua utilização para conservação por
longos períodos, são considerados relevantes, em virtude do reduzido
número de pesquisadores envolvidos (RAZDAN, 2003). Há relatos do seu
uso em mais de 60 espécies, incluindo em monocotiledôneas e em
dicotiledôneas, com maior representatividade nas espécies de clima
temperado (RAZDAN; COCKING, 2000).
Diante desse contexto, e em virtude da necessidade de informações
atuais em língua portuguesa sobre a conservação in vitro de recursos
genéticos vegetais, este capítulo tem como objetivo dar subsídios ao
melhor entendimento acerca do assunto, abordando as principais
estratégias, usos e aplicações da conservação e da criopreservação de
espécies vegetais in vitro.
A conservação dos recursos genéticos

vegetais
Em geral, qualquer tecnologia destinada à conservação de germoplasma
tem como princípio básico preservar o máximo possível a diversidade
genética de determinado vegetal, tanto no nível de espécies, quanto de
variedades ou de indivíduos, visando a seu uso atual e futuro como fonte
de variabilidade (RAZDAN, 2003).
Para tanto, existem basicamente dois modos de preservar os recursos
genéticos vegetais: a conservação in situ e a conservação ex situ. O
primeiro modo objetiva principalmente conservar os habitats naturais nos
quais a diversidade genética existe, incluindo áreas selvagens e de
proteção ambiental, reservas e sistemas agrícolas tradicionais, e a sua
utilização é priorizada por programas mundiais de conservação
estratégica, lançados desde 1980. Por sua vez, a conservação ex situ
compreende a retirada dos recursos genéticos de seu ambiente de
ocorrência natural e sua transferência para condições de armazenamento
artificiais (laboratório), de modo adequado e por curtos ou mesmo longos
períodos de tempo. Além disso, consiste no principal método para a
conservação dos recursos genéticos, que pode ser constituído por
materiais cultivados e selvagens, e requer para seu uso conhecimento
sobre a estrutura das populações, técnicas de amostragem, métodos de
regeneração e manutenção de variabilidade genética, particularmente
em plantas alógamas (RAZDAN, 2003; WITHERS; ENGELMANN, 1998).
Contudo, independentemente do modo, a importância de se conservar os
recursos genéticos vegetais é evidente em razão de suas múltiplas inter-
relações, principalmente entre os programas de melhoramento genético,
os agricultores e a produção de alimentos (Figura 1).
Figura 1. Representação esquemática sobre a importância da conservação

dos recursos genéticos vegetais e suas inter-relações com os programas de
melhoramento genético, os agricultores e a produção de alimentos.
Limitações associadas aos métodos

convencionais de conservação de recursos
genéticos de plantas
Preservação de sementes
De maneira geral, em se tratando de preservação ex situ, o
armazenamento de sementes é um dos métodos mais utilizados, em
razão de a maioria das espécies vegetais produzirem sementes capazes
de suportar determinado grau de secagem e de armazenamento, em
geral, a baixas temperaturas (sementes ortodoxas). Entretanto, a
conservação de sementes é considerada problemática para, pelo menos,
três grandes grupos de espécies vegetais: no primeiro grupo, estão as
espécies que não produzem sementes, ou a fazem de modo
insatisfatório, por isso são propagadas vegetativamente, a exemplo da
bananeira (Musa spp.); o segundo inclui as espécies que possuem
genótipos estéreis e aqueles que produzem sementes ortodoxas, mas
geralmente com alto grau de heterozigose, fatos que limitam a
conservação de genes combinados ou não, a exemplo da maçã (Malus
spp.), da batata (Solanum tuberosum), da cana-de-açúcar (Saccharum
spp.) e da mandioca (Manihot esculenta); o terceiro grupo inclui espécies
de plantas que produzem sementes recalcitrantes (caracterizadas pela
sensibilidade ou intolerância ao dessecamento abaixo do nível crítico de
umidade), incluindo várias frutíferas e madeireiras, especialmente de
origem tropical, como coqueiro (Cocos nucifera), abacateiro (Persea
americana), mangueira (Mangifera indica) e cacaueiro (Theobroma
cacao) (ENGELMANN, 2004; PANIS; LAMBARDI, 2006; WITHERS;
ENGELMANN, 1998).
Além dessas, existem as espécies produtoras de sementes intermediárias
que também apresentam problemas de armazenamento, bem como
aquelas sementes que, embora tolerem o dessecamento, são
intolerantes a baixas temperaturas, a exemplo do cafeeiro (Coffea
arabica), do mamoeiro (Carica papaya) e do dendezeiro (Elaeis
guineensis) (RAZDAN, 2003).
Somando-se a essas restrições, a conservação de espécies por sementes
apresenta a inabilidade de manter clones distintos (exceto em espécies
apomíticas); portanto, não se trata de um método a ser aplicado para
culturas propagadas vegetativamente, como a batata, a banana, o
abacaxi, a mandioca e outras.
Conservação em campo
Em virtude das razões mencionadas anteriormente, o método de
conservação ex situ em condições de campo tem sido tradicionalmente o
mais utilizado e preferido para as espécies de propagação vegetativa.
Todavia, essa forma de conservação apresenta inconvenientes que
limitam sua eficácia e ameaçam a segurança e a estabilidade dos
recursos genéticos conservados (RAZDAN, 2003; WITHERS; ENGELMANN,
1998). Entre as desvantagens comumente reportadas estão as perdas
ocasionadas por pragas, condições ambientais adversas, erro humano e
vandalismo. Soma-se a essas o fato de os bancos de germoplasma em
condições de campo apresentarem altos custos de manutenção. Também
não se pode esquecer de possíveis perdas de acessos conservados no
caso de limitações ou cortes orçamentários. Além disso, esse tipo de
conservação requer consideráveis áreas de terra, mão de obra e manejo
(PANIS; LAMBARDI, 2006). Concomitantemente, existem também os
problemas relacionados às etapas de coleta e ao intercâmbio dos
recursos genéticos, uma vez que, para culturas propagadas
assexuadamente, o material utilizado constitui-se geralmente de partes
vegetativas que nem sempre sobrevivem quando excisadas da planta
mãe (matriz), além de apresentarem o potencial de disseminar pragas e
doenças, que são limitações importantes para o intercâmbio de
germoplasma (WITHERS; ENGELMANN, 1998).
Estratégias de conservação in vitro de

recursos genéticos de plantas
Em consequência das limitações inerentes aos métodos convencionais de
conservação ex situ e in situ, tecnologias alternativas, como as de
conservação in vitro, têm sido desenvolvidas e aprimoradas. Atualmente,
tais alternativas são consideradas estratégicas para a conservação de
recursos genéticos vegetais, sobretudo para aquelas espécies
multiplicadas assexuadamente que produzem sementes recalcitrantes
ou, ainda, para as provenientes de engenharia genética (RAZDAN, 2003).
Em princípio, a simples introdução de determinado material vegetal in
vitro constitui uma forma de coleção de germoplasma. Todavia, em
virtude da inviabilidade de se manter elevado volume de material, aliado
à necessidade de transferências periódicas em curto período de tempo
(normalmente de quatro a seis semanas), torna-se impraticável utilizar o
simples cultivo in vitro para a conservação de germoplasma. Somando-se
a esses fatores, existem ainda os problemas relacionados às perdas
ocasionadas por erro humano ou por contaminação microbiana, durante
os subcultivos/transferências, além das limitações associadas à
instabilidade genética advinda normalmente do excesso de repicagens
ou da ação de reguladores de crescimento (WITHERS et al., 1990).
Ademais, a conservação de células e de calos embriogênicos de
importância por meio de subcultivos periódicos consome tempo, além de
geralmente reduzir o potencial embriogênico (PÉREZ et al., 1997).
Como alternativa, modificações no padrão de crescimento das culturas
têm sido utilizadas para a conservação in vitro de germoplasma vegetal,
cada qual com a possibilidade de ser aplicada de acordo com o material
vegetal e com as estruturas física e humana disponíveis. Nesse contexto,
a conservação de espécies vegetais pode ser realizada, de maneira geral,
a partir de dois sistemas: a) sistemas de baixo/lento crescimento; b)
sistemas de criopreservação ou conservação a temperaturas ultrabaixas
(-196 ºC).
Em ambos os sistemas, a conservação é feita por meio de alterações no
ambiente de cultivo, com o objetivo principal de desacelerar ou suprimir
totalmente o crescimento do material vegetal preservado durante o
maior tempo possível, sem, contudo, influenciar negativamente sua
estabilidade genética e viabilidade (GEORGE, 1993; WITHERS;
ENGELMANN, 1998; ROCA et al., 1991). Desse modo, vários são os tipos
de coleções in vitro relatados, entre os quais se destacam: a) coleções de
base in vitro (conservação por longo período usando criopreservação,
porém sem distribuição); b) coleções ativas in vitro (armazenamento de
materiais em baixo crescimento por um período relativamente curto, os
quais podem ser usados para multiplicação, avaliação, indexação e
distribuição); c) banco de genes in vitro (compreende as coleções ativa e
de base), empregado para intercâmbio de germoplasma em âmbito
nacional e internacional (RAZDAN, 2003).
As vantagens potenciais dos métodos de conservação in vitro são várias
e incluem: a) necessidade de espaço físico relativamente pequeno; b)
manutenção do material vegetal sob condições livres de estresses
bióticos (pragas e patógenos) e abióticos (condições ambientais
adversas); c) disponibilidade de material vegetal para propagar grande
número de plantas de forma rápida sempre que necessário; d) potencial
para prolongar o tempo necessário para a realização de
subcultivos/repicagens; e) facilidade para ser aplicada nos procedimentos
de manipulação genética em virtude de prover, por exemplo, um modo
simples de armazenamento de material experimental; f) permite o
acesso imediato ao germoplasma preservado pelos melhoristas; g)
redução dos obstáculos inerentes aos sistemas de quarentena no que diz
respeito ao transporte internacional de material vegetal vivo entre
centros de pesquisa e outras instituições. Além disso, as técnicas in vitro
permitem os seguintes procedimentos: conservação de variação
somaclonal nas culturas e nas linhagens de células de uso medicinal;
armazenamento de pólen com vistas na melhoria de sua longevidade;
conservação de germoplasma raro e de espécies ameaçadas de extinção;
retardamento do processo de envelhecimento de materiais vegetais
(ISLAM et al., 2003; RAZDAN, 2003; WITHERS; ENGELMANN, 1998).
Por exemplo, coleções de banana mantidas in vitro sob condições de
crescimento mínimo facilitam o intercâmbio de germoplasma, pois
reduzem o peso e o volume do material a ser transportado, além de
possibilitarem mínima ou nula disseminação de doenças e melhor
controle das condições ambientais. Ademais, os acessos podem ser
rapidamente multiplicados (OLIVEIRA et al., 2000). Nesse mesmo sentido,
as técnicas in vitro têm sido usadas amplamente para distribuição
internacional de recursos genéticos vegetais com notáveis exemplos
testados e comprovados para as culturas da batata, da mandioca, da
batata-doce e da banana. É necessário, porém, salientar que alguns
cuidados quanto à consistência do meio de cultura (se for o caso), tais
como tipo de recipientes (tubos de ensaio, frascos, etc.) (WITHERS;
ENGELMANN, 1998) e identificação correta devem ser considerados com
o objetivo de assegurar a estabilidade do material em trânsito.
Diversos são os tipos de material vegetal (explantes) utilizado para a
conservação in vitro, tais como: ápices caulinares, meristemas,
propágulos vegetativos em vários estádios de desenvolvimento (brotos,
gemas axilares, segmentos nodais), protoplastos isolados, suspensão de
células, cultura de calos e plântulas organizadas (RAZDAN, 2003).
Sistemas de crescimento lento

(crescimento mínimo)
O crescimento mínimo é considerado o modo mais direto de restringir o
crescimento e o desenvolvimento de plantas in vitro. Para isso, realizam-
se modificações nas condições físicas ou químicas do meio de cultura,
com o objetivo de aumentar ao máximo os intervalos de subcultivos ou
estendê-los indefinidamente, porém sem afetar a viabilidade genética e
biológica das plantas regeneradas. Tais modificações incluem a
manipulação dos constituintes do meio de cultura, conseguido
geralmente pela adição de reguladores osmóticos (açúcares álcoois –
sorbitol e manitol, e/ou sacarose), de reguladores de crescimento
(citocininas – BAP, ABA, ancimidol), e/ou pela omissão/redução de alguns
constituintes orgânicos e inorgânicos; alterações nas condições do
microambiente in vitro (redução da temperatura de cultivo e
modificações na composição de gases – O2 e CO2); tipos de fechamento
dos recipientes de cultivo (RAZDAN, 2003; ROCA et al., 1991; SARKAR et
al., 2005; WITHERS; WILLIAMS, 1998); e, mais recentemente, a técnica de
encapsulamento de propágulos vegetativos (sementes sintéticas ou
artificiais).
Ademais, outras variações podem ser realizadas por meio da alteração
da intensidade e da duração do período de luz, de modo que sua redução
aumente a viabilidade das culturas submetidas a baixas temperaturas,
possivelmente em razão da diminuição do processo de deterioração dos
tecidos (OLIVEIRA et al., 2000). Contudo, o que tem sido verificado é a
predominância da combinação desses fatores em detrimento do uso
separado. Porém, é necessário destacar que a utilização rotineira desse
sistema para conservar recursos genéticos vegetais pode ser limitada em
virtude da interação genótipo-ambiente, bem como por falta de
informação acerca da estabilidade genética do material conservado
(NEGRI et al., 2000). Nesse contexto, os mesmos autores observaram
diferenças na capacidade de conservação entre variedades de macieira,
de modo que a variedade primitiva/crioula (landraces) teve potencial
para retomar o crescimento reduzido drasticamente após um ano,
enquanto a variedade comercial ‘Starkspur Red’ manteve 90% de
sobrevivência após 18 meses de conservação.
Técnicas clássicas
Uso de baixa temperatura (armazenamento a frio)

É um método de conservação em médio prazo aplicado a algumas
plantas, no qual o material vegetal é subcultivado por várias vezes, em
intervalos de tempo relativamente longos, em condições de baixas
temperaturas (1 ºC a 20 ºC), de maneira que se reduza a atividade
enzimática e metabólica das plantas (RAZDAN, 2003).
Somando-se a isso, a suplementação do meio de cultura com reguladores
de crescimento, como o ABA, o ancimidol, os açúcares álcoois e/ou a
sacarose, bem como a diminuição da intensidade de luz, ou mesmo a
total ausência dela em associação à baixa temperatura, podem
efetivamente auxiliar na velocidade de redução da taxa de crescimento
(ISLAM et al., 2003). Dessa forma, prolonga-se o intervalo entre os
subcultivos e reduz-se a necessidade de mão de obra e de reagentes.
Consequentemente, diminuem-se os riscos de perdas por contaminação
(LEMOS et al., 2002). Além disso, a utilização desse método permite
obter uma coleção para uso na distribuição de plantas, com a vantagem
adicional de ser simples e de proporcionar, normalmente, alta taxa de
sobrevivência do material (possivelmente pelo fato de não haver
tratamentos com substâncias criogênicas, as quais são muito
empregados na criopreservação) (RAZDAN, 2003). Sucesso por meio
dessa técnica tem sido reportado em diversas espécies e, até mesmo,
nas culturas economicamente importantes (Tabela 1).
Quanto às suas limitações, pode-se citar a possibilidade de acumular
células que variam geneticamente de acordo com o tempo de
armazenamento, seja em virtude do uso em excesso ou inapropriado de
reguladores de crescimento, seja pelo elevado número de repicagens.
Além do mais, quando comparado à criopreservação, esse método
apenas reduz o crescimento das culturas, já que não provoca o
congelamento das células e dos tecidos, diferentemente do que ocorre
com a temperatura do nitrogênio líquido que paralisa completamente o
metabolismo das células (RAZDAN, 2003).
Tabela 1. Espécies conservadas in vitro sob condições de baixa
temperatura, associadas ou não a outras modificações do meio de cultura,
exceto à tecnologia de sementes sintéticas.
Tempo Tempe‐
Explante de ratura Outras
Espécie Referência
utilizado conser‐ condições
vação (oC)
Até 615 Van Den

Banana Brotos 16 – Houwe et
dias(1) al. (1995)
Brotos
MS 50% sais + BAP
apicais e
12 a 18 (0,89 µM) + ABA (5 Negri et al.
Maçã segmentos 4
meses µM), em ambiente (2000)
nodais
escuro
simples
Plantas sem MS sem reguladores

Banana raízes e 450 de crescimento, Oliveira et
17
(diploides) pseudocaule dias al. (2000)
podado sacarose (20 g L-1)
Batata MS + ancimidol (10

16 µM) + sacarose (60 Sarkar et
(Solanum Microestacas 6
meses al. (2001)
tuberosum L.) g L-1)
Cana-de-açúcar MS líquido + ABA (1

12 Lemos et
(Saccharum Brotos 15 mg L-1) + sacarose
meses al. (2002)
sp.) (20 g L-1)
20 e 10
Menta (Mentha
Explantes (por três
spp.)(diploides, MS sem reguladores Islam et al.
nodais e 6 meses semanas) e
tetraploides e de crescimento (2003)
apicais 2 (por seis
octaploides)
meses)
MS ½ + sacarose Divakaran
Orquídea 360
Brotos 2 (15 g L-1) + manitol et al.
(Vanilla spp.) dias
(15 g L-1) (2006)
MS + sacarose (60 g
Segmentos L-1) + manitol (20 g Gonçalves
Drosophyllum
com dois 8 meses 5 L-1) + zeatina (0,91 e Romano
lusitanicum
nós µM), em ambiente (2007)
escuro
(1) Outros acessos necessitam de transferências para meio de cultura fresco a cada 60 dias, o que
mostra a grande variabilidade entre os acessos testados (400). Os autores verificaram ainda que
bananas selvagens diploides são mais difíceis de serem conservadas por longo período, em prejuízo
de bananas comestíveis triploides e tetraploides.
Utilização de substâncias reguladoras de crescimento (ABA,
ancimidol, ácido acetil salicílico, etc.) e de reguladores
osmóticos (manitol, sorbitol, sacarose, etc.)
A esse respeito, a literatura tem reportado com frequência o uso de

agentes osmóticos como os açúcares álcoois manitol e sorbitol, além da
sacarose. Por sua vez, a utilização de reguladores como o ácido abscísico
(ABA), o paclobutrazol (PBZ), o ancimidol e o ácido acetilsalicílico (CANTO
et al., 2004; LEMOS et al., 2002; LOPEZ-DELGADO et al., 1998) também
tem sido reportada. Contudo, todas essas substâncias são sempre
associadas a baixas temperaturas, e a decisão de utilizar determinado
regulador e sua concentração é função de cada espécie e tipo de
explante, os quais apresentam diferentes concentrações endógenas de
hormônios.
De acordo com Dumet et al. (1993), os agentes osmóticos acima citados,
ao serem adicionados ao meio de cultura, promovem a remoção do
excesso da água intracelular, por gradiente osmótico, por isso o
crescimento da cultura ocorre de forma mais lenta. Esse fato corrobora
relatos de George (1993), que afirma que o sorbitol não é usualmente
metabolizado pelas plantas, além do fato de sua atuação estar
frequentemente relacionada à modificação do potencial osmótico do
meio de cultura. Nesse mesmo sentido, Fortes e Pereira (2001) relatam
que, entre os agentes osmóticos mencionados, o manitol tem
proporcionado bons resultados no que diz respeito à restrição do
crescimento e do desenvolvimento de diversas espécies, por isso é
frequentemente empregado. Sua eficácia tem sido atribuída ao fato de
esse carboidrato reduzir o potencial hídrico do meio de cultura e, com
isso, promover um estresse osmótico causado pela diminuição na
absorção de água e de nutrientes presentes no meio. Além disso,
resultados satisfatórios na inibição do crescimento vegetal, quanto ao
uso do manitol, são também relatados quando há associação com o ácido
acetilsalicílico (AAS) (LOPEZ-DELGADO et al., 1998).
No caso do PBZ e do ancimidol, seu estudo é justificado em virtude de
essas substâncias interferirem na síntese do ácido giberélico, inibindo o
crescimento em diferentes espécies de plantas (CANTO et al., 2004;
SARKAR et al., 2001). Dessa forma, apresentam potencial para aumentar
o intervalo entre subcultivos. Todavia, de acordo com Canto et al. (2004),
poucas são as pesquisas acerca dos efeitos desses reguladores in vitro,
havendo relatos até mesmo da ineficiência do PBZ quando usado em
concentrações de 0,5 mg L-1 a 1,0 mg L-1 para a cultura do abacaxizeiro.
Quando se trata do uso de agentes osmóticos, outro aspecto importante
é o fato de que a utilização de determinadas concentrações pode
ocasionar redução significativa na viabilidade e consequente
deterioração após o período de armazenamento, o que pode causar
toxidez, elevada oxidação ou problemas de excessivo potencial osmótico
(FORTES; PEREIRA, 2001; LEMOS et al., 2002). Discussão a esse respeito
é reportada por Fortes e Pereira (2001), segundo os quais embora a
combinação de manitol (87,6 mM) com ácido acetilsalicílico tenha sido
mais efetiva em restringir o crescimento de microestacas de batata,
apenas 37% sobreviveram, sugerindo maior estresse fisiológico em
detrimento do uso de sacarose, que proporcionou 76% de sobrevivência,
após 9 meses de armazenamento.
Técnicas alternativas
Algumas técnicas constituem alternativas para os métodos de
criopreservação e de armazenamento a frio. Entre elas, incluem-se as
alterações na atmosfera de cultivo (proporção dos gases O2 e CO2),
conseguidas por meio da redução na quantidade de O2 disponível. Essa
redução é obtida pelo recobrimento do material propagativo com óleo de
querosene, óleo mineral ou meio líquido, ou, ainda, pelo uso de
atmosfera modificada. O sucesso no uso desses métodos depende do
tipo de material e da espécie vegetal. Além disso, há relatos de sua
eficiência na redução do crescimento de pera (Pyrus communis), café
(Coffea sp.) e genótipos de gengibre (Zingiber officinale), embora
problemas como a hiper-hidratação e baixas taxas de restabelecimento e
sobrevivência dos explantes também tenham sido relatadas em alguns
casos (WITHERS; ENGELMANN, 1998).
Acrescenta-se ainda que, no sistema em que a pressão atmosférica que
circunda os tecidos cultivados é reduzida, tem-se a vantagem da redução
da atividade microbiana (RAZDAN, 2003). Ademais, a conservação em
médio prazo, utilizando-se pouco oxigênio à temperatura ambiente, pode
ser interessante para espécies tropicais, as quais são sensíveis ao frio,
embora os resultados estejam ainda em âmbito experimental (WITHERS;
ENGELMANN, 1998).
Conservação à temperatura da sala de crescimento

Embora a maioria dos trabalhos sobre conservação in vitro utilize baixas
temperaturas (igual ou inferior a 20 ºC), pesquisas têm sido conduzidas
com o intuito de manter material vegetal sob temperaturas próximas, ou
mesmo semelhantes, àquelas utilizadas nas salas de crescimento (Tabela
2). Para tanto, associações com substâncias reguladoras de crescimento
e agentes osmóticos também são reportadas (BONNIER; VAN TUYL, 1997;
FORTES; PEREIRA, 2001; NAIDU; SREENATH, 1999; TYAGI et al., 2007).
Uma das vantagens de se manter a conservação sob essa temperatura é
o fato de não ser necessário nenhum procedimento de encapsulamento
ou desidratação, nem equipamentos mais sofisticados. Além do mais, a
estrutura laboratorial existente é aproveitada.
Tabela 2. Espécies para as quais a conservação à temperatura semelhante
àquelas utilizadas nas salas de crescimento tem sido reportada.
Tempo
Tempe‐
Explante de Refe‐
Espécie ratura Sobrevivência/Conversão
utilizado conser‐ rência
(oC)
vação
Bonnier
Lilium 25
28 e Van
longiflorum e Bulbinhos Satisfatória
L. henryi
meses ºC(1) Tuyl
(1997)
25 Naidu e
Embriões 24
Café 70% Sreenath
zigóticos meses ºC(2) (1999)
Batata
25 ºC ± Fortes e
(Solanum Microestacas
9 meses 76% Pereira
tuberosum L., de batata 2 ºC(3) (2001)
cv. Macaca)
Curcuma 25 °C ± Tyagi et
Ápices 12
longa cv. 56% a 50% al.
Prathibha
caulinares meses 2 °C(4) (2007)
(1) Material cultivado em meio MS ¼, adicionado de sacarose (90 g L-1), 16 h de luz (10 µmol m-2 s-
1 a 20 µmol m-2 s-1).
(2) Material cultivado em meio MS, suplementado de ABA filtrado (18,9 µM), mantido no escuro.
(3) Material cultivado em meio MS, suplementado com sacarose (87,6 mM) e AAS (0 mg L-1 a 120
mg L-1), mantido a 16 h de luz.
(4) Material cultivado em meio MS, acrescido de BAP (2,5 mg L-1), açúcar comercial ou em cubos,
sob 16 h a 40 μmol m-2 s-1.
No caso de lírio, por exemplo, baixas temperaturas não são diretamente

aplicadas, em virtude do fato de que, sob temperatura de 0 ºC a 10 ºC, a
dormência dos bulbinhos é quebrada, o que ocasiona a proliferação de
brotos durante o armazenamento prolongado. Ademais, a morte dos
bulbos de lírio durante o prolongado armazenamento à temperatura de -2
ºC é reportada, assim como a cristalização de gelo (BONNIER; VAN TUYL,
1997).
Uso de sementes sintéticas (técnica de encapsulamento)

Sementes artificiais ou sintéticas têm sido definidas como estruturas
análogas à semente botânica, obtidas a partir do encapsulamento de
micropropágulos (unidades encapsuláveis1) em endosperma artificial2,
passíveis de ser utilizadas para semeadura sob condições in vitro ou ex
vitro e, sobretudo, capazes de se converterem em plantas normais
(GUEDES et al., 2007; HASSANEIN et al., 2005; STANDARDI; PICCIONI,
1998). Essa tecnologia foi inicialmente concebida por Murashige em
1977, e a primeira semente artificial envolveu embriões somáticos com a
finalidade de melhorar a sua conversão. Desde então, desenvolveram-se
diversos estudos, os quais permitiram sua aplicação não apenas para
embriões somáticos, mas também para ápices caulinares, agregados de
células, gemas axilares, entre outros propágulos vegetativos (GUEDES et
al., 2007; NYENDE et al., 2003; STANDARDI; PICCIONI, 1998). No entanto,
para os embriões somáticos, fatores como o desenvolvimento anormal, o
longo período para sua indução e a falta de sincronia entre as fases da
embriogênese têm desencorajado a utilização desse tipo de explante
(NYENDE et al., 2003), exceto para espécies em que os protocolos já se
encontrem bem definidos e sejam de utilização rotineira.
Sua aplicação na conservação de recursos genéticos vegetais in vitro tem
sido mais expressiva a partir da última década, com relatos para diversas
culturas, incluindo cereais, frutíferas, hortícolas, ornamentais e florestais
(MALABADI; STADEN, 2005; NAIK; CHAND, 2006), porém poucos aplicam
essa tecnologia em longo prazo (LISEK; ORLIKOWSKA, 2004; MARUYAMA
et al., 1997; NASSAR, 2003; NYENDE et al., 2003) (Tabela 3). Tal situação
tem sido atualmente modificada, especialmente após a integração da
técnica de sementes sintéticas ao método de criopreservação, como o
encapsulamento-desidratação e o encapsulamento-vitrificação. Além
disso, ao contrário da semente natural ou botânica, as sementes
sintéticas não acumulam reservas de armazenamento, nem desenvolvem
mecanismo de tolerância à seca. Por isso, sua utilização para o
armazenamento possui certas limitações quando se objetiva a
conservação por longos períodos, o que irá depender do tipo de unidade
encapsulável, da constituição do endosperma sintético, da temperatura
de armazenamento, dentre outros (NYENDE et al., 2003).
Tabela 3. Exemplos de espécies para as quais a tecnologia de sementes
artificiais a partir de cápsulas de alginato de cálcio tem sido utilizada para
conservação in vitro de germoplasma.
Tempo Tempe‐
Explante de ratura Refe‐
Espécie Sobrevivência/Conversão
vação (oC)
Cedro Maruyama
Ápices 12
(Cedrela 12 80% et al.
caulinares meses
dorata) (1997)
Maruyama
Guazuma Ápices 12
25 90% et al.
crinita caulinares meses
(1997)
Maruyama
Jacaranda Ápices
6 meses 20 70% et al.
mimosaefolia caulinares
(1997)
Orquídea
[Geodorum
4e6 Datta et al.
densiflorum Protocormos 4 86% e 71,6%
meses (1999)
(Lam)
Schltr.]
Morangueiro Lisek e
Ápices
e 9 meses 4 ≤ 60% Orlikowska
caulinares
framboeseira (2004)
Café (Coffea 12 Nassar

Microestacas 20 59%
arabica) meses (2003)
Cedrela
Ápices Nunes et
fissilis 6 meses 25 44%
caulinares al. (2003)
Vellozo
Batata
(Solanum Ápices 360 Nyende et
tuberosum 4 51% a 71%
caulinares dias al. (2003)
L.)(1)
Malabadi e
Embriões
Pinus patula 3 meses 4 73% Staden
somáticos
(2005)
Divakaran
Orquídea Brotos e 10
22 Satisfatório et al.
(Vanilla spp.) protocormos meses
(2006)
Kavyashree
Gemas 1a4
Amoreira 4 46,5% a 40,2% et al.
axilares meses
(2006)
Tempo Tempe‐
Explante de ratura Refe‐
Espécie Sobrevivência/Conversão
vação (oC)
Hibiscus Segmentos 18 West et al.

5 –
moscheutos nodais meses (2006)
(1) Esses autores utilizaram o sistema conhecido por dupla camada (hollow beads), o qual será
descrito posteriormente (PATEL et al., 2000).
O crescente interesse por essa técnica deve-se às suas várias vantagens

(Figura 2), bem como à associação com outros sistemas de conservação,
por meio da utilização de temperaturas ultrabaixas (criopreservação). Em
relação aos fatores-chaves para o sucesso dessa tecnologia, destacam-se
a avaliação e a otimização de parâmetros, como a concentração de
alginato de sódio, a concentração e o tempo de exposição ao cloreto de
cálcio e a constituição do endosperma sintético (cápsula) (Figura 3). Os
primeiros, por influenciarem a textura, a forma e o tamanho da cápsula;
e o último, por seu papel na nutrição das unidades encapsuláveis
(NYENDE et al., 2003; GUEDES et al., 2007).
Figura 2. Principais vantagens inerentes ao emprego da técnica de sementes

sintéticas para a conservação in vitro de recursos genéticos de plantas.
Fonte: Danso e Ford-Lloyd (2003), Maruyama et al. (1997), Nassar (2003),
Nyende et al. (2003), Wang et al. (2002) e West et al. (2006).
Sistemas de encapsulamento e princípios de utilização

Basicamente são três os sistemas de encapsulamento utilizados na
produção de sementes sintéticas de material vegetal, a saber: a) cápsula
de camada simples (beads); b) cápsula de camada dupla (hollow beads);
c) cápsula farmacêutica. Todavia, apenas os dois primeiros serão
abordados em virtude de sua maior aplicação na área vegetal.
Figura 3. Tipos de unidades encapsuláveis utilizadas para a produção de

sementes sintéticas, visando à conservação in vitro de germoplasma vegetal.
(A) microestaca (segmento nodal); (B) semente de orquídea recém-germinada
in vitro; (C) embrião zigótico de café; (D) microbroto de abacaxi; (E) ápice
caulinar; (F) embrião somático.
Ilustração: Dalilhia dos S. Nazaré.
Cápsula de camada simples (beads) – Este sistema consiste inicialmente

em misturar as unidades encapsuláveis, sob condições de total assepsia,
à matriz de encapsulamento com alginato de sódio. Posteriormente, com
o auxílio de uma pipeta automática e uma ponteira autoclavada, ou de
uma seringa descartável, os micropropágulos são individualmente
resgatados juntamente com uma alíquota de endosperma sintético, e
gotejados em solução de cloreto de cálcio (CaCl2.2H2O) para
complexação3 (formação da cápsula). Passado determinado tempo, as
cápsulas que contenham cada unidade encapsulável (sementes
sintéticas) são submetidas à tríplice lavagem em água destilada e
esterilizada para a retirada do excesso de CaCl2.2H2O, e, em seguida, são
conservadas. Depois de conservadas, caso seja necessário, realiza-se a
imersão das sementes sintéticas em solução de nitrato de potássio
(KNO3), por certo período (descomplexação4), e faz-se nova lavagem. Por
fim, as sementes artificiais são semeadas in vitro em recipientes para
emergência das unidades encapsuláveis e para conversão em plantas
(Figura 4).
Figura 4. Representação geral dos procedimentos necessários à produção de

sementes sintéticas, no sistema de camada simples (beads), utilizando-se a
técnica de encapsulamento com alginato de sódio. As setas largas indicam os
eventos que ocorrem durante as etapas de complexação, de descomplexação
e de conversão.
Cápsula de dupla camada (hollow beads) – Nas cápsulas de alginato de

cálcio convencionais (beads ou camada simples) os micropropágulos
geralmente ficam localizados próximos da superfície (Figura 5). Isso
ocorre graças ao processo de produção da cápsula, no qual a completa
proteção das unidades encapsuláveis não é conseguida, como ocorre na
semente botânica (PATEL et al., 2000). Assim, esses autores propuseram
como alternativa o método da dupla camada (hollow beads), com vistas
tanto na conservação quanto na produção de sementes sintéticas de
células vegetais, de ápices caulinares ou de embriões somáticos.
O método consiste inicialmente em misturar o material vegetal (unidades
encapsuláveis) em 10 mL de solução (1,5%) de carboximetilcelulose com
cloreto de cálcio (1%), seguido de gotejamento da suspensão (com o
auxílio de seringa 10 mL) dentro de 400 mL de uma solução de alginato
de sódio (0,8%). Assim, na superfície de cada gota, uma camada de
alginato de cálcio é formada de dentro para fora, enquanto a região
central permanece líquida. Decorridos 10 minutos de gelatinização, a
solução de alginato com as hollow beads é diluída com água deionizada
(400 mL), e a solução diluída é decantada (procedimento que é realizado
duas vezes). Por fim, as hollow beads são transferidas dentro de solução
de cloreto de cálcio (1%) e deixadas por mais 20 minutos para endurecer
(polimerização). Como resultado, obtêm-se cápsulas constituídas de uma
região central líquida, circundada por uma membrana de alginato de
cálcio (Figura 5). Comparativamente, a Figura 5 mostra o sistema de
cápsulas convencionais (beads), na qual se mistura o material com a
solução de alginato de sódio, seguido de gotejamento na solução de
cloreto de cálcio, o que resulta na gelatinização de fora para dentro da
cápsula.
Figura 5. Representação dos sistemas de encapsulamento por cápsula de
camada simples (beads) e de camada dupla (hollow beads) (PATEL et al.,
2000).
As principais vantagens desse método, quando comparado com as

cápsulas convencionais, incluem a completa proteção das unidades
encapsuláveis e a não emergência precoce do explante. Utilizando esse
método, Nyende et al. (2003) conseguiram satisfatório armazenamento
por prolongados períodos de germoplasma de batata, em que houve
100% de regeneração dos ápices caulinares por até 180 dias, à
temperatura de 4 ºC e 10 ºC. Ademais, após 270 dias, nenhuma
regeneração ocorreu à 10 ºC, enquanto 100% foi registrada à 4 ºC. Além
disso, os explantes encapsulados mostraram razoável regeneração após
360 dias à 4 ºC (51,5% a 70,8% entre os genótipos).
Criopreservação
Historicamente, apesar de a técnica de criopreservação ser
relativamente antiga e bem estudada na área microbiológica e ani-mal,
os estudos com vegetais superiores têm sido conduzidos apenas durante
os últimos 40 anos, e duas principais linhas de pesquisa são seguidas: a)
o melhor entendimento dos processos fisiológicos e bioquímicos
envolvidos no processo de congelamento; b) a conservação de material
vegetal sob condições viáveis (WITHERS; ENGELMANN, 1998). No caso
específico da conservação in vitro, o rápido desenvolvimento nas últimas
décadas, de novas tecnologias de criopreservação tem permitido que se
ampliem em longo prazo as possibilidades de armazenamento de
espécies cultivadas, florestais e daquelas em risco de extinção (PANIS;
LAMBARDI, 2006).
Em princípio, a criopreservação é um método baseado na manutenção do
metabolismo do material vegetal (explantes) sob condições de ausência
de divisão celular ou de metabolismo zero. Para isso, os explantes são
submetidos a temperaturas ultrabaixas (temperatura do nitrogênio ou
NL: -196 °C ou -150 °C), na presença ou ausência de substâncias
crioprotetoras. Tanto a temperatura do NL quanto a energia cinética
molecular e a difusão são extremamente baixas e, assim, todas as
divisões celulares e os processos metabólicos ocorrem muito lentamente
ou são totalmente paralisados, o que permite a conservação por um
período de tempo teoricamente ilimitado. Desse modo, a variabilidade
genética e a deterioração do material armazenado são teoricamente
inexistentes. Aliado a esses aspectos, o armazenamento em um banco
criogênico custa mais barato que outros sistemas disponíveis, o que se
deve ao fato do material criopreservado necessitar de pequeno volume,
permitir a manutenção da sanidade do germoplasma preservado e
requerer um mínimo de manutenção (ENGELMANN, 2004; SANTOS,
2004).
Nesse contexto, embora os estudos sobre os custos da criopreservação
sejam ainda incipientes, estimativas têm confirmado vantagens
financeiras quando se usa a criopreservação para a conservação de
germoplasma. Por exemplo, os custos de manutenção anual de um
acesso de fruteira temperada são de US$ 77,00 no campo, US$ 23,00 sob
condições de crescimento lento in vitro e somente US$ 1,00 quando se
utiliza a criopreservação. Já os custos anuais para conservar coleções de
mandioca no Ciat (International Center for Tropical Agriculture, Cali,
Colômbia), que inclui 5 mil acessos, chegam a cerca de US$ 5 mil sob
criopreservação, ao passo que sob crescimento lento in vitro chegam a
US$ 30 mil (ENGELMANN, 2004).
Além de sua capacidade de permitir o armazenamento de tecidos de
maneira indefinida, com baixos riscos ao material conservado (RAZDAN,
2003), outra vantagem da criopreservação é a preservação, por
prolongado período, de tecidos com características específicas, como
linhagens de células medicinais e produtoras de alcaloides, cultura de
pelos radiculares, tecidos geneticamente transformados e linhagens
competentes a transformação (PANIS; LAMBARDI, 2006). Todavia, a
criopreservação não é aplicável apenas à conservação de germoplasma.
Ela pode ser também utilizada para os seguintes procedimentos:
erradicação de vírus, fato demonstrado para as culturas da ameixeira, da
bananeira e da videira (BRISON et al., 1997; HELLIOT et al., 2002; PANIS;
LAMBARDI, 2006); criosseleção (seleção de amostras com propriedades
especiais na população congelada); propagação de espécies em larga
escala, baseada no processo de embriogênese somática, como no caso
das coníferas, além da manutenção da juvenilidade de tecidos vegetais
(ENGELMANN, 2004).
Desde 1975, o progresso obtido com essa tecnologia na área vegetal tem
possibilitado a regeneração de plantas completas a partir de células, de
meristemas e de embriões congelados e armazenados por longos
períodos de tempo, quase indefinidos. Atualmente, a criopreservação
tem sido utilizada com sucesso na conservação de germoplasma de um
amplo número de culturas comercialmente importantes, como a
mandioca (Manihot esculenta), a ervilha, o arroz, o coco, a cana-de-
açúcar, a banana e o morango, além de outras espécies de uso
medicinal, que se encontram ameaçadas de extinção (RAZDAN, 2003).
Ademais, para espécies que possuem sementes recalcitrantes, tem-se
observado menor avanço na pesquisa, possivelmente por causa do alto
número de espécies, principalmente das selvagens, cada qual com
características distintas, além do limitado nível de atividades de pesquisa
envolvendo a conservação dessas espécies (ENGELMANN, 2004).
Sem dúvida, a criopreservação é atualmente a técnica de conservação in
vitro que mais tem sido estudada. O aprimoramento de tecnologias
voltadas para essa técnica tem promovido tanto a diversificação de seus
métodos quanto a ampliação de seus usos (WITHERS; ENGELMANN,
1998). Tal fato deve-se muito provavelmente aos significativos
progressos que têm sido realizados na área nos últimos 15 anos, com o
desenvolvimento de procedimentos baseados no fenômeno da
vitrificação (ENGELMANN, 2004). No entanto, embora existam vários
procedimentos criogênicos para um crescente número de espécies
produtoras de sementes recalcitrantes e de órgãos/tecidos in vitro, o
emprego rotineiro da criopreservação na biodiversidade vegetal é ainda
considerado limitado (PANIS; LAMBARDI, 2006).
De modo geral, materiais como sementes ortodoxas ou brotos dormentes
podem ser criopreservados sem qualquer pré-tratamento, o que é
atribuído ao processo natural de desidratação desses materiais. Porém, a
maior parte dos explantes criopreservados (suspensão de células, de
calos, de ápices caulinares e de embriões) é constituída de altas
quantidades de água celular livre, o que os torna mais sensíveis a danos
durante o congelamento. Por essa razão, as células necessitam sofrer
desidratação artificial para protegerem-se dos danos ocasionados pela
cristalização da água intracelular em gelo, o que pode ser conseguido
pelo uso de protocolos de criopreservação clássicos e por aqueles
baseados na vitrificação, este último muitas vezes mais eficiente (MIAJA
et al., 2000). Na Tabela 4, citam-se alguns exemplos do uso da
criopreservação em larga escala para diferentes tipos de materiais,
tolerantes ou não a desidratação (ENGELMANN, 2004).
Tabela 4. Exemplos práticos do uso em larga escala da criopreservação

para conservação in vitro de recursos genéticos vegetais.
Material Quantidade Local
National Center For

37.654 acessos (cerca de Genetic Resources
360.629 sementes) Preservation (NCGRP, Fort
Espécies produtoras de sementes Collins, CO, EUA)
ortodoxas raras, ameaçadas de
extinção e com limitada
longevidade 1.200 acessos de 50
National Bureau of Plant
diferentes espécies,
Genetic Resources
principalmente plantas
(NBPGR, Nova Délhi, Índia)
medicinais em extinção
Tropical Agricultural
Espécies produtoras de sementes Sementes de 80 acessos de Research and Higher
intermediárias Coffea arabica Education Center (Catie,
Costa Rica)
National Bureau of Plant

65 acessos de diferentes
Genetic Resources
espécies
(NBPGR, Nova Délhi, Índia)
600 acessos que pertencem Indian Institute of

a 40 espécies de 15 Horticultural Research
Pólen
diferentes famílias (IIHR, Bangalore, Índia)
National Center For

13 cultivares de pera e 24 Genetic Resources
espécies de Pyrus Preservation (NCGRP, Fort
Collins, CO, EUA)
Institute for Crop and

519 variedades de batata Grassland Science em
Braunschweig (Alemanha)
International Potato Center

Espécies multiplicadas 200 acessos de batata
(CIP, Lima, Peru)
vegetativamente
International Network for

100 acessos de the Improvement of
germoplasma de Musa Banana and Plantain
(INIBAP)
Fonte: Adaptado de Malaurie (2001), Panis e Lambardi (2006) e Keller et al. (2006).
Quanto aos fatores que determinam o sucesso da criopreservação, cita-
se a proteção dos explantes contra injúrias durante o congelamento, as
quais podem ocorrer em virtude da formação de cristais de gelo dentro
das células que causam o rompimento das organelas e da própria célula
(lise celular). Nesse sentido, o estado da água e o equilíbrio osmótico
relacionado aos movimentos da água dentro e fora das células são
parâmetros de particular importância para a criopreservação, uma vez
que a água removida possui papel vital na prevenção da injúria pelo
congelamento e na manutenção da viabilidade pós-descongelamento,
essencial para o restabelecimento e para o crescimento do material
criopreservado. Outra fonte potencial de dano às células está relacionada
ao incremento na concentração de solutos intracelulares em níveis
tóxicos, ou a perdas de solutos vitais durante o congelamento
(GONZALEZ-ARNAO et al., 2008; RAZDAN, 2003).
Etapas do processo de criopreservação

Independentemente da técnica utilizada, de modo geral o processo de
criopreservação é constituído basicamente de cinco fases distintas: a)
congelamento; b) armazenamento; c) descongelamento; d)
restabelecimento dos explantes criopreservados; e) determinação da
viabilidade.
a) Congelamento
Consiste em suspender os explantes em meio de cultura. Em seguida,
realiza-se o tratamento com crioprotetores, a transferência para
criotubos estéreis e o congelamento do material a partir de diferentes
métodos, tais como: congelamento lento, rápido e/ou intermediário;
congelamento seco; vitrificação ou encapsulamento-desidratação (Tabela
5). A escolha de um desses processos deverá considerar o grau de
sensibilidade de cada material vegetal e de cada espécie a ser
trabalhada (RAZDAN, 2003).
Tabela 5. Alguns métodos utilizados na fase de congelamento em
protocolos de criopreservação de germoplasma vegetal.
Tipo de
Considerações gerais sobre o método
congelamento
Primeiramente, o material é submetido ao congelamento por meio de taxas

baixas de congelamento/esfriamento (de 0,5 ºC min-1 a 4 ºC min-1),
iniciando-se em 0 ºC até alcançar -100 ºC. Em seguida, é transferido para NL
(-196 ºC). Desse modo, ocorre o aumento da desidratação celular, que
progressivamente concentra os constituintes celulares e diminui o ponto de
Lento congelamento, evitando assim os danos advindos da formação de gelo (ice
damage) (Figura 6). Contudo, existe o risco de que a excessiva concentração
de solutos possa ocasionar toxicidade. Ademais, se a taxa preliminar de
resfriamento for muito rápida, pode ocorrer o aumento do gelo intracelular, o
que ocasiona a ruptura das membranas da célula, notavelmente o
plasmalema e tonoplasto (Figura 6) (GEORGE, 1993)
Baseia-se na transferência direta dos frascos (criotubos) que contêm os

Rápido explantes para NL (Figura 7), de modo que se reduza rapidamente a
temperatura, a uma taxa que varia de -300 °C a 11.000 ºC min-1
É caracterizado por combinar as vantagens dos métodos de congelamento

lento e rápido. Para isso, o material vegetal é inicialmente resfriado a uma
temperatura intermediária (de 1 ºC min-1 a 5 ºC min-1, por 30 minutos),
seguido da imersão rápida em NL. Dessa forma, ocorre a formação de gelo na
Intermediário região externa às células, e o protoplasma não congelado perde água em
(step-wise) virtude do deficit de pressão de vapor entre o protoplasma supercoloide e o
gelo externo. Esse tipo é reportado para ampla variedade de explantes,
incluindo ápices caulinares, gemas e culturas em suspensão, o que possibilita
aos ápices caulinares de morangueiro um aumento de 60% a 80% na
sobrevivência, quando comparado ao método de congelamento rápido
(SAKAI, 1997)
Inicialmente relatado para células vegetais por Uragami et al. (1989) e Langis
et al. (1989), tem sido o método escolhido em larga escala para conservar
tecidos vegetais por longos períodos (HELLIOT et al., 2002). A técnica é
baseada no fenômeno de vitrificação, que se caracteriza por um processo
Vitrificação
físico definido como a transição da água diretamente da fase líquida para
uma fase sólida amorfa (solução supersaturada e de alta viscosidade), obtido
normalmente pela exposição a soluções crioprotetoras altamente
concentradas, em que não há formação de gelo cristalino no congelamento
Nessa técnica, as células/tecidos são inicialmente encapsuladas em alginato

de sódio, seguido de incubação em sacarose (0,85 M) (por 4–16 horas), de
secagem das cápsulas em fluxo laminar (3–4 horas) e de posterior
congelamento rápido em nitrogênio líquido. Dessa maneira, o material é
Encapsulamento
induzido a adquirir tolerância à desidratação pelo uso exclusivo da sacarose
desidratação
como único crioprotetor. Porém, ressalta-se que esse método necessita de
um controle cuidadoso quanto aos procedimentos para desidratação e
penetração de crioprotetores, a fim de prevenir danos por toxidez química ou
por excesso de estresse osmótico durante a desidratação
b) Armazenamento/manutenção das culturas criogênicas

Figura 6. Representação dos eventos físico-químicos que ocorrem às células
do material vegetal a ser conservado durante o resfriamento lento.
Representa importante etapa do sistema de criopreservação, já que a

manutenção do material congelado sob temperatura apropriada é
fundamental para prevenir o aparecimento de cristais de gelo e,
consequentemente, manter a viabilidade do material. Assim, as culturas
são geralmente armazenadas a -196 ºC em botijões específicos, o que
requer um suprimento constante de nitrogênio líquido. Nessa fase é
também importante a realização de testes periódicos em algumas
amostras durante o longo período de conservação para controle da
viabilidade do material.
Figura 7. Representação dos eventos físico-químicos que ocorrem às células
dos materiais vegetais a serem conservados, durante o esfriamento rápido.
c) Descongelamento
Consiste na imersão dos materiais criopreservados em água, à
temperatura de 37 ºC a 40 ºC, que corresponde a um rápido
descongelamento (de 500 ºC min-1 a 750 ºC min-1). Dessa maneira, as
células são protegidas dos efeitos danosos decorrentes da formação de
cristais de gelo, o que enfatiza a necessidade de se reduzir o conteúdo de
água das células a um nível ótimo antes do congelamento.
d) Restabelecimento
Esta fase – considerada chave para o sucesso de qualquer protocolo de
criopreservação – consiste em submeter o material descongelado ao
restabelecimento do crescimento sob condições padrões. Isso porque
todo material criopreservado deve necessariamente ser capaz de
restabelecer seu padrão de crescimento e, com isso, ser utilizado para os
devidos fins, caso contrário todo o material será perdido. Para tal, os
materiais descongelados são lavados, normalmente por várias vezes5,
para remoção das substâncias crioprotetoras utilizadas, as quais podem
provocar injúria às células. Em seguida, os materiais são restabelecidos
em meio de cultura fresco, o qual pode conter ou não substâncias
reguladoras de crescimento, composição nutricional diferenciada, entre
outras modificações, o que vai depender do material criopreservado
(meristemas, plantas organizadas, calos, etc.).
e) Determinação da viabilidade
Após a criopreservação, é também importante que o material possua a
capacidade de ser utilizado. Para isso, sua viabilidade pode ser
rapidamente avaliada logo após a fase de descongelamento. Com esse
intuito, algumas técnicas podem ser utilizadas, tais como: submissão do
material criopreservado a testes de coloração com Fluorescein Diacetate
(FDA) ou cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC) (RAZDAN, 2003);
observações morfológicas sob microscópio de luz (expansão e
esverdeamento de primórdios foliares, por exemplo) (MIAJA et al., 2000);
observações em microscópio eletrônico, além de observações de fatores
associados a estabilidade genética, os quais serão abordados
posteriormente.
Protocolos de criopreservação
De modo geral, atualmente existem dois tipos de protocolos que são
considerados para criopreservação: os convencionais ou clássicos, e
aqueles baseados no processo de vitrificação, os quais diferem em seus
mecanismos físicos.
Protocolos clássicos ou convencionais

No início, a maioria dos trabalhos sobre criopreservação de culturas in
vitro tinha como foco um método baseado na crioproteção química e no
esfriamento com desidratação gradual do material vegetal, protocolo
particularmente promissor para cultura de células em suspensão
(RAZDAN, 2003). Nos protocolos clássicos ou convencionais, a fase de
congelamento é realizada na presença de gelo, e os protocolos
envolvem, de maneira geral, as seguintes fases: a) pré-tratamento dos
explantes com soluções crioprotetoras compostas de uma simples
substância, ou de uma mistura de substâncias químicas, como o dimetil
sulfóxido (DMSO); b) congelamento lento a uma determinada
temperatura de pré-congelamento; c) rápida imersão em NL; d)
armazenamento; e) descongelamento rápido; f) restabelecimento
(ENGELMANN, 2004). Por sua vez, as substâncias crioprotetoras são
usualmente adicionadas progressivamente até uma concentração final,
que é inferior àquela das soluções crioprotetoras usadas nos protocolos
de vitrificação. Contudo, embora esse pré-tratamento remova alguma
água das células, a maior parte é retirada durante a primeira etapa do
procedimento de esfriamento (esfriamento lento/pré-congelamento).
Assim, na segunda fase do congelamento (imersão rápida em nitrogênio
líquido), ocorre a cristalização da água remanescente ou a vitrificação
dos solutos intracelulares (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008).
São técnicas geralmente com certa complexidade operacional, que
requerem normalmente a utilização de caros e sofisticados freezers
programáveis, embora, em alguns casos, o uso desses equipamentos
seja desnecessário, pois a fase de congelamento lento pode ser realizada
com um freezer doméstico. Em relação à sua aplicação, sucesso tem sido
reportado para sistemas não diferenciados como células em suspensão,
calos e ápices caulinares de espécies tolerantes ao frio (ENGELMANN,
2004), diferentemente das espécies tropicais, para as quais tais
procedimentos têm ocasionado danos em ampla zona do domo apical
dos ápices caulinares, com exceção da cultura da mandioca (GONZALEZ-
ARNAO et al., 2008).
Protocolos atuais baseados na vitrificação

Nas técnicas clássicas de criopreservação, a remoção do conteúdo de
água celular e o comportamento da água remanescente durante os
processos de congelamento e descongelamento ainda são considerados
críticos para obtenção de sucesso. Por esse motivo, novas tecnologias
têm sido desenvolvidas e estudadas. Tais técnicas são baseadas no
fenômeno de vitrificação, um processo físico definido como a transição
da água diretamente da fase líquida para uma fase sólida amorfa, de
modo que se evite a formação de gelo cristalino (GONZALEZ-ARNAO et
al., 2008).
A principal característica dos protocolos é o drástico processo de
desidratação ao qual as amostras (material vegetal/explantes) são
submetidas. Esse grau de desidratação celular e de dessecação antes do
congelamento é obtido pela exposição a soluções crioprotetoras
altamente concentradas (soluções de vitrificação) e/ou a condições
físicas de secagem (ar estéril do fluxo laminar). Consequentemente,
maior eficiência na remoção da água intracelular é alcançada, já que a
maior parte, ou toda a água congelável, é retirada durante a fase de
desidratação. Decorrido essa fase, as amostras são submetidas ao
esfriamento, geralmente realizado de forma rápida pela imersão direta
em NL, o que reduz a vitrificação dos solutos intracelulares. Assim, as
células hidratadas, os tecidos e os órgãos são capazes de resistir à
exposição à temperatura do NL, pois todos os fatores que influenciam a
formação de gelo intracelular são evitados (GONZALEZ-ARNAO et al.,
2008; WITHERS; ENGELMANN, 1998). Engelmann (2004) afirma ainda
que, em todos os novos protocolos de criopreservação, a fase crítica é a
de desidratação, essencial para que se obtenha sobrevivência do
material criopreservado; os protocolos clássicos, por sua vez, têm como
fase crítica o congelamento.
Quando comparada às técnicas clássicas de congelamento, a
criopreservação por vitrificação apresenta vantagens práticas. É a mais
indicada para materiais, tais como órgãos complexos (ápices caulinares e
embriões), constituídos por vários tipos celulares com exigências únicas.
Ademais, pelo fato de evitar a formação de gelo no interior das células,
apresenta o potencial de permitir que estruturas meristemáticas
permaneçam intactas, além de assegurar altas taxas de
restabelecimento dos explantes criopreservados de modo direto (sem
passar pela fase de calos). Além disso, os procedimentos são
operacionalmente menos complexos (não exige o uso de congeladores
controlados) e possuem um amplo espectro de aplicação, ou seja,
necessitam apenas de poucas modificações para diferentes tipos de
células (GONZALEZ-ARNAO et al., 2008; WITHERS; ENGELMANN, 1998).
Os progressos na área de criopreservação vegetal, que utilizam
protocolos baseados na vitrificação, têm sido desenvolvidos desde o final
da década de 1980 e início dos anos de 1990. Esses processos
permitiram, de modo geral, a existência de sete diferentes protocolos
que são usados atualmente, muitos dos quais podem ser considerados
combinações ou incorporações de outros: a) pré-crescimento; b)
desidratação; c) pré-crescimento-desidratação; d) encapsulamento-
desidratação; e) vitrificação; f) encapsulamento-vitrificação; g) droplet-
freezing. O maior sucesso tem sido conseguido com os métodos de
vitrificação, de encapsulamento-vitrificação e de droplet-freezing
(GONZALEZ-ARNAO et al., 2008).
a) Pré-crescimento
Esta técnica baseia-se no cultivo dos explantes na presença de
substâncias crioprotetoras, seguido do congelamento rápido pela imersão
direta em NL (ENGELMANN, 2004).
b) Desidratação
É um procedimento simples que consiste na desidratação dos explantes,
seguida do congelamento rápido pela imersão direta em NL. A
dessecação pode ser conduzida em câmaras de fluxo laminar, de
corrente de ar comprimido, ou, ainda, em dessecador com sílica gel. O
tempo de dessecação varia de acordo com o tamanho do explante e com
a quantidade de seu conteúdo de água (o ótimo está abaixo de 10% a 20
% de umidade, com base no peso fresco). Após o armazenamento, o
material é submetido ao descongelamento e, então, transferido
diretamente para seu restabelecimento sob condições padrões. Essa
técnica tem sido aplicada para embriões zigóticos, ápices caulinares e
eixos embrionários e há relatos em embriões de várias espécies
recalcitrantes e intermediárias. Além disso, o estado fisiológico do
material é considerado um fator importante, já que taxas variáveis são
observadas quanto à sobrevivência (ENGELMANN, 2004; WITHERS;
ENGELMANN, 1998).
c) Pré-crescimento-desidratação
Em geral, compreende as seguintes etapas: tratamento de pré-
crescimento com crioprotetores, dessecação (sob fluxo laminar ou sílica
gel), congelamento rápido em NL, descongelamento rápido ou sob
temperatura ambiente e recrescimento em meio padrão. O processo de
dessecação segue o mesmo raciocínio do método de desidratação,
enquanto o conteúdo ótimo de água para armazenamento deve estar
entre 12% e 30%. Sua aplicação tem sido apenas para um limitado
número de explantes (segmentos caulinares de plantas in vitro, embriões
somáticos e zigóticos) e em poucas espécies até o momento (aspargo,
melão, dendê e coco). Além disso, os materiais criopreservados que
utilizam esse procedimento têm apresentado satisfatórias taxas de
sobrevivência, além de um recrescimento normalmente rápido e direto,
embora alterações nos padrões possam ocorrer em função do explante
(ENGELMANN, 2004; WITHERS; ENGELMANN, 1998).
d) Encapsulamento-desidratação
Este método, inicialmente descrito para meristemas de Solanum (FABRE;
DEREUDDRE, 1990), fundamenta-se na tecnologia desenvolvida para a
produção de sementes sintéticas, na qual explantes são encapsulados
numa matriz de alginato de cálcio. Depois que os explantes são
encapsulados, as sementes sintéticas resultantes são submetidas às
seguintes fases: a) pré-cultivo6 em meio com alta concentração de
sacarose (1–7 dias), exceto para espécies sensíveis que são submetidas a
um progressivo incremento nos níveis de sacarose; b)
desidratação/secagem dos explantes encapsulados sob atmosfera de
fluxo laminar de ar, ou sílica gel7, até cerca de 20% de água; c)
transferência para criotubos e submissão ao congelamento de forma
rápida, pela imersão direta em NL, ou lentamente (abaixo de -100 ºC),
dependendo do explante e do controle de conteúdo de água residual nas
células; d) descongelamento do material criopreservado; e)
recrescimento8 do material descongelado diretamente sob condições de
cultivo padrão (ENGELMANN, 2004; WITHERS; ENGELMANN, 1998).
Comparada a outras técnicas de criopreservação, o encapsulamento-
desidratação apresenta as seguintes vantagens: fácil manipulação dos
explantes, possibilidade de armazenar grandes quantidades de tecidos
delicados, utilização de crioprotetores não tóxicos (sacarose, glicerol) e
eficiência na proteção dos explantes durante a desidratação (VERLEYSEN
et al., 2005). Ademais, apresenta a possibilidade de congelar com
sucesso explantes de dimensões relativamente grandes, como ápices
caulinares (> 5 mm de comprimento) e embriões nos estágios torpedo e
coração (2 mm a 3 mm), além de preservar a integridade estrutural de
muitas células meristemáticas, evitando, assim, a formação de calo após
a criopreservação (WITHERS; ENGELMANN, 1998).
e) Vitrificação
É um método efetivo contra o congelamento. Para tanto, utiliza soluções
crioprotetoras, caracterizadas por serem altamente concentradas e por
superesfriarem sob temperatura muito baixa. Isso permite a solidificação
das estruturas de forma que se mantenham viscosas e estáveis, além de
evitar o processo de cristalização e os danos por injúrias. Tais soluções,
conhecidas pelas siglas PVS29 ou PVS3, são misturas complexas de
substâncias crioprotetoras selecionadas por sua habilidade para vitrificar,
ou seja, formar uma estrutura amorfa durante a etapa de esfriamento.
Geralmente, baseiam-se em glicerol e apresentam menor toxidez, de
maneira que sua utilização sob 25 ºC ou 0 ºC causa suficiente
desidratação em células ou em meristemas sem, no entanto, provocar
qualquer dano antes da fase de imersão em NL (WITHERS; ENGELMANN,
1998).
De modo geral, os procedimentos de criopreservação via vitrificação
consistem nos seguintes passos: a) tratamento do material vegetal com
substâncias crioprotetoras (solução loading); b) desidratação com uma
solução de vitrificação altamente concentrada (solução de vitrificação); c)
esfriamento rápido pela imersão direta em NL; d) reaquecimento por
imersão em água ou meio líquido em temperatura que varia de 20 ºC a
40 ºC, com o intuito de evitar o processo de devitrificação, o que pode
levar à formação de cristais de gelo e prejudicar a integridade celular; e)
remoção da solução de vitrificação (unloading) para evitar choque
osmótico, o que é conseguido por meio da diluição da solução de
vitrificação em meio líquido suplementado com sacarose ou sorbitol; f)
recrescimento em meio de cultura padrão (WANG et al., 2005a; WITHERS;
ENGELMANN, 1998).
O tempo de exposição a cada solução, bem como a concentração de
algumas substâncias, variam entre os diferentes protocolos empregados
(tipo de explantes, tamanho, etc.). No entanto, a prolongada exposição a
soluções de vitrificação pode ocasionar injúrias nos explantes em
decorrência da toxidez química ou do excesso de
dessecação/desidratação. Nesse sentido, o pré-cultivo dos explantes em
meio que contenha açúcar ou açúcares álcoois parece auxiliar na
tolerância à dessecação, pois submete os explantes a um moderado
estresse osmótico, que incrementa a tolerância (TOUCHELL et al., 2002).
Variações quanto aos protocolos baseados na vitrificação são observadas
também para a fase de desidratação quando se utiliza a solução PVS,
que pode ocorrer tanto em temperatura de 0 ºC quanto em temperatura
ambiente. Nesse caso, Withers e Engelmann (1998) afirmam que, à
temperatura de 0 ºC, ocorre redução da toxicidade dos explantes às
soluções de vitrificação, o que resulta em maiores chances de sucesso. O
recrescimento, por sua vez, geralmente é rápido, direto e com alta
sobrevivência; no entanto, pode ocorrer desenvolvimento anormal dos
explantes.
Entre as vantagens desse método, cita-se o fato de a vitrificação não
requerer o uso de equipamentos programáveis ou ultrafreezers (-80 ºC),
considerados caros, além de evitar a formação de gelo pelo uso de
soluções crioprotetoras altamente concentradas, as quais dessecam as
células e penetram nelas formando uma solução intracelular altamente
viscosa, que, por sua vez, forma cristais metaestáveis a baixas
temperaturas (ENGELMANN, 2004). Somado a isso, o procedimento de
vitrificação é fácil de conduzir e, frequentemente, apresenta alta
percentagem de restabelecimento (TAKAGI et al., 1997; THINH et al.,
1999). Por esses motivos, tem-se tornado o método preferível para
criopreservação nas últimas décadas, além de ser aplicado com sucesso
para criopreservar pelo menos 140 espécies e cultivares atualmente
(ENGELMANN, 2004). Ademais, pelo fato de os protocolos baseados na
vitrificação e no encapsulamento-desidratação desidratarem a maior
parte da água congelável a temperaturas não congeláveis e permitirem a
imersão direta em NL, eles são simplificados e possibilitam ampliar a
aplicação da criopreservação para diversos materiais, especialmente no
caso de espécies tropicais (HIRAI; SAKAI, 2003) e de espécies
particularmente sensíveis à baixa temperatura (WANG et al., 2005a).
f) Encapsulamento-vitrificação
Consiste na combinação entre o método de encapsulamento-
desidratação e os procedimentos de vitrificação. Nesse método, os
explantes são primeiramente encapsulados em cápsulas de alginato,
sendo as sementes sintéticas posteriormente submetidas ao pré-cultivo.
Em seguida, elas são tratadas com uma solução de vitrificação,
armazenadas em NL, descongeladas e restabelecidas para crescimento
(ENGELMANN, 2004; WANG et al., 2005b).
De modo semelhante à técnica de encapsulamento-desidratação, o
encapsulamento-vitrificação apresenta como vantagens o fato de a
cápsula (sementes sintéticas) permitir que os explantes sejam imersos
diretamente em NL. Com isso, não é necessário o uso de freezers
programáveis. Além disso, essa tecnologia, comparada a outros
protocolos, como o da vitrificação, proporciona maior flexibilidade e
facilidade de armazenamento de grande número de materiais (WANG et
al., 2005b).
g) Droplet freezing
Este método, primeiramente desenvolvido para a cultura da batata, na
década de 1970, tem possibilitado bons resultados, com altas taxas de
sobrevivência (ENGELMANN, 2004; SANT et al., 2008). Consiste
basicamente no tratamento dos explantes com solução que contém
substâncias crioprotetoras, a qual é substituída pela solução de
vitrificação. Em seguida, os explantes são dispostos sobre tiras de papel
alumínio com minúsculas gotículas da solução de vitrificação, que são
posteriormente imersas em NL, transferidas para criotubos com NL e
submetidas ao descongelamento. Em seguida, os explantes são
transferidos para a fase de restabelecimento (SANT et al., 2008).
Na Tabela 6, é possível observar alguns exemplos de trabalhos que
envolvem as diferentes metodologias para a criopreservação de material
vegetal.
Tabela 6. Exemplos de pesquisas que envolvem as
diferentes metodologias de criopreservação, com vistas na
conservação in vitro de recursos genéticos vegetais.
Técnica de Tempo de
Espécie Explante Referência
criopreservação armazenamento
Até dois anos,

com boa
Cultura de viabilidade e
Técnicas Pérez et al.
Citrus spp. calos produção de
convencionais/clássicas (1997)
embriogênicos embriões com
bom padrão de
crescimento
Batata-doce
Pennycooke
[Ipomoea
Droplet vitrification – e Towill
batatas (L.) (2000)
Lam.]
‘Troyer’
citrange
[Poncirus Apenas imersão
Encapsulamento- Ápices Wang et al.
trifoliata (L.) em NL por
vitrificação caulinares (2002)
Raf. × Citrus algumas horas
sinensis (L.)
Osbeck.]
Batata-doce
Hirai e
[Ipomoea Encapsulamento-
– Sakai
batatas (L.) vitrificação
(2003)
Lam.]
12 meses, com Wilkinson

Cosmos Encapsulamento- Ápices
boa sobrevivência et al.
atrosanguineus desidratação caulinares
e recrescimento (2003)
Banana (Musa Helliot et al.

Vitrificação Meristemas –
spp.) (2003)
Crisâtemo
(Dendranthema Ápices Halmagyi et
Várias –
grandiflora caulinares al. (2004)
Ramat.)
Dois anos, com

Mamão (Carica Ápices percentual de Wang et al.
Vitrificação
papaya L.) caulinares sobrevivência (2005a)
acima de 70%
Encapsulamento-
Framboesa
vitrificação e Ápices Wang et al.
(Rubus idaeus –
encapsulamento- caulinares (2005b)
L.)
desidratação
Dendê Elaeis Imersão rápida Sementes 7 dias Camillo et
guineensis al. (2009)
Pinhão manso Carvalho et

Imersão rápida Sementes 1 dia
Jatropha curcas al. (2009)
Orquídea Vendrame
(Híbridos de Vitrificação Sementes – et al.
Dendrobium) (2007)
Colocasia
Ápices Sant et al.
esculenta var. Droplet vitrification –
caulinares (2008)
esculenta
Estudos fisiológicos e moleculares

relacionados à conservação in vitro de
germoplasma
A utilização de tampas de polipropileno e de filme plástico como sistema
de vedação, para prevenir a contaminação e a dessecação das culturas
armazenadas in vitro, restringe a ocorrência de trocas gasosas entre a
atmosfera dos frascos e o ambiente externo. Como consequência, gases
como o etileno são acumulados no interior do recipiente de cultivo, os
quais têm sido associados com algumas das anormalidades observadas
nos materiais mantidos in vitro (SARKAR et al., 2002). Ademais, a alta
umidade mantida nos recipientes de cultivo, aliada aos efeitos advindos
do uso de reguladores de crescimento, de crioprotetores, de processos de
natureza física e química, é fonte potencial para induzir desordens
fisiológicas, estruturais e genéticas nos materiais sob conservação.
Para a maioria das culturas, a conservação in vitro de germoplasma pelo
uso de técnicas de crescimento lento tem sido a melhor alternativa.
Porém, pelo fato de os subcultivos serem mais espaçados nessas
condições, o acúmulo de gases no interior dos frascos de cultivo, como o
etileno, pode ser danoso e, em alguns casos, dificultar ou impossibilitar
que plantas normais sejam regeneradas ao final do armazenamento. Isso
ocorre porque algumas espécies respondem negativamente quando
expostas ao etileno. Como alternativa para essas espécies, poderiam ser
listadas a realização de transferências periódicas para meio de cultura
fresco e a utilização de sistemas de vedação que permitisse a troca
gasosa, entre outras. No entanto, quando o intuito é conservar
germoplasma in vitro, tais alternativas podem ser onerosas, por causa da
elevação dos custos, tanto pela aquisição de tampas especiais quanto
pela constante necessidade de mão de obra para as repicagens. Além
disso, existem os riscos quanto aos erros de manipulação das culturas e
à ocorrência de contaminações microbianas, que são indesejáveis,
principalmente quando existe pequena quantidade do germoplasma a ser
preservado (SARKAR et al., 2002).
Nesse sentido, estudo mais recente utilizando o complexo aniônico
tiossulfato de prata [Ag(S2O3)23-] (STS) reporta ser possível manter, ou
mesmo melhorar, a qualidade de microplantas de genótipos de batata
conservadas por tempo prolongado em virtude do efeito antietileno do
STS (SARKAR et al., 2002). Segundo esses autores, a utilização de
cápsulas de alginato que contenham o STS (procedimento indireto),
colocadas diretamente sobre meio sólido de MS, acrescido de manitol (20
g L-1) e de sacarose (40 g L-1), permitiu a conservação das microplantas a
6 ºC ± 1 ºC, por 16 meses, com efeitos benéficos até mesmo sob altas
concentrações de STS (1,0 mM a 4,0 mM).
Diante desse contexto, o aprofundamento das pesquisas relacionadas a
aspectos estruturais, fisiológicos e da estabilidade genética do material
vegetal preservado in vitro são de extrema importância para validação
de métodos promissores de conservação. Além de possibilitarem o
melhor entendimento dos efeitos de cada método empregado, tais
estudos são importantes para apontar suas possíveis causas e permitir
otimizações nas diferentes fases do processo de conservação e de
criopreservação in vitro, de maneira que os danos em âmbito celular, até
mesmo em regiões específicas dos materiais, possam ser avaliados e
diagnosticados (PANIS; LAMBARDI, 2006).
Contudo, apesar de existirem vários estudos sobre a conservação in vitro
de germoplasma vegetal, poucos avaliam as variações ocasionadas,
sejam elas de ordem fisiológica, estrutural ou genética, o que dificulta a
aplicação prática, rotineira e segura dos métodos desenvolvidos (SARKAR
et al., 2001). O que tem sido observado nesse aspecto são pesquisas
com o intuito de, por exemplo, elucidar os processos de crioinjúria e de
crioproteção durante a criopreservação, os quais utilizam para isso de
tecnologias mais avançadas, como a microscopia eletrônica, e até
mesmo técnicas baseadas em marcadores moleculares (WITHERS;
ENGELMANN, 1998). Tal situação ocorre muito provavelmente por causa
do crescente interesse, nos últimos anos, por esse método, pelo fato de
ele envolver um maior número de fases in vitro e utilizar substâncias
diversas (PANIS; LAMBARDI, 2006). Esses estudos são importantes por
fornecerem subsídios sobre a viabilidade e a possibilidade de aplicação
da criopreservação nos mais diversos tipos de germoplasma vegetal
(WITHERS; ENGELMANN, 1998).
É importante ressaltar também que o monitoramento da estabilidade
biológica e da genética do germoplasma conservado pode ser realizado
ainda durante o armazenamento in vitro, na fase de aclimatização ou em
condições de campo (OLIVEIRA et al., 2000). No caso da estabilidade
genética, testes dos genótipos doadores realizados em campo e
comparações com os preservados in vitro são importantes para
assegurar os resultados da estabilidade dos materiais vegetais (SARKAR
et al., 2001).
Estudos fisiológicos
Como citado anteriormente, estudos estruturais e fisiológicos podem ser
realizados a partir de observações de microscopia de luz e de
microscopia eletrônica, incluindo aqui a varredura e a transmissão,
conforme relatado nos trabalhos de Wang et al. (1998), de Helliot et al.
(2003) e de Wilkinson et al. (2003). Por sua vez, aspectos do estado
fisiológico dos materiais têm sido estudados basicamente por meio de
exames visuais, com o intuito de verificar a hiper-hidratação, a
vitrificação e a flacidez. Estes dois últimos são frequentemente
verificados em microplantas de batata conservadas por longos períodos
sob restrição de crescimento utilizando estresses osmóticos (SARKAR et
al., 1999).
Estabilidade genética
De modo semelhante ao que é exigido para a propagação clonal, a
conservação de recursos genéticos vegetais in vitro deve permitir que a
espécie em questão seja mantida. Além disso, deve possibilitar que sua
regeneração apresente fidelidade genotípica, o que é de especial
importância no caso de espécies raras e em extinção, cujo tamanho da
população pode ser extremamente baixo e nas quais qualquer perda
adicional de material por causa da degradação genética pode ser
inaceitável e danosa (WITHERS; ENGELMANN, 1998; WILKINSON et al.,
2003). Todavia, poucos trabalhos com conservação in vitro abrangem os
aspectos relacionados à fidelidade genética do material preservado
(PANIS; LAMBARDI, 2006).
Dessa forma, a escolha do método de conservação a ser utilizado deve
considerar a ocorrência de variação somaclonal, que pode estar
associada também à natureza do material vegetal e às substâncias
empregadas (WITHERS; ENGELMANN, 1998). Com esse intuito, os
pesquisadores têm utilizado várias técnicas, entre as quais se incluem: 1)
marcadores morfológicos e características agronômicas; 2) marcadores
citológicos incluindo descrição do cariótipo em nível cromossomal; 3)
marcadores bioquímicos, incluindo análises de isoenzimas, eletroforese
de proteína e produtos secundários; 4) marcadores de DNA (SARKAR et
al., 2001; TYAGI et al., 2007; URBANOVÁ et al., 2002; WILKINSON et al.,
2003). Este último tem como vantagem o fato de toda variação
genotípica ter um efeito permanente e herdável sobre a espécie; ao
contrário das variações fenotípicas, que podem ser reversíveis de acordo
com as repostas ao estresse. Ademais, ressalta-se o fato de que a
importância da estabilidade genética não pode ser subestimada e,
quando possível, uma combinação de técnicas podem assegurar os
resultados obtidos (WILKINSON et al., 2003).
Algumas das ameaças à estabilidade genética podem surgir de reações
particulares (formação de radicais livres e danos moleculares por causa
da radiação ionizante), as quais podem ocorrer, por exemplo, à
temperatura de -196 °C (GROUT, 1990 citado por PANIS; LAMBARDI,
2006), ou mesmo em decorrência do uso de determinados crioprotetores,
como o DMSO em determinadas concentrações (PANIS; LAMBARDI,
2006).
Nesse contexto, Harding (1994) observou a hipermetilação de DNA em
microplantas de batata mantidas por longos períodos e submetidas a
estresses osmóticos pelo uso de manitol, resultante provavelmente de
uma resposta adaptativa das células. Por sua vez, Sarkar et al. (2001), ao
avaliarem os efeitos do ancimidol na conservação de microestacas de
batata por meio de marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA), não constataram nenhuma instabilidade genética detectável após
16 meses de armazenamento. Já Wilkinson et al. (2003), ao utilizarem
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), não observaram
variações genéticas de C. atrosanguineus armazenados em NL por 12
meses. Nesse mesmo contexto, brotos de espécies de Vanilla, cultivados
em meio MS ½ suplementado com sacarose (15 g L-1) e com manitol (15
g L-1), e mantidos a 2 ºC por mais de sete anos com subcultivos anuais,
não mostraram qualquer variação no DNA, quando avaliados por
marcadores moleculares (DIVAKARAN et al., 2006).
Santos (2004) relata ainda que, pelo fato de embriões zigóticos serem
sistemas altamente organizados, e por conterem tecidos meristemáticos
e produzirem de forma direta plantas completas, sua utilização implica
em um menor risco de variação somaclonal. Por isso, podem ser
utilizados com sucesso para criopreservar germoplasma de muitas
espécies que apresentam sementes recalcitrantes ou intermediárias.
Considerações finais a respeito da

aplicação de técnicas in vitro para
conservação de recursos genéticos
vegetais
Uma limitação frequentemente reportada no uso rotineiro da
conservação in vitro em larga escala está relacionada aos altos custos
envolvidos, sobretudo para os métodos que necessitam de certo nível
tecnológico, como a criopreservação, na qual o controle e a variação de
temperaturas são indispensáveis para o congelamento e o
descongelamento dos materiais criopreservados (RAZDAN, 2003; TYAGI
et al., 2007). Além disso, existem os problemas que podem surgir em
decorrência das diferentes respostas dos genótipos às condições padrões
de cultivo. Tal situação tem sido reportada em germoplasma armazenado
à baixa temperatura e apresenta o potencial de afetar seriamente o
germoplasma da espécie na coleção in vitro, por ocasionar a perda
desses acessos que não respondem as condições de cultivo (BRENNAN et
al., 1990; DUSSERT et al., 1997). Aliado a esses fatores, existem os riscos
de variações somaclonais, de erros de manipulação humana, de
alterações estruturais e fisiológicas, além da dificuldade de resta‐
belecimento e de regeneração do material criopreservado.
Dessa forma, torna-se imperativo que tecnologias mais baratas e seguras
sejam desenvolvidas, as quais devem apresentar eficiência semelhante
aos equipamentos convencionalmente utilizados, possibilitando assim
maior aplicabilidade dos métodos de conservação in vitro, especialmente
nos países em desenvolvimento (IAEA, 2004; TYAGI et al., 2007).
Ademais, o desenvolvimento de técnicas para a distribuição, além de
uma rede de informações para os materiais conservados, são fontes
importantes para a melhoria do sistema de conservação in vitro.
Outro aspecto importante diz respeito ao fato de que, embora o método
in vitro, quando comparado aos métodos convencionais, apresente
considerável potencial e seja amplamente utilizado com relativo sucesso,
ele não deve ser visto como substituto para o método in situ. Isso porque
nenhuma técnica de conservação aplicada isolada conserva de modo
adequado toda a diversidade genética de determinada espécie, ou seja,
seu pool gênico (DIVAKARAN et al., 2006; WITHERS; ENGELMANN, 1998),
pois cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens, além de
requererem estratégias complementares para sustentar de modo efetivo
o máximo de diversidade genética vegetal (GONÇALVES; ROMANO,
2007). Portanto, os métodos de conservação in vitro devem ser utilizados
como uma estratégia complementar em programas de conservação de
recursos genéticos, para que, dessa maneira, possam oferecer segurança
adicional a esses recursos, tanto para uso atual quanto futuro,
juntamente com os bancos de genes no campo (DIVAKARAN et al., 2006;
MARTIN; PRADEEP, 2003).
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CAPÍTULO 8
O diagnóstico molecular aplicado à

cultura de tecidos vegetais
Maria Cristina Rocha Cordeiro O diagnóstico molecular é uma importante ferramenta que pode ser utilizada para
diversos fins, tais como: os trabalhos que estudam as diferenças genéticas entre espécies de animais (Figura 1) ou
plantas, as questões ambientais, como a poluição e seus efeitos sobre os organismos, e as doenças dos animais, dos
vegetais ou dos seres humanos. No caso das doenças humanas, o diagnóstico molecular mobiliza grandes setores,
como o farmacêutico (SERVICE, 2003), e possibilita tanto a prevenção quanto o tratamento dessas doenças.
Figura 1. Identificação molecular específica do nematoide Heterodera

glycines em PCR, utilizando-se a combinação de primers 13. Meloidogynes
incognita (Mi); M. javanica (Mj); M. arenaria (Ma); H. glycines (Hg);
Prathylenchus brachyurus (P); Rotylenchulus reniformis (R); amostras de
nematoide de vida livre (N1 e N2); peso molecular 100 pb (PM). A seta aponta
para o fragmento específico amplificado somente na amostra de H. glycines.
Foto: Maria Cristina Rocha Cordeiro
De uma maneira geral, o diagnóstico molecular tem como base moléculas que podem
ser proteínas ou sequências gênicas específicas. Essas moléculas são caracterizadas,
estudadas e analisadas previamente, de forma que possam ser correlacionadas com
situações fisiológicas específicas constituindo um biomarcador. Muitas são as
metodologias utilizadas para distinguir um possível biomarcador. Por exemplo, pode-se
citar a eletroforese em duas dimensões: a reação de polimerase em cadeia do DNA (PCR)
e as várias ferramentas da engenharia genética.
Com um determinado biomarcador, pode-se realizar um diagnóstico molecular. Esse
diagnóstico pode também ter como base diversas técnicas, tais como: a PCR; a
eletroforese em uma ou em duas dimensões; o Western blot; o ensaio enzimático do tipo
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), que utiliza anticorpos específicos ou não;
os marcadores moleculares do tipo Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD); os
Simple Sequence Repeats (SSR); o Reverse Transcription PCR (RT-PCR); o Real Time
quantitative PCR (RTqPCR); os microarranjos de DNA; entre outros.
Os diagnósticos moleculares de biomarcadores previamente selecionados utilizam
metodologias que devem identificá-los de maneira que possam ser aplicadas quatro
principais exigências: a sensibilidade, a reprodutibilidade, a especificidade e a distin‐
guibilidade.
Neste capítulo, será dada ênfase a dois aspectos particulares do diagnóstico molecular
utilizado na cultura de tecidos vegetais: a variação somaclonal e a detecção de plantas
transgênicas.
Variação somaclonal
A variação somaclonal é um fenômeno que ocorre frequentemente na cultura de tecidos
vegetais. Constitui uma alteração genética com relação ao material inicial. Em geral, é
uma variação não desejável para quem trabalha com o objetivo de, por exemplo,
micropropagar plantas em larga escala ou produzir plantas transgênicas que devem ser
distintas apenas em um aspecto genético em relação à planta-mãe. As variações
somaclonais podem ser de dois tipos: genética e não genética (epigenética) (JORDAN,
2005; LÓPEZ et al., 2004). Para mais detalhes, ver o capítulo 2 deste livro.
Primeiramente, é necessário esclarecer que a variação somaclonal pode ser identifcada
por meio de marcadores fenotípicos e moleculares. Variações epigenéticas são, hoje,
mais bem observadas por caracteres fenotípicos, enquanto as variações em nível
genético podem ser observadas facilmente por ferramentas como: RAPD, Inter Sequence
Simple Repeats (ISSR), SSR e Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Os marcadores moleculares mais usuais na identificação de variações somaclonais
genéticas são: RAPD, ISSR e SSR (GUO et al., 2006; MARTINS et al., 2004). Esses
marcadores representam uma cobertura total do genoma da planta, por isso podem mais
facilmente identificar nele pequenas alterações. No caso desses marcadores
moleculares, não é necessária a caracterização de um biomarcador específico, pois são
observadas alterações diretas no genoma da planta que podem ser facilmente
detectadas por meio da amplificação diferencial de bandas (fingerprinting). Os
marcadores RAPD e SSR são duas ferramentas que estão baseadas na técnica de PCR
(ROCHA C., 2005).
A PCR é uma técnica com a qual se pode amplificar em progressão geométrica
fragmentos de DNA, específicos ou não (Figura 2). De uma maneira geral, esse processo
ocorre em três fases distintas que se repetem em ciclos de número e de tempo variáveis.
A primeira fase é chamada de etapa de desnaturação do DNA, a segunda é chamada de
etapa de anelamento do oligonucleotídeo iniciador (primer) e a terceira é chamada de
etapa de polimerização das novas cadeias do DNA. Com respeito às técnicas de
marcadores moleculares que utilizam a PCR e são utilizadas para o diagnóstico de
variações somaclonais, pode-se dizer que uma das principais diferenças é o fato de que,
em RAPD ou ISSR, utiliza-se um único primer de sequência não especificada, enquanto os
SSR utilizam dois primers específicos, caracterizados previamente para a espécie
estudada. Além disso, os SSR são considerados marcadores codominantes, isto é,
reconhecem a presença de alelos dominantes e recessivos. Esse fato permite reconhecer
variações genéticas do tipo mutagênese nos diferentes alelos. Os marcadores RAPD ou
ISSR não possuem essa característica por serem considerados dominantes, ou seja,
apenas reconhecem alelos de caráter dominante (LÓPEZ et al., 2004).
Figura 2. Esquema geral da reação de PCR.

Ilustração: Maria Cristina Rocha Cordeiro.
No que diz respeito às principais exigências da técnica diagnóstica (especificidade,

reprodutibilidade, distinguibilidade e sensibilidade), os marcadores RAPD perdem um
pouco para os SSR nos quesitos especificidade e reprodutibilidade. No entanto,
experimentos em duplicata minimizam essa situação e fazem deles também uma
ferramenta bastante utilizada. Na verdade, os dois marcadores são complementares em
sua análise.
Esses marcadores foram utilizados com êxito nas seguintes plantas: em amêndoas
micropropagadas, com o objetivo de observar a estabilidade genética do material
produzido (MARTINS et al., 2004); em Codonopsis lanceolata, uma planta medicinal (GUO
et al., 2006); em cacau (Theobroma cacao) (LÓPEZ et al., 2004); e também em banana
(VENKATACHALAM et al., 2007).
Detecção de plantas transgênicas

Plantas transgênicas são aquelas que foram transformadas geneticamente com relação a
sua espécie original. Atualmente, são conhecidas muitas plantas transgênicas, que foram
transformadas para adquirir características, tais como: resistência a insetos, a diferentes
patógenos como fúngicos, bacterianos ou virais, herbicidas, etc. Destacam-se as plantas
de interesse agronômico como a soja, o milho, o algodão, o tomate, a batata, etc. Para
que se possa produzir uma planta transgênica, é necessário associar pelo menos dois
grandes componentes metodológicos: a engenharia genética e a transformação genética
de plantas relacionada com a cultura de tecidos vegetais. Primeiramente, é necessário
que se obtenha um gene alvo específico que represente um papel relevante no sistema
fisiológico da planta. Esse gene alvo é obtido por meio da utilização de diversas
ferramentas metodológicas da engenharia genética. A transformação genética das
plantas pode ser conseguida pelo método que utiliza o Agrobacterium (A. tumefaciens ou
A. rizhogenes) ou biobalística seguida de metodologias de cultura de tecidos que visam
regenerar e multiplicar o tecido vegetal transformado (PRIETO, 2005; BRASILEIRO; DUSI,
1999; LACORTE et al., 1999; SLUYS, 1999). Para mais detalhes ver os capítulos 9 e 10
deste livro.
Os genes alvos utilizados na transformação genética das plantas serão os biomarcadores
que serão utilizados na identificação da planta transgênica.
A identificação da planta transgênica é importante em várias fases, tais como: na fase da
produção da planta propriamente dita, visando à seleção das plântulas transformadas;
na fase anterior à sua produção, em escala comercial, como, por exemplo, nos testes de
biossegurança; e após sua liberação comercial, com a finalidade de monitoramento
ambiental, tendo como objetivo controlar possíveis escapes gênicos entre plantas na
área cultivada, bem como situações referentes ao comércio irregular de sementes ou à
quantidade encontrada em alimentos derivados (MARCELINO et al., 2003). A forma de
identificá-la ou reconhecê-la entre os parentais originais é realizada por meio de uma
técnica diagnóstica que pode detectar sua molécula biomarcadora (Figura 3). Nessa
figura, observam-se dez plantas fenotipicamente iguais; no entanto, somente a planta 3
contém uma marca genética diferente, amplificada em PCR, por ser uma planta
transgênica.
Figura 3. Esquema geral do diagnóstico molecular de uma planta transgênica.
As principais técnicas diagnósticas que podem ser utilizadas com plantas transgênicas
são: Southern blot, PCR, Western blot e ELISA. Porém, a mais utilizada, pela sua
praticidade, é a PCR. As demais são utilizadas na pesquisa científica relacionada.
O Southern blot tem como base a técnica de eletroforese de DNA em gel de agarose. Os
fragmentos de DNA separados nesse gel são transferidos para uma membrana de nylon
e fixados nela. Posteriormente, ocorre hibridização com uma sequência específica que
pode ser marcada, por exemplo, com radioatividade, quimioluminescência ou
fluorescência (Figura 4) (SAMBROOK et al., 1989). Essa é uma técnica que oferece boa
reprodutibilidade, distinguibilidade e especificidade. Ademais, sua sensibilidade aumenta
com a utilização da fluorescência. Essa técnica necessita mais expertise do operador e
sua realização envolve mais etapas de trabalho. Por isso, é mais lenta do que o PCR.
Figura 4. Esquema geral de uma análise em Southern blot.
O Western blot e o ELISA são duas técnicas que se baseiam no reconhecimento

específico de proteínas. Nesses dois casos, a busca é por proteínas traduzidas nas
plantas transgênicas.
O Western blot se parece com o Southern blot, pois também tem como base uma
separação eletroforética em gel. No entanto, aqui essa separação ocorre em géis
verticais de poliacrilamida específicos para proteínas. Logo após a separação
eletroforética, as proteínas são transferidas para uma membrana de nylon e, depois, são
reconhecidas por anticorpos específicos (chamados anticorpos primários) e não
específicos (anticorpos secundários). Este último está, em geral, marcado com uma
molécula diferenciadora que se pode acionar por uma reação enzimática (por exemplo,
biotina/avidina ou compostos que produzem fluorescência, etc.). Assim, nessa técnica,
realiza-se um duplo reconhecimento de anticorpos.
No ELISA também se faz um duplo reconhecimento de proteínas específicas com
anticorpos, mas essas não são separadas em um processo de eletroforese, e sim fixadas
em placas apropriadas (Figura 5).
Figura 5. Esquema geral da técnica ELISA.

Tanto o Western blot quanto o ELISA são técnicas muito específicas, distinguíveis,
sensíveis e reprodutíveis. Porém, são técnicas que requerem grande expertise por parte
do operador, além de requerer a produção de anticorpos primários específicos
(monoclonais). Mesmo no caso da possível utilização de anticorpos primários não
específicos (policlonais), sua produção, embora mais fácil, ainda é necessária. Por causa
deste último aspecto, tanto o custo quanto o tempo de obtenção de resultados
aumentam bastante quando comparados à técnica de PCR. A Tabela 1 apresenta um
resumo das principais características, vantagens e desvantagens das técnicas
diagnósticas.
Tabela 1. Resumo das principais características, vantagens e desvantagens das

metodologias utilizadas no diagnóstico molecular.
Tempo
para
Metodologia Sensibilidade Distinguibilidade Reprodutibilidade Especificidade Custo obtençã
de
resultado
PCR ++++ +++ +++ +++ + +
RAPD ++++ +++ ++ ++ + +
ISSR ++++ +++ +++ +++ ++ +
SSR ++++ +++ +++ +++ ++++ +
Southern blot ++++ +++ +++ +++ +++ ++
ELISA +++ +++ +++ +++ +++ ++
Western blot ++++ +++ +++ +++ +++ ++
Microarranjos
+++++++ +++ +++ +++ +++++ ++
de DNA
RTqPCR +++++++ +++ +++ +++ +++++ +
(+) = baixo; (++) = médio; (+++) = alto; (++++) ou superior = altíssimo.
Todas essas metodologias são muito sensíveis. A escolha entre uma ou outra depende do
custo, da expertise e da velocidade com que se deseja obter resultados.
As metodologias empregadas para o diagnóstico molecular de plantas transgênicas
descrito acima também podem ser utilizadas para o diagnóstico de outros organismos
geneticamente modificados (OGMs), como animais e microrganismos transgênicos.
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CAPÍTULO 9
Introdução de genes em
células vegetais mediada
pelo processo biobalístico
Ana Cristina Miranda Brasileiro
O processo biobalístico
O processo biobalístico (do inglês biolistic), também
conhecido por aceleração de partículas ou
bombardeamento de partículas, foi desenvolvido
inicialmente por J. Sanford, N. Allen, T. Klein e E. Wolf, da
Cornell University, (EUA) (SANFORD, 2000; SANFORD et
al., 1987, 1993), como uma alternativa para introdução
direta de material genético no genoma nuclear de plantas
superiores. Desde então, sua universalidade de aplicações
tem sido avaliada, demonstrando ser um processo efetivo
e simples para a introdução e a expressão de genes em
bactérias, protozoários, fungos, algas, insetos, tecidos
vegetais e animais, além de organelas isoladas, como
cloroplastos e mitocôndrias (ARAGÃO et al., 1992, 1993;
BAILEY et al., 1993; BARRETO et al., 1997; BOGO et al.,
1996; BOYNTON et al., 1988; DANIELL et al., 1991;
HARRIER; MILLAM, 2001; JOHNSTON et al., 1988; KLEIN;
FITZPATRICK-MCELLIGOTT 1993; RECH et al., 1996;
SANFORD, 2000; SANFORD et al., 1993; VAINSTEIN et al.,
1994).
O método consiste na aceleração de partículas com 0,2
µm a 3 µm de diâmetro, que atravessam a parede celular
e a membrana plasmática, de forma não letal, carreando
substâncias adsorvidas para o interior da célula (KLEIN et
al., 1987; SANFORD, 1988). Embora moléculas de DNA,
RNA ou proteínas possam ser carreadas, o processo
biobalístico tem sido mais empregado para introduzir
moléculas de DNA (nas formas circular ou linear) no
citoplasma ou nas organelas, como o núcleo e o
cloroplasto. Várias modificações têm sido introduzidas, o
que aumenta a eficiência e possibilita a obtenção de
plantas transgênicas de diversas espécies, que até então
não haviam sido transformadas por meio de outras
metodologias (ARAGÃO et al., 1996, 2000; BIRCH;
FRANKS, 1991; CHRISTOU, 1995; LUTHRA et al., 1997;
RECH et al., 2008).
Os sistemas de transformação mediados por
Agrobacterium são eficientes e têm sido utilizados com
sucesso para um grande número de espécies. Entretanto,
para algumas espécies, em virtude dos sistemas de
cultura de tecidos existentes, não é possível ainda realizar
a transformação mediada por Agrobacterium. Nesses
casos, a técnica de biobalística, graças à sua
versatilidade, deve ser empregada, uma vez que pode
transformar diferentes tipos de tecidos e de células,
independentemente do genótipo. Além disso, trata-se de
uma técnica rápida, que envolve menos manipulação das
células em cultura, quando comparada a outros métodos.
Vários tipos de explantes e de células podem ser
utilizados para a transformação por biobalística, tais como
folhas, calos, caule, etc.
Para aumentar a eficiência de transformação, a
biobalística pode também ser utilizada juntamente com a
inoculação com Agrobacterium em tecidos bombardeados
cujos microferimentos ampliam a área de infecção
(BIDNEY et al., 1992; BRASILEIRO et al., 1996). Nesse
caso, ou o tecido pode ser bombardeado com partículas
nuas para, em seguida, ser submetido a uma cocultura
com Agrobacterium, ou as bactérias podem ser
previamente misturadas às partículas que, então, são
aceleradas.
A obtenção eficiente de plantas transgênicas de muitas
espécies economicamente importantes, incluindo
monocotiledôneas, dicotiledôneas e gimnospermas,
somente tem sido possível mediante o processo de
biobalística (ARAGÃO; CAMPOS, 2007; CHRISTOU, 1995;
JAEHNE et al., 1995). Plantas transgênicas de mais de 300
espécies já foram obtidas com a utilização dessa técnica.
A técnica de biobalística pode ainda ser aplicada ao
estudo da expressão gênica transiente, em que uma
sequência de DNA introduzida em uma célula pode vir a
ser transcrita, mesmo sem ser integrada ao genoma. A
maior intensidade da expressão gênica transiente é
geralmente observada no período de 24 a 72 horas após a
transferência, e não é praticamente detectada após uma
semana. A análise da expressão transiente foi, e ainda é,
bastante utilizada para otimização dos parâmetros
envolvidos no processo de bombardeamento. No entanto,
recentemente tem sido mais utilizada em estudos de
regulação gênica e para a avaliação de sequências
regulatórias (promotores). Nesses casos, constroem-se
genes quiméricos, como as sequências regulatórias
ligadas a genes marcadores (principalmente gus e gfp). As
construções são utilizadas para bombardeamento de tipos
celulares específicos. Para esse tipo de estudo, a
biobalística apresenta vantagens sobre as técnicas que
utilizam protoplastos (eletroporação ou transformação
mediada por polietileno glicol – PEG), uma vez que os
tipos celulares são transformados sem necessidade de
manipulações in vitro mais sofisticadas. A expressão
gênica pode ser analisada em células intactas e em
tecidos organizados, o que é essencial para o estudo de
promotores tecido-específicos. Além disso, a técnica de
biobalística é simples e mais rápida.
Sistemas
Diferentes sistemas capazes de acelerar micropartículas
cobertas com ácidos nucleicos, a velocidades superiores a
1.500 km h-1, têm sido desenvolvidos e construídos. Todos
eles baseiam-se na geração de uma onda de choque com
energia suficiente para deslocar uma membrana
carregadora que contém as micropartículas cobertas com
DNA (RECH et al., 1996, 2008) (Figuras 1 e 2). A onda de
choque pode ser gerada das seguintes formas: por meio
de uma explosão química (pólvora seca) (SANFORD et al.,
1987); por uma descarga de hélio a alta pressão (ARAGÃO
et al., 1996, 2000; SANFORD et al., 1991); pela vapo‐
rização de uma gota de água por meio da descarga
elétrica com alta voltagem e baixa capacitância
(CHRISTOU, 1993; McCABE et al., 1988, McCABE;
CHRISTOU, 1993), ou baixa voltagem a alta capacitância
(ARAGÃO et al., 1992, 1993; RECH et al., 1991); ou por
uma descarga de ar comprimido (MORIKAWA et al., 1989).
Outros sistemas não exigem a utilização de uma
membrana carreadora (ARAGÃO et al., 1995; FINER et al.,
1992; SAUTTER et al., 1991; TAKEUCHI et al., 1992; VAIN
et al., 1993) (Figuras 1 e 2). Os sistemas que utilizam alta
pressão de gás hélio e descarga elétrica têm demonstrado
que possuem um amplo espectro de utilização, além de
serem mais eficientes para a obtenção de altas
frequências de transformação.
Figura 1. Esquema do princípio básico dos principais sistemas
biobalísticos para transformação genética de plantas. Nesses
sistemas, as micropartículas (1), geralmente de ouro ou de
tungstênio, são recobertas pelo DNA que contém os genes a serem
inseridos. As partículas são aceleradas a velocidades supersônicas (2)
e penetram nas células vegetais de forma não destrutiva (3). Os
sistemas diferem basicamente na geração de energia para
movimentar as partículas e no suporte em que elas são depositadas,
que pode ser de quatro tipos: (A) gás hélio com alta pressão, com as
partículas depositadas sobre um suporte plástico (membrana
carreadora de kapton ou mylar); (B) descarga elétrica para
vaporização de uma gota de água, com as partículas depositadas
sobre um suporte plástico; (C) gás hélio com baixa pressão, com as
partículas presas por capilaridade (em suspensão em um meio
líquido) em uma tela de metal (PIG); (D) gás hélio com baixa pressão,
com as partículas depositadas (secas) no interior de um tubo fino de
plástico. Nos sistemas com gás hélio com alta pressão e com
descarga elétrica (A e B), a membrana carreadora fica retida em uma
tela, por meio da qual as partículas atravessam em direção às
células-alvo.
Ilustração: Francisco J. L. Aragão.
Figura 2. Equipamentos de biobalística desenvolvidos para
transformação genética de plantas. (A) equipamento elétrico; (B)
equipamento baseado em fluxo de hélio através de tubos plásticos;
(C) PIG (Finer´s gun); (D) equipamento de alta pressão de gás hélio
(Sanford´s gun); (E) equipamento com cartucho de pólvora; (F)
equipamento portátil (hand-held gun).
Fotos: Francisco J. L. Aragão.
Os equipamentos originalmente desenvolvidos possuem

uma câmara selada (com vácuo parcial), o que limita
muito sua utilização em amostras grandes ou pouco
resistentes a danos provocados pela exposição ao vácuo.
Assim, desenvolveram-se equipamentos mais sofisticados
que não requerem câmaras de vácuo e podem ser
utilizados in vivo, mesmo em amostras grandes e em
condições de campo (RECH et al., 1996; RINBERG et al.,
2005; ROIZENBLATT et al., 2006; SHEFI et al., 2006)
(Figura 2). Uma das versões mais recentes desses
modelos é o HeliosTM, desenvolvido pela BioRad.
Equipamentos manuais (hand-held gene guns) têm sido
utilizados com sucesso tanto na transfecção de diversos
tipos celulares e organismos, tais como bactérias,
levedura, etc., quanto, especialmente, na introdução de
genes em plantas e em animais em condições naturais
(no campo ou casa de vegetação), bem como na
inoculação de vírus em plantas (BURKHALTER;
BERNARDO, 1989; GRUTZENDLER et al., 2003; O’BRIEN;
LUMMIS 2004; RECH et al., 1996; SAMBROOK; RUSSELL,
2006).
As micropartículas
Micropartículas de distintas naturezas podem ser
empregadas como carreadoras de DNA, desde que não
degradem ou causem quebras em ácidos nucleicos,
tenham alta densidade, tamanho e formato adequados.
No início do desenvolvimento da tecnologia biobalística,
testaram-se micropartículas de vários materiais, tais como
metais com alta densidade, como platina e irídio, além de
vidro, de sílica e de outros. Os testes resultaram em baixa
frequência de transformação genética (SANFORD et al.,
1993). Recentemente, a prata tem sido utilizada em uma
técnica chamada de diolística (ROIZENBLATT et al., 2006).
Atualmente, os microprojéteis mais empregados como
microcarreadores têm sido partículas de ouro ou de
tungstênio, cujas principais características são: 1)
micropartículas de tungstênio têm formato irregular e
medem de 0,2 µm a 3,0 µm; são potencialmente tóxicas
para alguns tipos de células (ARMALEO et al., 1990;
RUSSELL et al., 1992) e sujeitas à oxidação rápida com
consequente efeito negativo sobre o DNA; seu custo é
bastante reduzido; 2) micropartículas de ouro são
biologicamente inertes e possuem formato esférico; seu
diâmetro mede de 1,0 µm a 7,5 µm; são mais uniformes
que as de tungstênio e têm um custo mais elevado. Além
disso, experimentos com células animais têm
demonstrado que partículas de ouro maiores são mais
adequadas (CHENG; JOHO, 1994; RECH et al., 1996).
Células desidratadas de Escherichia coli e de
Agrobacterium tumefaciens, funcionando como uma
forma natural de encapsulação de DNA, foram utilizadas
com sucesso no lugar das micropartículas cobertas de
DNA, para a transferência de genes em suspensão celular
de fumo e de milho (RASMUSSEN et al., 1994).
O tipo apropriado de micropartículas varia de acordo com
o tamanho das células a serem transformadas. Como
regra geral, demonstrada empiricamente, as
micropartículas devem possuir em torno de um décimo do
tamanho da célula-alvo. Portanto, para células de
microrganismos (células bacterianas e esporos fúngicos),
micropartículas com diâmetro em torno de 0,2 µm (M5,
Sylvania) são mais apropriadas. Para células de plantas,
partículas com diâmetro de 0,2 µm a 1,5 µm (M10,
Sylvania) são as mais indicadas. Mazus et al. (2000)
mostraram evidências de que partículas de tungstênio
podem interagir com plasmídios e causar quebras na
molécula de DNA gerando moléculas lineares. É
interessante notar que o tungstato de sódio, o óxido de
tungstênio IV e o cloreto de tungstênio VI não causaram
qualquer dano ao DNA. Além do mais, o fenômeno é
dependente de pH (MAZUS et al., 2000). Para células
animais, que apresentam maior tamanho, recomendam-se
partículas de ouro, pelo fato de não apresentarem toxidez.
As partículas de ouro (com diâmetro de 1 µm a 3 µm)
também podem ser utilizadas para determinados tipos de
células vegetais (ARAGÃO et al., 1993).
Diversas características relativas às micropartículas
influem na eficiência de transformação, pela interação
com o DNA ou com a célula. Dessa forma, estudos que
avaliam o efeito de diferentes tamanhos, formatos,
homogeneidade e tipo de material das partículas podem
contribuir para a otimização do processo de biobalística.
Recentemente, micropartículas com formato de rosca, em
forma de tubos e com cavidades, têm sido desenvolvidas
e podem ser bastante úteis.
Diversos protocolos de precipitação de DNA sobre as partí‐
culas têm sido descritos (SANFORD et al., 1993). O
método mais
utilizado, desenvolvido inicialmente por Klein et al. (1987),
emprega cloreto de cálcio e espermidina. As partículas
com o DNA adsorvido são lavadas e ressuspendidas em
etanol absoluto e distribuídas sobre a membrana
carreadora. O etanol evapora rapidamente, e as partículas
com o DNA permanecem secas sobre o macrocarreador.
Como o etanol absoluto e a espermidina são muito
higroscópicos, as partículas com o DNA tendem a
absorver umidade, formando agregados. Esses agregados
de micropartículas danificam as células quando as
atingem e resultam em baixa frequência de
transformação. O experimento de Smith et al. (1992)
mostrou claramente que a umidade relativa do ar no
momento da deposição das micropartículas na membrana
é um fator muito importante. Esse fator é tanto mais
importante quanto menor for o diâmetro das partículas
utilizadas e menor for a célula-alvo. Por sua vez, DNA em
excesso ou preparações impuras também causam a
aglomeração das partículas (ARAGÃO et al., 1993; KLEIN
et al., 1988). Variações nas metodologias de precipitação
de DNA sobre as micropartículas, bem como protocolos
alternativos, podem diminuir os problemas associados aos
métodos disponíveis, principalmente pela redução da
formação de agregados e na reprodutibilidade dos
experimentos.
Parâmetros físicos importantes

Em virtude de sua massa reduzida, as micropartículas são
rapidamente desaceleradas em consequência do atrito
com o ar. Para que haja uma minimização desse efeito,
nos principais sistemas de biobalística descritos (com
exceção dos sistemas hand-held), a quantidade de ar na
câmara deve ser reduzida com auxílio de uma bomba de
vácuo, o qual deve ser mantido a uma pressão em torno
de 710 mm de Hg. Vácuo acima desse nível não conduz a
uma melhor frequência de expressão do gene introduzido,
provavelmente por causa da redução do vapor residual de
água da própria amostra biológica. Para certas aplicações,
o vácuo deve ser reduzido, a saber: no caso do
bombardeamento de células animais em cultura e animais
in vivo (JOHNSTON et al., 1991). Em alguns casos, gás
hélio é injetado na câmara de vácuo, de forma que
substitua o ar residual. Essa adição de gás hélio, de baixo
peso molecular e de baixa densidade, aumenta a
eficiência de transformação, provavelmente pela redução
do atrito e pela consequente diminuição da
desaceleração. Esse fato tem sido observado
principalmente em microrganismos, em que se utilizam
micropartículas menores (0,2 µm). Em bactérias, o
aumento da eficiência pode ser de 5 a 6 vezes maior,
enquanto em leveduras, pode ser de até 4 vezes
(SANFORD et al., 1993; SMITH et al., 1992). No caso de
plantas, em que se empregam partículas até cinco vezes
maiores (1,0 µm), a injeção de hélio na câmara de
bombardeamento não apresenta efeito significativo na
eficiência de transformação (SANFORD et al., 1993).
As distâncias entre as células-alvo e o ponto de origem
das partículas ou da fonte geradora de energia para
movê-las são extremamente importantes e devem ser
otimizadas para cada tipo celular. No caso dos
equipamentos de gás hélio a alta pressão, deve-se
otimizar não somente a distância entre a membrana de
ruptura e a membrana carreadora de partículas
(macrocarreador), como também a distância entre a
membrana carreadora até a tela de retenção e desta
última até o tecido-alvo. Isso é importante pelo fato de
ondas de choque se propagarem pelo interior do
equipamento no momento do disparo. As ondas de
choque e acústicas, necessárias para a aceleração do
macrocarreador, podem causar danos às células-alvo
(RUSSELL et al., 1992). A intensidade e a forma dessas
ondas variam de acordo com as distâncias entre a fonte
geradora da onda de choque (membrana de ruptura) e o
macrocarreador, entre o macrocarreador e a tela de
retenção, e desta última até as células-alvo. Esses
parâmetros também influem na velocidade final das
micropartículas, na sua capacidade de penetração e,
consequentemente, na eficiência da transferência e na
expressão gênica (KIKKERT, 1993; KEMPER et al., 1995;
SANFORD et al., 1993).
Outro parâmetro importante é a pressão do gás hélio,
que, na maioria dos casos, é de 1.200 psi; entretanto,
deve ser ajustada para cada tecido a ser bombardeado.
Uma pressão muito alta pode acarretar dano aos tecidos,
enquanto pressões mais baixas podem levar a uma baixa
penetração das partículas, que podem não atingir os tipos
celulares desejados em cada tecido-alvo.
Desenho de vetores
O processo biobalístico é bastante influenciado por
algumas das características dos vetores empregados, com
efeitos marcantes sobre a introdução e a integração dos
genes exógenos nas células. O DNA plasmidial pode ser
precipitado sobre micropartículas, acelerado e introduzido,
tanto na forma circular quanto na linear. O tamanho do
vetor, de per si, aparentemente não é um fator limitante
(LACORTE et al., 1997; SANFORD et al., 1993). Entretanto,
há uma limitação da massa de DNA que poderá ser
adsorvida pelas micropartículas, uma vez que, em
grandes quantidades, o DNA tende a gerar aglomerados
de micropartículas (ARAGÃO et al., 1993, LACORTE et al.,
1997). Teoricamente, 400 a 800 cópias de um plasmídio
de 10 kb são adsorvidas em uma micropartícula com 1,2
µm de diâmetro médio. Esses aglomerados causam danos
às células por causa de suas dimensões e de sua massa.
Demonstrou-se que o número de cópias dos genes
introduzidos é um fator importante para sua expressão
transiente (LACORTE et al., 1997). No entanto, a influência
sobre a integração ainda necessita ser investigada.
Finalmente, como o tamanho do vetor (DNA plasmidial) é
diretamente proporcional à sua massa e inversamente
proporcional ao número de cópias possível de ser
precipitado sobre as micropartículas, deve-se então dar
preferência a vetores pequenos, entre 2 kg e 15 kb. As
frequências de transformação estável (isto é, a obtenção
de plantas transformadas) parecem ser um pouco
reduzidas no momento da utilização de vetores lineares
(BONFIM et al., 2007; VIANNA et al., 2004). Entretanto, em
virtude de questões de biossegurança, pode-se optar pela
utilização de vetores lineares, os quais são produzidos
após a remoção (pela digestão com enzimas apropriadas)
de sequências gênicas que conferem resistência a
antibióticos presentes nos vetores circulares. É
recomendável que o vetor circular possua um sítio para
uma enzima que permita a digestão e a eliminação de
genes desnecessários para o processo de transformação
genética. É possível a cotransformação, por meio da
utilização de dois ou três vetores simultaneamente. Isso
permitirá a segregação dos transgenes nas gerações
seguintes. As frequências de cotransformação para genes
presentes em um único vetor chegam a cerca de 100%,
enquanto para genes presentes em vetores distintos são
de aproximadamente 50% (ARAGÃO et al., 1996).
Ao contrário dos vetores de Agrobacterium, os plasmídios
utilizados no processo biobalístico não necessitam de
nenhuma sequência moduladora da sua integração no
genoma vegetal. Em levedura (ORR-WEAVER et al., 1981)
e em algumas espécies de Synechococcus (WILLIAMS;
SZALAY, 1983), a integração do
DNA exógeno ocorre em virtude de sequências homólogas
ao DNA cromossomal (recombinação homóloga). No
entanto, a integração do DNA exógeno, introduzido por
métodos diretos no genoma de células vegetais, parece
ser diferente. Aparentemente, sua integração independe
de presença de sequências homólogas no genoma vegetal
(IIDA et al., 1990; MORIKAWA et al., 1994). Entretanto, o
mecanismo de integração ainda necessita ser mais bem
compreendido.
Transformação via
bombardeamento de meristemas
apicais
Com o surgimento dos processos biobalísticos, abriu-se a
possibilidade de transformação direta in situ das células
do meristema apical. Dessa forma, vislumbrou-se a
possibilidade de obtenção de plantas transgênicas por
meio da transformação de celulas-mãe do meristema
apical. No final dos anos de 1980, obteve-se a primeira
planta transgênica (soja) pelo processo biobalístico. O
processo ocorreu a partir de células transformadas do
meristema apical (McCABE et al., 1988).
Embora a transformação mediada por Agrobacterium
também possibilite a transformação de células
meristemáticas (ULIAN et al., 1988), essa técnica não tem
sido eficiente (BRASILEIRO et al., 1996). A combinação
biobalística-Agrobacterium também já foi empregada
(BIDNEY et al., 1992; BRASILEIRO et al., 1996), embora,
de igual modo, não tenha demonstrado ser um método
muito eficiente.
O meristema apical vem sendo alvo de um grande
número de estudos, dos quais a maioria tem investigado a
função das diferentes células que o compõem. Existe
alguma confusão quanto aos termos utilizados para
denominar determinados tecidos da região apical, que é
constituída do meristema apical propriamente dito, dos
primórdios dos órgãos laterais e da região de maturação,
onde a diferenciação se torna aparente (CUTTER, 1965).
Em feijão, ela é composta basicamente pelo meristema
apical, pelos primórdios foliares e pelas folhas primárias.
As diferentes partes do meristema apical são definidas
por dois conceitos distintos: por camadas e por zonas
(MEDFORD, 1992). Segundo Satina et al. (1940), a
primeira define três camadas distintas: L1, L2 e L3 (Figura
3). A camada L1 é a mais externa e forma a epiderme das
regiões diferenciadas. A camada L2 divide-se
preferencialmente no plano anticlinal (perpendicular à
superfície), e também no plano periclinal (paralelo à
superfície), no momento da formação dos órgãos. A
camada L3 divide-se tanto no plano anticlinal quanto no
periclinal. O segundo conceito baseia-se na divisão do
meristema em zona (ESAÚ, 1977; STEEVES; SUSSEX,
1989). Há uma zona central, uma zona periférica e a
medula (Figura 3). A zona central inclui todas as três
camadas. Suas células dividem-se com menor frequência
e, embora deem origem às demais células do meristema
apical, não são permanentes (RUTH et al., 1985). As
células periféricas têm como função a formação das
regiões laterais. Vários estudos demonstraram que os
brotos diferenciados são originados de novo em camadas
subepidérmicas (L2 e L3) do meristema apical, embora a
camada L1 também possa participar de sua formação
(FRANKLIN et al., 1991; MALIK; SAXENA, 1992; McCLEAN;
GRAFTON, 1989; MOHAMED et al., 1992). Esses brotos são
formados nas regiões periféricas do meristema apical
(ARAGÃO; RECH, 1997).
Figura 3. Eixo embrionário após a retirada das folhas primárias e
detalhe da estrutura do meristema apical, dividido em camadas (L1,
L2 e L3) e em zonas. ZC – zona central; ZP – zona periférica; M –
medula.
Ilustração: Francisco J. L. Aragão.
A transformação dessas células meristemáticas por meio

do processo biobalístico tem-se mostrado bastante
eficiente. As micropartículas podem atingir as células das
três camadas (ARAGÃO et al., 1993); entretanto, o
bombardeamento de micropartículas da região
meristemática de embriões posteriormente cultivados,
sem qualquer tratamento, mostrou-se ineficiente para
obtenção de plantas transgênicas (ARAGÃO et al., 1996,
2005; ARAGÃO; CAMPOS, 2007; Bonfim et al., 2007; RECH
et al., 2008). Em cultivares de elite de algodão, a
eficiência de transformação ficou entre 0,027% e 0,71%
com relação ao número de plantas transgênicas obtidas e
o número de embriões bombardeados (ARAGÃO et al.,
2005; McCABE; MARTINELL, 1993). A frequência de
transformação, no entanto, pode ser significativamente
aumentada por intermédio da indução de organogênese
na região do meristema apical. Em feijoeiro, a frequência
de transformação foi de 0,9% com a utilização de vetores
circulares (ARAGÃO et al., 1996), e de 0,2% a 0,8% com o
uso de vetores lineares (BONFIM et al., 2007; VIANNA et
al., 2004).
Incluem-se nos fatores biológicos que influenciam o
processo desde aqueles relacionados à integração do DNA
exógeno no genoma vegetal até os que se relacionam à
neoformação de brotos a partir das células
meristemáticas apicais. Além da fisiologia das células, a
morfologia da região apical e sua resposta a citocininas
são fatores muito importantes. Algumas variedades de
feijão apresentam os meristemas apicais encobertos total
ou parcialmente pelos primórdios foliares, o que dificulta
sua transformação. Por isso, é necessário encontrar
variedades cujo domo apical seja completamente exposto
ao bombardeamento (ARAGÃO; RECH, 1997; BONFIM et
al., 2007). Em caupi, não foi possível encontrar variedades
com o domo apical exposto. No entanto, foi possível
realizar a transformação pelo bombardeamento de células
meristemáticas apicais após a remoção das folhas
primárias e dos primórdios foliares (IVO et al., 2008).
Esses pontos são extremamente importantes para o
desenvolvimento de uma metodologia de transformação
que seja independente da cultivar.
Transformação cloroplasmática
A transformação cloroplasmática (inserção do transgene
no genoma do cloroplasto), em certos casos, tem algumas
vantagens em relação à transformação do genoma
nuclear. As principais vantagens apontadas são: altos
níveis de expressão heteróloga (DE COSA et al., 2001;
TREGONING et al., 2003); contenção do transgene, pois,
para a maioria das plantas superiores, o genoma
cloroplasmático tem herança materna (BIRKY, 2001; RUF
et al., 2001; SVAB; MALIGA, 1993); ausência do efeito de
posição, pelo fato de ser possível direcionar a integração
para uma região específica (STAUB; MALIGA, 1992); e
diminuição dos problemas de silenciamento gênico,
quando múltiplos genes devem ser inseridos, visto que a
maquinaria traducional dos cloroplastos tem a capacidade
de traduzir transcritos policistrônicos (DE COSA et al.,
2001; KANAMOTO et al., 2006; STAUB; MALIGA, 1995).
Com o advento da biobalística, foi possível inicialmente
transformar uma alga verde (Chlamydomonas) (BOYNTON
et al., 1988). Entretanto, apesar de todas essas
vantagens, quase uma década foi necessária até que essa
tecnologia fosse desenvolvida para plantas superiores
(SVAB et al., 1990; YE et al., 1990). Apesar de ser possível
transformar cloroplastos por meio de outras metodologias
(eletroporação e mediada por PEG), o processo de
biobalística tem sido mais presente na literatura.
Inoculação de vírus e de viroides

A biobalística também é utilizada para a inoculação de
vírus e de viroides em plantas. Esse método consiste na
transferência do genoma viral clonado, ou mesmo do DNA
ou do RNA de uma planta infectada, para a célula, o que
possibilita a infecção. A técnica é empregada,
principalmente em vírus, nos casos em que os métodos
para inoculação mecânica não se mostram eficientes,
como nos geminivírus, por exemplo (ARAGÃO et al., 1995;
GAL-ON et al., 1997; GARZÓN-TIZNADO et al., 1993;
GILBERTSON et al., 1991). Da mesma forma, o método se
mostra eficiente quando usado para inoculação com
viroides (MATOUŠEK et al., 2004). Ultimamente, a
biobalística tem sido o método preferido por vários grupos
para inoculação em estudos básicos de fitopatologia e em
teste de plantas transgênicas resistentes, em detrimento
de alternativas que envolvem vetor biológico (CALEGARIO
et al., 2007; HELLOCO-KERVARREC et al., 2002;
MAKWARELA et al., 2006).
Diolística
O processo de biobalística também é utilizado para
introduzir substâncias fluorescentes ou coloridas
(corantes) em células. Essa técnica é chamada de
diolística (O’BRIEN; LUMMIS, 2004). É possível encontrar
uma revisão sobre o assunto em O’Brien e Lummis (2007).
Nesse processo, os corantes aderem-se às micropartículas
ou aos filtros e, então, são “bombardeados” para
penetrarem nas células. A utilização desses corantes não
tóxicos, como carbocianina, os quais podem ser
transportados pela célula, tem permitido a marcação de
muitos tipos celulares e permanecem funcionais por um
longo período (O’BRIEN; LUMMIS, 2007). A diolística tem
vantagens sobre outras técnicas, como a microinjeção e a
eletroporação, por ser mais simples, rápida e por poder
marcar um maior número de células ao mesmo tempo.
Além disso, a técnica de microinjeção pode dialisar o
conteúdo celular e, dessa forma, causar ruptura em
componentes celulares vitais, o que afeta o
funcionamento da célula.
A técnica de diolística tem se mostrado muito útil para
estudos da arquitetura e morfologia em células animais
(O’BRIEN; LUMMIS, 2007), mas ainda é pouco utilizada
para o estudo de células vegetais. Recentemente,
corantes ligados ao cálcio têm sido utilizados para estudar
oscilações na concentração de Ca+2 em células-guarda de
Commelina communis, em células da alga verde
Chlamydomonas reinhardtii e em zigotos da alga marrom
Fucus serratus (BOTHWELL et al., 2006). Essa técnica
também tem sido proposta para introdução de
nanossensores óticos, que são aparatos de cerca de 1.000
nm de diâmetro, os quais podem “perceber” e transmitir
informações sobre eventos químicos e biológicos (BUCK et
al., 2004).
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CAPÍTULO 10
Protoplastos: tecnologia e
aplicações
Leonardo Soriano
Introdução
Os protoplastos são células vegetais desprovidas de
parede celular devido à ação de enzimas específicas que
degradam as fibras de celulose, hemicelulose e a matriz
de pectina. Por serem osmóticamente sensíveis, os
protoplastos são considerados os explantes vegetais mais
atrativos à biotecnologia, sobretudo por conta da sua
imediata resposta a estímulos externos, notável
capacidade de fusão celular, extração de organelas e
incorporação de materiais desejáveis, como DNA exógeno.
Por meio da totipotência celular, característica inerente às
células vegetais, é possível regenerar uma planta
completa a partir de um protoplasto. Esse notável sistema
tem estimulado estudos de expressão de genes isolados e
sua regulação, promovendo avanços nas áreas de
genômica, proteômica e metabolômica (XIAO et al., 2012).
Além disso, a obtenção de uma planta completa a partir
de uma única célula assegura a sua fidelidade genética
(DAVEY et al., 2003) e, por isso, os protoplastos são
comumente empregados em programas de melhoramento
genético de espécies de plantas de interesse agronômico.
Isolamento e cultivo de
protoplastos
O primeiro relato da obtenção de protoplastos foi em 1892
por meio do isolamento mecânico (KLERCKER, 1892). No
entanto, a técnica proposta disponibilizava poucas células
intactas, e seu rendimento era muito baixo. Somente em
1960, Cocking (1960) conseguiu isolar protoplastos da
ponta da raiz de tomateiro utilizando a enzima celulase,
extraída do fungo Myrothecium verrucaria, aumentando
consideravelmente o rendimento do processo. Dez anos
mais tarde, utilizando o corante fluorocromo calcoflúor
branco, Nagata e Takebe (1970) observaram a
regeneração da parede celular e as primeiras divisões
mitóticas ao estudarem protoplastos de mesofilo de
Nicotiana tabacum. No ano seguinte, a primeira planta de
N. tabacum, utilizando essa técnica, foi completamente
regenerada (NITSCH; OHYAMA, 1971).
Os protoplastos podem ser isolados a partir de mesofilo
(GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990), raiz (COCKING, 1960),
pecíolos (BIDNEY; SHEPARD, 1980), calos (KOBAYASHI et
al., 1983), suspensões celulares (MIZUHIRO et al., 2001),
embriões somáticos (NOMURA et al., 1982), hipocótilos
(SINHA et al., 2003), cotilédones (DOVZHENKO et al.,
2003), frutos (BROWN et al., 1997), coleóptilos (HALL;
COCKING, 1971), pedicelos florais (FLICK; EVANS, 1983),
segmentos caulinares (GNANASAMBANDAM; BIRCH,
2006), grãos de pólen (DUHOUX, 1980), ou seja,
praticamente a partir de qualquer tipo de tecido vegetal.
O sucesso do isolamento está vinculado à espécie, estado
fisiológico da planta, tipo e idade do explante, meio de
cultura e fatores ambientais (MATSUMOTO, 2006), os
quais influenciam na capacidade de protoplastos e células
derivadas expressarem sua totipotência e desenvolverem-
se em plantas viáveis.
Atualmente, há diversos protocolos de isolamento de
protoplastos disponíveis na literatura, incluindo tanto para
plantas monocotiledôneas quanto para dicotiledôneas,
sobretudo por meio de enzimas pectocelulolíticas em
conjunto com estabilizadores osmóticos (açúcares e
poliálcoois) e estabilizadores de membrana (cálcio e
fósforo) (CARNEIRO et al., 1998; DAVEY et al., 2003).
Entretanto, os procedimentos de isolamento mecânico são
raramente utilizados para o isolamento de protoplastos,
mas ainda são úteis para estudos que exigem baixas
concentrações celulares (BINDER et al., 2003).
Por conta da eficaz capacidade de degradar
separadamente a celulose, a hemicelulose e outros
polissacarídeos constituintes da parede celular, sem
danificar a membrana plasmática, a escolha e a
concentração das enzimas pectocelulolíticas variam de
acordo com a composição e espessura da parede celular e
da origem do tecido utilizado. As enzimas mais
empregadas mundialmente nos laboratórios são extraídas
de microrganismos saprófitas e possuem atividades
pectinolíticas e celulolíticas, as quais atuam na
despolimerização da celulose e descristalização de
cadeias (CARNEIRO et al., 1998). Dentre as enzimas
destacam-se as celulases Onozuka R10 e Driselase, a
pectinase Macerase R10 e a pectoliase Y-23. A formulação
da solução enzimática a ser empregada, bem como a
concentração de cada enzima (0,1% a 5%), pode diferir
sensivelmente até para cultivares da mesma espécie
(CASTRO et al., 2011).
O período de incubação necessário para a digestão
completa da parede celular varia de acordo com a espécie
(14 a 20 horas). Recomenda-se que o tecido vegetal
esteja em contato com a mistura enzimática sob agitação
suave (20 rpm a 40 rpm), com pH (5,4 a 6,2) e
temperatura (20 °C a 30 °C) que favoreçam a ação da
solução na obtenção de protoplastos viáveis. Nessa etapa
de isolamento, alguns aminoácidos como a glicina (0,1 M)
podem ser adicionados à solução enzimática para
maximizar a liberação de protoplastos (SUTIOJONO et al.,
2002).
Após o período de incubação, a purificação dos
protoplastos é realizada, verificando-se em microscópio
óptico invertido a ocorrência de digestão da parede
celular. A suspensão de isolamento é geralmente filtrada
em peneiras de nylon (45 μm) e sucessivamente
centrifugada (800 rpm a 1.000 rpm por 10 minutos)
separando os protoplastos de restos celulares, impurezas
e da solução enzimática. Em seguida, a cultura de
protoplastos é plaqueada em meio líquido ou semissólido,
cuja otimização da formulação é preponderante para as
próximas etapas de divisão celular, formação de
microcolônias e microcalos (ERIKSSON, 1985).
Para o cultivo de protoplastos e sua posterior
regeneração, a maiora dos meios de cultura encontrados
na literatura é baseada nos meios MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962), B5 (GAMBORG et al., 1968), SH (SCHENK;
HILDEBRANDT, 1972), KM (KAO; MICHAYLUK, 1975) e MT
(MURASHIGE; TUCKER, 1969), cujas formulações contêm
macro e micronutrientes, vitaminas, mio-inositol, açúcares
e ácidos orgânicos, em concentrações que proporcionam
uma alta viabilidade e eficiência de plaqueamento.
Para evitar o acúmulo de amido e induzir as primeiras
divisões celulares, os protoplastos são cultivados na
ausência de luz e temperatura entre 20 °C e 30 °C. A
regeneração da parede celular ocorre de acordo com a
fonte de protoplastos e as condições de cultura, podendo
variar de 1 a 72 horas (KLEIN et al., 1981; NAGATA;
TAKEBE, 1970; SIM et al., 1988). Para estimular a divisão
celular de protoplastos recalcitrantes de beterraba (Beta
vulgaris L.), Majewska-Sawka et al. (1997) recomendam a
adição das poliaminas espermidina, espermina e
putrescina (44 μM), associadas aos fitoreguladores ANA
(ácido naftaleno acético – 5 μM) e BAP (6-
benzilaminopurina – 2 μM), no meio de cultura.
A renovação do meio de cultura com a redução gradual da
pressão osmótica deve ser realizada pela diluição com
agentes osmóticos como o manitol, o sorbitol, a glicose, a
celobiose e a sacarose, em concentrações de 0,3 M a 0,8
M. Essa etapa é essencial para a manutenção da divisão
mitótica e, por conseguinte, a formação de microcolônias.
Os períodos de renovação do meio de cultura e de
desenvolvimento das etapas sequenciais dependem do
genótipo e estão relacionados ao estado fisiológico,
eficiência de plaqueamento e integridade do protoplasto.
Em cítrus, após uma semana de cultivo, é possível
verificar células em divisão (KOBAYASHI et al., 1983); aos
30 dias, microcolônias (VARDI et al., 1975); e, após 8 a 10
semanas, microcalos (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990).
A partir desse estágio, dependendo da espécie, o
processo de regeneração pode ocorrer tanto pela via
embriogênica (GRAMBOW et al., 1972) quanto pela via
organogenética (BOURGIN et al., 1979).
Hibridação somática
A hibridação somática via fusão de protoplastos não é um
evento dirigido, o qual permite a combinação total ou
parcialmente de genomas nucleares e citoplasmáticos,
sem perda significativa do vigor, aos níveis
interespecíficos e intergenéricos para contornar
incompatibilidades pré e pós-zigóticas, permitindo a
produção de plantas híbridas com genes de resistência a
pragas e doenças ou a estresses abióticos (LIU et al.,
2005). Trata-se de um processo aditivo de protoplastos e
tem sido uma ferramenta efetiva no melhoramento
genético de espécies economicamente importantes, como
batata, trigo, arroz e cítrus (JOHNSON; VEILLEUX, 2001).
Em virtude de não existir segregação meiótica na
hibridação somática, os genes recessivos deletérios nos
genitores permanecem mascarados nos híbridos
somáticos (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990).
Após o procedimento, podem ocorrer três resultados: a
fusão completa dos núcleos dos genitores ou cariogamia;
a perda cromossômica de um ou de ambos os núcleos; e a
perda total do núcleo de um dos genitores (BENGOCHEA;
DODDS, 1986). Este último ocorre em menor frequência,
com a perda de um dos núcleos parentais e com apenas o
intercâmbio aleatório de conteúdos citoplasmáticos
(SAITO et al., 1993). O material resultante desse
fenômeno é denominado como cíbrido, e, por manter
intacto um dos genomas, é objeto de estudos para
aumento da atividade fotossintética, taxas respiratórias
entre outras reações metabólicas.
Após sucessivos testes quanto à composição de soluções
e meios de cultivo, o primeiro relato de fusão de
protoplastos bem sucedido foi por meio da utilização de
altas concentrações de cálcio no meio de cultura, cuja
atividade está fortemente relacionada à manutenção da
estabilidade da membrana plasmática (KELLER;
MELCHERS, 1973). No ano seguinte, com a descoberta do
polietilenoglicol (PEG) e suas propriedades fusogênicas, a
técnica se notabilizou como uma importante ferramenta
para o melhoramento genético (KAO; MICHAYLUK, 1975).
Desde então, foi explorado o potencial considerável em
ampliar o conjunto de genes de culturas, e diversos
trabalhos foram realizados produzindo híbridos
interespecíficos (CARLSON et al., 1972; HELGESON et
al.,1998; MATSUMOTO et al., 2002; OHGAWARA et al.,
1985) e intergenéricos (KISAKA et al., 1998; LIU et al.,
1999; OZMINKOWSKI JUNIOR; JOURDAN, 1994; ZHOU et
al., 2001).
O processo de fusão pode ser resultante de tratamentos
químicos ou físicos. No tratamento químico, a membrana
plasmática dos protoplastos, após a etapa de isolamento,
possui carga elétrica negativa, e, para induzir o contato
íntimo entre as membranas plasmáticas, é necessária a
neutralização das cargas da superfície da membrana pelo
uso de policátions, como o polietilenoglicol (PEG), o qual
atua como agente aglutinador e tem se mostrado um
método simples e eficiente (BINSFELD, 1999; MOURÃO
FILHO et al., 1996). A ação fusogênica do PEG pode ser
visualizada em três etapas apresentadas na Figura 1. Por
sua vez, o tratamento físico consiste no uso de uma
corrente elétrica alternada de baixa voltagem, sob a qual
os protoplastos são submetidos e alinhados. Em seguida,
são aplicados pulsos curtos de corrente contínua, gerando
poros temporários nas membranas, permitindo assim a
fusão entre as células adjacentes (SHIMIZU et al., 1999).
Visando ao aumento da eficiência da técnica, métodos
mais refinados foram desenvolvidos, como a fusão
eletroquímica, que incorporou a indução química à
aplicação de pulsos de corrente elétrica (OLIVARES-
FUSTER et al., 2005).
Figura 1. Fusão química de protoplastos. A) Protoplastos
provenientes de calos de laranja-doce (cinzas) reunidos com
protoplastos de mesofilo de tangerina (esverdeados). B) Fusão dos
protoplastos pela ação do polietilenoglicol (PEG). C) Protoplastos pós-
fusão, podendo ser observadas células híbridas. Barras: 20 μm.
Foto: Leonardo Soriano
A hibridação somática necessariamente utiliza

protoplastos com propriedade embriogênica e alta
capacidade de regeneração, geralmente provenientes de
calos e suspensões celulares, juntamente com
protoplastos provenientes do mesofilo, de cor esverdeada,
para auxiliar no monitoramento da fusão.
Para favorecer a cultura de protoplastos e a formação de
microcolônias de cítrus, a literatura recomenda o meio
BH3, o qual apresenta uma composição bastante
complexa, contendo um grande número de vitaminas,
açúcares e ácidos orgânicos (GROSSER et al., 1992). No
cultivo dos microcalos, calos e embriões somáticos, os
meios de cultura utilizados na regeneração são baseados
nas formulações dos meios MS (MURASHIGE; SKOOG,
1962) e MT (MURASHIGE; TUCKER, 1969); bem como os
de formulações derivadas do MT, como os meios de
cultura EME, 1.500 e B+ (GROSSER; GMITTER JUNIOR,
2010).
A produção de híbridos somáticos por fusão de
protoplastos depende do sucesso de estágios sequenciais
(BINSFELD, 1999; GROSSER et al., 1992), os quais são
indicados na Figura 2.
Figura 2. Etapas sequenciais da hibridação somática via fusão de

protoplastos: I) fontes viáveis de protoplastos (calos embriogênicos e
fragmentos foliares); II) isolamento e cultura de protoplastos; III)
indução de fusão de protoplastos com alta frequência e sem perda de
viabilidade; IV) estabelecimento e indução da divisão celular nas
células fusionadas; V) formação de microcolônias.; VI) manutenção
dos microcalos; VII) indução da embriogênese somática; VIII)
organogênese in vitro.; e IX) aclimatização e confirmação da
hibridação.
Ilustração: Leonardo Soriano e Vitor Calderan
O período da fusão de protoplastos até a regeneração
completa varia de acordo com a espécie utilizada e do
tempo de resposta para emissão dos embriões, induzida
pelo meio de cultura. Avaliações morfológicas, citológicas
e análises moleculares são normalmente realizadas nas
plantas após a aclimatização. Diversos métodos foram
desenvolvidos para a confirmação da hibridação somática,
incluindo análises comparativas da morfologia vegetativa
das plantas regeneradas, quantificação da ploidia por
citometria de fluxo e, principalmente, testes de
paternidade utilizando marcadores moleculares (RFLP,
RAPD e SSR) (MATSUMOTO et al., 2002; OLLITRAULT;
LURO, 1995; SORIANO et al., 2012).
Transformação genética de
protoplastos
Diferentemente de hibridação somática, a transformação
de protoplastos é um evento dirigido, sendo possível a
inserção de DNA exógeno específico diretamente através
da membrana plasmática por meio de processos químicos
e físicos. Essa técnica de transformação é rápida e
fornece base para estudos de transformação nuclear
transiente e estável (GUO et al., 2012), e também para
transformação de organelas.
Destacada por sua eficiência e simplicidade metodológica,
a transformação de protoplastos tem sido empregada em
cultivares recalcitrantes ao processo de transformação
convencional (FLEMING et al., 2000; KOBAYASHI;
UCHIMIYA, 1989). Além disso, a transformação de
protoplastos é vantajosa por não apresentar quimeras,
pois a regeneração se dá a partir de uma única célula
isolada, sendo essa característica importante para a sua
utilização em programas de melhoramento e estudo da
expressão de genes (GUO et al., 2012).
Protoplastos têm sido empregados em experimentos de
transformação direta com plasmídios bacterianos desde
Davey et al. (1980), com a integração de genes exógenos
de forma aleatória no genoma da planta. Na
transformação direta, um gene de interesse é agrupado
em um cassete de expressão, contendo basicamente o
promotor seguido de uma sequência codificadora, um
gene marcador e um sinal de poliadenilação (terminador),
que é inserido em um plansmídeo bacteriano e transferido
diretamente em protoplastos, sem um vetor
intermediário, como Agrobacterium tumafaciens
(transformação indireta).
Novas técnicas fazem uso da síntese de peptídeos
cellpenetrating peptides (CPPs), os quais auxiliam na
condução de macromoléculas para o interior celular. No
caso, os CPPs ajudam o plasmídio a atravessar a
membrana plasmática dos protoplastos, aumentando a
eficiência de transformação (MÄE et al., 2005).
De forma geral, a metodologia de transformação direta
assemelha-se muito com a hibridação somática, com a
desestabilização da membrana dos protoplastos por
tratamento químico com polietilenoglicol (PEG) ou físico
via eletroporação. Ao invés da união dos protoplastos
genitores, é adicionada a suspensão plasmidial (0,8 µg
plasmídio µL-1 a 1,0 µg plasmídio µL-1) contendo o DNA
exógeno de interesse na suspensão de protoplastos numa
concentração em torno de 2x106 protoplastos mL-1 (OMAR
et al., 2008). Os genes de interesse são acompanhados
por genes de seleção, que conferem resistência a
antibióticos. Além desses, genes-repórteres como o β-
glucuronidase (GUS) e o green fluorescent protein (GFP)
são muito eficazes na detecção visual de células
transformadas (GUO et al., 2012; PAOLI et al., 2007).
Normalmente a frequência de transformação, no entanto,
é baixa; por isso, é necessário um sistema eficiente de
seleção de células e regeneração de tecidos. Tratamentos
térmicos prévios no DNA plasmidial e irradiação dos
protoplastos receptores podem aumentar a eficiência de
transformação, possivelmente pelo aumento da
recombinação de DNA genômico com o DNA exógeno
(DAVEY et al., 2003; TIWARI et al., 2001).
O protocolo de regeneração de plantas a partir da
transformação de protoplastos é basicamente o mesmo
que foi estabelecido na hibridação somática. Após a
seleção, é possível detectar a integração de gene de
interesse na planta regenerada por meio da combinação
com os genes-repórteres, por citometria de fluxo
(MADDUMAGE et al., 2002) e, principalmente, por meio de
análises moleculares, como PCRs convencionais e
quantitativas em tempo real (GUO et al., 2012) ou sondas
específicas (TIWARI et al., 2001).
Outras aplicações e perspectivas

Novas abordagens quanto ao uso de protoplastos têm sido
descritas, algumas das quais bem sucedidas
anteriormente para sistemas animais. O principal objetivo
no desenvolvimento de sistemas para protoplastos de
plantas é a oportunidade de utilização como uma célula
animal, porém com a vantagem de preservar a
propriedade totipotente e a sua condição autotrófica.
Desde 1892 (KLERCKER, 1892), a maximização da
estabilidade celular no meio de cultivo e o controle dos
processos de divisão celular, crescimento e diferenciação
a partir de uma célula isolada ainda constituem desafios
instigantes para os botânicos. A orientação para
desenvolvimento de protocolos viáveis pode ser obtida na
literatura, porém, parâmetros intrínsecos à espécie e
condições de cultivo devem ser determinados e
adaptados empiricamente.
Nos últimos anos, houve interesse crescente pelo uso das
plantas como sistemas de expressão gênica (XIAO et al.,
2012). No tocante à fusão de protoplastos, uma nova
aplicação é a criação de cromossomos híbridos. Koshinsky
et al. (2000) obtiveram células de calos resistentes ao
antibiótico higromicina com a fusão intergenérica de
protoplastos de Nicotiana tabacum com Arabidopsis
thaliana.
Quanto à transformação genética, mesmo com a
consolidação técnica de transformação nuclear, um
grande número de trabalhos destacam a transformação
de plastídios, em virtude da alta síntese de
macromoléculas nessas organelas e pela ausência de
efeitos epigenéticos nas plantas regeneradas (BOCK,
2001; DANIELL et al., 2002; GOLDS et al., 1993).
Vale ressaltar que os protoplastos também constituem um
sistema interessante para a obtenção de mutantes por
radiações ou agentes mutagênicos químicos, por conta do
volume de células homogêneas disponíveis a partir da
formação de microcolônias e microcalos (BRETAGNE-
SAGNARD et al., 1996; CARNEIRO et al., 1998). Outro
exemplo pertinente no campo molecular é o emprego de
protoplastos em pesquisas para a produção de proteínas e
inserção de macromoléculas em células vegetais (BRIERE
et al., 2004; MÄE et al., 2005; ROSENBLUH et al., 2004).
Contudo, a tecnologia de protoplastos está apta para
oferecer respaldo prático e teórico para o
desenvolvimento dessas importantes áreas de estudo.
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CAPÍTULO 11
O sistema Agrobacterium:
do solo para o laboratório
Ana Cristina Miranda Brasileiro
A galha-da-coroa (do inglês crown-gall), que se manifesta

principalmente em plantas de propagação vegetativa, é
uma doença de plantas conhecida na Europa desde a
Antiguidade. Traduz-se pela formação de uma galha na
coroa (junção entre o tronco e a raiz) ou diretamente nas
raízes da planta infectada. Sabe-se, há mais de um
século, que o agente etiológico causal da galha-da-coroa é
Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria tipicamente do
solo (CAVARA, 1897; SMITH; TOWNSEND, 1907). Estudos
posteriores mostraram que, ao contrário das células
sadias, os tecidos da galha-da-coroa, quando isolados da
planta e cultivados in vitro, são capazes de crescer
indefinidamente em meio de cultura, sem o acréscimo de
reguladores de crescimento (BRAUN, 1958; WHITE;
BRAUN, 1941). Essa particularidade despertou o interesse
de cientistas que trabalham nos mais diferentes campos
da pesquisa, pois, até então, pensava-se que a
proliferação do tecido das galhas vegetais era induzida
somente por um estímulo externo, de natureza química ou
mecânica.
Inicialmente, os pesquisadores associaram o
desenvolvimento dessas galhas ao câncer animal, como
se tratasse de um verdadeiro “câncer vegetal”, o que
estimulou numerosas pesquisas para o entendimento das
causas dessa doença (FERNANDES; MARTINS, 1985;
HOYKAAS; SCHILPERRORT, 1992). Esses estudos con‐
cluíram que o surgimento da galha é, na realidade, o
resultado de um processo natural de transferência de
genes da bactéria para a célula vegetal, que passam a
sintetizar substâncias que estimulam a divisão celular no
sítio de infecção. Os conhecimentos gerados desde então
culminaram em um entendimento bastante aprofundado
do parasitismo Agrobacterium-planta, que é considerado
atualmente um sistema modelo para estudos das
interações patógeno-hospedeiro, do transporte
intercelular de macromoléculas e do direcionamento de
proteínas para o núcleo. Nos últimos anos, o sofisticado e
fascinante mecanismo de transferência de informação
genética dessas bactérias para as plantas tem propiciado
o uso de Agrobacterium como vetor natural de
transferência de genes, o que permitiu a obtenção de um
grande número de plantas geneticamente modificadas.
O gênero Agrobacterium
As agrobactérias (Agrobacterium spp.) são bactérias
tipicamente do solo, do tipo bacilo Gram-negativo e
aeróbico. Todavia, alguns isolados, quando se encontram
nos tecidos vegetais, conseguem sobreviver sob
condições reduzidas de oxigênio. Suas células apresentam
um tamanho que varia de 0,6 µm a 1,0 µm x 1,5 µm a 30
µm, ocorrem isoladas ou aos pares e não formam esporos.
As agrobactérias são móveis na rizosfera por causa de
dois flagelos polares e de dois a quatro filamentos laterais
que permitem sua movimentação a aproximadamente 60
μm/segundo. Sua temperatura de crescimento está na
faixa de 25 °C a 28 °C, com colônias geralmente
convexas, circulares, lisas, apigmentadas ou de coloração
creme (HOLT et al., 1994).
Agrobacterium tumefaciens é considerada a espécie-tipo
do gênero Agrobacterium e foi descrita pela primeira vez
como Bacillus tumefaciens por Smith e Townsend (1907).
Posteriormente, o gênero Agrobacterium foi proposto por
Conn e enquadrado na família Rhizobiaceae que agrupa,
entre outros, os gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium,
Phyllobacterium e Azorhizobium que são bactérias
fixadoras de nitrogênio (HOLT et al., 1994, KERSTERS; DE
LEY, 1984). No gênero Agrobacterium (do grego agros =
campo e bakterion = bastonete), estão descritas, além de
Agrobacterium tumefaciens, que causa a doença
conhecida como galha-da-coroa (crown-gall), outras
quatro espécies, que diferem entre si pela sintomatologia
e especificidade de hospedeiro, quais sejam: a) A.
rhizogenes (Riker) Conn., que provoca a síndrome da raiz
em cabeleira (do inglês hairy root); b) A. rubi (Hildebrand)
Starr & Weiss, que induz tumores em Rubus spp.; c) A.
vitis Ophel e Kerr, que induz tumores em Vitis spp.; d) A.
radiobacter (Beijejerinck & van Delden) Conn., que são
bactérias saprófitas, não patogênicas.
Além da classificação baseada em sua fitopatogenicidade,
as espécies de Agrobacterium estão subdivididas em pelo
menos três biovares, de acordo com suas características
bioquímicas, fisiológicas e nutricionais, determinadas
pelos genes cromossomais (ANDRADE et al., 2003).
Entretanto, a divisão em biovares nem sempre é possível,
uma vez que várias linhagens apresentam características
intermediárias. Dessa forma, nos últimos anos, a
classificação das agrobactérias vem sofrendo uma série
de críticas e tem recebido sugestões de alterações, de
modo que a taxonomia do gênero Agrobacterium continua
ainda controvertida (BERIAM et al., 1996; HOLT et al.,
1994; KERSTERS; DE LEY, 1984). Além do mais, o recente
sequenciamento completo dos plasmídios Ti e Ri mostrou
que eles são altamente conservados, mesmo entre
espécies diferentes, o que pode ser o ponto de partida
para uma reclassificação do gênero (MORIGUCHI et al.,
2001; SUZUKI et al., 2000; WOOD et al., 2001; ZHU et al.,
2000).
Ocorrência da doença
As agrobactérias encontram-se distribuídas em todo
mundo, em solos cultivados ou não, e, mais
especificamente, na rizosfera das plantas contaminadas.
Nestas últimas, são encontradas nas galhas, nas raízes ou
no solo adjacente. As agrobactérias patogênicas ocorrem
com maior frequência em regiões de clima frio. Essa
preferência, provavelmente, está ligada à sensibilidade
que elas têm a altas temperaturas, e à sensibilidade
térmica do processo de infecção (LIPPINCOTT et al., 1981).
Mesmo em solos com elevada incidência da galha-da-
coroa, os isolados de A. radiobacter (não patogênicos) são
de 10 a 100 vezes mais numerosos que os das outras
espécies patogênicas (KRIMI et al., 2002).
Mais de 600 espécies vegetais são conhecidamente sus‐
ceptíveis à infecção por A. tumefaciens e A. rhizogenes. A
maioria delas pertence à classe das angiospermas
dicotiledôneas (>60%) e das gymnospermas, e, mais
raramente, às angiospermas monocotiledôneas (DE
CLEENE; DE LEY, 1976; ESCOBAR; DANDEKAR, 2003). Na
Europa, a doença conhecida como galha-da-coroa
provocada por espécies de Agrobacterium fitopatogênicas
é conhecida desde a Antiguidade, quando foi
primeiramente observada em videiras por Aristóteles e
por seu estudante Teofrasto. Embora sua incidência seja
baixa, a galha-da-coroa pode tomar proporções
devastadoras em certas culturas, principalmente em
países temperados, o que conduz à perda quase total da
produção, em particular para algumas espécies
ornamentais, frutíferas e florestais, que são propagadas
vegetativamente.
No Brasil, os primeiros relatos sobre doenças causadas
por espécies de Agrobacterium surgiram na década de
1930 em pessegueiro. Posteriormente, a galha-da-coroa
foi relatada em várias outras espécies, como castanheira,
videira, ameixeira, alface, chuchu, mandioca, entre outras
(BARROS et al., 2004; BERIAM et al., 1996; GOMES et al.,
1998). Em Minas Gerais, a galha-da-roseira surgiu
primeiramente em algumas propriedades. Posteriormente,
as práticas agronômicas adotadas para essa cultura,
como a propagação vegetativa e a enxertia, contribuíram
para uma rápida disseminação do patógeno (ROMEIRO,
1995).
Além de plantas, Agrobacterium pode transformar, em
condições de laboratório, uma vasta gama de organismos
eucarióticos, desde fungos filamentosos, levedura,
cogumelos cultivados a ouriços-do-mar e células humanas
(BULGAKOV et al., 2006; LACROIX et al., 2006b). Essas
descobertas abriram a possibilidade de utilização de
Agrobacterium como um vetor universal de transformação
genética que pode ser explorado como uma nova
ferramenta biotecnológica para a engenharia genética de
todos os organismos eucarióticos.
Biologia do processo infeccioso

A atração
No início do processo de infecção de uma planta por
Agrobacterium (Figura 1A), ocorre o reconhecimento e a
penetração da bactéria no tecido vegetal lesado, em
decorrência de ferimentos superficiais causados por
insetos, geadas ou tratos culturais. As bactérias são
atraídas em direção ao tecido vegetal por quimiotactismo
positivo em relação às moléculas-sinal, que são
exsudadas pelas células presentes no local da lesão, como
uma resposta inespecífica de defesa (TZFIRA; CITOVSKY,
2000). Essas moléculas-sinal são essencialmente
compostos fenólicos, monossacarídeos, aminoácidos e
prótons. A liberação de íons H+ (prótons) nos espaços
intercelulares culmina com o abaixamento do pH no local
do ferimento, condição que favorece o processo
infeccioso.
As agrobactérias se fixam à célula vegetal em uma etapa
inicial da formação do tumor, em virtude de um
reconhecimento específico entre o isolado de
Agrobacterium e a espécie vegetal hospedeira. Assim,
uma vez em contato com as células vegetais, as bactérias
sintetizam microfilamentos de celulose que estabilizam a
ligação inicial e propiciam uma melhor fixação entre a
bactéria e a célula hospedeira (MATTHYSSE et al., 2000).
Os genes envolvidos na interação agrobactéria-célula
vegetal estão localizados no cromossomo da agrobactéria
e incluem chvA, chvB, pscA, att, chvD, chvE, miaA, ros,
chvG, chvI e acvB (GELVIN, 2000; ZUPAN; ZAMBRYSKI,
1995).
Figura 1. A) Esquema do processo natural de infecção de uma

planta por Agrobacterium tumefaciens. As bactérias presentes no
solo são atraídas por moléculas-sinal, liberadas pela planta após um
ferimento. (B) Os genes vir, presentes no plasmídio Ti das bactérias
patogênicas, são então induzidos, iniciando assim a síntese de uma
cópia da região-T em forma de fita simples (fita-T), que, com a
proteção de sua extremidade 5’ pela proteína VirD2, é liberada do
plasmídio, formando o complexo-T imaturo. (C) Esse complexo
atravessa o sistema secretório, composto pelo canal VirB/VirD4, para
chegar ao citoplasma da célula vegetal. (D) Uma vez no citoplasma, o
complexo-T maduro é formado pela associação com a proteína VirE2
e se integra de maneira estável ao genoma nuclear da célula
hospedeira, na qual genes presentes no T-DNA serão então
expressos, sintetizando opinas e hormônios vegetais (citocininas e
auxinas). A ocorrência da galha-da-coroa é o resultado do
desequilíbrio hormonal provocado pela síntese desses hormônios nas
células transformadas.
Ilustração: Francisco J. L. Aragão e Ana C. M. Brasileiro.
Os filamentos de celulose formados permitem a formação

de agregados de células bacterianas em volta das células
vegetais próximas ao tecido ferido. Acredita-se que
existam receptores específicos para Agrobacterium na
superfície da célula da planta, já que um número finito de
agrobactérias é capaz de se ligar a essas células (GELVIN,
2000; MATTHYSSE; MCMAHAN, 1998). Alguns potenciais
receptores de Agrobacterium e algumas proteínas da
planta hospedeira, importantes para a fixação bactéria-
célula, já foram identificados, tais como os receptores tipo
vitronectina ou de ligação à ricadesina, além de diversas
proteínas vegetais que interagem com as proteínas
bacterianas (CITOVSKY et al., 2007). Recentemente,
demonstrou-se que a infecção por Agrobacterium ativa a
expressão de vários genes de defesa da planta, como, por
exemplo, a via de sinalização MAPK (mitogen-activated
protein kinase), durante os estágios iniciais do processo
infeccioso (DAFNY-YELIN et al., 2008). Essas proteínas de
defesa serão utilizadas pela bactéria para auxiliar o seu
processo de transformação genética, em um belo exemplo
de utilização abusiva de desvio do sistema biológico de
defesa vegetal a seu favor. Quando não mais necessários,
nos estágios mais avançados da infecção (formação do
tumor), esses genes de defesa terão sua expressão
reprimida pela bactéria.
O plasmídio Ti
Uma vez que a ligação inicial bactéria-planta esteja
estabilizada, as moléculas-sinal sintetizadas em resposta
ao ferimento da planta vão ativar a expressão de genes
de virulência que estão localizados em um plasmídio de
alto peso molecular (200 kb a 800 kb), conhecido como
plasmídio Ti (do inglês tumor-inducing). Em determinadas
linhagens, o plasmídio Ti pode representar 50% do
genoma (ALLARDET-SERVENT et al., 1993). Esse plasmídio
está presente somente em linhagens patogênicas de
Agrobacterium, em um baixo número de cópias, e de
poder ser transferido, via conjugação, para outras
bactérias (VAN LAREBEKE et al., 1974; WATSON et al.,
1975).
Duas importantes regiões funcionais no plasmídio Ti, que
estão envolvidas diretamente no processo de indução
tumoral, foram identificadas: a região-T, que corresponde
ao segmento de DNA transferido para a célula vegetal, e a
região de virulência, ou região vir, que contém genes que
codificam enzimas responsáveis pela excisão e
transferência da região-T (STACHEL; NESTER, 1986; VAN
LAREBEKE et al., 1974).
O plasmídio Ti possui, além da região-T e da região vir,
outras três regiões funcionais que não estão diretamente
envolvidas com o processo de indução tumoral. Essas
regiões são conhecidas como: a) região de transferência
conjugativa (loci tra e trb), responsável pela transferência
conjugativa do plasmídio Ti entre linhagens de
Agrobacterium spp. ou para outras bactérias Gram-
negativas; b) região de absorção e catabolismo de opinas
(região opc), envolvida na síntese de mais de 40 enzimas
específicas responsáveis pela absorção das opinas para
dentro da célula e pelo seu posterior catabolismo pela
bactéria; c) região de replicação (região rep), que é
necessária para a replicação e para as funções ligadas à
manutenção do plasmídio Ti dentro da bactéria
(estabilidade), ao controle do número de cópias durante a
divisão celular e à incompatibilidade entre bactérias. A
maioria dessas regiões é conservada entre os diferentes
tipos de plasmídio Ti, principalmente aquelas perten‐
centes à mesma classe de opina.
Essas cinco regiões cobrem aproximadamente dois terços
do plasmídio Ti. No restante, identificaram-se outros
genes ligados à determinação do espectro de hospedeiro,
aos genes reguladores (repressores, antagonistas,
ativadores, etc.) da expressão de outros genes do
plasmídio Ti e às outras funções ainda desconhecidas, as
quais, aparentemente, não estão diretamente envolvidas
na formação de tumores (ZHU et al., 2000).
A ativação do regulon vir

A região vir, que é ativada pelas moléculas-sinal durante a
ligação Agrobacterium-hospedeiro, é formada por um
conjunto de seis ou mais operons (conhecido como
regulon vir), que contém 34 genes conhecidos. Os
operons da região vir são corregulados por duas proteínas
da própria região vir (VirA e VirG), que são induzidas, de
maneira coordenada, em resposta a estímulos químicos
(moléculas-sinal). Isso significa que, após o
reconhecimento extracelular, o sinal químico é convertido
em uma reposta intracelular (MCCULLEN; BINNS, 2006).
As proteínas VirA e VirG pertencem a uma classe de
proteínas conhecidas como two-component regulatory
system. Em tal sistema, a proteína VirA funciona como
uma proteína sensora, enquanto a proteína VirG age como
um ativador transcricional por ligar-se a regiões
promotoras dos operons vir, iniciando assim o processo de
transferência da região-T (HOOYKAAS; BEIJERSBERGEN,
1994; WINANS et al., 1994). Na presença das moléculas-
sinal, a proteína VirA – uma histidina quinase presente na
membrana da bactéria – vai se autofosforilar e,
subsequentemente, transfosforilar a proteína VirG,
localizada no citoplasma bacteriano. Uma vez fosforilada,
a proteína VirG passa de sua forma inativa para uma
forma ativa. Assim, além da sua própria transcrição, ativa
a dos demais operons vir (HOOYKAAS; BEIJERSBERGEN,
1994; WINANS et al., 1994). Essa proteína interage com a
região vir box, uma sequência específica e altamente
conservada de 12 pb, presente na região promotora de
cada operon vir, o que permite uma regulação e uma
expressão coordenada desses genes (JIN et al., 1990).
Uma vez que todos os genes da região vir forem ativados,
inicia-se o processo de transferência da região-T para a
célula vegetal.
A síntese da fita-T
A região-T é definida e delimitada por duas sequências
repetidas de 23 pb, conhecidas como extremidades direita
e esquerda. O processo de reconhecimento, de clivagem e
de transferência da região-T inicia-se graças à atividade
dos operons virD e virC, que reconhecem e clivam dentro
desses 23 pb que delimitam a região-T.
As proteínas VirD1 e VirD2 parecem atuar em duas etapas
no processo de corte da região-T (Figura 1B). Assim, VirD1
poderia reconhecer as extremidades da região-T e, ao
mesmo tempo, converter o DNA para a forma relaxada,
por meio de sua atividade topoisomerase. Isso expõe as
sequências específicas de clivagem para a proteína VirD2,
uma proteína com atividade endonucleásica, que também
reconhece, especificamente, os 23 pb de cada
extremidade da região-T (YANOSFSKY et al., 1986).
Após a clivagem, a proteína VirD2 mantém-se
covalentemente ligada à extremidade 5’ da região-T
(HERRERA; ESTRELA et al., 1988; PANSEGRAU et al.,
1993), enquanto uma segunda clivagem ocorre na
extremidade 3’ esquerda, o que leva a liberação da fita
inferior da região-T. Durante essa liberação, uma cópia da
fita é sintetizada a partir da extremidade direita, na
direção 5’→ 3’, utilizando-se a fita de DNA superior da
região-T como molde, o que mantém assim a fita superior
em forma duplex. A síntese da fita inferior continua até
atingir o sítio de clivagem da extremidade 3’ esquerda. A
molécula de DNA linear, fita simples, gerada a partir do
deslocamento da fita inferior da região-T foi denominada
de fita-T. Dessa forma, o deslocamento da fita-T ocorre na
direção 5’ → 3’ da fita inferior da região-T, iniciando na
extremidade direita e terminando na extremidade
esquerda, o que indica a existência de polaridade no
processamento da fita-T (ZAMBRYSKI et al., 1989).
As proteínas VirC1 e VirC2, codificadas pelo operon VirC,
ligam-se a uma sequência conservada, localizada próxima
à extremidade direita, denominada overdrive (ou região
ode). Acredita-se que essa ligação favoreça a correta
orientação do complexo proteico VirD1/VirD2 para o
reconhecimento dos sítios de clivagem, e, dessa forma,
aumenta a eficiência no processo de clivagem e de
transferência da fita-T (TORO et al., 1989). Várias outras
enzimas, como helicases, polimerases e enzimas de
reparo, são também necessárias para a produção da fita-T
e são codificadas, provavelmente, por genes do
cromossomo bacteriano (ZAMBRYSKI, 1992).
O movimento intercelular do
complexo-T
Após sua formação, a fita-T deixa a célula bacteriana,
penetra na célula vegetal e integra-se ao DNA nuclear da
planta (Figura 1C). Para isso, a fita-T precisa atravessar a
membrana interna bacteriana, seu periplasma e a
membrana externa bacteriana. Supõe-se que a fita-T é
transportada da bactéria para a célula vegetal, como um
complexo nucleoproteico conhecido como complexo-T
imaturo, que é formado pela fita-T protegida na
extremidade 5’ pela VirD2 (CITOVSKY et al., 1989).
O transporte do complexo-T da agrobactéria para o
citoplasma da célula vegetal indica a necessidade de se
formar uma estrutura funcionalmente similar a um pilus,
ou poro celular, e ocorreria por meio da interação das
proteínas do operon virB com o complexo-T (WARD et al.,
1988; ZUPAN et al., 1998). O operon virB contém 11
genes, e a maioria das proteínas VirB está localizada nas
membranas interna e externa da bactéria, além de estar
diretamente ligada à formação do canal VirB ou ao
fornecimento de energia (atividade ATPase), que é
necessária tanto para a formação do canal VirB quanto
para o processo de exportação das moléculas (CASCALES;
CHRISTIE, 2004; MCCULLEN; BINNS, 2006).
A proteína VirD4, uma proteína ancorada na membrana
interna da bactéria, seria o produto que intermediaria a
ligação do complexo-T ao canal VirB, auxiliando na
translocação entre a bactéria e a célula hospedeira. O
complexo proteico formado por VirB e VirD4, associado às
membranas da bactéria, vai permitir a translocação do
complexo-T imaturo para o citoplasma da célula vegetal
por meio de um sistema secretório do tipo IV (T4SS)
(CHRISTIE, 2004). As proteínas VirB2, VirB5 e,
provavelmente, VirB7 formam o pilus-T, que é um
filamento extracelular que intermedeia a ligação do canal
VirB/VirD4 à parede (ou membrana) da célula vegetal
(MCCULLEN; BINNS, 2006).
Além do complexo-T imaturo, o canal VirB/VirD4 é
responsável pelo transporte de outras proteínas Vir, como
VirE2, VirE3, VirF e VirD5, que são exportadas de forma
independente para a célula vegetal (VERGUNST et al.,
2005). Essas proteínas efetoras participam também do
processo celular necessário tanto para a infecção quanto
para a transformação genética por Agrobacterium, mas
sua verdadeira função ainda não está completamente
desvendada.
Sabe-se que, uma vez no citoplasma, a maturação do
complexo-T é finalizada por sua associação com as
proteínas efetoras exportadas pela bactéria, em particular
com VirE2 (GELVIN, 2003). A proteína VirE2 é uma Single
Strand Binding (SSB) Protein e liga-se covalentemente e
de maneira não específica à fita-T (CHRISTIE et al., 1988;
GIETL et al., 1987). Por ocorrer com certa abundância e
por apresentar alta afinidade com DNA fita simples,
sugere-se que a ligação da proteína VirE2 à fita inferior do
T-DNA, além de evitar o seu dobramento, poderia protegê-
la da degradação de nucleases durante seu transporte
através dos poros nucleares (CITOVOSKY et al., 1989).
O movimento intracelular do complexo-

T
Uma vez superada a membrana da agrobactéria, a
segunda etapa da transferência do complexo-T é
atravessar os espaços intercelulares, a parede celular e a
membrana plasmática vegetal até o nucleoplasma. É
provável que existam receptores na membrana celular
vegetal que auxiliem na entrada do complexo-T no
citoplasma da célula vegetal, que é feito de forma ativa
(CITOVSKY; ZAMBRYSKI, 1993; HOWARD et al., 1992). Essa
ativação é mediada por uma sequência-sinal de
localização nuclear (NLS), presente na própria molécula a
ser transportada, ou em moléculas associadas a ela.
Como a fita-T não possui seus próprios sinais de
direcionamento, sua importação para o núcleo da célula
vegetal é, provavelmente, mediada pelas proteínas da
agrobactéria que a acompanham nessa odisseia, tais
como as proteínas VirD2 e VirE2 (ZIEMIENOWICZ et al.,
2001).
Continuando seu caminho, o complexo-T deve viajar
dentro do citoplasma para atingir o núcleo da célula
hospedeira. A densa estrutura do citoplasma – composta
por microtúbulos encruzilhados, pela actina e pela rede de
filamentos intermediários – impede a difusão Brownian de
macromoléculas, o que indica um mecanismo ativo de
transporte intracelular do complexo-T (TZFIRA, 2006). O
grande tamanho do complexo-T (estimado em 50 kD) e a
sua estrutura solenoidal (do tipo fio de telefone) reforçam
a hipótese do envolvimento de proteínas motoras
associadas aos microtúbulos durante seu transporte
intracitoplasmático (ABU-ARISH et al., 2004; SUH et al.,
2003).
Enquanto muitas proteínas de Agrobacterium envolvidas
no processo de transferência do complexo-T já foram
caracterizadas, pouco se conhece sobre os fatores
celulares vegetais que participam desse processo. Tanto
as proteínas vegetais pertencentes às famílias das
carioferinas e das cicloferinas quanto as importinas e as
proteínas VIP (VirE-interacting protein) podem atuar como
mediadoras e protetoras do transporte do complexo-T
(GELVIN, 2003).
Várias evidências dão suporte à hipótese de que há uma
relação evolucionária comum entre a transferência de
DNA para plantas, mediada por Agrobacterium, e a
transferência conjugativa de plasmídios entre bactérias.
Entre os processos comuns dos dois sistemas, encontram-
se o contato célula-célula, o início de transferência de
DNA e o transporte através das membranas. Essas
semelhanças incluem proteínas com sequências de
aminoácidos similares e/ou equivalência de funções,
organização gênica e propriedades físicas das enzimas
envolvidas, além de sugerir que o aparato de
transferência do complexo-T tenha evoluído de um
sistema de transferência conjugativa (ZHU et al., 2000).
A integração da fita-T no genoma

da planta
A última etapa no processo de importação e de
transferência da fita-T culmina em sua integração no
genoma nuclear da célula hospedeira (Figura 1D).
Entretanto, os mecanismos moleculares envolvidos nas
etapas de passagem pela membrana nuclear, de
transporte intranuclear e de direcionamento para a
cromatina ainda são poucos conhecidos. O diâmetro do
complexo-T (aproximadamente 15 nm) excede o tamanho
limite do complexo do poro nuclear, ou Nuclear Pore
Complex (NPC), de aproximadamente 9 nm, indicando que
o complexo-T entra no núcleo por um mecanismo ativo,
mediado pela maquinaria de importação nuclear da célula
hospedeira, que envolve também as proteínas VirD2,
VirE2 e VirE3 (CITOVSKY et al., 2006).
Sabe-se que pelo menos parte da fita-T deve estar
“descoberta” das suas proteínas acompanhantes (VirE2 e
VirD2) para que possa se expor à maquinaria de reparo de
DNA (proteólises) da célula hospedeira. Recentemente,
propôs-se o envolvimento de VirF, uma das proteínas
efetoras, na remoção da proteína VirE2 do complexo-T
(TZFIRA et al., 2004b). Essa maquinaria irá então
completar a fita-T em forma dupla para, dessa forma, ser
integrada ao genoma nuclear. Outra etapa importante é o
direcionamento do complexo-T para o local da sua futura
integração na cromatina da célula hospedeira. Esse
processo envolve tanto proteínas associadas à cromatina
quanto enzimas de modificação de histonas (LACROIX et
al., 2006a).
Diferentemente de outros elementos móveis, como trans‐
posons e retrovírus, a fita-T não codifica nenhuma
proteína requerida para sua integração. Dessa forma, a
integração da fita-T no genoma da planta pode ser
mediada pelas proteínas VirD2 e VirE2, em combinação
com vários fatores e mecanismos moleculares da própria
célula hospedeira (TZFIRA et al., 2000, 2004a). Os fatores
da planta são necessários para a complementação da
molécula de fita-T para DNA dupla fita (dsDNA), para a
produção de quebras no genoma do hospedeiro e para a
ligação da molécula do T-DNA nessas quebras.
Estudos realizados em plantas transgênicas de
Arabidopsis indicam que os sítios de integração da fita-T
ocorrem geralmente dentro das regiões
transcricionalmente ativas do genoma e de
descondensação da cromatina; entretanto, não há nessas
regiões uma preferência por cromossomo ou sequência
(LACROIX et al., 2006a). A integração da fita-T geralmente
ocorre em quebras da fita dupla, ou double strand breaks
(DSBs), no DNA do genoma eucariota, e isso se dá por
dois caminhos: via recombinação ilegítima ou não
homóloga (NHR) ou via recombinação homóloga (HR), que
necessita homologia entre o DNA integrante e o DNA-alvo.
No sistema NHR, o DNA integrante está geralmente em
forma de fita dupla, e sua integração envolve enzimas de
junção de pontas não homólogas, também chamadas de
nonhomologous end-joining (NHEJ). Por sua vez, o sistema
HR necessita de um DNA integrante que esteja, pelo
menos parcialmente, em forma de fita simples e,
geralmente, envolve um mecanismo de reparo de lacuna
de fita simples, ou single-strand gap repair (SSGR)
(LACROIX et al., 2006a).
Em qualquer dos casos, a integração das extremidades 5’
e 3’ parece ser assistida pela maquinaria da planta. Dessa
forma, a maquinaria de replicação do DNA e as enzimas
de reparo da planta são as prováveis candidatas para
auxiliar na integração da fita-T no genoma vegetal.
A expressão dos genes do T-DNA

Uma vez transferida para o genoma da célula vegetal e
integrada a ele, a fita-T passa a ser denominada T-DNA
(para DNA transferido). Essa integração é estável, e o T-
DNA é transmitido para as células-filhas após a divisão
mitótica e durante a meiose e a singamia. Os genes
presentes no T-DNA, embora apresentem origem
procariota, possuem sequências regulatórias que são
reconhecidas pelo sistema eucarioto vegetal, o qual
permite sua expressão após a integração. Um grupo
desses genes, também conhecidos como oncogenes,
codifica a síntese de enzimas envolvidas não somente na
via de biossíntese de hormônios vegetais (auxinas e
citocininas), mas também na regulação do balanço
auxina/citocinina. A expressão desses genes causa um
desequilíbrio hormonal nas células transformadas, e isso
resulta na sua proliferação desordenada, o que leva à
formação de tumores nos sítios infectados da planta
(ANDRADE et al., 2003; ZUPAN et al., 2000). Dessa forma,
a produção endógena de hormônios pelas células
transformadas explica por que esses tumores, uma vez
isolados da planta, são capazes de crescer
indefinidamente em meio de cultura, mesmo na ausência
de reguladores de crescimento (HOOYKAAS;
SCHILPEROORT, 1992).
Outros genes presentes na região-T codificam enzimas
envolvidas na via da biossíntese de opinas, que são
compostos formados pela condensação de aminoácidos
ou de carboidratos modificados. As opinas produzidas nos
tumores (células transformadas) são secretadas nas
regiões intercelulares do tumor e metabolizadas
especificamente pela linhagem de Agrobacterium indutora
do tumor (PETIT et al., 1983). As opinas sintetizadas
servem como fonte de carbono e de nitrogênio para
linhagem de Agrobacterium infectante, e, dessa forma,
criam um nicho favorável para o desenvolvimento da
bactéria (DESSAUX et al., 1993). As opinas também
estimulam a transferência conjugativa do plasmídio Ti
para linhagens de Agrobacterium não patogênicas, isto é,
sem o plasmídio Ti, o que aumenta a população de
Agrobacterium que utiliza essas opinas como fonte de
carbono. Até hoje, mais de 20 tipos diferentes de opinas já
foram identificadas. Assim, as linhagens de Agrobacterium
podem ser classificadas de acordo com o tipo de opina
sintetizada pelo seu T-DNA, como octopina, nopalina,
agropina, succimanopina, cucumopina, etc. (DESSAUX et
al., 1993).
Como resultado do processo infeccioso, a linhagem de
Agrobacterium indutora da galha faz a célula vegetal
parasitada produzir um tipo específico de opina. Somente
a linhagem indutora é capaz de catabolizar essa opina
como fonte de energia, de carbono e de nitrogênio. Dessa
forma, as células transformadas pelo T-DNA continuam
dividindo-se incontroladamente em virtude da produção
de citocininas e de auxinas e, quanto mais elas se
dividem, mais elas produzem opinas que, por serem
utilizadas pela bactéria, formam um nicho extremamente
favorável a ela.
Essa pressão seletiva favorece a multiplicação da
linhagem indutora da galha que, por sua vez, irá infectar
de novo as células vegetais que ainda não foram
transformadas. A síntese de opinas pelas células vegetais
infectadas e seu catabolismo pela bactéria indutora da
galha tiveram provavelmente um papel muito importante
na disseminação do plasmídio Ti na natureza. A teoria que
propõe a atuação das opinas como intermediárias
químicas do parasitismo é conhecida como o “conceito de
opinas” (DESSAUX et al., 1993).
O sistema de infecção de plantas pelas agrobactérias
representa, assim, uma situação única na natureza: a
transferência de um elemento genético, o T-DNA, de um
organismo procariota para um organismo eucariota
superior, com sua subsequente integração e expressão no
genoma hospedeiro. A demonstração de que a causa da
proliferação celular da galha é a transferência de
informação genética da bactéria para a célula vegetal
(CHILTON et al., 1977) foi o ponto de partida para
pesquisas intensivas visando à utilização desse sistema
natural de transferência de genes para a obtenção de
plantas transgênicas (ZAMBRYSKI, 1992).
Agrobacterium como vetor de

transformação de plantas
O conhecimento dos mecanismos moleculares e celulares
envolvidos no processo de infecção de uma planta
hospedeira por Agrobacterium permitiu a utilização dessa
bactéria como vetor natural de transformação genética de
plantas. O ponto de partida para pesquisas intensivas
nessa área foi a demonstração de que nenhum gene
presente na região-T, exceto os 23 pb de suas
extremidades, é necessário ao processo de transferência
e de integração da fita-T
no genoma da planta infectada (HOEKEMA et al., 1983;
ZAMBRYSKI et al., 1983). Assim, os genes presentes na
região-T podem ser eliminados e substituídos por genes
de interesse, com sinais para expressão e regulação em
plantas, sem que isso afete o processo de transferência.
Além das extremidades da região-T, a região vir do
plasmídio Ti é fundamental para o processo de
transferência. Entretanto, a remoção dos oncogenes do T-
DNA faz-se necessária, pois a expressão desses genes
interfere no balanço hormonal de auxinas e de citocininas
nas células transformadas e induz sua multiplicação
descontrolada. Por esse motivo, as células transformadas
pelo T-DNA selvagem não são capazes de regenerar
plantas normais. Uma linhagem de Agrobacterium, cujos
oncogenes foram removidos do seu plasmídio Ti, é
denominada “linhagem desarmada”, pois não é mais
capaz de induzir a formação de galhas em plantas.
Concluiu-se então que o desenvolvimento de vetores
baseados no sistema Agrobacterium requer que se
conservem as extremidades direita e esquerda da região-
T, mantendo também intacta a região vir, e que se
removam os oncogenes. Dessa maneira, qualquer outra
nova sequência de DNA, inserida entre as extremidades
da região-T, pode ser transferida e integrada no genoma
vegetal, sem afetar a regeneração da célula transformada
em uma planta.
Após a obtenção da linhagem desarmada de
Agrobacterium, a próxima etapa é a clonagem na região-T
do gene (ou dos genes) a ser transferido para a planta.
Entretanto, o grande tamanho do plasmídio Ti
(aproximadamente 200 kb) dificulta sua manipulação.
Assim, o sistema binário foi desenvolvido para que os
genes presentes na região vir do plasmídio Ti funcionem
in trans para processar e transferir a região-T (HOEKEMA
et al., 1983). A região-T, que contém os genes de
interesse entre suas extremidades, deverá estar clonada
em pequenos plasmídios (de 10 kb a 30 kb), denominados
vetores binários. Esses vetores são capazes de replicar-se
de maneira autônoma tanto em Escherichia coli como em
Agrobacterium (BRASILEIRO; CARNEIRO, 1998).
Sistema de transformação via
Agrobacterium
A partir do desenvolvimento de vetores binários e de sua
introdução em linhagens desarmadas de Agrobacterium
(Figura 2), foi possível a transferência de genes exógenos
para plantas, por meio da utilização dessa bactéria como
vetor natural de transformação. Os primeiros estudos de
transformação genética de plantas envolveram a
inoculação de tecidos de fumo (Nicotiana tabacum) com
linhagens engenheiradas de Agrobacterium (HERRERA
ESTRELLA et al., 1983; ZAMBRYSKI et al., 1983). A partir
de então, o sistema de transformação via Agrobacterium
vem sendo utilizado para transformar um grande número
de plantas. A alta eficiência de transformação, o baixo
custo operacional, assim como a simplicidade dos
protocolos de transformação e de seleção, são as
principais razões para a universalidade do uso do sistema
Agrobacterium (BRASILEIRO; LACORTE, 2000; TZFIRA;
CITOVSKY, 2006).
Atualmente, diversas características de interesse
socioeconômico já foram introduzidas em diferentes
espécies vegetais por transformação genética,
principalmente por intermédio do sistema Agrobacterium
e do método biobalístico (BRASILEIRO, 2001; BRASILEIRO;
CANÇADO, 2000; GUIMARÃES et al., 2003). Essas
características visam principalmente ao melhoramento do
desempenho em campo das plantas cultivadas, por meio
da resistência a estresses bióticos e abióticos.
Características relacionadas ao desenvolvimento da
planta e à qualidade do produto também podem ser
modificadas em plantas transgênicas. A tendência é que
cada vez um maior número de características possa ser
manipulado via engenharia genética, de forma que haja
um aumento da gama de produtos a serem
disponibilizados para o agricultor e para o consumidor. Em
um futuro breve, as plantas transgênicas desempenharão
também o papel de biofábricas, e serão desenvolvidas
para a produção de produtos de interesse por parte das
indústrias de medicamentos, de alimentos e de rações.
Figura 2. Esquema geral das etapas da transformação de plantas

por cocultura com uma linhagem desarmada de Agrobacterium.
Ilustração: Rodolfo Bezerra Batista.
Além de todas as implicações para a agricultura e para
outros setores da economia, as plantas transgênicas
constituem também um excelente sistema para estudos
básicos em diferentes campos da biologia, como fisiologia,
genética, botânica, biologia molecular e celular.
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Notas
Capítulo 1
1 Foot-candle = 10,7 lux.
Capítulo 3
1 Don Durzan em comunicação pessoal.
Capítulo 5
1 Um método para detectar fragmentação de DNA em
consequência de apoptose.
Capítulo 7
1 Unidade encapsulável é qualquer tipo de explante,
embriogênico ou não, que apresente tamanho reduzido
(até 7 mm) e tenha a capacidade de manter a viabilidade
e converter-se em planta normal, sob condições
adequadas, mesmo depois de ter sido encapsulado por
meio de uma matriz de encapsulamento. São exemplos de
unidades encapsuláveis: embriões somáticos, embriões
zigóticos, ápices caulinares, brotos, gemas axilares
(microestacas), células em suspensão, etc.
2 Endosperma artificial é uma matriz de encapsulamento
biodegradável, constituída pela mistura de um agente
geleificante (alginato de sódio) dissolvido em água ou que
contenha elementos minerais, fonte(s) de carbono,
vitaminas, aminoácidos e/ou reguladores de crescimento,
entre outros elementos necessários à correta manutenção
da viabilidade do material vegetal encapsulado
(STANDARDI; PICCIONI, 1998; MALABADI; STADEN, 2005),
o que irá depender do tipo de explante e da espécie
vegetal utilizada.
3 Esta fase consiste na formação propriamente dita das
sementes sintéticas e decorre da troca iônica dos íons
sódio (Na+) pelos íons cálcio (Ca2+), resultando na
produção de cápsulas firmes e isodiamétricas, as quais
são insolúveis, exceto na presença de nitrato de potássio
(KNO3) (NAIK; CHAND, 2006).
4 Consiste na utilização de uma solução de nitrato de

potássio (KNO3), com o objetivo de enfraquecer a cápsula
de hidrogel, favorecendo assim, o rompimento da cápsula
pelo explante. Tal enfraquecimento decorre do fato de que
os íons potássio (K+) do nitrato de potássio substituem os
íons cálcio (Ca2+), e com isso há um “amolecimento” da
cápsula (ONISHI et al., 1994).
5 Existem também trabalhos que não recomendam essas
lavagens, alegando possíveis perdas de certas
substâncias vitais.
6 Fase que objetiva induzir ou modificar a tolerância dos
explantes à desidratação.
7 Tem a vantagem de ser mais preciso e reproduzir taxas
de dessecação (WITHERS; ENGELMANN, 1998).
8 Nesta fase, podem ser necessárias condições
ambientais específicas, além da adição de reguladores de
crescimento no meio de cultura, ou, ainda, de
tratamentos que promovam rompimento das cápsulas, ou
mesmo a retirada dos explantes destas. Ademais, o ideal
é que o restabelecimento dos explantes ocorra sem a
intervenção da fase de calos (WITHERS; ENGELMANN,
1998).
9 A sigla significa Plant Vitrification Solution. A mais
comumente empregada é derivada da solução proposta
por Sakai et al. (1990), que consiste de glicerol (22% w/v),
etileno glicol (15% w/v), propileno glicol (15% w/v), DMSO
(7% w/v) e sorbitol (0,5 M).

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