Artículos originales
Ligamento Periodontal
Humano: comportamiento
de sus células en cultivo
in-vitro frente a un andamio
tisular utilizado para reparar
defectos óseos
G. Di Fabio de Cosso1; M.C. Nacucchio2; W. Zabala3; A. A.Cosso4
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, la reconstrucción del hueso perdido se ha convertido en un tema de vital importancia
para el éxito del tratamiento regenerativo odontológico.
Su uso fue incrementándose desde sus comienzos en el
tratamiento periodontal o la cirugía oral, hasta últimamente, en la terapia implantológica.1
Por otra parte la investigación de biomateriales compatibles se ha visto inundada de opciones desde hace un
tiempo, sobre todo cuando se habla de reconstrucción
de defectos óseos. La controversia en el uso de cada
uno, y el soporte más viable para ser utilizado como
andamio, son cuestiones que aún quedan por resolver
pero reservadas a la discusión entre los odontólogos
periodoncistas e implantólogos, especialistas en la materia, ya que escapan al alcance de este trabajo.
En tal sentido, se consideró adecuado elegir una de
estas propuestas actuales- una sustancia utilizada comúnmente como andamio de defectos óseos- para diseñar el
estudio con aplicación de una biotecnología, a fin de
observar el comportamiento de un cultivo celular frente
al mismo. Para ello se eligió una metodología ampliamen-
1.
2.
3.
4.
te descripta en la bibliografía- el cultivo de células2- para
estudiar in vitro a la célula protagonista de todo proceso de reparación tisular: el fibroblasto. Estas células son
elementos tejido-específicos que normalmente degradan
y sintetizan constantemente los diferentes elementos de
la matriz extracelular (MEC), pero también remodelan
los tejidos en reparación.3
INGENIERÍA TISULAR
El término ingeniería tisular fue acuñado por Fung en
1987 para designar a un área en expansión que está
asentada en los conocimientos básicos de la histología y
tiene por objetivo la construcción de tejidos nuevos, funcionalmente activos, a partir de células procedentes de
cultivos y de biomateriales que sirven de soporte. Desde
hace sólo veinte años, aproximadamente, se piensa en
la construcción de tejidos biológicos artificiales y su utilización terapéutica para restaurar, sustituir o incrementar las actividades funcionales de los propios tejidos
orgánicos.5
Farmacéutica. Lic. en Industrias bioquímico- farmacéuticas (UBA). Docente e investigadora de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la
Universidad J. A. Maza (Mendoza).
Doctor en Farmacia. Profesor Asociado Cátedra de Farmacotecnia Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA
Odontólogo. Doctor en Medicina. Docente Cátedra de Histología Facultad de Odontología. UNCuyo
Odontólogo. Especialista en Periodoncia. Docente Cátedra de Estomatología. Facultad de Odontología. UNCuyo
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FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012
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Actualmente, la ingeniería tisular se puede llevar a
cabo utilizando tres tipos de estrategias diferentes:
a. Ingeniería tisular por transferencia celular
(terapia celular)
En esta estrategia las células son primero aisladas,
mantenidas y tratadas in vitro y con posterioridad se
inyectan en la circulación sanguínea o implantan en
determinadas localizaciones del organismo. para poder
de ese modo, suplir la deficiencia estructural o funcional
que se hubiera podido producir en este tipo de células.
La transferencia de condrocitos autólogos para la reparación o sustitución de cartílago articular o de células
madre hematopoyéticas del cordón umbilical y de médula ósea, son algunos ejemplos de la utilización de este
tipo de estrategia.
b. Ingeniería tisular por conducción
La construcción de un nuevo tejido puede llevarse a
cabo fomentando la inducción del mismo en el seno de
nuestro propio organismo. Para ello existen diversas
posibilidades. Una sería utilizando los factores de crecimiento que son capaces de estimular a las células madre
pluripotentes o células madre progenitoras existentes en
la región en la que se desea crear el nuevo tejido, potenciando su diferenciación, proliferación y distribución en
el espacio, lo que puede llevarse a cabo directamente o
mediante la transferencia de células capaces de segregar
dichos factores. La matriz extracelular, ya sea como
material natural o como biomaterial elaborado de modo
artificial, también tiene en ciertos casos la propiedad de
inducir la formación de nuevos tejidos. Otra posibilidad
es la utilización de biomateriales y señales moleculares,
donde el primero actuaría como barrera creando un
espacio para facilitar el posterior crecimiento expansivo
del nuevo tejido; alternativa utilizada para el tratamiento
de la enfermedad periodontal bajo el nombre de regeneración tisular guiada.
c. Ingeniería tisular por elaboración de constructos
Se denomina constructo a la estructura que resulta de
la asociación de los tres elementos básicos: células, biomaterial y factores de crecimiento, en un dispositivo llamado biorreactor, utilizado para construir tejido artificial. Para construir este dispositivo es necesario, por lo
tanto, aislar las células del organismo y situarlas junto a
los factores de crecimiento sobre o dentro del biomaterial más adecuado al órgano o tejido que se desee construir. Se puede utilizar un solo tipo de células y un solo
tipo de biomaterial, como ocurre en constructos de piel
o mucosa en los que se utilizan fibroblastos y queratinocitos, o constructos de vasos arteriales, en los que las
células de elección son las endoteliales y musculares y
distintos tipos de biomateriales. El diseño y elaboración
de constructos debe intentar conseguir la naturaleza
estructural y funcional de los tejidos naturales, los tamaños y formas deseadas, la posibilidad de continuar su desarrollo una vez implantado en el organismo y la posibilidad de integrarse completamente en el huésped.
La construcción de tejidos artificiales en general y
bucodentales en particular, ha sido objeto de especial
interés en los últimos años con el objeto de su utilización
en terapéutica; para lograr este fin, debe entendérsela
como una nueva interdisciplina donde es fundamental
inmiscuirse en cada área de interés para conocer cada
detalle de la histología, anatomía y fisiopatología de cada
órgano o sistema que se quiere construir o reparar,
como así también de las técnicas y protocolos básicos
utilizados.
La generación de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular requiere, por tanto, aislar y cultivar células en
el laboratorio obtenidas de piezas anatómicas no cadavéricas y disponer de biomateriales capaces de sustituir a
las matrices extracelulares. Existen muchos tipos celulares que tienen capacidad de proliferación, especialmente
las células madres, y que pueden ser mantenidas y cultivadas en el laboratorio para ser utilizadas en ingeniería
tisular; para ello se requiere contar con una adecuada
fuente de células y elegir correctamente el tejido.
Gran parte de células que tienen capacidad de proliferación, especialmente las células madre, pueden ser mantenidas y cultivadas en el laboratorio para ser utilizadas
en ingeniería tisular, pero para ello se requiere contar
con una adecuada fuente de células.
A continuación, se describirá a los cultivos celulares especialmente a los cultivos celulares primarios- por ser
la biotecnología desarrollada en este trabajo experimental, a los biomateriales por ser uno de ellos el que se va
a probar y al Ligamento Periodontal Humano como fuente de obtención de células vivas, las mismas que en estado fisiológico se enfrentan al biomaterial cuando se quiere reconstruir los tejidos periodontales dañados o perdidos patológicamente.
1. Cultivos celulares
El cultivo de células (o cultivo de tejidos)
tiene su origen en el siglo XIX, cuando se comenzaron a estudiar
con cierto detalle los tejidos y órganos en vasos de
vidrio (tecnología in vitro). La mayoría de los medios utilizados actualmente para el cultivo de células se basan en
experiencias iniciales sobre la composición de soluciones que permitían que células obtenidas de tejidos
sobreviviesen fuera del organismo donante durante cortos períodos.
6
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G. DI FABIO DE COSSO y col.
Artículos originales
La incorporación de modificaciones que dieron lugar
a medios más sofisticados ha permitido que estas técnicas hayan alcanzado hasta el presente una gran evolución, ampliando así su campo de aplicación y desarrollo:
en la actualidad pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes.
El objetivo principal de estudiar las propias células
para saber cómo crecen, qué necesitan para su crecimiento, cómo y cuándo dejan de crecer derivó a otros
fines como la producción de vacunas, el desarrollo de
transgénicos, el estudio de: células tumorales y su relación con el ciclo celular, la maravillosa multiplicación a
partir un huevo fecundado, los enigmas todavía no descifrados de lo que hace a la diferenciación celular y las
perspectivas de creación de órganos y tejidos para trasplante.7 Por otra parte, tanto la tecnología de la fusión
celular como los ensayos de citotoxicidad son técnicas
de cultivo celular que, en cierto modo, han sido diseñadas para sustituir a la metodología in vivo.6
El uso de cultivos primarios para todo tipo de ensayos
ha tenido un desarrollo asombroso en los últimos años
y se puede consultar en la bibliografía un sinfín de trabajos que lo incluyen como una biotecnología imprescindible para estudiar toxicidades, compatibilidades y estructuras adecuadas para producción y elección de biomateriales en técnicas de regeneración tisular.8-18
Existen dos tipos básicos de cultivos celulares19: los
cultivos primarios y las líneas celulares. (Cuadro 1)
Cultivo primario es el primer cultivo in vitro de células tomadas directamente del organismo; es el cultivo
recién establecido, de vida corta, que generalmente se
pierde en los primeros pasajes, pero que durante los
mismos permite el estudio de las células en un estado
muy semejante al fisiológico. Si el cultivo logra establecerse da origen a una línea celular continua, todavía
diploide, que puede mantenerse por un número de pasajes limitado (alrededor de 50). Superada esta etapa, se
logra una línea celular continua establecida, que pierde la
diploidía inicial y teóricamente, puede mantenerse indefinidamente. Cuando las células son cultivadas como
línea celular continua, el fenotipo es diferente del tejido
original debido a que diversos factores, algunos desconocidos, que regulan forma, función y crecimiento in vivo,
están ausentes in vitro. Esto implica una desdiferenciación que es la pérdida de las propiedades fenotípicas asociadas a la célula madura y que puede darse cuando la
célula se maligniza o cuando, como en este caso, crece en
cultivo.
Los cultivos primarios pueden lograrse a partir de una
variedad de tipos celulares (fibroblastos, macrófagos,
células epiteliales, linfocitos, etc.), algunos de los cuales
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Cuadro 1. Clasificación de los cultivos de acuerdo
a su origen y adhesividad al sustrato
C L A S E S D E C U LT I V O S
CULTIVOS
PRIMARIOS
CELULAS QUE
CRECEN EN
SUSPENSIÓN
LINEAS CELULARES
PRE ESTABLECIDAS
(INMORTALIZADAS)
CELULAS QUE
CRECEN ADHERIDAS
A UN SUSTRATO
crecen y se desarrollan adhiriéndose a un sustrato por
lo cual se dice que dichas células son adherentes; en
nuestro caso, presenta tal condición el fibroblasto. Otras,
como los linfocitos y las derivadas de células tumorales,
no se adhieren al sustrato y crecen en suspensión.20
Cuando las células de un cultivo primario se ponen en
contacto con una superficie de vidrio o plástico, se
adhieren firmemente a ese soporte y se aplanan como
para ocupar una superficie máxima o monocapa.
La población celular de un cultivo primario tiene un
crecimiento limitado in vitro, conservando en sus divisiones las características fisiológicas y genéticas del tejido
de origen. Las subsiguientes divisiones de las células primarias tienden a la selección de un determinado tipo
morfológico y pueden seguir una multiplicación in vitro
durante muchas divisiones más manteniendo su característica euploide, aunque variando sus requerimientos
fisiológicos. Bajo la mayoría de las condiciones para el
crecimiento en cultivo, las células que mejor se multiplican tienen la forma ahusada y la tasa de desarrollo
correspondiente a células de tejido conectivo, razón por
la cual se las denomina fibroblastos. Sin embargo, se han
encontrado condiciones que promueven el crecimiento
selectivo de células, epiteliales, por ejemplo. La forma
que adoptan las células de una línea determinada depende en muchos casos de los medios de cultivo utilizados
para su desarrollo.
Para obtener un rendimiento óptimo del cultivo21 debe
tenerse en cuenta una serie de requisitos imprescindibles tales como suministrar el medio de crecimiento
adecuado y con la composición apropiada, renovándolo
convenientemente para asegurar el suministro de
nutrientes y la eliminación de los productos tóxicos del
metabolismo celular; establecer un equilibrio entre el
volumen del medio de cultivo y el espacio aéreo para
permitir el intercambio gaseoso entre ambos y determinar distintas variables que favorezcan el desarrollo del
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cultivo como cantidad de suero del medio, pH, temperatura óptima, cantidad de células sembradas.18
Las técnicas básicas para el cultivo primario de fibroblastos están ampliamente descriptas en la bibliografía
aunque con pequeñas diferencias con respecto a cada
autor. Las coincidencias encontradas (Cuadro 2) fueron el
medio de cultivo para fibroblastos: Medio Esencial
Mínimo modificado por Dulbecco (DMEM), la necesidad
de suplementar el mismo con Suero Fetal Bovino (SFB),
las condiciones de estufa gaseada a temperatura de 37°C
y 5% de CO2 y el estricto seguimiento de normas de
bioseguridad y uso de campana de flujo laminar en la
manipulación de los explantes.
Con respecto a las diferencias encontradas, la mismas
se refieren a la elección de los antibióticos (Cuadro 3)
tanto para preservar el explante desde su extracción
hasta su procesamiento como de los utilizados para adicionar al medio de cultivo, como también el medio de
transporte dado que en algunos casos se recomienda
HANK´S o HBSS y en otros solución fisiológica; además,
hasta se describen lavados de la muestra con hipoclorito de sodio al 1%, cosa que en este trabajo se descartó
por la posibilidad de toxicidad y muerte celular. En este
trabajo se optó por una combinación de Estreptomicina,
Anfotericina B y Penicilina G en cuanto a la selección de
antibióticos debido a que la cobertura que ofrecen es
compatible con la flora bacteriana oral y de HBSS como
solución de transporte y lavado por sus características
de pH fisiológico, y composición adecuada.
2. Biomateriales
Los biomateriales son compuestos de origen natural o
sintético que se utilizan con frecuencia en ingeniería tisular para sustituir la matriz extracelular del tejido a reproducir. Por ese motivo, la mayor parte de los biomateriales presenta una estructura que permite un adecuado
crecimiento de las células en su interior y/o en su superficie.4
Cuadro 2. Semejanzas y diferencias encontradas
entre las distintas propuestas existentes en la
bibliografía sobre las condiciones necesarias para el
cultivo de fibroblastos humanos
SEMEJANZAS
PROPUESTAS
DIFERENCIAS
ENCONTRADAS
■ Medio Esencial Mínimo modifi-
■ Elección de
cado por Dulbecco (DMEM)
■ Suero Fetal Bovino
■ 37°C y 5% CO2
■ Condiciones estrictas de
bioseguridad
antibióticos
La utilización de cualquier tipo de biomaterial en terapéutica ha de estar sometida a una serie de estrictos
controles que garanticen el cumplimiento de una serie
de indicadores de calidad:
✓ Biocompatibilidad o aceptación del organismo receptor. La
biocompatibilidad hace referencia a la capacidad de un
material a integrarse al organismo receptor sin causar daños
ni efectos secundarios indeseados.
✓ Ausencia de toxicidad o efectos secundarios indeseables.
✓ Ser estable e inerte químicamente.
✓ Cumplir los requerimientos biomecánicos necesarios para
llevar a cabo su función en el organismo.
✓ Facilidad de producción y procesamiento.
La ingeniería de tejidos buco-dentales artificiales por
ingeniería tisular ha sido objeto de especial interés en los
últimos años, con el objeto de su utilización en la terapéutica odontológica, aplicándose la ingeniería tisular por
inducción para la regeneración del periodoncio y la ingeniería tisular por elaboración de constructos para crear
sustitutos de mucosa bucal.
Por otra parte, los pacientes suelen presentarse para
tratamientos con implantes después que perdieron dientes y sufrieron resorción del reborde alveolar. Estos
casos obligan a realizar primero el aumento para reconstruir la pérdida ósea para luego colocar los implantes en
una posición guiada por la prótesis rehabilitadora. Las
terapias regenerativas tienen como objetivo la anatomía
local.22 La utilización de implantes dentales en pacientes
desdentados parciales y totales, con maxilares deficientes crea una nueva demanda de reconstrucción de hueso
previa o simultánea al tratamiento de implantes, en especial cuando se requiere una estética natural. Es característico que la pérdida ósea periodontal, la extracción
dentaria y el uso prolongado de aparatos protéticos
removibles por parte de los pacientes odontológicos
generen pérdida ósea alveolar que impide la colocación
de implantes en la posición prostética óptima.9 Mucho de
Cuadro 3. Antibióticos y concentraciones elegidos
para suplementar tanto al medio de transporte
como al medio de cultivo
Estreptomicina
Antibiótico aminoglucósido, 100 µl
bactericida extracelular
Anfotericina B
Antibiótico macrólido
y antifúngico
50 µl
Penicilina
Antibiótico bactericida;
activo frente a Gram(+)
100 µl
■ Medio
de transporte
■ Líquidos
para lavados
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G. DI FABIO DE COSSO y col.
Artículos originales
lo que se consigue con la cirugía de implantes y las técnicas de aumento de hueso se relacionan de manera
directa con los logros y conocimiento de la regeneración
ósea guiada. Desde el punto de vista histórico, el aumento o "regeneración" del hueso alveolar perdido por
extracciones dentarias, resorción o trauma representó
un desafío importante para los odontólogos.
A diferencia de otros tejidos, el hueso tiene la capacidad particular de regenerarse del todo. El factor limitante principal es el mantenimiento del espacio para la formación del hueso. Los materiales de injerto óseo se utilizan, entonces, para facilitar la formación de hueso en el
seno de un determinado espacio al ocupar ese espacio y
permitir el subsecuente crecimiento óseo (y la sustitución del injerto).23
Los mecanismos biológicos que fundamentan el
empleo de materiales de injerto óseo son la osteoconducción, la osteoinducción y la osteogénesis.24
La osteoconducción es la formación de hueso por
osteoblastos de los bordes de los defectos sobre el
material de injerto óseo. Los materiales osteoconductores sirven de andamio al crecimiento óseo, no inhiben la
formación de hueso ni inducen formación ósea. Sólo permiten que los osteoblastos formen hueso normal sobre
las superficies del material de injerto. Los materiales de
injerto óseo osteoconductores facilitan la formación
ósea al establecer un puente en el espacio entre el hueso
existente y una localización distante que de otro modo
el hueso no ocuparía.
La osteoinducción es la formación de hueso nuevo por
la vía de la estimulación de osteoprogenitores provenientes del defecto (o de los vasos) para diferenciarse en
osteoblastos y comenzar a formar hueso nuevo. Esta
inducción del mecanismo formador de hueso por células
que de otro modo permanecerían inactivas ocurre a través de mediadores celulares que "encienden" estas células formadoras de hueso, siendo a más estudiada, la familia de las proteínas morfogenéticas óseas.
La osteogénesis, en cambio, ocurre cuando osteoblastos viables son parte del injerto óseo como un trasplante óseo autógeno. Con irrigación adecuada y viabilidad
celular estos osteoblastos trasplantados forman nuevos
centros de osificación con el injerto. Así, además de la
formación de hueso por los osteoblastos, que ya están
presentes en el defecto, los osteoblastos que se agregan
como parte del injerto óseo también forman centros de
osificación y contribuyen a la capacidad total de formación ósea
Se utilizan muchos materiales de injerto como auxiliares en la reconstrucción de defectos óseos. Estos van,
de aloinjertos (derivados de la misma especie) a
Xenoinjertos (derivados de especies distintas) y
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Cuadro 4. Propiedades Biológicas de Diversos Materiales
de Injerto Óseo (Agrupados por clase de fuente)
Osteoconductor
Osteoinductor
Osteógeno
Aloplástico
Sí
No
NO
Xenoinjerto
Sí
No
No
Aloinjerto
Sí
Sí/NO
No
Autoinjerto
Sí
Sí
Sí
Aloplastos o materiales de Injertos sintéticos. Los materiales de injerto óseo tienen que ser, por lo menos, osteoconductores.
El biomaterial que utilizaremos en este estudio- sustancia comúnmente utilizada como andamio en defectos
óseos- consiste en una matriz ósea inorgánica de origen
bovino, en la cual se han eliminado todos sus componentes orgánicos, de tal manera que la composición química
es comparable a la del hueso humano, ya que presenta
una micro y macro estructura análoga con poros interconectados y consistencia semejante.25 Esto favorece el
crecimiento óseo en la zona implantada, remodelándose
gradualmente de forma fisiológica por los osteoclastos y
osteoblastos, lo que la convierte en una excelente alternativa cuando el empleo de hueso autógeno no está indicado o disponible.
Esta matriz es de uso profesional exclusivo y se presenta en forma de gránulos o bloques en el caso de que
la procedencia sea hueso esponjoso, o en gránulos solamente en el caso de que proceda de hueso cortical. En
este trabajo se eligió la forma granular procedente de
hueso esponjoso.
Procedencia de hueso Esponjoso:
Gránulos: Granulometría 0,25-1,0 mm y 1-2 mm en viales
estériles para único uso.
Bloques: de 1x1x2 cm / 1x1x3 cm.
Procedencia de hueso Cortical:
Gránulos: Granulometría 0,5-1,0 mm en viales estériles para
único uso.
3. Ligamento Periodontal Humano
El Ligamento Periodontal Humano es una delgada capa
de tejido conectivo fibroso, queune por medio de sus
fibras el elemento dentario al hueso alveolar que lo aloja.
Sus fibras principales se insertan por un lado, en el
cemento y por el otro, en la lámina cribosa del hueso
alveolar.
Artículos originales
Las funciones primordiales del ligamento periodontal
son:
✓ mantener al diente suspendido en su alvéolo.
✓ soportar y resistir las fuerzas empleadas durante la masticación.
✓ actuar como receptor sensorial propioceptivo, función necesaria para lograr el control posicional de la mandíbula y
una correcta oclusión.
Tiene diferentes denominaciones: periodonto, gonfosis,
membrana periodontal, ligamento alvéolo dental o desmodonto y se ubica en el espacio periodontal, que como
se indica anteriormente, está localizado entre la porción
radicular del elemento dentario y la compacta periodóntica del hueso alveolar, siendo sus límites a nivel del ápice
dentario el tejido conectivo pulpar, mientras que en la
parte superior se relaciona con el corion gingival.
Además de fijar el diente al hueso alveolar, el
Ligamento Periodontal tiene la función de soportar las
fuerzas de la masticación. Por este motivo, las fibras que
lo forman (colágenas) se parecen mucho a una cuerda
retorcida, en la cual las hebras individuales pueden ser
remodeladas de modo continuo sin que la fibra en sí
pierda su arquitectura y función. Estas fibras por lo general, se disponen oblicuamente entre el hueso y el cemento. El cemento, el ligamento periodontal y el hueso alveolar constituyen el aparato de sostén o periodoncio de
inserción.
Toda esta estructura está protegida por el denominado periodoncio de protección que comprende dos regiones:
✓ La encía que rodea al cuello dentario.
✓ La unión dento-gingival que une la encía a la pieza dentaria.
Estas estructuras aíslan al periodoncio de inserción del medio
séptico bucal.
El Ligamento, al continuarse con el tejido pulpar y con
el tejido conectivo de la encía y el de la unión dento-gingival, forma un conjunto estructural y funcional y, por
tanto, un solo sistema biológico. Clínicamente, esta relación es muy importante pues las infecciones que se producen aisladamente en cualquier lugar, pueden conectarse entre sí y extenderse a otras zonas, lo que constituye
las lesiones denominadas endo-periodónticas.
El Ligamento periodontal varía notablemente de un
individuo a otro, entre los distintos elementos dentarios,
y aún en las diferentes zonas de un mismo diente. Se
acepta que su espesor oscila entre los 0,10 y 0,38 mm.
Espesor:
Disminuye con la edad (ancho promedio de 0,20mm en
individuos jóvenes y de 0,15mm en personas > 50 años)
Aumenta con la función masticatoria: más ancho en dientes funcionales y más delgado en dientes disfuncionales o
retenidos.
Ancho:
Mayor en el extremo apical y cervical y menor en la
parte central.
Presenta una alta densidad celular, de las cuales los fibroblastos representan el 20% del total.
Los componentes estructurales del Ligamento periodontal, como todo tejido conectivo denso, son las células, las fibras y la sustancia fundamental amorfa. Además
posee vasos y nervios.
Los fibroblastos son las células del tejido conectivo
que secretan la mayoría de los componentes de la matriz
extracelular como proteoglicanos, glicosaminoglicanos,
fibras de adhesión y fibras de soporte, principalmente
colágeno fibrilar. Son células muy versátiles, que tienen la
capacidad de diferenciarse en otras células del tejido
conectivo en respuesta a un daño o estímulos adecuados. Existen evidencias de que los fibroblastos son células tejido específicas, es decir, que presentan diferencias,
dependiendo del tejido al que pertenecen.27
Los fibroblastos secretan colagenasa y otras metaloproteasas24, 26, 27 que permiten la renovación y reorganización constante del tejido conectivo normal en el adulto.9
Cuadro 5: Componentes principales del ligamento
periodontal humano
CÉLULAS
FIBRAS
Formadoras:
Osteoblastos
Fibroblastos
Cementoblastos
Colágenas
De Oxitalán
Resortivas:
Osteoclastos
Cementoclastos
Defensivas:
Macrófagos
Mastocitos
Eosinófilos
Restos epiteliales
de Malassez
Células Madres Mesenquimáticas
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G. DI FABIO DE COSSO y col.
Artículos originales
La importancia de este tipo celular en el Ligamento
Periodontal, además de su elevado porcentaje, se debe al
alto grado de recambio que experimenta el tejido periodontal, pues los haces de colágeno que lo forman, son
remodelados, removidos y reemplazados de modo constante. A diferencia de los que ocurre en el tejido óseo, la
síntesis y la degradación del colágeno en el ligamento es
llevada a cabo por un solo tipo celular que se podría
denominar fibroblasto o fibroclasto, según el momento
funcional en que se encuentre. A veces, estas dos funciones se realizan de manera simultánea. La síntesis implica
la participación del RER y el complejo de Golgi en la
producción y liberación de moléculas de tropocolágeno,
las cuales se polimerizan extra-celularmente para formar
las microfibrillas y luego las fibras de colágeno. Algunos
autores indican que el fibroblasto participaría en la configuración extracelular de las fibras de colágeno, lo que
sería de especial importancia en el ligamento periodontal. La degradación involucra dos fases: 1) la síntesis y
posterior liberación de la colagenasa, (enzima que digiere el colágeno y lo fragmenta en pequeñas porciones) 2)
La fagocitosis por parte de los fibroblastos de los restos
de colágeno degradados que son digeridos por medio de
sus lisosomas.
El remodelado de las fibras no se limita a una zona
media (plexo intermedio) como se interpretaba anteriormente, sino que puede ocurrir en todo el ancho del ligamento periodontal
Se ha comprobado que existe un equilibrio fisiológico
entre la elaboración y degradación de los componentes
para conservar la estructura normal del ligamento periodontal. Este equilibrio suele alterarse con la edad, aunque
el fibroblasto conserva un alto grado de actividad aún en
individuos adultos
Los fibroblastos del ligamento periodontal son, básicamente, similares a los del resto del organismo. Al MO
(microscopio óptico) un fibroblasto aparece fusiforme,
con extensiones citoplasmáticas ligeramente eosinófilas.
El núcleo, elíptico, grande, presenta cromatina laxa y dos
o cuatro nucléolos evidentes.
A: Cómo se vería
un fibroblasto al
microscopio óptico,
con núcleo grande,
ovalado y citoplasma
ahusado con
prolongaciones.
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FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012
Ultraestructuralmente, contiene todos los organoides
relacionados con la síntesis de proteína para exportación
(RER que alcanza el 5% del volumen celular, aparato de
Golgi, mitocondrias, vesículas secretoras, etc.). Presenta
también en su citoplasma un sistema de microtúbulos y
microfilamentos, muy desarrollados. Webb, ha descrito
en los fibroblastos del ligamento periodontal pero no en
los del conectivo gingival, la coexpresión de vimentina
(típico de células de origen mesenquimático y en vía de
maduración) y citoqueratina durante la fase de erupción
dental. Después de la erupción, desaparece la expresión
de citoqueratina.
Los fibroblastos se disponen paralelos a los haces de
fibras y en apariencia, sus prolongaciones envuelven a las
mismas. Su adherencia a las fibras se debe a la presencia
de una glicoproteína: la fibronectina. Esta disposición permite que durante los movimientos fisiológicos del diente
u ortodóncicos, los fibroblastos remodelen los haces de
fibras colágenas del ligamento.
Entre los fibroblastos del ligamento periodontal, además de contactos de membrana sin ninguna especialización, se observan uniones comunicantes y algunos desmosomas muy simples. Estos sistemas de unión solo se
observan en fibroblastos de tejido conectivo fetal, en cultivos y en los miofibroblastos de las heridas. Se ha tratado de explicar a través de estos contactos la coordinación de los fibroblastos del ligamento en la erupción y
en el rápido proceso de renovación del colágeno que
tiene lugar en este tejido.
El fibroblasto del ligamento periodontal presenta entre
otros, dos receptores de superficie muy característicos:
el EGF (factor de crecimiento epidérmico) y IL-1 (interleuquina 1). El incremento de este último estimula la actividad sintética del fibroblasto que entre otros productos
produce colagenasa e IL-6 (interleuquina 6). Esta última
sustancia estimula de forma significativa la actividad osteoclástica. Los fibroblastos del ligamento periodontal elaboran más IL-6 que los del tejido conectivo gingival. Esta
relación entre la producción de IL-1 e IL-6 puede ser
importante en la respuesta del tejido a las cargas orto-
B: Cómo se vería
un fibroblasto al
microscopio electrónico,
con numerosas mitocondrias, vesículas y
un gran aparato de
Golgi y Retículo
Endoplásmico Rugoso
(RER).
Artículos originales
dóncicas. Estudios recientes indican que los fibroblastos
del ligamento periodontal elaboran y segregan in vivo e
in vitro la proteína ligadora del calcio S100-A4. Dicha
proteína es uno de los componentes responsables de
inhibir la mineralización en el espacio extracelular del
ligamento periodontal. El ciclo de renovación del ligamento periodontal es de 45 días y la tasa promedio de
fibroblastos que se renuevan por día es del 2%.
Otros tipos de células formadoras presentes en el
Ligamento Periodontal son los Osteoblastos que se
encuentran cubriendo la superficie periodontal del hueso
alveolar (zona osteógena). Funcionalmente existen dos
tipos de osteoblastos, los activos que sintetizan continuamente laminillas óseas y los inactivos o de reserva. Las
células en reposo de la zona osteógena son activadas por
distintos estímulos como, por ejemplo, las fuerzas tensionales ortodóncicas. Los cementoblastos son células que
se distribuyen sobre el cemento, en especial sobre la
zona cementógena.
Dentro de las células resortivas consideraremos a los
osteoclastos, cuya presencia en el tejido normal se debe
a que permanentemente hay procesos de resorción y
aposición, para permitir los movimientos funcionales de
posición de los elementos dentarios y los cementoclastos (u odontoclastos dado que también pueden resorber
dentina): son células que solo aparecen en ciertos procesos patológicos o durante la rizoclasia fisiólogica de los
dientes temporales.
Entre las células defensivas, los mastocitos o células
cebadas son células que se hallan cerca de los vasos sanguíneos y que contienen gránulos densos de heparina,
histamina y enzimas proteolíticas. En ciertas condiciones
patológicas estas células presentan degranulaciones debido a lesiones tisulares, aunque su función en el tejido
periodontal es aún discutida. Los macrófagos son células
provistas de abundantes lisosomas que desempeñan una
función de desintoxicación y defensa del huésped, principalmente por su capacidad para ingerir, destruir y digerir
microorganismos y sustancias extrañas que podrían alterar el ligamento periodontal. La riqueza en lisosomas y la
presencia de microvellosidades facilita el diagnóstico
diferencial con el fibroblasto. Representan el 4% de la
población celular del ligamento periodontal. La distribución de los macrófagos en el ligamento periodontal es
heterogénea, encontrándose variaciones regionales de
densidad.
Las células o restos epiteliales de Malassez son posibles de hallar con frecuencia, en el ligamento periodontal, hacia el lado de la superficie cementaria, como nidos
o acúmulos celulares de naturaleza epitelial. Estas células
son restos desorganizados de la vaina epitelial de
Hertwig y su frecuencia y distribución cambia con la
edad, siendo más frecuentes en niños que en adultos y
hasta la segunda década de la vida se encuentran más
comúnmente en la región apical, pero con posterioridad
se localizan en la proximidad gingival, al lado de la cresta
alveolar. En esta región cervical, distintos autores sugieren que algunas células epiteliales de Malassez derivan,
presumiblemente, del epitelio gingival y del epitelio de
unión.
La morfología de las células epiteliales de Malassez
puede variar de acuerdo al plano de sección. En cortes
longitudinales o transversales se pueden observar al
microscopio óptico como cordones macizos de acúmulos celulares. En un corte tangencial, casi paralelo a la
superficie radicular, aparecen formando una red, cuya
malla se haya atravesada por fascículos de fibras colágenas cortadas de través. Estas células pueden ser escamosas (pavimentosas) o cilíndricas, con un núcleo prominente de cromatina densa. Al MET los grupos celulares
están aislados del tejido conectivo que los rodea por una
lámina basal similar a la que poseen las células epiteliales
de otras partes del organismo
Las células ectomesenquimáticas indiferenciadas son
células que se encuentran en gran cantidad en el tejido
conectivo periodontal. Son células pluripotenciales que
se sitúan alrededor de los vasos sanguíneos en una
extensión de aproximadamente 10µm.Tras la división de
estas células, una célula hija permanece en la zona perivascular y otra se diferencia hacia fibroblasto, cementoblasto u osteoblasto. Gould ha indicado que esta célula
madre posee en su citoplasma abundante RER y que en
ella comienza a sintetizarse el tropocolágeno. La interacción entre el estrés mecánico y el sistema EGF/EGFr
(factor de crecimiento epidérmico/receptores del factor
de crecimiento epidérmico), existente a nivel de estas
células, incide en el proceso de diferenciación celular de
esta población, regulando la función del ligamento periodontal como fuente de osteoblastos y cementoblasto
En el Ligamento Periodontal se encuentran distintos
tipos de fibras: colágenas, reticulares, elásticas, oxitalánicas y de la elaunina.
Las fibras colágenas representan la mayor parte del
componente fibrilar. Las fibras están constituidas por
colágeno tipo I (la más abundante), tipo III y tipo V. Al
margen de las fibras, en el Ligamento Periodontal se ha
detectado también colágeno tipoIV en las membranas
basales que rodean a las terminaciones nerviosas, los
vasos y los restos de Malassez y colágeno tipo VI en la
matriz extracelular. El colágeno tipo XII, que se describe
en los tejidos conjuntivos densos- ricos en colágeno tipo
I- ha sido identificado también en el ligamento periodontal después de la erupción dentaria. La interacción entre
la colágena tipo XII y los proteoglicanos parecen jugar un
papel importante en la organización final de este tipo de
tejidos
Las moléculas de colágeno ("tropocolágeno") que forman las fibras se agregan entre sí apenas son secretadas
constituyendo las microfibrillas del colágeno que poseen
41
G. DI FABIO DE COSSO y col.
Artículos originales
La sustancia fundamental o Matriz amorfa del Ligamento periodontal presenta, al igual que otros tejidos
conectivos, una elevada proporción de proteoglicanos,
sustancia compuesta por distintas cadenas de polisacáridos (glicosaminoglicanos -GAG-) unidas a proteínas.
una estriación transversal característica (con una periodicidad de 64 nm)
Las microfibrillas se agrupan en fibras, las cuales en el
ligamento periodontal se disponen en haces definidos y
presentan diferente orientación según las zonas del
Ligamento Periodontal. Cada fibra se parece a una cuerda retorcida y sigue un recorrido ondulado (la fibra es
flexible aunque muy resistente a la tracción). Ello permite cierto grado de movimiento al diente, pero a la vez,
por su gran resistencia a la tensión, oponer una firme
resistencia a movimientos de mayor intensidad.
Las microfibrillas individuales pueden ser remodeladas
de forma continua, en cualquier trecho de su recorrido,
mientras que la fibra mantiene su arquitectura y función
intactas. De esta manera los haces se adaptan a las continuas fuerzas que se aplican sobre ellos
A estos grupos de fibras con dirección definida se los
denomina fibras principales. Existen también fibras
secundarias, dispuestas desordenadamente entre las
principales.
Las fibras oxitalánicas y de elaunina se ponen de manifiesto con la técnica de Halmi con ácido paracético y fucsina aldehídica. Son consideradas fibras elásticas inmaduras. Las fibras de oxitalán ocupan el 3% del Ligamento
periodontal humano y siguen una dirección característica axial al diente con un extremo incluido en el cemento o en el hueso y el otro, generalmente en la pared de
un vaso sanguíneo o en el tejido conectivo que rodea a
las estructuras neurovasculares. Son más abundantes en
la zona del ápice y se cree que podrían tener la función
de sostener los vasos del Ligamento Periodontal y participar directa o indirectamente en el sistema mecanoreceptor del Ligamento Periodontal. Por tener propiedades semejantes a la fibronectina, algunos autores consideran que las fibras de oxitalán pueden ser importantes
en la emigración de los fibroblastos en el Ligamento
Periodontal. Con la edad, las fibras de oxitalán se hacen
más tortuosas y pierden parte de su elasticidad original.
Fibras reticulares y elásticas: son escasas. Por lo general se hallan formando parte de las paredes de los vasos
que irrigan el Periodoncio.
Materiales y Métodos
Se llevó a cabo un estudio de tipo experimental en el
laboratorio de Investigación de la Universidad J. A. Maza
con el fin de observar la influencia de una sustancia
comúnmente usada como andamio tisular en defectos
óseos sobre el comportamiento de las células del tejido
conectivo, y dentro de ellas su principal componente, el
fibroblasto, cuando se lo cultiva in vitro.
A partir de una muestra de ligamento periodontal consistente en un explante obtenido de una pieza dentaria
avulsionada por un profesional odontólogo con estricta
indicación de extracción por cuestiones ortodóncicas se
practican las técnicas básicas de cultivos celulares primarios para lograr un cultivo celular estandarizado y cuando se logra la confluencia adecuada, luego del primer
pase, se confronta con la sustancia comúnmente usada
como relleno en los defectos óseos
1. Obtención y transporte de muestras clínicas
Se tomaron 23 muestras de 11 pacientes jóvenes sistémica y periodontalmente sanos en los cuales se requería de exodoncia de premolares o terceros molares por
motivos ortodóncicos. Previamente se les hizo firmar un
formulario de consentimiento en el cual se informó de
las razones, propósitos y metodología a usar en este proyecto. (Anexo 1). Previo a la exodoncia se les indicó a los
pacientes la remoción de la carga bacteriana sobre la
superficie dentaria por los métodos mecánicos (cepillo e
interdental) juntamente con un enjuague enérgico con un
elemento antiséptico catiónico como es la Clorhexidina
al 0,12% asociado a Cetil-piridinio en forma de solución;
esto sin detrimento de la consideración de que el ligamento periodontal es un tejido no expuesto a la flora
METODOLOGÍA PARA CULTIVO DE FIBROBLASTOS GINGIVALES DESDE EXPLANTES
→
TRANSPORTE
EN S1
→
RASPADO
CON CURETA
→ CENTRIFUGAR
→
10`A 600 g
DESCARTAR
SOBRENADANTE
→
RESUSPENDER
EN S2
→
EXPLANTE
(MOLAR O PREMOLAR)
→
INCUBACIÓN
4 HS 37º C
RESUSPENDER
EN 53
→
→
S1: HANK’S + ATB# (Penicilina 100 Ul/Ml; Estreptomicina 100 µg/ml; Anfotericina B 25 µg/ml.
S2: HANK’S + Tripsina-EDTA (0,25% - 0,5 mM)
S3: DMEM + SFB 15% l-glutamina + ATB#
42
FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012
→
CULTIVAR EN ESTUFA
37º C 5% CO2 53
DESCARTAR
SOBRENADANTE
→
OBSERVAR AL MICROSCOPIO
RENOVAR EL MEDIO 53
CADA TRES DIAS
O SEGÚN NECESIDAD
CENTRIFUGAR
10’ 750 g
Artículos originales
indígena de la cavidad oral, en el caso de la elección de
las piezas dentarias para su exodoncia por motivos ortodóncicos.
La cirugía extractiva consistió en realizar una sindesmotomía que es una técnica quirúrgica que consiste en
liberar al diente, a nivel del cuello y en todo su contorno, de las inserciones ligamentosas que unen éste a la
encía. Se consigue introduciendo el sindesmótomo en el
surco gíngivo-dentario y recorriéndolo en todo su
entorno. El instrumento se introduce en el surco gingival
para separar o cortar las fibras que se insertan al margen
gingival en el cuello del diente y las fibras transeptales
que pasan de un diente al siguiente. Si esto se hace en
forma correcta, el diente solo queda unido al hueso por
el ligamento periodontal.
Los dientes inmediatamente extraídos se sometieron a
un proceso de desinfección y transporte en un medio
HBSS (Gibco) con antibióticos: 100 µl penicilina, 100µl
estreptomicina y 50 µl anfotericina (S1) con el fin de disminuir y evitar la presencia de microorganismos y conservar los especímenes durante el tiempo transcurrido
entre la exodoncia de éstos y su utilización para la
obtención de las monocapas celulares. Se mantuvieron
refrigerados entre 4 y 8 °C y por un período no mayor
a 4 horas. (Fig. 1)
El reclutamiento, evaluación y selección de los pacientes estuvo a cargo de un odontólogo especialista en
Ortodoncia, el examen periodontal, a cargo de un odontólogo especialista en Periodoncia y las cirugías de
extracción de las piezas dentarias, de una odontóloga
cirujana máxilo-facial.
2. Obtención de los explantes
Se lavaron y desinfectaron tres veces en HBSS más
antibióticos los dientes de los cuales se obtendrían las
muestras colocadas en cápsula de Petri estéril de 10 cm2
bajo campana de flujo laminar (Cabina de seguridad biológica Clase II/A. B3 SABELLA). Este líquido de lavado se
cargó en una jeringa estéril de 10 cc sin aguja, extrayéndose el líquido de lavado con pipeta estéril del mismo
volumen luego de uno o dos minutos de contacto, favoreciéndose el mismo con movimientos giratorios de la
cápsula de Petri. Luego se raspó el tercio medio radicular de la pieza dentaria extraída con curetas de Gracey
esterilizada- instrumento utilizado en Periodoncia para el
raspado y alisado radicular, (procedimiento quirúrgico
básico en la terapia periodontal)-, que consta de una sola
hoja de filo que es la que da al diente, y roma la que mira
al tejido blando en el ámbito de la bolsa periodontal, o
con hoja de bisturí N° 15 estéril, recogiéndose el material obtenido con micropipeta de 1000µl en un tubo
eppendorf que se llevó a centrifugación entre 600 y 750
rpm durante 10 minutos. (Centrífuga Gelec G142). Se
descartó el sobrenadante y se resuspendió el contenido
celular en la solución de disgregación (SED2): Hank´s +
Tripsina-EDTA (0,25%-0,5 mM)(0,1% Trypsin-EDTA 10x
15400 Gibco), llevándose a incubación a 37°C durante 4
horas, agitándose cada 20 minutos en vórtex. (Fig. 2)
3. Obtención de los cultivos primarios
Completada la disgregación con EDTA-Tripsina, se centrifugó nuevamente durante 10 minutos a 750-1000 rpm,
se descartó el sobrenadante y se tomó una alícuota para
hacer el recuento de células, previa tinción con azul tripán al 0,4% en PBS, en cámara de Neubauer para ajuste
de la suspensión a un número de células aproximadamente de 106 cél/ml
A estas suspensiones ajustadas se las colocó en cápsula de Petri de 5 cm2 y se les añadió inmediatamente el
medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM) (Invitrogen) suplementado con Suero Fetal
Bovino (SFB BioNos) y Antibióticos (Penicilina G 100 µl,
Estreptomicina 100µl y Anfotericina B 50 µl) (MP
Biomedicals) con una micropipeta calibrada en una cantidad aproximada de 1500 a 2000 µl, llevándose a estufa
de incubación a 37°C con 5% de CO2 (Thermo Electron
Corporation. Forma. Series 11 Water Jacketed CO2
Incubator HEPA Class 100). Las cajas se observaron bajo
microscopio invertido a las 24 horas después de haber
realizado el procedimiento, observando el comportamiento del cultivo, su potencial de crecimiento y capacidad de metabolizar el medio. Se siguió observando periódicamente, aproximadamente cada 3 días y de acuerdo al
resultado de estas observaciones se cambiaron los
medios de cultivo tantas veces como se consideró necesario retirándose el medio metabolizado y volviéndose a
colocar medio fresco con una pipeta Pasteur o micropipeta calibrada, previo lavado del cultivo con HBSS más
antibióticos, llevando un control riguroso del cultivo con
la utilización de un microscopio invertido, hasta obtención de la monocapa.
Este pasaje se realizó como se describe en la bibliografía: se retiró el medio de cultivo mediante una pipeta
estéril y se colocó EDTA-Tripsina 10X, cultivándose a
37°C durante 10-15 minutos, al cabo de los cuales se
colocó SFB para inactivar a la enzima y se dejó actuar 5
minutos más. Posteriormente se centrifugó a 700rpm
durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y el
contenido celular se resuspendió en medio de cultivo
suplementado con SFB y antibióticos.
4. Confrontación con andamio
Se agitó con Vórtex para homogeneizar y el volumen
obtenido se dividió en dos pozuelos: uno conteniendo sólo
los fibroblastos y el otro conteniendo además el andamio,
sustancia utilizada comúnmente como relleno óseo, homogéneamente distribuído en el fondo. (Fig. 3, 4, 5).
Estos procedimientos se repitieron con las últimas 11
muestras recolectadas según protocolo.
Dado que no se podía identificar a los fibroblastos por
medio de anticuerpos específicos por medios inmunohistoquímicos por razones económicas, se procedió a iden43
G. DI FABIO DE COSSO y col.
Artículos originales
tificarlos por métodos tradicionales de tinción con
Hematoxilina-Eosina. Para ello, cuando se consideraba
que ya había transcurrido un tiempo adecuado y previendo la declinación del cultivo por senescencia (aproximadamente 60 días) se procedió a la recuperación de las
células por el procedimiento enzimático descripto precedentemente (Tripsina-EDTA con incubación).
Una vez levantadas las células del sustrato que en este
caso de células adherentes es el pocillo de cultivo, se
recuperó el contenido del pocillo por aspiración con
pipeta. Se observó con lupa cómo las células perdían su
adhesión a la superficie, se redondeaban y parecían unirse entre sí. Se centrifugaron en tubos cónicos y descartándose el sobrenadante, se lavaron con Hank´s + antibióticos. Este procedimiento de lavado se repitió dos
veces. Finalmente, el contenido celular depositado se
recogió con ansa de platino estéril y se realizó el frotis
para hacer el teñido con Hematoxilina-Eosina, coloración
estructural, clásica, utilizada corrientemente tanto para el
estudio histológico como en el patológico. Consiste en la
aplicación de la Hematoxilina de Harris o de Mayer para
colorear los núcleos de azul (este colorante tiene carácter básico y el núcleo tiene carácter ácido por la presencia de los ácidos nucleicos) y la Eosina que es un colorante ácido tiñe el citoplasma y las fibras colágenas que
tienen carácter básico de color levemente rosa.
RESULTADOS
Hemos observado que con la técnica propuesta por
los trabajos descriptos en la bibliografía se puede obtener crecimiento y proliferación celular a partir de
explantes; las células obtenidas de ligamento periodontal
humano crecen y proliferan con buena adherencia en el
medio de cultivo D(MEM) como lo demuestran las imágenes tomadas mediante microscopía con cámara fotográfica (Olympus Stylus SCU840: zoom máximo por
aproximación al objetivo).
Se consideró que el cultivo registró aumento celular
coincidiendo con el aumento de la birrefringencia observada.
Imagen ampliada de un campo observado a 40X en
MO Olympus donde puede visualizarse a las células
como abultamientos refringentes un poco más claros.
También se ven haces de colágeno como cordones que
atraviesan el campo. (Fig. 6, 7, 8, 9)
Cuando se cultivan fibroblastos en presencia de una
sustancia ajena al medio de cultivo como lo es un biomaterial- en este caso, la matriz anorgánica proveniente de
hueso bovino desmineralizado-, éstos continúan su crecimiento y proliferación normal, sin evidenciar signos o
síntomas de toxicidad.
En las imágenes de la derecha se puede observar a los
fibroblastos distribuidos uniformemente entre los gránu44
FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012
Resumen de la actividad desarrollada: muestras, fechas de
obtención y procesamiento, dientes de los cuales se obtuvieron las mismas y resultados obtenidos.
MUESTRA
FECHA
EDAD
DIENTE
RESULTADOS
1
2y3
28/10/2010
8/11/2010
31
22
44
18 y 28
4y5
8/11/2010
14
14 y 24
6y7
16/5/2011
18
14 y 24
8
27/6/2011
25
3° molar
retenido
9,10,
11 y 12
1/8/2011
23
28, 18,
38 y 48
13 y 14
28/9/2011
28
34 y 44
15 y 16
18/11/2011
10
14 y 24
17 y 18
18/11/2011
25
18 y 28
19 y 20
24/5/2012
14
14 y 24
21,22
y 23
24/5/2012
18
28,18,
38 y 48
Contaminación
Muestra congelada.
Insuficiente cantidad
de células
Células de imágenes
compatibles con
fibroblastos. Se
mantuvieron en
cultivo durante 11
días en estufa
sin CO2
Muestra congelada.
Insuficiente
cantidad de células
Buena densidad
celular. A los 5 días
se pudo realizar
el 1° pase.
Células de imágenes
compatibles con
fibroblastos. Se
mantuvieron en
cultivo 60 días.
Buen crecimiento
1° y 2° pase.
Confrontados con
andamio
Buen crecimiento
1° y 2° pase.
Confrontados con
andamio
Buen crecimiento
1° y 2° pase.
Confrontados con
andamio
Buen crecimiento
1° y 2° pase.
Confrontados
con andamio
Buen crecimiento
1° y 2° pase.
Confrontados
con andamio
los de andamio conformando una suerte de red que
coincide con los hallazgos clínicos histológicos en animales de experimentación.1 (Fig. 10, 11, 12, 13, 14,15, 16,17)
Por otra parte, las cubetas que contenían andamio en
la placa de 6 pozuelos que se muestra a continuación
(imagen I: pozuelos A´, B´ y C´), presentaron una distri-
Artículos originales
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 6.
45
G. DI FABIO DE COSSO y col.
Artículos originales
bución homogénea y fija de andamio, que no se modificaba con el movimiento de la placa, lo que puede significar
que los fibroblastos como células adherentes, fijan a los
gránulos de matriz ósea bovina para formar tal enrejado,
ya que en las cubetas que contenían andamio sólo
(Imagen II: cubetas sin letras de la hilera inferior), éste se
desplazaba al ritmo del movimiento del fluido (en este
caso, el medio de cultivo). (Fig. 18, 19, 20)
El análisis histológico de las células, que se realizó por
la tinción Hematoxilina-Eosina arrojó las siguientes imágenes donde puede observarse a los núcleos teñidos de
azul y los citoplasmas en rosa pálido con forma ahusada.
DISCUSIÓN
Con este trabajo experimental cualitativo se logró
desarrollar y establecer una técnica de cultivo de células
de ligamento periodontal humano in-vitro óptima para su
crecimiento y mantenimiento que permitieron probar la
ausencia de toxicidad de un material utilizado en la práctica clínica para la regeneración ósea, ya que las imágenes
del cultivo en presencia del andamio muestran un desarrollo celular normal con buen crecimiento y proliferación. Los cultivos se pudieron mantener viables durante
2 pasajes más (alrededor de 60 días).
Las observaciones recogidas del seguimiento diario
permitieron corregir errores de las técnicas propuestas
tanto para la ejecución de las tareas propiamente dichas
específicas de cultivo como para las accesorias referidas
a la preparación de las soluciones, manejo de instrumental y muestras. Cabe destacar que aunque en la
Universidad J. A. Maza hay grupos de investigación que
trabajan con cultivos celulares- lo que permitió que se
contara con la infraestructura necesaria- ninguno de
ellos lo hace con cultivos primarios sino con líneas establecidas, por lo que la conformación de un nuevo grupo
insumió un tiempo precioso dentro del plazo acordado
por la beca otorgada por la Secretaría de Ciencia y
Técnica de la universidad mencionada.
Por otra parte, la coordinación del trabajo de laboratorio con la clínica es una tarea, sino ardua, por lo menos
compleja, ya que el reclutamiento de los pacientes debe
coincidir con su buen estado de salud y la cirugía se
debe realizar en un horario conveniente para que se
pueda procesar la muestra en tiempo y forma.
46
FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012
Quedan como tareas pendientes mejorar la captura de
imágenes ya que no se pudo medios inmunohistoquímicos porque no se pudo adquirir el kit de anticuerpos
para identificar fibroblastos. ✒
Nota: esta publicación fue editada del trabajo original,
especialmente para odontólogos y sólo refleja aspectos
de interés para los mismos. Para mayor información, pueden comunicarse con: gracieladifabio@umaza.edu.ar
AGRADECIMIENTOS
A los Profesores Dr. Marcelo Carlos Nacucchio y Dr.Walther
Zavala, directores de este trabajo, que con su dedicación y
sabios consejos acompañaron este estudio interdisciplinario
biotecnológico que relaciona a la Farmacología, la
Odontología en su especialidad de Periodontología y la
Biología Celular.
A la Dra. Galia Rossi, médica y cirujana máxilo-facial y al Dr.
Daniel Ferri por su aporte en el material de experimentación.
Al Hospital J. N. Lencinas en las personas: Dra. Mariela
Amprimo, Jefa del Laboratorio de Anatomía Patológica y su
colaboradora Srta. Ana Monge y Sra. Susana del Laboratorio
de Bacteriología.
A la Universidad Juan Agustín Maza por habernos elegido
como grupo de investigación para la Convocatoria del año
2010 y habernos confiado sus instalaciones, personal y patrimonio. Especialmente a la Sra Decano de la Facultad de
Farmacia y Bioquímica Farm María Gabriela Giornelli, a la
Ingeniera Amanda Di Fabio, a la Jefa del Laboratorio Central
Farm Stella Galfré y su cordial y atento grupo de colaboradores, quienes de manera incondicional y solícita supieron
acompañar y allanar todas las dificultades.
Al laboratorio Pharmatrix por facilitarnos el producto farmacéutico que se ha utilizado en este trabajo.
A los Profesores y técnicos del Laboratorio de Cultivos
Celulares del Departamento de Química Biológica de la
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad
de Buenos Aires: Dra Nélida Candurra, Juan Claus, Silvia
Coronato, Celia Coto,Viviana Castilla, Andrea Barquero, Carlos
Pujol y Luis Scolaro.
Al Dr. Adolfo Aragonés, quien con su entusiasmo permanente
supo alentarme para seguir adelante siempre.
Muchas gracias a todos.
Artículos originales
Cultivadas solo con
medio de cultivo
Cultivadas en presencia
de andamio
MUESTRA N° 21
2° pase
Figura 10
Figura 11
MUESTRA N° 22
2° pase
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
MUESTRA N° 23
2° pase
Figura 16. Foto de un cultivo en 2° pase con andamio visto en
MO 40X. Nótese que no aparecen imágenes compatibles con
cordones o haces de colágeno y que pareciera que los fibroblastos se insertan en el mismo gránulo conformando un continuo
de células adheridas al sustrato que en este caso se trata del
fondo del well tapizado con andamio
Figura 18
Figura 17. Foto de un cultivo en 2° pase con andamio.
Nótese la distribución de las células aún sobre el gránulo de
andamio.
Figura 19
BIBLIOGRAFÍA
1. CARIDE, F.; LAGUENS, M.; CARIDE, E. Estudio histomorfológico
del comportamiento de un relleno óseo, proveniente de hueso
bovino desproteinizado de origen nacional. Estudio de experimentación en ratas. Trabajo presentado en la XXVII Reunión
Anual de la Sociedad Argentina de Periodontología
2. POLLARD, J.; WALKER, J. Basic Cell Culture Protocols. Methods
in Molecular Biology. 2º Ed
3. LEAL, L.; PERDOMO, S.; SPINEL,C.Aislamiento y cultivo de fibroblastos endoneurales. Acta Biológica Colombiana, Vol 9 Nº2,
2004-57
4. GOMEZ de FERRARIS, Mª E.; CAMPOS MUÑOZ,A. Histología,
Embriología e Ingeniería Tisular Bucodental. Ed. Panamericana.
3ªEd. 2010.
Figura 20
Para consultar la bibliografía completa ver nuestra página web:
www.fundacioncarraro.org
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G. DI FABIO DE COSSO y col.