UNIVERSIDAD EL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA1
VI SEMESTRE
GUA No 5
BIOPROSPECCIN DE MICROORGANISMOS: AISLAMIENTO,
PURIFICACIN Y CONSERVACIN

1. INTRODUCCIN
A nivel mundial las empresas de carcter agroindustrial evidencian un crecimiento productivo
que impacta positivamente la economa de los pases, sin embargo durante la ejecucin de sus
procesos, generan a diario una cantidad importante de residuos. Muchos de estos residuos son
aprovechados por diversas especies de microorganismos, quienes haciendo uso de sus procesos
metablicos obtienen los recursos necesarios para su crecimiento poblacional.
Teniendo en cuenta lo anterior, es importante la caracterizacin microbiolgica de estos residuos,
ya que muchos de los microorganismos presentes en ellos exhiben caractersticas de inters
industrial como por ejemplo, actividad proteoltica, lignoltica, antimicrobiana, insecticida, entre
otras; que pueden ser aprovechadas en diversas aplicaciones agrcolas, industriales, sanitarias,
farmacuticas etc. Esta bsqueda sistemtica de organismos completos (o componentes naturales)
de la biodiversidad para darles un valor comercial en el desarrollo de productos, es lo que se
conoce como bioprospeccin. Estos productos tienen aplicacin en diferentes industrias como
farmacutica, biotecnolgica, medicina botnica, agro-insumos, etc. (Duarte y Vehlo, 2009)
En este sentido, el desarrollo de la microbiologa ha generado un impacto importante en
campos como los que se describen a continuacin:

Microbiologa de alimentos: que estudia los microorganismos como productores de alimentos

y como agentes de deterioro de los mismos. En el primer caso selecciona, mantiene, y mejora
microorganismos tiles en la generacin de productos alimenticios con nuevas caractersticas
sensoriales; es decir, modificacin de texturas, generacin de aromas y sabores. Mientras que
el segundo aspecto, se encarga de desarrollar mecanismos para prevenir y controlar el
contacto de microorganismos con los alimentos.

Microbiologa industrial: encargada de estudiar y manipular los microorganismos a gran

escala para la produccin de compuestos como materia prima o para la obtencin de
frmacos, vacunas, disolventes orgnicos e insumos alimentarios. Por ejemplo la protena
unicelular utilizada en la alimentacin animal, la produccin de alcohol, la generacin de
cidos orgnicos, entre otros.

Microbiologa mdica: estudia e identifica los agentes causantes de enfermedades, sus

posibles mecanismos de accin y mtodos de control.

Elaborada por: Ing. Jos Luis Hoyos Concha. Esp. Biotecnologa. M.Sc. Est. Doc. Ingeniera de Alimentos. Docente.
Actualizada por: Ing. Remigio Yamid Pismag Portilla. M.Sc. Ingeniera de Alimentos. Docente.
Bilogo Ivn Otero Ramrez. Est. Maestra Microbiologa Agroindustrial. Docente
Ing. Roco Bonilla Mndez. M.Sc. Diseo y gestin de procesos. Docente

Microbiologa agrcola: estudia los procesos microbianos tiles para el crecimiento de las
plantas, as como las enfermedades causadas por microorganismos fitopatgenos (hongos,
bacterias, virus, viroides, entre otros) y sus posibles mecanismos de control.

Microbiologa sanitaria y ambiental: desarrolla procesos de ingeniera y microbiologa a gran

escala para el tratamiento de residuos y descontaminacin de los ecosistemas.

Microbiologa del agua potable: investiga y aplica mtodos para eliminar microorganismos
patgenos en redes de agua.

1.1 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Con el fin de obtener los microorganismos que son de inters para el investigador, inicialmente es
necesario suministrar la muestra problema, la cual posee una carga de clulas microbianas viables
(cultivables) y aquellos que no se pueden reproducir en un medio de cultivo; de igual modo es
necesario tener claro los factores ambientales como temperatura, pH, contenido de humedad,
requerimientos nutricionales especficos (sustrato) para el crecimiento de estos microorganismos.
Con respecto al sustrato, se puede establecer la existencia de una gran variedad de medios de
cultivo, disponibles para el desarrollo selectivo o no de los microorganismos. Pero como el
objetivo es iniciar con un proceso de aislamiento de los microorganismos de inters, es
indispensable que dichos sustratos, aporten nutrientes para la obtencin de energa y desarrollo
selectivo de los mismos. Todos estos componentes, deben proporcionar las condiciones ptimas
para que los microorganismos sean capaces de conformar estructuras que les permitan
multiplicarse.
Una vez definidas las condiciones de sustrato y ambientales requeridas por el grupo de
microorganismos a aislar, se procede a realizar la siembra. En trminos microbiolgicos, se
entiende por SIEMBRA al proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de
microorganismos (inculo), desde un cultivo bacteriano (muestra problema) a un medio nutritivo
para su crecimiento. Entre los mtodos utilizados para el aislamiento de microorganismos se
encuentra las diluciones seriadas y siembra en placa.
El mtodo de las diluciones seriadas consiste en tomar una alcuota conocida de la muestra
problema y diluirla en proporciones fijas, hasta obtener varias diluciones en serie, donde se asume
que en cada muestra existe una proporcin conocida de microorganismos cuantificables por
mililitro. Es importante aclarar que cada muestra debe ser inoculada en medios adecuados para
favorecer su desarrollo y posterior aislamiento.
Siembra en placa: tcnica utilizada para hacer el aislamiento y recuento a partir de diluciones
seriadas. En este mtodo se usa principalmente cajas petri con agar slido previamente preparado,
en el cual se vierte una pequea cantidad de dilucin problema y se esparce con la ayuda de
perlas de cristal. En ocasiones se emplea agar en doble capa, donde el medio de cultivo debe estar
fundido y a 45C, se agrega 1ml de la dilucin a sembrar, realizando una breve agitacin. Una
variacin de estos mtodos, es que dicha dilucin se coloca en el centro de la caja de Petri estril,
se adiciona el medio de cultivo en la caja y se homogeniza con movimientos giratorios
horizontales y verticales, teniendo cuidado de no formar burbujas, finalmente se deja solidificar y
se procede a incubar.

1.2 CARACTERSTICAS MACROSCPICAS DE LAS COLONIAS BACTERIANAS

Una vez realizado el proceso de aislamiento en medios slidos, las bacterias forman estructuras
visibles denominadas colonias. Como regla general cada especie forma siempre en el mismo
medio colonias semejantes. Por tanto, los rasgos de las colonias son importantes para su
identificacin primaria; algunas de las caractersticas que permiten diferenciar una colonia se
muestran a continuacin:
Tamao: Puntiformes si son extremadamente pequeas. En adelante se miden y reporta el tamao
en milmetros (Pequea < 1 mm, mediana entre 1 y 4 mm, grande 4 mm >).
Elevacin: plana, elevada, convexa, umbilicada, cncava, etc.
Borde o margen: entero, irregular, dentado, lobulado, ondulado, filamentoso, etc.
Superficie: lisa o rugosa.
Consistencia: filamentosa, cremosa, seca o pulverulenta.
Propiedad ptica: brillante, opaco, translucida.
Color: amarillo, verde, rojo, blanca, etc.
1.3 PURIFICACIN
En biotecnologa, se recurre a una tcnica esencial de microbiologa para la obtencin de cultivos
puros, a partir de los cuales es posible analizar el comportamiento microbiano de una forma
precisa y selectiva.
El cultivo puro es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que
presumiblemente se ha obtenido a partir de una misma clula; cada uno de los cultivos puros que
componen una especie se denomina cepas.
Para la obtencin de cultivos puros se pueden utilizar varios mtodos que van desde el
aislamiento de una sola bacteria utilizando micro pipetas, diluciones seriadas, aislamiento por
agotamiento o utilizacin de medios de cultivo selectivos entre otros. La tcnica ms empleada en
microbiologa para procesos de purificacin es el agotamiento.
La siembra por agotamiento consiste en tomar una nueva caja de petri con medio slido, en la
palma de una mano, ligeramente inclinada muy cerca de un mechero. Con la mano contraria, se
maneja el asa previamente esterilizada y con ella se recoge el material de cultivo de la primera
siembra en placa. Se trazan estras paralelas hasta la mitad o tercera parte de la caja; luego se
flamea el asa, se gira la caja y se hacen estras en la misma forma hasta la mitad de la superficie
libre; se flamea nuevamente el asa y se hace girar la caja; se trazan estras perpendiculares a las
anteriormente trazadas en el cuadrante libre. Se esteriliza el asa antes de descartarla. El
procedimiento descrito se observa en la Figura 1.

Figura 1. Siembra por agotamiento

Observe que en el punto 3, la formacin de colonias es mucho ms clara y completamente

definida, este es el resultado deseado en el mtodo por agotamiento, el cual permite hacer la
purificacin del microorganismo objeto de estudio.

1.4 DESCRIPCION MICROSCPICA

Una vez se obtiene el cultivo puro se pueden realizar una serie de tinciones que permiten
diferenciar an mejor los aislamientos obtenidos as como tambin, verificar la pureza de cultivo
obtenido para proceder a otras actividades de inters para el investigador o el empresario.
Entre las tinciones ms utilizadas se puede mencionar: tincin de Gram, tincin de cpsulas y
esporas (para bacterias), tincin con azul de lactofenol (para hongos) y tincin con azul de
metileno (para levaduras).
1.5 CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS
En condiciones naturales cuando se agotan las fuentes nutritivas o bajo condiciones adversas, los
microorganismos paralizan o atenan su metabolismo, entrando en un periodo de dormancia. A
este fenmeno descrito se le ha denominado microbiostasis o hipobiosis. Cuando las condiciones
vuelven a ser favorables o existe una nueva fuente nutritiva el microorganismo inicia nuevamente
su desarrollo. Bajo este concepto la conservacin de microorganismos in-vitro ha intentado copiar
este procedimiento, sin embargo, no existe un mtodo de conservacin perfecto (Hernndez y
Loaiza 2014).
La conservacin de la biodiversidad microbiana autctona se debe dirigir a mantener viables y
estables fenotpica y genotpicamente especmenes representativos con aplicabilidades concretas,
para lo cual es necesario desarrollar tcnicas de conservacin especficas para cada una de ellas
previendo la reduccin de efectos adversos en el proceso. En este sentido, el xito de la
conservacin de los cultivos microbianos es esencial para las actividades de investigacin o
industriales (Snchez y Corrales 2005).
Algunas caractersticas de los mtodos de conservacin se describen a continuacin:
Conservacin en refrigeracin a 5 -8C: incrementa la vida til de los cultivos, se deben hacer
resiembras peridicas, es un proceso laborioso y consume mucho tiempo (Zamora, 2003). No
obstante, el mayor problema de las resiembras es la posibilidad de cambio en el
comportamiento genotpico y fenotpico (Snchez y Corrales 2005).
Conservacin por congelacin: tras la congelacin ocurre la mayor tasa de destruccin
bacteriana, sin embargo, se llega a estabilizar y las clulas se mantienen viables durante
largos periodos de tiempo. Cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento, mayor ser
la supervivencia de las bacterias, sin embargo, se requieren agentes crioprotectores como
glicerol o clara de huevo. Los agentes crioprotectores son compuestos qumicos no txicos,
con facilidad para atravesar la membrana celular y acumularse intracelularmente. Se
mantienen de forma amorfa durante el proceso de congelacin y son capaces de unir
electrolitos o molculas de agua para retrasar la congelacin. Entre otros efectos protectores
sirven para compensar la diferencia de presin osmtica que se genera cuando empieza a
congelarse la superficie de la clula. De esta manera se evita una perdida excesiva de agua
que podra provocar la deshidratacin y destruccin de las clulas. Este mtodo de
congelacin ofrece facilidad para procesar los microorganismos, confiabilidad de los
resultados, estabilidad de las cepas y el costo es favorable (Sanchez y Corrales 2005; Zamora,
2003).

Conservacin por suspensin con agua destilada: es un mtodo simple, econmico, seguro y
capaz de asegurar la supervivencia de los cultivos por perodos prolongados. Permite
mantener altos porcentajes de viabilidad, caracteres morfolgicos y fisiolgicos en periodos a
veces superiores a 5 aos, en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos
como levaduras y algunas bacterias. No obstante, no se ha comprobado la estabilidad de
caracteres especficos como la virulencia, el poder fermentativo y la preservacin de
transformantes genticos (Hernndez y Loaiza 2014).

Entre otros mtodos de conservacin se pueden mencionar: conservacin en nitrgeno lquido,

conservacin por deshidratacin, liofilizacin, desecacin en papel filtro, desecacin en suelo,
arcilla o silica gel, desecacin en bolas de alginato (Hernndez y Loaiza 2014; Zamora, 2003).
2. OBJETIVOS
Objetivo general
Desarrollar habilidades en procesos de bioprospeccin de microorganismos de inters a partir de
muestras ambientales e industriales.
Objetivos especficos
Reconocer diferentes tcnicas de aislamiento de bacteras, hongos y levaduras a partir de
muestras ambientales.
Conocer y aplicar una metodologa para la purificacin y conservacin de microorganismos
de inters
Comprobar la selectividad de los medios utilizados.
3. MATERIALES
Material
Erlenmeyer de 90 mL
Gradilla
Mechero
Asas
Pipetas de 10 mL
Propipetas
Micropipeta 1000 L 100 L
Perlas para inoculacin
Puntas para Micropipeta 1000 L 100 L
Papel aluminio
Papel Kraft
Toallas absorbentes
Vinipel
Cinta de enmascarar

Cantidad por grupo

1
1
1
1
1
1
1

Uso general

4. REACTIVOS
Reactivo

Cantidad por grupo

Medio de cultivo asignado para aislamiento

Medio de cultivo asignado purificacin
Agua destilada
Reactivos tincin de gram
Azul de lactofenol

1
1
2L

5. EQUIPOS
Equipo
Cmara de flujo laminar
Nevera
Incubadora a 30C y 35C
Microscopio

Cantidad por grupo

Uso general
Uso general
Uso general
Uso general

6. MATERIALES QUE DEBE TRAER EL GRUPO

De uso individual: tapabocas, guantes de latex, gorro. Por grupo: papel aluminio, papel kraft,
vinipel y toallas absorbentes.
GRUPO 1. Suero de leche
GRUPO 2. Agua de rallandera de yuca (proveniente de los tanques de fermentacin)
GRUPO 3. Jugo de caa o jugo de fique
GRUPO 4. Suero de leche
GRUPO 5. Agua de rallandera de yuca (proveniente de los tanques de fermentacin)
GRUPO 6. Agua de ro
7. PROCEDIMIENTO
7.1 PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO
7.1.1

7.1.2

Realizar la preparacin de los medios de cultivo de acuerdo a las indicaciones del

proveedor (Ver instrucciones en el recipiente). A continuacin se indica el medio de
cultivo correspondiente segn el microorganismo a aislar:
Levaduras: Agar cloranfenicol (YGC)
Bacterias cido lcticas: Agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS)
Bacterias amilolticas: Agar almidn
Bacterias acumuladoras de PHA: Plate Count Agar (PCA) + Glucosa 15 g L-1 + Azul de
nilo 1 L/mL
Llevar los medios de cultivo esterilizados a la cabina de flujo laminar y servir en las cajas
de petri. Dejar solidificar. Rotular las cajas con las respectivas diluciones que sern
inoculadas.

7.2 PREPARACIN DE DILUCIONES SERIADAS

7.2.1

Realizar la preparacin de una solucin madre de la muestra (dilucin 10-1), de la

siguiente manera:

Para muestras lquidas: Diluir 10 mL de muestra problema en 90 mL de agua destilada

estril.

Para muestras slidas: Disolver 10 g de muestra en 90 mL de agua destilada estril, agitar

durante 5 minutos y dejar reposar por otros cinco minutos.

Nota: Mantener la boca de los recipientes cerca del mechero y en lo posible mantener todo
cubierto y tapado para evitar contaminacin.
7.2.2

Tomar 1 mL de la solucin madre y llevar a tubo con 9 mL de agua destilada (dilucin

10-2). Preparar diluciones sucesivas 10-3, 10-4, 10-5 realizando este mismo procedimiento
(Ver Figura 2).

Figura 2. Preparacin de diluciones seriadas de la muestra

7.3 SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO
Nota: Realizar el procedimiento en cmara de flujo laminar.
7.3.1

7.3.2
7.3.3
7.3.4
7.3.5
7.3.6

Inocular en las cajas de Petri (con el medio estril previamente servido y solidificado),
100 microlitros de cada dilucin con la ayuda de una micropipeta y puntas previamente
esterilizadas.
Esparcir la muestra por toda la superficie del medio con la ayuda de perlas de vidrio y
realizando movimientos circulares.
Retirar las perlas cerca del mechero y sellar las cajas con con papel vinipel.
Incubar a 30C o 35 C segn el grupo de microorganismos que se desea aislar.
Colocar las cajas de forma invertida para evitar exudaciones que dificulten el desarrollo
microbiano.
Realizar observaciones y registros de crecimiento peridicamente.

7.4 DESCRIPCIN MACROSCPICA Y PURIFICACIN

Nota: Realizar todo el procedimiento descrito a continuacin en cmara de flujo laminar.
7.4.1
7.4.2
7.4.3

Realice la descripcin macroscpica de las colonias obtenidas de acuerdo a lo descrito en

el tem 1.2
Cerca de un mechero, tomar una de colonias de inters claramente identificada.
Con una asa flameada, sembrar por agotamiento (Ver Figura 1) en caja de petri con el
medio correspondiente.

7.4.4
7.4.5

Rotular y tapar cada caja con su muestra y sellar con vinipel.

Incubar a 30C o 35 C segn sea el caso.

7.5 DESCRIPCIN MICROSCPICA

Para la descripcin microscpica de los aislados obtenidos se emplear la tincin de gram para
bacterias, la tincin con azul de metileno para levaduras y tincin con azul de lactofenol para
hongos.
7.5.1

TINCIN DE GRAM

7.5.1.1 Deposite una gota de agua en un portaobjetos.

7.5.1.2 Tome una colonia y disulvala sobre la gota de agua haciendo una extensin sobre el
portaobjetos.
7.5.1.3 Fije la placa al calor
7.5.1.4 Una vez seco, cubra el extendido con cristal violeta y djelo por un minuto.
7.5.1.5 Lave con abundante agua.
7.5.1.6 Cubra nuevamente el extendido con lugol y djelo por un minuto.
7.5.1.7 Lave con agua.
7.5.1.8 Agregue alcohol-acetona dejando por 30 segundos.
7.5.1.9 Lave con agua.
7.5.1.10Finalmente, cubra la placa con safranina dejando por un minuto, lave, deje secar y
observe al microscopio en el objetivo de 100 x (Recuerde agregar aceite de inmersin).
7.5.2

TINCIN CON AZUL DE METILENO

7.5.2.1
7.5.2.2
7.5.2.3
7.5.2.4

Deposite una gota de azul de metileno en un portaobjetos.

Tome una colonia con el asa y disulvala sobre la gota de tinte.
Cubra con un cubre objetos
Observe en el microscopio a 40x o 100x (en caso de usar 100x recuerde usar aceite de
inmersin).

7.5.3

TINCIN CON AZUL DE LACTOFENOL

7.5.3.1
7.5.3.2
7.5.3.3
7.5.3.4
7.5.3.5

Deposite una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos.

Con un pedazo de cinta tome una muestra de micelio de la colonia objeto de estudio
Ubique el micelio sobre la gota de azul de lactofenol
Ponga un cubreobjetos sobre la zona donde deposit el micelio
Observe al microscopio en objetivo de 40x.

7.6 CONSERVACIN
Para la conservacin en tubos con agar inclinado se toma una colonia del cultivo puro y se hace
una estra sobre la superficie del agar inclinado. Llevar a incubar y conservar a 4C.

8. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

8.1 Cules son los posibles usos en el campo agroindustrial de los microorganismos objeto de
estudio?
8.2 Por qu son empleados cada uno de los medios de cultivo para los microorganismos
aislados en la prctica?

9. BIBLIOGRAFA

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