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Comunicado 155
Técnico
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ISSN 1676-7675
Dezembro, 2015
Sobral, CE
Metodologia Científica
On-line
Técnica Zimográfica como método para monitoramento da
Artrite Encefalite Caprina (CAE)
Angela Maria Xavier Eloy1
Rosivaldo Quirino Bezerra Júnior2
Raymundo Rizaldo Pinheiro3
Alice Andrioli4
Introdução
As metaloproteinases da matriz (MMPs) são uma
família de endopeptidases cálcio e zinco dependentes,
que promovem a degradação de todo tipo de
proteínas da matriz extracelular (MEC) (Figura
1), a qual determina a forma e as propriedades
mecânicas de tecidos e órgãos, agindo nas proteínas
da superfície das células, podendo também serem
chamadas de matrixinas. As MMPs são produzidas,
principalmente, pelos leucócitos polimorfonucleares,
queratinócitos, monócitos, macrófagos, fibroblastos e
pelas células mesenquimais, sendo secretadas como
proenzimas (NAVARRO et al., 2006).
Figura 1. Esquema das principais moléculas que aparecem na
matriz extracelular (MEC) do tecido conectivo.
Fonte: Adaptado de Atlas of Plant and Animal Histology (2015).
1
As MMPs participam de diversos processos
biológicos, como determinação da arquitetura da
MEC, desenvolvimento embrionário, implantação
do blastocisto, morfogênese dos órgãos,
desenvolvimento do sistema nervoso, ovulação,
dilatação cervical, regressão uterina pós-parto,
desenvolvimento e remodelação do tecido oral,
cicatrização, angiogênese e apoptose (VERMA;
HANSCH, 2007). No entanto, a ativação estimulada
ou crônica das MMPs, seja por vírus, bactéria,
seja por lesão traumática, pode resultar em um
desequilíbrio entre a atividade dessas enzimas
proteolíticas e dos inibidores dos tecidos das
metaloproteinases (TIMPs), com a consequente
ocorrência de alterações patológicas devido a
uma degradação excessiva de componentes da
matriz extracelular ou afins pelas MMPs (Figura 2).
Segundo Skiles et al. (2004), já foram identificadas
pelo menos 24 metaloproteinases (MMPs) em
mamíferos, sendo agrupadas em cinco classes:
colagenases, gelatinases, estromelisinas, MMPs do
tipo membrana (MT-MMPs) e outras enzimas.
Entre algumas ferramentas desenvolvidas para
avaliação das formas ativas e latentes das enzimas
proteolíticas, a técnica eletroforética zimográfica
é a que permite a visualização do número e
Médica-veterinária, PhD em Fisiologia Animal, pesquisadora da Embrapa Caprinos e Ovinos.
Médico-veterinário, doutor em Ciência Animal, aluno do doutorado da Universidade Estadual do Ceará/UECe.
3
Médico-veterinário, doutor em Virologia, pesquisador da Embrapa Caprinos e Ovinos.
4
Médica-veterinária, doutora em Reprodução, pesquisadora da Embrapa Caprinos e Ovinos.
2
2
Avaliação Técnica Zimográfica como método...
massa molecular aproximada de enzimas em
amostras biológicas, com base na degradação de
um substrato copolimerizado, no caso a gelatina,
juntamente com os géis de eletroforese.
De acordo com Leber e Balkwill (1997), Snoek-Van
Beurden e Von Den Hoff (2005) e Kupai et al. (2010),
a zimografia é o método mais usado por ser o mais
completo, capaz de detectar formas ativas e latentes
das MMPs e quantificar a atividade enzimática,
apresentando também alta sensibilidade para
diferentes classes de MMPs e baixo custo em
comparação a outras técnicas.
Em caprinos, este é o primeiro trabalho no qual se
investigou o comportamento das MMPs em animais
cronicamente infectados pela artrite encefalite
caprina (CAE), doença crônica que acomete
rebanhos leiteiros, acarretando alto índice de
morbidade e perdas econômicas consideráveis.
Agressão bacteriana, viral, física
Reação
Células inflamatórias, ex.: neutrófilos e
macrófagos; células da região lesionada,
ex.: células epiteliais, fibroblastos e
células vasculares endoteliais
Produção das formas latentes
Pro MMPs
Ativação das formas ativas
MMPs
Controle
TIMPs oriundas dos fibroblastos,
células perivasculares
Figura 2. Esquema da produção, ativação e inibição das MMPs
em casos patológicos.
Fonte: Adaptado de Cawston (1996) e Percival e Bowler (2004).
Experimento
Utilizaram-se dois grupos de cinco animais,
todos pertencentes ao rebanho experimental da
Embrapa. O primeiro foi composto de animais
das raças Saanen (n = 2) e Anglo-Nubiana (n= 3),
com idade variando entre 4-5 anos, naturalmente
infectados pelo Artrite Encefalite Caprina a Vírus
CAEV. O segundo grupo consistiu também de
animais das raças Saanen (n = 2) e Anglo-Nubiana
(n = 3), com idade entre 3-4 anos, soronegativos
para a CAE. A comprovação da infecção ou não
pelo vírus foi realizada por meio do Western
Blotting (WB) (RODRIGUES et al., 2014), e
confirmada pela Reação em Cadeia de Polimerase
(PCR) (ANDRIOLI et al., 1999), ao longo dos dois
primeiros anos. Os grupos foram mantidos em
sistema semi-intensivo em uma área isolada por
cercas duplas, recebendo concentrado balanceado,
capim-elefante (Pennisetum purpureum), sal
mineral e água ad libitum.
Os animais foram submetidos a exame clínico geral
para avaliação da condição corporal e manifestação
ou não da doença.
Protocolo do teste Zimográfico
Esta técnica consiste em copolimerizar o substrato
de gelatina a 0,2%, dependendo da MMP a ser
analisada, em um gel de SDS-PAGE a 12,5%. Como
o substrato está retido nos poros do gel, ele não
migra quando é aplicado à corrente elétrica durante
a eletroforese. Foi utilizado o seguinte padrão
molecular: Phophorylase b 97 kDa rf 0,16; Albumin
66 kDa rf 0,13; Ovalbumin 45 kDa rf 0,25; Carbonic
anhydrase 30; Da rf 0,46 ; Trypsin inhibitor 20,1 rf
0,67; α-Lactalbumin 14,4 rf 0,89.
A amostra biológica, podendo ser soro sanguíneo,
tecido, plasma seminal ou outros fluidos
biológicos, é desnaturada por SDS, porém não
reduzida, e então aplicada no gel (20µg) para
separação da quantidade conhecida de proteína.
Após a corrida eletroforética, as proteases
separadas são renaturadas dentro do gel, através
de lavagens repetidas com um detergente nãoiônico, como o Triton X-100 2,5%, que substitui
o SDS do gel (HEUSSEN; DOWDLE, 1980). O gel
Avaliação Técnica Zimográfica como método...
é então incubado overnight em um tampão (50
mM Tris, pH 7.8-8.0, 150 mM NaCl e 10 mM CaCl2)
à 37 °C em constante movimento, permitindo
que as proteases presentes nas amostras sejam
renaturadas e autoativadas, realizando a digestão
do substrato em uma zona ao redor de sua
posição no gel de eletroforese. Essas zonas são
visualizadas ao corar o gel com Coomassie Brilliant
Blue-G a 0,25% (TROEBERG; NAGASE, 2003) e,
posteriormente, submetidos à solução descorante
(etanol a 30% e ácido acético a 7,5% em água
Milli-Q). A identificação das proteases é realizada
comparando-se as áreas digeridas com os padrões
de massa molecular.
Para padronização do ensaio zimográfico com
gelatina em soro sanguíneo de caprinos sadios,
foram testadas diferentes quantidades de proteínas,
variando de 4 µg a 32 µg, e identificou-se como
padrão 20 µg (Figura 3).
Figura 3. Padronização da quantidade mínima ótima de soro
sanguíneo para análise zimográfica em caprinos.
Fonte: Bezerra Júnior et al. (2015).
Na figura 4 encontra-se a imagem de um gel
gelatinolítico de zimografia, obtido a partir
de experimento utilizando soro sanguíneo de
caprinos adultos sadios e soropositivos infectados
naturalmente pela artrite encefalite caprina (CAE).
Antes, porém, os animais foram testados por
Western blotting e PCR. O gel foi digitalizado
utilizando Visidoc-It™ Imaging System 6.4, UVP,
Cambridge, UK e a quantificação das bandas foi
realizada através do Doc-it® ls image analysis
software 6.0.
Figura 4. Zimograma representativo das amostras de soro sanguíneo de reprodutores caprinos (A) soropositivos e (B) soronegativo para
CAE, utilizando-se 20µg de amostra por poço.
Fonte: Bezerra Junior et al. (2015).
Nos géis (Figura 4) dos grupos infectados e sadios
encontraram-se massas moleculares de 72 kDa
(proMMP-2), 66 kDa (MMP-2 ativa), 92 kDa (proMMP-9) e 86 kDa (MMP-9 ativa) (BEZERRA JÚNIOR
et al., 2015), com diferentes frequências notando-
se claramente maior atividade gelatinolítica nas
amostras dos animais soropositivos para CAE.
Essas massas moleculares foram identificadas,
levando em consideração o padrão molecular
utilizado.
3
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Avaliação Técnica Zimográfica como método...
A análise densitométrica é de importância para
avaliar o grau de atividade das MMPs. Na figura
5 a densitometria mostrou claramente maiores
picos da Pro-MMP-9 (92 kDa) e da MMP-2 (66 kDa)
nos animais do grupo soropositivo, enquanto
no grupo soronegativo (Figura 6) observou-se
incremento da atividade da MMP-2 (66 kDa).
Sugere-se, portanto, que a Pro-MMP-9 (92 kDa)
seja um indicativo da infecção crônica pela CAE
e que a MMP-2 (66 kDa) por sobressair-se nos
animais soronegativos, faça parte natural dos
processos fisiológicos naturais de remodelação da
matriz extracelular (MEC). O perfil densitométrico
permite visualizar a atividade e monitorar com
segurança a reação das MMPs frente a inflamação
crônica da CAE.
Figura 5. Análise densitométrica dos géis zimográficos das amostras de soro sanguíneo de reprodutores soropositivos para CAE,
mostrando a atividade das MMPs (seta). Amostras individuais de soro sanguíneo (A, B, C) e amostras do grupo (D).
Fonte: Bezerra Júnior et al. (2015).
Figura 6. Análise densitométrica dos géis zimográficos das amostras de soro sanguíneo de reprodutores soronegativos para CAE,
mostrando a atividade das MMPs (seta). Amostras individuais de soro sanguíneo (A, B, C) e amostras do grupo (D).
Fonte: Bezerra Júnior et al. (2015).
Avaliação Técnica Zimográfica como método...
Considerações Finais
A técnica zimográfica é uma ferramenta de fácil
execução, de baixo custo e de acurácia comprovada
na identificação das formas latentes e ativas das
MMPs, mostrando-se eficaz na identificação do grau
de atividade do sistema imune inato frente ao vírus
da Artrite Encefalite Caprina (CAE). Portanto, poderá
vir a ser utilizada para monitorar rebanhos sadios,
avaliar a resistência dos animais frente à infecção e
colaborar com programas de controle da doença.
Referências
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On-line (2015)
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Presidente: Vinícius Pereira Guimarães
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Membros: Carlos José Mendes Vasconcelos, Diônes
Oliveira Santos, Maíra Vergne Dias, Manoel Everardo
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Tânia Maria Chaves Campelo, Viviane de Souza.
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Supervisão editorial: Alexandre César Silva Marinho
Revisão de texto: Carlos José Mendes Vasconcelos
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Editoração eletrônica: Maíra Vergne Dias