ELISA

ELISA utføres gjennom fire trinn:

1. Påføring av belegg: Antigenene blir festet til overflaten av brønnene.
2. Blokkering av mikroplaten: For å dekke over alle ubrukte potensielle bindingsseter på platen tilsettes et protein som ikke reagerer med andre stoffer i analysen.
3. Deteksjon: Det tilsettes antistoffer som kan bindes spesifikt til antigenene som er festet til overflaten av brønnene.
4. Signalmåling: Måling av signalet som blir sendt ut når et antistoff bindes til et antigen. Signalet stammer fra fargestoffet (substratet) som reagerer med enzymet som igjen er festet til det spesifikke antistoffet.

ELISA er en svært spesifikk og sensitiv analysemetode. At metoden er spesifikk (høy spesifisitet) betyr at den med høy grad av presisjon kan si at et stoff er til stede. Hvis stoffet ikke er til stede, vil den ikke gi utslag. Spesifisiteten kommer av antistoffenes evne til å gjenkjenne og binde kun én type antigen.

At metoden er sensitiv betyr at metoden med høy grad av presisjon kan si at en prøve er fri for substansen man måler hvis stoffet ikke er til stede. Sensitiviteten kommer av at det trengs svært små mengder antistoffer for å detektere ett antigen. Der noen typer immunologiske metoder behøver 6 nanogram antistoffer per milliliter for å detektere antistoffer, kan ELISA brukes til å detektere så små mengder som 0,01 nanogram antigen eller antistoff, og med kun 0,1 nanogram antistoff per milliliter.

Direkte ELISA egner seg blant annet til å påvise immunresponsen etter vaksinering. Dette er nyttig informasjon ved utvikling av vaksiner. Direkte ELISA er den raskeste og enkleste ELISA-metoden. Den er også lite utsatt for feilaktige målinger da den består av få komponenter.

I direkte ELISA er antigenet festet til bunnen av brønnen. Det enzym-koblede antistoffet bindes direkte til antigenet. Antigenet detekteres ved at det bindes spesifikt av et antistoff som er direkte festet til et deteksjonsenzym. For hvert antigen som skal detekteres må det tilsettes et antistoff som kan bindes spesifikt til det aktuelle antigenet.

Direkte ELISA har et enkelt oppsett, men gir et mindre spesifikt resultat enn de andre metodene. Den uspesifikke bindingen fører til at alle proteiner som er til stede i prøven vil feste seg til overflaten av brønnene, ikke kun det proteinet man eventuelt er interessert i å kvantifisere. Det er heller ikke mulig å forsterke signalet da det ikke tilsettes noe sekundært antistoff. Til gjengjeld er metoden mindre sensitiv for forurensning eller krysskontaminering da det brukes færre reagenser.

Indirekte ELISA ble brukt i utviklingen av en ELISA-basert hurtigtest for koronavirus (SARS-CoV-2) for å kontrollere at antistoffene som brukes i testen var spesifikke for SARS-CoV-2-antigener.

Antigenet er også her festet til bunnen av brønnen. Først bindes et primært antistoff til antigenet. Et sekundært enzymkoblet antistoff bindes så til det primære antistoffet. Indirekte ELISA egner seg blant annet til å måle den totale konsentrasjonen av antistoffer i en prøve. Overflaten til brønnene i en mikroplate blir først dekket av et belegg av et spesifikt antistoff. Det fører til at det kun er antigener som kan bindes til det spesifikke antistoffet som vil feste seg på overflaten av brønnene. Når antigenet skal detekteres, gjøres det i to trinn. I det første trinnet bindes det spesifikke antigenet av et umerket antistoff. I det andre trinnet brukes et sekundert antistoff som har et enzym festet til seg. Det sekundære antistoffet reagerer med det primære antistoffet.

Sensitiviteten til indirekte ELISA er større enn for direkte ELISA da flere enn ett merket antistoff kan reagere og bindes til det sekundære antistoffet, og ulike primære antistoffer kan kombineres med ett enkelt sekundært antistoff. Metoden er derimot mer utsatt for bakgrunnsstøy og uspesifikke målinger da det kan oppstå kryssreaksjoner mellom det absorberte antigenet og det sekundære antistoffet. Analysen tar også lengre tid da den består av to trinn.

En hurtigtest for koronavirus ble også utviklet basert på sandwich-ELISA. I sandwich-ELISA er det primær-antistoffet og ikke antigenet som er festet til bunnen av brønnen. Primær-antistoffet binder så antigenet, som igjen blir bundet av et annet primært antistoff med et enzym koblet til. Sandwich-ELISA egner seg til analyse og kvantifisering av proteiner i komplekse prøver.

Metoden er svært sensitiv og spesifikk. I denne metoden brukes det par av antistoffer; ett «fange»-antistoff og ett «deteksjons»-antistoff. Hvert antistoff har en spesifikk bindingsmekanisme til en spesifikk del av overflaten på ett antigen, for eksempel et protein.

For at metoden skal være sensitiv og produsere gode resultater må bindingsmekanismen mellom antistoff–antigen-parene være nøye undersøkt fordi et nøyaktig resultat avhenger av at antigenene og antistoffene bindes til hverandre i korrekt rekkefølge.

Før prøvematerialet kan tilsettes, dekkes overflaten til brønnene i mikroplaten av et belegg med «fange»-antistoff. Prøvematerialet med proteinet som skal undersøkes tilsettes og proteinene fester seg til «fange»-antistoffene. Et «deteksjons»-antistoff bindes så til det immobiliserte proteinet, slik at målproteinet er bundet i en sandwich mellom «fange»-antistoffet og «deteksjons»-antistoffet. Ved binding av substrat til «deteksjons»-antistoff sendes det ut et signal som er direkte proporsjonalt med konsentrasjonen til proteinet som undersøkes.

Kompetitiv ELISA kan brukes til å detektere ekstra små forbindelser eller forbindelser som er utfordrende å detektere, som lipider. Kompetitiv ELISA egner seg blant annet til måling av kolesterol i blodprøver. Her tilsettes antigen en løsning med overskudd av antistoff som bindes spesifikt til dette antigenet. Antigenet bindes til antistoff, og løsningen tilsettes så en mikrobrønnplate.

Kompetitiv ELISA er et alternativ til sandwich-ELISA. Enkelte målproteiner er for små til å bli «fanget» mellom to antistoffer. Kompetitiv ELISA er en mindre spesifikk metode enn sandwich-ELISA da det kun brukes ett antistoff. I denne metoden er det en forstyrrelse av deteksjonssignalet som indikerer konsentrasjonen av et antigen eller antistoff; ett omvendt proporsjonalt signal.

Ved kompetitiv ELISA dekkes først overflatene i en mikroplate med et «fange»-antistoff. Når prøven tilsettes, vil målantigenet bindes av «fange»-antistoffet. Så tilsettes et konjugert antigen som bindes til eventuelle ledige «fange»-antistoff. Jo lavere konsentrasjon av målantigen, jo flere ledige «fange»-antistoff og påfølgende sterkere signal sendes ut ved binding av substrat til det konjugerte antigenet.