Aplicacion CO2 Supercritico

7
~1 ti
41
t %J
ti
4cfC/L/
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA
Dpto. de NUTRICION Y BROMATOLOGA JI
1<
4k,
~~
i<
<ti
1k
<1
44
APLICACION DEL DIOXIDO DE CARBONO SUPERCRITICO AL PROCESADO DE
Lv
ALIMENTOS: NATA, SUBPRODUCTOS DEL REFINADO DE ACEITES VEGETALES Y ZUMO DE NARANJA

Pon cnne ?r flr.
-4 1
O> O
<ti>
11
iL
Sr. Dr.
41
vc.
O
t:
sn Dr
ji-..
4
1
U~c /: Sn Dr /~jzr-/9 /!Ch~ Li
Voc&: Sr Dt
Secr&tatiw 5;. Dr.
tV4~<
$44
1 O 11>
<
1 O
PEDRO RUIZ SALA Madrid, 1996
4 Ii
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

Dpto. de NUTRICION Y BROMATOLOGA II
APLICACION DEL DIOXIDO DE CARBONO SUPERCRITICO AL PROCESADO DE ALIMENTOS: NATA, SUBPRODUCTOS DEL REFINADO DE ACEITES VEGETALES Y ZUMO DE NARANJA
PEDRO RUIZ SALA Madrid, 1996
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas INSTITUTO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES ~ ,k c/. Juan de la Cierva, 3-28006 Madrid. Espaa CSiflj Tel (34-1>562 2900- Telefax (34-1)5644853
GUILLERMO SANTA-MARA BLANCO, Dr. EN CIENCIAS QUMICAS, INVESTIGADOR CIENTFICO DEL INSTITUTO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES DEL C.S.I.C.
CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado Aplicacin el dixido de carbono supercrtico al procesado de alimentos: nata, subproductos del refinado de aceites vegetales y zumo de naranja, y que constituye la memoria que presenta D. Pedro Ruiz Sala para optar al grado de Doctor en Farmacia, ha sido realizado en los laboratorios del Departamento de Tecnologas Sectoriales bajo mi direccin.
Y para que as conste firmo el presente certificado en Madrid a diecisiete de octubre de mil novecientos noventa y seis.
Guillermo Santa-Maria Blanco
Este trabajo ha sido realizado en el instituto de Fernentaciones industriales del Consejo Superior de investigaciones Cientficas, bajo la direccin del Dr Guillermo Santa-Mara Blanco, investigador Cientfico del CSJC, a quien agradezco su esfuerzo y espritu crtico en la realizacin de esta Tesis.
Tambin me gustara expresar mi agradecimiento:
A la Dra. Afaria Teresa Orzez Villanueva. del Departamento de Nutricin y Bromatologa JI de la Facultad de Farmacia, por haber aceptado ser ponente de esta Tesis.
A la Dra. Carmen Polo Snchez, Directora del instituto de Fermentaciones industriale.~ donde se ha realizado el presente trabajo experimental, por lasfacilidades con que he contado para el mismo.
/11 Aiinisterio de Educacin y Ciencia, por la concesin de una beca de Formacin del Personal lnvestigado; lo que posibilit llevar a cabo esta Tesis DoctoraL 11 Dr. Agustn Ola,w Villn, Profesor de investigacin del cSJC, por su asesoramiento en jodo momento. A las doctoras isabel Martnez Castro, M0 Carmen Gmez-Cordovs de la Vega y U0 Luisa Jimeno I-ferranz por su asesoramiento durante algunasfases de este trabajo.
Al Dr. lviurat Balaban por aceptarme durante mi estancia en la Universidad de Florida. A Conan, tambin a Diego, Pedro, AJercedes, Bridget y todas las personas que hicieron tan agradable el tiempo pasado en Gainesville.
A Julin Pastot PO). haber sido tanta su imprescindible ayuda. A Ivaribel Jimnez, por su ayuda desinteresada y por haberme presentado a sus padres
A mis compaeros A!ayte, Mag Al0 Carmen, Nieves, Elena, Toi, AIarta, Pepa, Mara, Ninj, Daniel, LoII, Amado y a lodos los dems <le instituto de Fermentaciones industriales que me han dejado con un imborrable bmen recuerdo.
Ai.y especialmente a Conchi y a Cristina, que siempre y en todo mo,nento han estado y estarn conmigo. A Ricardo, Raquel, Jon, Juani, Susana, David, Lourdes, Esther y a todas las personas que inc han hecho pasa buenos momentos durantes estos cuatro aos. A Alaria y a Federico, por ser tan encantadores y por esas tardes inolvidables de los sbados frente al piano. A Carlos, estupendo compaero durante la interminable SS. A Jacinto, que est conmigo en este ltimo ao de mi Tesis. A misfamiliares de Madrid, por su apoyo, sobre todo en mis comienzos. A mifamilia, que me ha visto tan poco estos aos.
NDICE
ABREVIATURAS Nomenclatura de los cidos grasos Otros trminos
CAPTULO
1.
INTRODUCCIN.
EXTRACCIN
CON
FLUIDOS 1 2 2 4 7
SUPERCRTICOS 1,1. FLUIDOS SUPERCRITICOS 1. 1. 1. Definicin de fluido supercrtico 1.1.2. Propiedades de los fluidos supercrticos 1. 1.3. Principios de la extraccin supercrtica
1.2.
APLICACIN
A LOS
ALIMENTOS
DEL DIXIDO
DE
CARBONO 13 13 14 16 17 17 18 18
SUPERCRITICO 1.2. 1. Aplicacin de la extraccin con dixido de carbono supercrtico 1.2.1.1. Grasas vegetales y animales 1.2.1.2. Procesado de ctricos 1.2.2. Aplicacin de la extraccin a nivel industrial 1.2.2.1. Descafeinizacin del caf 1,2.2.2. Extraccin del lpulo 1.2.2.3. Extraccin de especias
1,2.3. Aplicaciones no convencionales del dixido de carbono supercrtico al procesado de ctricos 1.2.4. Otras aplicaciones del dixido de carbono supercritico 19 20
21
OBJETIVOS
PLAN DE TRABAJO
22
CAPTULO 2. APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE CARBONO SUPERCRTICO A LA MODIFICACIN DE GRASA LCTEA EN
2.1, INTRODUCCIN 2.1.1. Lpidos 2.l.1.l.cidosgrasos 2.1.1.1.1. cidos grasos saturados 2.1.1.1.2. cidos grasos monoinsaturados 2.1.1.1.3. cidos grasos poliinsaturados 2.1.1.1.4. cidos grasos ramificados
2.1.1.1.5. cidos grasos con otros grupos funcionales
24 24 24 25 25 26 26 27 27 27 28 29 29 29 30 31 32 33 33 34
2.1.1.2. Lpidos simples 2.1.1.2.1. Triglicridos y compuestos relacionados 2,1.1.2.2. Esteres de esteroles 2.1.1.2,3. Otros lpidos simples 2.1.1.3. Lpidos complejos 2.1. 1.3.1. Glicerofosfolpidos 2.1.1.3.2. Gliceroglicolpidos 2,1.1.3.3. Esfingolpidos 2.1.1.4. Composicin de la fraccin insaponificable 2,1.1.4.1. Monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos 2,1.1.4.2. Triterpenos 2.1.1.4.3. Carotenoides
2.1.1.4.4. Esteroides 2.1.2. Composicin de la leche 2.1.2.1. Composicin de la grasa lctea 2.1.3. Composicin de las leches de vaca, oveja y cabra
34
35 36
41
2.1.4. La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares 2.1.4.1, Valor nutritivo de la leche 2.1.4.2, La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares 2.1.5. Las posibilidades del uso de la grasa lctea modificada 2.1.5.1. Adicin de otras grasas 2.1.5.2. Fraccionamiento 2.1.5.3. Hidrogenacin 2.1.5.4. Interesterificacin 2.1.5.5. Biomodificacin 2.1,5.6. Aplicacin de la grasa lctea modificada 2.1.6. Tecnologas para la obtencin de productos bajos en colesterol 2.1.6.1. Mtodos microbiolgicos 2.1.6.2. Adsorcion 2. 1.6.3. Manipulacin de la alimentacin animal
43 43 44 46 47 48 49 49 49 SO 51 51 51 52
2.1.7. Anlisis de los cidos grasos de los alimentos por cromatografla de gases 52 2.1.7.1. Preparacin de la muestra 2.1.7.2. Sistema cromatogrfico 2.1.8. Anlisis de los triglicridos por cromatografia lquida de alta eficacia 2.1.8.1. Sistema cromatogrfico 2.1.8.2, Anlisis cuali-cuantitativo 53 55 57 59
59 2.1.9. Espectroscopia de resonancia magntica nuclear de 3C de alta resolucin en lpidos 62 2.1.9. i. Estudio de la grasa lctea 2.1.9.2. Estudio de aceites vegetales 2.1.9.3. Estudio de aceites de pescado 63 65 66
ESTIMACIN DE LA COMPOSICIN EN TRIGLICRIDOS DE LA GRASA LCTEA
67
2.2. MATERIALES Y MTODOS 2.2.1. Preparacin de la muestra
67 67
2.2.2. Anlisis de los triglicridos de grasa lctea por cromatografia lquida de alta eficacia 2.2.3. Recogida de fracciones 68 69
2.2.4. Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones de HPLC por cromatografia de gases 2.2.4.1. Preparacin de la muestra 2.2.4.2. Sistema cromatogrfico 2.2.4.3. Anlisis cualitativo 69 69 70 71
2.2.4.4. Anlisis por cromatografia de gases acoplada a espectrometra de masas (GC/MS) 2.2.4.5. Anlisis cuantitativo 2.2.5. Desarrollo de modelos matemticos 72 73 74
2.2.6. Estimacin de la composicin en triglicridos de la grasa lctea de leche de oveja 78
2.2.7. Comparacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de oveja, cabra y vaca 79
2.3. RESULTADOS Y DISCUSIN
80
2.3.1. Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones de HPLC por cromatografia de gases 2.3.1.1. Anlisis cualitativo 2.3.1.2. Anlisis por GC/MS 2.3.1.3. Anlisis cuantitativo 2.3.2. Anlisis cualitativo de los triglicridos de la grasa de leche de oveja 2.3.2.1. Aplicacin de los modelos matemticos 80 80 80 86 87 87
2.3,2.2. Estimacin de la composicin en triglicridos de grasa lctea ovina 97 2.3.3. Comparacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de oveja, cabra y vaca 116
APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE CARBONO SIJPERCRTIcO A LA MODIFICACIN DE GRASA LCTEA EN NATA 122
2.4. MATERIALES Y MTODOS
122 122 122 124 125 125 125 126 126 127 127
2.4.1. Preparacin de la muestra 2.4.2. Descripcin del equipo de extaccin 2.4.3. Optimizacin del flujo de CO2 supercrtico 2.4.4. Optimizacin del volumen de CO2 supercrftico 2.4.5. Determinacin de la grasa de la nata 2.4.6. Medida de la humedad de la nata 2.4.7. Anlisis de colesterol por cromatografia lquida de alta eficacia 2.4.7.1. Obtencin de la fraccin insaponificable de la nata 2.4.7.2. Anlisis de colesterol por HPLC 2.4.8. Anlisis de triglicridos por cromatografia lquida de alta eficacia
2.4.9. Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin de grasa de nata sin y con adicin de bolas de vidrio 127
2.5. RESULTADOS Y DISCUSIN 2.5.1. Optmizacin del flujo de CO2 supercrtico 2.5.2. Optmizacin del volumen de CO2 supercrtico 2.5.3. Efecto en la extraccin de grasa 2.5.4. Efecto sobre la humedad de la nata 2.5.5. Efecto sobre la extraccin de colesterol 2,5.6. Efecto sobre la extraccin de triglicridos 2.5.7. Selectividad del CO2 supercritico en la extraccin de colesterol
128 128 130 130 135 137 142 147
ANLISIS POR ESPECTROMETRIA DE 3C-RMN
149
2.6. MATERIALES Y MTODOS 2.6.1, Preparacin de la muestra y extraccin de la grasa de la nata
149 149
2.6.2. Anlisis de los extractos mediante espectrometra de resonancia magntica nuclear de SC 149
150
150
2.7.1. Anlisis de los extractos mediante espectrometra de resonancia magntica nuclear de 3C
CAPITULO 3. APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE CARBONO SUPERCRTICO A LA MODIFICACIN DEL DESTILADO DE LA DESODORIZACION DE ACEITES VEGETALES 163
3.1. INTRODUCCIN 3.1.1. Los aceites vegetales 3.1.2. El aceite de oliva 3.1.3. Aceites de semillas oleaginosas 3. .4. Desodorizacin del aceite de oliva
164 164 164 165 166
ANLISIS DE LOS COMPUESTOS DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE DEL DESTILADO

DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA EFICACIA
168
3.2. MATERIALES Y MTODOS 3.2.1. Preparacin de la muestra 3.2.2. Descripcin del equipo 3.2.3. Anlisis cualitativo
168 168 169 170
3.2.3.1. Eleccin de la columna 3.2.3,2. Eleccin de la fase mvil 3.2,3.3. Eleccin del gradiente 3.2.3.4. Eleccin de la temperatura de la columna 3.2.3.5. Anlisis estadstico 3.2,4. Anlisis cuantitativo 3.2.4.1. Estudio del detector. Anlisis estadstico 3.2.4.2. Linealidad de la respuesta 3.2.4.3. Clculo del factor de respuesta 3.2.4.4. Precisin del mtodo
170 171 171 172 172 173 173 177 177 178
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.3.1. Anlisis cualitativo
178 178
3.3.1.1. Anlisis estadstico en la eleccin de la columna y la fase mvil 178 3.3.1.2. Eleccin del gradiente 3.3.1.3. Eleccin de la temperatura de la columna 3.3.2. Anlisis cuantitativo 192 199 199
3.3.2.1. Anlisis estadstico en el estudio de la respuesta del detector.., 199 3.3.2.2. Linealidad de la respuesta 3.3.2.3. Factor de respuesta 3.3.2.4. Precisin del mtodo ANLISIS POR ESPECTROMETRA DE 3C-RMN 3.4. MATERIALES Y MTODOS
205
212 212 214
214
216
APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE CARBONO SUPERCRTICO AL DESTILADO DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES VEGETALES
225
3.6. MATERIALES Y MTODOS 3.6.1. Descripcin del equipo extractor 3.6.2. Optimizacin en la preparacin de la muestra
225 225 225
3.6.3. Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin del desfilado de la
desodorizacin de aceites vegetales 3.6.4. Modificacin del equipo de extraccin
227 228
3.7, RESULTADOS Y DISCUSIN 3.7.1. Optimizacin en la preparacin de la muestra 3,7.2. Modificacin del equipo extractor
229 229 229
3.7.3. Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin de los compuestos de la fraccin insaponificable del destilado de la desodorizacin de aceites vegetales 237
CAPTULO 4. APLICACIN DEL DIXIDO DE CARBONO SUPERCRTICO A LA INACTIVACIN DE PECTINESTERASA EN ZUMO DE NARANJA 247
4.1. INTRODUCCIN. LOS CTRICOS 4.1.1. Composicin de los ctricos 4,1.2. Sustancias pcticas 4.1.2.1. Estructura y composicin 4.1.2.2. Ocurrencia y propiedades 4.1.3. Enzimas pcticos 4.1.4. Pectinesterasas en ctricos 4.1.4.1. Isoenzimas 4.1.4.2. Estabilidad de los isoenzimas 4.1.4.3. Estabilidad de la turbidezy actividad pectinestersica
248 248 251 252 253 255 257 258 259 260
4.2. MATERIALES Y MTODOS 4.2.1. Preparacin de la muestra
260 260
4.2.2. Efecto sobre el zumo de naranja del tratamiento con dixido de carbono en condiciones supercrticas 4.2.3. Determinacin de la actividad pectinestersica 4.2.4. Medida de la turbidez 4.2.5. Medida del color 4.2.6. Efecto del almacenamiento sobre la turbidez y el color 261 263 263 264 266
266
4.3.1. Efecto del tratamiento con dixido de carbono supercrtico sobre la inactivacin de la pectinesterasa de zumo de naranja 266
4.3.2. Efecto del tratamiento con dixido de carbono supercrtico sobre la modificacin de la turbidez del zumo de naranja 268 4.3.3. Efecto del tratamiento con dixido de carbono supercrtico sobre la modificacin del color del zumo de naranja 270
4.3.4. Modificacin de la turbidez y et color del zumo de naranja durante el almacenamiento 278
CONCLUSIONES
281
BIBLIOGRAFA
283
ANEXOS
300
ABREVIATURAS
NOMENCLATURA DE
LOS CIDOS GRASOS
al = ante/so alMa aPd br Bu Ca

= =
anleiso-margrico anteiso-pentadecanoico
al- 17:0
al- 15:0
ramificado Butrico Cprico 4:0 10:0 8:0 6:0
CI = Caprlico Co = Caproico = so Ma
L
= =
so-margrico
-17:0 9c, 12c- 18:2 12:0 9c, 12c, 15c-18:3 14:0 17:0 9c-14:l 9c-l8: 1 16:0 9c-16: 1 15:0 18:0 11t18:1
Linoleico
=
La
Lurico
Ln = Linolnico M = Mirstico Ma Mi O
P
= =
Magaiico Muistoleico
Oleico Palmtico
Pa
Pairnitoleico
Pd = Pentadecanoico 5
=
Esterico
V = irans-vaccnico
OTROS TRMINOS
3C-RMN = Resonancia magntica nuclear del 3C DDG = Destilado de la desodorizacin de aceite de girasol DDO
=
Destilado de la desodorizacin de aceite de oliva

=
FAME
ster metilico de los cidos grasos
FC = Fuerzas de cizallamiento
GC
Cromatografia de gases
HPLC = Cromatografa lquida de alta eficacia MUFA MS NC ND

= =
cido graso monoinsaturado
Espectrometra de masas Nmero de carbonos Nmero de dobles enlaces

=
NEC
Nmero equivalente de carbonos
NP = Nmero de particin
PUFA = cidos grasos poliinsaturado
SC
Tratamiento con CO
=
2 supercrtico
TCN
TG
=
Nmero terico de carbonos
Triglicrido
TIC = Corriente total de iones UFA

=
cidos graso insaturado
Captulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercr(ticos
Captulo 1. introduccIn, Extraccitin confluidos superoriticos.
1.1- FLUIDOS SUPERCRTICOS
1.1.1- Definicin de fluido supercrtico
Se puede definir fluido supercrtico como aquel que est sometido a condiciones de presin y temperatura por encima del punto crtico, siendo ste el punto designado por una temperatura crtica (Te) y una presin crtica (P0), por encina del cual no puede haber una liquefaccin al elevar la presin o vaporizacin al aumentar la temperatura. La figura 1.1. 1 respresenta un diagrama de fases donde se destaca la existencia de la regin supercrtica sobre el punto crtico.
El punto critico es caracterstico de cada sustancia. La tabla 1. 1.1 recoge la temperatura y presin crticas de varios de los solventes ms utilizados. La densidad en el punto crtico se denomina densidad crtica (Pc).
Tabla 1.1.1. Condiciones crticas de varios solventes Compuesto

T~ ( K (MPa) Pc (gImL) 0C)
CCIF3
28,8 21,48 0,58
CO2
31,1 7,20 0,47
SE6
45,5 3,80 -
C51112
196 3,29 0,23
1120
347,2 21,48 0,32
Las propiedades de los fluidos supercrticos son expresadas frecuentemente en trminos reducidos ms que en absolutos. Un valor reducido se define como el cociente entre el valor absoluto considerado y el valor correspondiente al punto crtico. Por tanto, si la presin y temperatura reducidas (Pr y T~) son superiores a la unidad, la sustancia en cuestin se haya sometida a condiciones supercrticas.
Captulo i. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
o
0
\QX
PC
Pc
GAS
Temperatura
Figura 1.1,1. Diagrama de fases slido-lquido-gas-tluido superertico. PT = punto triple, PC = >unto crtico, Pc = presin crtica, Tc = temperatura
crtica.
..~J~S.
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercritlco&
1.1.2- Propiedades de losfluidos supereriticos
La figura 1.1 .2a resume las propiedades bsicas y de mayor utilidad de los fluidos
supercrticos. Los fluidos supercrticos poseen unas propiedades fsico-qumicas intermedias entre las de los lquidos y los gases (tabla 1.1.2).
Tabla 1.1.2. Propiedades fisico-quimicas de los gases y los lquidos en comparacin con las del dixido de carbono supercritico. Densidad Gases CO 2 superertico T0, P0 TQ,6P 0 (g/mL) (0,1-2) i03 0,47 1,0 0,6-1,6 Viscosidad (g/cms) (1-3) io4 3 x io~ 3 1x10 (0,2-3) i02 Coeficiente de Difusin (cm2/s) 0,1-0,4 2>< l&
(0,2-2) io-~ 7 x 0 4
Lquidos
La densidad del fluido supercrtico es de 100 a 1000 veces mayor que la de un gas, y comparable a la de un liquido. En consecuencia, las interacciones moleculares pueden ser fuertes permitiendo acortar las distancias intennoleculares (Knowles y col., 1988). Como resultado, las propiedades de solvatacin son similares a las de los lquidos, pero con viscosidades significativamente ms bajas y coeficientes de difusin ms altos. Al ser de 10 a 100 veces ms bajos los valores de viscosidad y de lO a 100 veces ms
altos los coeficientes de difusin respecto a los de los lquidos hacen que la transferencia de masa de solutos en extracciones con fluidos supercriticos sea significativamente ms
alta que la de extracciones con lquidos (Schneider, 1978).
ii-lay que resaltar que la variacin de la densidad no es lineal respecto a la variacin de temperaturas y presiones sobre el punto crtico. La figura 1. 1 .2b describe un diagrama de fases con las variables reducidas. En puntos cercanos al crtico pequeas variaciones de la
4
Captulo 1. introduccin. Exlraccicin confluidos supercriticas.
poder solvente
variable
densidad
variable
buenas caractersticas dinmicas

41
compresibilidad
ty4
baja viscosidad
alt a
difusividad
muy baja tensin superficial
propiedades de tr an sp o rte
penetrabilidad
Figura 1.1.2a. Caractersticas principales de los fluidos supercrticos.
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
presin a temperatura constante proporcionan grandes variaciones de la densidad. A presiones distantes de la crtica el aumento de la densidad no es tan acusado.
1.1.3- Principios de la atraccin supercrftica
La extraccin con fluidos supercrticos es una tcnica que estudia las propiedades solvatantes de un fluido por encima de su punto critico.
La habilidad de un fluido supercrtico para la solubilizacin de slidos fue ya sealada por Hannay y Hogarth en 1879 al solubilizar sales metlicas en etanol en condiones supercrticas. Sin embargo, hasta los aos cincuenta no aparecen estudios sobre aplicaciones industriales, concretamente para eliminar las fracciones ligeras del residuo de la destilacin del crudo, A partir de los 70, La aplicacin de los fluidos supercriticos a la industria agroalimentaria es uno de los ms importantes centros de atencin por parte de las investigaciones.
En comparacin con otros tipos de extraccin, las principales ventajas de la que utiliza fluidos supercrticos son:
1. menores tiempos de extraccin,
2. uso, generalmente, de un fluido no txico, no inflamable o no colTosvo. 3. extraccin a temperaturas sin afectacin de compuestos termolbiles,
4, fcil separacin de los solutos del fluido supercritico. Esto no es posible en las extracciones convencionales en muchos casos, lo que crea contaminaciones indeseables del producto,
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
5. alta pureza del solvente, 6. posibilidad de realizar fraccionamientos,
7. posibilidad de seleccionar el tipo de extaccin eligiendo la polaridad del fluido,
su densidad y la utilizacin o no de modificadores,

8. bajo coste del solvente.
Las ventajas de la extraccin con fluidos supercrticos provienen de las propiedades antes comentadas y de la compresibilidad. Segn McHugh y Krukonis (1986) los grandes
cambios de densidad del fluido y, en consecuencia, el poder de solvatacin, pueden ser

realizados mediante pequeos cambios en la presin a temperatura constante al haber una gran compresibilidad si se trabaja a temperaturas prximas a la crtica.
Al depender la fuerza solvatante de un fluido supercrtico de su densidad, la posibilidad de solvatacin de un finido supercrtico hacia una sustancia en particular puede ser modificada fcilmente cambiando la presin de extraccin y, en menor medida, la temperatura. Esto hace que la extraccin con fluidos supercrticos sea selectiva.
Adems, con la propiedad de que la transferencia de masa est mejorada, el uso de la extraccin con fluidos supercrticos proporciona tiempos de extraccin ms breves y una eficiencia de extraccin mejorada por una mejor penetracin en la matriz (Wright y col., 1987).
Schneider (1978) descubri que el poder solvente de un fluido supercrtico no poda ser explicado exclusivamente desde el aumento de densidad. El poder solvente de estos fluidos depende de dos efectos:
.1
.~
~~~~trt ~.. .u~qy qrw
~w,
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
efecto de estado, que depende el estado fisico del fluido supercrtico y su
principal variable es la densidad,
efecto qumico, que define la intexTelacin entre el fluido supercrtico y el soluto.
Es diferente para cada soluto y depende de su polaridad, propiedades cido-bsicas y de la fomacin de puentes de hidrgeno.
En general, un incremento de la presin a temperatura constante produce un incremento en la solubilidad del compuesto pero disminuye la selectividad (Zadow, 1988). El efecto de la temperatura sobre la solubilidad es ms complejo, ya que sta puede aumentar,
disninuir o permanecer invariable con el aumento de temperatura a presin constante.

Este comportamiento viene dado por un factor predominante, que puede ser la presin de vapor del soluto o la densidad del solvente. A bajas presiones, la solubilidad disminuye
levemente con el aumento de temperatura; a altas presiones, aumenta marcadamente. El

primer efecto se debe a la disminucin de la densidad, el segundo se debe a que hay un importante aumento de la presin de vapor del soluto frente a la pequea variacin de la densidad del solvente en esta zona de altas presiones. Con una densidad detenninada, la
solubilidad aumenta con la temperatura (Luque de Castro y col., 1994).

La estructura qumica del soluto tambin es un factor a tener en cuenta a la hora de mejorar su selectividad, De modo esquemtico se pueden citar los siguientes grupos funcionales de los solutos y su efecto beneficioso o adverso sobre su solubilidad en CO2 supercrtico: aumentan la so/it bu/dad:
-
msaturaciones, ramificaciones, esterificaciones, eterificaciones,
Capltulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
disminuyen la solubilidad:
-
el aumento del peso molecular, aromaticidad, hidroxilos, carboxilos, halgenos, amnas, nitroderivados.
Se puede concluir que la eleccin de un fluido supercrtico depende de:
a.- la polaridad del soluto, b. poder solvente y selectividad requeridos,

-
c.- estabilidad trmica del compuesto a extraer a la temperatura de operacin,
d.- limitaciones instrumentales, que se asocian a la presin crtica de algunos fluidos,
e.- toxicidad del fluido superciltico.
Nonnalmente, el fluido supercrtico es utilizado a una temperatura poco mayor a su temperatura crtica y a una presin significativamente mayor a su presin crtica (Brignole y col., 1987).
Se ha estudiado una gran variedad de fluidos supercrticos para la extraccin que cubre un amplio rango de temperatura y presin crticas, pesos moleculares y polaridad (Hoyer, 10
>.
~.r
Caplulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
1985). El dxido de carbono es el ms usado por tener una presin crtica moderada (7,2
MPa) y baja temperatura crtica (3 1 0C), siendo de eleccin para la extraccin de compuestos termolbiles. Sin embargo, el CO 2 tambin tiene sus limitaciones, sobre todo para la extraccin de compuestos polares. La tabla 1.1.3 lista una serie de fluidos
supercrticos usuales con sus ventajas e inconvenientes, El agua no es usada por las dificultades tcnicas que supone trabajar a presiones por encima de su punto crtico. Actualmente, un tema de gran inters es la correlacin y prediccin de equilibrios de fases a alta presin. Ya se han descrito un gran nmero de diagramas de fases para mezclas binarias (fluido supercrtico y compuesto slido o lquido) (Schneider, 1978), aunque la prediccin de los equilibrios no est todava satisfactoriamente resuelta. Y, por supuesto, mucho ms complejos son aquellos sistemas para mezclas ternarias. Aunque de la misma forma que para los equilibrios lquido-lquido y lquido-slido, para los sistemas ternarios o ms complejos se comprueba que los fluidos supercrticos son disolventes especficos que permiten realizar una extraccin selectiva o un fraccionamiento.
Sin embargo, en 1982, Chrastil desarroll una ecuacin para predecir, en un sistema binario, la solubilidad de un compuesto en un fluido supercrtico. Esta correlacin emprica es a la vez de simple, relativamente fiable. Chrastil compar, asimismo, los datos con los obtenidos experimentalmente en su laboratorio y con datos de la bibliografia en una amplia variedad de compuestos y en un gran rango de presiones y temperaturas, resultando haber acuerdo entre los resultados. La ecuacin es la que se expone a continuacin:
C = pke<~~~ (1,1)
donde C = concentracin de un soluto en el fluido supercrtico (gIL), p = densidad del fluido (g/L),
constante,
11
o
rL
ca
o o
u, o he
-4
1~
4->
o
u, o
1
o
3-
a> u
u,
E
u, o
a
t
o
-4 a)
u,
ti,
he
o o
u,
11
o u
4
u,
O
o he 6
u
6 &
rL u,
II
-4->
a>
u, a) he u,
E
o
u,
~ a)
o e
o
~
~1 ~
u,
1
-4
iI!i
a).
a)
4-
yo
o
~ 4-
co
II c~ u
a
; he ~ E
2
o ~ :~ ~
~
00
he
-4
II
he he
3
o. o 3-
u, a) he he a)
u,> he ~
a>
cE
o o
g ~
u
he
he
O ch>
.~
a
o E
he
he 1~
o>
o
12
Captulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
a = AH/R, siendo AH el calor de reaccin total y R la constante de los gases,

b
=
Ifl(Ma
kMh)
q-kln<Mb), siendo M~ y Mb los pesos moleculares del soluto y
del gas y q otra constante.

Otros autores han utilizado la ecuacin de estado de Peng-Robinson para predecir equilibrios de fases de sistemas binarios con resultados satisfactorios (Sigmund y Trebble, 1992).
1.2- APLICACIN A LOS ALIMENTOS DEL DIXIDO DE CARBONO SUPERCR[TICO .2.1- Aplicacin de la extraccin con CO2 supercrrtico
A continuacin se detallan los procedimientos de extraccin supercrtica aplicada en el campo de los alimentos. Algunos investigadores realizan experiencias utilizando patrones de compuestos o mezclas de stos, sin embargo, Nilsson y Hudson (1993) resaltan que los datos obtenidos de esta manera poseen un bajo valor predictivo para un posterior estudio con mezclas complejas, siendo entonces muy necesario realizar las experiencias con muestras reales desde un principio.
Exlraccin comp/cia
Requiere condiciones de presin y temperatura mximas. La temperatura mxima de operacin generalmente depender de las propiedades fisicoqumicas del sustrato a
extraer, mientras la presin mxima de operacin vendr limitada por el diseo del equipo extractor,
13
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrltlcos~
Fraccionarnlenlo
Se lleva a cabo mediante una serie de pasos bajo diferentes condiciones de presin y
temperatura. Desodorizacln
Las condiciones para la desodorizacin son menos fuertes que las utilizadas para la extraccin completa o el fiaccionamiento ya que el objetivo es la extraccin de aquellos
compuestos ms solubles.
Muchos ejemplos de este tipo de aplicacin estn incrementndose en el campo de los productos naturales, especialmente en el de la industria alimentaria. Aqu, el CO2 tiene ms ventajas sobre otros solventes gaseosos o lquidos por las causas citadas anteriormente.
El CO2 supercritico es preferible al lquido ya que las sustancias a ser extradas son
mucho ms solubles, la relacin de extraccin seria de 2,5 veces ms alta dada la mayor difusividad en las condiciones supercrticas, y hay un mayor rango de posibles temperaturas para operar.
1.2.1.1 Grasas vegetales y animales

-
El rea ms investigada a nivel de planta piloto y escala semipreparativa es la extraccin de aceites de origen vegetal (Hubert y Vitzthum, 1978; Stahl y col., 1980; Bulley y col., 1984; Christianson y col., 1984; List y col., 1984; Taniguch y col., 1985; Dakovic- y col., 1989; Polak y col., 1989).
Friedrich y List (1982) y Zhao y col. (1987) pusieron de manifiesto que el aceite obtenido con CO2 supercrtico a partir de la soja y del salvado de arroz tema una serie de ventajas en relacin al obtenido con un solvente orgnico como el hexano. As, observaron que el 14
Capitulo 1, introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
contenido en hierro y fsforo era ms bajo, fundamentalmente debido a la baja solubilidad de los fosfolpidos en el CO2 supercrtico frente a los triglicridos. Por otra
parte, el aceite era menos coloreado, lo que conleva la no necesidad de refinamiento. Esto tambin era debido a la baja solubilidad de los carotenos y otros pigmentos. Otros estudios se encaminan a la purificacin de lpidos polares, como el de Weidner y col.
(1993), que consiguen optimizar las condiciones en un sistema continuo en contracorriente para el desengrasado de soja, de esta fonna obtienen un extracto oleoso que no contiene lecitina, mientras que el residuo del aceite original est compuesto prcticamente por ste fosfolipido. Compuestos antioxidantes, como los tocoferoles
tambin son objeto de estudio para la extraccin con fluidos supercrticos (Lee y col,,
1991, a partir de aceites de semillas) y pigmentos, como los caroteniodes a partir de zanahorias (Barth y col., 1995; Vega y col., 1995). Estos ltimos realizaron extracciones utilizando etanol como modificador para facilitar la extraccin de los carotenos, partiendo
de subproductos de industrias productoras de zumo de zanahoria.
En los ltimos aos, el desarrollo de nuevas tecnologas para intentar extraer el colesterol de la grasa se justifica dado el papel que ste desempea en la aparicin de trastornos cardiovasculares. Estos estudios se han realizado principalmente en huevo (Froning y col., 1990; Hung y Unger, 1995), estudiando tambin la afectacin de las proteinas
(Amtfield y col., 1992) y grasa lctea, pero tambin en otros alimentos, como en poio (Froning y col., 1994). Otros estudios se han encaminado hacia la obtencin de grasa modificada de origen lcteo o marino para conseguir extractos y fracciones de diferente composicin y caractersticas fisicas (Kaufmann y col., 1982; Shishikura y col., 1986; Yamaguchi y col,, 1986; Hardardottir y Kinsella, 1988). Algunos de los trabajos estudian la obtencin de grasa lctea modificada a partir grasa anhidra realizando diferentes tipos de fraccionamiento, obteniendo resultados bastante similaies, en los que las fracciones obtenidas a bajas densidades estaban enriquecidas en triglicridos de cadena corta y, amenudo, media, mientras que las fracciones obtenidas a altas densidades eran ricas en triglicridos de cadena larga por estar agotado el resto de triglicridos en el residuo. La extraccin de colesterol alcanza su mximo rendimiento en las primeras fracciones (Arul 15
CapItulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
y col., 1987 y 1988; Bradley, 1989; Kankare y col., 1989; Haminam y col., 1991; Chen y col., 1992a).
La obtencin de extractos ricos en cidos grasos poliinsaturados esenciales es otros de los objetivos de los investigadores. Muchos de los trabajos realizados en este campo estudian la extraccin selectiva de cidos docosahexanoico y eicosapentanoico a partir de aceites de pescado (Byeung, 1993; Jungro, 1993; Mishiay col., 1993; Temelli y col., 1995).
Otros nuevos estudios sobre la utilidad de la extraccin con fluidos supercrticos se encamina hacia el aprovechamientos de subproductos que sean ricos en compuestos de inters, como lo es el escualeno en la industria de los cosmticos y los esteroles como metabo]itos relacionados en la biosntesis de hormonas esteroideas. Bondioli y col., 1992; 1993) estudiaron el destilado de la desodorizacin de aceite de oliva (subproducto con una fraccin mayor de material insaponificable que el aceite virgen) como posible fuente de estos compuestos tras la realizacin de ensayos de extraccin con dixido de carbono supercritico.
1 2.1.2- Procesado de ctricos

Eliminacin de amargos
Kinball (1987) utiliz el dixido de carbono supercrtico para la extraccin de triterpenos amargos, principalmente la limonina de zumo de naranja. Utiliz temperaturas de 30 a 60 0C y presiones de 21,4 a 42,8 MPa, Los resultados concluyeron que la temperatura no tena un efecto significativo en la extraccin de limonina, pero si era efectivo el aumento de la presin. Tambin se extraa limoneno en bajas cantidades, pero no haba cambios de pH, cido ascrbico, contenido en pulpa, aminocidos y porcentaje de cidos,
16
fui
. ift. ~
1.
gIli#
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrit/cas.
Extraccin o concentracin de aceites esenciales de ctricos
Los aceites esenciales de ctricos son mezclas de mono y sequiterpenos, compuestos oxigenados y un residuo no voltil (Temelli y col., 1988). Los aromas de limn fueron
extrados por Kalra y col, en 1987; utilizaron presiones entre 9,31 y 10,69 MPa y temperaturas de 50, 60 y 80 0C. Observaron que un aumento de temperatura hizo aumentar la extraccin de limoneno y citral selectivamente segn las condiciones, as, es posible extraer selectivamente los componentes del limn y fraccionar los extractos.
Temelli en 1987 observ que, en general, los compuestos terpnicos eran ms solubles en dixido de carbono que los compuestos oxigenados. Esta conclusin es razonable, ya que los terpenos son compuestos apolares, tienen bajo peso molecular y alta presin de vapor, siendo ms solubles en dixido de carbono superortico; por tanto, la mayor parte del extracto es limoneno. Las condiciones pueden ajustarse a 70 0C y 8,3 MPa para minimizar los compuestos del aroma perdidos por la extraccin.
Favati y col. en 1988 extrajeron carotenos y lutena de concentrados de protenas de hojas por CO 2 supercritico. Se piensa que estos mtodos se pueden usar para la extraccin de
carotenoides de subproductos de naranjas.
1.2. 2- Aplicaciones de la atraccin a nivel industrial
1.2,2.1-
Descafeinizacin del caf
Este proceso se est utilizando de forma comercial en Alemania desde 1978. El proceso, segn Zosel (1978), consiste en una extraccin a partir de caf verde en remojo con CO2
0C que se recicla continuamente. En una torre de agua se produce la a 16-22 MPa y 90 despresurizacin, donde se acumula la cafena en una operacin que dura 10 It La cafena se recupera por destilacin. El contenido de cafena de los granos desciende desde un 0,7-3% hasta un 0,02%. La cafena se extrae selectivamente, no se extraen
17
~q~j
1a.S L.wnqurn
Capitulo 1. introduccin. Extraccin con fluidos superoriticos.
sustancias que contribuyen al aroma del caf. Tambin se puede conseguir la recuperacin del soluto por adsorcin sobre carbn activo.
1.2.2.2-
Extraccin del lnulo
El lpulo es el ingrediente responsable de las caractersticas aromticas y el sabor amargo de la cerveza. Sus constituyentes principales son las humulonas y lupulonas. Ambos son cidos grasos insaturados con alrededor de 25 tomos de carbono y grupos carbonilo e
hidroxilo, se extraen bien con CO2 supercrtico. Para la extraccin las bolitas de lpulo
comercial no se someten a ningn tipo de preparacin a parte de la pulverizacin. En 1983 se finaliz la construccin de una planta de extraccin supercrtica con una capacidad de 5000 toneladas en Alemania.
y
1.2.2.3- Extraccin de especias El uso de CO2 supercrtico se prefiere al de diclorometano, usado tradicionalmente. Actualmente se llevan a cabo extracciones de pimienta negra, chillies y nuez moscada para conseguir extractos que posean el aroma y las caractersticas ardientes de las especias (Flubert y Vitzthum, 1978).
La piperina es el constituyente principal de la pimienta negra (98%) y responsable del ardor de sta. Las extracciones de pimienta negra, seguidas de la transferencia de la fase supercrtica a una celda de separacin en condiciones de presin y temperatura por debajo del punto crtico producian un extracto que contena casi el 98% de la piperina.
4
fi
t/
18
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
.2.3. Aplicaciones no convencionales del dixido de carbono supercrttico al procesado de ctricos
Una solucin de dixido de carbono en agua causa la reduccin del pH, afectando los enzimas y microorganismos. Entre los enzimas investigados pueden nombrase la cxamilasa, glucosa oxidasa, lipasa, catalasa (Taniguchi y col., 1987), polifenoloxidasa y pectienesterasa (Zemel, 1989; Arreola, 1990). La turbidez es un importante atributo de calidad del zumo de naranja y otros ctricos y se estabiliza al protegerla de la accin de la pectinesterasa.
El tratamiento con dixido de carbono supercrtico se basa en la hiptesis de que ste junto con el agua del zumo dan lugar a cido carbnico, bajando el pH temporalmente e inactivando el enzima. Cuando la presin vuelve a ser la atmosfrica, el dixido de carbono se separa del zumo, restaurndose el pH original (Balabon y Areola, 1991). De esta forma podran evitarse temperaturas tan altas como en el tratamiento trmico convenciOnal.
La calidad de un zumo tambin depende de los cambios de flavor causados por inicroorganisnos que pueden desaxTollarse a pH bajos (Merteus y Knorr, 1992). Sin embargo, al conseguir pH menores debido a la formacin de cido carbnico puede limitarse de desarrollo de estas bacterias y hongos, pudiendo ser beneficioso su uso, Kamihira y col, en 1987 encontraron un efecto esterilizante del dixido de carbono supercrtico en Saccharomyces cerev/siae, Eseherichia coil, Staphylococcus aureus y Aspergillus nger a 20,3 MPa y 35 0C cuando el contenido de agua fue de 70 al 90%. Los microorganismos en seco no eran esterilizados cuando se trataban en las mismas condiciones. Molin (1983) estudi el efecto inhibitorio de CO 2 al 100% de varios
microorganismos incluyendo el gnero Laclohacil/us y encontr que se endenteca la velocidad de crecimiento.
19
.1
.~.I..V ..~ ,Wj,!.uI.sM.,.a...... 1...
fi
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrlIicos.
La calidad de un zumo tambin depende de otros atributos como el pH, estabilidad al almacenamiento, slidos solubles totales (0Brix), acidez total, color, contenido de cido ascrbico, flavor, aroma y apariencia. Estos atributos de calidad de un zumo pueden verse afectados por el tratamiento por dixido de carbono supercrtico.
1.2.4- Otras aplicaciones del dixido de carbono supercritico
Por ltimo, algunas aplicaciones van encaminadas a la inactivacin de polifenoloxidasa en crustceos (langosta y gamba) y patata, para evitar el cambio hacia colores desagradables durante la conservacin (Chen y col., 1992b; 1993).
El desengrasado de alimentos para la obtencin de derivados ricos en protenas es otra de las aplicaciones de la extraccin con CO 2 supercrtico. Maheshwari y col. (1995)
estudiaron varios mtodos para la eliminacin de compuestos que provocan olores desagradables en concentrados de protenas de soja, siendo el supercrtico el que proporciona mejores resultados, Wu y col. (1990, 1994) lo realizan en protenas y fibra alimentaria de maz, y Temelli y col. (1995) utilizan el dixido de carbono supercrtico para desengrasar las protenas de msculo de caballa. El desengrasado tambin se ha aplicado a alimentos transformados como patatas fritas, salchichas, manteca de cacahute, queso, galletas y hamburgesas (Sutter y col., 1994; Hopper y col., 1995; Webster, 1995).
20
JBJETIVOS
y
/ n el rea de la Tecnologa de los Alimentos, las novedosas tcnicas de extraccin que se asan en el empleo de dixido de carbono supercrftico poseen claras ventajas sobre quellas consideradas como convencionales, tanto por su inocuidad debida a las nopiedades del fluido como por las amplias posibilidades de realizacin de extracciones electivas de unos compuestos respecto a otros en matrices complejas. Con el fin de ~ontribuir al avance sobre la aplicacin de esta tcnica junto con el desarrollo de nuevos ioductos de mayor calidad y el aprovechamiento de subproductos, se plantearon los iguientes objetivos:
disminucin del contenido en colesterol de la grasa de la nata mediante la extraccin con CO2 en condiciones supercrticas,
fraccionamiento de la grasa lctea de la nata, mediante la extraccin con CO2 supercrtico, para la obtencin de extractos lpdicos de diferente composicin tiiglicrica que pueden ser utilizados en la elaboracin de distintos alimentos,
aprovechamiento de los destilados de la desodorizacin de aceites de oliva y girasol, subproductos del refinado de stos, para la obtencin, de modo selectivo mediante a extraccin con CO2 supercrtico, de escualeno, producto de gran uso a nivel industrial, mejora de la calidad de los zumos de naranja comerciales por inactivacin de la pectinesterasa mediante el tratamiento con CO2 superortico.
21
PLAN DE TRABAJO El desarrollo del trabajo ha incluido las siguientes etapas:
fi
estimacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de oveja, cabra y vaca mediante cromatografia lquida de alta eficacia en combinacin con la aplicacin de modelos matemticos y cromatografia de gases,
aplicacin de la extraccin con CO2 en condiciones supercriticas a la extraccin de colesterol y modificacin de la grasa presente en la nata,
estimacin de las distintas familias de compuestos lipdicos por espectroscopia de 13C. resonancia magntica nuclear del desarrollo y optimizacin de mtodos anliticos, cromatografia lquida de alta eficacia, para la determinacin de los esteroles y escualeno, y su aplicacin al anlisis de los destilados de la desodorizacin de aceites de oliva y girasol,
aplicacin de la extraccin con CO
2 en condiciones supercriticas a la extraccin
de escualeno de los destilados de la desodoxizacin de aceites de oliva y girasol,
tratamiento con CO2 en condiciones supercrticas del zumo de naranja para la inactivacin de la pectinesterasa y estudio de la modificacin de la turbdez y el color.
22
Cap/tulo 2. Aplicacin de la extraccin con dixido de carbono supercrftico a la mod<ficacin de grasa lctea en nata
Capitulo 2. Aplicacin o la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1- INTRODUCCIN
21.1- Lpidos
No existe una definicin satisfactoria universalmente aceptada sobre la palabra lpido En general se describen los lpidos como aquellos compuestos que son solubles en disolventes orgnicos como cloroformo, teres y alcoholes, lo que incluye a los esteroides, carotenoides, terpenos y cidos biliares junto a los cidos grasos y los acilgliceroles. ltimamente se considera que este criterio de clasificacin es bastante vago y sirve mejor para distinguir entre tpicos lpidos y los tpicos glcidos y protenas, dejando bastantes casos de clasificacin dudosa. Hay autores que definen los lpidos como los cidos grasos y sus derivados o sustancias relacionadas biosinttica o funcionalmente (Christie, 1989, Gunstone y Herslt 1992). Esta definicin incluye la mayora de los compuestos conocidos tradicionalmente como lpidos, se incluyen los steres de esteroles, pero no los esteroles libres. Si tenemos en cuenta esta segunda definicin podemos dividir los lpidos en dos grupos:
lpidos simples aquellos que tras la saponificacin dan como productos dos compuestos por mol como mucho (cidos grasos, glicerol, etc), como son los triglicridos o los steres de colesterol,
lpidos complejos si producen tres o ms compuestos por mol inicial tras la saponificacin, como los fosfolpidos y glicolpidos. Fosfolpidos y glicolpidos pueden dividirse tambin en glicero- y esfmgolpidos.
2.1.1.1- cidos 2rasos
Los cidos grasos son lpidos presentes en plantas, animales y microorganismos que contienen cadenas de tomos de carbono unidas a un grupo carboxlico en un extremo.
24
.1
.4.
t,aLA.A~atSIMSSIS vn r-~n<IC*rffr~rrs
Capitulo 2- Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
Pueden contener dobles enlaces (cis o srans), ramificaciones, otros grupos funcionales y generalmente son de cadena par. Segn el nmero de insaturaciones se clasifican en saturados, mono y poliinsaturados.
2.1,1.1.1- cidos grasos saturados
Existen en la naturaleza cidos grasos saturados de 2 a 36 tomos de carbono, siendo los ms abundantes los de 14, 16 y 18 carbonos. Los cidos de cadena lineal siguen la frmula: CH4CHzL1COOH
Los cidos grasos saturados de 12 o ms tomos de carbono son slidos a temperatura ambiente, con menos tomos se presentan en estado lquido.
2.1.1.1.2- cidos grasos monoinsaturados
Estos cidos grasos contienen un nico doble enlace en su estructura. Este doble enlace puede estar en diferentes posiciones en la cadena carbonada y presentar las configuraciones cs o rans. La frmula general se corresponde con la siguiente:
CHs(CHztCH#ZH(CHz)nCOOH
Los cidos c/s-monoenoicos con 18 carbonos o menos tienen puntos de fusin por debajo de la temperatura ambiente, los ismeros trans poseen puntos de fusin algo superiores. La presencia de insaturaciones provoca una mayor susceptibilidad a la oxidacin que los cidos saturados.
it
25
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lactea de nata.
2.1.1.1.3- cidos grasos poliinsaturados
Estos cidos grasos poseen ms de un doble enlace en la cadena carbonada. Pueden subdividirse en varias familias de acuerdo a su procedencia desde un precursor especfico de su biosntesis. Cada una de estas familias contiene desde 2 hasta un mximo de 6 dobles enlaces separados por grupos metilnicos y una misma estructura terminal. Estas familias son principalmente las de los cidos (n-9), (n-6) y (n-3), segn la posicin de la ltima insaturacin respecto al final de la cadena. De especial importancia son los cidos de la familia (n-3), como el cido ct-linolnico, por ser esenciales en la dieta animal y humana. Por otra parte, se ha comprobado que los cidos de la familia (n-3) reducen el desarrollo de tumoraciones como el cncer de mama (Col Helln, 1988).
ti
cido cx-linolnico
En general, los cidos grasos poliinsaturados son de bajo punto de fusin y son de ms fcil deterioro por oxidacin o autooxidacin.
2.1.1.1.4- cidos grasos ramificados Los cidos grasos ramificados se encuentran ampliamente distrubuidos en la naturaleza,
ti
pero como componentes minoritarios excepto en bacterias. Generalmente la ramificacin

ti
26
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
consiste en un solo grupo metilo en el penltimo (1w) o antepenltimo (ante so) tomo de carbono.
OH
o
cido /so-pentadecanoico
o
cido ante/so-margrico
2.1.1.1.5-cidos grasos con otros grupos funcionales De entre los hidroxicidos es particularmente importante el cido araquidnico y el grupo de los eicosanoides por ser intermedios en la sntesis de prostanoides. Tambin existen cidos grasos con grupos furanoides, ciclopropanos, ciclopentanos y ciclohexanos.
2.1.1.2-Lpidos simples
2.1,1.2.1- Trigilcridos y compuestos relacionados
Los triglicridos (o triacilgliceroles) son compuestos formados a partir de una molcula de gliceol en la que cada gupo hidroxilo est esterificado por un cido graso. En la
27
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
naturaleza son biosintetizados por sistemas enzimticos, lo que determina que est presente uno de los ismeros,
(a-l)cHoocR
R COO (a 3) C H2000R triacil-sn-glicerol
La mayora de grasas y aceites de animales y plantas consisten casi exclusivamente en triglicridos. En aceites vegetales suele haber triglicridos compuestos por cidos grasos insaturados, en grasas animales como el tejido adiposo predominan cidos de cadena larga (16 y 18 carbonos) y en la grasa lctea cidos de cadena corta. Las grasas de pescado y de mamferos marinos contienen en su fraccin triglicrica altas proporciones de cidos grasos poliinsaturados de 20 y 22 tomos de carbono, Los mono y diglicridos contienen uno y dos moles de cidos grasos por mol de glicerol respectivamente, y frente a los triglicridos son minoritarios en la naturaleza. Aparecen como intermedios en la biosntesis de triglicridos y otros lpidos, y tambin en la hidrlisis de stos.
2.1.1.2.2- Esteres de esteroles

Los esteroles pueden esterificarse con los cidos grasos dando lugar a los steres de esteroles. En las plantas se encuentran steres de f3-sitosterol, ergosterol, estigmasterol, etc., y en animales predominan los steres de colesterol.
28
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
2.1.1.2.3- Otros lpidos simples
Entre otros lpidos simples de menos inters en nuestro estudio podemos citar los alquildiacilgliceroles y plasmalgenos neutros, y los steres de ceras,
Los alquildiacilgliceroles estn formados por sustitucin de un cido graso de un triglicrido por una cadena alquilica mediante un enlace ter, Los plasmalgenos neutros contienen un enlace vinilter con la configuracin cis y se han detectado en algunos tejidos de origen animal en bajas cantidades.
CH2OCH=CHR RCOOc!II CII2OH plasmalgeno neutro
Entre los steres de ceras ms comunes se encuentran aquellos formados por la esterificacin de un cido graso con alcoholes grasos de longitudes similares, Se encuentran tanto en vegetales como en animales y microorganismos, y con diferentes funciones.
2.1.1.3- Lpidos complejos
2.1.1.3.1- Glicerofosfolpidos
Son compuestos con la estructura de l,2-diacil-sn-glicerol-3-fOsfatO o cido fosfatdico, en los que al grupo fosfato se une un grupo polar. Se agrupan en familias dependiendo de la base a la que est unido el resto de cido fosfrico. La fosfatidilcolina, comunimente 29
Lb ..iI < ~I .tnJ4S4IeII~eI~rdJ.lsIflfl
llamada lecitina, es el lpido ms abundante en las membranas de tejidos animales, tambin aparece en membranas de vegetales y, en algunos casos, de microorganismos.
CH 2000R RCOOCH
colina
_____________
CH3
CH2 O P O CH2 CH2 N CH3 O CH3

diglicrido . fosfrico fosfatidilcolina
Entre otros glicerofosfolpidos pueden citarse el fosfatidilglicerol, encontrado en cloroplastos, difosfatidilglicerol (o cardiolipina), en las mitocondrias del tejido muscular, fosfatidiletanolamina (o cefalina), fosfatidilserina y fosfatidilinositol. Cada clase de las nombradas anteriormente tiene una composicin distintiva en cidos grasos segn el tejido al que pertenezcan, aunque generalmente los cidos saturados se encuentran en posicin sn-l y los insaturados en sn-2.
ti
2.1.1.3.2- Gliceroglicolipidos
Los tejidos vegetales son especialmente ricos en lpidos en los que los l,2-diacil-sngliceroles estn unidos a un glcido en la posicin sn-3 mediante enlace glicosdico. Los principales son el mono y digalactosildiacilglicerOl, el primero de ellos tambin se encuentra en pequeas cantidades en el tejido nervioso de algunas especies animales y ambos son importantes en la composicin de los cloroplastos.
30
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
1~II2OCOR RCOOH Oil
L2OH
digalactosildiacilglicerol
2.1.1.3.3- Esfingolpidos
La caracterstica fundamental de estos lpidos es que estn formados por una base de cadena larga (12 a 22 carbonos) hidroxilada, con un doble enlace trans en la posicin 4 y unida a un cido graso, siendo la esfingosina la base ms abundante. Se encuentran en animales, plantas y microorganisinos.
Las cerarnidas contienen un cido graso unido al grupo amino de la base mediante un enlace amida y se encuentran en los tejidos como intermedios en la sntesis de esfingolipidos complejos o de su degradacin. La esfmgomielina es una ceraniida que
incorpora fosforilcolina en su molcula y es uno de los lpidos ms importantes del tejido nervioso de los animales, Los cerebrsidos son glicoesfmgolpidos ya que incorporan a la estructura de la ceramida glucosa o galactosa y se encuentran principalmente entre los lpidos del cerebro. Los ganglisidos son oligoglicosilceramidas muy complejas, conteniendo cido silico, glucosa, galactosa y galactosamina y aparecen principalmente en clulas ganglionares del sistema neivioso central.
it ti A
31
CapItulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
OH es fin gos in a
o
galactosa OH
011
12
o
0
CHON
2
1
p/ /t
NHt
O . graso galactosilceramida
2. 1 1 .4- Composicin de la fiaccin insaponificable

.
En este grupo se incluye una serie de compuestos que no se consideran lpidos, pero que se caracterizan por ser hidrocarburos o derivados oxigenados de stos, son liposolubles y presentan afinidades marcadas con los lpidos.
De una parte, aparecen hidrocarburos saturados acclicos en pequea proporcin en la fraccin insaponificable; sin embargo, la mayor parte de los compuestos pertenecen, por su forma de originarse, a una serie de productos naturales que alcanza una extraordinaria diversificacin estructural y en la cual se encuentran representantes de destacada significacin biolgica. Es el grupo de los isoprenoides o poliprenos, que se pueden considerar resultantes de la polimerizacin de un hidrocarburo bsico de 5 tomos de carbono, el isopreno.
l it2
Isopreno
~Ii~
A
32
La agregacin de grupos isoprnicos origina sustancias que reciben nombres relacionados con la denominacin terpenos.
2.1.1.4.1- Monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos
Son sustancias que abundan especialmente en vegetales, sobre todo en esencias, ya que suelen ser de elevada volatilidad, y en resinas y blsamos. El fitol es un diterpeno que forma parte de la estructura de la clorofila, es constituyente de las vitaminas liposolubles E (tocoferoles) y K, y est muy relacionado en su estructura con la de la vitamina A.
r
4
HO.
c-tocoferol
2.1.1.4.2- Triterpenos
Estn constituidos por 6 unidades isoprenoides y se encuentran en aceites de pescado y vegetales, resinas y saponinas.
Un triterpeno no cclico muy importante es el escualeno, que se asla fundamentalmente del insaponificable de aceites de hgado de peces seos o cartilaginosos. Su importancia reside en su papel de producto intermedio en la sntesis de los restantes triterpenos cclicos y de los esteroides.
ti ti
it
33
escualeno
2.1.1,4.3- Carotenoides
Los carotenoides son compuestos profusamente repartidos entre los vegetales, tambin se encuentran en animales y microorganismos. Los carotenos (a, ~3 y y~ poseen uno o dos ciclos en los extremos de la molcula y su escisin por el doble enlace central da lugar a la formacin de vitamina A.
~-caroteno
Existen muchos derivados oxigenados de los carotenoides, como la xantofila y el licoxanteno, tambin se han descrito derivados cetnicos, cidos, aldehdos y epxidos.
2.1.1.4.4- Esteroides
El grupo de los esteroides comprende las sustancias naturales derivadas estructuralmente del ciclopentanoperhidrofenantrenO. Estas sustancias engloban a compuestos como los
34
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
esteroles, cidos biliares, estrgenos, andrgenos, gestgenos, corticoides, vitaminas del grupo D, etc. Los esteroles poseen una cadena lateral en el carbono 17 y un hidroxilo en 3, y muy frecuentemente se encuentran esterificados con cidos grasos, Son compuestos minoritarios pero se encuentran en casi todos los organismos. El colesterol se encuentra en casi todas las grasas de origen animal.
Y
fi
HO colesterol
Los esteroles presentes en organismos vegetales reciben el nombre genrico de fitosteroles, como lo son el estigmasterol, campesterol, j3-sitosterol, etc.
21.2- Composicin de la leche
La leche es un sistema coloidal constituido por una solucin acuosa de lactosa, sales y otros muchos elementos en estado de disolucin, en donde se encuentran las protenas en estado de suspensin y la materia grasa en estado de emulsin. En la tabla siguiente se muestran los valores aproximados en que se encuentran los componentes de la leche de vaca (Riel, 1991); la composicin exacta de una muestra de leche vara en funcin de mltiples factores y nicamente se puede conocer mediante su anlisis.
2>
>2> >2
35
Componentes mayoritarios: Agua Materias grasas Protenas y sustancias nitrogenadas no proteicas Glcidos Sales 86,9% 3,9% 3,2% 5,1% 0,9%
34
Componentes minoritarios: Enzimas Vitaminas Pigmentos (carotenos, xantofilas, riboflavina) Clulas diversas (clulas epiteliales, leucocitos, bacterias, levaduras, mohos) Otros elementos (dixido de carbono, oxgeno, nitrgeno y otros gases) Sustancias extraas
2.1,2.1-Composicin de la grasa lctea

2>34
La composicin de la grasa lctea es muy compleja y muy variable. Las variaciones en su composicin se deben fundamentalmente a la especie de animal que se trate, raza, individuo, alimentacin, estacin del ao, edad y periodo de lactacin.
322
ti>Jt
La materia grasa se encuentra en la leche formando glbulos esfricos suspendidos en la fase acuosa del suero. El dimetro de stos varia entre 2 y 10 I.un. Un glbulo graso es una masa de triglicridos envuelta en una membrana lipoproteica, membrana que posee
36
un espesor de cerca de 0,005 xm en el caso de un glbulo graso de 5 gm (Veisseyre, 1980). Segn Veisseyre (1980) y Riel (1991) los triglicridos ms insaturados y los que tienen un peso molecular ms bajo, estn situados en el centro del glbulo, probablemente porque son lquidos y as quedan retenidos por los glicridos slidos que se localizan en la periferia. Los fosfolpidos, al ser anfifilos, estabilizan los glbulos y estn en cantidad suficiente como para formar una capa mono-molecular en la superficie de todos los glbulos grasos. La parte polar se orienta hacia la fase acuosa y el segmento apolar hacia la fase lipdica. Las globulinas que tambin existen en las membranas y la carga total del glbulo graso, que es negativa, contribuyen a mantener la estabilidad del glbulo en emulsin. Adems, la membrana contiene pequeas cantidades de mono y diglicridos, carotenoides, colesterol, metales (hierro, cobre, magnesio y zinc), agua ligada y enzimas (fosfatasa alcalina y xantina oxidasa) La figura 2.1.2.1 representa, de forma esquemtica, la composicin del glbulo graso.
JI
4~
it
1
4$
,2
6/ti
J2j
.3>-li
37
21
24
Figura 2.1.2.1. Estructura de un glbulo graso 1: triglicridos insaturados y de bajo peso molecular; 2: triglicridos slidos 3: fosfolpidos; 4: lipoproteinas, enzimas, aglutininas; 5: cargas elctricas.
38
III.
4 hdwpectsttflws
Captulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
Segn Gunstone y col. (1986), la composicin del glbulo graso de la leche de vaca es la siguiente:
Componente Lipdico Carotenoides Escualeno steres de Colesterol Triglicridos cidos Grasos Libres Colesterol Diglicridos Monoglicridos Fosfoipidos
Lpidos de Membrana
Total en el Glbulo Graso
(%)
0,45 0,61 0,79
53,4
(%
ti. ti.
U
>4
tr 97-98 0,10-0,44 0,22-0,41 0,28-0,59 0,016-0,038 0,2-1,0
6,3 5,2 8,1 4,7 20,4
y.
22~
La composicin en cidos grasos de la grasa lctea (tanto los que constituyen los triglicridos, que son la mayora, como los que se encuentran libres) es ms compleja que la de los aceites vegetales. Este complejidad se debe a varios factores (Walstra y Jennes, 1984), que incluyen:
1
a) cidos grasos procedentes de la grasa de la dieta y que llegan a la glndula mamaria a travs de la sangre y la linfa. En su mayoria son de 16 o ms tomos de carbono,
b) cidos grasos sintetizados en la glndula mamaria. Son cidos de cadena corta y inedia, mirsitco y parte de palmtico. Adems, las clulas mamarias de rumiantes poseen una alta actividad desaturasa que insatura los cidos esterico y palmtico.
39
4
c) microorganismos en el rumen, que hidrogenan total o parcialmente cidos grasos de 18 carbonos de los alimentos consumidos, por lo que introducen ismeros posicionales y geomtricos de cidos grasos monoinsaturados y tambin cidos grasos ramificados en el total de la composicin de cidos grasos. Segn Gunstone y col. (1986) la grasa lctea es la mezcla grasa de origen natural ms compleja debido a su composicin en cidos grasos y, por tanto, en triglicridos. Se han caracterizado alrededor de 500 cidos grasos, siendo unos 15 mayoritarios y existen numerosos ismeros mono y poliinsaturados y ramificados.
4>
22>
U
2
it
Los estudios de Breckenbridge y col. (1969), Marai y col. (1969) y Parodi (1982), sobre la distribucin posicional en los triglicridos de los cidos grasos mayoritarios indican que los cidos butrico y caproico se encuentran siempre en la posicin sn-3 del triglicrido. Los cidos caprilico y cprico y los insaturados de 18 tomos de carbono se unen preferentemente en la misma posicin que los anteriores, pero no exclusivamente. Otros cidos grasos tambin tienen posiciones preferentes para la esterificacin, como los cidos lurico y mirstico en la posicin sn-2 y palmtico y esterico en la posicin sn-l. Coincidiendo con los datos apodados con Anifantakis (1986), este tipo de distribucin es comn a casi todas las leches de mamferos, incluyendo las de oveja y cabra,
41
La grasa lctea tambin contiene lecitinas, cefalinas, esfingomielinas y trazas de cerebrsidos. El contenido total de estos compuestos en la leche es de alrededor de un 0,03%, es decir, aproximadamente un 1% de los lpidos totales en leche. La contribucin de las lecitinas es del 60%, la de las cefalinas del 30% y la de las esfmgomielinas del 10%. El contenido de la leche en cerebrsidos no supera el 0,002% (Riel, 1991).
it4
Ii
itt >21
$2
Los componentes insaponificables suponen un 0,4% de la masa de materia grasa. Cuantitativamente, los esteroles son los compuestos ms importantes, principalmente el colesterol y sus precursores, el ergosterol y el 7-dehidrocolesterol. La exposicin de estos
1>2
40
ltimos a los rayos ultravioleta los transforma en vitaminas del grupo D. Tambin se encuentra en la leche lanosterol y escualeno. Adems del colesterol de la fraccin lipdica, tambin hay colesterol en la fase acuosa de
la leche en forma de proteino-colesterol y formando complejos en la membrana de los

glbulos grasos. Tiene papel emulsionante y se le atribuyen propiedades antilipolticas de
ji
la leche,
jI>
Los tocoferoles son sinnimos de vitamina E, siendo el mayoritario de la leche el atocoferol. Desde el punto de vista tecnolgico, son antioxidantes naturales especialmente tiles para prevenir la oxidacin de los fosfolpidos.
21.3- (omposicin de las leches de vaca, oveja y cabra
La produccin de leche de oveja y cabra es de gran importancia en algunos paises donde las condiciones climticas no son favorables para el mantenimiento del ganado vacuno.
La produccin mundial de leche de estas especies se sita en tercer y cuarto lugar tras la
leche de vaca y la de bfala. Sin embargo, en algunos paises del rea mediterrnea la
1
produccin de leche de estas especies ha revalorizado su importancia econmica como resultado de una mayor aceptacin a nivel mundial de los productos derivados de stas.
Este creciente inters ha sido evidente si tenemos en cuenta que los estudios realizados
sobre leche de oveja y cabra se han duplicado en la ltima dcada, An as, los datos
disponibles sobre la composicin de estas leches son pocos si los comparamos con los
que se poseen de leche de vaca, de mayor inters comercial y considerando tambin la limitacin geogrfica de la produccin de leche de oveja y cabra y su contexto tradicional al que se han asociado.
41
.1
Ir.
.~IIflb tSr ~li.~r.tS~qiSaA.aSflsS.i~sfl .~.u u Ji>v~rvrwtwy~
A pesar de la baja produccin de leche de oveja y cabra a nivel mundial, son de gran importancia en las regiones del Mediterrneo (Le Jaouen y Toussaint, 1993), Oriente Prximo, India y Europa del Este. La produccin de leche de estas especies est encaminada fundamentalmente a la elaboracin de quesos, pero en algunos paises se utiliza tambin pa;a producir yogures, mantequilla y leche fennentada, y la leche de cabra tambin se consume directamente como tal, Otros productos que van aquiriendo cada vez ms importancia son aquellos encaminados a sustituir la leche de vaca por leche de cabra en los casos de aparicin de alergias a sus protenas o de malnutricin (Desjeux, 1993, Hachelaf y col, 1993; Razafindrakoto y col, 1993). Este aumento del estudio de la leche de oveja y cabra ha dado como fruto trabajos que renen los ltimos datos aportados, como los de Ramos y Jurez (1981, 1982, 1986a y b, y 1993), Jurez y Ramos (1984, 1986), Anifantakis (1986), Boyazoglu (1989), Yener (1989) y Mann (1994). En ellos se compara la composicin de la leche de estas especies con la de vaca y la aplicacin para la obtencin de productos derivados.
41
it ti?,
3
~ii 4
It
1
2)
y =1 ti>
Tal como seala Haenlein (1995), la composicin de la leche de oveja y cabTa vara dentro de un rango muy amplio debido a las diferencias genticas entre especies, entie razas de una misma especie e incluso entre individuos de una misma raza, adems de otros factores ya citados anteriormente, como oculTe en el caso de la leche de vaca. Remeuf (1993) descubri que variantes genticas de cabra conducan tambin a diferente cantidad de grasa en la leche, Sin embargo, se coincide en indicar el mayor valor nutritivo de la leche de oveja por tener mayor cantidad de grasa, protenas, minerales y slidos totales que la leche de vaca y cabra, siendo el mismo el contenido de lactosa. La leche de cabra tiene, por lo general, una composicin ms semejante a la de vaca. Segn la bibliografia consultada por Jurez y Ramos (1984), la composicin de la leche de oveja y cabra es la siguiente:
fi
ti
3,
.21
<1
341
22
42
III
Oveja Slidos totales Lpidos Protenas Lactosa Cenizas 15,8-23,4 4,54-12,60

4,3-6,77
Cabra 11,33-18,68 2,84-7,78 2,64-5,30

3,91-6,30
ti
4, 19-5,25 0,79-0,95
0,77-0,95
it
Segn los estudios de Anifantakis (1986) y Ramos y Jurez (1993), al comparar las leches de vaca, oveja y cabra, se vio que destaca un mayor contenido de los cidos caproico, caprlico, cprico y lurico en las de cabra y oveja (20-25% frente a 10-12% de la leche de vaca) y de palmtico, esterico y oleico en la de vaca.
21.4. La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares
u
it it it
2,1.4.1- Valor nutrutivo de la leche
La leche es un alimento nutricionalmente muy completo, sobre todo en la edad de crecimiento, ya que aporta protenas de alto valor biolgico y calcio, y tambin es rico en vitaminas A y B. Se puede decir que es un alimento de muy alto valor nutricional y de un bajo coste econmico (Juansolo, 1992).
Sin embargo, tras el estudio de Vzquez-Martnez (1992), respecto a la evolucin del consumo de eche y derivados en Espaa hay que decir que experiment un espectacular aumento entre 1964 y 1980, descendiendo a partir de entonces. En 1987 el consumo de leche en Espaa fue de 125,5 kg/ao/perSona y continu descendiendo hasta 109,3 kgao/persona en 1990. Una de las causas de este descenso en el consumo es que se considera que la leche entera y sus derivados son alimentos con alto contenido en grasas 43
saturadas y colesterol, tipo de grasas que se recomiendan limitar en su consumo por su relacin con la aparicin de trastornos cardiovasculares (Cos Blanco, 1992).
2. 1.4.2- La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares
La leche de vaca es popularmente conocida como un alimento con una importante cantidad de colesterol, si bien, no se tiene en cuenta que normalmente la leche de mujer tiene una cantidad mayor (Paul y Southgate, 1978) y que esto ltimo se puede relacionar con que el organismo del lactante pueda metabolizar el colesterol de modo ms efectivo (Mott, 1986).
4
ji 3 2
Adems de lo dicho anteriormente acerca del colesterol, la grasa lctea se considera tambin una grasa saturada, lo que incurre en un uso abusivo de este trmino. El
porcentaje en que se encuentran los cidos grasos saturados en la grasa de vaca est alrededor de un 60% del total, lo que significa que ms de un tercio de los cidos grasos son insaturados. Se puede aadir que es muy importante conocer la diversidad de cidos grasos saturados que presenta la grasa lctea, encontrndose longitudes de cadena desde 2 a 20 carbonos. Los cidos grasos de cadena corta y media (2 a 12 tomos de carbono) se digieren ms rpidamente que los de cadena larga y se absorben por un mecanismo diferente, pasando directamente a la sangre, evitndose el paso por el hgado y siendo
21
tu
adems fuente de energa de ste (Sickinger, 1975). Por tanto, no contribuyen al aumento de la concentracin de lpidos en la sangre. Los efectos adversos de los cidos grasos saturados se deben fundamentalmente a que favorecen la elevacin de la concentracin de colesterol en la sangre. En esta consideracin tambin se suele descuidar el hecho de que solamente dos de estos cidos grasos producen este efecto de forma significativa (mirstico y palmtico). Recientes estudios han demostrado que el cido esterico no produce estos efectos (Bonanome y
it?
$1
>34]
44
Grundy, 1988). En resumen se puede concluir que solamente el 34% de los cidos grasos de la grasa lctea tienen actividad hipercolesterolemiante.
vi~
Los cidos grasos monoinsaturados se encuentran aproximadamente en un 32% del total, siendo el cido oleico el mayoritario. En un principio se pens que estos cidos no elevaban los niveles sanguneos de colesterol, pero que tampoco contribuan a hacerlos disminuir. Recientes estudios han reevaluado el efecto sobre el colesterol en sangre de ellos (Mattson y Grundy, 1985; Orundy, 1986; Mensink y Katan, 1987; Baggio y col.,
1988; Grundy y col., 1988). Estos estudios han podido concluir que las dietas ricas en
cidos grasos monoinsaturados inducen menores niveles plasmticos de colesterol y LDL que dietas altamente saturadas,y no producen variaciones en la trigliceridemia y en los niveles de las HDL. En comparacin con dietas pobres en grasas y ricas en glcidos se observ que producan menores valores de colesterolemia y mayores de HDL. En conclusin, los beneficios que aportan dietas que contienen cidos grasos
monoinsaturados parecen ser: en primer lugar disminuyen los niveles plasmticos de colesterol y LDL, incluso cuando la dieta es altamente energtica. No disminuyen los niveles de HDL, lo que puede ser ventajoso, ni elevan los de triglicridos totales, lo que s ocurre con dietas ricas en glcidos. Finalmente, se oxidan con ms dificultad que los cidos grasos poliinsaturados (Gua, 1989).
II
.34
~ k
1
En lo referido a los cidos grasos poliinsaturados, hay que decir que la grasa lctea es algo pobre debido a la hidrogenacin que sufren en el ruinen por los micTorganismos. No se puede decir que la leche sea una de las fuentes ms importantes de cidos grasos esenciales. Sin embargo, no se puede por ello negar que la leche en s es uno de los alimentos ms importantes de la dieta.
E.
.
12
itt
2I
> .
Se dice normalmente que la leche es un alimento con alta concentracin de colesterol, aunque contribuye modestamente al colesterol total ingerido en la dieta (slo 55 mg/da de un total de 500 a 1000 mg/da). Junto a esto hay que considerar que el colesterol ingerido con los alimentos es solamente uno de los factores que influyen en la
45
W u. ~as~q~ ~r&!I1W4tWpV
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
concentracin de colesterol plasmtico (Beynen y col., 1987). Sin embargo, esto est en entredicho y hay diversidad de opiniones sobre la incidencia del colesterol de la dieta sobre los niveles plasmticos.
2.1.5- Lasposibilidades del uso de la grasa lctea mod~flcada
Histricamente, la grasa lctea ha sido muy utilizada, ya como leche en s, nata o mantequilla. Sin embargo, ha habido una gran disminucin en su consumo, sobre todo en los paises occidentales, y es por esto que se estn tomando medidas para que los consumidores no rechacen los productos lcteos que contengan toda su grasa. Todos los productos de carcter graso que se ofrecen en el mercado estn siendo menos consumidos y coincide, adems, que la mantequilla es el ms caro de ellos.
La causa fundamental por la que se rechaza la mantequilla y la grasa lctea en general es por el contenido en cidos grasos saturados considerados hipercolesterolemiantes y tambin por su contenido en colesterol. Estos dos factores han hecho que este alimento sea tambin apartado de las dietas que aconsejan los mdicos.
El flavor y la textura de la mantequilla son considerablemente mejores que los de otras grasas, como las margarinas, que se usan como sustitutos; pero sus propiedades fisicas y reolgicas, especialmente la poca capacidad para untarse a la temperatura del frigorfico, hacen, tambin, que la mantequilla sea poco atractiva para los consumidores.
Para aquellos que demandan productos de buena calidad, de origen natural y buen sabor, la mantequilla seguira siendo esencial en la dieta, pero otras veces el consumidor se decanta por productos de mezcla de mantequilla con aceites vegetales parcialmente hidrogenados para procurar una mayor untabilidad. Sin embargo, estas mezclas, realizadas segn la tecnologa de las margarinas, presentan algunos problemas en el sentido tecnolgico y tambin cientfico. Los productos bajos en grasa presentan ms
46
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lactea de nata.
problemas y se relacionan con la inestabilidad de la emulsin y el consiguiente favorecimiento del crecimiento de microorganismos.
Es muy dificil que un nico mercado de grasa lctea pueda compensar el descesnso del consumo de sus derivados. Al contrario, parece que la solucin se encuentra en aumentar el espectro de productos, en la diversificacin. Para que esto se pueda llevar a cabo es necesario conocer a fondo la estructura de la grasa lctea y establecer las propiedades de los componentes que la forman. Este proceso ha sido ya llevado con xito en la fraccin proteica de la leche y sera deseable que se consiguiesen los mismos resultados con la grasa lctea.
Unas de las propiedades ms valoradas de la grasa lctea son sus caractersticas organolpticas, mucho ms apreciadas que las de otras grasas y aceites comestibles para la elaboracin de productos de confitera, bollera y para untar. Sin embargo, en contra de estas ventajas encontramos inconvenientes que hacen que se modifique esta grasa para su consumo y se estudien nuevos mtodos de modificacin. Entre los inconvenientes podemos citar los anteriormente dichos y el precio, que encarece an ms las formas procesadas de la grasa lctea.
La complejidad de la composicin de la grasa lctea hace posible que pueda ser modificada y fraccionada para obtener nuevos derivados con caractersticas fisicas y organolpticas diferentes y de gran inters. Los mtodos de modificacin son los citados a continuacin.
2.1.5.1- Adicin de otras grasas

La mezcla de dos o ms grasas est ampliamente difndida en la produccin de margarinas y otras grasas comestibles. Esta prctica es barata y puede realizarse en las
47
industrias lcteas. El mayor inconveniente es la modificacin de los caracteres organolpticos, que no son preferidos frente a los de la grasa lctea original.
2,1.5.2- Fraccionamiento
El fraccionamiento por cristalizacin se usa ampliamente y puede separar la grasa lctea en fracciones ms o menos slidas (Deffense, 1993). Existen tres mtodos que se utilizan a gran escala:
1.
El fraccionamiento mediante disolventes consiste en la cristalizacin de la grasa a
partir de disoluciones en disolventes como hexano o acetona. Se obtienen buenas separaciones, pero el proceso es costoso y slo se ha demostrado rentable en el fraccionamiento de manteca de cacao. Tambin tiene el inconveniente de la completa eliminacin de los disolventes, con la consecuente prdida de los aromas naturales.
2.
El fraccionamiento mediante detergentes se realiza por cristalizacin de la grasa
fundida al adicionar soluciones detergentes acuosas. Una centrifugacin separa la fase acuosa junto con los cristales de la fase oleosa. El gran inconveniente de este mtodo es la total eliminacin de los residuos de detergente.
3.
En el fraccionamiento en seco la grasa se cristaliza por enfriamiento progresivo y se separa por filtracin a vacio a partir de la grasa fundida. Este mtodo no emplea reactivos qumicos, siendo uno de los ms adecuados, aunque es poco selectivo. El mtodo Tirtiaux es utilizado a escala industrial. Este mtodo es muy utilizado y es capaz de producir desde 1 hasta 5 fraccines en la grasa lctea anhidra, pero su principal inconveniente es el tiempo de espera para que se complete la nucleacin y crecimiento de los cristales, que est entre 8 y 12 h (Tirtiaux, 1976).
48
Cap u/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1.5.3- Hidrogenacin
La hidrogenacin es particularmente til para elaborar grasas semislidas a partir de aceites vegetales. La hidrogenacin se ha usado en la grasa lctea para mejorar el mantenimiento de su calidad, si bien, presenta el inconveniente de la formacin de ismeros irans. 2] 1
2>~
-1
2.1.5,4- Interesterificacin
La interesterificacin es el resultado de un reordenamiento al azar de los cidos grasos de una grasa, producindose una nueva mezcla de triglicridos, y variando sus propiedades fisicas. Aplicada sobre la grasa lctea, la interesterificacin proporciona una mayor dureza, punto de fusin y contenido en grasa slida, Esta tcnica posee poco inters
porque se realiza al azar,
2.1.5.5- Biomodificacin
La adicin de enzimas para la modificacin de las grasas constituye un mtodo de reciente uso. Normalmente se utilizan lipasas para la modificacin de aceites vegetales, ya que los costes son altos para su aplicacin a la grasa lctea. Kemppinen y KaIo (1993) utilizan lipasa de Pseudornonas fluorescens para la modificacin de la grasa lctea y posteriormente realizan un fraccionamiento. La interesterificacin enzimtica tiene tajos rendimientos. ltimamente se estudia el empleo del dixido de carbono supercrtico para la obtencin de triglicridos estructurados.
49
~I3; < .
:z
2.1.5.6- Anlicacin de la grasa lctea modificada
Conseguir mantequillas ms fciles de untar cuando se encuentran a la temperatura del frigorfico ha sido una de las primeras aplicaciones. Las mezclas con aceites vegetales han sido las soluciones ms ampliamente utilizadas; si a esto aadimos que los aceites vegetales pueden someterse a diferentes grado de hidrogenacin obtenemos una diversidad de productos segn sus propiedades fisicas. Para obtener productos enteramente de origen lcteo se 0pta por fraccionar la grasa en tres fracciones y utilizar las de mayor y menor punto de fusin, Tambin se puede usar la mantequilla hidrogenada totalmente para mezclarla con aceite de girasol y as obtener un producto bastante consistente rico en cidos grasos poliinsaturados.
Las fracciones de alto punto de fusin se suelen utilizar en productos de bollera, beneficindose de la consistencia de esta grasa y de su aroma y sabor. Las fracciones liquidas a temperatura ambiente pueden utilizarse para dar consistencia ms suave a la mantequilla y para mejorar la reconstitucin de la leche en polvo.
Las fracciones provenientes de la grasa lctea pueden utilizarse tambin en confitera. Una aplicacin importante es la sustitucin por grasa lctea de la manteca de cacao (ms cara) en la fabricacin del chocolate. La grasa lctea hidrogenada o las fracciones slidas pueden ser utilizadas para evitar que los chocolates con leche sufran una separacin en dos fases por romperse la emulsin. Se ha observado que hasta un 25% de la grasa de algunos chocolates es de origen lcteo.
Sin embargo, el alto precio de la grasa lctea es un obstculo para el uso de sus procesos de modificacin. Este problema se podra superar si pueden obtenerse productos de mejor calidad,
50
.1 ~q
Cap(tu/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1.6- Tecnologas para la obtencin de productos bajos en colesterol

2.1.6.1- Mtodos microbiolgicos
Algunos microorganismos como los gneros Arthrobacter, Bacillus, Brevibacierium, Corynebacicriurn, ]vlycobacteriurn, Nocardia, Serrat/a y Slrepton2yces pueden convertir el colesterol en productos inocuos como son el dixido de carbono y el agua (Aihara y col., 1988). Estos mtodos an no estn totalmente desanollados para su uso. En las condiciones estudiadas, la oxidacin del colesterol no es completa y se producen elevados contenidos de xidos de colesterol, que se consideran ms aterognicos que el propio colesterol. Existen otros microorganismos, como Eubacterum, que reducen el colesterol a coprostanol, metabolito inocuo, pero la aplicacin de stos mtodos a los alimentos no es satisfactoria (Beitz y col., 1990).
2.1.6.2- Adsorcin
El colesterol puede ser adsorbido a partir de grasa lctea anhidra utilizando carbn activo,
pudindose eliminar hasta un 95% del colesterol.
Otra tcnica, propuesta tambin en 1989 (annimo), consiste en la formacin de complejos insolubles con saponinas.
La 13-ciclodextrmna es un oligosacrido cclico de siete unidades de glucosa. Su afinidad por molculas apolares o de polaridad media permite la formacin de fuertes complejos de inclusin con el colesterol. Bayol y col. (1988), Cully y col. (1990) y Roderbourg y col. (1990) han conseguido extraer el colesterol de lpidos o aceites, nata y yema de huevo mediante B-ciclodextrinas con xito. Oakenfiill y Sidhu (1992) describen un mtodo utilizado en Australia que discurre a bajas temperaturas, habiendo una mnima afectacin de los compuestos y prdida de compuestos voltiles. Cuando este proceso se 51
~. .:O:fV~~f~M~P,
leva a cabo en huevos o productos lcteos (leche o nata) se llega a eliminar hasta un 800% del colesterol total.
ji
2.1.6.3- Manipulacin de la alimentacin animal
2]
la habido intentos de alterar los niveles de colesterol en huevos y sangre de gallina por aedio de la manipulacin de la dieta o de aditivos de la alimentacin animal. Esto ncluye el aumento de las cantidades de protena, adicin de salvado de avena, pectinas,
it
ornas, escleroglucanos, cido nicotnico, grandes cantidades de vitaminas A, C, etc.. En
~ mayora de los casos los resultados no han sido los esperados. Sim y Bragg (1977)
bservaron que la adicin de fitosteroles en la dieta de las gallinas contribua a rebajar el olesterol sanguneo, pero elevaba el contenido en el huevo, debido a que su efecto nticolesterolemiante era causado por una inhibicin de la absorcin del colesterol de la .ieta, pero no tena efectos sobre el metabolismo del colesterol. El colesterol no puede
>12
ji
educirse en ms de un 15% nicamente mediante la dieta, lo que hace necesario emplear tras mtodos (Saijpaul y col., 1994).
1~
22>
2.1. 7- Anlisis de los cidos grasos de los alimentos por cromatografa de gases
a croinatografia of.rece unas grandes posibilidades de separacin y posterior

dentificacin de los cidos grasos; ms concretamente, la cromatografa de gases ha sido
~tcnica cromatogrfica que ms ha avanzado en los ltimos aos en el anlisis de los

cidos grasos.
it
:1 anlisis de los cidos grasos puede dividirse en dos pasos sucesivos, que son la
reparacin de la muestra y la posterior separacin cromatogrfica.
52
2. 1.7.1. Preparacin de la muestra
La preparacin de la muestra est encaminada hacia la formacin de derivados voltiles a la temperatura del mtodo cromatogrfico, puesto que la mayora de los cidos grasos no son voltiles, sera imposible llevar a cabo la separacin. Tambin, la muestra ha de ser preparada para conseguir la hidrlisis de los cidos grasos de los compuestos a los que estn esterificados, principalmente el glicerol. Los derivados voltiles ms comunmente utilizados son los steres metlicos, por su gran sencillez y rapidez de la preparacin. Sin embargo, presentan inconvenientes para el anlisis cuantitativo cuando los compuestos fonnados son extremadamente voltiles, tal es el caso de los steres metlicos de los cidos grasos de cadena corta como el butrico, caproico, caprlico, etc.. Otro inconveniente del uso de steres metlicos se refiere al anlisis cuantitativo de los cidos grasos insaturados (especialmente los poliinsaturados), ya que stos se oxidan fcilmente en el manejo de la muestra y se destruyen en el inyector por la alta temperatura necesaria
mencionado, los steres metlicos de los y cidos grasos son los derivados ms lo tiles y para una rpida volatilizacin (Shantha Napolitano, 1992). Pese a todo antes
~
4 ti 1?
~111
tambin ms utilizados cuando los inconvenientes se superan (por ejemplo, con un patrn interno).
Existen otros mtodos para la volatilizacin de los cidos grasos que pueden proporcionar
mejores resultados cuando stos se requieren. Pueden citarse los steres de butilo para
reducir la volatilidad de los steres de los cidos grasos de cadena corta, que pueden
mejorar los factores de respuesta en un valor de 0,3 (Iverson, 1986). Otros mtodos se
utilizan para el anlisis de cidos grasos libres y esterificados por separado (Martnez-
Castro y col., 1986; de la Fuente y col., 1993).
El anlisis cromatogrfico en s de los steres metlicos puede hacer variar los resultados
de un anlisis cuantitativo, que estn en funcin de que la esterificacin haya sido
cuantitativa antes de inyectar la muestra en el cromatgrafo de gases. Los factores a tener
en cuenta para una reaccin cuantitativa son principalmente los reactivos utilizados y el
53
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /ctea de nata,
tiempo necesario que ha de transcurrir para la esterificacin completa. A esto hay que aadir que el mtodo utilizado puede hacer variar la composicin de los cidos originales durante la reaccin, aparecer nuevos ismeros geomtricos y posicionales, y artefactos que lleven a confusin en el anlisis cualitativo de los cidos. Algunos estudios realizados (Sheppard e Iverson, 1975, Bannon y col, 1982a y b) concluyen que no hay un mtodo ideal entre todos los propuestos, pero que a la vez son todos igualmente apropiados si se realizan correctamente.
Varios investigadores han indicado que los reactivos que se fundamentan en la utilizacin de bases de alcalinos son los ms indicados para un mejor anlisis de cidos grasos por cromatografa de gases (Bannon y col,, 1982a; 1982b; Craske y Bannon, 1987; Craske y col., 1988). El mtodo de la potasa metanlica es muy empleado para la transesterificacin de los acilgliceroles en steres metlicos. El empleo de este reactivo tiene la ventaja de la rapidez y sencillez y de que la reaccin puede transcurrir a temperatura ambiente, en tales condiciones la reaccin transcurre cuantitativamente en 20 siempre que no haya una gran cantidad de cidos (Utrilla y col., 1976) y sin
A1~
mm,
1> 1
fi
problemas de isomerizacin. El colesterol y los esfingolpidos necesitan condiciones ms drsticas para la isomerizacin (Christie, 1982). La reaccin ha de llevarse en medio anhidro, normalmente heptano, para evitar la hidrlisis de los metilsteres y la
4 .k
3??
consecuente liberacin de los cidos grasos, ya que esto resultada en una cuantifiacin por defecto y a temperatura ambiente para que no haya conjugacin de las insaturaciones.
[>2?>
En cualquier caso, el mtodo establecido ha de seguirse estrictamente para conseguir una reproducibilidad y repetividad de ste. Se tendr en cuenta la temperatura de los disolventes de extraccin, la agitacin manual o con instrumentos como un generador de ultrasonidos o un vorex y cualquier paso en el mtodo que suponga una variacin en la solubilidad o volatilizacin de los compuestos. La adecuacin del mtodo deber probarse primero con patrones de cidos grasos de cadena corta o insaturada, que son los que ofrecen resultados ms variables y ms difciles de reproducir.
54
2.1.7.2. Sistema cromatogrfico
It
La eleccin de la polaridad de la fase estacionaria de una columna capilar de slice fundida es un factor importante de cara a obtener una buena resolucin de los picos y una fcil y rpida identificacin de stos en anlisis de rutina. Sin embargo, no constituye ste un factor decisivo, como ocurre en las columnas de relleno, ya que, independientemente de la polaridad de la fase los resultados suelen ser bastante satisfactorios cuando el resto de condiciones del anlisis se han optimado. El nmero de las diversas fases estacionarias es bajo silo comparamos con la mayor diversidad de fases para las columnas rellenas, este hecho se debe a que cubre todas las necesidades de los anlisis de los cidos grasos (Sidisky y Ridley, 1991). Se debe considerar que, silos resultados lo permiten, son preferibles las fases de menor polaridad, ya que suelen ser de ms larga vida y ms resistentes que las de mayor polaridad, como pueden ser las metilsiliconas.
La elucin de los steres metlicos en las columnas con fases apolares sigue un orden de acuerdo con el punto de ebullicin, eluyendo en primer lugar los steres de menor punto de ebullicin y por ltimo los que lo poseen mayor. Los derivados insaturados eluyen justo antes de los saturados de misma longitud.
La gran desventaja de las fases apolares es la mala resolucin en la separacin de cidos insaturados; por ejemplo, la elucin de los cidos oleico, linoleico y linolnico puede verse solapada entre s, lo mismo puede ocurrir con cidos de 20 y 22 carbonos en la cadena. Esto hace preferible utilizar fases de mayor polaridad, sobre todo teniendo en cuenta la gran importancia que tienen estos cidos en la composicin de los alimentos y de la leche entre ellos. Las fases estacionarias que actualmente cuentan con ms inters son las de polaridad intermedia, como los polietilenglicoles. Su aplicacin destaca para el anlisis de alimentos de origen marino, dada la gran resolucin que ofrecen en la separacin de los distintos ismeros de cidos grasos insaturados (Ackman, 1986).
55
En las fases polares o de polaridad media el orden de elucin es por punto de ebullicin cuando se trata de cidos grasos de cadena saturada lineal, posteriormente eluyen los cidos insaturados de igual longitud por orden ascendente de nmero de insaturaciones. Los cidos con dobles enlaces conjugados eluyen despus de sus correspondientes no conjugados. Los cidos ramificados eluyen a tiempos ms cortos que sus
correspondientes lineales, tanto ms cuanto ms cerca del carbono col est la ramificacin, y para ramificaciones iguales (Ackman, 1986).
El sistema de deteccin ms ampliamente utilizado es el FID (flame ionization detector) o de ionizacin de llama. Existen otros tipos de detectores ms completos,pero los datos que se aportan pueden ser innecesarios e insuficientes; tal es el caso de la espectrometra de masas, que slo con gran experiencia permite diferenciar ismeros insatu.rados en lo que se refiere a la posicin y configuracin del doble enlace y adems posee una menor sensibilidad que el detector de ionizacin de llama.
Respecto a la grasa lctea y sus derivados hay que resaltar que, quizs, son las grasas que ms variedad de compuestos presentan; siendo las que suponen un mayor reto para el anlisis de los lpidos que contienen. Los cidos grasos van desde 2 hasta 26 tomos de carbono, saturados, mono y poliinsaturados, con ismeros cis y (ram conjugados o no, y cidos lineales y ramificados. Para muestras en las que solamente sea nesesario identificar y cuantificar los cidos grasos esterificados, como triglicridos en su mayora, se prefiere utilizar columnas de polaridad intennedia, dando muy buenos resultados (De Jong y Badings, 1990). Christie (1989) resalta que la importancia econmica de la grasa lctea ha sido en parte importante causante del avance producido en el anlisis de sus componentes. As, ha sido posible la identificacin de 437 cidos grasos diferentes, siendo unos pocos de ellos de inters nutricional y nicamente entre 20 y 30 de ellos son de mayor inters para los analistas. Tambin seala que pueden presentarse problemas de cara a la buena separacin de los compuestos, pero las mayores dificultades aparecen en la cuantificacin. Los problemas son un conjunto de los mencionados anteriormente y son 56
1
principalmente: una transesterificacin completa sin prdidas de compuestos, la introduccin de la muestra en la columna evitando discriminaciones en las prdidas de compuestos en la divisin de flujo y recomienda que la programacin de temperatura sea
tal que los componentes de la muestra emerjan a intervalos de tiempo aproximadamente Kl
1~
iguales.
2.1.8- Anlisis de los trigilcridos por cromatografa lquida de alta eficacia
La tnica de HPLC en fase inversa no acuosa tiene una serie de ventajas en el anlisis de triglicridos sobre otras tcnicas cromatogrficas. Estas ventajas hacen cada vez ms del HPLC la tcnica de eleccin en el anlisis de los triglicridos y son las siguientes (Hamilton, 1986):
(a)
existe la posibilidad de separar los triglicildos sin necesidad de
formar derivados ni de que se descompongan por causa de altas temperaturas, como ocurre en los anlisis por cromatografa de gases; se cuantifican de modo ms sencillo que en cromatografa en capa
(b)
fina;
(c)
una vez separados, los componentes de la mezcla pueden recogerse
para contrnuar con anlisis posteriores.
El anlisis de los triglicridos de la grasa lctea supone el mayor reto en lo que se refiere al anlisis de triglicridos ya que es la muestra de origen natural ms compleja. Patton y Jensen (1975) ya sealaron que debido a la compleja composicin de los cidos &asos de la grasa lctea, prodran existir 64 x 106 especies distintas de triglicridos. Si consideramos solamente alrededor de 20 de los cidos grasos ms abundantes podra
57
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
haber 8000 especies moleculares de triglicridos incluyendo los ismeros posicionales.

,
Es por esto por lo que una muy buena separacin por HPLC no consiga a veces separaciones de especies nicas, sino, ms bien, de molculas de triglicridos semejantes (Christie, 1987).
Los primeros estudios que establecieron las bases de la investigacin tal como se lleva a cabo actualmente en lo referido a separacin de triglicridos por HPLC en fase inversa no acuosa fueron realizadas por Wada y col. (1977, 1978). En estos estudios se pueden destacar dos contribuciones:
(a)
la caracterizacin individual de cada especie molecular de triglicrido por
medio de lo que se denomin nmero de particin (NP), siendo,
NP=NC-2XND (2.1)
donde NC
ND
nmero de carbonos del triglicrido, exceptuando los del glicerol, nmero de dobles enlaces,
(b)
el establecimiento de una relacin entre el NP de cada triglicrido y el
factor de capacidad k de cada uno de los picos del cromatograma.
De este modo dedujeron que los triglicridos eluyen en orden ascendente de NP y que para triglicridos con un mismo NP eluyen primero los de mayor ND.
El nmero equivalente de carbonos (NEC) fue defmido por Herslf y col. (1979) segn la
siguiente ecuacin:
NEC=NC-aXND
(2.2)
siendo a un valor prximo a 2 dependiente del sistema cromatogrfico.

58
An as, aparecen pares criticos de triglicridos que poseen los mismos NEC y ND, constituyendo un problema en la identificacin de las especies. Las mezclas complejas de triglicridos, cuyo intervalo de NEC es amplio, son difciles de analizar por mtodos isocrticos, por lo que generalmente se realizan mediante gradiente de polaridad (Robinson y Macrae, 1984; Barrn y col., 1990).
2.1.8. 1. Sistema cromatogrfico
El detector de masa o de luz difundida ha sido introducido recientemente en el anlisis de
triglicridos. Se basa en la evaporacin de la fase mvil y la medida de la luz reflejada y refractada por las partculas slidas de soluto que se forman, La ventaja principal de este detector es que se puede utilizar con gradientes de polaridad, hecho que no era posible con el detector de ndice de refraccin y complicado con el ultravioleta, si bien, la sensibilidad es menor que la del detector UV (Christie, 1991).
La composicin de la fase mvil puede variar segn el tipo de triglicridos que se vayan a analizar y segn otras condiciones cromatogrficas, como puede ser el tipo de detector a emplear. Generalmente se utilizan disolventes no acuosos (Barrn y Santa-Mara, 1987). En lo que se refiere a la fase estacionaria influye la polaridad de la fase, tamao de partcula y longitud de columna. De las columnas estudiadas, las de octadecilslice son las de mejores resultados (Goiffon y col., 1981; Podhala y Tregard, 1982; Deffense,
1984; Barrn y col., 1987).
2.1.8.2. Anlisis cuali-cantitativo
Una dificultad a la hora del anlisis cualitativo de la muestra se debe a que existen pocos triglicridos mixtos en estado puro que puedan ser utilizados como patrones para la 59
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /ctea de nata.
identificacin. Para realizar esta identificacin de las especies moleculares de triglicridos separados por HPLC se han estudiado relaciones entre el tiempo de retencin y el nmero de particin (Wada y col., 1977; 1978), el nmero equivalente de carbonos (Herslf y col., 1979, Frede, 1986), y la longitud de cadena equivalente (Goiffon y col., 1981), segn la cual existe una relacin lineal entre el logk y las longitudes e insaturaciones de cada cido graso integrante de cada triglicrido, cumplindose que:
logk=K+CMIA c<~ d~
+ C15l8
cdfldB + Cicle
CdCdc
(2.3)
siendo K la ordenada en el origen, A, B y C los cidos grasos componentes del triglicrido, /a longitud de cadena de cada cido graso, d el nmero de dobles enlaces de cada cido graso, ci,, los coeficientes de cada variable independiente,
El mtodo de EI-Hadmy y Perkins (1981) se basa en el clculo del TCN (nmero terico de carbonos). ste puede ser determinado para cualquier triglicrido a partir de la regresin lineal del logk frente al NC de su correspondiente triglicrido saturado por interpolacin de su logk. De este modo cualquier triglicrido saturado posee un TCN coincidente con su NC y con su NEC. El factor U se utiliza para calcular el TCN de triglicridos insaturados y se calcula experimentalmente a partir de la diferencia en el NP de patrones insaturados y sus correspondientes saturados tras la interpolacin de su logk.
El proceso se lleva a cabo con el clculo de las siguientes ecuaciones:
*
log k
bNPt~, bNPt~~,
(2.4)
log k
3
(2.5)
~Uj
NP;, -NIj~0~,
(2.6) 60
rtwrr~
19Sm
4
1>
TCN= NPJ, Xu,.
(2.7)
siendo NP
NC para triglicridos saturados; en el caso de insaturados se obtiene
experimentalmente por interpolacin.
Otros trabajos, como el de Takahashi y col. (1988), proponen las siguientes ecuaciones para la estimacin de los triglicridos:
logk MB
2/3 logk u.,~, + 1/3 logk 8DB
(2.8)
logk
ABC =
1/3 logk t~AA + 1/3 logk 888
1/3 logk ~c~ (2.9)
siendo A, B y C los cidos grasos que componen un triglicrido.
La complejidad de la composicin en triglicridos de la grasa lctea hace que la resolucin cromatogrfica y eJ anlisis cualitativo sean ms difciles que en otras grasas y aceites. Por ello se realizan acoplamientos entre dos o ms tcnicas analticas como son HPLC y OC (BalTn y col, 1990, Maniongui y col., 1991).
En este trabajo se ha conseguido una mejor estimacin de la composicin en trglcridos de la grasa lctea por combinacin de HPLC y OC, y de modelos matemticos basados en el clculo del NEC (a partir de NC y ND,y de NC y ND de cada cido graso integrante de cada triglicrido), y del propuesto por Takahashi y col. (1988).
G1
Cap/tu/o 2. Ap/bodn a la extraccin de grasa lctea de nata,
21.9- Espectroscopia de resonancia magntica nuclear de 3C de alta resolucin en lpidos La resonancia magntica nuclear ha tenido un uso muy Initado en el anlisis de grasas y aceites naturales hasta recientemente, probablemente debido a la carencia de informacin bsica de la materia y al elevado coste de los equipos.
El uso de la RMN de protn (H) ha sido muy limitado por aportar un nmero pequeo de seales, dando poca informacin, aunque existen trabajos que utilizan su mayor sensibilidad para la determinacin de compuestos minoritarios, como los diglicridos en aceites vegetales y la combinacin con la 3C-RMN para realizar correlaciones heteronucleares bidimensionales {Sacchi y col., 1991). Otros trabajos se basan en la mejor y rpida cuantificacin de la ~I-l-RMNpara cuantificar los mono-, di- y triglicridos por separado a pesar de que puede haber solapamiento de seales o en una tpida caracterizacin de extractos lipdicos (Sparling y col., 1989; Sze y Jardetzky, 1990; Pollesello y col, 1991). Sin embargo, la 3C-RMN est adquiriendo importancia, los equipos actuales llegan a ser de 300 MHz o mejores y, a pesar de su coste, son ms asequibles, y su mayor resolucin es una herramienta ms til para la caracterizacin de mezclas de triglicridos (1-lenderson y col., 1994).
En la tabla 2,1.9 se presentan los desplazamientos qumicos de los grupos funcionales ms comunes en lpidos (Pretsch y col,, 1976; Levy y col,, 1980).
Tabla 2.1.9. Desplazamientos qumicos ms comunes en lpidos. Grupo Funcional H 3C-C 8(ppm) 0-30 0-30 10-40 10-70 20-100 62
C-C~C C-C=C C-CI-12-C
Capitulo 2. Aplicacin a la exfraccin de grasa lctea de nata.
tabla 2.1.9 (contuniacin C-0H2-COX (X:C,O,N> C-CH2-O CH2-O-P-O

C-COX (X:C,O,N) C-COOH
30-60 58-92 60-80 80-160

165- 180 175-185
(continuacin) Se poseee actualmente cada vez ms informacin sobre los desplazamientos qumicos usando especies moleculares individuales, como el linolenato de metilo representado en la figura 2.1.9, Esto se puede aplicar a espectros ms complejos de muestras naturales (Gunstone, 1993a; 1993c; 1994), aunque la optimizacin de los parmetros de adquisicin y procesado de los espectros para reducir et tiempo de las experiencias, y la comparacin de los resultados con los obtenidos por los mtodos de rutina an estn en las primeras fases (Sacchi y col., 1992).
2.1.9.1- Estudio dela grasa lctea
La grasa lctea tiene como caracterstica el contener cidos grasos de cadena corta, que producen seales de RMN muy caractersticas y diferentes a las de los cidos de cadena media y larga, adems de que su solapamiento suele ser menor, Utilizando los datos de las intensidades puede saberse la composicin molar porcentual de los cidos butrico, caproico, caprlico, monoinsaturados, poliinsaturados, y diferenciar la presencia de ismeros t y ttans, Existen tablas que aportan datos de desplazamiento qumico de los carbonos Cl-C3 y wl-w3 (que son los ms definitorios a la hora de distinguir los cidos grasos de cadena corta) y de otros carbonos de inters en grasa lctea como son los olefinicos y allicos (Gunstone, 1993b). Este mismo trabajo realiza un anlisis de diferentes grasas animales, vegetales y frmulas infantiles para detectar adiciones de 63
CapItulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
TMS
12
>1r~
CDCI3
1
JI
180
160
140
120
100
80
60
40
20 ~(ppnt)
Figura 2.1.9. Espectro de 3C.RMN del linolenato de metilo en CDCI3 con TMS como patrn interno (Cliristie, 1990). DespazilmidlitOS qumicos: C1, 174,16; C-16, 131,92; C-9, 130,24; C-12/13, 128,29; C.10, 127,8; C.15,127,18; -O-CH3, 51,36; C-2, 34,11; C-7,29,63; C-415/6, 29,21 a 29,18 C-s, 27,25; C-11, 25,68; C-t4, 25,58; C-3, 24,99; C-17, 20,60; C-18, 14,29.
64
Caplu/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
grasa lctea, aceites lnricos, grasa parcialmente hidrogenada y cidos poliinsaturados, sin embargo presenta los resultados de manera semicuantitativa.
2.1,9.2- Estudio de aceites vegetales Los compuestos de mayor inters y sencillez de identificacin y cuantificacin son los cidos grasos insaturados tras la asignacin de los carbonos olefinicos, alilcos y divinilmetilnicos. Tamben se pueden cuantificar los cidos grasos libres separadamente de los esterificados y los compuestos de la fraccin insaponificable. La mayorfa de los estudios se han realizado para detectar mezclas de aceites de oliva vrgenes y refinados (Sacch y col., 1990), determinacin de diglicridos (Sacchi y col., 1991), distribucin posicional de los cidos grasos de los triglicridos de aceite de oliva (Saech y col., 1992), que pretende utilizar la RMN para detectar mezclas de aceites de oliva virgen con aceites esterificados sintticamente evitando procedimientos qumicos para la preparacin de la muestra. El trabajo de Zamora y ccl, (1994) consisti en la caracterizacin de la fraccin insaponificable de aceites de oliva y orujo de ojiva, aportando datos sobre los desplazamientos qumicos del escualeno, esteroles y alcoholes triterpnicos. Los mtodos de resonancia pueden ser muy tiles para usarlos como referencia en mtodos enzimticos de rutina, pero no como mtodos de rutina debido a la duracin de las experiencias y, sobre todo, al coste requerido de los equipos.
Otros estudios se encaminan a la caracterizacin de aceites ricos en cidos grasos de uso en fabricacin de pinturas, plsticos, sntesis qumica o estudios metablicos, como el trabajo de Neff y col. (1993) para la caracterizacin de ceites de semillas de Vernonia galarnensis y Crepis alpina, ricos en cidos vernlico y crepnico respectivamente.
65
CapItulo 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1.9.3- Estudio de aceites de pescado

Los aceites de pescados ms estudiados han sido los de salmn (Aursand y col., 1993) y atn (Sacchi y col., 1993), ya que son ricos en cidos eicosapentaenoico y docosahexaenoico, cidos grasos poliinsaturados de la familia (n-3). Estos cidos grasos presentan seales con desplazamientos qumicos caractersticos en las regiones olefinicas y carbonlicas, y al presentarse en alta cantidad pueden ser cuantificados y comparados satisfactoriamente con mtodos convencionales de anlisis como la OC. Sacchi y col. (1993) adems realizan una caracterizacin del aceite del atn y cuantifican los cidos grasos libres, la distribucin posicional ct-~ de los cidos grasos poliinsaturados esterificados a glicerol y la concentracin de fosfolpidos.
p
si
Ii 1>
1<
66
VV.
u;cflT.:us?.u.uIiu,wPwnnI
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de traa
ESTIMACIN DE LA COMPOSICIN EN TRIGLICRIUOS DE LA GRASA LCTEA
2.2- MATERIALES Y METODOS
221- Preparacin de la muestra La leche cruda de oveja fue proporcionada por el Complejo Agropecuario de la Zomunidad de Madrid situado en Aranjuez.
a extraccin de la nata se lleva a cabo calentando la leche en un bailo de agua a 3 5-40 >C darante 20-30 mm. Posterionnente, la nata se separa por centrifugacin a 20 0C
lurante 30 mm a 3000 r.p.m.. Los tubos que contienen la leche centrifugada se ponen en
ma bao de hielo hasta que la nata se ha solidificado, recogindose y guardndose en ..ongelador a -20 0C hasta su posterior anlisis.
~a extraccin de los triglicridos se llev a cabo segn un trabajo de Barrn y col. 1990). Un gramo de nata se deposita en un matraz al que se aade el disolvente de ~xtraccin ii-hexano (Panreac), conteniendo BHT (Fluka) como antioxidante en urna ~oncentracinde 0.1 mg/mL, en una relacin de 10/1 (mL/g). La mezcla se homogeniza
rn un bao de ultrasonidos y se introduce en un embudo de decantacin, al que se aade

sanol (Panreac)-agua destilada (80:20, vol/vol) en una relacin 3/2 respecto al volumen Le ii-hexano utilizado. La mezcla se agita enrgicamente y se deja reposar hasta la .ompleta separacin de las fases. La inferior, hidroalcohlica, se lava dos veces con iexano. Los lavados con hexano se aaden a la fase orgnica inicial.
ti-
4a fraccin orgnica se filtra con papel Wathman LPS y se concentra a sequedad en
orriente de nitrgeno. El residuo triglicrico (alrededor de 0,50 g) se redisuelve en 2 ml .e hexano y se filtra a travs de membrana de tamao de poro 0,2 .mm. Se inyectan 10 j.it
67
>3
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata. 1>
de la disolucin para el anlisis por cromatografla lquida de alta eficacia. Para la recogida de fracciones a la salida de la columna se inyectaron volmenes de 20 gL,
2.22- Anlisis de triglicridos de grasa lctea por cromatografa lquida de alta eficacia
El mtodo de cromatografia lquida de alta eficacia utilizado para el anlisis de los triglicridos se bas en uno previamente desarrollado por Hierro y col. (1992) y Hierro (1994). El sistema cromatogrfico utilizado consisti en dos bombas modelo 125 (Beckman), un inyector Rheodyne modelo 7125 con un bucle de carga de l0.tL, se utilizaron dos columnas de acero inoxidable de 25 cm y 15 cm x 4,6 nun de di. rellenas con Spherisorb ODS-2 de 3 hm de dimetro (Phase Separations, Synita) conectadas en serie y termostatizadas en un bao de agua a una temperatura de 30 0C. Se utiliz un detector de masa (ACS 750/14, The Arsenal) con una temperatura en el evaporador de 45 0C y 138 kPa de presin de aire. El aire a presin era proporcionado por un compresor (Mr Control) y posteriormente secado por dos trampas de agua. Los vapores formados en el detector eran eliminados mediante un extractor. La deteccin de patrn de tributirina para el estudio del NEC se realiz bajando la temperatura del evaporador del detector hasta 20 0C.
La fase mvil consisti en una elucin en gradiente desde O a 70% (vol/vol) de acetona en
acetonitrilo (ambos de grado HPLC) en dos etapas: un inicial aumento lineal de 0,70/o/min en acetona durante 50 mm seguido de elucin isocrtica durante los siguientes 20 mlii, y un segundo aumento lineal de 0,7%/mm de acetona en acetonitrilo seguido tambin de una elucin isocrtica de 42 mm hasta el final del anlisis. El flujo empleado> fue de 0,9 mL/mm y la presin de 17,2 MPa. El gradiente y la adquisicin de datos provenientes del detector se controlaron con el programa System GoId (Beckman) a travs de una interfase modelo 406 (Beckman).
68
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /ctea de nata. ~
223-Recogida de fracciones
La recoleccin de fracciones a la salida del sistema cromatogrfico fue necesaria para realizar un posterior anlisis de cidos grasos tras la separacin por HPLC, con el fm de identificar las especies moleculares mayoritarias de triglicridos. El carcter destructivo del detector de masa hizo necesario la toma de fracciones en un punto anterior a ste y su cronometracin basndose en inyecciones previas, puesto que no es posible [a adquisicin de datos. Las fracciones se recogieron cada 40 s a la salida de la columna a partir del minuto 14 (ya que anteriormente a este tiempo no hay todava elucin de compuestos), de tal forma que no hubo recogida de ms de un pico cromatogrfico estrecho por fraccin y que picos anchos pudieron ser recogidos en fracciones sucesivas.
En total se recogieron 227 fracciones de I-IPLC conteniendo triglicridos disueltos en la
fase mvil. Estas fracciones se guardaron en congelador hasta su anlisis por cromatografia de gases.
2.2. 4- Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones F-IPLC por

cromatografa de gases
2.2.4.1- Preparacin de la muestra
Los triglicridos separados mediante HPLC y recogidos en fracciones se hidrolizaron para analizar sus cidos grasos constituyentes como steres metlicos (FAME).
69
Capitulo 2. AplicacIn a la extraccin de grasa lctea de nata,
i1~
1
Los triglicridos contenidos en las diferentes fracciones se depositaron en viales de fondo cnco de 1 mL de capacidad para favorecer la concentracin de la muestra y se llevaron a sequedad por evaporacin de la acetona y acetonitriilo mediante una corriente de nitrgeno.
La preparacin de la muestra fue una modificacin de los mtodos descritos por Utrilla y col. (1976) y Barrn y col. (1990>. El mtodo se basa en la formacin de steres metlicos de los cidos grasos, derivados voltiles en las condiciones de anlisis. Las modificaciones realizadas tuvieron como fines una mayor concentracin de la muestra en el disolvente de inyeccin y alargar el tiempo de inyeccin hasta 100 mm. En el vial cnico conteniendo los txiglicridos se adicionaron 20 hL de n-heptano (MerlO y 10 uL de KOI-1 2N en metanol. La mezcla se agit en ultrasonidos durante 1 mm. Se inyect 0,1 pL de la fase heptnica conteniendo FAME tras 20 niin.
La tripelargonina se utiliz como patr interno ya que sta no era detectada en los anlisis de las muestras.
2.2.4.2- Sistema cromatogrfico
El anlisis de los cidos grasos de los triglicridos de las fracciones recogidas se realiz en un crornatgrafo de gases HRGC 5160 Mega Series (Carlo Erba) equipado con un detector de ionizacin de llama (FID) y un inyector con posibilidad de divisin de flujo (sp/ii/spliI/ess).
Se utiliz una columna de slice fundida de 24 m x 0,23 mm de di. recubierta con SP1000 (Supelco), cuyo espesor de fase era de 0,25 p.m. Como gas portador se utiliz N2 a 0C, detector a 40 kPa de presin. Las condiciones fueron las siguientes: inyector a 275 250 0C, temperatura inicial de la columna 40 0C mantenidos durante 4 mm, seguida de
70
1v >1
>3
una rampa de temperatura de 10 0C/min hasta alcanzar los 150 0C, y otra de 2 0C/min hasta 200 C y esta temperatura se mantuvo durante 60 niin hasta el final del anlisis. Los cromatogramas y los resultados se procesaron mediante un integrador Spectra-Physics modelo Data Jet. La duracin del anlisis permiti la buena separacin de los cidos grasos de la muestra ya que la mayor sensibilidad del equipo utilizado permiti la deteccin de cidos grasos minoritarios como los ramificados, los de cadena impar y los ismeros de linoleico y linolnico. La pequea cantidad en la que se encontraban los triglicridos a la salida de la colunma del HPLC hizo necesaria la inyeccin sin divisin de flujo (splless) y su mantenimiento durante 20 s para permitir la entrada de la totalidad de la muestra en la columna. Tras este tiempo el flujo de split fue de 40 mL/mm.
2.2.4.3-Anlisis cualitativo
La identificacin de los cidos grasos que constituan los triglicridos de las distintas
fracciones de HPLC se llev a cabo mediante la comparacin de los tiempos de retencin con los obtenidos en el anlisis de una mezcla de patrones de cidos grasos. La identificacin de cidos grasos ramificados, de cadena impar y los insaturados minoritarios no fue posible con patrones y se recurri a la bibliografa existente (Antila y Kankare, 1983; De Jongs y Badings, 1990).
Los paflones utilizados tenan una pureza de aproximadamente del 99% y fueron los siguientes:
esteres metlicos de los cidos butrico, caproico, caprlico, cprico, lurico,

71
mirstico, palmtico, esterico, oleico, linoleico y araquidico (PolyScience Corporation),
Cap(tu/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
1>~
-
steres metlicos de los cidos lrans-vaccnico y a-linolnico (Sigma Chemical).
2.2.4.4- Anlisis por cromatografia de 2ases acoplada a esuectrometria de masas

(OC/MS
Para el anlisis por OC/MS se inyectaron muestras de triglicridos de grasa de leche de oveja con el fin de confirmar la identificacin de cidos grasos de asignacin dudosa. Sin embargo, algunos estudios, como el de Christie (1989) indican que no siempre los derivados metlicos son indicados para la identificacin mediante la MS, adems insiste en que sta sea la tcnica espectroscpica ms dependiente de la experiencia del investigador para la identificacin de estructuras moleculares y que no hay reglas estrictas en la rotura de las molculas. Christie tambin seala que, en el caso de la elucidacin de cidos grasos insaturados, no se forman iones que sirvan de indicacin para la localizacin o estereoqumica de los dobles enlaces en los ismeros de posicin, debindose a una posible migracin de stos cuando se forma el ion molecular y dando numerosos productos intermedios y consiguientemente iones muy diversos. En el caso de los cidos poliinsaturados, sus espectros ofrecen iones con varias intensidades, pero no puede decirse que sirvan para la interpretacin de la posicin de los dobles enlaces. Nonnalmente, se considera que la ventaja de la CC/MS se debe a que aporta datos sobre los pesos moleculares de los compuestos junto a los de los tiempos de retencin, lo que se puede considerar bastante satisfactorio. La dificultad en la identifiacin se extiende tambin a los cidos grasos de cadena ramificada, y sobre todo a la hora de discernir entre ismeros
SO
y anletw.
La preparacin de la muestra consisti en la extraccin de triglicridos por el mtodo descrito en el apartado 2.2.1 y posterior formacin de los steres metlicos de los cidos grasos segn el apartado 2.2.4.1.
72
El equipo utilizado fue un cromatgrafo de gases 5890 Series II acoplado a un espectrmetro de masas 5971A, ambos Hewlett-Packard. Las condiciones del mtodo de inyeccin fUeron las mismas utilizadas en el apartado 2.2.4.2 excepto que el gas portador utilizado fue helio.
2.24.5- Anlisis cuantitativo La cuantificacin de los cidos grasos se realiz siguendo la tcnica del patrn interno. Se utiliz tripelargonina como patrn debido a que sta no se encontraba en cantidades detectables en las muestras inyectadas y a que era el compuesto de estructura ms semejante a los cidos grasos de cadena corta, y por tanto ms voltiles, presentes en la eche (butrico, caproico y caprlico).
Asimismo, tambin se observ que se producan menores respuestas de los cidos grasos insaturados, por lo que se decici utilizar otro patrn interno para su cuantificacin. Se tom el propio cido palmtico de la muestra como padrn interno de estos compuestos ya que en la zona de elucin prxima no era posible utilizar ningn compuesto inexistente en la muestra sin que coeluyese con los ya presentes. Adems, el cido palmtico es el ms abundante en la leche, por lo que quedaba asegurada su presencia en la mayora de fracciones de HPLC y prcticamente no sufra modifiaciones durante la preparacin de la muestra o inyeccin, por lo que se consider que tena un factor de respuesta (Fr) de 1 respecto al cido pelargnico.
Del mismo modo, se asign al patrn interno y resto de cidos grasos presentes en la muestra (cidos grasos de cadena media y larga saturados lineales y ramificados) un Fr 1.
=
73
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nato.
Para el clculo del factor de respuesta de los cidos grasos de cadena corta o insaturada se prepararon soluciones patrones de los siguientes compuestos en las siguientes cantidades:
150 ig/mL de tripelargonina y tripalmitina, 10, 15, 50, 75, 100, 150, 225 y 300 ng/mL de tributirina, tricaproina, tricaprilina,
trioleina, trilinoleina y trilinolenina.
Las soluciones se inyectaron 5 veces y se procedi al clculo del factor de respuesta y la desviacin estndar relativa. El factor de respuesta se defmi como:
F~
(2.10)
siendo: F~ el factor de respuesta del compuesto i,
Q la concentracin del compuesto /, Gp, la concentracin del patrn interno,

A1 el rea del compuesto /, A~, el rea del patrn interno.
2.2.5- Desarrollo de modelos matemticos
Se inyectaron en el HPLC y por quintuplicado soluciones de los siguientes patrones: tributirina, ticaproina, tricaprilina, tripelargonina, tricaprina, trilinolenina, trimiristoleina, trilaurina, 1 ,2-dilauroil-3-miristina, tritridecanoina, 1 ,2-dinristoil-3 -laurina, trilinoleina,
dimiristol-3 -palmitina, tripentadecanoina, 1 ,2-dipalmitol-3-miristina, trioleina,
1,2-
dioleoil-3 -palmitina, 1 ,2~dipalmitol-3-Olena~ tripalmitina, 1,2-dioleol-3 -estearina, 174
...
Ir~-.
estearol-2-oleol-3-palmitina, 1 ,2-diestearol-3-miristina, trimargarina, 1,2-diestearoil-3 olena, 1 ,2-diestearol-3 -palmitina y triestearina.
La inyeccin de estos patrones permiti el clculo del factor de capacidad (k) a partir de sus tiempos de retencin (tr) y el tiempo muerto (to).
A partir de estos datos y del nmero de carbonos, NC. y nmero de dobles enlaces, ND, de cada triglicrido arriba indicado se realiz un anlisis de regresin lineal mltiple (ecuacin 12) mediante el programa IR de BMDP (Statistical Software Inc.). Posterionnente se calcul el NEC de los triglicridos puros utilizados como patrn (ecuacin 14) y por ltimo se realiz otro anlisis de regresin lineal de logk en funcin del NEC (ecuacin 15) (iR BMDP). Los clculos a seguir fueron los siguientes:
13
(2.11)
logk=a+bNC+CNII (2.12)
<2.13)
NEC=NC+a>ND (2.14) logk%d+eNECEJt (2.15)
siendo EE el error estndar de la regresin.
Se puede estimar el k de un triglicrido dado y viceversa, el NEC que corresponde a un pico.
75
Debido a que al realizar un anlisis de regresin siempre se produce un error (EE) se decidi calcular un NEC mximo y un NEC mnimo que delimitaran un intervalo para un valor de k:
NEQ~
Iogk~~d~EE; (2.16)
e
NECniat
ogk
d+EE;
(2.17)
Se aplicaron tambin los modelos desarrollados por Takahashi y col. (1988), lo que oblig a la inyeccin de patrones de triglicridos heterogneos y homogneos. Se utilizaron los tiempos de retencin de los patrones en el anlisis por regresin lineal (IR BMDP) para conseguir el cumplimiento de las siguientes ecuaciones:
logk
A.AB
2/3 logk
~j~
1/3 logk BBB, (2.18) 1/3 logk ~ (2.19)
logk ABC = 1/3 logk MA + 1/3 logk BBB
Los patrones utilizados fueron los recogidos en la tabla 2.2,4.5.
76
41 Captulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
Tabla 2.2.4.5. Triglicridos puros utilizados como patrones para el
desarrollo de los modelos de Takahashi y col. (1988).

_____ AAA
BBB
CCC
LaLaM MMLa LL0 MMO MMP AAB PPM OOP PPO
LaLaLa MMM LLL MMM MMM PPP 000 PPP
MMM LaLaLa 000 000 PPP MMM PPP 000
008
SSM SSO sSP ABC OPS
000
SSS SSS SSS 000
Sss
MMM 000 PPP PPP SSS
Los triglicridos del aceite de soja estn perfectamente caracterizados (Barrn, 1989), ya que posee nicamente 14 especies moleculares detectables mediante el mtodo de HPLC utilizado. De los 12 triglicridos heterogneos, 4 poseen los tres cidos grasos distintos. Por tanto, se realizaron inyecciones de aceite de soja, del mismo modo que la inyeccin de patrones, para obtener ms datos que proporcionaran mejores resultados.
Tambin se desarroll el mtodo de Goiffon y col. (1981) para el clculo de la longitud de cadena equivalente. De este modo se pretendi obtener el mayor nmero de modelos posibles que apoyasen y facilitasen la estimacin de los triglicridos.
Se inyectaron mezclas de patrones de FAMEs (PolyScience Corporation) en el HPLC con el fin de establecer una relacin entre los tiempos de retencin de estos steres y de los triglicridos y sus constantes moleculares mediante el programa lR (BMDP) de regresin
77
0
lineal mltiple, Los patrones se disolvieron en acetona y se inyectaron pci triplicado cada una de las disoluciones siguientes: FAMEs de C4:0, C6:0, C7:0, C8:0, C9:0, CLO:0, C1l:0, C12:0 y C14:0, FAMEs de C16:0, C1S:O, CE:! (O), C18:2 (L), C18:3 (Ln), C20:0 y C22:O
disueltos al 10% en etilbenceno,

-
mezclas de ambas disoluciones,
Se intercal un detector UV (LDC Analytical) a 210 un entre la columna de HPLC y el detector de masa para mejorar la deteccin de los FAMEs ms voltiles. Sin embargo, fue necesario el uso del detector de masa para la deteccin de los FAMEs de mayor peso molecular porque el gradiente de acetona produca una fuerte deriva de la lnea base en el detector Uy.
2.26- Estimacin de a composicin en triglicridos de la guiso de leche de oveja La composicin en triglicridos se estim segn una modificacin del mtodo descrito por Barrn y col. (1990), basado en el clculo del NEC a partir de los kW de los picos cromatogrficos de HPLC y en la composicin molar en cidos grasos en cada fraccin recogida a la salida de la columna y analizada por OC y teniendo en cuenta que las tres posiciones de los cidos grasos en el glicerol son equivalentes, hecho que se justifica porque el anlisis por HPLC no separa ismeros de posicin (Bailey, 1951; Hersldf y Kindmark, 1985; Perrin y Prvot, 1986).
Para el tratamiento de los datos en la estimacin de la composicin los triglicridos se cre un programa informtico en lenguaje QuickBasic (Anexos 1 y II), en el que a partir de los datos de reas de los cidos grasos presentes en cada fraccin y los NEC
78
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa (dciea de nala,

1~
correspondientes a cada tiempo se obtuvieron los triglicridos posibles en mayor proporcin en cada fraccin.
22.7- Comparacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de oveja, cabra y vaca. La leche cruda de vaca (1 muestra de 250 mt) para el estudio de comparacin fue proporcionada por la granja diplomada La Chirigota, en Villanueva del Pardillo (Comunidad de Madrid); la leche cruda de cabra (1 muestra de 250 mt) se obtuvo de la granja Queseras Ibricas, en Fuenlabrada (Comunidad de Madrid). La leche oveja se obtuvo segn se explica en el apartado 2.2.1.
La fraccin triglicrica de la leche de las tres especies animales se extrajo del modo indicado en el apartado 2,2.1 y posteriormente se realiz un anlisis por HPLC segn se ha indicado previamente en el apartado 2.2.2.
La aplicacin del programa de desconvolucin de picos permiti que stos fueran agrupados de acuerdo con sus constantes moleculares. Las especies moleculares se agruparon segn su NEC en NEC = 34; 34 <NEC =40 y NEC
>
40.
7.9
2.3- RESULTADOS Y DISCUSIN

2.3.1- Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones de HPLC por cromatografa de gases
2.3.1.1- Anlisis cualitativo
El anlisis de los cidos grasos de la grasa lctea por cromatografia de gases permiti la
separacin e identificacin de 43 especies moleculares distintas (figura 2.3.1.1). Con estos resultados se destaca el gran nmero de distintos cidos grasos constituyentes de los triglicrides de la grasa de la leche, hecho que dificulta la identificacin de estos ltimos. Los cidos grasos mayoritarios son los de cadena saturada par junto con oleico y linoleico, pero tambin se detectaron cidos grasos de cadena impar, tanto saturados como insaturados, ramificados, e ismeros de los cidos oleico, linoleico y linolnico. Suponiendo que los cidos grasos se esterificaran al azar a la molcula de glicerol, las especies posibles sedan 433 79.507.
2.3.1.2-Anlisis yor GC/MS
Los resultados obtenidos inediente el anlisis de los cidos grasos por CC/MS sirvieron para confirmar la identificacin de algunos cidos grasos de asignacin dudosa, en especial los cidos de 19 y 20 carbonos y los insaturados de 18. El ion molecular del espectro de masas nos aport informacin sobre los pesos moleculares de los diferentes compuestos, de este modo se pudo averiguar sin ninguna duda el nmero de carbonos y de insaturaciones de los cidos antes mencionados. Sin embargo, no fue posible determinar la posicin de los dobles enlaces en la cadena hidrocarbonada ni su isomeria cis-lrans.
80
~
o
o
_
Q e
4>..
iflcf. 7~4
,,~
u
CQ..
L.. ~
>-~
o
..
c2
~ -.-~
rl
<4
o
fl
~>
4.>
064 a>
00
4>
oc
5
o
.~
<
~o ~O...
fl
4U~-t
c~ 9~
tn
00
~n
o
~ c~
__
:~
4j:
o
9~e~tt~Cfl
..
A-,
oc
-
cd ~ t C)
C~
81
4;~ r%~
La utilizacin de helio como gas podador en el mtodo desarrollado, que utiliza nitrgeno, produjo una disminucin de los tiempos de retencin y por ello la resolucin empeor; no obstante, el nmero de picos y su orden de elucin no vari.
En la figura 2.3. 1.2a se presenta un cromatograma de la corriente total de iones (TIC) obtenido mediante el anlisis OC/MS, en l aparecen los steres metlicos de los cidos grasos. En la mayora de los casos fue posible la completa caracterizacin de los compuestos, gracias a la comparacin con patrones, sin embargo, en el resto solamente
pudo obtenerse infonnacin de sus nmeros de carbonos y de dobles enlaces. En las

figuras 2.3.1.2b y 2.3.1.2c se ofrece una ampliacin de la TIC entre los 30 y 50 mm del anlisis GC/MS y las corrientes de los iones 268, 284, 292, 312, 310 y 294,
correspondientes respectivamente a los iones moleculares de los steres metlicos de los

cidos C16: 1 (el segundo de ellos corresponde al cido palmitoleico), C17:0 (ramificados y lineal, respectivamente), linolnico, nonadecanoico, nonadecenoico, y C18:2 (el segundo colTesponde al cido linoleico). Esto nos ha permitido asignar los tiempos de retencin de compuestos con distinto peso molecular.
82
Captula 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
-d
40
-O o
u
0 o
ca
o
o
ca
o o
o
ca
o
u
(a
o
.4-. (a
4> ca
o
42
4-.
o
42
o o
eN
en
rl
o
-a a
.0
a (u
4 0
o
0
s o 4.
0
rs 4 ei
4
o
4.
r~
o
0
r
O o 0
II,
1~
1--
83
41?
4
(f
Ahu3ndpncln
1 .Se-07
Cap4$fy 2. A4licacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
1.4
0-4-07
.2o-07
e-.-07
6000000
6000000
4000000
2000000
32.00
34.00
36.00
44.00
46.00
Abundancia
e coco
76000
Ion 268
70000 e ecco coceo
Sao 00
50000
46000
.40000 26000 acoco 26000

20000 46000
1 1
Tiempo
icaco 6000]
....>0
SL4..
$400
36,00
asco
40.00
4~.O0
44.00
46.00
40.00
Ion 284 Abundancia

200000
-. -
0 0000.
,00000. 1 70000 100000

1 -
60000
1.40000
1
30000
120000
-, 1
0000
100000.
00000 60000 -
70000. 0000000000.4000030000 20000 10000

32:00
Tiempo
-4o-
3-4.00
J[
fs
.00 40,00 .40.00
30.00
30.00
.0.00
84 Figura 2.3.I.2b. Corriente de los iones 268 y 284 por OC/MS
2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
-7wunoancIa
1 .6e>~07
1.40+07
1 .2o-.-O7
1 04-07
8000000
6000000
4000000
2000000
32.00
42.00
Abundancia
= 0000
$0000 1 0000 1 0000 0000
Ion 292
liempo Abundancia
.40
Ion 312
acoco
~
1
-~
1 0000 0000
Tiempo
00
-4000
<40O~
-~
33,00
3<4
OC>
30
00
OS.00
.40.00
.43.00
Abundancia
30000 $0000 10000 <0000
Ion 310
Tiempo
0000 ...*0 33 00 3-400 30300 SS.0o -40.00 .42.00 .00 .40.00 S.00
Ion 204 Abundancia

160000 1-40000 130000 120000 110000 100000 00000 00000 70000 00000
60000 40000 00000 20000 0000
Tiempo
-4
32.00
34.00
30.00
3fl.O0
40.00
42.00
44.00
40.00
40.00
85
Figura 2.3.1 .2c. Corriente de los iones 292, 312, 310 y 294 por OC/MS

2.3.1.3- Anlisis cuantitativo En todos los casos se inyectaron los patrones por quintuplicado. Los resultados de los clculos del factor de respuesta segn se indic en el apartado 2.2.4.5 y sus desviaciones estndar relativas, que hacen referencia a la precisin del mtodo de anlisis, fueron los siguientes:
cido Graso Butrico Caproico
F 4,20 2,10
CV(% 5,38 3,34
Caprlico
Oleico Linoleico Linolnico
1,61
1,09 1,15 1,15
1,93
4,00 4,05 4,28
En la tabla 2.3.1.3 se ofrecen los porcentajes en que se encuentran los cidos grasos de los triglicridos mayoritarios estimados en la grasa total de la leche de oveja. Los resultados del anlisis de la grasa de oveja demostraron que los cidos mayoritarios son el palmitico, mirstico y oleico por este orden, pero tambin es importante la cantidad en la que se encuentran los cidos de cadena corta y media (4 a 12 carbonos). El cido
vaccnico se encuentra en una concentracin mayor a la de otros cidos insaturados como

el miristoleico, palmitoleico y linollico, siendo el tercer cido insaturado en importancia
por su proporcin. Tambin es de destacar la alta concentracin en que se encuentran los cidos grasos de cadena impar (sobre todo lineal, pero tambin ramificada) en comparacin con otros tradicionalmente considerados en la estimacin de la composicin de la grasa lctea, como es el cido linolnico.
86
y
Tabla 2.3.1.3. Porcentajes de los cidos grasos mayoritarios.
c. Graso
Bu Co
7,36
c. Graso
o/o
PS
alMa Ma
1,03 0,18 0,31 0,34 6,75 10,52 1,36 1,82 0,14
6,50 4,07 8,55

7,82
CI
Ca La M
Ma
5
16,05 1,08 0,23 1,29 24,62
o
y
MI
aiPd
Pd
L Lii
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Ramos y Jurez (1986b). Posteriormente se procedi a la inyeccin de las 227 fracciones recogidas a la salida de la columna de HPLC para la cuantificacin de los cidos grasos. Los datos que se obtuvieron se procesaron el programa de estimacin segn el apartado 2.3.3 para obtener las posibles molculas de triglicrdos presentes en cada fraccin.
2.3.2- Anlisis cualitativo de/os triglicridos de/a grasa de leche de oveja
2.3.2.1- Aplicacin de modelos matemticos
El tiempo muerto del anlisis HPLC se calcul a partir del volumen muerto estimado a partir de la ecuacin (20), ya que las sustancias que apenas sufren retencin en las
columnas no son detectables debido a su volatilizacin a las temperaturas de anlisis del evaporador:
87
f~
= ~kteta>oi
~>Agw
11%
P Metano) Siendo: Yo el volumen muerto, to el tiempo muerto,
(2.20)
PAgita
ni la masa de la columna con metanol o agua, p la densidad.
~ el flujo,
El volumen muerto te de 2,54 mL, que con el flujo de 0,9 mt/mm del mtodo de HPLC
dieron un tiempo muerto dc 2,82 mm. Los resultados obtenidos para la ecuacin (2.12) tomando datos de todos los patrones de triglicridos proporcionaron valores bajos del coeficiente de determinacin (r2): log/c = -0,34074 + 0,04 176NC 0,0699ND,
-
?=0,9390; (2.21)
y una no adecuada distribucin de los residuos (figura 2.3.2. la), por lo que no se pudo asumir que la regresin fuese lineal.
La aplicacin del modelo de Takahashi y col, (1988) ofreci los siguientes resultados:
logk ~
0,15451
0,6287 logk%~+ 0,2770 logkBBB,
=0,9961; (2.22)
logk,nc= 0,17554 + 0,6002 logk~+0,0342 logkBEB+O,2629 logk~cc, = 0,9992. (2.23)
En la primera de las regresiones (2.22) los resultados de los ceoficientes son semejantes a los esperados (2/3 para el primero y 1/3 para el segundo) y el coeficiente de determinacin es prximo a la unidad. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los 88
Capitulo 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
0,1
+ +
+,
o u
0,0
-0,1
++ * ++ +
-0,2
*
0,2
+
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
-0,3 0,0
Valores previstos de logW Figura 2,3.2.la. DIstrIbucIn de residuos obtenida al utilizar Lodos los patrones de triglicridos
0,06 0,04 0,02 0,00 -0,02 -0,04 .0,06 .0,08 .0,2
1
+
+
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 8k
Valores provistos de io
Figura 2.3.2.ld, DistribucIn de residuos tras el au,lisi5 de los patrones que eluyen durante el ,rinser gradiente e socrtico
0,04
0,02
0,00
-0,02
-0,04
-0,06 1,40
1,45
1,50
1,55
1,60
1,65
1,70 1,75 1,80 Valores provistos de iogk
Figura 2.3.2.le. Distribucin de los residuos tras el anlisis ~lelos patrones que eluyen durante el segundo gradiente e [socrtico
89
patrones de triglicridos homogneos que pudieron utilizarse fueron tan slo 6 para 12 triglicridos heterogneos y que no pudieron conseguirse datos para tiempos anteriores al minuto 75 (t, del LaLaM). Los resultados tras la aplicacin de los datos a la segunda ecuacin (2.23) no fueron los deseados, los coeficientes deberan ser todos semejantes a 1/3; el hecho de tener un coeficiente de determinacin tan elevado es slo una consecuencia de haber utilizado un nico patrn heterogneo (OPS).
La figura 2.3. l.2b muestra un cromatograma de aceite de soja. Al ampliar los datos disponibles con la utilizacin del aceite de soja, los resultados fueron:
IogkAn 0,12801
0,6257 logk~~ + 0,2962 logk88n,
~2 =
0,9971; (2.24)
logkABC = 0,01969 + 0,1393 logk&v, + 0,3931 logkBBB 0,4433 logkccc, 2=zO,9961. (2.25) r Estos resultados no mejoraron los anteriores. De este modo se demostr que el modelo de Takaihashi y col. no se adecuaba al mtodo cromatografico utilizado en este estudio y se vio imposibilitado su uso para la estimacin de los triglicridos de la grasa lctea.
La figura 2.3.2. lc muestra un cromatograma de FAMEs por HPLC con sus tiempos de retencin y con los registros para los dos detectores utilizados. Se puede observar que el orden de elucin es idntico al de los triglicridos a pesar de que la retencin sea menor. En primer lugar se obtuvo una ecuacin lineal que relacion la retencin croinatogrfica de los FAMEs con sus constantes moleculares, dando buenos resultados:
logk
-0,47750 + 0,07356NC 0,1558ND,? = 0,9934.

-
(2.26)
90
Captula 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lactea de nota.
E
-
o
o>
N
Cfl
4-
E
o
N
o.
Co
o o
1, PC Sa 44> 4>
o ~oo
4.> PC
E
1~ aL o
E o
5-
a
5-.
-~
0~-4
~
_
0 00.<0 000
~p.j~
o N
91
r ~ &f~9U~fm
~
Posterionnente se realizaron regresiones entre los factores de capacidad de los FAMES y los triglicridos segn la siguiente ecuacin:
logk <i~o = alogk
FAMEI +
hlogk FAME2 + clogk
FAME3,
(2.27),
procediendo del siguiente modo:
logkFAME
-0,468 + 0,0732NCpAMp 0,1S8NDFAME; (2.28)

-
logkTci = l,l6l3logkFAMEI + l,ll4SlogkFAME2 + OlogkFa,4E3;
(2.29)
pero los resultados no fueron satisfactorios debido a que los FAMEs ehifan durante el primer gradiente, y los triglicridos lo hacan durante todo el mtodo (para el estearato de metilo t.
=
24,24 mm, eluyendo durante el primer gradiente, para la SSS t.
160,90,
eluyendo en el segundo isocrtico). Adems, ya que exista una repetin de datos para el caso de triglicridos homogneos y heterogneos (del tipo AAB) se produca una desestimacin de unas variables por otras debido a las fuertes correlaciones entre estas variables, consideradas corno independientes.
La aplicacin del mtodo de Ooiffon y col. (1981) dio como resultado el siguiente: 0.0224/n -0,051 id + 0,0164/c 0,0272d0, 20,9722. (2.30) r
-
Iogk
0,71627
0,01 91/~~ 0,0428d

-
El mayor inconveniente que presentan estos resultados es semejante a los obtenidos de los FAMEs, se trata de que muchas veces se producen fuertes correlaciones entre las variables coincidentes dependiendo de las constantes moleculares de los triglicridos utilizados en la regresin.
93
Por el contrario, si los valores del logk de los patrones utilizados se relacionan con el NC y ND poi separado en dos grupos, se obtienen valores altos del coeficiente de determinacin y el anlisis de los residuos (figuras 2.3.2. id y e) permite asegurar que la regresin es lineal, del tipo de la representada en la ecuacin (2.12). El primero de estos grupos colTesponde a los triglicridos que eluyen durante el primer gradiente y primer isocrtico (antes del minuto 70), y que son tributirina, tricaproina, tricaprilina, tripelargonina, tricaprina, trilinolenina, triiniristolena y trilaurina. El segundo grupo de triglicridos conesponden al resto de los patones utilizados. La figura 2.3.2. lf representa un cromatograma de HPLC de los triglicridos utilizados como patrones, con sus correspondientes tiempos de retencin y el mtodo de gradiente utilizado. Los clculos realizados para el NEC de triglicridos que eluian antes de los 70 niin fueron los siguientes:
logk z0,81 130+ 0,06025NCO,1280ND
(2.31)
0,1280 =2,12; 0,06025
(2.32)
NEc=Nc2,I2ND;
(2.33) (2.34)
Iog k
0,81143 + 0,06025NEC 0,0289; r2 = 0,9967
togk
0,811430,0289 0,06025
(2.35)
NECflJQX
Iogk
0,81143+0,0289;
0,06025
(2.36)
94
-r-.
Ql
06091 SSS
o
-Ql
sogtt sso
55w FLZI O StZI 00
gjg~j
61814 SSd
o
.4-.
a.>
ottu
500
cid
Ql
ci
-t
-~
PC
4>
16CZI 000 LCZZI SIN

u o
.4-.
tzst pnra
ci>
5-
2=t901Oil ~sw NIAIPSj

-~
a
PC
4>
cl
Ot&6 C16 NNI
in
\f~S uuJou13a~p~i1pJ.
8991 N~flfl ZSI?
W<JIfl
.4-
o
Ql
cl 5aL cl
Li
-4
ei
cl
Og19 !N!N!N
o
Ql
-4
~ ti>
%L4
ZCE
6~ZZ
99?.
EU!UO~Ifl1Od1j
139T~9t?9
5
Ql
090009
~j~ ngngn~ o o
~~1 1
%
o
uuo~~a~
1
Ql
95
siendo: k
el factor de capacidad en el tiempo en que comienza a tomarse el factor de capacidad en el tiempo en que se termina de tomar
fraccin (t),
~ ~
una
1
una
fraccin (t2
t]
40 s).
Los resultados para el segundo grupo de triglicridos fueron:
Iogk =0,72097+ 0,01919NC0,04121ND;
(2.37)
0,04121
0,019 19
=2,15;
(2.38)
NEC=NC-2,15ND;
(2.39) 2
=
logk = 0,72093 0,O19l9NEC0,0151; r
0,9699
(2.40)
NEC,,,
!ogk+0,720930,0151
0,01919
(2.41)
NEC,~
Iogk +0,72093+0,0151 0,01919
(2.42)
Estos ltimos resultados fueron los nicos vlidos de entre los propuestos por otros autores en la bibliografia. La inadecuacin de los modelos invalidados se debe a que se propusieron para sistemas isocrcticos de separacin, condiciones en las que se podra haber obtenido buenos resultados en lo que se refiere a la adecuacin de los modelos; sin embargo (tal como ocurre en los estudios llevados a cabo por otros investigadores en sistemas isocrticos de elucin), los resultados en la separacin cromatogrfica de los triglicridos no son tan buenos como los conseguidos en el sistema de gradientes utilizado en el presente estudio, con la consecuente estimacin de un nmero bajo de 96
Capitulo 2. Aplicacin o la extraccin de grasa lctea de nata,
especies moleculares. Al realizar la modelizacin tras dividir el cromatograina en dos tramos se consigui que estos modelos fueran vlidos y perfectamente aplicables, y sumado al sistema cromatogrfico que pernti la obtencin de un gran nmero de picos, se logr la estimacin de un gran nmero de especies moleculares de triglicridos con gran garanta La aplicacin de los anlisis por OC de las fracciones de I-IPLC mejor los resultados al obtenerse la composicin en cidos grasos de cada fraccin y, de este modo, realizar la estimacin tambin en funcin de las cantidades en que se encuentran cada uno de los triglicridos en cada fraccin, no slo en funcin de su presencia.
2.3.2.2- Estimacin de la composicin en triglicridos de grasa lctea ovina
La aplicacin de las ecuaciones anteriores (2.35, 2.36, 2.41 y 2.42) redujo el nmero de triglicridos posibles en cada una de las 227 fracciones recogidas a la salida de la columna de I-IPLC a aquellos con adecuados parmetros moleculares (NEC) para cada pico en su tiempo de retencin correspondiente.
Adems, el anlisis por OC de los cidos grasos presentes en cada fraccin tambin redujo drsticamente el nmero de especies moleculares estimadas para cada pico, y en algunos casos imit la posibilidad incluso a un nico triglicrido. La composicin en triglicridos de cada fraccin se calcul a partir del porcentaje molar de los principales cidos grasos en cada fraccin, teniendo en cuenta que las especies ms probables que se consideraron fueron aquellas que se encontraron en porcentajes altos (normalmente mayores a 0,0 1%, dependiendo del nmero de cidos grasos encontrados en cada fraccin) y que sus NEC se incluyeron entre los limites de NEC de cada fraccin teniendo en cuenta el error estndar de las regresiones como los valores de NECrn y NECmx (ecuaciones 2.35, 2.36, 2.41 y 2.42).
El los anexos 1 y II se muestran los programas desarrollados en QuickiBasic para la estimacin de la composicin en triglicridos que eluyen antes y despus de los 70 mm 9,7
>
~ffj~~i>R
..
Cap~ulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa ldctea de nata.
respectivamente. Estos programas realizan una seleccin de los triglicridos adecuados para la estimacin de entre todos los posibles. Para ello aplica las ecuaciones 2,33 y 2.39 para el clculo del NEC de cada triglicrido, posteriormente calcula el NEC<,, y NECO,X de cada fraccin y selecciona los triglicridos de NEC comprendido en el intervalo. Tras esta pulmera seleccin, el programa calcula los procentajes molares en que se encuentra cada triglicrido a partir de los datos del anlisis de GC y reduce el nmero de triglicridos a los que se encuentran en %mol> 0,01.
A continuacin se detallan, paso a paso, los procesos seguidos para la estimacin de la composicin en triglicridos de la grasa lctea en tres tramos del cromatograma de HPLC, mostrando cada uno de ellos una dificultad creciente. La figura 2.3.2.2a muestra el cromatograma de los triglicridos indicando las zonas que se describen como ejemplos de demostracin:
A) en primer lugar, cuando fre posible, se utilizaron os tiempos de retencin de triglicridos puros para la identificacin. Este es el caso ms sencillo, y pudo realizarse para la estimacin de la trioleina (000). El tiempo de retencin de la trioleina usada como patrn (123,9 mm) pudo hacerse corresponder con el tiempo de retencin de un pico que apareca durante los minutos 122 y 123, ptimamente resuelto respecto de los anterior y posterior. No obstante, tras realizarse los anlisis de las fracciones por OC y el clculo del NEC adecuado al tiempo de retencin, la asignacin qued confirmada. El anlisis de cidos grasos correspondi al de las fracciones 164
-
165. La tabla 2.3.2.2a
rene los resultados obtenidos en cada paso para la asignacin de la trioleina: primeramente se exponen los resultados obtenidos en el anlisis por GC en cada fraccin, seguidamente se calcula el nmero de triglicridos posibles (si se considera que los cidos grasos se distribuyen al azar e independientemente de que tengan NEC adecuado o no al tiempo colTespondiente), por ltimo se ofrecen los triglicridos resultantes tras las limitaciones que los reducen nicamente a aquellos con NEC apropiado y en porcentajes molares superiores a 0,0 1% (resultados ofrecidos por el programa del anexo II).
98
~AMk~A,ot4flnld4eePont~wd4*tflo4we*1hz?.
Tabla 2.3.2.2a. cidos grasos mayoritarios y triglicridos estimados en las fracciones correspondientes a la elucin de la trioleina. N0 Fraccin cidos Grasos Mayoritarios (ng inyectados) Ca (1,1); La (0,8); M (2,0); P (28,6); 8 (2,1); 0(36,4); V (1,1); L (2,1) Ca (1,3); La (1,2); M (4,2);Pd(2,9);P (40,5); 5 (4,8); 0 (49,2); V (4,3); L (1,5) Triglicridos Posibles Triglicridos Estimados 000 00V SOL
164
512
165
729
000 00V SOL
Tabla 2.3.2.2b. cidos grasos mayoritarios y triglicridos estimados en las fracciones correspondientes a la elucin de NP = 52. N0 Fraccin cidos Grasos Mayoritarios (ng inyectados) Ca (0,6); La (0,4); M (1,2); Pd (0,5); P (3,2); Triglicridos Posibles Triglicridos Estimados
192
343
PdSS
SSO
5 (1,4); 0 (0,6)
193 Bu (17,6); Co (23,7); Cl (12,0); Ca (25,7); La (17,7); M (36,5); Pd (3,4); P (53,5); Ma
1728
PSs PsS
(1,0); 8 (12,9); 0 (29,7); L (2,6)

194 195 nd nd
*
o o
100
Tabla 2.3.2.2b (continuacin). cidos Grasos N0 Fraccin Mayoritarios (ng inyectados) 196 Crn:i (8,8); La (0,6); C 13:o (2,9); C13;i (1,3); M (1,4); P (2,6); 5 (0,6); 0 (0,9) Bu (1,1); Co (1,6); Cl (2,0); Ca (5,8); La (3,3); M (8,0); Pd (0,7); P (16,1); 5 (7,0); 0
Triglicridos Posibles
Triglicridos Estimados SSO
512
Pss
197
1000
PdSS
sso Pss
5832
(1,0)
198 Bu (3,1); Co (4,0); Cl (4,0); Ca (8,9); Cmi (2,1); La (5,4); Cuo (8,4); M (10,5); Pd (1,1); P (16,6); 5 (5,0); 0 (13,0); V (1,0); L (2,1); Ci9:o (0,7); Ln (0,9); o/cC182 (0,5); C20:o (0,2) Bu (1,0); Co (2,3); Cl (12,3); Ca (2,0); La (2,0); M (3,4); P (5,7); 5 (2,0); 0 (3,4); L (0,7); C190 (0,2); Ln (0,1) Bu (1,0); Co (3,5); Cl (10,1); Ca (2,9); La (5,3); M (7,8); 5 (4,6); O (3,9); Y (0,2); L (1,0); Cig:o (0,2); Lxi (0,1); doCg:2 (0,1) Ca (0,3); La (0,3); M (0,8); P (3,3); 5 (2,7); 0 (0,9) M (1,1); P (4,0); 5 (2,3); 0 (1,2)
199
1728
200
2197
SSO
PSS
201
216
SSO
202
64
SSO
101
c~fiflllmO2.2AAfiRe&*tw1JqC$E2YaeL45ht#er~&flAtfld1Se qaS.
Tabla 2.3.2.2b (continuacin). N0 Fraccin cidos Grasos Mayoritarios (ng inyectados) Co (0,4); Cl (0,2); Ca (1,0); La (0,4); M (0,9); P (2,6); 5 (1,7); 0(0,8) Triglicridos Posibles Triglicridos Estimados Sso Pss
203
512
no detectados.
Tabla 2.3.2.2c. cidos grasos mayoritarios y triglicridos estimados en las fracciones correspondientes a la elucin de NP N Fraccin cidos Grasos Mayoritarios (ng inyectados ) Co (0,8); Ca (1,4); La (2,0); M (5,3); Pd (1,0); aPd (1,2); Pd (1,8); P (5,1); Pa (1,6); Ma (0,6); alMa (0,6); Ma (0,5); 5(1,4); O (8,3); V (0,2); L (1,7); o/cC 182 (0,5) Ca (1,2); La (1,0); M (3,6); Pd (0,3); WPd (0,3); Pd (1,0); P (9,4); Pa (1,6); 5 (1,2); 0 (10,8); L (3,7); o/cC182
(1,4)
46. Triglicridos Posibles Triglicridos Estimados
151
4913
73
152
1728
53
153
Co (0,6); Cl (1,2); Ca (1,3); La (1,8); M (21,1); Pd (1,5); P (15,1); Pa (2,6); 5 (1,0);
2197
43
0 (22,4); Y (0,5); L (4,6); doCg;2 (1,3)
102
guftn2.Mnhiwzr~YhnhtWfJdih4fermfrff&fe
nata:
Tabla 2.3.2.2c (continuacin). N0 Fraccin cidos Grasos Mayoritarios (ng inyectados) 154 Ca (1,8); La (2,1); C 130 (0,5); M (1,2); M
Triglicridos Estimados
4913
75
(26,9); iPd (0,4); wPd

(0,5); Pd (3,7); P (22,5); Pa (6,2); Ma (1,4); 5 (3,9); 0 (36,3); Y (2,7); L (3,1); Lxi (1,3); etcCs;2 (0,9)
155
Cl (6,8); Ca (1,2); Coi (1,7); La (1,2); M (6,3); Pd (1,2); P (4,1); 5

(0,3); 0(2,1) Co (2,5); CI (0,8); Ca (1,5); La (11,7); M (58,4); Pd (0,6); aPd (1,3); Pd (0,9); P (62,5); Pa (2,2); Ma (0,3); a/Ma (0,6); Ma (0,1); 5(10,1); 0 (45,1); Y (3,4); L (6,0); Ln (0,4); e/cC182 (2,0) Cl (5,4); Ca (1,0); La (6,9); M (29,2); P (18,3); 5 (1,5); 0(8,8) Ca (0,8); La (3,0); M (11,8); P (10,1); Pa (1,0); 5 (1,3); 0 (1,3); Y (0,6) Cl (2,4); Ca (0,7); La (2,0); M (4,9); P (7,8); 5 (0,4); 0 (0,7)
729
10
156
6859
48
157
343
158
512
18
159
343
103
Tabla 2.3.2.2c (continuacin). cidos Grasos N0 Fraccin Mayoritarios (ng inyectados) 160 Bu (1,8); Co (1,8); Cl (1,1); Ca (7,2); La (14,5); M (46,7); Pd (3,2); aiPd (5,4); Pd (4,8); P (75,6); Pa (1,1); Ma (2,0); alMa (1,7); Ma (1,1); 5 (22,0); 0
Triglicridos Estimados 66
9261
(21,4); Y (0,5); L (1,5); Ln (0,2); o/cC

182 (0,3); C2o:o (0,7) 161 Ca (6,6); La (5,7); M (19,2); Pd (1,4); WPd (1,5); Pd (1,9); P (32,8); Pa (0,4); Ma (0,7); alMa (0,7); Ma (0,4); 5 (12,1); 0(5,2); Y (0,8); Lxi (0,9) Co (0,7); Cl (0,6); Ca (2,1); La (1,1); M (4,5); iPd (0,5); aPd (0,8); Pd (2,4); P (7,8); Ma (0,3); alMa (0,4); Ma (0,7); 5 (2,9); 0 (16,8); Y (1,2); L (0,8) Ca (0,9); La (1,4); M (8,4); Pd (1,3); aPd (2,6); Pd (6,8); P (17,2); Ma (1,3); alMa (1,6); Ma (1,8); 5 (3,8); O (47,6); Y (2,2); L <1,0) 3375 70
162
4096
82
163
2744
86
104
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /4oteo de nata.
La trioleina es el triglicrido que se presenta en mayor porcentaje molar, siendo el 00V minoritario y eluyendo en la cola del anterior (el enlace trans prolonga el tiempo de retencin). Posteriormente eluye el SOL porque la acumulacin de dobles enlaces en unos cidos (como el linoleico) y la presencia de cidos saturados (como el pahuitico) provoca un aumento en el tiempo de retencin respecto a otros triglicridos con igual NEC pero con igual ND en cada cido graso (000). La mejora de la eficacia de las columnas de HPLC (n0 platos/m 160.369 en la columna de 15 cm, columna de 25 cm: 161.364) confinn los resultados anteriores al aparecer tres picos donde antes exista nicamente uno. La figura 2.3.2.2b muestra el la eficacia de la separacin. segmento de cromatograma
correspondiente a estos triglicridos donde se separaran los tres triglicridos tras mejorar
B) en segundo lugar se describe el desarrollo de la estimacin llevada a cabo para los triglicridos de NP = 52. Estos triglicridos eluyen en el cromatograma de HPLC durante los minutos 143 a 151, tal como se muestra en la figura 2.3.2.2a, y se recogieron en las fracciones 192 a 203. En primer lugar se analizaron los FAMEs de cada fraccin por GC y se obtuvieron las reas resultantes tras la integracin. La figura 2.3 .2.2c corresponde al cromatograma obtenido por OC de los FAMEs de la fraccin 201, recogida desde los 147 mm 20 s hasta el minuto 148. La tabla 2.3.2.2b incluye los resultados de los cidos grasos mayoritarios para cada fraccin, el nmero de triglicridos posibles y los triglicridos finales, resultantes de la seleccin llevada a cabo en funcin de que tengan el NEC apropiado y que a la vez posean un %mol >0,0 1 (aplicacin del programa del anexo II). El anlisis de la fracciones 194 y 195 no dio cantidades cuantificables de FAMEs; las fracciones 198 y 199 s las dieron, pero los tiiglicridos posibles no estuvieron dentro del intervalo de NEC adecuado para el tiempo de elucin. Las primeras fracciones resultaron contener un triglicrido de NP 51, el PdSS, que apareci como un pequeo pico
anterior al SSO. Se estim que el 55V era un pequeo pico que elula posteriormente al
SSO, ya se ha citado anteriormente que los dobles enlaces rrans retardan el tiempo de
retencin respecto a los cis (El-Hadmy y Perkins, 1981; Laakso y Kallio, 1993), si bien, 105
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de graXa 4ctea de nata.
099
o,
1~
o tyss
o o o o
5-
60
99 61,
o,
o
o
st s
o
4-
o d
e en
U u
107
Capitulo 2 Aplicacin a la ex/mocin de grasa lclea <le naln.
esto no se pudo comtemplar a la hora del clculo del NEC por no disponer de patrones con este tipo de insaturacin. De los picos mayoritarios de NP
=
52 en el crornatograma
de HPLC, el SSO eluye antes que el PSS por poseer menor NEC. La estimacin de los cuatro triglicridos se adecu perfectamente a los picos que aparecieron en el cromatograina, tal como se ve en la figura 2.3.2.2a.
C) en ltimo lugar exista el problema de que en la identificacin de algunos picos se mostraba de fonna clara que ciertas especies podan corresponder a ms de una fraccin. Teniendo en cuenta el orden de elucin junto a una representacin de la probabilidad de encontrar un triglicrido especifico en una fraccin especfica fue posible tambin la asignacin de los picos. Es el caso de la asignacin de los triglicridos con NP 46, cuyo
proceso se detalla a continuacin. La figura 2.3.2.2a muestra la seccin de cromatograma correspondiente a los triglicridos con NP
=
46. Este es el ms complejo de los casos
presentados, ya que las fracciones son de composicin muy variada en cidos grasos, lo que aumenta el nmero de especies posibles de triglicridos. El nmero de especies moleculares de triglicridos tambin es mayor porque, con los cidos grasos descritos, son mayores las combinaciones posibles que posean 45
<
NEC = 46. Los tiempos de
retencin de estos triglicridos se sitan entre los 116 y 122 mlii, que corresponde con las fracciones 151 a 163. El cromatograma de la figura 2.3.2.2d se corresponde con la composicin en cidos grasos de la fraccin 154, en l aparece un mayor nmero de cidos grasos diferentes y en mayor cantidad que en el cromatograma de la fraccin 201 (figura 2.3.2.2c). La tabla 2.3.2.2c, tal como las tablas anteriores, muestra los resultados obtenidos en cidos grasos mayoritarios, triglicridos totales posibles y triglicridos finales resultantes de la estimacin en cada una de las fracciones. El nmero de triglicridos resultantes tras una primera estimacin fue muy elevado, por lo que hubo que reducir este nmero por medio de aumentar e] %mol mnimo permitido 0,1%. La tabla 2.3.2.2d rene los triglicridos que, fmalmente, se consideraron en la estimacin.
108
09 29
It U
0
-5
o
~5$
o
?.t 9
sc)
o
It h~
LI)
o o
9.
o
04
1
60 62
o o (3 rl
Cl
ct>
109
Tabla 2.3.2.2d. Triglicridos finales con NP su NEC correspondiente.
46 en cada fraccin para la estimacin y
N0 Fraccin Triglicrido (NEC) 151 LOO (45,41), POL (45,56), MOO (45,71), PPaO (45,71), MOV (45,71), PPL (45,71), MSL (45,71), MPO (45,85), MPY (45,85), LaSO (45,85), MPP (46), MMS (46), LaPS (46) 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 LOO, SLL (45,41), POL, MOO, PPaO, PPL, MSL, MPO, LaSO, MPP, MMS, LaPS LOO, POL, MOO, PPaO, MOY, PPL, MSL, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS LOO, POL, PSLn (45,56), MOO, PPaO, MOV, PPL, MSL, MPO, MPV, LaSO, MPP, MMS, LaPS MOO, MPO, MPP LOO, POL, MOO, PPaO, MOY, PPL, MSL, MPO, MPV, LaSO, MPP, MMS, LaPS MOO, MPO, LaSO, MPP, MMS, LaPS MOO, PPaO, MOY, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS, LaPS MOO, MPO, MPP, MMS, LaPS POL, MOO, PPaO, MOY, PPL, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS, LaPS PSLn, MOO, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS, LaPS, CaSS (46) LOO, POL, MOO, MOY, PPL, MSL, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS, LaPS, CaSS LOO, POL, MOO, MOY, PPL, MPO, MPV, LaSO, MPP, MMS, LaPS
La figura 2.3.2.2 (e y 1) muestran una representacin de la probabilidad de encontrar los 16 triglicridos de NP

=
46 resultantes, realizada a partir de los %mol obtenidos para
cada una de las especies moleculares en cada fraccin. Esta figura muestra que puede existir ms de un mximo para cada triglicrido. La asignacin se realiz siguiendo un orden creciente de NEC. Sin embargo, existen especies con igual NEC, por lo que la asignacin realiz en base a los porcentajes molares y a criterios de elucin que no pudieron valerse de un desarrollo matemtico. Un segundo anlisis realizado en columnas con la eficacia mejorada demostr que el nmero de triglicridos estimados se adecuaba al nmero de picos en este nuevo anlisis, adems, el orden asignado fue conecto porque
110
se correspondi el valor de rea de cada pico con el %mol aproximado de cada triglicrido. El tratamiento de desconvolucin de los picos (mediante el programa PeakFit, Jandel Scientific) contribuy a la confirmacin de la existencia de los triglicridos estimados y a proporcionamos las reas corregidas. El resultado obtenido tras la ordenacin de los triglicridos segn su tiempo de retencin, la asignacin de cada uno de ellos a un pico del cromatograma y la representacin del trazado de las gaussianas por la desconvolucin de los picos se muestra en la figura 2.3.2.2g. Se observ que en el primer anlisis por HP.LC el nmero de especies (16) no se corresponda con el nmero de picos debido a la baja eficacia, pero tras la mejora de sta se obtuvo un nmero de picos mayor y se observ tambin que algunos triglicridos aparecan como hombros visibles de otros picos y se pudo realizar la desconvolucin de un modo ms satisfactorio y sencillo. El triglicrido que primero eluye es el LOO, su NEC es el menor (45,41) y todos sus cidos grasos son insaturados, por lo que adelantan su elucin respecto a otros triglicridos con igual NEC pero con un cido saturado (SLL). El POL eluye antes que el PSLn por la misma razn, y son el tercero y cuarto en eluir, respectivamente, por tener en NEC mayor a los anteriores (45,56). En tercer lugar eluyen los triglicridos de NEC
=
45,71: MOO, PPaO, MOY, PPL y MSL por este orden, segn las razones antes dichas. Se asign la elucin del PPaO antes que el MOV por tener el mximo %mol en un tiempo anterior. El MOV eluye posteriormente al MOO por la retencin que provoca el enlace rans, adems de que lo corrobora la distribucin de los porcentajes molares de cada uno. Estas mismas explicaciones son las que ordenan la elucin de los triglicrdos de NEC
=
45,85 y que es, respectivamente: MPO, MPY y LaSO; adems, el LaSO posee el mayor tiempo de retencin debido a que los cidos grasos saturados de mayor NC contribuyen en modo ms marcado a aumentar los tiempos de retencin que los cidos grasos saturados de menor NC contribuyen a reducirlo. El orden asignado a los triglicridos saturados (NEC
=
46) es el siguiente: MPP, MMS, LaPS y CaSS. Indudablemente, el
MPP es el triglicrido mayoritario y esto se refleja claramente en los resultados de los % molares. El ltimo pico en eluir es el CaSS, sus dos restos de cido esterico provocan un aumento en la retencin muy importante; este efecto es menos patente cada vez en el LaPS, MMS y MPP, siendo el MPP el triglicrido saturado de ms pronta elucin. 113
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea
Se identificaron 181 especies moleculares de triglicridos; 79 de ellas fueron saturadas, 44 monoinsaturadas y 58 poliinsaturadas. La mayora de las especies insaturadas contuvieron un solo cido graso insaturado (61), 41 contuvieron dos, y 5 tuvieron los tres cidos grasos insaturados. Adems, se identificaron 10 tiiglicridos de NC impar, bien lineales, bien ramificados. Las especies estimadas quedan recogidas en la tabla 2.3.2.2e.
De las 181 especies moleculares, 151 se haban previamente citado en la bibliografa sobre componentes de la grasa lctea por Barrn y col. (1990), Bornaz y col,, (1992) y Myher y col. (1993). Las otras treinta especies restantes han sido descritas por primera vez en este anlisis.
Debido al hecho de que la identificacin de triglicridos se bas no solamente en la estimacin del NEC sino tambin en el anlisis por OC de fracciones obtenidas tras una separacin por HPLC, algunas de las especies descritas previamente por otros autores no se encontraron en este estudio. Este es el caso del estudio llevado a cabo por Bornaz y col. (1992), que describi la identifiacin de 26 especies moleculares que contenan cido inolnico. Sin embargo, nuestro estudio solamente ha permitido poner de manifiesto nueve de ellas, ya que contenan otros cidos grasos que se encontraron en mayores cantidades. El resto de especies no se ha mostrado en los resultados por encontrarse en un porcentaje menor al 0,01% del total de triglicridos en cada fraccin.
Nuestros resultados coinciden con los de Myher y col. (1993) en la identificacin de triglicridos con cidos grasos de cadena impar (NC
=
15 y 17), tanto lineales como
ramificados; esto se debe principalmente a la mejora de los anlisis de los steres metilicos de cidos grasos por OC. Inclusive, en este estudio ha sido posible la diferenciacin entre ismeros isa y an/ciso, no slo en el anlisis OC de los cidos grasos, sino tambin en la estimacin de las especies moleculares de los triglicridos. Los cidos tridecanoico y nonadecanoico fueron analizados por OC, pero no se incluyeron en
114

Tabla 2.3.2.2. Triglicridos estimados en grasa lctea de oveja,
NPIco 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 15,658 16,602 17,592 19,017 21,282 22,614 23,045 23,927 26,805 27,632 28,112 29,017 29,329 29,908 31,033 33,300 34,008 34,258 34,782 35,393 36,213 37,427 38,242 41,992 42,344 N lico NPko 63,140 48 49 50 64,758 65,084 66,858
Ir
TG
26 27
28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
42,922 44,349
45,006 45,983 46,495 48,725 49,650 51,119 51,962 52,596 53,191 54,027 54,619 55,908 55,421
41
42 43 44 45 46
=
57,425
59,550 59,746 60,449 60,817 62,248
=
1Bssflssp CoCoM BuCIM EluCoP I3uBiuS BuCaL BLICIO I3uCaM BmuCIP RuCoS CoCIO Bu CaO CoCIP I3uUM BuCal 3uCIS IluUPd CoMiL BuML CoCaO BuLoO BuMIP CICaM CoLaM CoCal BuMM fluLal RuCaS CaLa La CoOLu, BsOL CIM[1a CaCaL CIL4L CoML I3uPL CICaO CoLnO BuMO IlssPIa IluMiS NI. CaLaLa CaCaM CILaM CICIS CICaP Coto1 CoMM CoCaS BsMP BuLaS I3uciPdI I3uPdl CoCaN CIOL, CoOL CaML BuOO BuOV CoPL CoMO
I3uPO
BuPV CoMP CaCa? BuPP 76 77
102,663
CaMS
103,922 105,654 CoSS
OLL
OOLn
SLLn PaOL. PLL
BuMS
CoPdO BuaIMaO
BuMaO Hs,MaO
51 67,890 LaLaL CaLaM CILaP CoLaS OnOto CO!. CcOO CoSL Ca MI, CI?!. CoPO RuSO OlMO
POLo,
78 79 06,976 108,222 MOL MPaO
LaOO MIPO
80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 109,040 110,317 1,485 112,727 14,098 15,205 116,833 117,232 118,050 119,204 MPL MMO LaPO MMI
52 53 54 55 56 57
71,308 71,958 72,470 73,279 75,253 76,827
taP?
LsMS CoPS 0185 LOO SLL
OlLaS
PO!.
lSL, MOO PPaO MOV PL MSL MPO MP,? USO MPP MMS
58 59
77,800 79,345
60 61 62 63 64 65 66
81,592 83,021 84,705 85,931 87,193 88,462 90,191
67 68 69 70 71 72 73 74
91,679 93,723 95,348 96,852 97,712 98,925 99,827 101,043
CaMPa LaLaM OaMM CIMP CoPP BssIS OaLaP CaPaO 0100 UML CaPL LaLaO CaMO OaMV CIPO CoSO LoLaP LaMM CoMP CaLaS dM5 CII, CoPS RuSS CaPd OaOO LOL LaPL MML CaSL LaMO CaPO 0180 MMII MMM LaMP CalP LataS
90 91
20,220 121,571
LaPS
CaSS 92 93 94 95 96 97 98 [23,374 123,883 125,013 125,831 127,079 27,975 29,358 31,123 32,587 33,421 34,924 135,978 137.041 138,014 139,829 143,005 144,391 145,142 148,111 60,683
000 LOS
SL?
roo
PO
MSO
99
100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111
PPv pl, MPS

LaSS 800
soy
So PS, N.I. PS MSS PLISE SSO Ssv SS
SSS
triglierido; Nl.
no idenlilicado.
115
CapIndo 2. Aplfroetdn chi tutUn & nata Mc$ea de nata.
la estimacin de triglicridos debido a las bojas cantdsdes en que se encontraron en el contenido total de la grasa lctea. Igualmente al estudio de Barrn y col (1990). se tuvo en cuenta cl cido trans-vaccnico por encontrarse en un 1,36% en cl anlisis de cidos grasas en la fi-accin triglicrica total. Sin embargo, hay que resaltar que en el estudio antes mencionada solamente se describen 116 especies moleculares de triglicidos, en lugar dc las 185 de nuestro estudio, debido a que tan solo consideraron 14 cidos rasas para la realizacin de los clculos de los triglcndos a causa de la menor sensibilidad de su anlisis por OC.
2..?. 4- ComparacIn de la composicin en olgllcdrldn de la grasa de leche de oveja, cabra y vaco. La figura 2.3.4a rene los cromatogramas de uiglicridos dc leche de yuca, oveja y cabra y como se puede observar, las diferencias son solamente cuantitativas Expresados en porcentajes de rea, los resultados son los recogidos en la tabla 2.3.4. La figura 2.3.4b mt,estras los resultados reFerentes al NEC y tambin al grado de saturacin de los triglicridos. Tabla 2.3.4. reas (%) de los triglicridos de la grasa de leche de yuca, oveja y cabra en funcin de su NEC. NEC 40 34 < NEC S 40 NEC S34 Total Yuca 10,83 25.16 64,01 48,93 33,96 lOO
Oveja Cabra
18,23 15,21
32,84
loo 100
40,
La leche de vaca es la que pasee la mayor proporcin de triglicndos de NEC
>
seguido de la leche de cabra y la de oveja respectivftffiflltC Sin embargo, la leche de 116
Cap tu/o 2. AplIcacin a la extrafy,{p 1{e grasa lctea de rial
fi~
It
125 150 175
25
50
75
100
OVEJA
150 125
175
25
50
75
100
tiempo (ruin)
CABRA
25
75
100
125
150
175
117
F~gwra 2.3,4a. CroflIatogTaIflfiS de IIPLC de irIglIcrslOS de leche de vaca, oveja y cabra.
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
oveja es la ms enriquecida en triglicridos de NEC = 40, delante de la de cabra y la de vaca, por este orden. En cualquiera de las tres especies, la grasa lctea posee mayor proporcin de triglicridos de NEC
>
40 que del resto de triglicridos, la menor
proporcin de triglicridos est cuando stos son de NEC = 34, tambin para las tres especies animales. Estas diferencias entre las proporciones de triglicridos segn su NEC son ms patentes para la leche de vaca y menores para la leche de cabra y oveja respectivamente; en esta ltima existe una mayor equiparacin de las proporciones de triglicridos en funcin de sus NEC.
Los triglicridos saturados son los mayoritarios en la grasa lctea de las tres especies animales. Entre las leches de las tres especies, es la de vaca la que posee una menor proporcin respecto a la de cabra y oveja, siendo entre estas dos ltimas la proporcin muy semejante. Los triglicridos monoinsaturados se encuentran en mayor proporcin en la leche de vaca, teniendo la leche de oveja valores menores pero cercanos; la leche de cabra posee la menor proporcin de estos triglicridos. Los triglicridos poliinsaturados estn en la leche de cabra en la mayor proporcin (siendo incluso mayor a la de triglicridos monoinsaturados), con un porcentaje ligeramente menor en la leche de vaca; la leche de oveja es la que menos proporcin de triglicridos poliinsaturados posee. En las leche de vaca y oveja, existen ms cantidad de triglicridos monoinsaturados que pollinsaturados, al contrario de lo que ocurre en la leche de cabra.
Estos resultados pueden explicarse basndose en la composicin en cidos grasos de la grasa lctea de estas especies (Ramos y Jurez, 1986). La leche de oveja es ms rica en cidos grasos de cadena corta (NC = 8) y poliinsaturados, y la leche de vaca lo es en cidos grasos saturados de cadena larga (NC =16). Se confirm que la leche de vaca posea la mayor cantidad de triglicridos insaturados, debido a la mayor cantidad de cido oleico; mientras que las cantidades fueron inferiores en leche de oveja y cabra, aunque semejantes entre ellas (55,31, 51,12 y 5 1,13%, respectivamente).
119
En la figura 2.3,4c se muestran los porcentajes de triglicridos en funcin de su NEC, segn sean de leche de vaca, oveja y cabra, y de acuerdo a su grado de saturacin. La leche de vaca posee el mayor porcentaje de triglicridos de NEC> 40 poliinsaturada, sin embargo, la leche de cabra es la ms rica en triglicridos de 34
<
NEC = 40
poliinsaturada. Estos resultados estn en concordancia con las cantidades relativas de cidos grasos de cadena corta, media (8
<
NC =12) y larga y sus diferentes
combinaciones para dar lugar a triglicridos en las tres especies animales.
120
Capitulo .2. 4ad o le ntmcds de msa Ida de
>u&
APLICACIN DE LA
EXTRACCIN CON DIX[DO DE CARBONO
SUPERCRITICO A LA MODIFICACIN DE GRASA LCTEA EN NATA

2.4- MATERIALES Y MTODOS
24.1- PreparacIn de la muestra Se utiliz leche cruda de oveja proporcionada por Queseras Campo Real en Campo Real, (Madrid). La obtencin de la nata a partir de la leche se realiz segn los mtodos detallados en el apartado 2.2.1
2.4.2- 1)escrlpcin del equipo de extraccin Las extracciones se llevaron a cabo utilizando un extractor de fluidos supereriticos sempreparativo LDC Analytical que fue modificado previamente en el laboratorio (Hierro, 1994). La figura 2.4.2 muestra un dagrama de este equipo de extraccin.
El dixido de carbono liquido es impulsado por medio de una bomba de velocidad variable cuya cabeza se encuentra enfriada a 11 0C mediante un bao criogtnico para mantener el CO 2 en estado lquido. El CC)2 a la salida de la bomba se calienta
previamente a la entrada al interior de la celda de extraccin (55 mL de capacidad). Esta celda de extraccin posee una camisa calefactora controlada mediante una sonda termopar.
El CO2 supercrtico. que contiene el extracto lipdico, es despresurizado tras la salida de

la celda a su paso por un restrictor variable, la despresurizacin causa el cambio a CO2 en estado gaseoso. separndose el extracto y recogindose en un erlenmeycr a presin 12.2
Capitulo 2. Ap#arMn o o exlmccft$n de <msa Jata de nOW
/1
30~>9
~12<si. Mil
o
0
6
ti J
t.i ~ i~ 1
E a
:11
i
u
o
a
&
u
.t 6ti
z
-Q
ji
uoira za
UOGVI
4>
uvwauJ.NI
a
3. E
eL
b.
ti
23
Capliulo 2. AplIcacin a la exftwcch$n de *nta lctea de nola.
atmosfrica. Se evitaba la formacin de nieve carbnica en el restrictor calentndolo con

tina resistencia. Las extracciones se realizan en modo dinmico, controlndose el volumen de CO2 y flujo para que se mantengan constantes. Las extracciones se realizaron por duplicado. Se utilizaron 10 g de nata por extraccin. La cantidad de grasa extraida se obtuvo por pesada del extracto. La cantidad de nata residual se obtuvo por diferencia entre la inicial y el extracto. Posteriormente se realizaron los anlisis por HPLC de colesterol y trigliciidos de la nata antes y despus de su tratamiento con CO2 supercrtico. Tambin se calcul la humedad de Las natas antes y despus de su tratamiento.
2.4,3- Optimizacin delflujo de CO2 supercrlflco
Este estudio junto con el de la optimizacin del volumen de CO2 se realizaron con leche de oveja anteriormente estudiada en el punto 2.2.1, cuyo contenido en colesterol de la nata fue de 2,2 mg /g. El flujo ptimo de CO2 se cakul en base a conseguir un mayor rendimiento de la extraccin de colesterol. El control se hizo variando el recorrido del mbolo de la bomba para conseguir flujos entre 0,50 y 3 lJmin medidos a presin atmosfrica. 0C, condiciones adecuadas para la Las extracciones se realizaron a 21,4 MPa y 40 extraccin de colesterol. El volumen de CO 2 en cada extraccin fue de 400 L. Posteriormente se realizaron los anlisis de colesterol por HPLC.
1
24
CapItulo 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nal
2.4.4- Optimizacin del volumen de CO2 supercr(tko
Se calcul el volumen necesario para extraer un mximo de colesterol. Las condiciones 0C manteniendo el flujo ptimo obtenido de extraccin fueron de 17,9 MPa y 40 previamente.
Se estudiaron volmenes de CO
2 de 100 a 700 L medidos a presin atmosfrica.
Posteriormente se analiz por HPLC el colesterol extrado.
2.4.5- Determinacin de la grasa de la nata
La grasa de la nata previamente a la extraccin con CO2 se determin por extraccin

slido-lquido, utilizando 75 mL de una mezcla de cloroformohnetanol (2:1) en un Soxhlet durante 1 h para extraer la grasa contenida en 1 g de nata, Despus se evapor el disolvente en atmsfera de N2 y se determin la grasa gravimtricamente por pesada del residuo.
Tras la extraccin con CO2 supercrtico, el peso del extracto corresponda al de la grasa extrada.
2.4.6- Medida de la humedad de la nata
El agua contenida en la nata poda actuar como modificador en la extraccin de la grasa; es por esto que se decidi analizar la humedad de la nata original y del residuo tras la extraccin con CO2 supercrftico. Adems, el agua puede ser coextraida con los componentes lipdicos mediante un proceso de arrastre de vapor, por lo que su contenido en la nata tratada podra variar con las condiciones de extraccion.
125
Capitulo 2, AplicacIn a la extraccin de grasa Mc/ea de nata.
La medida de la humedad de la nata se realiz a partir de 400 mg de muestra siguiendo el mtodo oficial de la AOAC (1990), en estufa a 100 0C. Se calcul la humedad en
porcentaje por diferencia con el peso al cabo de h.
2.4. 7- lndlistv de colesterol por cromatografio lquida de alta eficacia 2,4.7.1- Obtencin dc la fraccin insaDonificable de la nata La separacin de la fraccin insaponificable de la grasa de la nata es necesaria para el
anlisis de colesterol por HPLC, puesto que los componentes mayoritarios, tos
triglicridos, interfieren en el anlisis (Hurst y col., 1983).
A 1 g de nata (tratada o no con CO
2 supercrtico) se le aaden 50 mL de KOH metanlica
2N preparada en el da. En ese momento tambin se aaden 400 .tL de estigmasterol (patrn interno) de una solucin de 2,5 mg/mL de hexano para conseguir una concentracin de 1 mg/g nata. Esta mezcla se pone a calentar a reflujo durante 30 njin. La solucin restante se lleva a un embudo de decantacin, y el matraz se lava con das porciones de 25 mL de agua destilada que tambin se llevan al embudo. Se afladen 10 mi de una solucin de NaC al 10% para facilitar la separacin de las fases y se extrae con dos porciones de lOO tuL de ter etlico/ter de petrleo (1:1). Se recogen las fases 0C. Despus, esta fraccin se etreas y se llevan a sequedad con un rotavapor a 30 redisuelve en 5 mL de ter de petrleo, se pasa por un filtro de 0,2 gm y se inyectan 20 en el HPLC.
126
Capitulo 2. AplIcacin a Ja extraccin de grasa hielen de nata.
2.4.7.2- Anlisis de colesterol por {PLC
El sistema croniatogrfico utilizado consisti en una bomba modelo 6000A (Waters
Assoc.), un inyector Rheodyne modelo 7125 con un bucle de carga de 20 iL, un horno para la columna (Kariba Instruments) y un detector ultravioleta de longitud de onda
vajiable 3100X (LDC Analytical), conectados a un sistema de adquisicin dc datos System GoId (Beckman) a travs de una interfase modelo 406 (Beckman). Se utiliz una columna Spherisorb ODS-2 (Phase Separations) dc 5 pm de dimetro de parifeula y 4,6 mm x 20 cm de tamao mantenida a una temperatura constante de 45 0C. Los anlisis de realizaron en condiciones isocrticas a un flujo de 2 mL/mm y deteccin en Uy a 205 nm. La fase mvil fue hexano/isopropanol en la proporcin 99,9:0,1.
24.8- Andilsis de triglictEridos por cromatografa lquida de alta eficacia La extraccin de los triglicridos de la grasa de la nata (tanto tratada con CO
2 supercrftico
corno no) y su posterior anlisis por HPLC se realizaron segn se detalla en los apanados
2.2.1 y 2.2.2 respectivamente.
2.4.9- Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin de grasa de nata sin y con adicin de bolas de vidrio Los lO g de nata se sometieron a la extraccin con CO2 supercrftico con las siguientes
condiciones de presin y temperatura:

temperaturas de 40, 50 y 60 presiones de 8,3; 9,7; 14,5; 17,2; 19,3; 24.1; 29,0 y 33,8 MPs.
0C.
127
CapItulo 2. AplicacIn a lo extraccin de grasa lcteo de nota.
El volumen de CO2 de cada extraccin fue de 350 L y el flujo medido a presin atmosfrica de 1,5-2 L/min. Las extracciones se realizaron en cada condicin por duplicado. Posteriormente, y a la vista de los resultados, se realiz una segunda serie de duplicados afladiendo 100 bolitas de vidrio de 4 mm de dimetro como dispersantes de la nata para aumentar la superficie de contacto con el CO2 y evitar la formacin de canales preferenciales.

2.5.1- Optimizacin delflujo de CO2 supercrftlco
La variacin de la potencia de la bomba entre porcentajes del 30 y 100% del recorrido

total del mbolo proporcionaron flujos comprendidos entre los 0,4 y 3 L/min, medidos a presin atmosfrica. La figura 2.5.1 muestra la variacin de la cantidad de colesterol extrado respecto a la variacin del flujo proporcionado por la bomba. Como se puede observar se alcanza un mximo de colesterol extrado a flujos comprendidos entre 1,5 y 2,2 L/min, siendo los valores mayores obtenidos en los anlisis de 1,65 y 1,75 mg/g nata.
Se concluy que la mayor extraccin de colesterol se produca consiguiendo flujos de CO2 entre 1,5 y 2 L/min. FLujos inferiores producan extracciones menores de colesterol debido a la lenta renovacin de CO2 y su consiguiente mayor grado de saturacin de colesterol, a 0,48 Llmin se produjo la menor extraccin con 0,42 mg colesterol extraido/g nata. Flujos superiores a 2 L/min eran demasiado altos para un buen intercambio de colesterol entre la nata y el CO2, la extraccin descendi hasta 1,10 mg/g con el flujo de 2,94 L/nin.
128
CnInctnrnI
nv*rn <~
~,
1~gg <u/o 2. AplIcacIn a la extraccIn de gPOSd lctea de nola
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00 0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 flujo de Dldxdo de Carbono (L/min)
Figura 2.5.1, Influencia del flujo de dixido de carbono en la extraccin de colesterol
Colesterol
Extrado de Nata (rng/g)
1 00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
loo
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
100
Volumen de Olxido de Carbono (L)
Figura 2.5.2. InfluencIa del volumen de dixido de carbono en la extraccin de colesterol
29
Capitulo 2, Aplicacin a la extraccin de gras lctea de nata.
2.5.2- Optimizacin del volumen de CO2 supereritico
Se observ que, en las condiciones estudiadas, la extraccin de colesterol aumentaba conforme lo haca el volumen de CO2 hasta llegar a los 600 L (figura 2.5.2). A partir de este volumen la extraccin de colesterol llega a un mximo, tras el que un aumento de volumen no produce una mayor cantidad de colesterol extrada, siendo este mximo de 0,96 mg/g nata.
Se eligi realizar las siguientes extracciones con volmenes de 350 L de CO2. Volmenes superiores alargan excesivamente la duracin de la extraccin (ms de 4 h), no siendo viable la realizacin del estudio planteado. Adems, tiempos prolongados de extraccin conducen a la extraccin mxima de todos los compuestos de la grasa lctea, siendo la extraccin selectiva de colesterol menor respecto a la de los triglicridos. Estas conclusiones se vieron corroboradas por los resultados posteriores de extraccin de grasa total, colesterol y la selectividad conseguida (apartados 2.5.3, 2.5.5 y 2.5,7).
As pues, las siguientes extracciones se realizaron con un flujo de 1,5-2 L C02/min consumiendo 350 L.
2.5.3- Efecto en la atraccin de grasa La muestra de nata de la que se parti tena un contenido en grasa del 69%.
En las tabla 2.5.3 a y b se indican las masas de extracto obtenidas para cada condicin de presin y temperatura y para extracciones realizadas sin y con presencia de bolas de vidrio respectivamente. Tambin se indica la solubilidad de la grasa en cada extraccin expresada como mg grasa/L CO2. En las figuras 2.5.3 a y b se representa la cantidad de
130
CapItulo Aplicacin a la extraccin dc rasttlfteafle nd/4 Cupuiu 2. u pkusu u ~ tWn,n.J tgttS$4 JJS<3X flA;
Tabla 2.5.3a. Masa y solubilidad de la grasa extrada sin bolas de vidrio. Temperatura1 50 Solubilidad 0,40 .66 4,54 10,20 10,77 Extracto 0,03 0,02 0,29 1,48 2,12 5,79 0,40 1,43 7,23 9,91 10,34 12,60 0,14 0,58 1,59 3,57 3,77
40 Presin2 8,3 9,7 14,5 17,2 19,3 24,1 0,14 0,5 2,53 3,47 3,62 4,41
60 Solubilidad 0,09 0,06 0,83 4,23 6,06 16,54
Extracto3 Solubilidad4 Extracto
29,0
33,8
extraida/L CO
3,62
5,18
10,34
14,80
4,95
4,64
14,14
13,26
5,97
6,07
17,06
17,34
temperatura en oc, 2 presin en MPa, 3niasa de extracto en g, 4salubiiidad expresada como mg grasa 2
Tabla 2.5.3b. Masa y solubilidad de la grasa extrada con bolas de vidrio. Temperatura
Presin 8,3 9,7
40 50 Extracto3 Solubilidad Extracto Solubilidad 0,20 0,07 0,14 0,05 0,43 0,15 0,23 0,08
Extracto
0,04
60 Solubilidad 0,11 0,46 3.9,

8,71
0,16 1,37 3,05
14,5 17,2 19,3

24,1
2,36
4,57 4,46 4,60
6,74 13,06 12,74 3,14 14,57
0,75 2,09 2,96 5,17 5,71
2, 4
5,97
8,46
4,77
4,63
5,73 5,25
13.23 16,37
29,0
33,8
5,10
5,81
16,31
temperatura en 0c, 2
cxtra.da/L CO
presin en MPa,
15,00 5,83 16,60 5,54 1niasa de extracto en & 4scbibikdad expresada como mg grasa
128
131
grasa no extrada, estimada por diferencia entre el contenido de grasa de la muestra sin tratar y la cantidad de grasa extrada.
Observando los resultados se aprecia que la solubilidad y el rendimiento de la extraccin aumentan confonne aumenta la presin en el rango estudiado de presiones y temperaturas. El efecto de la temperatura vara dependiendo de la presin a la que se ha realizado la extraccin. Los ensayos realizados a presiones menores a 20 MPa ofrecieron mayores valores de solubilidad cuando la temperatura era de 40 0C, siendo semejante la solubilidad de la grasa para las extracciones a 50 y 60 0C. Este hecho se debe a que el factor ms importante en el aumento de la solubilidad de la grasa es el aumento de la densidad del CO 2 supereritico, que se produce al disminuir la tempratura a la que se somete el fluido.
Los resultados coinciden con los expuestos para el estudio realizado con leche en polvo (Hierro, 1994) en condiciones semejantes y en mantequilla (Chen y col., 1992a).
Los ensayos realizados a presiones mayores de 20 MPa conducen a resultados de solubilidad diferentes segn se hayan realizado con o sin bolas de vidrio. El rendimiento conseguido en los primeros ensayos, sin bolas de vidrio, es menor a las temperaturas de 0C que a 60 0C. Este comportamientO se debe a que a la mayor temperatura la 40 y 50 nata presenta un estado ms fluido, menos compactado, facilitando la difusin del CO 2 y, por tanto, la transferencia de masa. Los segundos ensayos, realizados con bolas de vidtic~ 0C. Fueron dieron lugar a rendimientos semejantes entre si y la extraccin anterior a 60 los mayores rendimientos que se pudieron conseguir en todas las extracciones realizadas. Estos resultados mostraron defmitivamente la efectividad de la adicin de un soporte slido, como las bolas de vidrio, para conseguir una mejor dispersin de la nata, aumentar la superficie de contacto con el CO 2 e impedir la formacin de canales preferenciales,
como ocurra en la primera serie de extracciones realizadas, donde los resultados flieron menos satisfactorios. El efecto del aumento de superficie de contacto con el CO2 coincide con el conseguido por Snyder y col. (1984) para la obtencin de aceite de soja a partir de
133
grano entero, copos o harina. Estos autores no slo resaltan la importancia de aumentar la superficie, sino tambin la de impedir la compresin de la muestra con el aumento de la presin, que dara lugar a aparicin de canales preferenciales y zonas inaccesibles al fluido. De este modo, las bolas de vidrio constituyen un soporte que aumenta la superficie de la nata y, a la vez, es slido, inerte y resistente a la presin.
En estas condiciones de presin mayor a 20 MPa se observ que el efecto de la densidad sobre la solubilidad de la grasa era contrarrestado por el efecto de la presin de vapor de los compuestos extrados. A estas presiones el efecto del aumento de la presin de vapor sobre la solubilidad adquiere ms importancia que el efecto de la disminucin de la densidad del CO2 al aumentar la temperatura, contrariamente a como ocurri a presiones 0C menores a 20 MPa. Este hecho produce que el rendimiento de la extraccin a 60 y 50 se iguale al conseguido a 40 0C. Shishikura y col. (1986) observaron que la extraccin de los lpidos disminua al aumentar la presin utilizando mantequilla, mientras que la extraccin aumentaba de forma lineal en el caso de la grasa anhidra, suponiendo la presencia de agua como la causa de las diferencias encontradas. Sin embargo, estos resultados difieren de los obtenidos en el presente trabajo, siendo intermedios entre los de grasa anhidra y mantequilla en el estudio antes mencionado. Los resultados distintos pueden suponer que el signo de la emulsin es tambin un factor a tener en cuenta a la hora de elegir un sustrato para la extraccin. Los resultados tambin difieren de los obtenidos por Yu y col. (1992) con grasa anhidra, la extraccin de grasa fue siempre menor a 60 0C que a 40 0C incluso a las ms altas presiones (31 Mpa).
En la tabla 2.5.3c se indican las densidades de CO
2 supercritico que existen en las
diferentes condiciones de presin y temperatura calculadas segn la modificacin de Pitzer sobre la ecuacin de los gases ideales (Pitzer, 1955; Pitzer y col., 1955).
134
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa Iatea de nata,
Tabla 2.5.3c. Densidades de CO2 supercrltico en las condiciones de estudio (SPSolverrM, Program Iseo, Inc.). Densidad (g/mL) Presp}MPa) 8,3
9,7
0C 40 0,34 0,56 0,78 0,82 0,84 0,88 0,91 0,94
50 0C 0,24 0,35
&o 0C
0,20 0,27 0,58 0,67 0,72 0,78 0,83 0,86
14,5
0,69
0,75 0,78 0,83 0,87 0,90
17,2
19,3
24,1 29,0
33,8
Teniendo en cuenta nicamente las densidades de cada extraccin en la variacin de la solubilidad de la grasa se observa que, se produce un rpido aumento de la solubilidad a partir de 0,62 gImL para la temperatura de 60 0C, 0,69 g/mL para 50 0C y 0,78 g/mL para 40C, siendo este aumento semejante en las tres temperaturas, aunque la solubilidad a 60 es mayor a una densidad constante debido al aumento de la presin de vapor de los componentes del extracto, que se suma al efecto de la densidad (figura 2.5.3c). Los resultados de Yu y col., (1992) difieren con los del presente estudio en resaltaz una densidad tras la cual se experimentaba un rpido aumento de la densidad y que es de 0,5 g/mL para 40 oc y 0,6 para 60 0C, no observndose en el estudio influencia del aumento de la presin de vapor al aumentar la temperaturas incluso a densidades altas.
2.5.4- Efecto sobre la humedad de la nata
El contenido de agua de la nata una vez tratada con CO
2 supercritico tambin es
dependiente de la presin y temperatura de las extracciones, La humedad de la nata varia 135
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccIn de grasa lctea de nata,
en parte debido a que se extrae junto con el CO2 y en parte porque la fraccin grasa de Ja nata es mucho ms soluble en el fluido supercrtico, influyendo en el porcentaje de agua. Los resultados de las medidas quedan reflejados en la grfica 2.5.4. 0C la disminucin de la humedad
La extraccin por arrastre est confirmada porque a 60 esmayorquea400Cy5o0C.
A las densidades de 0,20 y 0,24 gImL existe una extraccin importante de agua que hace que los porcentajes en el residuo sean inferores a los de la nata original (28%). Esta humedad se mantiene hasta densidades cercanas a 0,60 g/mL o desciende levemente, este hecho puede explicarse porque, si bien hay una extraccin de agua, hay una pequea pero progresiva disminucin del contenido de grasa en la nata. Densidades superiores producen un rpido aumento de la solubilidad de la grasa, y la nata con tan bajo contenido en grasa da como resultado un aumento de la humedad hasta un .50%.
Los resultados se asemejan a los obtenidos por Snyder y col. (1984) a partir de soja, es decir, que la humedad de los residuos va aumentando con la presin. La causa es la extraccin mayor de compuestos lipdicos por ser stos ms solubles en CO 2 supercrftico.
2. 5,5- Efecto sobre la extraccin de colesterol
La nata de partida tena un contenido de colesterol de 2,20 mg/g.
Los resultados de las extracciones con CO2 supercritico sobre la concentracin de colesterol resultante en las natas tratadas quedan reflejados en las tablas 2.5.5 a y b. Las figuras 2.5.5 a y b representan el efecto de la presin y la temperatura sobre la disminucin de la concentracin del colesterol, El las primeras extracciones, realizadas sin bolas de vidrio se obtuvo un bajo rendimiento en general para todas las presiones y temperaturas estudiadas, con excepcin de las realizadas a 33,8 MPa. El contenido en
137
CapItulo 2. AplicacIn a la exfrtxtdn t nne Man & nata

4~ A~t WUCWC O Mi cxuiati SM
#~F~U PMIM~
Tabla 2.5.Sa. Concentracin de colesterol en la nata sin bolas de vidrio tras el tratamiento con CO2 supereritico.
Presin (MPs) 8,3 9,7 14,5 l7,2 19,3 24,1 29,0 33,8
40 2,27 2,42 2,04 1,93
0C
trscln de colesterol so 0C 2,02 2,01 1.95 1,98

1,70
~~WC 60 C 2,14
2,37 1,68 1,54 1,40 1,50 .43 0,86
1,77
1,70 1,64
-
1,69
1,74
0,76
Tabla 2.5.5b. Concentracin de colesterol en la nata con bolas de vidrio tras cl tratamiento con CO 2 superertico de colesterol (mg/e) Concentracin 0C 50W 60 C 40 1.29 1,61 1,92 1,10 1,64 1,77
1,12
Presin (MPs) 8,3 9,7 14,5 17,2 19,3

24,1
1,52
0,70
1,07 0,71 0,66 0,64 0,61 0,57
0,96 0,63
0,72 0,54
0.61
0.59
0,62 O~59
29,0 33,8
0,61
35
138
colesterol tras el tratamiento a 9,7 MPa es superior o igual al de 8,3 MPa en las tres temperaturas, pudindose explicar por haber una menor cantidad de agua en la nata. Se observa que a presiones entre 14,5 y 29,0 MPa el aumento en la extraccin de colesterol es casi inexistente, pero a 33,9 MPa hay un brusco aumento en el que se extrae el 65% del colesterol de la nata de partida. La solubilidad del colesterol es generalmente mayor a 60 C que a las otras temperaturas por el efecto del aumento de la presin de vapor ya comentado anteriormente.
En el caso de las extracciones realizadas con bolas de vidrio se puede observar que el rendimiento de la extraccin de colesterol aumenta sensiblemente en comparacin con los ensayos anteriores, sobre todo a partir de 14,5 MPa, y se mantiene para presiones mayores. Estos resultados muestran claramente la necesidad de dispersar la nata en un soporte slido para aumentar el contacto entre las fases y la transferencia de masa por el aumento de la dispersin del CO2 en la muestra a tratar. El rendimiento llega a ser de un 75%. Estos resultados mejoran otros obtenidos anteriormente por Yu y col. (1992) utilizando grasa anhidra, mediante los que consigui en las condiciones de mayor 0C) un rendimiento del 20%. extraccin de colesterol (31 MPa y 40 Los resultados mejoran los obtenidos por Shishilwra y col. (1986), ya que, utilizando mantequilla, observaron una gran disminucin del rendimiento en la extraccin de grasa a partir de 20 MPa y 40 0C, y un enriquecimiento en triglicridos de cadena larga, con lo que el rendimiento en la extraccin de colesterol fue muy bajo a partir de esta presin y los extractos se empobrecieron en colesterol. El estudio llevado a cabo con grasa anhidra proporcion un mejor rendimiento en la extraccin de grasa y de colesterol, con lo que la selectividad conseguida fue baja. En el presente trabajo se obtuvieron residuos con niveles intermedios de grasa y de colesterol.
El efecto de la densidad del CO
2 y la temperatura de tratamiento se representa en las
figuras 2.5.5 c y d (sin y con presencia de bolas de vidrio respectivamente). En ambos 0C son siempre los que producen una mayor casos se aprecia que los tratamientos a 60
140
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
solubilidad del colesterol en el fluido supercrftico (excepto a 0,20 y 0,27 g/mL y 60 0C en las extracciones sin bolas). De esta forma se destaca que, si bien la densidad es un factor a considerar, la temperatura es un factor determinante para la extraccin de colesterol. De hecho, el mayor rendimiento se alcanza ya a 60 0C con una densidad (0,67 g/mL) menor que a 50 0C (0,75 g/mL), y an menor que a 40 0C (0,82 g/mL). Este comportamiento es semejante al que se produce en el caso de la extraccin de la fraccin grasa total (apartado 2.5.3).
2. 6- Efecto sobre la extraccin de triglicridos Los extractos obtenidos se consideraron compuestos por triglicridos casi en su totalidad. De esta forma se puede considerar la variacin de la cantidad de extracto obtenido como la variacin en la extraccin de triglicridos. Tras los anlisis por HPLC de los triglicridos no extrados, se calcularon las cantidades relativas de triglicridos atendiendo a:
NEC = 34 (triglicridos de cadena corta e insaturados de cadena media o larga), 34 <NEC = 40 (triglicridos de cadena media e insaturados de cadena larga), NEC > 40 (triglicridos de cadena larga, sean saturados o insaturados).
Aparte de las diferencias ya discutidas en el apartado 2.5.3 sobre el rendimiento de la extraccin entre las realizadas sin o con bolas no se encontraron otras diferencias. Las cantidades relativas de triglicridos de distinto NEC y grado de saturacin fueron las mismas para las extracciones sin y con bolas para cada condicin de presin y temperatura.
En la tabla 2.5.6 se muestran las cantidades relativas de triglicridos segn su NEC, temperatura y presin. Se observa que para las tres temperaturas de estudio los extractos
142
Captulo 2. Aplicacin a
o
en o en
4 extraccin de grasa lctea de nata

u
y it en
o OC
ti it CNN
<fl00 E it
QN
en
it
O
en ti
oc en
oC en
it a
en r-
it
Q Ir)
o
ti
r-~
o
ti ~ en viso
nr
en
u
o
en
ti en
00
CNN
z
r io&efe=oV SC o en en it ti it en en en
fi ti o (A
en
en
it
SC
e-$
so
en
oC en
r-
en
QN
CO
it
QN
it
en
o
ti
a O NO
o Sc
0000 en en
a N it SON C&nO
en it CON
oc
ti
Ci.
en
en
en
en
&
en
o
it
8
o
VI
OC u o oc oC z o en h-
t u
1o)
e o ti en oC oC sC
en en en N en en
ti
QN
~O
QN
e oc e-
ti
ci,
y it en
O QN t
u
Co
Oit
en
it
o
e.>
a~&&~vi~oCoC oC o en en en en en en i en
it
e--
QN
r,
Os
Os
o
4) o
u
en
CO
e- en
o
o)
-4
o
SO ti
O e-N
~O O N it
ti
en
a.
<-4
4~
o e E
4)
o
e
o> e) Co o
en u VI o u o a z
ti N N
it E-

en
en
N
it
NO ti
e-Vi
o
ti ti ti
.3
u
u
o
CO
t
H
O ti .0
o
it
NCC fi fi SO ti N
eno
e-r
e--
00
O
oo
fi
ti QN
N
fi
SO o e it
ti ti
fi
ti
t
<-4
o ti
ct
00
0.
e-U
E~
-
VI
140
43
Capitulo 2. AplicacIn a la extraccin de grasa lctea de nata.
de presiones menor y mayor (8,3 y 33,4 MPa) tienen una composicin similar a la fraccin triglicrica de la nata de partida (24,53% NEC = 34; 38,93% 34 <NEC = 40;
NEC
>
40)con la nica diferencia de la masa de extracto total obtenida. nicamente a
presiones intermedias se consigue mejorar la selectividad de la extraccin, al aumentar la
extraccin de triglicridos de NEC = 40 y disminuir la de los de NEC> 40. La mxima

selectividad de la extraccin se consigue a 17,2, 19,3 y 24,1 MPa a las temperaturas de 40, 50 y 60 0C respectivamente. mejorndose la selectividad conseguida al aumentar la temperatura. Estos resultados nos indican claramente la influencia positiva de la temperatura en el aumento de la solubilidad de triglicridos con menor punto de fusin (insaturados y de cadena corta y media) por aumento de su presin de vapor; si bien, con las presiones ms elevadas mejora la extraccin de los triglicridos de mayor punto de fusin. Las figuras 2,5.6a y b representan respectivamente el crornatograma triglicridos de la nata de partida o control y tras el tratamiento a 24,1 MPa y 60 0C. de
En la grfica 2.5.6c puede verse la influencia de la densidad en la selectividad de la extraccin de los distintos tipos de triglicridos. Existe una densidad (0,8 g/mL) alrededor de la cual se alcanza un mximo en la selectividad de la extraccin de triglicridos con
NEC <40 independientemente de la temperatura de tratamiento, aunque sta contribuye

a mejorar esta selectividad segn se ha comentado anteriormente. A densidades menores o mayores se pierde la selectividad por aumento de la extraccin de triglicridos con
NEC > 40.

Estos resultados difieren en parte con los obtenidos en investigaciones anteriores de grasa lctea realizada por otros autores. Chen y col. (1992a), estudiando la grasa lctea anhidra, obtienen resultados semejantes en lo referido a la variacin de la solubilidad de los triglicridos totales respecto a la presin y temperatura, observando que la extraccn mejoraba al aumentar la presin y disminuir la temperatura, excepto a presiones altas, en las que la temperatura produca poca influencia, explicndose este comportamiento por el balance entre el efecto de la densidad del CO 2 y el efecto de la presin de vapor de los 144
20
40
so
so
100
120
140
160
tiempo (mm)
20
40
60
80
100
120
140
160
tiempo (mm)
Figura 2.5.6a: trigllcrldos de la nata control, b: triglcrldos de nata tratada a 24,1 MPa y 60 C
145
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccIn de grasa lctea de nata.
triglicridos. Shukla y col. (1994) realizaron un tratamiento a 40 0C y 24,1 MPa utilizando grasa anhidra, obteniendo un extracto rico en triglicridos de alto NC y ND, lo que difiere con los resultados de esta investigacin (aumento de la extraccin de trglicridos de NEC = 40), si bien existen triglicridos insaturados de alto NC con NEC =40. Las diferencias encontradas pueden ser debidas a que la nata contiene agua y adems es una emulsin de signo O/A.
2.5. 7- Selectividad del CO
2 superertico en la extraccin de colesterol
Majewski y col. (1994) definieron el coeficiente de selectividad del CO2 supercrtico para la extraccin de colesterol basndose en la coextraccin del colesterol y los triglicridos. El colesterol, tericamente menos soluble en el CO2 supercritico que los triglicridos, posee una alta afinidad por los triglicridos de cadena corta y media. Refirindose a la concentracin de colesterol y cidos grasos en los sustratos antes y tras su tratamiento, definieron el coeficiente de selectividad de la siguiente manera:
Selectividad
re/acion colesterol acdos grasos NC < 14 en control // NC ~ (2.43)

~,
Los cidos grasos de menos de 14 tomos de carbono son los de cadena corta y media. Del mismo modo se pueden realizar los clculos con triglicridos de NEC constituyndose la ecuacin de la manera indicada:
<
42,
Selectividad
relacion colesterol / trigliceridos NEC < 42 en control relacion colesterol / trigliceridos NEC c 42 en residuo (2.44)
La figura 2.5.7 representa los resultados obtenidos del clculo de la selectividad. La 0C cuando la densidad es menor a 0,7 g/mL, es decir, mejor selectividad se produce a 60 la selectividad mejora si se reduce la densidad. La selectividad empeora con la 147
Capitulo 2. AplicacIn a la extraccin de grasa flotea de natfli
disminucin de temperatura y los mximos se consiguen a densidades de 0,8 y 0,9 g/mL para 50 y 40 0C respectivamente. Los resultados coinciden con los de Majewski y col. (1994) sobre los estudios con grasa lctea anhidra en que a presin adecuada para conseguir la mejor selectividad a 60 0C est entre 15 y 17,5 MPa. Los resultados difieren en que en su estudio la selectividad es mejor a 50 que a 60 0C, pero sealan que no es cierto que estos resultados puedan ser fiables totalmente. Los resultados tambin concuerdan con los de Yu y col. (1992), donde la mayor selectividad se consigui a presiones menores de 15 MPa cuando la temperatura fue de 60 0C (la densidad era menor de 0,6 g/rnL); la disminucin de temperatura hasta los 40 0C produjo que la selectividad alcanzada fuera menor que a 60 0C, si bien el mximo tambin se alcanz en el mismo intervalo de presiones (la densidad fue menor de 0,8 gImL), al contrario que lo obtenido por lvlajewski y col. (1994) en el mismo sustrato.
148
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nota.
ANLISIS POR ESPECTROMETRIA DE 3C-RMN
2.6.1- Preparacin de la muestray extraccin de grasa de nata La nata, de leche cruda de oveja procedente del Complejo Agropecuario Comunidad de Madrid en Aranjuez, se obtuvo del mismo modo a la del apartado 2.2.1. Las extracciones se realizaron en modo dinmico con un volumen de CO siguientes condiciones:
2 de 360 L en las
presiones de 13,8, 17,2, 20,7 y 24,1 MPa, 0C. temperaturas de 40 y 60
2.6.2- Anlisis de los extractos mediante espectrometria de resonancia magntica nuclear del C
Se pesaron 100 mg de los extractos obtenidos y se disolvieron en cloroformo para su filtracin en papel 1 PS (Whatman). Posteriormente se evapor el disolvente mediante una corriente de N 2 y el extracto seco se redisolvi en cloroformo deuteraclo para su anlisis.
13C. Los valores de los El equipo utilizado fue un Varian XL-300 de 75 MHz en desplazamientos qumicos se expresaron un unidades 5 (ppn. Los espectros se realizaron por triplicado.
149
2.7- RESULTADOS Y DISCUSIN 2. 7. 1- Anlisis de los extractos mediante resonancia magntica nuclear del 3C El espectro obtenido a partir de la grasa lctea antes de los tratamientos se encuentra representado en la figura 2.7,la, Las figuras 2.7.lb, c y d son ampliaciones de las regiones carbonlica, olefinica y saturada respectivamente. Se observa la baja sensibilidad de la tcnica espectroscpica ya que solamente es posible la deteccin de los compuestos mayoritarios, en este caso los triglicridos. No fue posible la deteccin de colesterol.
Sin embargo, pudo realizarse un anlisis de distribucin posicional de los cidos grasos que componen los triglicridos, detectndose cidos grasos de cadena corta unidos nicamente en la posicin a (o a) En la tabla 2.7.1 se detallan los desplazamientos qumicos colTeSpOndientes a cada seal y el grupo funcional que se ha asignado. Tabla 2.7.1. Desplazamientos quimicos y grupos funcionales asignados tras el anlisis por 13C-RMN de los triglicridos de la grasa lctea de oveja. 5 (ppm) 173,220 173,185 173,018 172,820 172,784 131,959 130,315 130,220 130,025 129,715 128,312 Carbono correspondiente Ca a.g. saturados Cl cza.g. insaturados Clcz(Bu) Cl~ a.g. saturados Cl
1~
a.g. insaturados HC (Ln) HC<V)
HCC(L,Lfl) H& (O, E) HCIO) HC=(Ln) 50
Captulo 2. Aplicacin a la exfraccin de grasa lctea de nata.
tabla 2.7.1 128,280 128,137 127,954 127,780 127,181 68,972 62,129 3 5,943 34,242 34,073 32,6 18 32,592 31,956 31,814 31,684 31,553 31,280 29,8-28,9 27,254 27,202 2 5,668 25,568 24,936 24,903 24,565 22,775 22,700 22,305 20,600
(continuacin) HC (Ln) HC=(L) HC= (L) HC=.(Ln) HC=(Ln) HC-O- (ji) H2C-O-(c~) C2a (Bu) C2ji C2a C}12-CH trans CH2-CH trans o3 w3n-7(V) w3 (Cl) w3 csn-6 w3 (Co) -(CH2)0CHrCH
CIS
CH2-CH eL =CH-CHrH& (Cl 1 de L y Ln) t~CH~CHz-HC (C14 de Ln) C3ji C3ct C3 (Co) 0)2(L)
w2 (Co) w2 (Ln)
151
tabla 2.7. 1 18,369 14,252 14,093 14,000 13,862 13,602 cidos grasos
(continuacin) w2 C3 (Bu) ml (Ln) col ml (L) ml (Co) col (Bu)
Los datos obtenidos permiten la cuantificacin de los cidos grasos de cadena corta de forma separada del resto de cidos grasos; esto mismo es posible con los cidos grasos poliinaturados. Tambin es posible cuantificar los cidos grasos (ram separadamente de los cis.
Se calcul un nmero de carbonos medio a partir de las integrales de los extractos analizados de la fonna siguiente:
(CH, +CH, +CH= + 1) x3 COZ]
NC-~
(2.45)
La relacin de carbonos insaturados frente a saturados:
1=
S
CH2 +CH,
(2.46)
Tambin se calcularon los porcentajes molares de:
cido butrico, a partir de m2 (C3), cido caproico, a partir de m3, 152
acido caprlico, a partir de m3, carbonos trans en el total de insaturados a partir de los carbonos allicos, acidos linoleico y linolnico en el total de cidos grasos insaturados, expresado
como cido linoleico.
Los resultados obtenidos se presentan en las figuras 2.7.1 (e
k). Se observa que, a
temperatura constante, conforme aumenta la presin hay un aumento en el nmero de carbonos medio del extracto por aumento progresivo de la densidad (figura 2.7. le), lo que se traduce en un aumento de la extraccin de triglicridos de alto peso molecular. La disminucin de la temperatura produce una mayor extraccin de estos triglicridos por aumento de la densidad a una presin constante a partir de 17,2 MPa. Por el contrario, a la menor presin del estudio (13,8 MPa), el aumento de la temperatura produce un aumento de la extraccin de triglicridos de mayor peso molecular; esto se debe a que el aumento de la temperatura conduce a un evidente favorecimiento de la extraccin por arrastre de aquellos triglicridos de mayor punto de fusin, estos triglicridos son ms dificiles de extraer si la temperatura es baja (40 0C), ya que las condiciones de baja presin del tratamiento producen una densidad baja, con poca capacidad para extraer los triglicridos de mayor NC nicamente por efecto de la solubilizacin en el fluido. A las presiones intermedias, 17,2 y 20,7 MPa, la mayor densidad a 40 0C que a 60 0C es ya suficiente para que se extraigan los triglicridos de mayor peso molecular en mayores cantidades, ya que a estas presiones pequeas variaciones de presin conducen a grandes variaciones de densidad. A 24, 1 MPa, la presin es tan alta que no existen apenas diferencias de densidad entre 40 y 60 C, el nmero medio de carbonos se iguala en las dos temperaturas por verse favorecida la extraccin de los triglicridos de mayor NC con el aumento de su presin de vapor a 60 0C.
Se observa en la figura 2.7. lf que el aumento de densidad al aumentar la presin y a temperatura constante produce un aumento de la extraccin de los triglicridos insaturados, excepto a la presin de 24,1 MPa, en corcondancia con el aumento -de los triglicridos de mayor NC (figura 2.7. le) porque la mayor parte de los triglicridos 153
CapItulo 2. AplicacIn a/a extrt&2cin de grasa lctea-de nata.
O.
o. o
CV.>
e? 1o o CO C~ 4)
o
da da .4- e.>
da
1~
o
e.) U.
cd
~ .10
Lo
154
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa flotea de ntq,
o.
4>
gjo -st 4>

<.3
2
CV,
ni
ni
h.
r o. o.
CO (V.1
c.d
<.3
te e.>
st
NG>
4
e>
CV,
CV,
10
FO
(y,
eN
55
CapItulo 2. AplIcacin a la extraccin de grasa lcftg de nola

O.
O.
(o
c.d <.3
-c
4>
E
c.d
CV ni <.3
E
-o
04
6b
4>
ni
ni
pi
156
insaturados son de alto NC. La mayor densidad conseguida a 40 0C y 24,1 NIPa produce un aumento de la extraccin de triglicridos saturados de cadena larga, por lo que la relacin i/s disminuye. A 60 0C estas variaciones son apenas apreciables.
El mayor porcentaje molar de cido butrico (figura 2,7. lg) conseguido a mayores temperaturas y menores presiones supone que los triglicridos que contienen ste cido graso (el de menor NC) son los ms fcilmente extraibles conforme las densidades empleadas son menoresa temperatura constante, contribuyendo, adems, de modo importante el efecto del aumento de su presin de vapor al utilizar tempertaras mayores (60 0C). A las dos presiones intermedias estudiadas se produce un descenso en la extraccin de butrico por aumento de la extaccin de triglicridos que contienen cidos caproico y caprlico, que se recupera en parte a 24,1 MPa. Los cidos caproico y caprlico se extraen en mayor proporcin en condiciones intermedias de presin (17,2 y 20,7 MPa) a 40 0C (figuras 2.7.1 h e i) contrariamente a la extraccin de butrico, condiciones en las que hay una mayor extraccin de triglicridos de cadena inedia. El efecto producido a 60 0C y 13,8 MPa es el mismo que ocurre en la variacin del NC medio.
En general se observa una mayor solubilidad de triglicridos con insaturaciones cts que irans a presiones bajas, hecho que produce que los extractos tengan una composicin enriquecida en cidos cts respecto al control. Este resultado puede explicarse ya que los enlaces cis producen menores puntos de fusin que los trans en las molculas, favoreciendo su extraccin. El aumento de la densidad al aumentar la presin produce el efecto contrario, apareciendo extractos ricos en cidos trans-insaturados respecto al control. El efecto del aumento de la temperatura en el aumento de la presin de vapor de aquellos triglicridos menos voltiles, los que poseen enlaces Irans, es evidenciable a presiones de 13,8 MPa, donde la densidad tan baja es poco eficaz para una buena extraccin, y a 24,1 MPa, donde la densidad a 40 y 60 0C muestra apenas diferencias.
Los cidos grasos poiinsaturados forman parte de triglicridos de bajo NEC y se extraen de forma ms selectiva a las menores presiones y 60 0C en comparacin con los cidos 160
grasos monoinsaturados, debido a que las menores condiciones de densidad favorecen la extaccin selectiva de aquellos triglicridos de menor punto de fusin, como son los PUFAs.
Los resultados que se refieren a la variacin en la extraccin de los triglicridos segn su NC concuerdan con los aportados anteriormente en los trabajos realizados sobre la composicin de grasa lctea y su extraccin con CO2 supercrtico, teniendo en cuenta que los sustratos utilizados en los anteriores trabajos son mantequilla (con el signo contrario de emulsin) y grasa anhidra. Esto mismo ocurre con los resultados que se refieren a la extraccin diferencial segn sean los triglicridos saturados o insaturados.
Los resultados referentes a la extraccin de triglicridos con insaturaciones en cts o trans son los primeros realizados, igualmente a los que se refieren a la extraccin de los cidos grasos de cadena corta y los PUFAs, y no han podido ser contrastados con otros resultados de la bibliografia, ya que los estudios realizados por otros investigadores solamente analizan las diferencias entre la extraccin de triglicridos saturados o insaturados debido a que los mtodos de anlisis empleados generalmente (OC) no distinguen entre ismeros geomtricos. Por la misma razn, el resto de resultados no son totalmente comparables, ya que la nata es un sustrato que no ha sido utilizado para la extaccin con CO2 supercrtico, la nica referencia es el trabajo de Hierro (1994). 3C-RtvliN han sido Las mayores ventajas del anlisis de extractos por espectrometra de la sencillez en la preparacin de la muestra, la posibilidad de realizar un anlisis de mezclas complejas sin previa purificacin de la muestra y la consecuentemente rpida obtencin de resultados, y que sea un mtodo no destructivo. Por contra, inconveniente ha sido la baja sensibilidad que impide la deteccin de compuestos minoritarios, como el colesterol, que sin embargo es cuantificable por HPLC. La espectrometra de 3C-RIVIN ha podido ser utilizada como complemento al anlisis de triglicridos por HPLC. Resulta una tcnica de eleccin para cuantificar parmetros, que para el HPLC son ms complejos de averiguar, muy tiles a la hora de establecer la influencia de las condiciones 161
de extraccin supercrtica (presin y temperatura) sobre la grasa lctea: influencia sobre la extraccin de los cidos de cadena corta (separadamente butrico, caproico y caprilico), influencia sobre la extraccin de triglicridos con distinta isomeria geomtrica, y con diferente grado de saturacin. En este sentido, la RMN aporta datos novedosos sobre los resultados de la extraccin con dixido de carbono supercritico sobre la grasa de la nata.
162
Captulo 3. Aplicacin de la atraccin con dixido de carbono superertico a la modificacin del destilado de la desodorizacin de aceites vegetales
Capitulo 3. AplIcacin al destilado de la desodorizacin de aceItes vegetales.
3.1- INTRODUCCION 3.1.1- Los aceites vegetales
Los aceites vegetales son productos naturales y, como tales, contienen muchas clases de compuestos diferentes. Los triglicridos son los componentes mayoritarios, constituyendo ms del 95% del aceite. Sin embargo los componentes minoritarios son tambin de gran importancia, tanto para evaluar la calidad del aceite, procedencia o adulteraciones posibles como por ser de inters en la industria qumica, alimentaria o cosmtica, como los tocoferoles, esteroles, escualeno, etc.
3.1.2- El aceite de ojiva El aceite de oliva es el procedente nicamente de los frutos del olivo (Oleo curopaca) con exclusin de los aceites obtenidos por disolventes, o de orujo de aceituna refmado, o por procedimientos de reesterificacin y de toda mezcla con aceites de otra naturaleza. Este aceite es de gran importancia econmica en los paises mediterrneos, particularmente en Espaa.
Dentro del aceite de oliva, a nivel comercial, se distinguen varios tipos (Madrid, 1986, C.O.J., 24-11-1995):
Aceite de oliva virgen. Aceite obtenido del fruto del olivo nicamente por procedimientos mecnicos o por otros medios fisicos en condiciones, especialmente tnnicas, que no produzcan la alteracin del aceite, que no hayan tenido ms tratamiento que el lavado, la decantacin, la centrifugacin y el filtrado. No se considerar apto para el consumo humano el aceite de oliva virgen lampante.
Aceite de oliva refinado. Aceite de oliva obtenido del aceite de oliva virgen mediante
164
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales
tcnicas de refinado que no provoquen modificaciones de la estructura gliceridica inicial,
Aceite de oliva (antes aceite puro de oliva o 100% puro de oliva). Aceite constituido por una mezcla de aceite de oliva virgen apto para el consumo en la forma en que obtiene y de aceite de oJiva refinado.
Aceite lampante es aquel de sabor defectuoso o de acidez superior al 3%, por lo que no se considera comestible.
Aceite de orujo de oliva refinado es el aceite obtenido por tratamiento con disolventes de los orujos de oliva, con exclusin de los aceites obtenidos por procedimientos de reesterificacin y de toda mezcla con aceites de otra naturaleza.
3.1.3- Aceites de semillas oleaginosas
Son los aceites obtenidos de las semillas oleaginosas expresamente autorizadas de acuerdo con las normas establecidas en la reglamentacin y sometidas a refinacin completa previamente a su utilizacin como aceites para consumo humano (Madrid, 1986). A nivel mundial, estos aceites se consumen y producen en mayor cantidad que el de oliva, si bien, en Espaa no tienen tanta importancia socioeconmica.
Entre otros, podemos citar e] aceite refinado de girasol, mafz, pepita de uva, crtamo (producidos enteramente en Espaa), soja, cacahute, colza, algodn y mezclas de dos o ms de ellos.
Los aceites de semillas no suelen comercializarse sin refinar, porque suelen proceder de una extraccin con disolventes (como el hexano) y, en menor medida, de una extraccin mecnica.
165
Capitulo 3. Aplicacin a~ destilado de Ja desodorizacin de aceites vegetales
3.1.4- Desodorizacin del aceite de oliva
El aceite de oliva necesita ser refinado cuando no es de buena calidad, lo que sucede cuando se extrae de aceitunas tratadas de forma poco adecuada. Actualmente, la cantidad de aceite de oliva sometido a refinacin ha disminuido debido a la mejora de los mtodos de recoleccin, almacenamiento, procesado y otros factores. Sin embargo, el aceite de oliva que tiene que ser refinado se suele someter a varas o a todas de las operaciones siguientes:
eliminacin de sustancias resinosas, neutralizacin de los cidos grasos libres, desodorizacin, decoloracin.
La desodorizacin es el proceso de eliminacin de las sustancias responsables de los malos olores y sabores (aldehdos y cetonas sobre todo). Este proceso se lleva a cabo a baja presin (3-5 mm Hg) y a alta temperatura (180-250 0C). La desodorizacin se suele aplicar a aceites viejos que han desarrollado malos olores por oxidacin. El aceite de oliva fresco rara vez necesita ser desodorizado. Con la desodorizacin se eliminan tambin los residuos de plaguicidas (Kiritsakis, 1992). En los ltimos aos se ha extendido mucho el uso de la llamada refinacin fisica del aceite de oliva, que consiste en suprimir la etapa de neutralizacin separando los cidos grasos libres (con e] resto de materias voltiles y algo de aceite neutro arrastrado) en el curso de la desodorizacin con vapor de agua. Los productos arrastrados son principalmente cidos grasos, glicridos y compuestos insaponificables, encontrndose estos ltimos en proporcin mucho ms alta que en el aceite de partida. Este hecho aumenta el inters por el estudio del subproducto obtenido, pudindose revalorizar, y que, adems, se produce en cantidades cada da mayores a medida que se extiende la utilizacin de la refmacin fisica (Martnez-Moreno y Serra-Masa, 1980).
166
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
El inters del destilado de la desodorizacin radica principalmente en la elevada proporcin de compuestos insaponificables que posee. De ellos, el escualeno es el ms abundante, seguido, en mucha menor cantidad de compuestos esterlicos, pudindose utilizar el destilado como fuente de estos compuestos. El escualeno es un hidrocarburo presente en abundancia en algunos aceites de pescado y normalmente se usa como agente humectante o emoliente en cosmtica, adems de poseer inters por ser precursor en la biosntesis del colesterol (Bondioli y col., 1993). Una razn que imita el uso del escualeno en cosmtica es la incertidumbre de su disponibilidad como resultado de convenios de proteccin de los animales marinos que son su fuente primaria de obtencin. Este hecho ha aumentado el inters hacia el aprovechamiento de aceites vegetales y, sobre todo, de los subproductos de su elaboracin, ya que son relativamente abundantes, ms baratos y ricos en este compuesto. Otros compuestos presentes en el destilado tambin son de inters, como el ~-sitosterol y estignasterol, que se ha visto que poseen actividad sinrgica hipoglucemiante (Jamaluddin y col., 1994).
La metodologa analtica de los esteroles en grasas, aceites y alimentos en general se basa normalmente en la extraccin de la materia insaponificable, aislamiento de la fraccin de esteroles por cromatografia en capa fina y separacin de los componentes de la fraccin por cromatografa gaseosa. Este mtodo es el oficial segn la legislacin espaola para esteroles en grasas y aceites (B.O.E. nm. 274, 15 de noviembre de 1985). Otros mtodos incluyen la utilizacin de una columna de cromatografia lquida preparativa sustituyendo la saponificacin (Worthington y Hitchcock, 1984), o se basan en el acoplamiento LCGC (Grob y col., 1992; Artho y col., 1993; Seorns, 1996) o en la sustitucin del anlisis mediante OC por el de HPLC utilizando detectores de varacin del ndice de refraccin o UV (Cortesi y col., 1977; Holen, 1985). La desventaja que presenta el uso de los detectores de ndice de refraccin o ultravioleta (X entre 205 y 210 tun) en el anlisis de esteroles por HPLC es que no permiten hacer gradientes y por lo tanto es dificil conseguir un mtodo que permita separar mezclas de un gran numero de esteroles. Para
167
aumentar la resolucin sera necesario el empleo de gradiente de fase mvil. Por ello en este apartado se estudi inicialmente la aplicacin del detector de masa, utilizado ya en el anlisis de otros componentes lipdicos como los triglicridos. Adems, el detector de masa se puede utilizar para cuantificar escualeno junto con un nmero amplio de esteroles.
Los anlisis de escualeno siguen los mismos mtodos que los ms comunes para el anlisis de la fraccin esterlica, es decir, la separacin mediante cromatografa de gases tras la saponificacin y la preseparacin por croxuatografla en capa fina, como es el utilizado por Bondioli y col, (1993) para el anlisis de los extractos de DDO obtenidos mediante extraccin con CO2 supercrtico. Otros mtodos ms recientes para el anlisis en alimentos de escualeno utilizan la cromatografa de fluidos supercrticos (Staby y col., 3C-RMN (Zamora y col., 1994), y el acoplamiento LC-GC 1994), la espectroscopia de directo (Grog y col., 1992; Artho y col., 1993; Sefiorns, 1996).
ANLISIS DE LOS COMPUESTOS DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE DEL DESTILADO DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA
3.2.1- Preparacin de a muestra
Las muestras de destilado de la desodorizacin de aceite de oliva y girasol provinieron del Instituto de la Grasa (C.S.I.C., Sevilla) y se mantuvieron en congelador hasta el momento de su uso.
A 1 g de destilado se le aaden 50 mL de KOH metanlica 2N preparada en el da. Esta mezcla se pone a calentar a reflujo durante 30 miii. La solucin restante se lleva a una
168
Capitulo 3. Aplicacin al desfilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
ampolla de decantacin, y el matraz se lava con dos porciones de 25 nL de agua destilada que tambin se llevan al embudo. Se aaden 10 mL de una solucin de NaC al 10% y se extrae con dos porciones de 100 mL de ter etlico/ter de petrleo (1:1). Se recogen las -fases etreas, se concentran con un rotavapor hasta un volumen aproximado de 5 mL y se filtran con papel separador de fase Wathman 1PS para eliminar restos de fase hidroalcohlica; posteriormente se llevan a sequedad con el rotavapor. El residuo obtenido se redisuelve en 1 mL de acetona para el anlisis de los esteroles. De la disolucin anterior se reservan 0,5 mL y se llevan con acetona a un volumen final de 5 mL para el anlisis de escualeno.
3.2.2- Descripcin del equipo El sistema cromatogrfico utilizado consisti en dos bombas modelo 125 (Beckman), un inyector Rheodyne modelo 7125 con un bucle de carga de 20 gL, se utilizaron varias columnas de acero inoxidable (para la optimizacin del anlisis cualitativo, apartado 3.2.3.1) de 4,6 mm de di. rellenas con Spherisorb ODS-2 de tamao de partcula variable (Phase Separations, Syinta) en un bao de agua para el control de la temperatura. El detector de masa fue un ACS 750/14 (Ihe Arsenal) con una temperatura en el evaporador de 45 0C y 172 kPa de presin de aire, condiciones que se variaron para la realizacin del anlisis cuantitativo. El aire a presin fue proporcionado por un compresor (Air Control) y posteriormente secado por dos trampas de agua. Se utilizaron balas de aire para alcanzar presiones de 276 kPa en el evaporador durante el estudio del detector, ya que el compresor solamente proporcionaba presiones mximas de 210 kPa. Los vapores formados eran eliminados por medio de un extractor. Los datos eran adquir dos a travs de una interfase modelo 406 (Beckman) hasta un System Goid (Beckman).
La fase mvil consisti en eluciones en isocrtico o gradiente de metanol, etanol o sopropanol en acetonitrilo, todos de grado HPLC (apartado 3.2.3.2). El flujo empleado fre
169
Capitulo .3. AplIcacin al destilado de la clesodorizacln de aceites vegetales.
de 1,5 mL/mm. Los mtodos de elucin de la fase mvil fueron controlados mediante el programa System GoId (Beckman).
3.2.3- AndlisiLv cualitativo
La optimizacin en el anlisis cualitativo se llev a cabo para identificar los picos de las muestras y para conseguir, en anlisis de corta duracin, una buena resolucin entre los compuestos que facilitara la posterior cuantificacin. Para ello, se combinaron distintas condiciones de longitud de columna y tamafio de partcula, tipo y proporcin de modificador, temperatura de la columna y elucin isocrtica o con gradiente de polaridad. Posteriormente se realiz un estudio estadstico de los factores de capacidad (k) y resolucin (R) de pares crticos.
El anlisis cualitativo se llev a cabo inyectando por triplicado soluciones metanlicas de desmosterol, ergosterol, lanosterol, fucosterol, colesterol, estigmasterol, cainpesterol, sitosterol y escualeno (Sigma Chemical) en concentraciones de 10 mg/mL.
13-
3.2.3.1- Eleccin de la columna
Para es estudio del tipo de columna se utilizaron las tres que se disponan en el laboratorio, que presentaban tres longitudes diferentes y dos tamaos de partcula:
7,5 cm longitud, 3 ~tm tamao de partcula 5 3
-1.5 -20
1.70
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
3.2.3.2- Eleccin de la fase mvil
La fase mvil estuvo constituida por acetonitrilo y un modificador de la polaridad. El orden de polaridad de los eluyentes a la temperatura de estudio (45 0C) fue el siguiente: acetonitrilo > metanol> etanol> iso-propanol.
Como estimacin de la polaridad del modificador se utiliz la constante dielctrica (e) medida a temperatura ambiente a la hora de realizar los clculos en la obtencin de los resultados. Las constantes son las siguientes:
acetonitrilo, E 37,50;
=
metanol, e etanol, e
=
32,63;
24,30;
=
so-propanol, e
18,30,
En primer lugar se realizaron estudios en elucin isocritica utilizando cada uno de los modificadores en proporciones de O a 100%.
3.2.3.3- Eleccin del gradiente
La eleccin de gradiente se llev a cabo utilizando la columna de 20 cm. Se realizaron gradientes de metanol en acetonitrilo de:
-
1, 2, 3, 4 y 5%/mm a partir del 0%, 4,5%/mm a partir del 10%, 4%/mm a partir del 20%.
171
3.2.3,4- Eleccin de la temperatura de la columna
Se estudi la resolucin en funcin de la temperatura de la columna Para ello se program la temperatura del bao de agua a 35, 45 y 55 oc. Este estudio se realiz utilizando la columna de 20 cm y un gradiente de metanol en acetonitrilo del 30/o/mrn,
3.2.3.5- Anlisis estadstico Los resultados sobre tiempos de retencin de los patrones en cada una de las condiciones estudiadas se utilizaron para establecer ecuaciones que relacionaran el k con las variables del sistema cromatogrfico. En los casos en los que aparecieron pares crticos, la utilizacin nicamente de k para la valoracin de los resultados careca de consistencia, por lo que se decidi tener en cuenta la anchura de los picos calculando la resolucin y establecer, as, las mejores condiciones de ehicin. La decisin del clculo de la resolucin se debi principalmente a que el acetonitrilo de la fase mvil produca un distanciamiento de los k, favoreciendo la separacin; sin embargo, tambin se favoreca la fonnacin de colas en los picos, producindose solapamientos que podran dificultar la cuantificacin. La resolucin se calcul a partir de la anchura del pico en la base, inidindose sta de forma manual, ya que el programa informtico disponible (Suitability de System GoId) no apreciaba la formacin de colas. En los casos en los que los picos aparecieron solapados se utiliz el programa Peakfit de Jandel Scientific, versin V3. liB para la descomposicin en gaussianas y posterior medida de las anchuras. La resolucin se calcul segn la ecuacin:
Vr
WbI + Wbj
(3.1)
2 siendo: R la resolucin,
172
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
A/r
la variacin en los tiempos de retencin del par critico 1 y 2,
Wb la anchura en la base de los picos 1 y 2.
Las ecuaciones que relacionan /6 y 1? con las variables del mtodo de separacin se obtuvieron mediante los programas iR y 9R de regresin lineal mltiple de I3MDP. El programa 9R tiene la ventaja sobre el IR de que posee menores valores de tolerancia y ofrece unos segundos resultados alternativos tras eliminar los puntos anmalos o hiera de rango. Adems, da los valores de error de estimacin y prediccin.
3.24- Anlisis cuantitativo
3.2.4.1- Estudio del detector. Anlisis estadstico El detector de masa posee amplias posibilidades aplicado al anlisis de compuestos lipdicos, compuestos para los que el detector de indice de refraccin y el ultravioleta no permiten la utilizacin de gradientes de polaridad. En la mayora de los casos, las razones que conducen al uso de este detector son:
la necesidad de utilizar gradientes de elucin para poder separar los componentes
de mezclas complejas, como son algunas grasas naturales,

-
las fases mviles ms convenientes para estas separaciones absorben en la regin
U.v,
-
los compuestos a analizar absorven poco a longitudes de onda superiores a 200
un.
Este detector puede ser utilizado con cualquier disolvente o mezclas de stos, siempre que sean suficientemente voltiles y sobre todo, en relacin a los solutos, que no se
73
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
volatilicen en las condiciones del evaporador. En la figura 3.2.4.1 se muestra un esquema del funcionamiento del detector. La fase mvil con compuestos ya separados es nebulizada por medio de la entrada de aire a presin, que es factor determinante en el tamao de las gotas formadas. Esta nebulizacin favorece la posterior volatilizacin en el evaporador, que se mantiene a una temperatura a la que se volatilice la fase mvil, pero no los solutos. Finalmente, los compuestos a detectar quedan formando pequeas partculas slidas que provocan la desviacin de un haz de luz (principalmente por reflexin y refraccin, Charlesworth, 1978), la luz dispersada se detecta en un fotomultiplicador y es directamente proporcional a la masa de soluto. Adems de la volatilidad del soluto, tambin influyen en la deteccin su estructura qumica y la cantidad inyectada, ya que son otros factores que detenninan el tamao y nmero de partculas formadas en el proceso de deteccin.
Se ha descrito por varios investigadores que la respuesta del detector de masa no es lineal y que adems depende fuertemente de la temperatura del evaporador y, en menor medida, de la presin del aire en el nebulizador y la cantidad inyectada (Charlesworth, 1978; Macrae y Dick, 1981; Macrae y col., 1982; Stolyhwo y col., 1983, 1984, 1985 y 1987; Mourey y Oppenheimer, 1984; Perrin y Prevot, 1984; Oppenheimer y Mourey, 1985; Warner y Mounts, 1990; Hopia y col., 1992; Dreux y col., 1996). Sin embargo, a pesar de las variaciones que se puedan producir en las respuestas, se puede asumir que, en un rango de cantidades de soluto, el rea del pico (A) se relaciona con la masa (ni) mediante la siguiente relacin exponencial: A =anit (3.2)
donde a y x son coeficientes dependientes del tamao de las gotas, concentracin y naturaleza del soluto, presin del evaporador y extractor, y temperatura del evaporador.
174
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorzacin de aceites vegaiaies.
Aire a Fase mvil
4.
NEBULIZACIN ~ presin
o
z o
-4
00000
y
oc
Fuente de luz DETECCIN Fo t orn u Iti pl ica do r
Figura 3.2.4.1. Esquema de un detector de masa
175
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
La transformacin logartmica de la ecuacin anterior, sin embargo, muestra ya una dependencia lineal entre los logaritmos de A
y
m:
logA=xlogm+loga; (3.3)
Los valores de x encontrados en la bibliografa se encuentran entre 0,9 y 1,8, siendo correctos todos ellos al entrar dentro del intervalo terico establecido 0,66-2,0, si bien, la respuesta ser ms prxima a la linealidad con valores de .x ms cercanos a la unidad. Charlesworth (1978) realiza un estudio profundo del detector y concluye que, para concentraciones elevadas y dependiendo del resto de condiciones, la respuesta pasa de exponencial a sigmoidal, encontrndose un pequeo intervalo intermedio de
concentraciones donde la respuesta es lineal.
En el presente trabajo se deci estudiar la temperatura del evaporador y presin del aire para optimizar la relacin rea/masa segn los modelos propuestos. Las temperaturas y presiones mximas y mnimas vinieron dadas por las limitaciones del detector y compresor, y por el aumento en exceso del nivel de mido basal. Las condiciones estudiadas fueron las siguientes:
-
se inyectaron por triplicado disoluciones de 10 y 20 .tg de ergosterol, colesterol,
estigmasterol y escualeno en acetona, las temperaturas del evaporador estudiadas fueron de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, SOy 96 0C a una presin de 172 kPa,
-
se estudiaron temperaturas de 25, 45, 60, 80 y 96 0C a las presiones de 103, 207
y276kPa.
Los resultados se procesaron mediante el programa 9R del BMDP para conseguir que las respuestas de los distintos patrones fueran los ms semejantes y elevadas posibles.
176
Captula 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites wgetales,
3.2.4.2- Linealidad de la respuesta
Se inyectaron por duplicado dos disoluciones de ergosterol, colesterol, estigmasterol y escualeno en las cantidades de 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 30 y 40 gg, y 85 pg de escualeno.
Una vez establecidas la condiciones de presin y temperatura del detector se obtuvieron las ecuaciones que relacionaron la respuesta con la cantidad inyectada (la adecuacin a la linealidad era menos satisfactoria si los ensayos se realizaban en condiciones no optimizadas del detector de masa). La lunealidad de Ja respuesta se calcul segn el modelo descrito en el apartado anterior. Las operaciones se realizaron mediante el programa 9R de regresin lineal simpie del BMDP.
3.2.4.3- Clculo del factor de resnuesta En el clculo del factor de respuesta se decidi utilizar ergosterol como patrn interno, ya que no se presentaba en la muestras de destilado de la desodorizacin de aceite de oliva ni girasol, y se resolva bien respecto a los compuestos de inters de las muestras y otros componentes no identificados.
Se inyectaron por duplicado dos soluciones con cada una de las siguientes cantidades:
-
10 .tg de ergosterol, 2,5; 5; 10; 20; 30 y 40 gg de colesterol, estigmasterol y escualeno.
liJado que el anlisis cuantitativo con el factor de respuesta se basa en el clculo por mnimos cuadrados, es decir, regresin lineal, se transformaron los parmetros en una
171
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodo zac On de aceites vegeto/es
forma logartmica que garantiza la relacin lineal simple entre la respuesta y la cantidad inyectada:
log4 logC~, ; (3.4) logAs, IogC,

.
siendo:
2r1
el factor de respuesta del compuesto 1,
C, la concentracin del compuesto /,
Gp la concentracin del patrn interno, A, el rea del compuesto /,

A~ 1 el rea del patrn interno.
3.2.4.4- Precisin del mtodo La precisin de todo el mtodo analtico, incluido el proceso de preparacin de muestra, se estim analizando por duplicado 5 hidrlisis de un mismo destilado de oliva, adicionando 1 mg de ergosterol como patrn interno, y se calcul la desviacin estndar relativa.
3.3.1- Anlisis cualitativo 3.3. 1. 1- Anlisis estadstico en la eleccin de la columna y la fase mvil Los resultados de k obtenidos tras la inyeccin de los patrones permitieron el estudio de la variacin del logk de cada uno de ellos frente al tipo de columna utilizada, tipo de
178
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodonizacin de-aceites- vegetales.
modificador y porcentaje en el que se encontraba en la fase mvil. En el caso del sopropanol, no se pudo hacer el estudio con la columna de 20 cm y 3 ~Im porque las mezclas con acetonitrilo daban presiones excesivamente altas; los mismo ocurra con el etanol, En el caso de la columna de 7,5 cm prcticamente no hay separacin con porcaentajes superiores al 2% por lo que no se ha tenido en cuenta. Las ecuaciones obtenidas son las siguientes:
A- Metanol, columna de 7,5 cm, 3 I~m:

-
Desmosterol: Ergosterol: Lanosterol: Fucosterol: Colesterol: EstigmasterOl Campesterol: p-Sitosterol:
logk logk log/c logk logk logk logk logk
1,76 0,00 193%MeOH;

-
0,986 1;
0,9816; 0,9891;
1,83 0,00282%MeOl-I;
-
1,91
0,00266~%MeOH;
9 9 19 19
19 19
= = =
=
1,94 0,00315~%MeOH;
-
0,9880; 0,9933;
0,993 8;
1,96 0,00327.%MeOH;
-
2,01 0,00356~%MeOH;
-
2,02 0,00355~%MeOH;
-
0,9836; 0,9889;
2,08 0,0037P%MeOH;
-
B- Metanol, columna delS cm, 5 gm:

-
Desmosterol: Ergosterol: Lanosterol: Fucosterob Colesterol: EstigmasterOl CampesteroL p-Sitosterol:
logk logk logk logk logk logk logk logk
1,11- 0,00272%MeOH; 1,14- 0,00293.%MeOH; 1,24- 0,00302%MeOH; 1,27- O,00339~%MeOH; 1,29- 0,0036 l~%MeOH; 1,34- 0,00378%MeOH; 1,36- 0,00376~%MeOH; 1,40- 0,00383~%MeOH;
19 19 19 19 19
0,9309; 0,9229; 0,9823; 0,9446; 0,9669; 0,9800; 0,9085; 0,9729;
C- Metanol, columna de 20 cm, 3 gm: logk 1,78 0,00228~%MeOH; ErgosteroL

-
2
=
0,9537;
179
Capalo .3, Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegnales.
Lanosterol: Fucosterol: Colesterol: Estigmasterol: Campesterol: frSitosterol:
logk
1,85 O,00230%MeOH;
-
=0,9851;
=
ogk = 1,89- O,00255%MeOH; logk = 1,91 0,00282%MeOH;

-
0,9563; 0,9814; 0,9838;
19
logk = 1,95 0,00300%MeOH;

-
logk = 1,96- 0,00292~%MeO1q;

]ogk = 2,00- 0,00313%MeOH;
=0,9779; =0,9841;
D- Etanol, columna de 15 cm, 5 gm:

-
Desmosterol: Ergosterol: Lanosterol: Fucosterol: Colesterol: Estigmasterol: Campesterol:
logk= 1,11 0,00788%EtOll-1;

-
~0,9668;
=0,9651;
logk= 1,14- 0,00806%EtOH;
logk= 1,23 0,00883~%EtOH;

-
logk = 1,26 0,O0907~%EtOH;

-
logk = 1,27 0,009 1 E%EtOH;

-
0,9898; 0,9707; 0,9788;
= =
=
logk
1,33 0,00954%EtOH;
-
logk = 1,34 0,00962%EtOH;
19 0,9846; 9 = 0,9779;
~-Sitosterol: log/c = 1,39- 0,010O5~%EtOH;
19
19
0,9843;
E- iso-Propanol, columna de 15 cm, 5 .zm:

-
0,9750; 0,9706;
Desmosterol: Ergosterol: Lanosterol: Fucosterol: Colesterol: Estigmasterol: Campesterol:
logk = 1,10- 0,00911 ~%iPrOH; logk logk logk J,13 0,00940%IPrOH;

-
1,22- 0,01018%iPrOH; 1,25- 0,01049%iPrOH;
=0,9881;
logk= 1,27- 0,0l065~%iPrOH; logk l,32-0,0llI3~%iPrOH; logk 1,33-0,01 l22~%iPrOH; 1,3$ -0,01 170%IPrOH;
19 19
0,9734;
0,9824;
19=0,9870;
logk~ ~-Sitosterol:
19
= =
0,9809; 0,9854.
Las figuras 3.3.1. 1(a-e) son las representaciones grficas de las ecuaciones anteriores. Se observ que la variacin del factor de capacidad en funcin del tipo de modificador era
)80
iouzK
Cap (talo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
~storoJ * ergosterol fi latiosterol * fucosterol ~ cojosterol estgtiiaStCtOl e caniposterol 4 B.sitosterol
1,50 0 20 40 60 80 100
MeOH
(%)
Figura 3.3.1.la, Influencia de la proporcin de unetausol en la variacin de k. Columna dc 7,5 cm de longitud.
logK
desmes toro * OrgOslerOl

fi lanosiorol + fucosterol &
colesterol
estigfliatleffll .*oanipestaoi ql 13-shtosLerol
0,80
20
40
80
100
MoOli
(%)
la proporcin de metano1 en la variacin de k. Figura 3.3.1.lb. !nlluenCiS de Columna dc 15 cnt de longiluid.
*orgstewi
1 fi la nos loro + fucosterol &colestetol ostigniasterol e eaiiipOStOrOl * il.silo,terol
80
100
MeOH Figura 3.3.1,lc. ufluetitia de la proporcin de ittttflOl

cli
(%) 181
al variacin dc k.
Colunula de 26 cm dc longitud.
Capitulo 3, Aplicacin al destilado de la desodq~l~ocin de aceitesvg?jqlgs
desniosterol * ergoslerl lanosterl + Cuoosterol tcoles terol estigsinsteroi C campestorol *B.sitosterol
0,2
20
40
60
80
EtOil
100
(%)
Figura 3.3.1.Id. lnfl~iencIa de la proporcin de olanol en la variacin de It. Coinnina dc 15 cm.
logK
des moslerol
*OrgOSlCrOl
Glanosterol + fucostero1 * coles Icrol ostgiswskrc~l campeste rol B.siioslerol
0,0
20
40
60
80 i.PrOH
100
(%)
Figura 3.3.1.Ie. Influencia de In proporcin dc Iso.psOpaSOI en la wariaclia de k. Coluinflhl de 15 cus dc longilud.
152
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodarizacln de aceites vegetales.
1o 4)
4..
tiempo (mm>
Figura 3.3.1.lf. Anlisis de 8-sitosterol por HPLC en las siguientes

condiciones:
15 cm, tamao de partcula: 5 im, fase mvil: acetonitrilo 100% detector: UV.
-
colufluiia
183
Capitulo 3, Aplicacin al desfilado de la desodorizacicln de aceites vegetales
ms evidente en el iso-propanol, seguido del etanol y metanol respectivamente debido a que la menor polaridad del modificador causa una elucin ms rpida de los solutos. En el caso de utilizar iso-propanol, el logk descendi hasta 0,2 aproximadamente y para todos los compuestos del estudio, para el caso de la utilizacin de etanol logk fue de _0 4 En ambos casos la duracin de los anlisis es cofia, sin embargo, esto hacer empeorar la resolucin entre los compuestos eluidos. El empleo de metanol condujo a mayores tiempos de retencin que el etanol e iso-propanol para iguales procentajes en la fase mvil; de este modo, la separacin de los diferentes compuestos fue ms satisfactoria. La utilizacin de bajos porcentajes de modificador e, incluso, de 100% de acetonitrilo en la fase mvil conduca a la mxima separacin de los compestos analizados, sin embargo, la resolucin no era aceptable debido a que los picos presentaban importantes colas. La figura 3.3.l.lf muestra un cromatograma de estas caractersticas, donde se aprecia la aparicin de la cola en el pico de 13-sitosterol. Al comparar la variacin del logk respecto a la longitud de columna (columnas de 20 y 7,5 cm) se observ que la columna de mayor longitud produca resultados ms satisfactorios que los de la de menor longitud, adems de que los logk estaban ms distanciados entre cada compuesto. El hecho de encontrar valores de logkmucho menores en la columna de 15 cm no se debe a la longitud sino al tamao de partcula, observndose que la utilizacin de partculas de 5 xm conduce a la obtencin de menores tiempos de retencin que el uso de partculas de 3 jxm. De este modo, y en una primera aproximacin a los resultados finales, se poda asegurar la conveniencia de la utilizacin de la columna de 20 cm de longitud, 3 gm de tamao de partcula y metanol como modificador, para evitar al mximo la coelucin de los compuestos de la mezcla.
Posteriormente se estudi la resolucin de los pares criticos, ya que se vi que algunos picos presentaban colas con baja proporcin de modificador. Se calcul la variacin de la resolucin segn el tipo y porcentaje de modificador en el caso de la utilizacin de la columna de 15 cm y 5 gm de tamao de partcula. La longitud de columna se estudi para los casos de 7,5 y 20 cm, ya que posean el mismo tamao de partcula (3 km) y con
184
metanol como modificador. Los resultados fueron los que aparecen en las figuras 3.3. 1. lg-p).
Las figuras 3.3.1.lg y h muestran cmo los mejores resultados en la resolucin se consiguen al aumentar la longitud de la columna y disminuir el porcentaje de modificador; sin embargo, la resolucin entre estigmasterol y campesterol mejora al aumentar el porcentaje de metanol (figura 3.3.l.lj). La resolucin entre fucosterol y colesterol solamente mejora al aumentar la longitud de la columna a partir de los 12 cm (figura 3.3.l.ly). En cuanto a lo referido al tipo de modificador, para el par critico desmosterol-ergosterol (figura 3.3.1.1k) la mxima resolucin se consigui utilizando etanol en un 20%, si bien, la resolucin dependi poco del tipo de modificador y ms del porcentaje en que se encontraba en la fase mvil. La resolucin entre el lanosterol y el fucosterol (figura 3.3. 1.11) fue baja independientemente del tipo de modificador empleado, incluso sin modificador. Hay que puntualizar que este estudio, el de la resolucin en funcin del tipo de modificador, se llev a cabo utilizando la columna de 5 pxm de tamao de partcula del relleno, y es fcilmente apreciable que la resolucin aumenta sensiblemente al cambiar a al tamao de 3 Itm: la grfica 3.3. 1. lg sobre la resolucin entre el lanosterol y fucosterol se basa en columnas de 3 iim y muestra que para una supuesta longitud columna de 15 cm la resolucin conseguida es siempre superior a la de los resultados obtenidos en 3.3.1.11. Los resultados de la resolucin entre lanosterol-colesterol, fucosterol-colesterol y estigmasterol-caflipesterol (figuras
3.3. i. 1(m-f) son semejantes a los obtenidos en el caso del par lanosterol-flicosterol, observndose un ligero aumento de la resolucin al aumentar la polaridad del modificador, excepto para el par lanosterol-colesterol, aunque sus resutados muestran valores altos de resolucin. La figura 3.3.1. lo muestra cmo la resolucin entre el par critico desmosterol-ergosterol disminuye de modo apreciable al aumentar el porcentaje del modificador, coincidiendo con los resultados aportados anteriormente (figuras 3.3.1. 1(g-i). La resolucin entre el ergosterol y el lanosterol, utilizando metano! y la colunma de 20 cm (figura 3.3.l.lp) muestra siempre valores altos, pero son los mayores los encontrados para porcentajes alrededor del 50%.
185
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales

Resolucin
entre desmosterol
ergosterol
R Resolucin P=Porcca,laje dc Modificador T=Tipo de Modificador CLoogitud dc i~ Columna
1,6
1,4
lo
1,5 80 0,022W
-
O,0001281~2 C = 7,5 cm
08
06
20
40
60
80
100 MeOR 11%)
Figura 3.3.1.lo. Influencia de la proporcin de netanol en la variacin de la resolucin. Columna <le 7,5 cm.
Resolucin entre ergosterol y lanosterol 65 6,0
5,5
5,0 4,5 4,0
3~5~
20
40
6<)
80
100 MeOH (%)
Figura 3.3.l.lp. Influencia de a proporcin de metanol en la variacin de la resolucin. Columna de 20 cm.
191
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegala/es
Los resultados muestran, en general, que, como era de esperar, se consigue una mejora de la resolucin al disminuir el tamao de partcula del relleno, al aumentar la longitud de la columna para aquellas de igual tamao de partcula, y al aumentar la palaridad. Estos resultados concluyeron que para conseguir una mejor separacin de los patrones del estudio se deba utilizar la columna de 20 cm y 3 pm de tamao de partcula con metanol como modificador en la fase mvil. Respecto al porcentaje de metanol hay que decir que para los pares crticos que elidan en primer lugar la resolucin mejoraba con bajos porcentajes, sin embargo, para el par estigmasterol-campesterol (el que sufra una mayor retencin) la resolucin aumentaba con el porcentaje de modificador, hecho que se explica porque el aumento de la aunchura de los picos en la base era contrarrestado por el empleo de ms cantidad de metanol. Estas ltimas conclusiones hicieron aconsejable el empleo de gradiente de polaridad. La figura 3.3.1. lq muestra un cromatograma obtenido utilizando la columna de 20 cm de longitud, con metanol, y las estructuras qumicas de los patrones utilizados.
3.3.1.2- Eleccin del gradiente El gradiente permiti acortar el tiempo de anlisis, mejorando la eficacia al estrechar los picos sin perder resolucin.
Se obtuvieron las ecuaciones correspondientes a la variacin del factor de capacidad con el porcentaje inicial de metanol y con la velocidad de gradiente:
Desmosterol:
logk logk
1,850 0,01498-O;
-
1,775 -0,00496~I;
-
Ergosterol:
logk= 1,859 0,01487ii1; logk= 1,784 0,00485~ 1;

-
192
Capitulo 3. AplicacIn al destilado de la desodorizaclnde aceites vegetales.
escualeno
desmosterol
-5
4.>
A
o 3-
o 3-.
o
o 3...
It
o
o
3-
E ti,
4.>
o 4> 04
.4
It
It
u
4.. A
4)
Cf) o,
a4) 4.. A o -4... ci,
lo tiempo (mm)
15
o
33
ergosterol
lanosterol
fucos terol
estigmasterol
campesterol
B-stostero]
Figura 3.3.1.lq. Cromatograma y estructuras moleculares de los esteroles utIlizados.
193
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodarizacin de aceites vegetales
Lanosterol:
logk= 1,889 0,01218G;

-
logk=
-
1,828
0,00354~ 1;
Fucosterol:
logk= 1,953 0,0l800G;

-
logk = 1,863 0,00441 4;

-
Colesterol:
logk = 1,978 O,01944C;

-
logk = 1,881
-
0,00435 1;
Campesterol:
logk = 2,0 13 0,020180;

-
logk = 1,912 0,00406 I;

-
~-Sitosterol: logk = 2,056 0,02 182G;

-
logk = 1,946 0,00386 ~I;

-
Escualeno:
logk = 1,893 0,0O706~G;

-
logk= 1,858 0,00129 ~I;

-
0/o/min, donde O es el gradiente en 1 es el metanol inicial en Las figuras 3.3.1.2 a y b muestran las representaciones grficas de las ecuaciones arriba indicadas, Se observ que el comportamiento del escualeno frente al gradiente era copletamente distinto al del resto de componentes, producindose pocas variaciones del tiempo de retencin, es decir, que el grasdiente de polaridad no parece afectar al tiempo de elucin del escualeno. Estas diferencias pueden ser debidas a la distinta estructura molecular del escualeno respecto a los otros compuestos. De esta forma, y en el rango estudiado, la retencin relativa del escualeno mejoraba con unos compuestos a la vez que empeoraba con otros. En el caso de haber un porcentaje inicial de metanol del 0% la elucin del escualeno se produjo entre a del lanosterol y flicosterol. Si el % inicial era de un 40% la elucin del escualeno, apenas variada, se produjo en el ltimo lugar, tras la elucin del B-sitosterol. El resto de componentes sufri una disminucin del tiempo de retencin al aumentar el gradiente, no habiendo diferencias entre ellos, con poca afectacin de la selectividad (a) en la mayora de los casos y para ambas experiencias; la
194
Capitulo 3. AptCOCifl ci destilada de la desodorizacin ce aceiteS vegOtOlOS 2,1 logk
i.7~
Gradiente dc metanO1 (%/tflifl)
Figura 3.3.1.2fl. Influencia del gradlefltC en la variad6 dc 1<. % Inicial O.
40 1,5 o -o
MetallOl
(% ndal)
Figtlra
3.3.1.211. InflUenCiO del porcefltflit Inichil de metano1 en la variaClOfl de It. 195
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desoaorizacin de aceites vegetales
excepcin fue el par lanosterol-fucosterol en el que la selectividad toma valores prximos a 1 cuando las condiciones fueron de un 40% de metanol inicial. Los pares crticos estudiados fueron desmosterol-ergosterol y campesterol-13-sitosterol para la obtencin de los valores de resolucin, en el primero de ellos e! valor de a fue bajo en todas las condiciones, en el segundo caso fue el ensanchamiento de los picos lo que llev a esa determinacin. Los gradientes entre 2 y 40/dniin consiguen mayores separaciones entre el escualeno y los esteroles lanosterol y fucosterol.
Posteriormente se procedi al estudio de la influencia de los dos factores cromatogrficos en la resolucin de los pares crticos. Las figuras 3.3.1.2 e y d muestran las ecuaciones obtenidas y sus representaciones grficas.
La resolucin entre el desmosterol y e! ergosterol (figura 3.3. l.2c) disminuye de modo importante a medida que el porcentaje inicial de modificador aumenta y en menor medida cuando dismunuye. Para la mejor separacin de estos compuestos conviene utilizar procentajes iniciales bajos y gradientes de 3
-
8%/mm. La mejor resolucin entre el

-
campesterol y el B-sitosterol se consigue para porcentajes iniciales muy bajos (0
%) y
gradientes bajos; la resolucin con un gradiente del 30/dmin y acetonitrilo inicial al 100% conduce a una resolucin cercana a 1.
Concluyendo: se observa que en el rango estudiado se obtena una mejor resolucin con un bajo porcentaje inicial de metanol y gradientes medios. As pues, se decidi que el gradiente fuera de 3%/mm partiendo de 0% de metanol, de esta forma, tambin se consegua que el escualeno eluyera entre el lanosterol y el fucosterol consiguindose la mejor separacin posible del escualeno con cualquiera de los esteroles estudiados, Respecto a los anlisis de muestras de destilado de a desodorizacin de aceites de oliva o girasol se consigui que escualeno eluyera en primer lugar, sin producirse solapamientos con el estigmasterol, campesterol ni 3-sitosterol (compuestos existentes en el desfilado).
196
O~MkM 3. A~&ws*~ al dWIk* l
talles vegetales
3,%l3jIeccin d~ la temneratura de la La figura 3.3.1.3 muestra los resultadas del clculo de la resolucin de los pares crticos (desmosterol-Ianoserol, lanosterol-fucoserol, fucostcrol-coles-terol, colesterolcampesterol y campesterol-B-sitosterol> dependiendo de la temperatura de la columna. Se observ que la temperatura ms adecuada era la dc 45 0C, ya que la de 55 0C dismunia los tiempos de retencin con apenas variacin de la anchura de Los picos, y la de 35 oc provocaba la aparicin de colas, por lo que haba tambin prdida de resolucin. As pues, la temperatura de la columna durante el anlisis se fij en 45
O(2~
3.3.2- AndIlsis cuantitativo
2ALLIzA1Ihli&I5SIUdI~tieo en el estudio de la resuuesta dcl detector

La figura 3.3.2. la muestra Las reas resultantes obtenidas tras la inyeccin de la solucin
de patrones en la cantidad de 20 pg, siendo las condiciones de presin del detector de 172 kPa y de temperatura entre 20 y 60 del ergosterol entre 20 y 45
0(2, 0(2~
Se observa un descenso marcado de la respuesta
existiendo apenas variacin a partir de esta temperatura y
hasta los 60 0C. La respuesta del colesterol sube un comportamiento semejante, si bien, no de modo tan acusado. La respuesta dcl estigmasterol desciende Ligeramente entre los 20 y 35 0C. aumentando a temperaturas superiores. La respuesta del escualeno vara de modo completamente distinto al resto de componentes de la solucin al producirse un aumento importante entre los 20 y 40 0C, con una menor disminucin a temperaturas mayores. Las bases de estos comportainientos se encuentran, principalmente, en la volatilidad (segn Charlesworth, 978, en la temperatura a la que la presin de vapor es de mm Hg. o bien, el punto de fusin en su defecto) de cada uno de los compuestos, reunidos en la tabla 33 2 1 junto con su conespondicne punto de fusin.
199
ANTERIOR
Ciopizulo 3. AplIcacin al destIlado de la &toflmcMn de acvltn wpahu. Resolucin 3,0 lanosterol-fucoste rol 2.5
-
2.0
1.5 r
-
coles terol-campeste rol Incostcrol-eolestcwl
1,0
0.5
0,0 35
45
55 Temperatura (C)
Figura .iJ.I2. Influencia de le temperatura de la columna.
rea 250
20
30
40
SO
66
lemperatura l evaporador (T> Figura JJJ.la. Isflueoclm de la lemperulura en el d,~eeIat eobn el Un. de i~ paStean.
200
Tabla 3.3.2.1. Puntos de fusin de los componentes de la disolucin. Pto. fusin (0C) 168 148 164 <-20
Ergosterol Colesterol Estigmasterol Escualeno
La disminucin de la respuesta que ocuire en los casos del ergosterol, colesterol y estigmasterol en el rango de temperaturas bajas (25 45 oc para el ergosterol, 20
-
45 oc
para el colesterol, 20
35 oc para el estigmasterol) se debe a la disminucin del tamao

,
de las partculas slidas en el evaporador ya que aumenta la volatilizacin al aumentar la temperatura. A temperaturas superiores (>45 0C para el ergosterol y colesterol,
>
35 0C
para el estigtnasterol) se produce un aumento del tamao de las partculas debido a la dilatacin de stas, siendo entonces ste un factor dominante sobre la volatilizacin y aumentando la cantidad de luz desviada. Este mismo ltimo comportamiento ocurre en el caso del escualeno entre 20 y 40
0c, es decir, el aumento del tamao de las partculas por
la dilatacin que sufren al aumentar la temperatura, por encontrarse en estado lquido a estas temperaturas, ya que la dilatacin que se produce en estado lquido es mucho ms importante que la producida en los estados slidos. Sin embargo, a temperaturas por encima de sta ltima (40 oc) comienza a apreciarse el efecto de la volatilizacin, habiendo un leve descenso de la respuesta al acercarse a temperaturas en el evaporador cada vez mayores. Estos resultados son concordantes con los obtenidos por otros autores y por los obtenidos mediante razonamientos empricos (charlesworth, 1978), basndose las explicaciones dadas en las observaciones de estos otros autores.
Una segunda experiencia, que se dedic al estudio de la presin del nebulizador y a ampliar el rango de temperaturas hasta los 96 oc ofreci los resultados que se muestran en las figuras 3.3.2.1 (b-e). Se observa que las nuevas temperaturas del estudio de 80 y, especialmente, 96
0c consiguen un gran aumento de la volatilizacin de todos los solutos
Capitulo 3, Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales rea 200
150
100
50
o loo
150
200
250
300 Presin (kPa)
Figura 3.3,2.1W Influencia de la presin y temperatura del evaporador en la respuesta del ergosterol
rea
300
250
200
150
100
50
o 100
150
200
250
300
Presin (kPa)
Figura 3.3,2.le. Influencia de la presin y temperatura del evaporador en la respuesta del colesterol
202
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites y rea 250
200
150
1.
100
so
o 100
150
200
250
300 Presin (kPa)
Figura 3.3.2.Id. Influencia de la presin y temperatura del evaporador en la respuesta del estigmasterol.
Area
300 250 200 150 loo 50
-a--.
100
150
200
250
300 Presin (kPa)
Figura 3.3.2.le. Influencia de la presin y temperatura del evaporador en la respuesta del escualeno.
203
Capitulo 3. AplicacIn al destilado de la desodorizac.In de aceites vegetales.
posteriormente a la evaporacin de la fase mvil, produciendo una gran disminucin de la respuesta. En el caso del escualeno, y debido a su mayor volatilidad, la respuesta es extremadamente baja, hacindose casi indetectable a 96 oc (figura 3.3.2. le). El aumento de la presin a temperatura constante conduce a la formacin de partculas de menor tamao, con la consecuente prdida de respuesta. Charlesworth (1978) da explicacin a este ltimo comportamiento: la diminucin del tamao de partcula supone que la relacin superficie/volumen aumenta, adems de que se produce un mayor nmero de partculas, por tanto, la respuesta aumentara. Sin embargo, para panculas muy pequeas es muy importante el efecto de la prdida de luz reflejada y refractada, que son los mecanismos ms importantes en el fenmeno de la dispersin de la luz, surgiendo otros fenmenos (dispersin de Raleigh y dispersin de Mie) que producen luz dispersada de menor intensidad. De este modo, el ergosterol, colesterol y estigmasterol, slidos a temperatura ambiente, presentan dos mnimos y dos mximos en los perfiles de respuesta, el primero de ellos se produce a las menores temperaturas cuando se produce un aumento de la temperatura del evaporador y se debe al efecto de la disminucin del tamao de partcula estando en estado slido, su localizacin varia en funcin del compuesto en cuestin y de la presin utilizada. El segundo nnlino en el perfil de la respuesta se produce a la mayor temperatura del estudio (96 0C), encontrndose la partcula en estado lquido o semislido. El perfil de respuesta del escualeno sita los mininos en las temperaturas extremas (25 y 96 0C) independientemente de la presin de estudio y encontrndose siempre sus partculas del la nebulizacin en estado lquido. La disminucin de la presin conduce a la formacin de particulas de g~~ui tamao con
,
el consiguiente aumento de la respuesta por el favorecimiento de la reflexin y refraccin como fenmenos dominantes en el proceso de dispersin de la luz y producen luz de mayor intensidad, por eso la respuesta mayor se alcanza, a temperatura constante, a la presin de estudio ms baja (103 kPa) para cualquiera de los cuatro compuestos estudiados (figuras 3.3.2. lb-e).
204
Captulo3. Aplicacin al destilado de la desodorlzack5n de aceites vegetal
La variacin de la respuesta con la presin del nebulizador y la temperatura d evaporador del detector de masa pudo ser estudiada mediante las ecuaciones que se hallan en las figuras 3.3.2. 1(f-i) junto a sus representaciones grficas y que fueron obtenidas mediante regresin mltiple.
El comportamiento es similar entre ergosterol, colesterol y estigmasterol. Para estos compuestos la mxima respuesta se alcanza a las menores presiones y temperaturas, disminuyendo rpidamente a partir de los 80 0C, siendo poca la influencia de la presin a partir de esta temperatura. El comportamiento diferente del escualeno qued reflejado en el clculo de su respuesta, ya que la mxima respuesta de escualeno se consigue tambin disminuyendo la presin, pero a temperaturas cercanas a 45 0C, en lugar de 25 0C; la respuesta disminuye rpidamente a partir de 70 0C, con casi nula influencia de la presin.
Las condiciones ptimas del detector fueron 30 oc y presin de 137 kPa. De este modo la respuesta de todos los compuestos pudo ser lo ms alta posible siendo a la vez semejante entre ellas (1,9 1,7). Temperaturas de 25 0C o menores no convinieron para el
-
estudio, ya que, si bien producan altas respuestas, aumentaba mucho el nivel basal de ruido por la dificil eliminacin de la fase mvil en el evaporador.
3.3.2.2- Linealidad de respuesta El estudio de la linealidad de la respuesta en las condiciones del detector no optimizadas (45 oc, 172 kPa) dio lugar a resultados semejantes a los obtenidos por Charlesworth en 1978 en el estudio de compuestos apolares. Se observ la tendencia sigmoidal de la respuesta (figura 3.3.2.2a), existiendo un comportamiento logartmico para cantidades superiores a 50 gg, lineal en un tramo intermedio desde 6 hasta 25 .ig (figura 3.3.2.2b), y exponencial para las cantidades menores en el estudio (figura 3.3.2.2c). Al representar los datos obtenidos sobre un eje doble logartmico se observ que los resultados seguan la tendencia de una recta, concordando con los resultados anteriores de otros investigadores,
205
---
-~
rea

k 1~~
&
ergosterol colesterol estigmasterol
esaialeiio
*
10
20
30
40
50
60
70
80
Canlidad inyectada g) Figura 3.3.2.2a. Linealidad de respuesta. Coadicloues del deleetor 45 C, 172 kPa.
rea
ergosterol escualeflo * colesterol * estgnnsterOl
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Cantidad inyectada
o~tg)
26
Figura 3.3,2.2b. Lluealdad de respuesta. Condiciones del deteeton 45 oc, 172 kpa,
rea 120
100
ergosterol esctwleno * colesterol Vesligmasterol
o
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 Cantidad intectada Qg)
208
Figura s.3,2.2e. unealidad de respuesta. CoudteIt>iieS del detector 45 C, 172 Id?..
>~J>yy<
ji<4j>~i 4- >
it
rp

-
1000,0
100,0 * ergosterol etotialeno 10,0 ~colestetol * estignaSterOl
1,0
0,1 0,5
5,0
50,0 Cau,tidad inyectada Qig>
Ftg~.ra 3.3.2.2<1. Represealaetn dol,te.Iogarftssttca de la ltnealtdsd de respUesta. Coatielises del detector: 45 C, 172 kPs.
rea 1000
ergosterol
eseufi lene U colesIetOL * estigmastetol
20 Cantidad inyectada
25
(ns)
Figura 3.3.2.Ze. llepresentad dohIelogarItflhlC de la tiacaltdad de respuesta. Comsdlctosses del detector: 45 C, 172 kpa,
rea
* ergosterol oscualeno colesterol * estign,asterol
0,1 0,5
1,0
2,5
5,0 6,0 Cantidad inyectada (JLg) de la liaealidatl de respuesta.
Figura 3,3.2.21. RepresCIttfiCtdfl dobte.logarItflhICfi Condiciones del detector: 45 C, 172 lcPa.
209
Capitulo .3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
excepto para las cantidades mayores, hecho que tambin se ha descrito en la bibliogafia sobre triglicridos y otros compuestos de baja polaridad (figuras 3.3.2.2d-D. Al realizar las regresiones, los valores del exponente x fueron de 1,55 para el ergosterol, 1,40 para el escualeno, 1,51 para el colesterol y 1,46 para el estigmasterol, encontrndose todos ellos dentro del intervalo aceptado por otros investigadores.
Los resultados del clculo de la linelidad de respuesta obtenidos tras la optimizacin del detector mejoraron los previamente conseguidos. Las ecuaciones obtenidas fueron las
siguientes:
Ergosterol: Escualeno: Colesterol: Estigmasterol:
logA logA logA logA
0,803 + l,l6dogC; 0,705 + l,l9~]ogC; 0,846 + 1,12logC; 0,504 + 1,25 dogC; r2 r2 r2
0,9834; 0,9917; 0,9894; 0,9946;
donde A C
=
rea, cantidad inyectada en gg.
Los valores hallados para x descendieron en los cuatro casos para hacerse ms cercanos a la unidad, lo que significa que la respuesta se acerca ms hacia una tendencia lineal. Estos resultados tambin posibilitaron la extensin de la respuesta exponencial hasta cantidades de 50 ~g. Las figuras 3.3.2.2(g y h) muestran la representacin grfica de las ecuaciones obtenidas, mostrndose, adems, la adecuacin con los datos experimentales. El lmite de deteccin para cada compuesto se calcul a partir del error estndar de las regresiones obtenidas (EE), siendo el lmite de deteccin la cantidad en ~.ig que proporciona una respuesta tal que logA
=
2EE.
210
CapItulo 3, Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales
Los lmites de deteccin obtenidos fueron los siguientes: ergosterol: 0,26 gg; escualeno: 0,31 Mg; colesterol: 0,22 ~g; estigmasterol: 0,46 gg.
3.3.2.3- Factor de respuesta Los factores de respuesta obtenidos se representan en la figura 3,3.2.3. Si no se consideran los resultados obtenidos para cantidades inyectadas inferiores a 2,5 pg, los factores obtenidos respecto al ergosterol son: 0,88 0,94
0,86
Fescuajeno = Fcoestero
=
Fesiigtiiastero =
212
Factor de respuesta
16 1,4
1
*
+
1,0 0,8
0,6
Al,~ u
0,4
0,2 0,0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Cantidad inyectada (tg) Escualeno
+ Colesterol *
Estigmasterol
Figura 3.3.2.3. Factor de respuesta de los esteroles y el escualena.
213
ANLISIS DE LOS DESTILADOS DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES VEGETALES POR ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DE 3C DE ALTA RESOLUCIN 3.4- MATERIALES Y MTODOS
La preparacin de las muestras y el procedimiento utilizado es el mismo que se detalla para los anlisis de muestras de nata y sus extractos <apartado 2.6 y 2.7). Las muestras analizadas fueron:
-
destilado de la desodorizacin de aceite de oliva, girasol, extracto obtenido a 13 MPa, 40 0C y 70 mm a partir del destilado de aceite de
oliva.
La identificacin de los compuestos se llev a cabo con la ayuda de tablas de desplazamientos qumicos existentes en la bibliografia. La tabla 3.4 contiene los desplazamientos qumicos correspondientes al escualeno (Breitmaier y col., 1975) y 13sitosterol (Wright y col., 1978).
214
Tabla 3.4. Desplazamientos qumicos de escualeno y Il-sitosterol. Escualeno 3-Sitosterol

ti6
8(ppm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 25,7 131,2 124,4 26,7 39,8 134,8 124,4 26,8 39,8 135,0 124,4 28,3 17,7 16,0 16,0
~jO
S(ppm) 37,31 31,57 71,69 42,25 140,76 121,59 31,92 31,92 50,17 36,51 21,11 39,81 42,33 56,79 24,32
8(ppm) 28,26 56,11 11,87 19,40 36,17 18,82 33,95 26,13 45,85 29,18 19,84 19,07 23,09 12,32
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
(~4 2 6
numeracin de los carbonos del escualeno
215
numeracin de los carbonos del 13-sitosterol
Se calcul el porcentaje molar en que se encontraban los compuestos anlizados de modo anlogo al realizado con la grasa lctea.
3.5- RESULTADOS Y DISCUSIN Los espectros de DDO obtenidos mediante 13C-RMIN son los mostrados en las figuras 3.5(a-c), las figuras 3.5(d-f) muestran los espectros de DDG. A continuacin, en la tabla 3.5a se detallan los desplazamientos qumicos asignados a sus correspondientes carbonos, as como sus integrales para cada seal y en las muestras analizadas.
Tabla 3.5a. Desplazamientos qumicos, grupos funcionales asignados e integrales
correspondientes tras el anlisis por 3C-RMN de los DD de aceites de oliva y girasol. rea DDO DDG
5 (ppni)
180,27 135,07 134,86
Carbono
Control
Extracto
-COOH1 CO (Es)2 C6 (Es)
11,62 2,6 2,6
15,7 3,2 3,2
15,7
-
216
<enfrIo
A$ca*M al &stthz& eh a <hna&rtMCMfl eh caltes wpfttles
tabla 3.Sa (continuacin)
rea
DDO
Carbono
DDG
Control 2,9 1,5 15,0 3.5 1,5 1.5 3,3 6,5 0,3 5,7 5,5 15,4 2,7 19,9
Extracto 3 1,9 16,8 4,9 .9 1,9 5,0 10,1 .6 10,7 21,9 20,6 4.0 166,8 5,6 32,4 4.8 4,8 7.6 3.0 16,9 21,7 4.3
4
131,19 130,19 130,01 129,71 128,07 127,91 24,43 24,32 + 24,29 60,16 39,73 34,10 31,90 3 .52 29,7628,83 28.26 27,21 27, 15 26,77 26,66 25,65 24,96 24,68 22,67 7,64 6,01
C2(Es> CIJ(L) C9(O,L) CO(O) CIO(L) (712(L) (73 (Es> (77, CII
(Es)
10,6 15,9 8,1 9,0 11,2 0.8
n.a. (72
C5,C9(Es)
26,2 19,5 19,0 57,5
w3 (L)
(712 (Es) CH 2-.CH~

CIA
3,3 23,8
2.5
33,3
(78 (Es> (74 (Es) CI(Es)+ Cli. (1) 03(L)

03
2,5 5.18 2,6 121,0 5,8 2,4 2,7
3,9
1
>26,6 36.8 04 217
(713 (Es) (714 (Es)
(#nk. 3. A$icat al
Sn eh
th aceites vegetales
tabla 3.5a (continuacin) rea DDO

Control Extracto
DDG 4,! 21,5 0,4 27,2
5,97 4.07
(715 (Es) col
2,7 15,2 compuesto
Los carbonos no wgn.ados a wng~sn libres de La muestra. jis aa escualeno, no asignado
defitudo se refieren al total dc cidos grasos 1
Los componentes principales, tanto del DIJO. DDG, como del extracto analizado fueron los cidos grasos libres, de este modo se comprob que estos compuestos son tambin extrados por el dxdo de carbono supereritico. Los cidos grasos mayoritarios fueron os insaturados. oleico en el D[)O, y linoleico y oleico respectivamente en el DDG. Los cidos grasos saturados se encontraron en menor proporcin. No se detect la presencia de cidos grasos de cadena corta, que s aparecen como consecuencia de tratamientos de calentamientos severos, como las frituras (CalI Hellin y ClauseIl. 1985). Estos resultados indcaron que la composicin en cidas grasos de los destilados es muy semejante a la del aceite virgen, aunque en los primeros se encuentran libres. No se detect la existencia de trglcridos, tampoco de otros lpidos saponificables como son los steres metilicos y etlicos de os cidos grasos, tan abundantes en otros estudias realizados por otros investigadores (24,1%; Bondioli y col.. 1993). La fraccin insaponificable del DIJO y su extracto estuvo compuesta en su gran mayora por escualeno. y no se detect la presencia dc ningn otro compuesto. La proporcin de escunieno encontrada en el DIJO fue muy superior a la del DLX), donde nicamente pudo cauntificarse la cantidad de escualeno partiendo de aquellos carbonos con tiempo de relajacin ms corto (carbonos metiuicos); sin embargo. ste pudo detectarse gracias a la apreciacin dc seales menores no cuantificables. Asimismo, pudo ser detectada la 218
(tvla
1 tp&eflM it
eh te
eh OC#tU vegetales
o
CV
o
104
o
ti>
O di 4-
di
o
cd 4>
o
ci o o,
-l
y o
di
di
4
o o
o
cd t3 ti
ti
o
o <oj
-
di
04
u,
it
o
ti>
1>
219
~ft,k 3 Ap&stM cl &riM ib te
lles vegetales
o
oa
4>
~
nl
o o
PC
o
4>
o
4> -o n
y-)
Kg
r
<fl
h
1-
L
a o-
y Y
:0
~.00
CV
ci
cd
4>
y1>
o
4>
o o
y-)
CV
Cfl
220
(epMwJo 3 A$Wds~i al rna ib te <h
dc atedies vegetales
1~
e
ti> e> cd
~.rn
e o o, di e
cd o
04>
e .2 u
4>
--e o e
cd u, 2> o
-u e o
CV
a ow
u u 04 --e
4-,
cd
221
y> y
(.~wUWo3 Ap&~wMn al &sttn dc a &arkrflsS>i <h aceitas vegetales
o
F
~1~
ti> e
e
u,
u, o
u,
o
PC
e> U c
CV
o a.>
SE
L
fi
o
te-)
en
ki
en
cd
ho
CV
e o o
-e
cd e> di di
o SE
~
fi
a>
VN
F .1
l4.~
1
en
222
Captado 3. Ap&tacin al uilab eh a
eh aceites vegetales
presencia de compuestos esterlicos en el DIJO, lo que no ocurri en cl DDO. La baja intensidad de las seales de stos compuestos junto con [a similitud dc sus 8 (Wright y col. 978) no permiti distinguir entre la existencia de 13-sitosterol, estigmasteral, cainpesterol u otro esterol. La composicin dcl DIJO y su extracto fue bastante similar. Seguidamente. la tabla 35b recoge los resultados obtenidos para a cuantificacin de los componentes de los destilados: Tabla 3.Sb. Composicin de los liD de aceites de diva y girasol DDO Control Escualeno lnsaturado/saturado2 OIeicolllnoIeco
(%mol> ados grasos libres (maL/meO
DDG 16,02 3,06 7,84 1,45 1,58 0,71
Extra cta
(CI5xl0~ I~C5+w) (di cn;i (@o<o} ~ k (710(L))
15,08 3,61 9,00
El hecho de utilizar los carbonos metilicos y metilnicos para cuantificar los compuestos de las muestras se debe a que poseen tiempos de relajacin menores, con lo cual, los resultados obtenidos en las integraciones son los ms prximos a Los valores reales. Esto se observa claramente si sc comparan las integrales obtenidas para Los carbonos col y los carboxilicos. los segundos poseen integrales menores debido a unas relajaciones incompletas. El uso de los carbonos oleihicos es el ms conveniente para el clculo de la relacin moLar entre cidos oleico y lanoleico, por existir por sopando seales caracterlsttcas de cada uno de ellos Los tiempos de rtlajacLn no influyen en cl clculo al tratarse de seflales muy prximas
223
CapItulo 3. A$tanin it nhlmM eh te &wehrscMa eh aceites vegetales
Los resultados obtenidos tras los anlisis del DDO y su extracto son muy similares, con lo que se podia concluir que en esas condiciones la selectividad en la extraccin era baja y los compuestos se encuentran en las mismas proporciones antes y despus de la extraccin supcrcdtica. No se pudieron establecer comparaciones entre la composicin de los destilados y los aceites virgenes de os que procedieron al no diponer de ellos En cuanto a los datos encontrados en a biblliografla acerca de la composicin de los aceites virgenes de oliva y girasol (Gunstone y col., 1986) se vio que existia una gran variabilidad; sin embargo, se pudo concluir que la composicin de los destilados estaba dentro de los rangos de composicin de los aceites vrgenes en lo referido nicamente a la composicin en cidos grasos y con la diferencia de que en los destilados se encuentran en forma carboxillica libre y en los aceites se encuentran esterificados al glicerol constituyendo los tnglicrmdos. Si consideramos que los cidos grasos libres del DIJO son oleico y palmtico (los mayoritarios) obtenemos que el escualeno se encuentra en una concentracin de 208 g/Kg. Esta concentracin es sensiblemente mayor a la encontrada en el aceite virgen
1~11 1111
(alrededorde 1,5 mg/Kg. Fedeli, 1977).

13 >1
14
14
224
VV
:.W$JMI1%
jlUl5JIJIflhlI
Capwh 3. Apiktctbi it ehufle> eh a &sodw*twt&w ch aceites vegetales
APLICACIN DE
LA
EXTRACCIN
CON
CO2
SUPERCRITICO
AL
DESTILADO DE LA DESODORIZACIN DE ACErrES VEGETALES 3.6- MATERIALES Y MTODoS 3.6. 1- PeserIpddn del equipo extractor Las extracciones con fluidos supererticos se llevaron a cabo con un extractor Hewletty
Packard modelo 7680A equipado con un restrietor variable que permite el control independiente del flujo y la presin, y adems produce una despresarizacin instantnea del fluido supererhhco a su salida La muestra se deposita en una celda cilndrica de acero inoxidable de 7 mL de volumen, para la recogida del extracto el equipo est provisto de una trampa slida intercambiable, donde se produce la calda de presin mencionada, que se aya posteriormente con un disolvente orgnico para la recuperacin del extracto retenido El control del sistema se realiza automticamente a travs de un programa informtico especifico suministrado con el equipo, con un ordenador Hewlett-Packard modelo Vectra QSI]65. El fluido superertico usado fue dixido de carbono de calidad analtica. Existe tambin un sistema criognico mediante dijudo de carbono para enfriar la bomba, celda de extraccin, restrictor y trampa, y que no necesariamente ha de ser de calidad tan alta como el superertico. La figura 3>6.1 muestra un esquema del funcionamiento del equipo.
1-1 -
y-
ti
y-:
3. & 2-
Opilmlzadn en la preparacin de la muestra
-4<
44
<11
La celda se prepar para la extraccin introduciendo el destilado, habiendo taponado previamente la entrada y salida de la celda con lana de vidrio. Con este mtodo se producan contaminaciones en la lineas del extractor, ya que la muestra es lquida y sale por la parte infenor de la celda, contaminando las extracciones posteriores. Por ello, se decidi utilizar arena de mar lavada (Panreac) en una cantidad dc 5 g para servir de
225
f~.v;r;.Tr.::nr?<~
t~1~i!Iq~,
4 Tfl~
WUMS
Cwltuto 3. Ap&oclon it dnttIsM de o
n de nifes wgetain
soporte del destilado. Tan-lo la arena como la lana de vidrio no se extraan ni retenan los compuestos de la muestra. La cantidad de muestra indrodtjcida dependi de dos factores: a) que el extracto se obtuviera en la mayor cantidad posible y b} que la arena no quedara saturada de muestra y sta pasan hacia los conductos del extractor. Las muestras fueron destilados de la desodorizac&n de aceites de ojiva y girasol.
3.4.3- Efecto de la presin y la tempEratura en la escrracdn del desfilado de la

desodorizacln de aceites vegetales Se estudi la cantidad de destilado extrado en funcin de la temperatura y la presin aplicadas en la celda, En los diferentes mtodos utilizados se consideraron los valores de las siguientes variables: flujo del fluido supercritico: 1 y 3 mL/mm, tiempo de extraccin: 20 y 30 mm, fraccionamientos: hasta los 70 ruin con frecuencias de 2, 5 y 10 mm, temperatura dc la celda de extraccin: 40, 50 y 60 0C, presin: lO; 13; 5, 17,5; 20; 22,5; 25 y 30 MPa. disolvente de lavado: cloroformo:metanol (2:1), trampa para recoger los extractos: de botas de acero inoxidable (Hewlett-
Packard). 1 En los pnmeros ensayos realizados, el extracto fue depositado sobre la superficie de las bolas de acero de la trampa, que se lav con la mezcla de disolventes mencionada tras completar la extaccin.. recogindose las disoluciones en viales de 1 mL. El nmero de viales utilizado fue de 6 para asegurar la completa disolucin del extracto y averiguar a la vez el nmero mnimo de viales necesarios, que se encontr ser de 2. La cantidad de extracto se obtuvo por pesada tras la evaporacin del disolvente en una corriente de N~. 2.27
Capitulo 3. Apflczrtn si thullab de la ch
di aaJW w~moIe.t
En todos los casos se mantuvo la trampa a 20 *~C y el restnctor a 45 0C durante la extraccin, elevndose la temperatura de la trampa a 45 ~Cdurante el lavado de la misma con disolvente. Los fraccionamientos se realizaron manteniendo presin y temperatura de la celda constantes. Finalizado el tiempo de extraccin de cada fraccin se acomodaban las condiciones de lavado, recogindose los vinies con la disolucin, y posteriormente se continuaba con un nuevo paso extractivo dcl fraccionamiento Asimismo, se colocaron frascos con la mezcla cloroformo:metanol (2:1) a la salida haciendo burbujear el CO 2 gaseoso que saJe del extractor con el fin de retener los restos
de extracto arrastrado por el gas. Los extractos obtenidas se analizaron por cromatografla Lquida de alta eficacia (segn los apartados 32 y 33).
3.4.4- Modificacin del equipo de atraccin Las modificaciones realizadas en el extractor se encaminaron a obtener todo el extracto producido, para que no existieran prdidas, y. a la vez, a mejorar la repetibilidad de las extracciones
4?
228
>7,4
Capnilo 3. Ap&a*h. al suM de la
Ib> de tnfln wqjuloln
3.5- RESULTADOS Y DISCUSIN 3.5. 1- Optimlzacin en la preparacin de la nwestra Se comprob que una cantidad superior a 400 mg de muestra produca una saturacin de la arena, pasando el destilado al interior de las lneas del equipo, contaminndolo. Dado que la cantidad de arena utilizada era a mxima admisible debido a la capacidad de la celda de extraccin, se tomo la cantidad dc 400 mg como la mayor posible para la obtencin de extractos sin producirse contaminacin ni prdidas hacia el interior del equipo. Sin embargo, tal como se comprob posteriormente, la trampa de bolas de acero no permita la retencin de altas cantidades de extracto, por lo que hubo que reducir ]a cantidad de muestra a la mxima permitida por La trampa, que fue dc 80 mg. Esta reduccin dificuit La obtencin de mayores extractos. La modificacin llevada a cabo en el equipo extractor (apanado 3.7.2) permiti nuevamente el uso de cantidades de muestra de 400 mg
1
3. 7.2- Modificacin del equipo atractor La figura 3 72a representa el esquema del extractor una .ez modificado. La modificacin consisti en burbujear el CO2 gaseoso en un frasco que contena la mezcla cloroormo:mctanol (2.1> empleada (200 mL) pan impedir que se perdiera extracto por arrastramiento de molculas de salmo por el gas tras la despresurizacin El realizar la modificacin fue necesario tras descubrir que se producan prdidas de la muestra extrada
II
2.29
(~MwIa J. Ap&sdu al deslate de a
de
anita ~qetnM.r
(>1ra modificacin necesaria fue la de obviar a salida del extracto disuelto procedente de la trampa hacia los viales. En su lugar, se procedi a conducirlo al frasca de burbujeo. La cantidad de extracto se obtuvo por pesada tras la evaporacin del disolvente a presin reducida. Los primeros resultados obtenidos se ilustran en la figuras 372b. Estos resultados se obtuvieron previamente a la modificacin del equipo y con una cantidad de muestra de 4(X) mg Se observ que fraccionamientos realizados con frecuencias de 5 ruin a 40 0C con diferentes presiones conducan a resultados en la extraccin total dificilmente explicables, ya que a Las presiones ms bajas (13 MPa) se obten a mayor cantidad de
y-,
4
Y y-Y .4
extracto que a las mayores presiones y as sucesivamente. Del mismo modo, se observ que el mximo en la extraccin se alcanzaba antes en el tiempo para presiones mayores (25 MPa), pero el rendimiento era siempre menor a que bajas presiones. Tras alcanzarse el mxmo de extraccin se produca una extraccin nula de destilado en las siguientes fracciones. La figura 372c muestra la variacin en la cantidad extrada en los fraccionamientos dependiendo de la duracin de cada paso en Las condiciones de 13 MPa y 40 0C. Los fraccionamientos realizados con frecuencias de 5 ruin condujeron a la abtencin de mayores cantidades de extracto, mientras que la cantidad de extracto disminuy conforme aumentaba la duracin de cada paso, siendo menor con fracciones de 10 ruin. Las extra4cones llevadas a cabo en un solo paso con una duracin de 70 mm produjeron extractos mmnLmos La imposibilidad de la explicacin <le los resultados obtenidos se resolvi cuando se comprob que la cantidad de extracto restante se eliminaba por arrastramiento del CO~ gas tras la despresurizacin. La colocacin de frascos con disolvente en la salida del gas para la extraccin de 70 mm en un solo paso permiti confirmar esta hiptesis ya que las cantidades perdidas se recuperaron y llegaron a igualar a las cantidades extradas en los fraccionamientos dc 5 mm (tambin indicado en la figura 3 7 2cy Este hecho sc debe a que la trampa dc bolas de acero es incapaz de retener todo el extracto, llegada una cantidad. sta queda saturada y el resto de extracto se pierde junto 231
y--
si
es y
y-
1~
Capit> 3 4&otiw al suk de a de
de asilar t<qsloles
al CO2 gaseoso El fraccionanuento en tiempos cortos permite que la trampa no se sature y que se recupere para el siguiente paso tras el lavado con el disolvente. Esta es la razn por la que los resultados ms satisfactorios se alcanzaron para tiempos de fracciones de 5 mm, seguidos de lO mm y por ltimo dc 70 miii (figura 3.7k). Al elevar la presin del tratamiento se produce una ms rpida extraccin por lo que los efectos comentados anenonnente sc hacen ms patentes y provocan que el tiempo necesario de cada paso en un fraccionamiento se reduzca hasta 2 mm. Las figuras 3 72d para los tratamientos a 40 ~Cy 352e para los tratamientos a 60 ~C muestran que, independientemente de la presin del tratamiento, los resultados en el rendimiento de la extraccin son buenos y totalmente explicables si los pasos del fraccionamiento tienen una duracin de 2 mitin. Las condiciones de mayor extraccin se alcanzan a 30 MPa y 40 ~C,siendo ya total la extraccin a los 20 fin de tratamiento. A medida que disminuye la presin de estudio a temperatura y tiempo constante disminuye el rendimiento obtenido, existiendo una gran diferencia entre los resudados obtenidos a 25 y 22.5 Mpa. hecho explicable por el descenso de densidad que se produce. A la 0C los rendimientos obtenidos son menores que a 40 0C girando en temperatura de <> tomo al 4O9~., y las diferencias debidas a la presin utilizada son menos patentes. Las diferencias entre obtenidas entre Las extracciones a 40 0C y a 60 ~C se deben a que el proceso determinante en la extraccin es el debido a La densidad y el aumento de la solubilidad de los compuestos a extraer, tanto a altas, medias o bajas presiones, y en lo que se refiere nicamente a la cantidad de extracto. Al comparar el rendimiento de la extraccin lubindose reahzado el fraccionamiento o no, y antes de la modificacin del equipo de extraccin (figura 3 7 20. se observa claramente que las mayores diferencias se producen entre las extracciones a 40 ~C y a presiones sucesivamente mayores ya que stas se producen m 4s rpidamente, con lo que la trampa se satura antes y la cantidad de
extracto no retemdo en la trampa es mayor La tapacidad de la trampa para retener el extracto y a consecuente necesidad de
baja
realizar fracconamtenuvs cm pasos muy cortos condujo a que los mtodos utilizados no 233
C~,UUU 3. 4&ctri e/
de te
ido de aceites vege
fueran factibles y Fue necesana La modmficacian del equipo de atraccin. Las figuras 37 2g y h muestran los resultados obtenidos para los tratamientos de extraccin del destilado de la desodorizacin del aceite de oliva y girasol respectivamente, utilizando el acoplamiento del frasco de burbujeo. Estos datos quedan tambin reflejados en las tablas 37.2a y b Tabla 3.7,2a. Extractos obtenidos a partir del destilado de la
desodorizacin de aceite de ojiva (mg) en las condiciones indicadas.
lo 15 20 25
30
25,3
155,0
5,9 116,1 221,7

345.4
3,8 5,7
230.4 355,4
237,9
326.8 377,2
362<?86
Tabla 3.7.2b. Extractos obtenidos
partir del
destilado de
la
desodorizacin de aceite de girasol (mg) en las condiciones indicadas. Presl6n (Mf.) 40 W 50 oc lO 15 20 25 30 25,7 113.2 226,5 261.2 10,1 93,4 165,5 264.6 60W 10,9 61,8 152.4 284,1 345,9
273 334l~0
A presiones dc 10, 15 y 20 MPa el mximo mudmuento de la extraccin se produce a 40 T, seguido de 50 y 60 C debido a que la deirndad dcl fluido es el (etor dominante en la extraccin. A la presin de 25 MP. sc produce un equshbno entre La densidad del fluido y el efecto de la volatilidad del utstrato, existiendo un rendimiento semejante a las 236
CepJfidoJ A
al &smbb & le
de melles vegetales
tres temperaturas de estudio, esto mismo se produce entre 50 y 60 ~C & 20 MPa. El cambio de densidad provocado por I~ compresibilidad del fluido es poco notable entre 25 y 30 MPa. sin embargo, es marcado el efecto del aumento dc la presin de vapor por aumento de la temperatura; esto conduce que el mayor rendimiento se alcance a 60 0C, seguido de 50 y 40 C respeccivarnese, y de modo ms evidente en el caso de las
expenencias realizadas con destilado de la desodonzacion de aceite de girasol.
3.7.3. Sfeco de la presin y la temperatura en la extraccin de os compuestos de la fraccin nsaponlflcabfr del destilado de la desodorizacin de aceites vegetales los compLiestos insaponificables hallados en el destiLado dcl aceite de oliva fi.eron escualeno, f3sitostero.l, campesterol y esngmasterol, se detectaron otros compuestos minoritarios, pero sin llegar a identificarlos (posiblemente A-avenasterol o A?estigmasienoIY Estos mismos compuestos fbercn los existentes en los destilados de aceite de girasol y sus extractos, habiendo ms cantidad de esteroles y menos escualeno respecto a las muestras de clin (tabla 3 7.3a). No se detect la presencia de &-caroteno m de cx-tocoferol en ninguna de las muestras analizadas tras 1-a inyeccin de patrones. Las figuras 3.73a y b muestran los cromatogramas de ODO y DDG respectivamente. Tabla 3.73., Composicin & la fraccin insaponficable del destilado de la desodozac,n de aceites de clin y girasol DDO<%) E,seu-aeno Campesterol FMlgrnasterol IL<Sltonerol
~tetdcMnct~de
DDG<%1 26,5 1 22.56 23,81 27,05
40,96 29,19 mi d. 29J5
237
C&pMt 3. A-p&a#n al desUde fr-U
de aceites vegetales
1 1
1>
10
tiempo <an)
20
flgesn Y7J8. Cninwgrama por HPLC de los compuestos osepoalflca bies del desitied. de la dnodorlzacl6n de aceite de olive,
4.>
si)
lo
20
25
tiempo (mii)
u 3k CNmatograma por HPLC de la fraccl4o lmuapnUkahle tal dwttlede de la desedorliacln de aceite de

girasol-.
nra
238
csirt~
J Apfinra al
-
t ~j4)j
* aceito vegetales
El escualeno es el componente mayontao en la fraccin inupouiftcablc de ambos sustrastos, si bien

,
el DDO posee la mayor cantidad. El segundo componente en
procentaje es el 8-sitosterol> FI campesacrol es el esterol que se encontr en menores proporciones en el DOC, sin embargo, no se detectaron cantidades cuantificables de estigmasterol en el 000 Las tablas 37.3<Lg) muestran las eantuiades extradas, expresadas en mg en cada extracto, de los compuestos ansapowflcosabks identificados para cada una de las condiciones estudiadas y con 000 y DOC corno sustrato. Los anlw-s realizados a los extractos obtenidos a partir dc DOC no detectaron estigmasterol en cantidades cuantficables. excepto en las condiciones de 30 MPs y 50 C. Independientemente de la temperatura, a la presin de lo MPs slo se detect la presencia de escualeno, a 15 MPa se extrajeron 1,14 mg de B~siiostero a 40 C y el campesterol comenz a ser cuantficable a partir de las extracciones a 20 MPs y SC) C. Las cantidades extradas de escualeno, campesterol y B-si-tostcrol amnentaron al aumentar La presin de la extraccin, siendo siempre mayoritaria la cantidad extrada de escualeno, seguida de B-sitosterol y campesterol Los extractos obtenidos a partir del DLX) tambion contuvieron escualeno como componente mayontano, seguido dc &siostcrol. estiginasterol y escuaieno. Sin embargo. la cantidad de esteroles extrada lite superior a la del 000. El campesterol se extrajo cuantitativamente a partir de 2.5 MPs a las tres temperaturas. El estigmasterol y el tt-stosterol no se detectaron en los extractos obtenidos a 10 MPs y SO y 6<0 <~C. Las figuras 3.7.3c <DLX)) y d (DOC) representan la extraccin de escualeno y de esteroles totales en ftn~n de la densidad dcl C0~ y la temperatura dc los tratamientos.
Se observa que ni te mm mayor extraccin dc escualeno respecto -a los esteroles a densidades inferiores a 0,70 g/snL, sobre todo en el caso del ODO, presentando la extraccin de esualeno pocas variaciones en todo el rango dc densidades (entre 1 y 3
mg. tanto para los extractos de DLX) como dc DlXs) tos esteroles son pobremente eximidos a den
afcrnns a 0,70 MiL un embargo. a densidades superiores
239
CapItulo 3 Ap&nCtAn al &MUa&> eh La de
eh aceites vegetales
Tabla 3.7.3b. Composicin (mg> de la fraccin iusaponiflcable de los extractos de DDO obtenidos a 40 ~C. Presin (MP.) escualeno campesterol estigmaiterol 0-altosterol 0 15 20 25 30 1,91 2,33 2,38 2,41 2,48
-
1,14 1,21 1,47 180
1,43 1,79
Tabla 3.7,Jc. Composicin (mg> de la fraccin insapomfcable de los extractos de ODO obtenidos a 50 0C. Presin (NiPa) escualeno cmnipesterol eutlpmasterol 0sltosterol lO 15 20 .12 2,38 2.67
-
1,59
1,45
25
30
2.56
2,61
1,65
1,73
1,66
1,80
1,42
Tabla 3.7.3d. Composicin (mt> de La fraccin insaponficable de los extractos de DDO obtenidos a 60 C. Ji4xtI,sscualent~E0Q!tOr9J lO 1.32
-
estlgmasterol 13-altosterol
-
15 20
25 30
2,48 2,41
2,51
1,20
1,71
fi,
1,7? 1,6-4
2,49
1,67
Capttrlo .1 A#kac$n al kutibuM eh u eksu&rfrncSv de aceiles vegetales
Tabla 3.7.3e. Composicin (mg) de La fraccin nsaponiflcable de los extractos de DDG

obtenidos a 40 C. Presin MPs lO 15 20 25 30 escualeno tun 1,54 2,09 2,86 2,38 2.58
-
feral uit . asterol f3sit**terol 1,14 1,43 1.36 1,24 153 1,04 1.39 1,86 1,90 2,05
1,87
Tabla 3.7.Jf. Composicin <mg) de la fraccin insaponificable de los extractos de DDG
obtenidos a 50 W.
Pres~4~!IMYa) escusleno lO 15 20 25 30 1.12 1.98 2,19 2,21 2,61 eaj~pesterolest1~gnusterol 0-sitosterol -
1,35 1,45 1,60 l,7E
1,29 1.58 1,91 2,59
1,34 1,76
Tabla 3.7.Jg. Composicin (nsj) de la fraccin Insaponirscable de los extractas de DDG
obtenidos a 60 %.
Presin(MPBI_eseusleno eam,pesterol estIgmas 0 15 20 25
__
13-sltosterol
-
1,10 1,57 2,66 2,79 2,44
1,37
1,35 1,611 2,07
1,18
1,59 2,30 2,45
1,20 1,37
30
Cap&do 3. A$arMn al tu~bt eh a k
1 aceItes vegetales
experimentan un rpido aumento en sm cantidades extradas, elevndose la cantidad de esteroles totales obtenida por encima de la de escualeno.
La temperatura acta de modo decisivo en la extraccin de los componentes de la

fraccin insaponificabie (figuras 3>7>3< y d}. Se observa que el aumento de la temperatura
a densidad constante aumenta las cantidades extradas de escualeno y, ms claramente, de

esteroles. El aumento de la temperatura se observa principaltuente sobre la extraccin de los esteroles, ya que estos compuestos son menos solubles que el escualeno en el CO2 supercritico y el aumento de la volatilidad se constituye como factor primero en la extaccin Este claro aumento de La extaccin de esteroles se produce a densidades de 9C, 0.79 WmL a $0 0C y 0,89 ViriL a 40 ~C. La extraccin de esteroles en 0,74 g/mL a 60 las condiciones de ms bajas densidades tambin viene dada por las cantidades relativas de stos en lo destilados originales, de ene nodo, hay una mayor extraccin de esteroles en las muestras de DIX1 debido a que se presentan en mayores cantidades y de escualeno en cl [390. Tambin se observa el efecto de la temp~eranra del tratamiento en la extraccin del escualeno, producindose mximos dc extraccin, para cada temperatura, en densidades semejantes a las de los esteroles, pero de modo menos marcado. La selectividad de La extaccin del escualeno respecto al total de esteroles puede definrse. de modo anlogo al dcl colesterol respecto a los tnglicridos (apanado
COrno
2.5.7),
re*-rwn ~awk,w 1 esaen>in en el exrcpelo

rOa cm erm*no ehiero& s en origen
Los resuludos de La scfrenvuhsd quedan reflejadas en las figuras 3.7.3< para el ODO y
3 7 31 para cl Dlxi La mayor scltctwtdtid St ikatua para las extracciones donde no ha habido extraccin dc esteroles, redsenlastaMas37.iayb)
>
los valores hueme w&uio, sm embargo, las
cannilade de escualeno eaaido son muy
(los rendimientos en la extraccin estn
5ScproduccotromzimoenIasckctiMada2OMPay 244
CtpftWo 2. Ap&rUn al desnUde de ka
de ches vegetales
las temperaturas dc 40 y 60 C para La extraccin dc escualeno a partir de DDG, alcanzndose el valor de

2.5,
que. sin embargo, es inferior al alcanzado en estas mismas 1.5 en cualquiera dc las tres
condiciones partiendo de 300 (alrededor dc 3>. A presiones mayores de 20 MPa, la selectividad dismtnuye, llegando a valores dc 3 temperaturas y sustrastos, excepto a 25 y 30 MPa y 40 C con DIX), que se mantiene superior <cercana a 2), debido a La menor extraccin dc esteroles en estas condiciones. Se puede concluir que las condiciones de mayor selectividad se alcanzan a las menores presiones y mayores temperaturas de estudio, pero se desaconseja el tratamiento por obtenerse un bajo rendimiento de extracto. Las condiciones ms fav&ables son Las que se producen al tratar DDO a una presin de 20 MPa y 40 C. S se parte de DOC con las mismas condiciones de tratamiento, la selectividad conseguida disminuye en 0,5 unidades. Una gran parte de los componentes de los destilados de la desodorizacin de los aceites de oliva y girasol son cidos grasos libres, y stos tambin se extraen cuando se someten a un tratamiento con CO2 supereritico, tal como se vio en los anlisis realizados por RMN (apartado 35). Se calcularon las cantidades relativas de compuestos insaponificables (escualeno ~ esteroles) que se encontraban en los extractos por diferencia a partir de las masas de extracto obtenidas gravun~tricamente. Los resultados quedan expresados en las figuras 3 73gparaelDDOy3 73h parad DDG. Se aprecta que a lo MPa y. en mucha menor medida, a 15 MPa los extractos se hayan enriquecidos en material msaponifick, aunque la cantidad extrada es demasiado baja.
A presiones mayores, no parece haber vanacin en las respecto a la de aculas grasas hbret Las condiciones dc 60
favorables en Las reduccin de la extxtccin dc los cidas
bajas cantidades extradas

0C y 1<) NiPa fueron las ms del DDO, seguido de la
extraccin a 50 y 40 N- por cte arden La explicacin puede ser la baja volatilidad de los cidos grasos Ubres frese a las esteroles y, sobre todo, al escuaLeno. que es el compuesto niapniftcabk que sc encuentra en ms cantidad en los destilados. La menor cantidad en que se encuentra el escuakno en el DLX) frente al DDO puede ser la causa de que la 245
(op#nk 3 A~tat*u nf kaiah it a
de
netites vegetales
fraccin insaponificable se encuentre en menor proporcin en los extractos, aunque tambin se ha de tener en cuenta que el DOC tiene ms cantidad de cidos grasos insaturados que el DDO y que stos son ms fcilmente extrafbles por el CO2 supercritico> Las extracciones a que se somete el DDG proporcionan extractos menos ricos en compuestos insaponiflcabies que el DDO y Las diferencias conseguidas a las mayores temperaturas son menos evidentes. A partir de 20 MPa y para todas las temperaturas y sustratos del estudio se mantiene la relacin entre compuestos sapomficables/nsaponificablet, habiendo una composicin semejante a la de las muestras en su origen>
246
Capitulo 4. Aplicacin del dixido de carbono supercritlco a la inactivacin depectinenerasa en zumo de naranja.
Caplinio 4 ApUawMtnpmekbwrIMn&u hUpa
4 aso de naranja
4.1- INTRODUCCIN. LOS CTRICOS Los frutos citncos representan una de las producciones ms relcnntes de la agricultura espaola y la ms importante de la provincias de Mwtia y Valencia. Predominan las variedades para el consumo en fresco, pero tambin tienen nnpoctancta las que pueden destnarse a las industrias para su trat4bnnactn en zwnos.
4.1.!- Composidn de law cftran Los frutos ctricos. por su alto contenido en vitaminas y componentes minerales, constituyen, dentro de la alimentacin humana, un producto de apreciado valor nutritivo. Entre dichas frutas, las naranjas son las ms aceptadas. esto se debe flrndarneatalmcnte al sabor agradable debido a La relacin azcar/cido, caractertstica de ellas y a sta notable valor alimenticio (KdTord, 1973) Las partes fundamentales de Los fi-tatas cnicos son epicarpio o flaveda, mesocarpio o albedo y endocarpio o pulpa (figura 4 1 1. El flavedo es la capa ms externa del fruta En eRa se encuentran los piastidios y numerosos vesculas de aceite esencial. Los caroteno,ximtofila y. en menor candad. El albedo es una capa blanca y ~enq
>
contienen clorofila en los frutos no maduros, y

> >
cuando el fruta ha madurada
compuesta por clulas de forma ytamafio
rmgular, con grandes esp~ws iutercelulurn Denos de aire. La wmposicn del albedo es la 7~5 80% Materia seca 20-25% 248
Cq~tYM 4
Apfieatn pan a eflimcMn it Ja

-
Mamo de naranja.
Azcares Glucosa Fructosa Sacaron Celulosa Sustancias pcticas
44% 63.3% 20,5% 16%

33%
20%.
Los ctncos son, a continuacin de tas manzanas, b segunda fuente ms importante de pectinas pitia La mdustna. Otros componentes dcl albedo son Los glucsidos hesperidina y lmonina~ este ltimo importante por el problema & su intenso sabor amargo en la aceptacin de los productos derivados de los citricos. Debajo de las capas que consatuyen el fiando y albedo est el endocarpio o pulpo, formado por una serie de segmentos. Cada segmento contiene una masa compacto de vesculas con junio La pulpa es la principal pete comestible dcl fruto y gencrahuente alcanza el 50- 80% del peso del fruto entero <Keftord. 1973> Los slidos disueltos en los ctricos estn compuestos principalmente por azcares y es dentro de los slidos
zumos
acdos fin Las naranjas son los azcares Las
disueltos Los acdos presentes en e] nana de naranja son el ctax que predomina, y el nialico laminen hay pectinas solubles que al expmir la fruta quedan, en pone, incorporadas al zumo Entre Las enrunas cxtuentes cabe destacar la pectiuesterasa. cuya actividad es mayor en el endocarpio que en el albedo. Por itmo, dentro del fruto estn kas protenas y dc aceite ni las que cabe
un alto porcentaje de
249
C#nU 4 A$wtrtM pta a tnrtnwtttn eh a pn
4 tuteo de naranja
epicarpio me 4kiflrpt
anzkn~arpic
~cai lite segnento

mest-r&ftfi entre eegfltitoa
vn.cula conteniendo
zumo
pared celular cal ul a
WZICULA
pared celular
orgnu o aun>
vattnia conteniendo
CMMLA
Figura 4.1.1.
M~rAflog*a do la carattJm.
250
C~swU
4.
Aptftatn pro U awflnwMu it a pee
Manto de naranja.
4.1.2- Sustwwlaspdcilcas 1 tu sustane mas pcticas son un grupo compkjo de polisacridos cidos que se encuentran en
cantidades variables en el espacio intercelular de los tejidos do plantas superiores,

paruculannente en la lmina medis Estas sustancias se pueden clasificar del siguiente modo (Fogarty y Kelly. 1983>: designan a aquellos glcidos coloidales complejos de origen vegetal y que contienen una gran proporcin de unidades de cido anhidrogalacturnico. Los grupos carboxlicos del cido poligalacturnico pueden estar esterificados parcialmente por grupos metilo o parcai o totalmente neutralrutdos por una o ms bases, la
-
es el nombre dado a la instancia que origina las sustancias pcticas,
tambn de origen vegetal y que adems es insoluble en agua, ~ azcares cosquenocontienenmsque
una pequea parte dc steres metilicos. B~o las condiciones adecuadas forman geles con
y
cidos; si el contenido en metcnilos es bajo pueden ibrmarse geles con algunos
iones Las sales de los cidos pectnicos pueden ser neutras o cidas la
psM~fl~ o
Las
se refieren a los cidos pectinicos solubles en agua, pueden
contener diferentes proporciones dc steres meulicos y grado de neutralizacin, Tambin pueden tbrrnar geles el es el cido
XAipIaCUEICO
coloidal esenchnente libre de steres
rnetihcos Los pectatos ni sw sales derivada.
251
Captniloi Aptteertdu pu tu
-
tsJiarodonoranJa
Los polisacridos pcticos son cidos poligalacturnicos. fonnack>s por cido galacturnico con enlaces cx- 1,4 (que potencian la fonnacin dc coloides> y ramifIcaciones de otras unidades no urnica.s, como rhamnosa, arabinos, galactosa. niosa y cosa~ La figura 4 1 2 1 representa la estructura general de las sustancias pcticas (Macmillan y Sbeiman, 1974).
O O
3
OH O OH OH
SI
> 1
>
[
OH Figura4l2.l Estructuradelas El de estenfkacicnes dc kw
4>
Jo
3
OH
O CH3
OH O
nmero
ca4nllscos a rnnol es miahle y depende acetilos en C2 y C3,
tambin de la especie vertal cm cuutta. Palo apater
252
Cq#etu 4 A plka Sn pu La teaeaewt eh Li
l amo ch naranja.
afectando a tas propiedades de gelifleacin. El peso molecular, en el caso de la naranja, est alrededor de 400(X) y 50000. La prdida de solubilidad puede producirse por las siguientes razones: unin a iones polivalentes como los de cako~ io y bierro, que causan la
precipitacin de las sustancias pcticas poco esterificadas y reducen la solubilidad de las altamente esenfleadas,
2. unin de los grupos carboxflicos a los hidroxilos de otros constituyentes celulares, como la celulosa o hernicelukxsas. 3. enlaces inicos entre los carboxilos y
Los
grupos bsicos de las protenas.
uniones ms dbiles con otros constituyentes celulares.
5 entretazamienro mecnico entre s o con polimeros de la pared celular.
4ilZ
Lassustancaspcucaasclocahtaflcflla pared primaria de los vegetales pnmcras etapas de crecimiento y rnsolubles, que se nnsft>nmw cm solubles facilidad de disoluctn en agua pero en caso de pwductrsc una dependiendo del peso concentracin.
>
niediaflacapadewnintercelularyla La textura de los frutos depende, la ir suavizando la textura. La
y I%IWk 1960} Su sintcsis comienza en las
en parte, de La cantidad de sacas pcbCa& El fruto ~trde presenta protopectinas,

>
al de
La longitud & la cadena polisacrida, u Anima dxsolucwnu altamente viscosas,

> -
fricas iujca, pH., temperatura y
41
253
Cqinle 4 Ap*c4wMn pum la twdhrbhs it U
eW amo de naranja
La siguiente tabla muestra el contenido de sustancias pcticas en algunos frutar
Fruto Uva Manzana Pomelo Limn Limn (semillas) Limn (corten) Limn (pulpa> Naranja (corteza) Naranja (membrana) Naa~culas~
Sustmndas$~!!~t~L. 0,2-1,0 0,5-1.6 1.6-4,5 3,0-4,0 6,0 32,0 25,0 20,0 29.0
En zumos de ctricos, a diferencia dc otros unos. su naturaleza turbia se considera una caracterstica deseable. La uwbdetz propia del zumo no se presenta en el zumo existente en las vacuolas celidares, sino que proviene dc la ruptura de las clidos durante el proceso de extraccin En este proceso, compuestos de alto peso molecular de los organelos y citoplasma quedan suspendidos en ci zumo junto con
-
dc membrana y material de origen la turbidez al auno y se compone de un Sin embargo. el efecto de la pectina
pctico. Toda esta suspensin coloidal (Bennet. 1987), siendo el 3O~/o restante an
3O~/o de protenas, 20% dc besperidina, 15% dc celukna y laemicehilosa y 5 dc pectina

>
sobre la rurbidez es el ms importante (KimbsiI, 1991). ya que su insolubilizacin tambin puede arrastrar otros compuestos o200 (XX)) dc conaderar su gran peso molecular (hasta 100.000
254
Caphlo 4. A$kwMn para U 6
de be
*1 auto de naranja.
4.1.3- Endmav pddlcar La abundanca de sustancias pcticas en Los vegetales ha creado difrrentes sistemas enzimticos capaces de degradar estas estucbsn.
stos
se diferencian tanto por su
mecanismo de accin como por su distribucin. Los enzrmas pcbcos se producen por plantas y microorganismos. pero no por clulas animales 1 os enzimas pcticos se clasifican en dos pnncipales grupos (Rombouts y Pilnilc, 1980): 1 enzimas que desesterifican mediante hidrlisis, son las pectinesterasas (tambin llamadas pectasas y pectin-mneal metanol y cido pctico (figura 4.1.34 O ~OCH~ O HO OH H O HO OH Figura 4 1 3a> Reaccin de la
>
~ La desesterificacin de 1. pectina produce
O H
CH3OH
Jl
O (PE)fr a. son las despohmerasas. Estos idicos por hidrlisis (hidrolasos, figura 4513c)>
3-
2 enzimas que rompen la cadena enzimas producen la toan de los enlaces 4.l.3b>o por3.ehrnmacion<
1 S
1
255
(#ts 4 tp&utMn para tu
de la
iJSM> de naranja.
O -OH H OH HO >1 O -OH

-fr
~ H PO
O OH
4-
51
Si
41
PO
Figura 4 1 3b> Reaccin de las bidrolasals (po
Si
Las poligalacturonasas tienen a los
como mejor susarato para sta accin, mientras que
la actividad disminuye al amnentar el grado de eteifeacin.

4
~ H
O OCH3 H O
O OH
OH O 0CM3 O OH OH
4-,
Fgura4 It Reaccindels
<sZC*IC4iB&
PL>.
i~
iii
256
-
[4
414
CapUn/o 4. AplicacIn para la Inactivactn cte fa pectinesterasa del zumo de naranja>
4.1.4- Pectinesterasas en ctricos
Las pectinesterasas son biosintetizadas por plantas superiores, hongos y algunas bacterias. Las de frutos son las mejor estudiadas, encontrndose mltiples formas moleculares e isoenzhnas. La accin pectinestersica fre ya estudiada por Frmy en 1840, que observ que al adicionar zumo de zanahoria a una solucin de pectina se formaba un gel. El gel se deba a la hidrlisis de los steres de la pectina seguida de la precipitacin como pectato clcico.
Los ctricos, junto con el tomate, son los frutos que presentan mayores cantidades de pectinesterasa (Versteeg y col., 1978). El ablandamiento de los tejidos del fruto durante la maduracin y el almacenamiento se ha asociado con la accin de la pectinesterasa, ms que a la accin de los otros enzimas pcticos.
La calidad de los zumos de ctricos depende de las reacciones enzunticas que ocurren no slo durante el desarrollo y maduracin del fruto, sino tambin durante el procesado y almacenamiento del zumo. Cuando un zumo se obtiene por expresin del ctrico, los enzimas son liberados de los lugares donde normalmente se encuentran. Varios de estos enzimas catalizan reacciones adversas que afectan al sabor y apariencia del zumo, en general a su calidad. La pectinesterasa es el enzima que ms afecta al empeoramiento de la calidad del zumo. Al comienzo del desarrollo de la industria de procesado de zumos de ctricos se reconoci la clarificacin en zumos embotellados y enlatados como resultado de la accin de pectinesterasa que no haba sido inactivada por medio de la pasterizacin, normalmente realizada a 70 <C 1 mm (Ting y Rouseff, 1986).
La pectinesterasa se encuentra asociada con elementos estructurales del fruto. Segn Bruemmer (1980) no exista actividad en el zumo filtrado, pero encontr 58, 44 y 28 unidades de actividad pectinestersica por kg de tejido seco en flavedo, albedo y pulpa respectivamente. Si nos atenemos al zumo, la mxima actividad se encontr en los restos de
257
Cop/uto 4. Ap/Jaretn para fa inactivacln de a pectineslerasa del zumo de naranja
vesculas (pulpa) y la menor en el sobrenadante del zumo centrifUgado, siendo la actividad del zumo proporcional a su contenido en pulpa (Ronse, 1951; Rouse y col., 1954). Jansen y col. (1960) mostraron que la pectinesterasa est unida a las paredes celulares formando un complejo enziina-sustrato con la pectina. Conforme la pectinesterasa acta sobre la pectina, desesterificndola, el enzima va pasando al medio desde la pared hasta llegar a un equilibrio. Sin embargo el enzima soluble es un 20% ms activo que el unido a la pared.
4.1.4.1- Isoenzimas
Actualmente se conocen varias formas de pectinesterasa de ctricos que difieren en sus propiedades cinticas y termoestabilidad (Versteeg, 1979). Algunas de las inegularidades para la inactivacin trmica de la pectinesterasa y la estabilidad de la turbidez pueden atribuirse a la accin de diferentes formas de pectinesterasa. Se han encontrado formas mltiples de pectinesterasa de ctricos. Evans y McHale (1978) caracterizaron dos isoenzimas en naranjas y limones, el primero de ellos lo encontraron en la piel y el segundo en las vesculas y carpelos. Versteeg y col, (1978) tambin partieron de pulpa y piel de naranjas, llegando a caracterizar dos isoenzimas (PEI y PEH). Los trabajos de Rombouts y col. (1982) llegaron a aislar PEil nicamente de la piel, pero FBI se encontr tambin en carpelos y vesculas. Ambos tenan un peso molecular de 36200, pero PEI era dos veces ms activo. PEI tena una actividad ptima a pH 7,6 y PEII a 8,0. Posteriormente, Versteeg (1979) aisl un tercer isoenzima (HM-PE) y comprob que era ms termoestable que PEI y PEII, de 54000 de peso molecular y con un
5%
de la actividad total. Tambin pudo
separar HM-PE en tres fracciones, siendo el isoenzima HM-PEII el que contena el 85% de la actividad. En total se llegaron a aislar 12 isoenzimas de pectinesterasa en zumo de naranja, si bien, PEI y PEil mostraron ms del 80% de la actividad (60% y 30% respectivamente).
258
Capitulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectineslerasa del zumo de naranja.
4.1.4.2- Estabilidad de los isoenzimas La actividad pectiinestersica de naranja se pierde solamente en un 15% tras dos aflos si se conserva a 4 oc en NaC O, 1M y tampn fosfato a pH 7,5 (Versteeg, 1979). A 30 oc PH era estable 24 h a pH 4 y 7, pero PEil slo lo era durante 6 h a pH 4. Sin embargo, HIM-PE era activo tras 15 das de almacenamiento.
Experiencias sobre la estabilidad trmica llegaron a la conclusin de que a pH 4, PEil era la menos estable al inactivarse a 55 0C. PEI se inactivaba a 65 0C y HM-PB a 85 0C. Segn Kiinball (1991), la temperatura de pasterizacin nonnalmente empleada para el zumo de naranja (alrededor de 66 0C) ha de elevarse hasta 88 0C durante un tiempo no inferior a 10-15 s para evitar la accin de los enzimas; en el zumo de limn la temperatura puede bajarse hasta 74 0C por su alto contenido en cidos, Segn Versteeg (1979), PEI y PEII poseen el 90% del total de la actividad clarificante del zumo a 30 oc, sin embargo, a 5 0C PEI solamente consevaba un 1% de su actividad a 30 oc y no se obsevaba una clarificacin significativa hasta la cuarta semana, excepto por la causada por la HM-PB, que si permaneca activa, Segn Ting y Rouseff (1986) la temperatura de pasterizacin ha de elevarse hasta 90 oc lii s o temperaturas mayores con menores tiempos. Seymour y col. (1991a y b) purificaron y caracterizaron dos fonnas de pectinesterasa, la termoestable (TS-PE) y la terinolbil (IL-PE) distinguindose por
su inactivacin a
70 0c durante 5 mm. Segn Snir y col. (1996) la
inactivacin de la TL-PE se consigue a partir de 2 mm, no variando la actividad tota! en calentamientos de tiempos menores o iguales a 10 miii.
Wicker y Temelli (1988) estudiaron la cintica de unactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja cuando era sometida a un tratamiento trmico, observando un comportamiento no lineal debido a la existencia de fracciones de enzima con diferente termoestabilidad, si bien la velocidad de inactivacin poda acomodarse a una cintica de orden 1. Sin embargo, anterionnente, Marshall y col. (1985) observaron que la cintica de inactivacin del enzima dependa de la cantidad de slidos solubles en el zumo, cuantificada como 0Brix, entre 10
-
35 0Brix la cintica era de primer orden, pero por encima de 40 0Brix la cintica se tomaba
259
Capitulo 4. AplIcacin para la inactivacin de fa pedneserasa del zumo de naranja
sigmoidal. Los estudios sobre la inactivacin de la pectinesterasa se han realizado en su mayora sobre tratamientos trmicos a presin atmosfrica, incluso se han realizado estudios sobre la inactivacin con CO2 supercritico; sin embargo, no se han encontrado referencias que traten de acomodar los resultados de inactivacin a una cintica cuando los tratamientos se realizan mediante la tcnica del CO2 supercrtico.
4.1.4.3- Estabilidad de la tarbidez y actividad pectinestersica
Versteeg (1979) concluy que HM-PE era el isoenzima responsable de la desestabilizacin del zumo de naranja durante el almacenamiento y que la estabilizacin de la turbidez se consigue por calentamiento a 90 oc i niin para inactivar este isoenzima. Sin embargo, la alta temperatura del procesado produce sabores desagradables en el zumo (Kew y Veldhuis, 1961). Adems, aunque representen las menores fracciones de la actitividad pectinestersica del total del fruto (Rombouts y col., 1982; Versteeg, 1979; Seymour, 1991a; Wail<er, 1992), 0C, siendo necesaria su estas formas son las ms activas en zumos mantenidos a 4 inactivacin (Versteeg, 1980; Seymour, 1991b). Tambin, Versteeg y col, (1980) advierten de la posible desestabilizacin de la turbidez a pesar del almacenamiento a temperaturas bajo cero pero superiores a -20 0C, incluso en concentrados.
4.2.1- Preparacin de la muestra Previamente a cadatratamiento, las naranjas procedentes del comercio (4 Kg) se expriman en un exprimidor domstico Braun Citromatic de 50 Hz. El zumo se hizo pasar por un tamiz de 1 mmi de luz de malta para eliminar fragmentos groseros de pulpa y evitar la aparicin de obstrucciones en la conducciones del equipo de tratamiento supercrtico.
260
.
CapItulo 4 Aplicacin para la Inactivacln de la pectinesterasa del zusno dc naranja
Parte del zumo obtenido se utilizaba para realizar los diferentes tratamientos. El resto del
zumo se conservaba a 4 oc y se utilizaba como control para los posteriores anlisis a realizar
en el mismo da. Las muestras se congelaron a -20 oc para prolongar su conservacin en el caso de que fuera necesano.
4.2. 2- Efecto sobre el zumo de naranja del tratamiento con dixido de carbono en condiciones supercrticas
Los tratamientos se llevaron a cabo utilizando el extractor de fluidos supercrticos semipreparativo LDC Analytical modificado (apartado 2.4.2). Se realizaron en modo
esttico y sin obtencin de extracto. La figura 4.2.2 representa el equipo tal como fue
modificado para los tratamientos del zumo de naranja. La celda fue la comnmente utilizada para la extraccin a partir de slidos con las vlvulas cerradas para la realizacin de tratamientos estticos. El zumo se someti a las siguientes condiciones de temperatura, presin y tiempo:
40 y 60 oc, 6,9; 20,7y34,5 MPa, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 minutos, 120 y 180 mm
a 34,5 MPa y 60 0C con el fin de someter la pectienesterasa a las condiciones de inactivacin ms severas.
-
Posteriormente se realizaron los anlisis junto con el control, que fue el zumo recin exprimido sin someter al tTatazrnento supercrtico.
261
______________________
CapItulo 4. Aplicacin para la inacthacin de lapeclinesterasa del zumo de naranja.
CRIOSTATO
CELDA DE EXTRACCrN
9
o
lz~ E-.
oc
CONTROLADORES
DE TEMPERATURA
Figura 4.2.2. Esquema del extractor superertico sernipreparativo para el tratamiento de zumo de naranja
262
Capitulo 4 AplicacIn para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja
4.23- Determinacin de la actividadpectinestersica La actividad pectinestersica (APE) de los zumos controles y los sometidos a condiciones supercrticas se detennin por valoracin (Ronse y Atkins, 1955). Para evitar errores por exceso en la valoracin, el dixido de carbono de la muestra se ehminaba bajo coniente de
N2.
Se utiliz como sustrato 30 mt de una solucin de pectina de ctricos altamente metoxilada (Sigma Chemical Co.) al 1% en solucin acuosa con NaC 0,1M y NaN3 lniiN1, agitada 0C. El pH de esta solucin se ajusta a 7,50 (ptimo de actuacin del constantemente a 30 enzima) con disoluciones de NaOH y Hcl. La adicin de la muestra (2-5 mL) provoca la liberacin de inetanol y grupos carboxilicos procedentes del sustrato en exceso. La APE se calcula a partir del volumen de NaOH 0,0 lN consumido para neutralizar los grupos carboxlicos producidos en un tiempo de 5 mm. Se define 1 UPE (unidad de actividad pectinestersica) como la cantidad de enzima que libera 1 iimol de grupos carboxilicos por mmuto en las condiciones estndar de ensayo. La APE se suele dar como UPE por unidad de volumen de muestra en mL y se calcula mediante la siguiente frmula:
UPE mL
(mL NaOH) (N NaQEZ) (1O~) (4.1) (mm) (mL zumo)
4.24- Medida de la turbidez El zumo se someti a las siguientes condiciones:
temperaturas de 40, 50 y 60 0C,
presiones de 6,9; 138 ,, 20T ,, 276 , y 345 MPa,
263
Capitulo 4. Aplicacin para la inacilvacin de fapectinesterasa del zumo de naranjo.
El tiempo de tratamiento fue de 1 h. Tras el tratamiento el zumo era extrado con la presin propia de la celda. Tambin se realizaron tratamientos en los que se despresuriz la celda previamente a la extraccin del zumo. En el mismo equipo se realizaron tratamientos a 40, 50 y 60 0C durante 1 h a presin atmosfrica para la realizacin de controles tnnicos. Tambin se someti el zumo a presin subetitica (5,5 MPa) y temperatura ambiente durante un tiempo mnimo como control en la variacin de turbidez sin inactivacin de pectinesterasa.
La medicin de la turbidez se realiz segn el mtodo de Versteeg y col. (1980). El zumo se centrifug a 320xg durante 10 miii. El sobrenadante se virtio en cubetas de 1 mm de espesor y se midi la absorbancia a 660 nm frente a un blanco de agua destilada en un espectrofotmetro Beckman modelo DUt7O.
El clculo de la precisin del mtodo de medida se realiz a travs del clculo de la desviacin estndar relativa de triplicados de muestras. Se realizaron quintuplicados durante dos das de una misma muestra ya centrifugada para comprobar la estabilidad de la turbidez de los preparados.
4.2.5- Medida del color
El color es uno de los atributos de calidad ms a considerar en Ja apariencia o aspecto de los alimentos, En concreto, se ha observado anteriormente que el color de los zumos de naranja sufre variaciones al ser sometido a tratamientos supercriticos, si bien, estos resultados son difcilmente interpretables (Balaban y Arreola, 1991).
El color se midi segn el mtodo de Gonzles y col. (1990). Previamente se centrifug el zumo a 320xg durante 10 mm. Se realizaron los espectros de absorcin UVVJS de los
264
Capl u/a 4. Aplicacin para fa inactivacin de la peclinesterasa del zumo de naranja
sobrenadantes en el espectrofotmetro, acopiado a un ordenador con velocidad de registro de 2400 mulmun, equivalente a registrar un dato de absorbancia cada 2 mm. Las medidas se realizaron por quintuplicado para el estudio de su precisin. El mtodo de Gonzles y col, se fiuindamenta en el la CJE, mejorando el tiempo de anlisis de las muestras. Se realiza un registro y procesamiento de datos con ordenador, se consigue el control de un alto nmero de muestras en un tiempo coito y, adems, el anlisis de los atributos cromticos de los muestras estudiadas es ms eficiente, cmodo, preciso, exacto que otros utilizados anteriormente y permite un mejor entendimiento de los resultados. Este mtodo ha sido utilizado con xito por Gonzles (1990), Gonzles y col. (1990>, y Gmez-Cordovs y Gonzlez-Sanios (1995).
Posteriormente se calcularon los parmetros cromticos, que son la intensidad, tonalidad, brillantez, longitud de onda dominante y pureza de cada muestra. Estas variables se definen de la siguiente manera (Gonzles, 1990):
intensidad, es el rea entre la curva de absorbancias y el eje de longitud de onda desde 400 hasta 600 nm,
tonalidad, es la pendiente de la curva de absorbancias en el rango de 450 a 500 nm, por regresin lineal simple, brillantez, es la cantidad de gris que condene un color, dentro de una escala comprendida entre el negro y el blanco,
longitud de onda dominante, es el matiz de color tal como rojo, verde, azul, etc.,
pureza, corresponde a la variacin que tiene un color cuando al permanecer invariable el tono se va aclarando paulatinamente.
265
CapItulo 4. Aplicacin para la inaclivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja.
4.2 6- Efecto del almacenamiento sobre la turhdezy color Se llev a cabo un estudio de la variacin de la turbidez y del color durante el almacenamiento de zumos sometidos a los siguientes tratamientos:
1. almacenamiento a 4 0C,
-
control (zumo no tratado),

27,6 MPa y 40 0C durante 1 h, extrayendo el zumo a presin, 27,6 MTPa y 50 0C durante 1 h, extrayendo el zumo a presin,
2, almacenamiento a temperatura ambiente,

-
control (zumo no tratado),
34,5 MIPay 60 oc durante ib, extrayendo el zumo a presin, ~ p,jy~ a temperatura ambiente dwwitc el ~ ndmo necesario para su posterior extraccin a presin.
-
Ifl.J>AtjJt~
4,3.1- Efecto del tratamiento con dixido de carbono supercr(fico sobre la nactivacin depectinesterasa de zumo de naranja
El estudio de la precisin del mtodo de valoracin de la APE, tras realizar valoraciones por quintuplicado, ofreci valores de desviacin estndar relativa <9%, Las tabla 4.3.1 presenta los resultados de APE de los zumos antes y tras el tratamiento supercritico para las condiciones estudiadas.
266
Capitulo
4.
Aplicacin para la Inactivacin de Mi pectinesterasa del zumo de naranja.
Tabla 4.3.1. Actividad pectinestersica (UPEImL) de con dixido de carbono supercritico (SC-CO tiempo (mm) 0 1 10 15 20 30 45 60 90 120 180 40 0C 6,9 NIPa 20,7 MPs 1,21 1,05 1,10 1,10 1,05 1,00 1,00 0,75 0,65 0,55
-
los zumos antes y tras los tratamientos 60W
2). atniosf. 1,15 0,80 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
-
34,5 MPs 1,19 1,15 0,90 0,95 0,90 0,75 0,60 0,35
-
________________________________________
6,9 NIPa 34,5 MiPs 1,20 0,30 0,30

-
1,20 1,20 1,25 1,15 1,00 0,80 0,70 0,50 0,45

-
1,20 0,25 0,25

0,25
0,30 0,25 0,25 0,25 0,20

-
0,25 0,20
-
0,15 0,15 0,20 0,20
Se observ que los tratamientos a 60 oc fueron los ms enrgicos; sin embargo, tambin se observ que la presin era un factor a tener en cuenta, ya que los tratamientos a presin atmosfrica a 60 0C sufrieron una menor inactivacin de la pectienesterasa. A presin atmosfrica y 60 0C la unactivacin es ms lenta que a cualquiera de 1-as presiones de estudio, ya que al cabo de 1 miii la actividad se ha reducido solamente a 0,80 UPE/mL, mientras que en los tratamientos supercrticos llega a ser de 0,20 UPE/mL, pudindose considerar valores de +0,05 como elTor del propio mtodo de medida. Los tratamientos realizados a 60 0C dejaron una actividad residual de 0,20 0,05UPE/mt causada por la pectienesterasa tennonesistente (la inactivacin se consigui totalmente en ensayos realizados a 90 oc y presin atmosfrica).
En los estudios realizados a 40 0C se pudo adecuar al orden cero la cintica de unactivacin mediante anlisis por regresin lineal simple, siguiendo la ecuacin:
267
Capitulo 4 Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja.
APErnL=APE6 /rnLKt
(4.2)
donde: APE0 K t
= =
APE inicial expresada como UPE,
constante de velocidad expresada en UPE/(niL~niun),
tiempo en minutos.
Los resultados obtenidos para la cintica de unactivacin fueron los indicados a continuacin: 0C y 6,9 MPa: APE/mL -0,00509t + 1, 1288, r2 0,9210; -40 40 0C y 20,7 MPa: APE/mL -0,01033t + 1,2401, 0,9023;
= =
-
-40 0Cy 34,5 MiPa: APE/mL=-0,14204t+ 1,20501,?0,9715.
Se puede observar, tambin, el efecto dependiente de la presin sobre la inactivacin pectinestersica, ya que la constante de velocidad de inactivacin aumenta progresivamente (en valor absoluto) al aumentar la presin del tratamiento, siendo la alcanzada a 20,7 MPa el doble que a 6,9 MPa, y a 34,5 MIPa llega a iriplicarse. ste un hecho que satisface las espectativas para conseguir efectos de inactivacin con empleo de menores temperaturas de calentamiento. Sin embargo, los tratamientos no son tan drsticos como los que se realizaron a 60 0C, independientemente de la presin utilizada.
4.52- Efecto del tratamiento con dixido de carbono supereritico sobre la nodflcacin de la turbidez del zumo de naranja
Los resultados tras la medicin de la turbidez de una misma muestra durante dos das se presentan en la figura 4.3.3a (del apartado 4.3.3). Se observa que la turbidez de los zumos tras la centrifugacin es muy estable tras dos das de mediciones, ya que la desviacin estndar relativa conseguida es <1,5%, del mismo modo que esta turbidez no impide una muy buena repetibilidad de los resultados. La razn de la estabilidad se explica ya que tras la
268
CapItulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesierasa del zumo de naranja.
centrifugacin disminuye la concentracin de pectinesterasa en el disminuyendo su actividad.
sobrenadante,
La precisin del mtodo al realizar triplicados de un zumo ofreci un valor de desviacin estndar relativa <1,5%, siendo un mtodo muy preciso (figura 4.3.3b, del apartado 4.3.3).
Se observ un aumento generalizado de la turbidez del zumo de naranja tras los trataniletitos supercriticos. El aumento no se produca en los tratamientos trmicos a presin atmosfrica. La tabla 4.3.2 presenta los resultados de absorbancias a 660 nm de los zumos antes y tras los tratamientos en las condiciones indicadas. En todos estos casos el zumo se extrajo a presin tras finalizar el tratamiento. La figura 4.3.2 representa la variacin de turbidez calculada del siguiente modo: AT siendo:
AT la T, T T
~
2?
(4.3)
variacin de la turbidez,
la turbidez antes del tratamiento,
1la twbidez tras el tratamiento, antes y tras los tratamientos con dixido de
Tabla 4.3.2. Turbidez (ka) de los zumos carbono supercritico (SC-CO2). Presin (MiPa)
____________
40
Temperatura ( 50
____________
0C) 60
2
control
00381 0,1069 0,2231 0,0864 0,1967 0,0963
SC-CO
control SC-CO2 atmosfrica 6,9 13,8 20,7 27,6 34,5 0,0359 0,0271 0,0476 0,0393
0,0504
control 0,0359 0,0406 0,0200 0,0393 0,0869 0,0869
SC-co2
0~O320 0,0847 0,1479 0,1337 0, 707 0,1199 269
0,0359 0,0340 0,0464 0,0393 0,0504 0,0274
0,0417 0,0763 0,2063

0,1197
0,1204
0,0274
0,1496
Capitulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la peclinesterasa del zumo de naranja.
Sin embargo, aument tambin la turbidez en los zumos que no eran sometidos a presiones leves (5,5 Mpa) y a temperatura ambiente. El aumento en la turbidez de los zumos no se produjo cuando stos eran extraidos del equipo tras la despresurizacin de la celda (a presin atmosfrica) a pesar de haber sido sometidos al tratamiento supercrltico (ver tambin el apartado 4.3.4). Por lo tanto, el aumento de la turbidez no se debe al tratamiento superciitico sino a las fuerzas de cizallan-iiento que se producen mediante la despresurizacin. Estas fuerzas provocan una disgregacin de las partculas del zumo en partculas ms pequeas y numerosas que se mantienen ms tiempo en suspensin, aumentando la turbidez del zumo y disminuyendo la formacin de precipitados. En conclusin, el aumento de turhidez del zumo no es dependiente de la presin y la temperatura del tratamiento superertico a que se ha sometido sino que depende de las fuerzas producidas al realizar la despresurizacin simultneamente a la obtencin del zumo una vez tratado.
4.3.3- Efecto del tratamiento con dixido de carbono superertico sobre la mod~flcacin del color delzjitno de naranja
Se realizaron los clculos de precisin del equipo y delmtodo al igual que en la medida de la turbidez (apartado 4.3.2). Los resultados, representados en las figuras 4.3.3a y 4.3.3b respectivamente, fueron igualmente satisfactor os.
La figura 4,3.3c muestra los espectros de absorcin UVIVIS de un control, dos zumos sometidos a condiciones supercriticas (obtenidos simultneamente, despresurizacin de la celda, SC) y de un ziuno presurizado a 5,5 Mpa,
SC+FC,
o tras la
FC.
Los zumos tratados con dixido de carbono superoritico y extrados a presin (SC+FC) ofrecieron valores de absorbancias mayores que los controles en todo el espectro de longitudes de onda estudiado. Estos resultados indican que n-o existe un cambio en el color 270
CapItulo 4. AplicacIn para la inactivacin de lapectinesleraso del zumo de naranja.
Absorbancia 4,0
35
CV(%)
2,0
3,0
25
1,5
2,0
1,0
1,5
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
250
200
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
Longitud de Onda (nm) Figura 4.3.3a. Precisin en la medida del espectro 13V/VIS
Absorbancia
4,0
3,5
CV (a/o)
20
3 0
2,5
1,5
2,0
1,0
1,5
11,0
0,5
0,5
0,0
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
0,0 800
Longitud de Onda (nm) Figura 4.3.3b. Precisin del mtodo de medida del color
271
captulo 4. Aplicacin para la inactivacin de lapectinesterasa del zumo de naranja,
smo una prdida de transmitancia debido a la mayor presencia de particulas suspendidas en el zumo. Sin embargo, entre 400 y 600 nm se aprecia que se produce un aumento de la absorbancia que no se corresponde nicamente con un simple aumento de las particulas en suspensin, sino que es debida a la modificacin del color. Las mayores aborbancias en estas longitudes de onda producen un viraje de color desde el naranja (control) hasta el amarillo (zumo tratado) fcilmente apreciable bajo un examen visual. La figura 4.3.3d muestra una fotogralla de un zumo antes del tratamiento y de otro zumo tratado del modo SC+FC.
El tratamiento a
5,5
MIPa y temperatura ambiente (FC) produjo resultados similares a los
anteriores. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los zumos tratados y extraidos a presin atmosfrica (SC) y los controles. Las causas de estos resultados son las mismas que las expuestas para la modificacin de la turbidez (apartado 4.3.3), es decir quela ausencia de frerzas de cizallamiento evita la formacin de ms partculas suspendidas, no aprecindose modificacin de la transmitancia.
La tabla 4.3.3 ofrece los resultados obtenidos para los controles y los tratamientos realizados. Se observa que, tras los tratamientos, se produce un aumento en los valores de pureza e mtensidad, no se produce diferencias significativas en los valores de longitud de onda dominante, y disminuyen los valores de brillantez y tonalidad. Estos resultados se achacan al aumento de la turbidez y no a un cambio de color, excepto los resultados de la tonalidad, que reflejan el cambio del naranja (controles) al amarillo (tratados).
Los resultados obtenidos difieren a los obtenidos por Balaban y Arreola (1991) ya que no se observaron diferencias dependientes de las condiciones de temperatura y presin de tratamiento sino de la forma de obtencin del zumo una vez tratado para la inactivacin de la pectmesterasa.
273
Tabla 4.3.3a. Influencia en la brillantez del tratamiento supercrtico y posterior obtencin del zumo a presin. Temperatura (0C) Presin (MIPa) atmosfrica 6,9 13,8 20,7 27,6 34,5 31,82
39,14
40 control SC-CO, 3L83

2,95 2,34 5,25 0,28 3,97
50
control 31,82 53,41 21,50 30,89 23,32 37,75
60
SC-CO
28,41 7,76 0,16
2 control
31,82 25,41 48,58 30,89
35,22 35,22
SC-CO
37,73 5,67
47,86 30,89
23,32 37,75
0,80
1,36 0,60 3,19
1,90
2,05 0,77
Tabla 4.3.3b. Influencia en la pureza del tratamiento supercrtico y posterior obtencin del zumo a presin. Presin (MiPa) control atmosfrica
6,9
40 SC-CO, 31,17
91,89
Temperatura ( 50 control 32,28 26,30 51,23 47,48

53,22
0C) 60
SC-CO, control
35,98 87,28 98,76 94,27 90,73 96,89
SC-CO,
32,61
88,91
32,28 49,28 30,09

47,48
53,22
32,28 47,84
33,37 47,48 43,07 43,07
13,8 20,7 27,6 34,5
93,19
88,05 95,28
97,95 95,74
8401 42,18
38,39
89,29
38,39
265
Captulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja.
Tabla 4.3.3c. Influencia en la longitud de onda dominante del tratamiento superoritico y posterior obtencin del zumo a presin. Temperatura (0C) Presin (MPa) control atmosfrica 6,9 13,8 20,7 27,6 34,5 580,2 579,1 579,6
575,4 574,9
40 SC-CO 579,3 585,8 586,8

584,9 587,1
50 2 control 580,2 579,5

581,3
60 SC-CO2 579,8 583,6

592,6
control
580,2
SC-CO2
578,8
581,1
579,2 575,4 577,6 577,6
584,6
589,8 585,3 588,3 587,0
575,4
574,9
587,4
586,5
580,5
585,6
580,5
589,6
Tabla 4.3.3d. Influencia en la intensidad del tratamiento superoritico y posterior obtencin del zumo a presin. 0C) Temperatura ( 60 50 40 Presin (MPa) control SC-CO 2 control SC-CO2 control SC-CO2 131,28 118,33 131,28 141,11 131,28 131,19 atmosfrica 6,9 13,8 20,7 27,6 34,5
128,72 92,92
460,35 494,43 388,91

705,14
79,76 189,24 150,05 181,05 121,78
347,96
166,96
97,71
386,38 676,87 579,09 569,27 348,12
852,96 522,98 485,60 638,57
150,05 181,05 121,78
150,05 126,48 126,48
418,35
266
CaplitIo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja
Tabla 4.3.3e. Influencia en la tonalidad del tratamiento supercrtico y posterior obtencin del zumo a presin. Temperatura (0C) 60 50 40 Presin (MPa) control SC-CO control SC-CO control SC-CO .2,75 iO~~ -3, ra~ -2,754W -2, 7710>~ -2,751W -s,sa~ atmosfrica 3,97 io~~ ,i367.1G~2 -6,08 iO~ -1, 48310> 6,9 -2,77 j~.3 -2,5221& -2,42 iO3 .1,59010> -4,42 iW -270410> 13,8 ..7,75.I0>1 .1,17210> .~,75 io-3 -1,56910 ,7,75. i& -2,41&ltT 20,7 -9,15 iW -131510> -5,16 o3 -3,4&lcT 27,6 -3,451W -1,26610> -3,451W -1,89210> 34,5
267
Capitulo 4. Aplicacin para (a inactivacin de lapeclinesterasa del zumo de naranja
4.3.4- Modticacin de la turbidez y color del zumo de naranja durante el almacenamiento Las figuras 4.3.4a y b muestran fotograflas de los zumos conservados a 4 0C tras un da y una semana, respectivamente, del tratamiento con CO 2 supercrtico. Se observa que tras un da todas las muestras han clarificado parcialmente. La turbidez del clarificado es mayor en los dos zumos tratados que en el zumo control debido al aumento del nmero de menores partculas en suspensin. Adems, se observa que el volumen de precipitado es menor en los zumos tratados, ya que parte de ste an se conserva en suspensin, y su aspecto es ms gelatinoso. Las observaciones realizadas tras una semana de almacenamiento desde el tratamiento sirvieron para marcar ms las diferencias entre el zumo control y los tratados.
Respecto a los zumos almacenados a temperatura ambiente se realizaron medidas de turbidez durante 15 dias, tras los que los zumos presentaban ya un deterioro que imposibilit la realizacin de posteriores medidas. Los resultados se representan en la figura 4,3.4c, En los tres casos estudiados se observ un aumento de turbidez al cabo de un da, debido probablemente a la actuacin de otros procesos enzimticos que producen un aumento del nmero de partculas estables en suspensin (poligalacturonasas y pectfn-liasas), con el consiguiente aumento de la turbidez.
A partir del cuarto da de almacenamiento, el zumo que no fue sometido a ningn iratamiento recuper el valor inicial de la turbidez y sta sigui perdindose lentamente hasta el da 15. Hay que tener en cuenta que la turbidez inicial en los controles es baja, con lo que la disminucin que se produce durante el alimacenainiento es poco pronunciada. Los zumos que suflieron las fuerzas de cizallamiento (SC+FC y FC, figura 43.4c), producidas por la salida del dixido de carbono a presin, alcanzaron valores iniciales de turbidez sensiblemente mayores a los controles, tal como ya se ha indicado en el apartado 4.3.2, pero no se puede considerar significativa la diferencia de turbidez entre estos dos tipos de tratamientos. 278
Cap/nilo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja
El zaino piesutizado (FC, figura 4.3.4c) sufri una rpida prdida de turbidez desde el da 1 hasta el da W, ya que el aumento de la turbidez te compensado posteriormente por la accin de la pectinesterasa, que conservaba plenamente su actividad. Posterionnente, la clarificacin se desalToll ms lentamente,
El zumo sometido a condiciones supercr!ticas (SC + FC, figura 4.3.4c) mantuvo estables los valores de tubidez hasta el da 10 debido a la baja actividad pectinestersica. Una posible reacitvacin del enzima (Balaban y Areola, 1991) fue la causante de la prdida de turbidez entre los das 10 y 15. De este modo se comprueba que semejora la turbidez de un zumo con el tratamiento de presin, si bien es la inactivacin de la pectinesterasa llevada a cabo con el dixdo de carbono supercritico la que pennite una estabilizacin de estos valores elevados de turbidez durante tiempos de almacenamiento ms prolongados.
280
Conclutlfles.
CONCLUSIONES
la. El anlisis de la grasa lctea por cromatografiEl lquida de alta eficacia junto con el anlisis por GC de los cidos grasos de las fracciones procedentes de la separacin por HPLC premiti la estimacin de 181 especies moleculares, 30 de ellas identificadas por primera vez, debindose destacar la presencia de 10 triglicridos con un nmero impar de carbonos y 3 con un cido graso de cadena ramificada.
2a~
La comparacin en la composicin triglicrica de la grasa de leche de oveja, cabra y vaca, pone de manifiesto que la de oveja es la ms enriquecida en triglicridos saturados de media, la de vaca en triglicridos de cadena larga saturados y la de cabra en triglicridos saturados de cadena media. La adicin de un soporte slido e inerte que aumente la superficie de contacto y evite la formacin de canales preferenciales es necesario para mejorar el rendimiento de las extracciones y, sobre todo, la extraccin selectiva de colesterol.
3a
4a
Las condiciones de 14,5 MPa y superiores en presencia de bolas de vidrio son las que proporcionan una mayor reduccin de colesterol en la nata (75%)
independientemente de la temperatura. La mayor selectividad se consigue a la 0C. densidad de 0,7 gImL y temperatura de 60
5a, La espectroscopia de 3C-RMTN ha demostrado ser una tcnica de utilidad por ser
complementaria a las tcnicas cromatograficas usadas en la presente memofltt
6~. El detector de masa a 30 oc y 121 kPa es adecuado para el anlisis cuantitativo por HPLC de esteroles y escualeno en mezclas en las que exista una gan variedad de estos compuestos.
281
Conclusiones.
Y. La mayor selectividad en la extraccin de escualeno respecto a los esteroles en los destilados analizados se consigue a bajas presiones (10 - 20 MPa) y altas 0,39 g/mL) temperaturas (60 y 50 0C), si bien, densidades muy bajas (0,29
-
conducen a bajos rendimientos de la extraccin. ga, La inactivacin de la pectinesterasa responde a una cintica de orden cero, siendo la constante de velocidad directamente proporcional a la temperatura y presin del tratamiento con CO 2 supercrtico.
Y. El aumento de la turbidez y la variacin de color de los zumos tratados se debe a la aparicin de fuerzas de cizallamiento en el caso de que la obtencin del zumo sea simultnea a la despresurizacin. La variacin de la turbidez y el color, en las condiciones estudiadas, es independiente de la presin y la temperatura del tratamiento,
loa.
La inactivacin de la pectinesterasa junto con la obtencin del zumo simultneamente a la despresurizacin contribuye a preservar el aspecto del zumo durante el almacenamiento, ya que, a temperatura ambiente, se consigue un aumento de la turbidez y su mantenimiento hasta un tiempo de 15 das,
282
b/logr
BLBLIOGRAFL4L Ackman, R.G.(i970) The analysis of fatty acids and related materlais by gas-liquid chromatography Frogress in 11w chenstry of lite fais andoiher lipids 12,167. Ackman, RO (1986) Analysis of O/ls andFats, Elsevier Applied Selence, Amsterdam. Aihara, H., Watanabe, K., Nakamura, R. (1988) Degradation of cholesterol in hens egg yolk and its lipoprotein by extracellular enzymes of Rodococcus equl. Lebensmiltel WYssenchajt -und-Technologie 21, 342. Anifantakis, EM. (1986) Comparision of the physico-chemical properties of the ewes and cows milk. Boletn FIL-JDF. 202, 42. Annimo, (1989) Cholesterol reduction technologies overview, ~ Research Review, Specia repor 2. Antila, V., Kankare, y. (1983) The fatty acid composition of milk lipids. Milchwissenschdft 38, 478. AOAC (1990) Official methods of analysis Methad 920.107 analytical chemists, Arlington, Estados Unidos.
14th
5~0flsnMlkM2rketitIgBO
ed. Association of official
<
Arntfield, SD, Bulley, NR., Crerar, W.J. (1992) Supereritical CO2 extraction of egg yolk: impact oftemperature and entrainer on residual protein. J. Am. Oil Citen:. Soc. 69, 823. Arreola, A.G. (1990) Effect of superoritical carbon dioxide on sorne quality attributres of single strength orangejuice. M Sc Tesis. Universidad de Florida, Gainesville, Estados Unidos. Artho, A., Grob, K., Mariani, C. (1993) On-line LC-GC for the analysis oftbe minar componeflts in edible olis and fats - The direct method involving silylation. Fol 3d. Technol. 95, 176. Arul, J., Boudreau, A>, Makhlouf, J., Tardif, R., Sashasrabudhe, MR. (1987) Fractionation of anhydrous milk fat by supereritical carbon dioxide, J FoodSci, 52, 1231. Arul, 3., Boudreau, A., Makhlouf, J., Tardif, R>, Grenier, B. (1988) Distributian ofcholesterol in milk fat fractionations. J Dairy Res. 55, 361. 3C and H Aursand, M., Rainuzzo, JR, Orasdalen, R. (1993) Quantitative higb-resolutiafl nuclear magnetic resonance of w3 fatty acids from white muscle of atlantic salman (Salmo salar).J. Am. Oil Chern. Soc. 70, 971. Baggio, O., Pagnan, A., Muraca, M., Martini, 5., Opportufla, A., BollanOrne, A., Ambrosio, GB., Ferrari, 5., Guarini, P,, Piccolo, D., Manzato, E., Corrocher, R., Crepaldi, 0. (1988) Olive oil enriched diet: effect on serum lipoprotein levels and biliary cholesterol saturatian. American Journal of clin/ca nuir ilion 47, 960. 283
Bibliografla.
BaLey, A.E. (1951) Composition of glycerides with randomly distributed fatty acid radicais. Industrial oil andfatproduc(s, 20 ed., Interscience, New York, 834. Balaban, MO, Arreola, A.G (1991) Supercriticai carbon diaxide applied to citms processing Tr~rnsactioi~ of tite .3 Zth Annual Citrus Engineering Co,!ference, A,. Soc. Mechanical Eng., FI section, Lakeland, Estados Unidos> Bannon, CD., Craske, JD., Hal, NT., Harper, NL., ORourke, KL (1982a) Analysis of fatty acid methyl esters wih higb accuracy and reliability. II. Methylation offats and ols witb boron trifluoride-methanol. j Chrornatogr. 247, 63. Bannon, CD., Breen, G.J., Craske, J.D., Hai, NT., Harper, NL., ORourke, KL. (1982b} Analysis of the fatty acid methyl esters with high accuracy and reliability. 111. Literature review ofand investigations into the developement of rapid pracedures for tho methoxidecatalysed methanolysis offats and oils. J Chromatogr. 24?, 71. Barrn, L.J>R., Santa-Maria, G. (1987) Non-aqueous reversed-phase HPLO analysis of trigtycerides Citrornatograpitia 23, 209. Barrn, L>J.R>, Santa-Maria, O., Diez-Masa. J.C. (1987) Influence of bcnded-phase column type, mobile phase composition, temperature and flow-rate in the analysis of> triglycerides by RP-HPLC. J Liquid Chromatogr 10, 3193. Barrn, L.J.R. (1989) Composicin triglicrica de grasas y aceites naturales. Identificacin y cuantificacin de especies moleculares por cromatografla lquida de alta eficacia. Tesis Doctoral, Universidad Autnoma de Madrid> Barrn, L.J.R., Hierro, M.T.G., Santa-Maria, 0. (1990) HPLC and GLC anaysis of the triglyceride composition ofbovine, avine and caprine milk fat J. Dafry Res. 57, 517. Barth, MM., Cen-Zliou, Kute, KM., Rosenthal, CA. (1995) DetermiflatiOn of optirnuin conditions for supercritical fluid extraction of carotenoids from carrot (Daucus carola L.) tissue. J. Agric. Food Citen:. 43, 2876. Bayal, A., Maffrand, J.P., Gonzlez, B., Frankinet, J, (1988) Process for the eliminatian of steroid compounds contained in a substance of biological origin. Patente australiana n0 28449/89. Beitz, D.C.. Young, J.W., Dehal, S.S. (1990) Method of converting cholesterol in foad te coprastanol. Patente de los Estados Unidos N0 4.921.710. Bennet, R.D. (1987) De la presentacin al Citrus Products Technical Committee Del USDA Fruit and Vegetable Laboratory, Pasadena, Estados Unidos> Beynen, A.C., Katan, M.B., van Zutphen, L.F.M. (1987) Hypo- and hyperrespOflders individual differences in the response of semm cholesterol concentration te changes in diet. Advances u lipid research 22, 115. 284
B(bllogrq/lci.
Bonanome, A,, Grundy, SM. (1988) Effect of dietary stearic acici on plasma cholesterol -and lipoprotein leveis. New Englandjournal ofmedicine, 318, 1224. Bondioli, P., Mariani, C., Lanzani, A., Fedeli, E., Mossa, A., Muller, A. <1992) Lampante olive oil refining with supercritical carbon dioxide J. Am> Oil Chem. Soc. 69, 477 l3ondoli, P., Mariani, C., Lanzani, A., FedeIl, E., Muller, A> (1993) Squalene recovery tYom olive oil deodorizer distillates. j Ant. Oil Citen>, Sac. 70, 763. Bornaz, S., Novak, O,, Parmentier, M. (1992> Seasonal and regional variation iii triglyceride composition offrench butterfat. j Am. Oil Chem. Soc, 69, 1131. Boyazoglu, J. (1989) La production laitire ovine en systmes extensifs mditerranens. Le alt dans la rgion mdilerrandenne. Options mditerandennes. Centre International de Hautes Etudes Agrononilques Mediterranennes (CII-IEAM) srie srninaires 6, 141> Bradley, R.L Jr. (i989) Removal of cholesterol from milk fat using supercritica carbon dioxide. J. Dairy Sc 72, 2834. Breckenbridge, WC., Marai, L., Kuksis, A> (1969) Triglyceride structure of human mlk lit Ca,;. .1 Biochern. 47, 761. Breitmaier, E., Hijas, O., Voelter, W. (1975) Atlas of 3C-NMR. Ed Heyden & Son Ltd., Norfolk, Reino Unido. Brignole, EA., Andersen, PM>, Fredenslund, A. (1987) Supereritical fluid extraction of alcohois frorn water> md. Eng. Citen;. 26, 254 Bruemmer, J.H. (1980)8. Relaionship ofcitrus enzymnes to juice quaiity. ClrusNulrition andQualhy, Ed. 5. Nagy, JA. Attaway, ACS Symposium Series, Division of Agricultura] and Food Chemistry at the i79th Meeting ofthe American Chemical Society, Houston, Estados Unidos. Bulley, NR>, Fattori, M., Meisen, A,, Moyls, L (1984) Supercritical fluid extractions of vegetable oil seeds. J Am. Oil Chem. Soc. 61, 1362. Byeung, HL. (1993) Extraction and separation of EPA from sardine by using supercritical carbon dioxide extraction. J Korean Sociey of Food and Naln/ion 22, 629. Charlesworth, J.M. (1978) Evaporative analyser as a mass detector for liquid ehromatography. Anal. Citen?. 50, 1414> Chen, H, Schwarz, S.J., Spanos, GA. (1992a) Eractionation ofbutter oil by supercritical carbon dioxide. JDahySci. 75, 2659. Chen, J.S., Balaban, MO., Cheng-i, W., Marahal, M.R., Hsu, W.Y> (1992b) Inactivation of polyphenol oxidase by high-pressure carbon dioxide> >1 Agric. FoodChem. 46, 2345.
285
Bibhografta
Chen, J.5., Balaban, MO., Wei, CI., Gleeson, R.A., Marshall, M.R. (1993) Elrect of carbon dioxide on the inactivation of Florida spiny lobster polyphenol oxidase. J&i. FoodAgrk 61, 253> Clirastil, J. (1982) Solubility of solids and tiquids in supercritical gases>.! Phys. Che,. 86, 3016. Cliristianson, D.D., Friedrich, JP., List, G.R, Warner, K, Bagley, E.B., Stringfellow, A.C., Inglett, GE (1984) Supereritical fluid extraction of dry-niil]ed Dom germ witli carbon dioxide j Food Sol. 49, 229> Christie, W.W. (1982) Lipid analysis. Isolation, separation, identification and structural analysis of Iipids Pergamon Press, Oxford, Reino Unido, Cliristie, W.W. (1987) The analysis of lipids with special reference to milk fat. Recafl advances in chemistry and tecbnology of fats and cus. Ed. R.J. Hamilton, A> Bhati, Eiaevier Applied Science, Londres, Reino Unido, 57 Ch.ristie, W.W(1989) Gas chrornatography and .lipids. Tbe Oily Press Ud, A]loway, Reino Unido> Cliristie, W.W (1991) Recents developments in high-performance liquid and gas chromatography of lipids. Rei. u,-:, Co,psGras3s, 155. Christie, W.W. (1992) Detectors for 14gb performance Jiquid chromatography of lipids with special reference to evaporative light-scattering detection. Advances in lipid methodology oneEd. W.W CIiristie, Ihe Oily Press, Ayr, Reino Unido, 239.
-
COl. (1995) Norma comercial aplicable al aceite de oliva y al aceite de orujo de oliva. Comit Olecola Internacional T. 15, N0 2, rey. 3, 24 de noviembre de 1995. Coil Ilelln, L., Clausefl, M. del P. (1985) Incidencia de la fritura en Ja composicin de la fraccin lipdica de diversos aperitivos de consumo generalizado en nuestro pas. Anales de Brorncaologia 36, 207. Coil Hellin, L (1988) Estudio del insaponificable de la grasa de sardinas frescas del mercado de Madrid> Anales de Bromaologia 40, 351. Cortes, N., Fedel, E., Gasparoli, A., Tiscornia, E. (1977) Croniatografia liquida ad alta pressiOne (HPLC) nellanalisi degl insaponifcabili degl cli vegetali. Rh. 1/al. Soskmze Grasse 54,
16.
Cos Blanco, Al, de (1992) VI. Las grasas. Caractersticas, tipos y funcin. Alimentos ricos en grasa. Carencias y excesos. Manual de la alimemaci,; y atricin para educadores, Notigraf SA., Madrid> Craske, LtD., Bannon, C.D. (1987) Gas liquid cbroniatography of the tatty acid compositen of Leus and olis: a total system Lar high accuracy. J Am. Oil (bern. Bco. 64, 1413.
286
01/aliogrqfla.
Craske, JD., Bannon, C.D., Norman, L.M. (1988) Limitations of arnbient temperature rnetliods Lar he methanolysis of triaclyg]ycerols in the analysis of fatty acid metbyl esters with higb accuracy and reliability. j Am. 011 Chern. Soc, 65, 262. Cutly, 1, Vollbrecht, HR, Weismaller, 5. (1990) Process for the rernoval of cholesterol or cholesterol esters for egg yolk. Patente australiana n0 60836/90. Dakovic, 8., Turkulov, J., Dimic, E> (1989) Quality of vegetable ojs obtained by extraction with carbon dioxide. Fat Sct Technol 91, 116. Deifense, E> <1984) Appiication de Ja chromatographie liquide haute perforinance ~lanalyse des triglycerides des graisse vgtales a animales et de leurs fractions obtenues par cristallisation fractionne Rey [van.Corp.s Oras 31, 123 Deifense, E> (1993) Milk fat fractionation today: a review. j Am. Oil Chem. Soc, 70, 1193. de la Fuente, MA., Fontecha, 1?, Jurez, M. (1993) Fatty acid composition ofthe trigtyceride and free fatty acid fractions in dfferent cows-, ewes- and goats-milk cheeses. 7. Lebens,n.Uniers. Forscit. 196, 155. De Jong, C., Badings, Hl. (1990) Determination of Ihe Erce fatty acids in rnilk and cheese. Procedures for extraction, clean up and capiflary gas chromatographic analysis. J +1/gb Resol. Chromaogr. 13, 94. Desjeux, J.F. (1993) Valeur nutritionnelle du alt de chvre. Lail 73, 573. Dreux, M., Lafosse, M., Morin-Allory, E. (1996) Iba evaporative light scattering detector-A universal instrurnent for non-volatile solutes in LC vid SFC. (-OC Jnternational3, 148> E-Hadmy, AH., Perkins, E.G. (1981) RP-HPLC of natural triglyceride mixtures: critical pair separation. J Am. Oil (ben;. Soc. 9, 867. Evans, R., Mel-lale, W.Z (1978) Multiple forms of peotinesterase in limes and oranges. Phytochem. 17, 1073. Favati, F., King, J.W., Friedrich, SP., Eskins, K. (1988) Superoritical CO and lutein from leaf protein concentrates. J Foad Sel. 53, 1532. Fedeli, E. (1977) Lipids ofolives. Prog. Chem. FalsotherLipids 15, 57. Fogarty, WM., Kelly, Cl. (1983) 3. Pectie Enzymes. Microbial enzyrnes ciad biofechnoogy. Ed. W.M. Fogarty, Applied Sejence Publishers, iEssex, Rieno Unido. Frede, E. (1986) Improved I-IPLC separation of triglycerides by epecial tempeng procedures. (broma/ograpitia 21, 29. Friedrich, SP., List, GR. (1982) Characterization ofsoybean oil extractad by supereritical carbon dioxide and hexane. J. Agric. Food (bern. 30, 192.
287
2 extraction of carotene
Bibtlograjia.
dioxide extraction of lipid-bearing Friedrich, J.P., Pryde, EH. (1984) Supereritical carbon Oil Chem. Soo. 61, 223. rnaterials and characterization of the products. .1 Am. Niemann, L., Siekrnan, D.K. (1990) Froning, 0W., Wehling, RL., Cuppett, S.L., Pierce, MM, egg yolk using supercritical carbon Extraction of cholesterol and other lipids from dried dioxide. J FoodSct 55, 95. Froning, 0W., Fieman, F., Wehling, RL., Cuppett, S.L., Nieniann, L. (1994) Supereritical carbon dioxide extraction of lipids vid cholesterol from dehydrated chicken meat. Poulty
Sol. 73, 571.
Goiffon, J.P,, Rerniniac, C., Olle, M. (1981) Appiication de la chromatographie liquide haute performance lanalyse des triglycerides des corps gras 1 Recherche des meilleures conditions opratoires, cas de lhuile de soja. Rey. Fra,;. Corps Gras 28, 167. Gmez-Cordovs, C., Gonzlez-SanJos, ML. (1995) Interpretation of variables during the aging of red wines: relationship with families ofphenolic compounds. J~ Agrio. FoodCitem. 43, 587. Gonzles, L (1990) Contribucin al estudio de la estabilidad fisico-quimica del vino, Tesis doctoral, Universidad Politcina de Madrid Gonzles, L, Prez-Zfliga, F.J., Bravo, F. (1990) Color measurement derivatives: wines, beers and brandies. Alimentar/Cf 10, 59.
iii
fermented beverages and
Grob, K., Arito, A., Mariani, C. (1992) Determination of raifination of edible oils and fats by olefinie degradation products of sterols and squalene, using caupled LC-GC. Fol Sol. Technol. 94,
394.
Grundy, SM. (1986) Comparision of monounsaturated fatty acids and carbohydrates for iowering plasma cholesterol. New Englandjourncf 1 of medicine, 314, 745. Grundy, SM., Florentin, L., Nix, D., Whelan, MF. (1988) Comparision of monounsaturated fatty acids and carbohydrates for reducing raised levels ofplasma cholesterol iii man. American journa/ of clin/cal nulrilion, 47, 965. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., Padley, F.B. (1986) Ihe lipid handbook. Chapnian and Hall Ltd. Ihe University Press, Cambridge, Reino Unido. Gunstone, F.D., Herslf, HG. (1992) A lipid glossary. Ihe Oily Press, Alloway, Reino Unido. Gunstone, F.D. (1993a) 1. High resolution 3C NMR spectroscopy of lipids. Advances in lipid methodology - two. Ed. W.W. Christie, Pie Oily Press Ltd., Dundee, Reino Unido. Gunstone, F.D. (1993b) Information on tlie composition of fats from their high~resolutiOn 3C nuclear rnagnetic resonance spectra. J. Am. Oil Chem. Soc. 70, 361.
288
BIbIiografltr
Gunstone, FD. (]993c) Ihe composition of hydrogenated fats by high-resolution C. nuclear magnetie resonance spectroscopy. J Am. Oil Che,, Soc, 70, 965.
-
Gunstone, FD., (1994) High resolution 3C NMR. A technique for the study of lipid structure and coniposition. Prog. Lpid Res, 33, 19. Gua, M.I. (1989)111> Dairy Fats: Nutritional flashes or dietary deflghts? Faisfor tite fis/are. De Bilis Horwood Limited, Chichester, Reino Unido. Hachelaf, W., Boukhrelda, M, Benbouabdellah, M., Coquin, It, Desjeux, U., Boudraa, G., Touharni, M (1993) Digestibiiit des graisse du alt de chvre diez des enfants prsentant une mainutrition dorigine digestive. Coniparision aveo le lail de vacie. LaY 73, 593. Haenlein, G.F>W> (1995) Nutritional value ofdairy products ofewes and goats milk. Proc&olio crnd ul/Ilzation ojewes and goats milk. FIL -IDF, Creta, Grecia Hamilton, R.J. (1986) Thin layer chromatograpby and higb performance quid chromatograpliy. Analysis of ojis and faIs Ed. R.J. Hamilton, J.B. Rossell, Bisevier Applied Soience Publishers, Londres, Reino Unido, 243. I-Ianirnam, H, Sderberg, Y, Sivik, B. (1991) Physical properties of butter oil fractions cbtained by supercritical carbon dioxde exraction. Fa) Sc). Techno 93, 374. Hardardottir, 1., Kinsella, JE. (1988) Extraction of lipid and cholesterol from tlsh muscle witli superertical tluids. j Food Sol. 53, 1656. Henderson, J.M., Petersheim, M., Temp]eman, 01., Soflly, ~j. (1994) Quantitation and stnicture elucidation ofhe positional sornen ti a triacylglyceroi mixture usrng proton arid carbon one- and two-dimensional NMR. 1 Agric. FoadChear 42, 435. I-Ierslf, E., Podaha, O,, loregard, B. (1979) HPLC oftriglycerides. J Am. Oil Che,, Soc. 56, 864. Herslf, E, Kindniark, 0 (1985) HPLC oftriglycedes with gradient elution atid rnass detectian. L:ids 20, 783. Hierro, M TO., Njera, AL., Santa-Maria, 0. (1992) Analysis of triglycerides by reversed-pbase HPLC with gradien elution using a light-scattering detector. Re~ Fsp. Cieno. Teonot Aliment. 32, 635. Hierro, M>T>G. (1994) Modificacin de la grasa lctea con dixido de carbono en condiciones supercrticas, Tesis Doctoral, Universidad Complutense de Madrid, Madrid. Halen E. (1985) Rapid separation of free sterois by reversed-phase high performance liquid chromatography. J Am. Oil Che. Soc. 62, 1344.
289
B/b/logrq/Ia.
Hopia, Al, Plironen, VI, Koivistoinen, P.E., Hyvbnen, L>E.T, (1992) Analysis of lipid clasaes by solid-pliase and high performance size-exciusion chromatography. J Am. Oil Che,. Soc. 69, 772, Hopper, ML., King, JW., Johnson, J.H., Sermo, AA., Butier, RIf, (1995) Multivessel supercritical fluid extraction of feod items in total diet study. J. AOAC Jnternational 78, 1072. Boyer, GO. (1985) Extraction with supercritical fluids:why, how and so what Chem. TecA,, 15, 440> Hubert, 1., Vitzthum, 0.0. (1978) Method Lot separating caifeine from supereritical solutons> Angeii~ Che,. ini Ed. England, 17, 710. Hung, TV, Unger, MA. (1995) Cholesterol reduced egg yotk by supereritical fluid extraction.
FoadAustra/la 47, 227.
Hurst, W.J., Ajeo, MD., Martin, R.A, Jr. (1983) High performance liquid chromatography analysis ofcholesterol in milL .1 Dairy Sol. 66, 2192. Iverson, J.L., Sheppard, AY (1986) Determination of fatty acids in butter fat using temperatureprogrammed gas chromatography ofthe butyl esters. Food (bern. 21, 223. Jamaluddin, F, Mohamed, 5., Lajis, M.N. (1994) Hypogiycaemic effect ofParkia specioso seeds chic to dhe synergistic action of (3-sitosterol and sigmasterol. Food Che,. 49, 339. Jansen, EF, Jang, R., Bonner, 1. (1960) Orange pectnesterase binding and activity [aoci Res. 25, 64. Juansolo Barrenechea, MA. (1992) Estudio de los alimentos del grupo primero: lcteos. Caractersticas, preparacin, conservacin Manual de la alimentacin y nuiricin paro educadores, Notigraf SA., Madrid. Jurez, M., Ramos, M (1984) Dairy products fi-orn ewes and goats milk. Dairy industries
international 49, 20.
Jurez, M., Ramos, M. (1986) Physico-chemical characteristics of goat s milk as distinc from those of cows milk. FIL-JDF BulA. 202, 54. Jungro, Y> (1993) Extraction of EPA and DHA from turia oil using supercritical carbon dioxide. Korean j Food Sol Teebuol. 25, 288. Kalra, H., Chung, S.Y.K., Chen, Ci (1987) Phase equlibrium daLa for SC extraccin of lernon flavors and palm ols with CO2. E/udpitase equis. 36, 263. Kamihira, M., laniguchi, M., Kobayashi, 1. (1987) Sterilization of microorganisrns Wth supercritical carbon dioxide. Agrio. Biol. (bern, 2, 407.
290
JJ1 b/logrcifla.
Kankare, V., Antila, V., Harvala, T., Komppa, V. (1989) Estraction of milk fat with supereritical carbon dioxide. Milchwissensc/,af 44, 407, Kaufmann, V.w., Biernoth, O., Frede, E~, Merk, W., Prech, D., Timmen, H. (1982> Fractionation of butterfat by extraction with supercritcal carbon dioxide, KIilchw/ssensz=/zajcg 37, 92> Kemppinen, A., Kalo, P (1993) Fractionation ofte triacyglycerols of lipase-niodified butter oil. Am. 0/1 Cite,. Soc. 70, 1203>
./
Kew, T.J., Velduis, M.K. (1961) Coud stabilization in citrus juico. Patente US. 2, 995,448.
KI.rnball, DA> (1987) Debittering ofcitrusjuices using SCCO2. J Food Set 52, 481. Kntall, D. (991) 8. Juico Cloud. CUras Processing. Quah/y Control and Technology, Ed. Van
nostrand ReinhoJd, AY!, Nueva York, Estados Unidos. Kiritsakis, A.x. (1992) El aceite de oliva, A. Madrid Vicente Ediciones. Madrid. Knowles, D.E., Richter, BE., Rede, E., Merk, W., Precht, D., Tinunen, H. (1988) Supercritical fluid chrornatograpby: a new technique for AOAC. Milchwissenscbaft 71, 451. Laakso, P., Kai~, H. (1993) riacylglyceros in winter buttcrfat containing conflgurational lsomers of monoenoic fatty acids residuos 1 ]Jisaturated nionoenoic triacyglyceros. J Ant. Oil Citen;. Soc. 70, 1161> Lee, 14., Chung, B.H., Park, Y.H. (1991) Concentration of tocopherols Lrom soybean sludge by supereritical carbon dioxide. J Am. 0/1 (bern. Soc. 68, 571. Le Jaouen, J.C., Toussaint, 0. (1993) Le alt de chvre en Europe. LaY 73, 407. Levy, OC., Lichter, RL., Nelson, G.L. (1980) Carbon-i3 nuclear magnetio resonance specfroscopy, Wiley, Nueva York, Estados Unidos. List, GR., Friedrich, J.P, Pominski (1984) Cbaracterization vid processing of cottonseed oil obtained by extraction with supercriical carbon dioxide. JAm. Oil Chem. Soo. 61, 1847.
Luque de Castro, MD., Valcreel, M., Tena, MT. <1994) Anatytical superoritical fluid
extraction. SpringerLab Manual, Springer-Verlag, Alemania. Macrae, R., Dick, 1. (1981) Analysis of carbohydrates using he rnass detector. JI Chromalogr. 210,138. Macrae, R., Trugo, L.C., Dick, 1. (1982) The mass detector: a new detection system for carbohydrate and lipid analyses. C/iromatographia 15, 476. Madrid, A. (1986) Manual de industrias aiimentarias. Antonio Madrid Vicente Ediciones, Madrid. 291
Aib/iogra/Ia,
Maheshwari, It, Ooi, El., Niko]ov, it. (1995) Off-flavor removai orn soy-protein isolate by using Jiquid and supereritical carbon dioxide J An 011 Chern. Sae. 72, 3)07.
Majewski, W., Mengal, P., Perrut, M., Ecaard, JP. (1994) X. Supercritical fluid fractionation of butier oil. Snpercriiica/ fluid processing offoad and bion,ateriai~ Ed. S SM. Rizvi. Blackie Academic and Professional, Estados Unidas.
Maniongui, C., Gresti, Y, Bugat, M., Gauthier, 5., Bezard, J., (1991) Determinaban of bovine
butterfat triacylglycerols by reversed-phase chrornatograpby JI Chrornatogr. 543, 81,
Jiquid
chroniatography
and
gas
Mann, EJ. (1994) Ewes and goas milk. Dairy Industries Irnernadonal junio, 21. Maral, L., l3reckenbridge, WC,, Kuksis, A. (1969) Speciflc distribution of fatty acids itt dic milk fat triglyceride ofgoat and sheep. Lpids 4, 562, Marshall, MR, Marcy, LE., Braddock, R.Jk (1985) Bifec of total solids leve! en heat Inactivation of pectinesterase in orangejuice. JI Food Sol. 50, 220> Martnez-Castro 1, Alonso, L., Jurez, M. (1986) Gas cbromatographic analysis of free fatty acids and glycerides of milk fat using tetramethylamnionium hydroxide as catalyste. Citroniatograpitia 21, 37. Martnez-Moreno J.M., Serra-Masa, A> (1980) Composicin de las oleinas procedentes de la refinacin fisica del aceite de oliva. Grasas y aceites 31, 183.
Mattson, F.H., Grundy, SM. (1985) Comparision of tlie effects of dietary saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids on plasma lipids in man> JI. of fipid
researcb 26, 194>
McHugh, M., Krukonis, y, (1986) Superoritical fluid exraction. Principies and practices. Butterworth, Stoneham, Massachusetts, Estados Unidos. Macmillan, J.D., Sheinian, M.I, (1974) 4. Pectic Enzymes. Foodrelated enzymes. Ed. IR Whitaker. Advances in chernisty series, a symposiurn of the Division of Agricultural and Food
Chemistxy, 1 6th Meeting ofthe American Chemical Society, Chicago, Estados Unidos. Mensink, R.P., Katan, MB. (1987) Effects of monounsaturated fatty acids versus coniplex carbohydrates on ROL iii healthy men and women. Lancel 1, 122. Mertens, B., Knorr, D. (1992) Developments of nonthermal processes for food preservation. Foad Tecitnology 46, 124. Mshra, 13K, Temelli, F,, Ooraikul, B. (1993) Extraction and purification ofomega-3 fatty acids with art ernphasis on superoritical fluid extraction. A review. FoodRe& mt. 26, 217. Molin, 0. (1983) Ihe resistance Lo carbon dioxide of sorne foad related bacteria> E-nr, J AppL Microbiol. Biotechno/. 18, 214.
292
-5
Sb-hografta.
?%4ott, GE. (1986) Deferred efects of breastfeeding versus Formula feeding on serun>i lipoprotein concentracions amI cholesterol metabolism itt baboons. The breasfed infanc: a ruodel for performance. 91 conferencia Ross en investigacin peditrica, De. L.J. FUer y S.J. Fornan, Columbus, Ohio, Estados Unidos, 144.
Mourey, HM., Oppenheimer, LE (1984) PrincipIes of operation of an evaporative lightscattering detector for Jiquid chroniatography. Anal, (bern. 56, 2427.
Myher, J.J., Kuksis, A., Marai, L. (1993) Identification of the less conimon isologaus short-chain triacylg]ycerols itt te niost volatile 2.5% molecular distillate of butter oH. JI. Am. OH Citen;. Sao. 70, 1183, Neff WE., Adlof, RO, Konshi, PL, Wesleder, D. (1993) Fligh-resolution liquid chromatography ofte tricylglycerols of Vernonia galamensis and Creps alpina seed ols, J Am. Oil Citen,. Sao. 70, 449,
Nilsson, W.B., Hudson, J.K. (1993> Solubility ofsimple and mixed triacylglycerols itt superoritical CO2. JI Am. Oil Che,. Sao. 70, 749 Oakenfiill, D., Sidhu, G.S. (1992) Low cholesterol egg and daiiy products. Outlook and Agr/culture 21, 203 Oppenheiincr LE., Mourey, TEl. (1985) Examination of the concentradon response of evaporative light-scauering mass detectors. JI Chomatogr. 323, 29>7. Parodi, P.W. (1982) Positional distribution of fatty acids in trigiycerides from rnilk of several species of mamnialians. LIpids 17, 437, Patton, 5., Jensen, RO. (1975) Lipid metabolism and membrane ibnctions ofthe mammary gland. Pvog. Cite,. [cris ant? otiter L4ds 14, 163. Paul, AA., Southgate, DAT (1978) McCance and Widdowsons dic composition of foods.
Londres: HMSO, Reino Unido.
Perrin, J.L., Prvot, A. (1984) tJtilsation dun cltecteur A difibsion de la lumire dans Ianalyse des corps gras par CLHP. Rey [se, Corps Gros 31, 495. Perrin, iL., Prvot, A, (1986) Use of a laser light scattering detector ir> HiPLC analysis of fats and oUa. II Anaiysis oftriglycerides. Rey Fra,>. Corps Gros 33, 437. Pitzer, RS. (1955) Volurnetric and thermodynaniic properties of fluds (1). Thearetical bass and vinal coefficients. JI Am. Chem. Sao. 77, 3427. Pitzer, K,S., Lippman, D.Z., Cut, R.F. Jr,, Huggina, CM., Petersen, D.F. (1955) Voluwetric and thermodynamic properties of fluida (Ji). Compresibiiity factor, vapor preasure, ami entropy of vaporization. JI Am. Chem. Soc. 77, 3433. 293
Bibilografla.
Podhala, O., Tregard, B. (1982) A system for identification of triglycerides in reversed pbase HPLC chromatograms hased on equivalen carbon numbers. J High ResoL Citromatogr./Cbromato gr. Comm. 5, 553. Polak, J.T., Balaban, M, Peplow, A., Philips, Al. (1989) Supereritical carbon dioxide extraction of lipids from aigae ACS Symp. Ser. 406, 449. Pollesello, P., Eriksson, O., Kvam, B.J., Paoletti, 5., Saris, N-E,L. (1991) H-NMR studies of lipid extracts of rat liver mitochondria. Bioohem. andBiopitys. Res. (omm, 179, 904. Pretsch, E., Clerc, T., Stibl, it, Simon, w (1976) Tabellen zur Strukturantklruflg Organisober Verbindungen mit Spektroskopischer Metoden, Springer, Berlin, Alemania Ramos, M., Jurez, M. (1981) The composition ofewes and goats milk Boletn FIL-IDF 140. Ramos, M, Jurez, M. (1882) The composition and utilization ofewes and goats milk. FIL-IDE 2,318. Moscu. Ramos, M., Jurez, M (1 986a) Mtodos analticos para la identificacin de mezclas de 1-eche de diferentes especies> Revista Espaola de Lechera 7, 19. Ramos, M, Jurez, M (1986b) Chromatographic, electrophoretic and immunological methods for detecting mixtures of milks from different species. Boletin FIL -IDF 202, 175. Ramos, M., Jurez, M. (1993) Current research on goats milk in Spain. Lat 73, 417. Razafindrakoto, O., Ravelomanafla, N., Rasolofo, A., Rakotoarimatlana, R.D, Gourgue, P., Coquin, P., Briend, A., Desjeux, JF. (1993) Le lait de chvre peut-il remplacer le lat de vache chez lenfant mainutr? LaY 73, 601. Remeut, F (1993) Influence du polymorphisme gntiqu.e de la casine ~ caprine sur les caractrstiques physico-chimiques et echnologiques du iait. Lail 73, 549.
Riel, R (1991) 1. composicin y estructura fisico-quimica de la leche> Ciencia y tecnologlci de/a leche. Arniot, J Ed. Acribia, S.A., Zaragoza.
Robinson, J.L., Macrae, R. (1984) Comparisifln of detection systems for the high~perfor1flaflDe liquid chromatographiC analysis of complex triglyceride mixtures. JI. Higit Resol.
Ch,ornatogr./ChrontcttOr. (omm. 5, 553.
Roderbourg, El, Dalemans, D., Bouhon, R. (1990) Process for reducing tbe content of cholesterol and free fatty acids in an animal fat material and fat material so obtained. Patente australiana n0 51259/90. Rombouts, FM, Pilnik, W. (1980) 5. Pectio Bnzymes. Microbial enzymes md bloconversiOflS. Ed. AH. Rose, Academio Press, Londres, Reino Unido.
294
Bibliografla
Rombouts, F.M., Versteeg, C, Karrnan, 1-1., Plnik, W (1982) Pectinesterases in coniponent patt of citrus fruits related to problerns ofcloud Ioss and gelation in citms products. Use ofenzymes la
,/ood tecitnoogy, Dupuy, Ed Techique, Paris, 483.
Rouse, AH> (1951) Effect of insoluble solids and partido size of pulp cm pectinesterase activity ir> Orangejuice Fi Sta/e Hor/. Soc. Proc. 64, 162, Rouse, AH., Atkins, C.D., 1-Iuggart, R.L, (1954) Effect of pulp quantity on chemical and pliysical properties ofcitrusjuices and concentrates. FoodTechnol. 8,431> Rouse, AH, Atkins, C.D (1955) Pectinesterase and pectin in commercial citrus juices as detemiined by rnethods used at the Citrus Experiment Station. University ofFLorida Agrie. Exp. Stn, 5>70> Sacchi, Y, Addeo, F., Giudicianni, 1., Paolilio, 1,. (1990) Appiicazione della spettroscopia 3CNMR ala determinazione di znono-digliceridi de acid grassi liben nellolio di oJiva di presione e nel rettificati. Ri:4 ita?. Soslanze Grasse, 67, 245,
Sacchi, R., Paolillo, L., Giudciann, 1., Addeo, F (1991) Rapid H-NMR determination of 1,2 and 1,3 diglycerides in virgin olive oils. Itas. .1. FoodSet. 4, 253. Sacchi, R., Addeo, F., Giudicianni, 1., Paolillo, L. (1992) Analysis of the positional distribution of fatty acids in olive oil iriacylglycerols by high resolution 3C nuclear magnetio resonance of tbe carbonyl region. 1/al. J FoodSci. 4, 117. Sacchi, R, Medina, 1., Aubourg, SP, Giudicianni, 1., Paolillo, L., Addeo, F. (]993) Quantitative
high-resolution 13C NMR analysis of lipids extracted from tite withe muscle of atlantic tuna (Titunnus alalunga). J Agrie. Food (bern. 41, 1247. Saijpaul, S., Makkar, G.S., Icbhponani, J.S. (1994) Technologies for low-cholesterol eggs and
dairy products. India Foodlndustry 13, 46. Schneder, G.M., (1978) Physicai-chemical principIes of extraction with above-critical gases> Angew. (beni. 90, 762.
Seflorns, Fi., Tabera, J., Herraiz, M. (1996) Rapid separador> of free sterols ir> edible oils by onUne coupled reversed phase liquid-chromatography-gas chromatography. JI Agrie. Food
Citen. (en prensa).
Seymour, lA., Preston, J.F., Wicker, L., Lindsay, JA., Marsball, M. (1991a) Purification and properties ofpectinesterase ofMarsh Grapeftuit pulp. J Agrie. Foad Chen;. 39, 1075.
Seymour, lA., Preston, LE., Wicke~ L, Lindsay, LA., Wei, C., Marshall, M.R. {19911j Stability of pectinesterase ofMarsh white grapeftuit pulp. JI Agrie. Food Chem. 39, 1080.
Shantha, NC., Napolitano, GE. (1992) Gas chromatography offatty acids. JI Chrorna/ogr. 624, 37, Sheppard, A.J., Iverson, J.L. (1975) Esterification of fatty acids for gas-liquid chroniatograplic analysis. JI Citroma/ogr Sai. 13, 448.
295
BibIiografta
Shishikura, A., Fujirnoto, K., Kaneda, T., Aral, K., Salto, 5. (1986) Modification of butter oil by extraction with supercritical carbon dioxide. Agrie. BioL Che,. 50, 1209. Shukla, A, Bhaskar, AR., Rizvi, S.S>H>, Mulvaney, S.J. (1994) Pbysicochemical and rheologcal properties of bulter made from supercriticai fractionated mi)k fat. J Dairy Sol. 77, 54. Sickinger, K. (1975) Clinical aspects amI therapy of fat malassimilation with particular reference
to te use of medium chain trigiycerides. Pie role of Eats in human nutrition. De. Al.
Vergroesen, Academic Press, Londres, Reino Unido, 116.

Sidisky, L.M., Ridley, Hl. (.1991) lemperature dependence of equivalent chain length values en capillary columns ofdifferent polarity. .1. Jiigb Resolul. Citrornatogr. 14, 191. Sigmund, PM., Trebble, MA. (1992) Phase behaviour prediction in supercritcal systems usng generalized soluto critical properties. Can JI (he,. Eng. 70, 814. Sim, JS, Bragg, DE. (1977) Effect of the dietar> factors en serum and egg yollc cholesterol levels of laying hens. Pod/rySci. 56, 1616. Snir, R., Koehjer, PE., Sinis, KA., Wicker, L (1996) Tota] and hermostab]e pectineserase ir> citnis
juices JI FoodSci? 61, 379. Snyder, J.M., Friedrich, IP., Christianson, D.D. (1984) Effect of moisture and particle size of tite extractability ofoils from seeds with supercritical CO=. JI Am. Oil Chem. Soc. 61, 1851.
Sparling, ML., Zidovetzk, R., Muller, L., Chan, S.l. (1989) Analysis ofmembrane lipids by 500 MHz El NMR. Ana/y/lecH Biochernisfty, 178, 67. Staby, A., Borch-Jensen, C., Balchen, 5., Mollerup, J. (1994) Quantitative analysis of marine cilla by capillary supereritical fluid chromatography. Chrornatograph/a 39, 697. Stahl, E., Schuetz, E., Mangoid, H.K. (1980) Extraetion of seed olis with liquid and supercriticai carbon dioxide. .1. Agrie. Food Chern. 28, 1153.
Stahl, E, Quirin, KW., Gerard, D., (1987) Verdich. Gase Zur Extrackt. Raifina, Springer, Berlin,
Alemania.
Stolyhwo, A., Coln, El., Chiochon, 0(1983) Use of tight scattering as a detector principIe lii liquid chroniatography. JI Chroma/ogr. 265, 1 Stolyhwo, A., Colin, H., Martin, M, Guiodon, 6. (1984) Study of tite quantitative properties of the Jight-scattering detector..! Chroma/ogr 288, 253. Stolyhwo, A., Colin, H., Guiechon, 0. (1985) Analysis of triglycerides in olis and ata by liquid chromatography with laser light scattering detector. Anal. (bern. 57, 1342.
296
Bibliografla
Stolyhwo, A., Martin, M., Guiochon, 0. (1987) Analysis of iipids classes by HPLC with Orn evaporative !ight scattering detector. JI Liquid chromaogr, 1237.
Sutter~ L.ED.N, Silva, M.F.F., Cassel, E. (1994) Superoritica] extraction, a new industrial technology. Ciencia e tecnologia de ahmenros 14, 3
Sze, D.Y., Jardetzky, 0. (1990) Characterization of lipid composition ir> stimulated human lymphocytes by 2H-NMIR. Biochindea el Biopbysica Acta, 1054, 198.
Takahashi, K., Hirano, T., Saito, M (1988> Application of partition chromatographic theory lot the analysis of marine triglyceride molecular species. Nippon Suisan Gcrkkaishi 54, 523>
laniguchi, M., Tsuji, 1, Shibata, M, Kobayachi, T. (1985> Extraction of oils from wheat gerni with supercritical carbon dioxicle. Agric. Rio!. Chem 49, 2367.
laniguchi, M., Kamihira, M., Kobayashi, T. (1987) Effect oftreatment with supercriticai carbon
dioxide on enzymatc activty. Agrie. Rio!. Citen;. 2, 593. Temelli, E. (1987) SCCO 2 extraction of terpernes froin cold pressed valencia orange oil.
Conferencia Ph.D. Universidad de Florida, Gainesville, Estados Unidos.

Temell, E., Chen. C.S., Braddock, R.J. (1988) SCCO2 extraction itt citrus oil prooessing Food Icbnot 8, 145 Temell, F., LeS Jane, E., Long, E (1995) Supercriticai CO2 extraetion of oil frorn Atiantio rnackerel (Sconu5er seonibrus) aid protein tbnciaonality> J Food Set 60, 703
Timrns, RE., (1989) XVII. Pie possibiiities Lot using modifled milk fats iii te production of confectionary fats, shortenngs and spreads [cris for (he ./ture. Ed. Bilis Horwood Limited, Chichester, Reino Unido> Ting, 5V., Rouseff, RL. (1986) Citrus Fuits aid Iheir Products, Analysis, Techonology, Marcel Dekicer, Inc., Nueva York, Estados Unidos
Tirtiaux, F. (1976) Industrial fractionation of fats Uy controlled crystallization> Olagineux 31,
279> Utrilla, R.M., Jurez, M., Martnez-Castro, 1. (1976) El factor tiempo en la conversin de grasa en steres metilicos. Grasas y aceites. 27, 323. Varsel, C. (1980) Citrus juice processing as related to qualit> and nutrition. Citnis Nutrition amI Qualty. 5. Nagy y JA. Ataway, eds. ACS Symposion series, 145, Washington, D.C., Estados Unidos. Vzquez Martnez, C. (1992) 1. Problemas de las sociedades desarrolladas en relacin con la nutricin. Manual de la alimenlaeiQ y mflricwn para educadores, Notigraf 5. A,
Madrid.
297
Bibliografla,
Vega, P.J., Shns, C., OKeefe, 5, Balaban, M.O. (1995) Supercritical carbon dioxide e>dracti.on efficiency of carotenes from carrots IFTAnnucdMeellng 1995 Pster Veisseyre, R. (1980) 1 Caracteres, composicin y estructura de Ja leche, Lcrctologic lenica, Ecl Acribia, Zaragoza.
Versteeg, C. (1979> Pectinesterase from te orange fivit - their purification, general characterisdos aix] juice colud destabilizing properties. Agrio. Res. Rep 892, Purdee, Wageningen, Netlierlands,
Versteeg, e., Rombouts, F.M, Pilnik, W (1978> Purification md sorne charactiristics of twa pectienesterase isoenzymes from orange. Lebesniuel-Wisseuschcft md Teclmologie 11, 267. Versteeg, C, Rombouts, F.M., Spaasen, CH., Pilnik, W. (1980) Themicstabiliy asid orange juice c!oud destabilizing properties ofmuitiple pectinesterase fien orange. JI Food Sol. 45, 969 Wada, 5, Koizumi, C., Nonaka, J. (1977) Ana[ysis of triglycerides of soybean oil by high performance liquid chromatography ir> combination with gas liquid chromatography. Yukagaku 26, 95. Wada, 5., Koizurni, C., Takiguchi, A, Nonaka, 5. (1978) A study en triglyceride composition of lipid from commercial beef by high performance liquid chromatography. Yukagaku 27,
579>
Walker, EL (1992) Optirnization of extraction ant] puriflcation of pectinesterase from Florida oranges, MS Tesis, Dep.. of Foc Selence ant? Human Nuirilion, Universidad de Florida, Gainesville, Estados Unidos.
Walstra, 1., Ilenness, R. (1984) Dair> Chemistry ami PIxysics. John Wiiley ami Sons, Nueva York, Estados Unidos, Wamer, K., Mounts, TL. (1990) Analysis oftccopherols ami phytosterols in vegetable olis bi HPLC with eveporadve light-scattering detection. JI Am. Oil Cbem. Sao. 67, 827. Webster, L.J. (1995) Total fat analysis: 5FF is setting fue standard. World ql Ingredients 5,46. Weidner, E., Zhang, Z., Czech, B., Peter, 5. (1993) Deoiling of crude lecititin with propane. [c/i Wissenscbafi md Teclinologie 95, 347. Wicker, L., Temell, F (1988) Heat inactivation ofpectinesterase ir> orangejuice pulp. JI Food Sol. 53, 162> Worthngon, RE,, Hitchcock, ML. (984) A method for the separation of seed oil steyl esters and free esterois: application to peanut aid com ojs. JI Am Oil Chem. Sao. 61, 1085. Wright, J.L.C., Mclnnes, A.G, Shimizu, 5., Smith, DG., Walter, JA. (1978) Identiflcation of C24 alkyl epiniers of marine sterols by 3C nuclear magnetio resonance espectroscopy. Can J (bern. 56, 1898. 298
Bb/ogrq/la.
Wright, 8W., Wright, C.W, Gale, RW., Smith, RD. (1987) Analytical Supereritical fluid extraction of adsorbent materials. AnaL Cben,. 59, 38> Wu, Y.V, Friedrich, LP., Warner, 1<. (1990) Evaluation of corn distillers dried grans defatted with supercritical carbon dioxide. Cereal Citem. 67, 585. Wu, Y.V,, King, J.W., Warner, K. (1994) Evaluador> of corn gluten meal extracted with supercritical carbon dioxide and other solvents: flavor and composition Cereal Che,. 71, 217. Yamaguchi, K., Murakami, M., Nakano, El., Konosu, 5., Kokura, T., Yanamoto, FI., Kosaka, M, Hata, K (1986) Supercritical carbon dioxide extraction of oils from Antaretie krills. JI Agrie. Food (bern. 34, 904.
Yener, SM. (1989) Milk production froni goats. Le laY dans la rgion rndduterranenne. Op/loas
n;diteranennes. Centre International de Hautes Etudes Agronomiques Mediterranennes
(CIHEAM) srie sminaires 6, 149. Yu, iR, Rizvi, 5>511., Zollweg, lEA. (1992) Fluid-liquid equilibria of anhydrous milk fat wit supercritical carbon dioxide .1. Supererltical Fl-uids 5,123.
Zadow, JO., (1988) Fermentation ofwhey ant] permeate. Bu/A ini. Da/ry Fed 233, 53 Zamora, R., Navarro, JL, Hidalgo, F.J. (1994) Identification and clasitication of olive ols by high-resolution 13C nuclear magnetie resonance. .1. Am. Oil Chern. Soc. 71., 361. Zeniel, GP. (1989) Low pH inactivation of polyplenoloxidase. M. Sc Tesis. Universidad de
Florida, Gainesville, Estados Unidos.
Zhao, W, Shishikura, A, Fujimoto, A., Aral, K., Salto, 5. (1987) Fractional extraction of rice bran oil with supercritical carbon dioxide. Agrio. Rial. Citen,. 51, 1773. Zosel, K (1978) Method for removing caffeine from coifee. Patente alemana 2.732.103.
299
Anexos.
ANEXO 1
10 CLS REM************randonigradienteeisocraticoprimeros***************** 20 OPTIoN BASE 1 30 N 30: TNPUT NUMERO YNOMBREDELAFRACCION; 5<, X$ 40 DIM As(N), D(N, 2), AGT(N), CONC(N, 2), 17(N), PAG(N)
50 PR>INT - INDICA EL AREA DE LOS SIGUIENTES ACDOS GRASOS 60 PRJiNT EN NUMERO DE CUENTAS 70 FOR 1 1 TO N: READ A$(I), D(I, 1), D(I, 2) 80 PRTNT A$(I), D(I, 1), D(1, 2): INPUT AREA; AGT(I) 85 NBXT 1 92 CLS : Y x * 40/60 + 13 + 1/3 93 INPUT AREA DEL PATRON INTERIO EN NUMERO DE CUENTAS; API 94 INPIJT CONCENTRACION DE PATRON INTERNO; CPI 95 ECNmjn = (LOG((Y - 2.8297) /2.8297)! LOG(10) + .81143 .0289) .06025 96 ECNrnax (LOG((Y - 28297 + 2/3) /2.8297)/LOG(10) + .81143 + .0289)/.06025 109 FORI= 1 TON 110 IP 1 1 THENF(I)= 238: 0010 118 111 ff1 2 TREN F(I) >476: 0010 118 112 IP 1 = 3 TREN F(I) .623: GOTO 118 113 fF1 =23 THIENF(I) .914: GOTO 117 114 IP 1 = 25 TI-liEN 17(1) .868: 0010 117 115 1117 1 27 TREN F(1) .87 ELSE F(I) = 1 1117ff 1 = 23 OR 1 = 25 OR 1 = 27 TREN CONC(1, 1) AGT(I) * CONC(15, 1) (AGIOS) 17(I)): COTO 119 118 CONC(I, 1) AGT(1) * CPI 1 (API * 17(1))
-
119 NEXTI 140 CLS

150 FORI= 1 TON 155 POR J=I TON 160 POR 10 = STO N 163 TRGO(J) = D(I, 1) + D(J, 1) + D(I0, 1): TRGO(2) D(I, 2) + D(J, 2) + D(I0, 2) 165 ECN = TRGO(1) - 2>12448 * TRGO(2) 170 IP ECN > ECNmin ANIS ECN <ECNmax TREN CONC(1, 2) CONC(1, 1): CONC(J, 2) CONC(J, 1): CONC(I0, 2) CONC(I0, 1)
175 NEXT 10
180 NEXTJ 181 NE.XTI
182 Z$
B:\FV + X$: OPEN O, #], Z$
183 FOR 1 = 1 TO N: WRITE #1, A$(I), D(I, 1), D(I, 2), AGT(I), CONC(I, 1), CONC(I, 2), F(I): NEXT 1 184 WRITE #1, API, CH
185 GLOSE 1
210 TCONC
= =
O
= =
220 FOR 1= 1 ION: TCONC TCONC + CONC(I, 2): NEXT 1 230 FOR 1 1 TO N: PAG(I) (CONCQ, 2)! TCONC) * 00 240 NEXT Y 241 LPRINT FRACCION; X; ELUCION A LOS; Y; MINUTOS 300
242 LPRINT ECNmn=; ECNmin; ECNm &, ECNmax 243 LPRIINT AREA DE PATRON INTERNO ,API, CONCENTRCION DE PATRCY44 INTERNO: CPI 250 LPRINT: LPRJNT TRIOLICERIDO; TAB(33); NC; TAB(39>; WDEII. TAB(46k ECN; TAB(57); %; : LPRINT 260 FOR 1 1 TO N 270 FOR J 1 TO N 280 FOR 10 .1 TO N 290 TRG$ A$(J) + A$(J) + A$(10) 320 117 J ITHEN 360 330 IF 10 J THEN RES (PAG(I) PAG(J) PAG(10)) /(1000<)) tSE RES (PAQ<T) PAG(J) PAG(I0) 3)/(10000): (lOTO 370 360 lE 10 J THEN RES (PAG(l) PAG(J) PAG(I0) 3)/(10000) ELSE RES (PAC)(I) PAG(J) * PAG(l0) * 6)/(10000) 37OIFRES<l THEN4IO 375 ECN (D(l, 1) + D(J, 1) + D(l0, 1)) -2>12448 (DQ, 2) + D<J, 2) + DQO, 2>) 380 IF ECN < ECNmIn OR ECN> ECNmax TREN 410 400 LPRJNT TAB(4); TRG$; TAB(32); TRGO(l); TAB(39). TRGO<2t TAB(43); EGN; TAB(55); RES 410 NEXT 0 420 NEXT J 430 NEXT 1 440 DATA C4:0 ,4,0,C6:0 ,6,0,C8 O ,S,0,CIO:0 ,10.0$CIO:I e,I0,17C120 tIZO tl$.O,tlS:O 450 DATA C13:0 130040 ,14,0,C14 1 ~,I4,l,Ri.Cl5:0~,t5,O,~4Ai~CI50 15,0 460 DATA CIS:l 45,1,C16:O ,i,0,CI:0 #160MC16:l ~.l6,I,Cl6 I(fl.),16,i,i. C17:0 .17,0 470 DATA ai-C17:0 ,17,0,C17:0 ,17,0,C17 1 ,I7,1,~Cl8 O tlS,0$CIS:l(O) Ufl) 480 DATA CE: 1(V) ,8,I,C18:2(L) ,18,27C19 O ,l9,O7CIS:3(I&n> ,1L3 490 DATA ctcC 18:2 1 8,2,C20:0 ,20,0,C20: ,20, 1 700 EMO
; = = = = * * * * * = = * * * * = * , ,
e
IOCLS
20 OPTION BASE 1 30W = 30: INPUT NUMERO Y NOMBRE DE LA FRACCION. X, X$ 40 DIM AsN), D(N, 2), AGT(N), CONC(N, 2), P(N), PAG(N) 50 PRINT INDICA EL AREA DE LOS SIGUIENTES ACIDOS CRASOS 60 PRINT EN NUMERO DE CUENTAS 70 POR 1 1 TO N: READ A$(l), D(l, 1), 0(1,2) 80 PRINT A$(I), 0(1, 1), D(I, 2): INPUT AREN; AGTQ) 85 NEXT l 92 CLS : Y = x * 40/6013 + 1/3 93 INPUT AREA DEL PATRON iNTERNO EN NUMERO DE CUENTAS. API 94 INPUT CONCENTRACION DE PATRON INTERNO; CM 95 ECNmin (LOG((Y - 28297>/ 2>8297)1 LOG{IO>- 720%- 0151)101919 96 ECNmax =(LOG((Y -28297 +2/3)/28297)ILOG<l0)-. 72093 * 0151>/ 01919 [09 PORI= ITON [10 IF 1 = l THEN F(1) = 238 (lOTO lIS III IF 1 = 2 THEN F(1) =476 (lOTO lIS 112 IF 1 = 3 TREN F(1) = 623 (lOTO lIB 113 IP 1 = 23 TREN F(I) .914: (lOTO 117 114 IP 1 = 25 THEN F(I) 868: (lOTO 117 115 IP 1 = 27 TI-LEN P(I) 87 ELSE F(I) 117 IP 1 = 23 OR 1 = 25 OR 1 27 TREN CONC(I. 1) AGT(I> * CONC(IS. 1>/(A01415)t
-
F(1)): COTO 19
liS CONC(I. I) = AGT(I) * CPI 1 (API * P(T)) 119 NEXT 1 140 CLS 150F0R1 ITON 155 PORJ= ITON 160 POR 10 = J TO N 165 ECN = (0(1, 1) + D(J, 1) + DOC, 1)) -2 [4747* <XI, 2) + EX>. 2) + NI .2 170 IP ECN > ECNrnin ANO ECN < ECNmaX TREN CONCO. 2) ~ONCQ 1> CONC(J, 2> CONC(J, 1) CONCO0, 2) = CONC(I0, 1) 75 NEXT 10 180 NEXT J 181 NEXT 1 82 Z$ [3 \PV + X$- OPEN O. al. 21$ 183 POR 1 1 TO N WRITE $11. A$(IX 0<1. It XI. 2>. AGTUt CONCO. [>,CONC(L 2~ F(l) NEXT 184 WRITE fI, API. CPI 185 CLOSE 1 210 TCONC =0 220 POR 1 1 TO N TCONC TCONC + cONttL 21 ?4EXT 230 POR 1 L TO N PAG(t) (CONC(I. 2)1 TtONc) 1W 240 NEXT 1 ELUCION A L&St Y, MINUTOS FRCCION, X; 241 LPRINT ECNm x . ECNat ECNmiW~ ECNmift, o 242 LPRINT
-
iv
Anexos.
243 LPRINT AREA DE PATRON INTERNO: ; API; CONCENTRACION DE PATRON INTERNO: ; CH 250 LPRINT : LPRINT TRIGLICERIDO<; TAB(33); NO; TAB(39); <DE; TAB(46); ECN; TAB(57); %; : LPRINT 260 FOR 1 1 TO N 270170RJ=ITON 280 FORJO = 5TO N 290 TROS = A$(I) + AS(S) + 320 IP J <o> ITHEN 360 330 IP 10 = 5 TREN RES (PAG(I) * PAG(J) * PAG(I0)) (1 0000) ELSE BES (TPACI(I) * PAG(J) *PAG(I0) * 3)/(10000>: GOTO 370 360 IP 10 = 1 TREN RES = (PAG(I) * PAG(J) * PAG(I0) * 3) 1(100 00) ELSIE RES =(PAG(I) * PA(l(J) * PAG(I0) * 6)1 (10000) 370 IFRES<i TH?EN4IO 375 ECN= (D(I, ])-1-D(J, 1) -i-D(I0, 1)) -2.14747 * (13(1, 2)+D(J,2)+D(I0, 2)) 380117 BON < BONmin OR ECN> iECNmax TI-lEN 410 390 TRGO(]) = D(I, 1) + D(IJ, 1) + D(10, 1): TRGO(2) D(I, 2) + D(J, 2) + D(I0, 2) 400 LPRIINT TAB(4); TRG$; TAB(32); TRGOQ); TAB(39); TRC3O(2); TAB(45); ECN; TAB(55); RES 410 NEXT lO
420 NEXT J 430 NEXT 1 440 DATA 04:0 ,4,O, 06:0 ,6,0,C8:0 ,8,0,CIO:0 ,l0,0,CIO:l ,10,1,C12:0 ,12,0 450 DATA C13:0 13,0,<C14:0 ,14,0,<C14:1 ,14,1,iCIS:0 15,0,aiC15:0 <%15,0,C15:0
<,
45,0 460 DATA 015:1 ,15,1, 1 CI:0 %16,0,CI:0 ,16,0,C16: 1 tlb,I,<C16: l(Pa) <,16,t,<i
017:0,17,0
470 DATA al-CI 7:0 ,17,0,C17:0 ,17,0,CI 7:1 ,17,1,CIS:0 , 18,0,<CIS: 1(0)1,18,1 480 DATA 018:1(V), 18,1,018:2(L) ,18,2,C19:0 ,19,0,C] 8:3~Ln) ,18,3 490 DATA ctcC]8:2 ,18,2,C20:0 ,20,0,C20:1 ,20,l 700 END
ANTERIOR
303

Aplicacion CO2 Supercritico

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Aplicacion CO2 Supercritico

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Aplicacion CO2 Supercritico

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

7

APLICACION DEL DIOXIDO DE CARBONO SUPERCRITICO AL PROCESADO DE

ALIMENTOS: NATA, SUBPRODUCTOS DEL REFINADO DE ACEITES VEGETALES Y ZUMO DE NARANJA

U~c /: Sn Dr /~jzr-/9 /!Ch~ Li

PEDRO RUIZ SALA Madrid, 1996

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

PEDRO RUIZ SALA Madrid, 1996

Guillermo Santa-Maria Blanco

Tambin me gustara expresar mi agradecimiento:

ESTIMACIN DE LA COMPOSICIN EN TRIGLICRIDOS DE LA GRASA LCTEA

2.2. MATERIALES Y MTODOS 2.2.1. Preparacin de la muestra

2.2.6. Estimacin de la composicin en triglicridos de la grasa lctea de leche de oveja 78

2.2.7. Comparacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de oveja, cabra y vaca 79

2.3. RESULTADOS Y DISCUSIN

2.4. MATERIALES Y MTODOS

128 128 130 130 135 137 142 147

ANLISIS POR ESPECTROMETRIA DE 3C-RMN

2.6. MATERIALES Y MTODOS 2.6.1, Preparacin de la muestra y extraccin de la grasa de la nata

2.7. RESULTADOS Y DISCUSIN

2.7.1. Anlisis de los extractos mediante espectrometra de resonancia magntica nuclear de 3C

164 164 164 165 166

ANLISIS DE LOS COMPUESTOS DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE DEL DESTILADO

LQUIDA DE ALTA EFICACIA

168 168 169 170

3.3. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.3.1. Anlisis cualitativo

3.5. RESULTADOS Y DISCUSIN

225 225 225

3.6.3. Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin del desfilado de la

desodorizacin de aceites vegetales 3.6.4. Modificacin del equipo de extraccin

229 229 229

4.2. MATERIALES Y MTODOS 4.2.1. Preparacin de la muestra

4.3. RESULTADOS Y DISCUSIN

LOS CIDOS GRASOS

al = ante/so alMa aPd br Bu Ca

ramificado Butrico Cprico 4:0 10:0 8:0 6:0

Destilado de la desodorizacin de aceite de oliva

ster metilico de los cidos grasos

HPLC = Cromatografa lquida de alta eficacia MUFA MS NC ND

cido graso monoinsaturado

Espectrometra de masas Nmero de carbonos Nmero de dobles enlaces

Nmero equivalente de carbonos

Nmero terico de carbonos

TIC = Corriente total de iones UFA

cidos graso insaturado

Captulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercr(ticos

Captulo 1. introduccIn, Extraccitin confluidos superoriticos.

1.1- FLUIDOS SUPERCRTICOS

1.1.1- Definicin de fluido supercrtico

Tabla 1.1.1. Condiciones crticas de varios solventes Compuesto

Captulo i. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.

Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercritlco&

1.1.2- Propiedades de losfluidos supereriticos

Captulo 1. introduccin. Exlraccicin confluidos supercriticas.

buenas caractersticas dinmicas

muy baja tensin superficial

Figura 1.1.2a. Caractersticas principales de los fluidos supercrticos.

Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.

1.1.3- Principios de la atraccin supercrftica

1. menores tiempos de extraccin,

Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.