Content analysis of phosphonates in plant material

Teresa KłosińsKaa,*, ewa archanowicza, andrzej anTczaKa, andrzej radomsKia, Tomasz zielenKiewicza, Tomasz oszaKob, jusTyna nowaKowsKab, KaTarzyna KubiaKb, miłosz TKaczyKb Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Warszawa; bInstytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary a Content analysis of phosphonates in plant material Analiza zawartości fosfonianów w materiale roślinnym DOI: 10.15199/62.2015.6.XX Concn. of PHO32– ions in plant tissues was detd. by using reaction with Ag+ in acidic soln. to metallic Ag ppt. The amt. of Ag was detd. by X-ray fluorescence spectrometry (XRF) and UV-VIS spectrophotometry. The XRF method was less laborious, but its accuracy was lower. Its sensitivity was insufficient to det. very low concns. of phosphonates. The UV-VIS spectrophotometry, after Ag dissoln. in concd. HNO3, complexation of Ag+ with dithizone, extn. with CHCl3 and detn. without removal of free dithizone, showed a significantly higher sensitivity. Opracowano metodę ilościowego oznaczania fosfonianów w tkankach roślinnych. Zaproponowana procedura oparta jest na reakcji tych jonów z jonami srebra w środowisku kwaśnym, w wyniku której strąca się osad metalicznego srebra. Ilość wolnego srebra, powstałego w wyniku działania fosfonianów, została oznaczona metodami spektrometrii fluorescencji rentgenowskiej XRF i spektrofotometrii UV-VIS. Metoda XRF jest mniej pracochłonna, lecz jej czułość to ok. 0,1 mg srebra, co nie stanowi wyniku zadowalającego w przypadku śladowych ilości fosfonianów w tkankach roślinnych. W przypadku spektrofotometrii UV-VIS, po roztworzeniu srebra w stężonym HNO3, skompleksowaniu jonów Ag+ ditizonem, ekstrakcji chloroformem i bezpośrednim oznaczeniu spektrofotometrycznym bez usuwania Dr Teresa KŁOSIŃSKA w roku 1992 ukończyła studia na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Od 2001 r. pracuje na Wydziale Technologii Drewna Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, gdzie jest adiunktem. Specjalność naukowa – struktura i właściwości fizyczne drewna. * Autor do korespondencji: Wydział Technologii Drewna, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa, tel.: (22) 593-86-48, fax: (22) 593-86-31, e-mail: teresa_klosinska@sggw.pl 1000 wolnego ditizonu, uzyskano znacznie większą czułość, wynoszącą 0,03 μM srebra. Na podstawie ilościowej reakcji fosfonianów, srebra i ditizonu można oszacować zawartość fosfonianów w tkankach roślinnych. Fosfoniany, czyli sole lub estry kwasu fosfonowego, są obecnie coraz częściej wykorzystywane w hodowli roślin oraz w leśnictwie. Pod względem struktury chemicznej różnią się one od stosowanych powszechnie w nawożeniu roślin fosforanów(V). Jeden atom tlenu mniej w cząsteczce oraz bezpośrednie wiązanie wodór-fosfor zmieniają istotnie ich właściwości. W przeciwieństwie do fosforanów(V), które stanowią źródło fosforu dla roślin, fosfoniany charakteryzują się innym spektrum działania. Związki te mogą być stosowane jako nawozy, biostymulatory oraz fungicydy1–3). Mimo że fosfoniany są bardzo łatwo absorbowane przez rośliny (zarówno przez korzenie, jak i liście), to nie stanowią dla nich dobrego źródła niezbędnego do życia fosforu. Związany w tych solach fosfor trudno uwalnia się w tkankach roślin, nieznane są także enzymy, które w tkankach roślinnych utleniałyby fosfoniany do fosforanów(V), a zatem dostępność tego pierwiastka dla rośliny jest ograniczona. Ponadto fosfoniany w większych stężeniach wykazują działanie fitotoksyczne. Zatem stosowane najczęściej w nawozach fosfoniany potasu i amonu są dla roślin raczej źródłem potasu i azotu niż fosforu4, 5). Dowiedziono, że fosfoniany wykazują właściwości biostymulujące, powodując wzrost odporności roślin zarówno na czynniki biotyczne, jak i abiotyczne. Związki z tej grupy powodują wzmocnienie ściany komórkowej (wzrost bariery mechanicznej), stymulację syntezy fitoaleksyn (chemiczna broń rośliny w odpowiedzi na stres, np. zranienie, Mgr inż. Ewa ARCHANOWICZ w roku 2011 ukończyła studia na Wydziale Technologii Drewna Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Od 2011 r. jest uczestnikiem studiów doktoranckich na tej uczelni. Specjalność naukowa – mechaniczna obróbka drewna, inżynieria materiałów drzewnych i drewnopochodnych. 94/6(2015) obecność patogenów) oraz indukcję apoptozy (kontrolowane niszczenie) zainfekowanych komórek6). Fosfoniany w niewielkim stopniu stanowią źródło fosforu dla roślin, lecz są skutecznymi biostymulatorami i fungistatykami. Preparaty zawierające fosfoniany działają wielokierunkowo, powodując ograniczenie wzrostu komórek grzyba, zahamowanie wytwarzania zarodników, pobudzanie grzybów do wydzielania tzw. metabolitów stresu, będących dla rośliny sygnałem do produkcji aleksyn. Szczególnie dużą skuteczność fosfonianów odnotowano w przypadku pasożytów grzybopodobnych z rodzaju Phytophthora7, 8). Najkorzystniejszą formą nawożenia roślin wydaje się być stosowanie preparatów, w których zachowane są odpowiednie proporcje fosforanów(V) i fosfonianów9). Mimo szerokiego spektrum wykorzystania fosfonianów w rolnictwie i leśnictwie do tej pory brak danych o ich przemianach w tkankach roślinnych. Jest to głównie spowodowane trudnością z wyizolowaniem tej ściśle określonej formy fosforu z bogatego w ten pierwiastek materiału biologicznego. Znanych jest kilka metod ilościowego oznaczania fosfonianów, ale są one kosztowne, pracochłonne i mało wiarygodne dla materiału biologicznego. Jedną ze stosowanych metod ilościowego oznaczania fosfonianów jest analiza jodometryczna, polegająca na redukcji jodu do jonów jodkowych zgodnie z równaniem (1): I2 + PHO32– + H2O → 2I– + 2H+ + HPO42–, (1) a następnie odmiareczkowaniu nadmiaru jodu10). Metoda ta sprawdza się wyłącznie dla dużych stężeń fosfonianów w materiale niebiologicznym (stężenia na poziomie 0,4% P2O5) i jest często stosowana do określania ich ilości w nawozach. Kolejna metoda również polega na reakcji roztworu fosfonianów z jodem, a następnie na spektrofotometrycznym oznaczeniu nadmiaru I2 jako adduktu ze skrobią przy długości fali 580 nm11). Także ona nie rozwiązuje problemów z selektywnością analizy fosforu w formie fosfonianów, ale poprzez zastosowanie barwnego kompleksu I2 i skrobi oraz oznaczeniu instrumentalnym ma znacznie lepszą czułość i jest przydatna do oznaczania fosfonianów w stężeniach 1–80 mM. We wstrzykowej analizie przepływowej (FIA) z detekcją spektrofotometryczną analizę fosforanów(V)12) prowadzi się metodą błękitu fosforomolibdenianowego wg równania (2): PMoVI12O403– + 4e– → PMoV4MoVI8O407–, (2) (3) i ponowne oznacza fosforany(V), tym razem traktowane jako fosfor całkowity. Metoda jest szybka i precyzyjna, ale podobnie jak w przypadku metod opartych na miareczkowaniu nie nadaje się zbyt dobrze do oznaczania śladowych ilości fosfonianów w tkankach roślinnych i jest przydatna dla stężeń powyżej 3 g/dm3. Brak również danych na temat wpływu fosforu pochodzącego ze związków organicznych na wyniki oznaczania stężeń fosfonianów. Oznaczanie fosfonianów jest również możliwe za pomocą metod chromatograficznych13), jednak w tym przypadku, nawet podczas analizy wody, konieczne jest wstępne oczyszczanie w pre- Dr inż. Andrzej ANTCZAK Dr inż. Andrzej RADOMSKI notkę biograficzną i fotografię Autora wydrukowaliśmy w nr 5/2015, str. 815. Dr inż. Andrzej RADOMSKI notkę biograficzną i fotografię Autora wydrukowaliśmy w nr 5/2015, str. 814. Dr inż. Tomasz ZIELENKIEWICZ notkę biograficzną i fotografię Autora wydrukowaliśmy w nr 5/2015, str. 816. 94/6(2015) 2Ag+ + PHO32– + H2O → 2Ag0↓ + 2H+ + HPO42– (4) Strącone w wyniku reakcji metaliczne srebro tworzy na bibule charakterystyczne ciemne pola o intensywności zabarwienia skorelowanej z ilością srebra. Istnieją przesłanki, że reakcja (4) nie zachodzi dla fosforu pochodzącego ze związków organicznych, zatem pozwala na selektywne oznaczenie fosfonianów. Reakcja ta charakteryzuje się również dużą czułością i pozwala oznaczyć stężenie PHO32– z dokładnością do 1 mM (0,01% w próbkach biomasy). Korzystając ze sporządzonego wzorca barw, autorzy określili zawartość fosfonianów w liściach i korzeniach eukaliptusa (Eucalyptos sp.) i awokado (Persea sp.). Zasadniczą wadą tej metody jest wizualna, a wiec mało obiektywna ocena ilości metalicznego srebra powstającego w wyniku reakcji z fosfonianami. Nikt też przed autorami tej metodyki nie potwierdził specyficzności reakcji fosfonianów z jonami srebra w środowisku kwaśnym. Wykorzystanie zależności między ilością strącanego w wyniku reakcji srebra a stężeniem fosfonianów w roztworze jest obiecujące, ale wymaga dalszych badań, przede wszystkim w kierunku wyeliminowania subiektywnej oceny wyników. Celem badań było opracowanie metodyki oznaczania fosfonianów w tkankach roślinnych za pomocą reakcji z jonami srebra w środowisku kwaśnym, z wyeliminowaniem wizualnej oceny wyników i zastąpieniem jej instrumentalnym pomiarem ilości strąconego srebra oraz potwierdzenie specyficzności reakcji dla fosfonianów w przypadku analizy biomasy roślinnej. Dodatkowym założeniem dla metody była możliwość wykonania dużej liczby pomiarów w krótkim czasie; jako kryterium przyjęto 100 pomiarów w ciągu 1 tygodnia. Część doświadczalna a następnie fosfoniany utlenia się zgodnie z równaniem (3): 2MnO4– + 5PHO32– + 6H+ → 2Mn2+ + 3H2O + 5HPO42– kolumnach w celu usunięcia m.in. chlorków, związków organicznych i powierzchniowo czynnych. Analizy chromatograficzne w przypadku oznaczania fosfonianów w materiale roślinnym dają wiarygodne wyniki, ale tego typu metodyka jest droga i pracochłonna. Zastosowanie chromatografii jonowymiennej z supresją jonową i detekcją konduktometryczną pozwoliło oznaczyć stężenie fosfonianów z dokładnością do 0,002 μM14). W przypadku oznaczania fosfonianów w materiale biologicznym najbardziej istotnymi problemami są ich niskie stężenia oraz oddzielenie od innych form fosforu. Problemy te wydaje się rozwiązywać metoda wykorzystująca redukcję jonów srebra przez fosfoniany w środowisku kwaśnym15), zgodnie z równaniem (4): Surowce Stosowano preparat fosfonianowy Actifos firmy Agropak sp. j., stosowany przez Instytut Badawczy Leśnictwa w eksperymentach terenowych jako środek fungistatyczny przeciwko Phytoptora sp. Według deklaracji producenta jest to roztwór fosfonianu amonu, zawierający azot w formie amonowej (10,2%) oraz mikroskładniki: bor (0,02%), miedź (0,008%), żelazo (0,06%), mangan (0,04%), molibden (0,004%) i cynk (0,02%). Chloroform miał czystość cz.d.a. i był przydatny do pracy z ditizonem. Pozostałe odczynniki także miały czystość cz.d.a. Woda była dwukrotnie redestylowana w aparaturze szklanej. Badano liście dębu (Quercus robur L.) rosnącego na terenie Akademii Obrony Narodowej w Warszawie Rembertowie, w okolicach al. Sztandarów, Dr hab. Tomasz OSZAKO w roku 1983 ukończył studia na Wydziale Leśnym Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Obecnie pracuje na stanowisku profesora nadzwyczajnego w Instytucie Badawczym Leśnictwa w Sękocinie Starym. Specjalność – fitopatologia leśna. 1001 liście topoli (Populus trichocarpa Torr. & A. Gray) rosnącej na polu doświadczalnym SGGW Wolica oraz korę topoli (Populus nigra L.) pochodzącą z pnia wiatrołomu znajdującego się na terenie kampusu SGGW przy ul. Nowoursynowskiej w Warszawie. Wobec badanych materiałów biologicznych ani w najbliższej okolicy nigdy nie stosowano żadnej formy nawożenia preparatami zawierającymi fosfoniany. Aparatura Do pomiarów metodą spektrometrii fluorescencji rentgenowskiej (XRF) wykorzystano aparat typu EDXRF, Midex M firmy Spectro, w którym wzbudzony atom w cząsteczce emituje wtórne promieniowanie rentgenowskie trafiające do detektora, a stężenie pierwiastka oznaczane jest na podstawie zliczeń impulsów (N) na określonym poziomie energetycznym. Do analizy ilościowej kompleksów srebra z ditizonem wykorzystano spektrofotometr UV mini 1240 firmy Shimadzu, z podwójnym źródłem światła, o zakresie pomiarowym 190–900 nm. Metodyka badań W celu przygotowania roztworu roboczego fosfonianów próbkę 5 cm3 preparatu Actifos rozcieńczono wodą redestylowaną w kolbie miarowej o pojemności 500 cm3. W tak przygotowanym roztworze bazowym określono stężenie fosfonianów metodą analizy jodometrycznej10). Wynosiło ono 0,03605 M, co odpowiadało zawartości fosforu 1,117 g/dm3. Roztwory o mniejszych stężeniach sporządzano przez rozcieńczenie roztworu roboczego. Badania czułości metody XRF wobec srebra prowadzono, wykorzystując roztwór wzorcowy AgNO3 o stężeniu 1 M oraz roztwory uzyskane poprzez kolejne rozcieńczenia, aż do stężenia 0,03 µM. Krople badanych roztworów umieszczano na płytce z poli(metakrylanu metylu) i analizowano metodą XRF. Badania reakcji jonów Ag+ z fosfonianami prowadzono, używając roztworów wzorcowych PHO32– w zakresie stężeń od 3,6∙10–2 M do 1,2∙10–5 M. Do zamykanych szczelnie probówek wprowadzano 5 cm3 badanego roztworu fosfonianów, po czym dodawano 1 cm3 roztworu azotanu srebra o stężeniu 0,4 mol/dm3 i 0,1 cm3 roztworu kwasu azotowego o stężeniu 0,1 mol/dm3. Reakcje prowadzono w temperaturze pokojowej przez 60 min. Po tym czasie próbki odwirowywano przez 3 min (5000 rpm). Ciecz znad osadu odpipetowywano, a próbki przemywano kolejno wodą destylowaną, roztworem 0,1 M tiosiarczanu sodu i ponownie wodą destylowaną, odwirowując próbkę po każdym przepłukaniu w tych samych warunkach. Po usunięciu znających się w roztworze jonów srebra osad metalicznego srebra suszono, a następnie roztwarzano, dodając 0,03 cm3 stężonego HNO3. Po roztworzeniu srebra dodawano 0,17 cm3 wody i wiązano nadmiar kwasu azotowego, dodając 0,2 cm3 nasyconego roztwory cytrynianu sodu. Następnie roztwór przenoszono na płytkę PMMA i analizowano w spektrometrze XRF. Badania metodyki spektrofotometrycznego oznaczania srebra prowadzono dla stężeń ditizonu i ditizonianu srebra w zakresie od 0,4 μM do 0,1 mM. Weryfikację sprawności analizy prowadzono, używając roztworów wodnych AgNO3 o stężeniach od 0,2 μM do 0,04 mM. Roztwory umieszczano w fiolkach, zobojętniano 1 M roztworem Dr hab. Justyna A. NOWAKOWSKA w roku 1994 ukończyła studia na Uniwersytecie Louis Pasteur w Strasburg (Francja). Obecnie pracuje na stanowisku profesora nadzwyczajnego w Instytucie Badawczym Leśnictwa w Sękocinie Starym. Specjalność – genetyka drzew leśnych. 1002 amoniaku do wyczuwalnego zapachu amoniaku, a następnie dodawano 0,05 cm3 lodowatego kwasu octowego. Świeży roztwór bazowy ditizonu w chloroformie o stężeniu 0,01% przygotowywano raz w tygodniu i przechowywano w ciemnym miejscu pod warstwą 1 M kwasu siarkowego. Roztwór roboczy o stężeniu 0,0004% był sporządzany przez rozcieńczenie roztworu bazowego każdorazowo w dniu pomiarów. Badania wydajności reakcji fosfonianów z jonami Ag+ prowadzono dla PHO32– w zakresie stężeń od 0,5 μM do 0,5 mM oraz dla roztworów odniesienia niezawierających fosfonianów. W zamykanych szczelnie fiolkach o objętości 12 cm3 umieszczano po 5 cm3 badanych roztworów wzorcowych fosfonianów, po czym dodawano 1 cm3 0,4 M roztworu AgNO3 oraz 0,1 cm3 0,1 M roztworu HNO3. Całość pozostawiano bez dostępu światła w temperaturze pokojowej na czas 30–240 min. Po tym czasie próbki odwirowywano przez 10 min (3600 rpm). Roztwory odpipetowywano znad osadów, a następnie zawartość fiolek płukano kolejno: 0,1 M roztworem HNO3, wodą, 1 M roztworem NH3 oraz dwukrotnie wodą. Każdorazowo zawartość fiolek mieszano, osady odwirowywano i odpipetowywano roztwory. Przemyte osady metalicznego srebra pozostałe w fiolkach zadawano 0,2 cm3 stężonego HNO3 i mieszano do całkowitego ich rozpuszczenia. Uzyskane roztwory zobojętniano 1 M roztworem NH3 do wyczuwalnego zapachu amoniaku, a następnie dodawano 0,05 cm3 lodowatego kwasu octowego. Do fiolek dodawano 4 cm3 roztworu roboczego ditizonu, zamykano szczelnie, wstrząsano i pozostawiano do odstania. Jeśli dolna warstwa chloroformowa zabarwiona była na zielono lub żółtozielono, 3 cm3 roztworu w CHCl3 pobierano pipetą bezpośrednio do kuwety spektrofotometru. W przeciwnym przypadku roztwory w CHCl3 odpipetowywano do odpowiedniej kolbki miarowej. Dodawano kolejne porcje roztworu roboczego ditizonu i odpipetowywano do kolbki miarowej, aż do uzyskania żółtozielonego lub zielonego zabarwienia ostatniej porcji. W takim przypadku na koniec trzykrotnie dodawano jeszcze po 1 cm3 roboczego roztworu ditizonu i odpipetowano w celu ilościowego przeniesienia kompleksu AgHDz do kolby miarowej. Kolbę miarową dopełniano roztworem roboczym ditizonu, zawartość mieszano i pobierano 3 cm3 do kuwety spektrofotometru. Pomiary absorbancji wykonywano przy długości fali 490 nm i 605 nm wobec chloroformu jako odniesienia. Materiał biologiczny do badań (liście i korę) wysuszono próżniowo w temp. 60°C i przechowywano w stanie suchym. Próbki rozdrobnionego materiału biologicznego o masie 1,0±0,1 g umieszczano w probówkach szklanych i ekstrahowano przez 2 h (liście) lub 5 h (kora) w łaźni wodnej w temp. 95°C. Ekstrakcję prowadzono, używając 10 cm3 wody z dodatkiem HNO3 (0,01 M, pH ok. 2). Tak przygotowane ekstrakty stosowano w badaniach selektywności reakcji jonów Ag+ z PHO32–. Badano ilość wydzielonego metalicznego srebra w reakcji wg opisanej wcześniej procedury, stosując te ekstrakty bez dodatku fosfonianów. Próbki wysuszonych i rozdrobnionych liści i kory o masie 1,0±0,1 g umieszczano w szczelnie zamykanych fiolkach, po czym dodawano wodę i mieszano na zimno do nasycenia materiału. Następnie dodawano roztwór fosfonianów w ilości odpowiadającej zawartości H2PHO3 w suchej masie, 0,1–100 mg/kg. Całość mieszano w celu ujednorodnienia i odparowywano do sucha. Dalsza analiza była prowadzona zgodnie z opisaną procedurą ekstrakcji oraz oznaczania fosfonianów w roztworach wzorcowych. Zawartość fosforanów (jako H2PHO3) obliczano jako stosunek masy z wzoru (5): Dr Katarzyna A. KUBIAK w roku 2006 ukończyła studia na Wydziale Rolnictwa i Biologii Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Obecnie pracuje na stanowisku adiunkta w Instytucie Badawczym Leśnictwa w Sękocinie Starym. Specjalność – mikrobiolog środowiskowy. 94/6(2015) cH 2 PHO 3 = 40,998 ⋅ CAgHDz ⋅ VCHCl3 mi (5) w którym cH2POH3 oznacza zawartość fosforynów, µg/g, CAgHDz stężenie ditizonianu srebra, mmol/dm3, VCHCl łączną objętość dodanego roztwo3 ru ditizonu w chloroformie, cm3, a mi suchą masą próbki, g. Wyniki badań i ich omówienie Ze względu na szybkość techniki XRF, w której pojedyncza analiza zajmuje ok. 1 min, podjęto próbę jej zastosowania do analizy srebra wydzielonego w reakcji z fosfonianami. Wstępne testy wykazały, że nie ma możliwości bezpośredniej adaptacji metody podawanej przez Stasikowskiego15), w której metaliczne srebro po redukcji fosfonianami jest sączone i oznaczane wizualnie. Ponieważ spektrometria XRF jest metodą powierzchniową, oznaczanie metalicznego srebra w mieszaninie z nośnikiem oraz materiałem filtracyjnym wymagałoby idealnie powtarzalnej matrycy do zapewnienia wiarygodności wyników. Dodatkowym problemem był niejednorodny rozkład srebra na przekroju poprzecznym próbek po sączeniu, widoczny także u Stasikowskiego15). Różnice liczby zliczeń między próbami wykonanymi dla stężenia PHO32– 3,6 mM sięgały 30%, a dla stężenia 36 mM prawie 20%. Wynik ten uzyskano, stosując maksymalny rozmiar przesłony 5 mm i dodatkowo uśredniając wyniki 3 pomiarów w obrębie pojedynczej próbki. Tak mała powtarzalność praktycznie dyskwalifikowała metodę. Kolejnym krokiem była homogenizacja próbki, uzyskana przez roztworzenie wydzielonego srebra i pomiar srebra w roztworze. Na rys. 1 przedstawiono (dla użytego aparatu XRF) zależność liczby zliczeń sygnałów pochodzących od atomów srebra od stężenia Ag+ w roztworach wzorcowych. Dla stężeń poniżej 10–5 M analiza była niemożliwa ze względu na zbyt słaby sygnał, porównywalny z wynikami dla prób zerowych. W bezpośrednich badaniach ekstraktów roślinnych uzyskano z kolei wyniki tła na poziomie 200–1000 zliczeń w tych LogN 5 3 samych warunkach pomiaru. Czułość metody w odniesieniu do próbek środowiskowych była rzędu 10–3 M i wymagała stosowania dużych próbek i zatężania roztworów. Dla próbki materiału lignocelulozowego o masie 1 g w przedstawionej metodzie granicą oznaczalności PHO32– było 32 mg/kg. Przeprowadzono badania, w których wzorcowe roztwory fosfonianów zostały poddane reakcji z jonami Ag+ i dalszej analizie XRF. Wyniki (rys. 2) potwierdziły dobrą dokładność metody dla stężeń PHO32– powyżej 0,01 M. Dla mniejszych stężeń obserwowano z jednej strony większy rozrzut wyników, a z drugiej wyraźnie mniejszą średnią z pomiarów w stosunku do rzeczywistego stężenia fosfonianów. Ta ostatnia obserwacja wskazuje na konieczność przeprowadzenia badań szybkości reakcji z jonami Ag+, zwłaszcza dla niewielkich stężeń badanych próbek. Ponieważ metoda bezpośredniego pomiaru zawartości srebra w osadzie po reakcji z fosfonianami spektrometrem XRF okazała się niemożliwa, a metoda polegająca na roztworzeniu srebra metalicznego jest pracochłonna i mało czuła, podjęto badania w celu zaadaptowania metody spektrofotometrycznej z użyciem ditizonu16). Zasadnicze różnice w stosunku do typowej analizy polegały na uproszczeniu procedury, co pozwoliło na skrócenie czasu analizy. W przypadku mikroanalizy fosfonianów w tkankach roślinnych jest to nie mniej istotne niż dokładność wyniku. Pierwszą zmianą było pominięcie etapu usuwania nadmiaru ditizonu, co w przypadku próbek o objętości kilku cm3 byłoby uciążliwe. To spowodowało konieczność uwzględnienia absorpcji wolnego ditizonu (H2Dz) obecnego w próbce. Analiza widma UV-VIS H2Dz oraz ditizonianu srebra (AgHDz) w chloroformie wykazała, że maksimum absorpcji dla ditizonu występuje dla długości fali 605 nm, a absorpcja AgHDz jest dla tej długości fali zaniedbywalna. Maksimum absorpcji dla ditizonianu srebra to 467 nm, jednak dla tej długości fali występuje też silna absorpcja H2Dz. Największa wartość stosunku współczynników absorpcji AgHDz/H2Dz, wynosząca 1,55 (dla stężenia 0,025 mM) odpowiada długości fali 490 nm. Absorpcja ditizonu zmniejsza się wtedy ponad dwukrotnie w stosunku do absorpcji przy 467 nm, a dla AgHDz jest nadal wysoka. Na rys. 3 przedstawiono zależności kalibracyjne dla wybranych długości fali (490 nm i 605 nm). Na ich podstawie można było określić stężenie ditizonianu srebra bez konieczności ekstrakcji wolnego ditizonu, oznaczając stężenie C(H2Dz) bezpośrednio z pomiaru całkowitej absorbancji dla długości fali 605 nm, A605 = A605(H2Dz). W kolejnym kroku ze stężenia ditizonu C(H2Dz) należało wyznaczyć „częściową” absorbancję ditizonu dla długości fali 490 nm. Z kolei absorbancję ditizonianu srebra A490(AgHDz) należało wyznaczyć z różnicy między 1 -6 -4 -2 0 Log(C Ag+, mol/dm 3) Fig. 1. Dependence of detector signal (counts) on the silver ion concentration Rys. 1. Zależność sygnału detektora XRF (liczba zliczeń) od stężenia jonów srebra Wydajność analizy, % 130 100 70 40 Mgr inż. Miłosz TKACZYK w roku 2012 ukończył studia na Wydziale Leśnym Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Jest asystentem w Instytucie Badawczym Leśnictwa w Sękocinie Starym. Specjalność – fitopatologia leśna. 94/6(2015) -3 -2 -1 0 3 Log(C PHO32–, mol/dm ) Fig. 2. Overall yield of phosphonates determination with XRF Rys. 2. Ogólna wydajność oznaczania fosfonianów metodą XRF 1003 niach z wykorzystaniem techniki XRF, podczas przemywania osadów srebra roztworem Na2S2O3 w części próbek pojawiało się zmętnienie, które nie przeszkadzało w analizie. W przypadku analiz spektrofotometrycznych takie zmętnienie spowodowałoby błędy pomiarowe, dlatego zmieniono procedurę przemywania osadów srebra. Na rys. 5 przestawiono wyniki oznaczania zawartości fosfonianów dla różnych stężeń oraz po różnym czasie reakcji z jonami Ag+. W przypadku stężeń PHO32– powyżej 0,1 mM reakcja przebiegała z wydajnością powyżej 95% już po 60 min. W przypadku mniejszych stężeń czas reakcji musiał zostać znacznie wydłużony. Dla stężenia PHO32– 5 μM po 60 min wydajność reakcji wynosiła zaledwie 67%, po 120 min 88%, a do ilościowego przebiegu reakcji konieczne było 180 min. W przypadku stężeń mniejszych wymagany był jeszcze dłuższy czas reakcji (dla stężenia 0,5 μM po 240 min wydajność wynosiła tylko 76%). W tym kontekście istotna staje się kwestia ewentualnej reakcji jonów Ag+ z substancjami redukującymi obecnymi w biomasie. Na rys. 6 został przedstawiony wynik badania ilości wydzielonego metalicznego srebra w kontakcie z ekstraktami z liści dębu i topoli AgHDz 490 nm 1,0 H2Dz 490 nm Absorbancja H2Dz 605 nm 0,5 0,0 0,00 0,02 Stężenie, mmol/dm 3 0,04 Fig. 3. The calibration curve of free dithizone and silver dithizonate Rys. 3. Krzywe kalibracyjne dla ditizonu i ditizonianu srebra zmierzoną całkowitą absorbancją dla 490 nm A490 a absorbancją wolnego ditizonu A490(H2Dz), i na tej podstawie określić stężenie ditizonianu srebra C(AgHDz). Po uwzględnieniu przedstawionych zależności kalibracyjnych otrzymano zależność (6): CAgHDz = 0,1109∙(A490 – 0,1988∙A605) (6) Na rys. 4 przedstawiono sprawność oznaczania jonów srebra metodą spektrofotometryczną (wg procedury pomiaru bez oddzielania wolnego ditizonu), liczoną jako stosunek stężenia oznaczonego w próbce do stężenia nominalnego. W całym badanym zakresie stężeń nie obserwowano błędu systematycznego zawyżenia lub zaniżenia stężenia Ag+. Dla stężeń poniżej 1 μM wyniki cechowały się znacznym odchyleniem standardowym, nieprzekraczającym jednak 20% wartości średniej. Dla mikroanalizy materiału biologicznego taki błąd jest jeszcze dopuszczalny, gdyż jest porównywalny z typowymi różnicami dla osobno pobieranych próbek. Rozrzuty wyników stawały się nieakceptowalne dopiero dla stężeń poniżej 0,3 μM, co należy przyjąć za granicę oznaczalności srebra opisaną metodą. Kolejna seria badań miała odpowiedzieć na pytanie, czy reakcja Ag+ z fosfonianami w podanych warunkach jest ilościowa. W bada- Wydajność analizy, % 100 240 min 180 min 60 min 30 min 0 -7 70 -5 -4 -3 Log(C PHO32–, mol/dm ) Fig. 5. Yield of reaction with silver ion at different times and phosphonates concentration Rys. 5. Wydajność reakcji fosfonianów z jonami Ag+ w zależności od czasu jej trwania i stężenia fosfonianów "Pozorne" stężenie PO 32–, μM Wydajność analizy, % 100 -6 3 maksimum 8 130 120 min 50 średnia 4 0 40 0 -7 -6 -5 -4 Log(C Ag+, mol/dm 3) 100 200 Czas reakcji z Ag+, min Fig. 4. Effectiveness of silver ion spectrophotometric determination Fig. 6. Amount of silver reduced by organic extracts, calculated as corresponding phosphonates concentration Rys. 4. Sprawność oznaczania jonów srebra metodą spektrofotometryczną Rys. 6. Ilość srebra zredukowanego w reakcji z ekstraktami organicznymi, przeliczona na odpowiadające jej stężenie fosfonianów 1004 94/6(2015) Zawartość fosfonianów oznaczona, mg/kg oraz kory topoli. Przeliczenie wyniku na pozorne stężenie fosfonianów pozwalało na bezpośrednią ocenę wpływu reakcji ubocznych na wynik pomiaru. Na wykresie zaznaczono wartości średnie oraz uzyskane wartości maksymalne (nie mniej istotne z punktu widzenia oceny dokładności całej metody). Dla czasu reakcji wynoszącego 120 min zawyżenie oznaczonego stężenia PHO32–, pochodzące od substancji organicznych, może wynosić do 2,5 μM, co dla 5 cm3 ekstraktu z 1 g biomasy oznacza błąd rzędu 1 mg/kg. Ponieważ mniejsze stężenia PHO32– wymagają jeszcze dłuższego czasu reakcji, należy uznać że granicą wykrywalności fosfonianów w biomasie jest ok. 2 mg/kg. Zwiększanie masy próbek pobieranych do badań nie przyniesie tu poprawy, gdyż proporcjonalnie wzrośnie stężenie organicznych substancji redukujących. Wyniki pomiarów zawartości fosfonianów w biomasie dotowanej roztworem zawierającym PHO32– przedstawiono na rys. 7. Dla stężeń PHO32– w materiale roślinnym rzędu 10 mg/kg i większym uzyskano znakomitą zgodność wyników pomiarów z wartościami nominalnymi. W przypadku próbek o zawartości PHO32– 0,1 mg/kg wyniki cechowały się dużym zawyżeniem wartości w stosunku do nominalnej oraz dużymi rozrzutami względnymi. Granicą poprawnych wyników było ok. 1 mg/kg. Zgodność była nawet lepsza, niż można byłoby oczekiwać na podstawie wcześniejszych badań. Nie można jednak wykluczyć, że wpływ na wynik miało skompensowanie dwóch efektów: zaniżenia wyniku wskutek niecałkowitego przereagowania PHO32– oraz zawyżenia na skutek reakcji Ag+ z substancjami organicznymi. 100 10 1 0,1 0,01 0,01 0,1 1 10 100 Zawartość fosfonianów wprowadzona, mg/kg Fig. 7. Effectiveness of phosphonates determination in organic samples Rys. 7. Sprawność oznaczania fosfonianów w próbkach organicznych 94/6(2015) Podsumowanie W wyniku przeprowadzonych doświadczeń ustalono metodykę ilościowej analizy fosfonianów w tkankach roślinnych. Stwierdzono niewielką przydatność metody XRF, ograniczoną do próbek o bardzo dużej, rzędu 0,1%, zawartości PHO32–. Analiza spektrofotometryczna wydzielonego w reakcji z PHO32– srebra dała znacznie lepsze rezultaty. Określono czas potrzebny do całkowitego przereagowania fosfonianów i jednocześnie zbadano wpływ substancji organicznych na wynik. Zaproponowana procedura pozwala w krótkim czasie i przy nakładzie niewielkich środków finansowych przeanalizować dużą liczbę próbek i oznaczyć fosfoniany z dużą dokładnością. Granica wykrywalności PHO32– w biomasie wg tej procedury została określona na 2 mg/kg. Praca wykonana w ramach projektu badawczego Life 11 ENV/ PL/459 PROJECT ACRONIM: HESOFF „Evaluation of the health state of forests and an effect of phosphite treatments with the use of photovoltaic SLE”, finansowanego przez The European Community according to LIFE + Program and by the National Fund for Environmental Protection and Water Management in Poland. Otrzymano: 16-07-2014 LITERATURA 1. R. Glinicki, R. Saszt-Paszt, E. Jadczyk-Tobiasz, J. Fruit Ornamental Plant Res. 2010, 18, nr 1, 111. 2. H. Forster, J.E. Adaskaveg, D.H. Kim, M.E. Stanghellini, Plant Dis. 1998, 82, 1165. 3. A.E. Mc Donald, B.R. Grant, W.C. Plaxton, J. Plant. Nutr. 2001, 24, 1505. 4. J.J. Street, G. Kidder, Fla. Coop. Ext. Serv. Fact Sheet SL-8, 1989. 5. R. Smillie, B.R. Grant, D. Guest, Phytopatology 1989, 79, 921. 6. H.T.B. Thao, T. Yamakawa, Soil Sci. Plant Nutr. 2009, 55, 228. 7. M.J. Aberton, B.A. Wilson, M.J. Cahill, Australasian Plant Pathology 1999, 28, 225. 8. T.J. Jackson, T. Burges, I. Colquhoun, G.E.St.J. Hardy, Plant Path 2000, 49, 147. 9. D.C. Young, Pat. USA 6824584 (2004). 10. V.P. Franzini, J.A. Gomes Neto, Quím. Nova 2007, [online] 30, nr 2, 308. 11. R.A. Barco, D. Patil, T.M. Salmassi, G. Hanrahan, Am. Geophys. Union, Fall Meeting 2004, abstract #B21C-0903. 12. P.R. Dametto, V.P. Franzini, J.A. Gomes Neto, J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 5980. 13. G.H.P. Roos, C. Loane, B. Dell, G.E.St.J. Hardy, Commun. Soil Sci. Plant Anal 1999, 30, 2323. 14. C. Han, J. Geng, X. Xie, X. Wang, H. Ren, S. Gao, Environ. Sci. Technol. 2012, 46, 10667. 15. P. Stasikowski, D. Clark, J. McComb, B. Shearer, P. O’Brien, G. Hardy, Research into natural and induced resistance in Australian native vegetation of Phytophthora cinnamomi and innovative methods to contain and/or eradicate within localised incursions in areas of high biodiversity in Australia, Tender Number 2008, 19/2005DEH Sub Project 19.2.2. 16. Z. Marczenko, M. Balcerzak Separation, preconcentration and spectrophotometry in inorganic analysis, Elsevier, 2000. 1005