Amplificacin de un fragmento del gen 16S rADN mediante la tcnica de PCR

RESUMEN En los diferentes laboratorios de la dcada de los 80, un nuevo estndar para la identificacin bacteriana comenz a desarrollarse, demostrando que las relaciones filogenticas entre los organismos procariotas se pueden determinar por medio de la comparacin de una parte estable del cdigo gentico. La parte del ADN ms utilizada para propsitos taxonmicos en bacterias es el gen rADN 16S, el cual contiene regiones altamente conservadas que permiten establecer la relacin taxonmica entre familias, clases y filos, adems posee regiones variables que permiten diferenciar una especie dentro del mismo gnero. En el presente trabajo se amplific una regin del gen rADN 16s mediante la tcnica de PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa), se prepararon tres tratamientos, dos controles positivos, 1 y 2 (CP1 y CP2), con una muestra de ADN y un control negativo (CN) sin ADN. En el proceso de PCR se emplearon 30 ciclos y posteriormente realiz una corrida electrofortica con gel de agarosa al 1%, el mismo que no mostr la amplificacin de los fragmentos.

INTRODUCCIN Para la amplificacin de segmentos especficos de ADN en una secuencia de ADN

se aplican diferentes tcnicas, entre las ms usadas tenemos: PCR (Polymerase Chain Reaction)

Es un mtodo in vitro de sntesis de ADN con el que un segmento especfico de ADN es amplificado (Rodrguez etal.; 2004). Este mtodo, segn Rodrguez etal.; (2004) consta de 25 a 35 ciclos repetitivos, cada ciclo se conforma de tres pasos: Denaturacin de las cadenas molde: Se rompen los puentes de hidrgeno del ADN, incubndolo a una temperatura alrededor de 95C, por un minuto o menos. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. Alineacin de primers: Se hibridan las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los cebadores o primers, a una temperatura que ayuda el apareamiento de bases nitrogenadas complementarias de ambas clases de ADN (ADN blanco y Primer). Esta temperatura depende de la temperatura de fusin de los primers, la cual oscila entre los 50 y 60 C. Elongacin: Se efecta a 72C, temperatura a la cual la polimerasa extiende la longitud de los primers, aadiendo los nucletidos segn la complementariedad de la cadena molde. Isothermal

Temperatura constante (60-65C) Accin de dos o tres primers Una polimerasa diferente de la Taq polimerasa que se usa en PCR

Aqu se usa la Bst polimerasa, que adems de la actividad de polimerizacin de los nucletidos, tiene la capacidad de abrir las cadenas dobles de ADN sin la necesidad de calentamiento. La reaccin se la puede detectar por la reaccin de Luciferinaluciferasa (Rojas, 2009). Se disean cuatro primers (FIP, F3, BIP y B3) que reconocen 6 distintas regiones en el gen de inters. Los productos de amplificacin tienen una estructura que consiste en repeticiones invertidas y alternadas de la secuencia a amplificar en la misma cadena (Puray, S/A).

LCR (Ligase Chain Reaction) Segn Chvez etal.; (2006), la LCR es una tcnica que sirve para detectar y amplificar secuencias diana de ADN, donde primero se sintetizan dos oligonucletidos que sean complementarios a la secuencia diana completa, uno por el extremo 5 y el otro por el 3. Si la secuencia diana se encuentra en la muestra de ADN que se est examinando, los oligonucletidos se fijan a ella reuniendo sus extremos en el centro y, mediante una ligasa termoestable, se unen para formar un polinucletido completo. El ligamiento no se producir si la muestra no contiene la secuencia diana o si el empalme entre la secuencia diana y los oligonucletidos es imperfecto (Chvez etal.; 2006). Sometido a una temperatura elevada, el nuevo polinucletido se disocia del molde de ADN original; despus de bajar la

LAMP (Loop-mediated Amplification)

La amplificacin isotrmica (60-65 C) consiste en convertir, en forma cclica, material gentico plasmoidal de doble hebra y a partir de ella, realizar la transcripcin a ARN, el cual sirve de templado para un nuevo ciclo de amplificacin (Kievits etal., 1991). Segn Rojas (2009), en la tcnica LAMP la secuencia de ADN molde se amplifica siguiendo estos parmetros:

temperatura, ste y el ADN original servirn de moldes para un segundo ciclo de hibridacin, ligamiento y disociacin trmica. En cada ciclo se duplica el nmero de nuevos polinucletidos completos (Chvez etal.; 2006). El objetivo de la prctica es amplificar el fragmento 16s de 1000 - 1500 pb de eubacterias mediante PRC.

Primer R dNTPs MgCl2 DDW

10-100 pmol/Rx 200400M (mix) 1.5-3.5mM --2.5-7.5 % TOTAL

100 pmol/L 20mM (mix) 25mM --60% (en agua)

20pmol /Rx 200M 1.5mM --5%

0.2 0.5 3 26.5 4.2 50

Condiciones termociclador MATERIALES Y MTODOS Preparacin de controles Para realizar la amplificacin del fragmento entre 1000 y 1500 pb del gen 16s rADN, se prepar una solucin master mix por triplicado de las concentraciones detalladas en la tabla N 1 sin considerar el ADN. Con un volumen final de 135L de la misma, se tom 90L para los controles positivos CP1 y CP2 adicionando 10L de ADN, as se obtuvo dos controles de 50L cada uno y 45 L de master mix para el control negativo, al cual se le adicion 5L de DDW. Para realizar la PCR convencional bifsica se consideraron las condiciones detalladas en la tabla N 2, en base a un programa previamente estandarizado en el laboratorio: Tabla N2: Condiciones termociclador Etapa Denaturacin inicial Denaturacin HibridacinExtensin Extensin final Mantenimiento Nmero Temperatura Tiempo de (C) (min) Ciclos 96 96 66 72 4 4:00 0:30 1:30 2:00 10:00 30 1 1 1

Tabla N1: Clculos para la preparacin de los tratamientos

Electroforesis en geles de agarosa Con la finalidad de comprobar el peso molecular del fragmento amplificado se realiz una electroforesis horizontal con gel de agarosa al 1% a 100V, 300mA durante 1 hora. RESULTADOS

Conc. Recomen. 10050ng/Rx 1-5 u/Rx 5x 10x 10-100 pmol/Rx

Conc. Stock 15ng 5 u/L 5x 100 pmol/L

Conc. Final 75ng/Rx 2u/Rx 1x 20pmol /Rx

Volumen (L) 5 0.4 10 0.2

Buffer Primer F

En la Imagen 1 se puede apreciar que no se obtuvo resultado alguno en la amplificacin del gen 16S ribosomal (rADN16S) tanto en el CP1 como en el CP2.

MgCl2, que pueden reducir la eficiencia de amplificacin o generar productos inespecficos; tambin la desnaturalizacin del ADN polimerasa, inhibir la sntesis de los fragmentos de ADN. Tomando en cuenta estas consideraciones y al observar que no se produjo resultado alguno en ambos controles positivos, se presume una serie de factores que afectaron la amplificacin del gen, como son: haber tenido daos por factores mecnicos gracias a una manipulacin excesiva de la muestra, la susceptibilidad del DNA para ser desnaturalizado por rupturas de la cadena, as como tambin la desnaturalizacin del DNA polimerasa, en el momento que se homogeniz el master mix en la mini centrifuga, inhibindose la polimerizacin del gen 16s y por ende, una ineficiencia en la amplificacin del gen. Se puede descartar contaminacin por parte de la muestra que contena el gen 16S ribosomal, y de los reactivos utilizados, ya que no se amplific ninguna banda correspondiente al negativo (CN); por lo que se presume haber tenido un dao mecnico de la muestra por el exceso de manipulacin. CONCLUSIN No se pudo visualizar ninguna banda resultante de la electroforesis en ambos controles positivos (CP1 y CP2), ya que no se obtuvo la amplificacin gen 16S ribosomal, presumiblemente por daos mecnicos en la manipulacin de la muestra. REFERENCIAS Valderas, K. Universidad Austral de Chile (UACH). 2012. Caracterizacin de Cepas de Bacillus Aisladas de Muestras de Miel y de Colmena Mediante la Secuenciacin del Gen Ribosomal 16S. [en red]. Disponible

Imagen 1. Electroforesis horizontal en gel de agarosa, de la amplificacin del gen 16S ribosomal (16s rADN) en el CP1 Y CP2 que se muestra sin resultado alguno, mientas que el CN se encuentra ausente de ADN. El marcador utilizado fue AXYGEN 1kb leader

DISCUSIN Dorado (2009), menciona que existen muchos factores que pueden afectar a la eficiencia de la tcnica de PCR, entre los cuales se considera: la contaminacin del ADN que se va amplificar, la cual puede inhibir el ADN polimerasa; asimismo concentraciones demasiado altas o bajas de

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