T34218

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
Departamento de Qumica Fsica I
TESIS DOCTORAL
Fabricacin de liposomas y de cpsulas polimricas
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Marta Ruano Aldea
Directores
Francisco Ortega Gmez

Ramn Gonzlez Rubio
Madrid, 2013
Marta Ruano Aldea, 2012

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA FSICA I
Fabricacin de
liposomas y de
cpsulas polimricas
Trabajo presentado para optar al grado de Doctor en Ciencias, por:
Marta Ruano Aldea
Directores de la Tesis Doctoral
Francisco Ortega Gmez Ramn Gonzlez Rubio

Catedrticos de la Universidad Complutense de Madrid
Contenido
Agradecimientos ....................................................................................... 11
1 Introduccin y objetivos .................................................................... 15
1.1 Introduccin general ................................................................... 16
1.2 Los lpidos .................................................................................. 18
1.3 Liposomas o vesculas ................................................................ 21
1.3.1 Fenmenos de Agregacin ................................................... 22
1.3.2 Estabilidad coloidal segn la teora DLVO .......................... 35
1.3.3 Clasificacin de liposomas .................................................. 40
1.3.4 Tcnicas de obtencin de liposomas .................................... 42
1.3.5 Aplicaciones de los liposomas ............................................. 45
1.3.6 Liposomas cargados............................................................. 48
1.4 Microgeles .................................................................................. 49
1.4.1 Geles sensibles a la temperatura .......................................... 51
1.4.2 Geles sensibles al pH ........................................................... 56
1.5 Polielectrolitos ........................................................................... 57
1.5.1 Complejos de polielectrolitos .............................................. 60
1.5.2 Capas de polielectrolitos. Sobrecompensacin de cargas ...... 62
1.5.3 Tcnica capa a capa (LbL) ................................................... 64
1.5.4 Polielectrolitos funcionalizados ........................................... 67
1.6 Introduccin a las clulas artificiales .......................................... 70
1.6.1 Hbridos con compartimentos polimricos y liposomas ........ 73
1.7 Objetivos de la Tesis .................................................................. 75
2 Tcnicas experimentales .................................................................... 79
2.1 Tcnicas dispersivas ................................................................... 80
2.1.1 Dispersin de luz dinmica (DLS) ....................................... 80
2.1.2 Dispersin de rayos X de bajo ngulo (SAXS) ..................... 90
2.1.3 Dispersin de neutrones de bajo ngulo (SANS) .................. 97
2.1.4 Citometra de flujo ............................................................ 101
2.2 Potencial Zeta ........................................................................... 103
2.2.1 Fundamentos ..................................................................... 103
2.2.2 Instrumentacin ................................................................. 107
2.2.3 Metodologa ...................................................................... 108
2.3 Fluorimetra o Espectrofotometra de fluorescencia .................. 110
2.3.1 Fundamentos ..................................................................... 110
2.3.2 Instrumentacin ................................................................. 113
2.4 Tcnicas de microscopa ptica ................................................. 114
2.4.1 Microscopa de contraste interferencial (DIC) .................... 114
2.4.2 Microscopa confocal (CLSM) ........................................... 116
2.5 Tcnicas de microscopa electrnica e inica ............................ 117
2.5.1 Microscopa de transmisin ............................................... 118
2.5.2 Crio-microscopa electrnica de transmisin ...................... 120
2.5.3 Crio-microscopa electrnica de barrido ............................ 122
2.6 Tcnicas de superficie .............................................................. 126
2.6.1 Balanza de cuarzo .............................................................. 126
2.6.2 Elipsometra ...................................................................... 130
3 Materiales y mtodos ....................................................................... 135
3.1 Materiales ................................................................................. 136
3.1.1 Fosfolpidos ....................................................................... 136
3.1.2 Tensioactivos .................................................................... 138
3.1.3 Polmeros y microgeles ...................................................... 138
3.1.4 Sondas fluorescentes ......................................................... 142
3.1.5 Productos encapsulados ..................................................... 143
3.1.6 Entrecruzadores ................................................................. 144
3.1.7 Otros materiales ................................................................ 146
3.1.8 Disoluciones tampn ......................................................... 148
3.2 Metodologa ............................................................................. 148
3.2.1 Preparacin de los liposomas por extrusin........................ 148
3.2.2 Determinacin de la concentracin de fsforo .................... 152
3.2.3 Sntesis de microgeles ....................................................... 154
3.2.4 Sntesis del polmero funcionalizado con grupos SH. ....... 156
3.2.5 Sntesis de nanocpsulas polimricas ................................. 157
3.2.6 Tcnica capa a capa sobre sustratos esfricos..................... 158
3.2.7 Funcionalizacin de los liposomas. Ensayo cuantitativo .... 163
4 Resultados y discusin ..................................................................... 167
4.1 Estudio del recubrimiento de Liposomas ................................... 168
4.1.1 Liposomas ......................................................................... 168
4.1.2 Estudios en sustratos planos .............................................. 234
4.1.3 Ensayos de liberacin para los sistemas formados .............. 250
4.2 Microgeles ................................................................................ 253
4.2.1 Variacin del tamao con la temperatura y pH ................... 254
4.2.2 Recubrimiento capa a capa con polielectrolitos .................. 257
4.2.3 Variacin de la Movilidad electrofortica con T ................ 265
4.2.4 Estabilidad del microgel .................................................... 269
4.3 Hbridos ................................................................................... 272
4.3.1 Citometra de Flujo ............................................................ 274
4.3.2 Microscopa ptica: Confocal y de contraste ...................... 282
4.3.3 Microscopa electrnica de transmisin ............................. 285
4.3.4 Ensayos de liberacin ........................................................ 286
5 Conclusiones ................................................................................... 295
6 Conclusions ..................................................................................... 301
7 Summary ......................................................................................... 307
8 Bibliografa ..................................................................................... 311
9 Anexos ............................................................................................ 337
9.1 Abreviaturas ............................................................................. 338
9.2 Listado de figuras ..................................................................... 340
9.3 Listado de tablas ....................................................................... 357
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo de investigacin se ha llevado a cabo en el Departamento de
Qumica- Fsica I en la facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad
Complutense de Madrid bajo la direccin de Dr. Francisco Ortega Gmez y
Ramn Gonzalez Rubio.
A Francisco Ortega y Ramn Gonzalez por permitirme formar parte de
su equipo de trabajo, su infinita paciencia, comprensin, motivacin, trabajo
en mi formacin y en esta tesis. Ha sido una grata oportunidad el poder
trabajar con ellos y compartir su inestimable dedicacin dndome una
considerable libertad para encontrar mi propio camino en el proceso de esta
investigacin.
Agradezco la labor formativa de la Universidad Complutense de
Madrid y las facilidades otorgadas durante el desarrollo del presente
trabajo. Al Ministerio de Ciencia e Innovacin, por el apoyo econmico,
otorgado durante el desarrollo de mis estudios de doctorado.
Mi sincera gratitud a los miembros del tribunal por el tiempo que
dedicaron durante la revisin de la tesis, con aportaciones valiosas para la
mejora del trabajo.
A mis padres y hermanas que con mucha paciencia y cario han sabido
estar conmigo a pesar de la distancia. Son el mejor apoyo y me siento bien
al pensar que es un orgullo para ellos. Aunque mis sobrinos no lo sepan,
Alazne y Ainar por ser muy pequeos por los ratos que he estado con ellos,
pocos pero demasiado intensos y que intentar que sean ms momentos.
Oscar Llorca por la toma de fotografa de crio-TEM, Christian
Santeufemio por ser mi amigo y sus sabios consejos sobre CrioSEM, Dr
Atta por la aportacin de ideas.
A Hernn por darme la oportunidad de visitar instalaciones de neutrones
europeas y aprender tanto, al ILL e ISIS por permitir acceder a sus
instalaciones.
A John Erick Wong por ser mi amigo al mismo tiempo que responsable
de mi estancia y a Walter Richtering por su hospitalidad durante cuatro
meses disfrutando de sus instalaciones y aprender sobre los microgeles. A
todos los amigos que dej en Aachen, Tinting, Christine, Minerva. Thomas
Eckert (RWTH AAchen University, Aachen, Alemania) por las medidas de
SAXS y las discusiones de los resultados.
A Frank Caruso por darme la oportunidad de conocer su trabajo de cerc a
y poder compartir momentos agradables con su equipo Hannah, Marloes,
Angus, Damien, James, Catalina. A todos mis amigos de Melbourne que me
ayudaron y nunca me sent sola, en especial a Anahi, Huang Zhang -Jin,
Mick, Lana.
A Bridgette Boudlhal por hacerme sentir parte de su equipo, a Tatiya, mi
alma gemela por ser mi amiga y compaera de trabajo y con ella a toda la
comunidad tailandesa afincada en Boston.
A Cristina, Sandra, Dani, Sonia e Ins por su colaboracin y por la gran
ayuda durante el desarrollo de la tesis.
A mis amigos de patines, Mariano, Mnica, Pablo, Nacho, Mariajo,
Almudena, Antonio, Bene.por ser lo mejor de Madrid y sobre todo por
tantos ratos buenos en las rutas X, incontables momentos que han envuelt o
este periodo de investigacin. Por ese apoyo incondicional de Pedro, Fer y
Laura.
A toda la gente del departamento que siempre se ha portado genial
conmigo. Gracias a Laura, Armando, Edu, Mario, Lauri, David y Alberto
por compartir buenos momentos en los comienzos y sobre todo su
comprensin. He tenido suerte tambin de conocer a Lara, gracias por llenar
el departamento de alegra, desde siempre fuiste una amiga, una buena
amiga. A Jacobo, Sara, Maria-Jos, Ana, Mac, Ruddi, Silvia, Edu, Mnica y
al resto de mi grupo, Grupo de Sistemas Complejos (GSC) por compartir el
buen ambiente en esas jornadas de primavera que fueron toda una
experiencia y todo lo que unieron, as el departamento es ms cercano para
todos.
A Alma, Hezzi, Bea, Nubia, Fernando y Elisa por tantos momentos
buenos, ayuda incondicional, siempre con una sonrisa en la boca,
inventando palabras, aprendiendo nuevas, conociendo lugares y conociendo
un poquito ms de cada uno, en definitiva forjando una amistad da a da.
Al CAI de Infrarrojos donde he realizado prcticamente toda la
investigacin, a Jose, un apoyo incondicional y un verdadero amigo y de
nuevo a Bea, gran ayuda, contrincante del pdel e insustituible amiga.
Gracias a todos por dejar que formara parte de vuestras vidas!
Equation Chapter (Next) Section 1

1 INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
16 Introduccin y objetivos
1.1 INTRODUCCIN GENERAL

La ciencia ha vivido en las dos ltimas dcadas una nueva revolucin, el
paradigma nano, representado por dos nuevas disciplinas denominadas
nanociencia y nanotecnologa. stas estn basadas en el desarrollo de
mtodos de fabricacin precisos, reproducibles, y de bajo coste para la
obtencin de estructuras cada vez ms pequeas, que abarcan desde la escala
de la micra hasta la nanomtrica y que se aplican en una variedad de
sectores industriales, tales como comunicaciones, energa, agua, mdico -
sanitario, etc [32].
En medicina y ciencias de la salud, en particular, el desarrollo de
sistemas para terapia y diagnosis, la liberacin de frmacos o la ingeniera
de tejidos, biosensores, ha sido objeto de enorme inters y las
investigaciones en estos campos han crecido enormemente en los ltimos
aos. Por ejemplo, se ha aplicado la nanotecnologa a la biotecnologa [32-36]
dando lugar a la nanobiotecnologa, donde se engloba el estudio de
biotransportadores para liberacin controlada de frmacos, para optimizar su
biocompatibilidad [37]cuando entra en contacto con tejido celular, parte de su
composicin ha de tener algunos de los componentes celulares, como es el
caso de los fosfolpidos que forman parte de los liposomas [33], que han sido
empleados para la liberacin de vacunas, enzimas y vitaminas en el cuerpo
humano [38-40]. La principal limitacin que se ha encontrado hasta ahora es su
comportamiento en el medio gastrointestinal, que limita su uso por va oral,
y por ello las nuevas investigaciones se centran en introducir alguna
modificacin en la estructura del liposoma, como puede ser el recubrimiento
de su superficie con un polmero adecuado para superar esta limitacin. Este
tipo de materiales se han formado basndose en una tcnica sencilla y a la
vez verstil propuesta por Hong y Decher [41], que se denomina Ensamblaje
Secuencial Electrosttico de polielectrolitos (ELL), o crecimiento capa a
capa (LbL).
Las nanocpsulas pueden tambin construirse utilizando una partc ula
coloidal como plantilla para un recubrimiento por el mtodo LbL. Estos
materiales denominados de tipo ncleo-capa (core-shell) presentan
propiedades diferentes de las de la partcula plantilla que forma el interior
(core) ya que tras modificar la composicin superficial se produce una
mayor estabilidad y variacin de las propiedades fsico-qumicas [42]. Con
frecuencia, las molculas que se desea encapsular se mezclan con los
1.1 Introduccin general 17
Figura 1.1 Formacin de materiales core-shell y microcpsulas por ensamblaje

electrosttico capa a capa de polielectrolitos [29, 30] . Una partcula de
slice es recubierta por interacciones eletrostticas con polielectrolitos
y posteriormente se elimina la partcula plantilla dando lugar a una
cpsula polimrica.
precursores de las partculas coloidales durante el proceso de sntesis. Para

su caracterizacin se han llevado a cabo estudios exhaustivos, con un gran
nmero de tcnicas experimentales, principalmente espectroscpicas de
dispersin (luz, rayos X, neutrones) y electrocinticas (potencial zeta) . De
esta forma ha sido posible conseguir sistemas bien caracterizados y aptos
para ser utilizados en los procesos de encapsulacin.
La liberacin del principio activo encapsulado se realiza por difusin a
travs de la pared exterior [43] en el caso de las cpsulas polimricas, y en el
caso de liposomas por destruccin de la membrana utilizando
concentraciones altas de iones divalentes como el calcio, tensioactivos,
cambio de pH o de temperatura [44-47]. Los liposomas suelen utilizarse para el
encapsulamiento de sustancias activas solubles en agua y en particular se
han utilizado frecuentemente para la encapsulacin de sistemas
enzimticos [31].
Antes de comenzar con los objetivos que se persiguen en esta tesis, se
llevar a cabo una revisin de los fundamentos del comportamiento de los
materiales usados y de los procesos de agregacin espontnea en los que se
basa el trabajo realizado.
1.2 LOS LPIDOS

En general, los lpidos son tensioactivos con una o varias cadenas
hidrocarbonadas (en algn caso formando ciclos fusionados), que presentan
como el resto de tensioactivos uno o varios grupos polares o inicos en un
extremo de la molcula. Comnmente son liposolubles, es decir solubles en
disolventes orgnicos tales como cloroformo/metano [48] . Aunque existen
lpidos sintticos, el trmino lpido se refiere, habitualmente, a un conjunto
amplio de productos naturales que incluyen grasas, ceras, esteroles,
vitaminas lipo-solubles (A, D, E y K) y mono-, di- y triglicridos, entre
otros. Las funciones biolgicas ms importantes de los lpidos son, entre
otras, almacenamiento de energa, componentes de las membranas celulares
y molculas de sealizacin.
Los lpidos se clasifican, en funcin de la presencia o no de alguna
insaturacin en la cadena hidrocarbonada, como insaturados o saturados y ,
en funcin de su reactividad con las bases fuertes, los lpidos pueden ser de
dos tipos: saponificables (pueden ser hidrolizados por grupos OH y dar
Figura 1.2 Clasificacin estructural de los lpidos [3] . Se distinguen lpidos de

almacenamiento de energa como los triglicridos y los lpidos de
membrana como los fosfolpidos y glicolpidos.
1.2 Los lpidos 19
lugar a jabones o sales de los cidos grasos) y no saponificable. Ejemplos de

no-saponificables son las vitaminas A y E, y el colesterol. Lpidos
saponificables son los triglicridos, glicerofosfolpidos y los esfingolpidos,
que contienen cadenas largas de cido carboxlico, o cidos grasos que
esterifican una molcula ya sea el glicerol o la esfingosina [48, 49].
La clasificacin se resume en la Figura 1.2. Los fosfolpidos, o
diacilfosfoglicridos son steres de glicerol con cidos grasos (R -COOH,
donde R es una cadena hidrocarbonada muy variada) en los que una
molcula de glicerol sin carga, se une a dos cidos grasos (1,2-
diacilglicerol) y a un grupo fosfato. El fosfato se une mediante un enlace
fosfodister a otro grupo de tomos, que generalmente contienen nitrgeno,
como colina denominndose fosfatidilcolina.
Los fosfolpidos son molculas anfiflicas cuya parte hidrfoba (repele al
agua) est constituida por las cadenas hidrocarbonadas de carcter neutro y
el componente hidrfilo (afn al agua) es la cabeza del fosfolpido que posee
carga elctrica, como se puede observar en la Figura 1.3.
Todas las membranas plasmticas activas de las clulas poseen una
bicapa de fosfolpidos, gracias a su propia autoasociacin, con la cabeza
polar hacia el exterior de la superficie interaccionando con el agua y sus
colas dirigidas hacia el interior, juntndose unas a otras. Por tanto, esta
bicapa es una estructura cooperativa que se mantiene unida por
Figura 1.3 Estructura tpica de la fosfocolina formada por una cabeza hidrfila y
una cola hidrfoba.
interacciones no covalentes que la refuerzan.

Los fosfolpidos, al igual que todas las molculas de carcter anf iflico
pueden clasificarse segn la cabeza polar como aninicos (cabeza polar
negativa), catinicos (cabeza polar positiva), zwiterinicos y no inicos
(cabeza polar sin carga). Es la cabeza polar del fosfolpido la que
proporciona el valor de la carga al agregado formado [50]. La longitud y grado
de insaturacin (enlaces dobles existentes en las cadenas) presente en la
cadena hidrocarbonada es un factor importante. Estos dos parmetros van a
marcar la flexibilidad de la membrana. [51] [52] Se da mayor rigidez en
fosfolpidos de cadena larga y esta rigidez aumenta con el nmero de
[53, 54]
insaturaciones.
La estabilidad de los lpidos se ve afectada por varias reacciones
qumicas que se pueden producir en disolucin. Esterificacin y
saponificacin por un lado, y degradacin hidroltica [55] por otro. En la
esterificacin, un cido graso se une a un alcohol mediante un enlace
covalente liberando agua y en la saponificacin o hidrlisis alcalina, el
cido graso se une a una base para dar lugar una sal de cido graso o jabn
liberando agua [51, 56]. La hidrlisis depende de varios factores como el pH,
temperatura, tipo de tampn, fuerza inica longitud de la cadena
hidrocarbonada y tipo de cabeza polar, por ello existen varias
recomendaciones para que se mantengan estables como son el
almacenamiento de la bicapa lipdica en estado criogenizado tras la
liofilizacin [57] y/o la mezcla de lpidos con colesterol o carbohidratos [58, 59].
Figura 1.4 Fases del lpido en funcin de la temperatura. El cambio de fase se

debe a un desorden de las cadenas hidrocarbonadas que forman
parte de los lpidos debido a un cambio de temperatura [25, 26] .
1.2 Los lpidos 21
Los lpidos poseen diferentes fases lipdicas [55] cuya presencia depender
de la estructura del lpido, del tipo de disolvente y de la temperatura de
trabajo[60], tal como se puede apreciar en la Figura 1.4 [61-63]. Las fases
identificadas en la Figura 1.4 son L (fase de gel lamelar), P (fase
intermedia denominada ripple gel phase) y L [51, 64] (fase de lquido
cristalino lamelar).
Desde el punto de vista del comportamiento trmico los fosfolpidos
pueden encontrarse en forma gel (alta temperatura) o en forma cristalina
(baja temperatura). La temperatura que marca el paso de una fase a otra se
denomina temperatura de transicin, T m, y es caracterstica de cada lpido
puesto que depende directamente del tamao de la/s cadena/s, presencia de
insaturaciones y de la naturaleza de la cabeza polar. As, cuanto mayor es la
longitud de la cadena hidrocarbonada, mayor es la energa necesaria para
realizar el cambio de fase, y por tanto la temperatura de transicin es
mayor [65] y por otro lado la presencia de dobles enlaces [66], en la cadena,
aumenta la dificultad de empaquetamiento y disminuye, por tanto, la
temperatura de transicin.
Desde el punto de vista de la preparacin de liposomas, hay que tener en
cuenta que la composicin lipdica determinar la facilidad de formacin y
el tipo de liposoma formado. La eleccin de un lpido o mezcla de lpidos
debe realizarse en base al conocimiento de sus propiedades y en funcin de
la aplicacin que se quiera dar al liposoma [3] .
Equation Section (Next)
1.3 LIPOSOMAS O VESCULAS

Los liposomas se descubrieron en 1961 por Bangham [67-69] y
colaboradores quienes observaron que algunos lpidos forman estructuras
membranosas cuando estn en disolucin acuosa. Estas estructuras
vesiculares altamente organizadas estn constituidas por lamelas o bicapas
lipdicas concntricas que encierran un interior acuoso. Comnmente, a las
vesculas formadas por fosfolpidos se denominan liposomas, y las que estn
formadas por lpidos son las vesculas, pero ambas denominaciones para los
liposomas son aceptadas. Por ello en esta tesis, vescula y liposoma se

utilizarn como sinnimo.
Para su elaboracin se utilizan fosfolpidos con o sin la incorporacin de
colesterol [70], tocoferol, sondas fluorescentes u otros materiales,
introducidos en la bicapa lipdica con el fin de dotar a las vesculas de
alguna propiedad particular como puede ser carga superficial, reducir la
permeabilidad de la membrana o incrementar la estabilidad de los lpidos en
la bicapa.
Las vesculas formadas por fosfolpidos son usadas como modelo para
estudiar el comportamiento de membranas biolgicas, debido a que
muestran similitudes como pueden ser su estructura, composicin,
selectividad y permeabilidad selectiva [71] .En los aos 70,
Gregoriadis [72] inici el estudio sobre el potencial que presentan estos como
sistemas de liberacin de frmacos o de otras molculas bioactivas.
La ampliacin de las aplicaciones en las que se utilizan liposomas es
debido a que son capaces de incorporar a su estructura molculas
hidroflicas, hidrofbicas y tambin las de carcter anfiflico. Adems
algunas de sus propiedades fsicas como carga superficial, tamao,
permeabilidad y rigidez de la pared, o su capacidad de carga son fcilmente
modulables debido a la amplia variedad de fosfolpidos que existen. Por
ltimo, si se utilizan lpidos funcionalizados, se pueden unir anticuerpos [73,
74]
u otros ligandos a la superficie del liposoma, lo que les convierte en
sistemas que pueden acceder con mayor facilidad a determinados tejidos,
por ejemplo tumores, acercndose al concepto que Helrich [75] introdujo
denominndolo bala mgica.
1.3.1 Fenmenos de Agregacin

Las molculas anfiflicas como los tensioactivos convencionales, lpidos y
determinados copolmeros de bloque, poseen una caracterstica estructural:
una parte de la molcula (polar o inica) tiene afinidad por el agua, mientr as
que la otra parte de la molcula (apolar) es insoluble, siente repulsin, por el
agua. Esta esquizofrenia molecular es la responsable del fenmenos de
autoasociacin de estas molculas en agua (aunque tambin ocurre en otros
disolventes) dando lugar a una multitud de estructuras organizadas, en las
que la energa libre del sistema adopta un valor mnimo.
1.3 Liposomas o vesculas 23
En gran medida detrs de este fenmeno de autoasociacin estn las

peculiares propiedades del agua como disolvente. Uno de los modelos
mecano-estadsticos ms sencillos que describen la mezcla de lquidos o la
disolucin, es el modelo de disoluciones regulares, en este modelo la
energa libre de mezcla se compone de la suma de dos trminos: uno que
procede de la ganancia en entropa configuracional del estado mezcla y el
otro que procede de la energa de mezcla, y que generalmente se trata a
travs de una interaccin par entre vecinos. En principio, en el caso de
disoluciones en agua, la divisin entre un trmino de entropa
configuracional y uno de energa de interaccin es tambin vlido, sin
embargo, el trmino de interaccin es mucho ms complicado que una
interaccin par directa entre vecinos. La interaccin molecular entre el agua
y molculas de tipo hidrocarburo (cadenas apolares de las molculas
anfiflicas) genricamente denominadas como aceites es tan especfica e
importante que se le ha dado el nombre de interaccin o efecto hidrofbico.
La interaccin hidrofbica tiene una importante componente entrpica,
distinta de la entropa de mezcla. As, aproximadamente el 80% del cambio
de energa libre, asociado a la solubilizacin de una molcula de
hidrocarburo en agua se debe a una disminucin entrpica. Esta disminucin
tiene su origen en la red de enlaces de hidrgeno que constituyen la
estructura del agua lquida. Si se inserta en esta estructura, una molcula
incapaz de formar enlaces de hidrgeno (hidrocarburo), la red de agua se
reordena para maximizar el nmero de enlaces de hidrgeno, restringiendo
el nmero de configuraciones accesibles a las molculas de agua en las
cercanas del soluto, disminuyendo entrpicamente. Es decir, las molculas
de soluto fuerzan a las molculas de agua cercanas a adoptar un estado ms
ordenado, tratando de maximizar la formacin de enlaces de hidrgeno. Esta
interaccin hidrofbica es la responsable ltima de la insolubilidad de un
hidrocarburo en agua, lo que da lugar a una separacin de fases cuando estos
dos componentes se mezclan. Sin embargo, es posible que esta separacin
de fases este limitada a una micro-separacin de fases, dando lugar a la
formacin de agregados microscpicos (micelas) termodinmicamente
estables. Consideremos la diferencia entre micro- y macro-separacin de
fases en un modelo sencillo, tomemos una disolucin donde el soluto est
con una fraccin en volumen, , y donde X N es la fraccin en volumen de
soluto presente en agregados de N molculas. Obviamente la suma sobre
todos los posible agregados conduce a la fraccin en volumen total,
N X N . La condicin de equilibrio implica que el potencial qumico, ,
de las molculas de soluto sea el mismo independientemente del entorno en

que se encuentren y por tanto
kBT X
N log N (1.1)
N N
En esta expresin N es la energa libre asociada al paso de la molcula de

soluto de un estado puro a un agregado de N molculas en disolucin y el
segundo trmino da cuenta de la entropa traslacional de agregado, por tanto
cuanto mayor es el nmero de agregacin menor es esta contribucin.
Reagrupando la ecuacin anterior podemos despejar X N
N ( N )
X N N exp (1.2)
kBT
Podemos eliminar particularizando la expresin para N =1, de tal forma

que obtenemos la siguiente ecuacin que expresa la fraccin en volumen de
soluto en un agregado de tamao N en trminos de la fraccin libre de
soluto, X 1 ,
N
( )
X N N X 1 exp 1 N (1.3)
k BT
De esta ecuacin se deduce que si N 1 la mayor parte de las molculas de

soluto estarn en disolucin en estado monomrico, mientras que si N < 1
se formarn agregados. La forma especfica en que N dependa de N
determinar que los agregados sean de tamao finito o infinito (separacin
de fases).
Para ilustrar este ltimo punto consideremos una mezcla de fluidos, un
agregado esfrico con N molculas de uno de los fluidos (soluto) tendr un
radio r (3Nv / 4 N A )1/3 , donde v es el volumen molar y N A el nmero de
Avogadro. Este agregado esfrico tendr asociada una energa interfacial
4 r 2 , donde es la tensin interfacial y por tanto podemos escribir N en
funcin de como
2/3
4 3N kBT
N (1.4)
N N A 4 N 1/3
donde kBT 4 (3v / 4 N A ) . Utilizando esta expresin de N en 1.3

2/3
obtenemos
N
1
X N N X 1 exp 1 1/3
N (1.5)
N X 1 exp( )
N
Este resultado implica que si X 1 adopta un valor pequeo, de tal forma que
X 1 exp() < 1, se formarn muy pocos agregados y cuando X 1 se aproxime a
exp(-), puesto que las fracciones X N deben ser inferiores a la unidad, todo
soluto adicional que se aada debe agregarse. En este ejemplo N es una
funcin montona decreciente en N y por tanto el tamao efectivo del
agregado que se formar ser infinito (separacin de fases), habr por tanto
una fraccin en volumen crtica, c , a partir de la cual las molculas de
soluto aisladas coexistirn con un agregado infinito. Esto que no refleja la
solubilidad del soluto en algunas ocasiones se denomina como
concentracin de agregacin crtica o CAC.
La situacin anteriormente descrita, no es la habitual para molculas
anfiflicas para las que N adopta un valor mnimo para un determinado
valor finito de N, y los agregados formados en este caso, denominados
genricamente como micelas, aparecen a una fraccin en volumen crtica
denominada, concentracin micelar crtica o CMC. Estos fenmenos de
agregacin de molculas anfiflicas conducen no solo a las estructuras
ms sencillas como son las micelas esfricas [76] , sino a toda una serie de
estructuras como son las micelas cilndricas, bicapas, vesculas, micelas
inversas, en el caso de tensioactivos convencionales y lpidos (ver Tabla
1.1) y algunas ms en el caso de tensioactivos no convencionales (ver
esquema). Los jabones y tensioactivos sintticos, tiene comnmente una
cadena hidrocarbonada unida al grupo de cabeza, polar o ionico, sin
embargo existen tensioactivos con dos cadenas hidrocarbonadas, entre lo s
que destacan los fosfolpidos. A pesar de la gran variedad de estructuras
qumicas de las molculas anfiflicas su comportamiento respecto a la
agregacin puede ser racionalizado en trminos simples, a partir de unos
pocos parmetros geomtricos, siguiendo las ideas de Israelachvili [54]. El
proceso de autoensamblado viene fundamentalmente dirigido por la
necesidad de minimizar la energa libre del sistema minimizando el contacto
entre las cadenas hidrocarbonadas del tensioactivo con el agua, mientras se
Tabla 1.1 Geometra de los agregados frente al parmetro de e mpaquetamiento P c .
mantiene el contacto entre los grupos cabeza polar o inico con el agua. Es
este balance, entre mantener alejadas del agua las cadenas y l os grupos
polares o inicos cerca del agua lo que conduce a un mnimo de N para un
determinado valor de N. El parmetro de empaquetamiento P c , est
relacionado con los factores geomtricos que a continuacin se describen,
as:
Pc v / a0 lc (1.6)
Los argumentos geomtricos anteriormente citados se basan en tres

parmetros: rea ptima del grupo de cabeza a 0 , longitud crtica de la
cadena l c y volumen de la cadena o cadenas hidrocarbonadas v [77, 78] . El
ltimo es simplemente el volumen de la parte apolar de la molcula,
mientras que l c esta relacionada con la longitud de la cadena en una
configuracin completamente extendida.
En la Tabla 1.1 adaptada del libro de Israelachvili [78] se recogen las
condiciones que dan lugar a la formacin de las distintas geometras de los
agregados.
La idea de rea ptima del grupo de cabeza se ilustra en la Figura 1.5. Si
a 0 es pequeo los grupos de cabeza coexisten en un rea pequea con la
consiguiente repulsin electrosttica o de otro tipo, que conduce a un
aumento en la energa libre. Por otro lado, si a 0 es grande las cadenas
hidrocarbonadas entran en contacto con el agua con el consiguiente aumento
de la energa libre interfacial. Entre estos dos lmites se encuentra el valor
de a 0 ptimo. Debe tenerse en cuenta que este argumento no es solamente
geomtrico, puesto que procede del balance entre interacciones repulsivas y
atractivas, de hecho si se modifica el alcance de esta interacciones (p.e.
apantallando las interacciones electrostticas con un aumento de la fuerz a
inica) el valor de a 0 se ve modificado.
Si la geometra de empaquetamiento de un tensioactivo favorece la
formacin de un agregado esfrico (micela), es decir cuando el parmetro de
Figura 1.5 Determinacin del rea ptimo de las cabezas polares, a 0 , mediante el
balance entre las fuerzas interfaciales atractivas y las fuerzas
repulsivas entre las cabezas polares.
empaquetamiento cumple, v / lc a0 1/ 3 , N tendr un mnimo para un

determinado nmero de agregacin N=M, y las micelas ms pequeas que el
tamao ptimo tendrn un rea por grupo de cabeza demasiado grande, por
tanto habr un coste energtico asociado al contacto del agua con las
cadenas hidrocarbonadas. Por otro lado si las micelas son ms grandes que
el tamao ptimo sus grupos de cabeza estarn demasiado juntos, entonces
la interaccin entre estos grupos y la dificultad de empaquetamiento de las
cadenas forzar que algunas molculas de tensioactivo pasen al interior
hidrofbico de la micela. Un mnimo de N puede ser expresado a travs de
una variacin parablica alrededor del mnimo con amplitud,
N M ( N M ) 2 (1.7)
Y utilizando la ecuacin 1.2 obtenemos una expresin que relaciona X N y

XM
N /M
X M ( M N )
X N N M exp (1.8)
M k BT
Sustituyendo la aproximacin parablica para N , la ecuacin1.8 se expresa

N /M
X ( M N )2
X N N M exp (1.9)
M k BT
Esta ecuacin para M suficientemente grande conduce a una distribucin

prcticamente Gaussiana con varianza,
kBT
N M
2
(1.10)
2M
Si el mnimo de la parbola es suficientemente profundo comparado con

k BT la distribucin ser muy estrecha y en el lmite tendremos nicamente
monmeros y micelas con nmero de agregacin M es decir
M

XM M X 1 exp (1.11)
k BT
donde = 1 - M y la fraccin en volumen total de tensioactivo es = X 1 +

X M . De esta ecuacin se deduce que la CMC ser c exp( / kBT ) .
Para parmetros de empaquetamiento 1/ 3 v / lc a0 1/ 2 , la geometra
ms probable es la de una micela cilndrica. Un sistema tpico que forma
este tipo de micelas son los tensioactivos inicos convencionales con
contraiones hidrofbicos y/o a altas concentraciones salinas, condiciones en
las que a 0 disminuye. Para este tipo de agregados, en principio, N no
presenta un mnimo con N, puesto que la energa de las molculas de
tensioactivo, que estn en la parte central del cilindro, es independiente de
la longitud de este y por tanto de N. La nica dependencia con N procede de
las terminaciones semiesfricas del cilindro, en estas las molculas deben
empaquetarse en semiesferas para proteger las cadenas hidrocarbonadas del
contacto con el agua, lo que produce una contribucin positiva a la energa
E SE. As podemos escribir N como la suma de un trmino constante ,
procedente de las molculas en la parte central del cilindro, y la
contribucin por molcula colocada en alguna de las dos semiesferas,
2ESE / N k BT / N
kBT
N (1.12)
N
Y sustituyendo de nuevo en la ecuacin 1.3 obtenemos
X N N X1 exp exp( )
N
(1.13)
De donde podemos obtener la fraccin en volumen total, , sumando sobre

todas las fracciones
X N N [ X 1 exp( )]N exp( )

N N
X1 (1.14)

1 X1 exp( )
2
A partir de este resultado se puede encontrar un resultado para X 1 en funcin

de la fraccin total, , para valores de esta suficientemente grandes respecto
a la CMC [CMC exp(-)] , es decir [ exp() >> 1]
1
X 1 1
exp( ) (1.15)
exp( )
y por tanto X N vendr dado por

N
1
X N N 1
exp( ) (1.16)
exp( )
Al contrario que con micelas esfricas esta distribucin es bastante ms

ancha y asimtrica hacia la zona de nmeros de agregacin altos. Siendo el
valor ms probable de N, N mp exp( ) .
Bicapas y vesculas
Para valores del parmetro de empaquetamiento 1/ 2 v / lc a0 1, la
geometra preferente es el de una bicapa curvada, formando vesculas o
liposomas, o una bicapa o membrana plana (v / lc a0 1) , las molculas
anfiflicas que cumplen estos requisitos geomtricos son los tensioactivos
bicatenarios, como los lpidos que tiene valores altos de v para un mismo l c
respecto a un tensioactivo monocatenario de la misma longitud de cadena y
grupo polar. No es de extraar, por tanto, que estos lpidos sean los
componentes fundamentales de las membranas celulares. En la Figura 1.6 c)
se muestra una micela formada por una monocapa de lpidos mientras que en
la Figura 1.6 b) se observa una vescula formada por una bicapa de lpidos,
quedando agua atrapada en el interior. En ambos casos, las cabezas de los
lpidos estn en contacto con el medio acuoso, y dependiendo de las
condiciones descritas, se favorecer la formacin de la bicapa o de la
micela [79, 80].
Utilizando argumentos similares a los usados al describir las micelas
cilndricas, podemos estimar la distribucin de fragmentos de bicapas
presentes por encima de la CMC y por tanto expresar el cambio de energa
puesto en juego al colocar una molcula de lpido en una bicapa de nmero
de agregacin N como
kBT
N (1.17)
N
Figura 1.6 a) Representacin esquemtica de una bicapa de lpidos. b)

Representacin de una vescula unilamelar [9] formada por una bicapa
de lpidos. c) Representacin de una micela formada por una
monocapa de fosfolpidos.
donde el primer sumando corresponde con la energa de una molcula

alejada de los bordes de la bicapa y el segundo con la energa de una
molcula situada en los bordes. La diferencia entre las ecuaciones 1.12 y
1.17 es puramente geomtrica en un agregado en forma de membrana o
disco, el nmero de molculas en el interior, N, es proporcional al rea (es
decir,~r 2 ) mientras que el nmero de molculas en el borde es proporcional
al permetro (~r) y por tanto N1/2 . De forma anloga a las micelas
cilndricas, substituyendo en la ecuacin 1.3 obtenemos
X N N X1 exp exp( N )
N
(1.18)
Es instructivo comparar este resultado con el obtenido para agregados

cilndricos, se encuentra que en lugar del factor exp(-), aparece exp(-
N1/2 ), y esta dependencia exponencial con N 1/2 implica que no existe una
verdadera distribucin de tamaos de membranas o discos, por encima de la
CMC (que ser extremadamente pequea) las molculas de lpido que se
aadan formarn agregados infinitos, en la prctica un sistema muy
polidisperso dominado por agregados lamelares gigantes. Existe, por

supuesto, la posibilidad de que la membrana se cierre sobre s misma dando
lugar a las denominadas vesculas o liposomas, eliminando por tanto los
efectos de borde y el factor N 1/2 , sin embargo existe un coste energtico en
la formacin de la vescula, asociado a la curvatura que se debe impartir a la
membrana para formar esta estructura, efecto que se discutir ms adelante.
Para sistemas de un solo tensioactivo en agua, las vesculas son
nicamente estables a muy bajas concentraciones (~nM), aunque e n la
prctica pueden formarse en concentraciones razonables utilizando diversas
tcnicas para aportar energa. No obstante, estos sistemas son metaestables,
aunque con una vida suficientemente larga para los tiempos tpicos de la
mayor parte de los experimentos.
Como se comenta anteriormente, las molculas anfiflicas capaces de
formar bicapas son aquellas con valor de v suficientemente altos para llevar
el parmetro de empaquetamiento a valores de y 1. Esta condicin, que
cumplen los tensioactivos bicatenarios como son los lpidos, tiene otras
implicaciones que conviene discutir. En primer lugar el aumento de
hidrofobicidad entraa una notable disminucin en la CMC (~nM) y una
muy baja solubilidad en agua del lpido respecto al tensioactivo
monocatenario convencional. En segundo lugar, la dinmica de entrada y
salida del tensioactivo en los agregados se ralentiza considerablemente.
Es conocido, desde el trabajo de Anianson y col [81] que la formacin de
micelas (agregados) y por tanto la dinmica con la que estos sistemas llegan
a las estructuras de equilibrio, viene determinada por dos procesos de
relajacin con distintos tiempos caractersticos. El primer proceso de
relajacin es rpido y corresponde a la entrada-salida de monmeros
individuales del agregado, el tiempo de relajacin caracterstico de este
proceso es entre 10 -7 -10 -9 s y puede variar en funcin del tamao del
tensioactivo y la naturaleza del agregado. El segundo proceso es, en general,
ms lento (10 -3 s -1 ) y corresponde a un proceso en el que se equilibra la
concentracin de tensioactivo libre y la concentracin total de micelas, este
proceso a veces se denomina como formacin-disolucin. En tensioactivos
con cadenas largas (-C n H2n+1 , con n>10) o en bicatenarios es el primer
proceso el que controla el estado de equilibrio. El tiempo de residencia del
tensioactivo en el agregado, proporcional al tiempo de relajacin, es
inversamente proporcional a la concentracin libre de tensioa ctivo
(i.e. CMC). Es aqu donde aparece una profunda diferencia entre agregados
micelares (tensioactivos monocatenarios, con CMC 10 -3 -10 -4 M) y bicapas

y vesculas (tensioactivos bicatenarios, con CMC 10 -9 - 10 -10 M), en el
primer caso los tiempos de residencia son del orden de milisegundos
mientras que en el segundo de horas o das.
Hay otros procesos dinmicos, como son la propia difusin superficial de
la molculas de tensioactivo en la superficie del agregado y en una
membrana aparece, adems, una dinmica denominada flip-flop, asociada
al intercambio de lpido entre las capas exterior e interior de la membrana.
Estos procesos son especialmente importantes en sistemas agregados mixtos,
formados por dos o ms tensioactivos o lpidos.
Curvaturas y fluctuaciones en una membrana

Anteriormente se coment que la transformacin de una membrana en una
vescula requiere un coste energtico asociado a la curvatura que debe
adoptar la membrana al cerrase sobre si misma. Discutiremos brevemente la
energa asociada a este proceso y las fluctuaciones de forma de origen
trmico inherentes a cualquier membrana. La curvatura de cualquier
superficie en un punto puede ser descrita a partir de dos radios principales
de curvatura, r 1 y r 2 [82, 83], a partir de estos radios se puede escribir el
cambio de energa asociado al proceso de doblar una membrana, dE el , como
la energa elstica necesaria para modificar la forma de un rea, dA,
adoptando curvaturas c 1 y c 2 .
k
dEel (c1 c2 c0 )2 kS c1c2 dA (1.19)
2
donde c 0 , es la curvatura espontnea de la membrana y tiene en cuenta la

tendencia de la membrana a doblarse en una u otra direccin dependiendo de
las restricciones moleculares de empaquetamiento. Para una monocapa de
tensioactivo el radio de curvatura espontnea viene controlado por los
factores de empaquetamiento discutidos anteriormente en relacin con el
parmetro de empaquetamiento. Para una bicapa formada por un solo
componente la curvatura espontnea es cero, y cualquier tendencia de una de
las capas a curvarse queda compensada por la curvatura contraria
(desfavorable) de la otra capa.
Las dos constantes elsticas que aparecen en la ecuacin (1.19), k y k S , se
conocen como mdulo de doblamiento (bending) y mdulo de silla
(saddle-splay). Para una bicapa estable k > 0, lo que quiere decir es que el
estado de equilibrio corresponde a curvatura media nula, i.e. (c 1 +c 2 )/2 = 0.
Sin embargo el modulo de silla puede ser positivo o negativo de manera que
el sistema puede adoptar una curvatura Gaussiana positiva ( c 1 c 2 > 0) o en
forma de silla, es decir curvatura Gaussiana negativa (c 1 c 2 < 0),
dependiendo de la interaccin molecular especfica entre las molculas de
lpido.
Para una determinada forma de la superficie (membrana plana,
vescula,...) solo es necesario considerar el trmino de energa de
doblamiento (bending) en la ecuacin (1.19), si no se produce ningn
cambio topolgico en la superficie. Esto permite abordar de forma sencilla
el efecto de las fluctuaciones trmicas en una membrana (con curvatura
espontnea nula [84] , c 0 = 0, considerndola como una pelcula semi-infinita
donde se producen distorsiones en la forma, sin cambio en la topologa). La
energa elstica de deformacin ser en este caso
k
Eel (c1 c2 )2 dA (1.20)
2
Si se considera el movimiento Browniano en la membrana como una serie de

distorsiones de la pelcula, pueden ser descritas como ondas estacionarias de
vector de onda q y amplitud a(q). La ecuacin 1.20 permite calcular la
energa de deformacin asociada a una de estas ondas estacionarias como
ka 2 (q)q 4 /2 por unidad de rea. En equilibrio el principio de equiparticin
permite expresar la energa de cada onda como k B T /2, encontrndose para la
amplitud cuadrtica de la onda estacionaria, de longitud de onda 2 /q
kBT

2
a(q) (1.21)
Akq 4
donde A es el rea de la membrana. La distorsin trmica (Browniana) de la

membrana en equilibrio corresponder con la superposicin de modos
estacionarios sinusoidales de todas las longitudes de onda, con fases
aleatorias y amplitudes cuadrticas dadas por la ecuacin (1.21). La
rugosidad efectiva de la membrana, z, se encuentra sumando sobre todas
las longitudes de onda:
Aqdq kBT k T dq
z 2 B 3 (1.22)
2 Akq 4
2 k q
La integral en esta ecuacin diverge, y el significado fsico es que las ondas

con longitud de onda grande (del orden del tamao de la membrana) tendrn
amplitudes progresivamente mayores y por tanto debemos visualizar la
membrana como altamente rugosa en longitudes de escala grandes, de
manera que nicamente podremos considerarla plana a nivel local, por
debajo de una longitud de persistencia que depende exponencialmente con k.
Como ya se ha comentado, la doble capa lipdica que forman los
liposomas es en general asimtrica, es decir, la distribucin de los diversos
tipos de fosfolpidos en la capa externa y la capa interna del liposoma es
diferente. Esta caracterstica es una constante en la composicin de las
membranas celulares. La distribucin asimtrica de lpidos en la bicapa se
deriva de la configuracin que deben adoptar en los monmeros como
consecuencia de la distinta curvatura en la capa interna y externa. La
situacin termodinmicamente ms favorable ser aquella que minimice las
interacciones electrostticas de las cabezas inicas, con lo que, se tiende a
una discriminacin de monmeros en razn de su diferente estructura inica
y de su volumen [84].
1.3.2 Estabilidad coloidal segn la teora DLVO

La teora DLVO fue la primera teora que se desarroll para describir
cuantitativamente la estabilidad de las suspensiones coloidales. Debe su
nombre a Derjaguin y Landau [85], Verwey y Overbeek [86] y establece que la
interaccin entre dos partculas coloidales se explica mediante un balance de
las fuerzas de dispersin atractivas, fuerzas de London -Van der Waals y las
de repulsin electrostticas, debidas al solapamiento de sus dobles capas
elctricas. Estas dos fuerzas se pueden evaluar por separado, gracias a que
su origen es independiente. Dependiendo de la magnitud relativa de estas
dos interacciones, el valor neto de la interaccin puede ser atractivo o
repulsivo (Ver Figura 1.7).
En esta teora se supone que las partculas que interaccionan son tan
grandes, comparadas con los iones del polielectrolito de su alrededor que
permanecen inmviles en la disolucin, lo que permite expresar la
interaccin entre las partculas en funcin de la distancia.
La teora DLVO tambin supone que la partcula tiene una distribucin

de carga superficial uniforme, por lo que no se puede explicar en aquello s
casos en los que la distribucin de carga sea irregular.
De forma general, la adicin de polielectrolitos cargados sobre una
disolucin de partculas cargadas provoca dos fenmenos: inversin de
carga [87-90] de la partcula y condensacin del polielectrolito (re-entrant
condensation) [87, 88, 91] . El primero ocurre cuando poliiones de carga
contraria se depositan sobre la superficie de la partcula y la carga efectiva
que caracterizaba a la partcula invierte su signo. El segundo efecto,
coincidente con la inversin de carga, consiste en la formacin de agregados
sobre la partcula y en la disolucin. El tamao de los agregados aumenta
con la concentracin del poliin hasta alcanzar un valor mximo (que es el
punto de inversin de carga) a partir del cual decrece hasta volver a su valor
inicial o un poco mayor debido al espesor del polielectrolito depositado
sobre la partcula.
La formacin de estos agregados es independiente del sistema polmero-
partcula elegido, ya que ha sido observado en liposomas catinicos
interaccionando con polielectrolitos aninicos [87] , niosomas hbridos [92]
interaccionando con polielectrolitos catinicos y en partculas de
poliestireno cargadas interaccionando con polielectrolitos naturales [93, 94] de
carga opuesta. Por esta razn, y encontrada la limitacin de no poder
explicar la heterogeneidad de la carga por la teora DLVO, se han buscado
nuevas herramientas.
Velegol y Twar [95] modificaron la teora clsica DLVO teniendo en
cuenta la distribucin de carga no uniforme sobre la superficie de las
partculas. Demostraron que la distribucin de carga no uniforme y la
superficie de las partculas coloidales dan lugar a un potencial inter-
partcula que, incluso en partculas con la misma carga, tiene un
componente atractivo.
El modelo se basa en la aproximacin de Derjaguin y en una extensin
del modelo de Hogg-Healy-Fuerstenau (HHF) [96] . El potencial resultante
depende del promedio del potencial electrosttico superficial y de su
desviacin estndar. Velegol y Twar supusieron que la superficie de la
partcula, S, tipo est formada por N regiones (si se nombran como i, va
del i=1,N ) y cada una de ellas tiene un potencial de superficie, . Estas
i
regiones deben ser de un tamao suficiente tal que L , donde L es la

longitud de la cadena, as las interacciones laterales se pueden despreciar
Figura 1.7 Variables que interviene en la aproximacin de Derjaguin para dos

partculas prximas de radio R A y R B , respectivamente.
(prcticamente significa que L 1 y L H donde 1 es la longitud de

Debye). Los potenciales de superficie, A y B , de dos partculas que se
aproximan en la teora HHF es por lo tanto remplazado con un valor del
potencial individual que depende de la regin en la que se est de la
superficie, A y B donde i y j son los dominios (de las partculas de carga
i j
opuesta) que en ese momento se encuentran cercanos. Definiendo como

el potencial medio, se puede escribir: , donde es una
i i i
contribucin que vara en funcin de la regin en la que nos situe. Este valor
est distribuido de forma independiente y no est correlacionado, es decir:
A2 A2 ij , si A

Ai Bi A B si A B (1.23)
2
B B , si B
2 ij
donde es la funcin delta Krenecker y es la desviacin estndar del

ij
potencial de superficie de las esferas tipo . As, la expresin resultante para

la fuerza media del potencial resultante proporcionado por Velegol y Twar
ser:
A2 B2 2 A iA 2 B iB A2 B2 1 coth hi
M
AB 2 A iA B iB
2 i 1
S (1.24)

cosh ki
donde M es la suma de todas las regiones implicadas de las partculas y h i es

la distancia entre las i regiones. La media viene dada por:
A2 B2 A2 B2 1 coth hi
M

AB 2 A B
2 i 1
S (1.25)

cosh ki
Si se aplica la aproximacin de Derjaguin, la suma anterior puede escribirse

como
RA RB 2
hH r (1.26)
2 RA RB
y para cualquier funcin genrica entre las superficies de dos esferas, F(h),
se emplea la siguiente funcin:
M
RA RB
F h A 2 R F (h)dh (1.27)
A RB
i i 0
i 1
donde r es el radio del anillo, de manera que el par de fuerzas del potencial
de interaccin medio queda
A2 B2 A2 B2 ln 1 e2 H
RA RB
AB (1.28)
RA RB 2 A B ln coth H

2
donde es la permitividad dielctrica del medio de dispersin, 1 es la

longitud de Debye y H es la distancia entre las superficies de las partculas.
Como podemos observar, el potencial combina un trmino de carga neta
de repulsin ( ) y otro de atraccin ( ) debido a la
heterogeneidad de la carga y conduce a la presencia de una barr era de
energa. El valor mximo de este potencial representa la barrera de energa
que la partcula debe sobrepasar para producirse la adsorcin del
polielectrolito sobre la misma.
Cuando se cumplen las siguientes condiciones: R >>1 y HR <<1
siendo =A,B; si A y B son relativamente pequeos (menos de 25mV a
temperatura ambiente) y las partculas son de la misma naturaleza qumica y

con cargas similares, se recupera la aproximacin de Derjaguin.
Si las dos partculas estn uniformemente cargadas, , la expresin
se convierte en la expresin de HHF para dos esferas idnticas:
2 2
ln 1 2
2 2

2
AB R
max (1.29)
2 2
2 2

ln 2

y, por tanto, la distancia mxima a la que se encuentran dos partculas queda
1 2 2
H max ln (1.30)
2
El valor de max de esta barrera aumenta linealmente con el radio de la

curvatura, R, de las superficies de las partculas que se aproximan, y para
partculas deformables (como es el caso de polielectrolitos que recubre los
liposomas), el tamao del agregado depende del potencial superficial . A
baja fuerza inica hay una contribucin de fuerzas de atraccin de Van der
Waals que opera a distancias muy cortas pero que apenas modifica la
situacin. Al realizar una simulacin utilizando el potencial de Velegol -
Twar, y modelizando la coagulacin como un proceso de agregacin debido
a la compactacin producida sobre los liposomas, se concluye que cuando se
alcanza la barrera tpica de energa 10k b T, el grupo de liposomas queda
cinticamente estabilizado. Como consecuencia, se puede escribir una
expresin para el radio cintico de equilibrio:
1
10 KbT
2 2 2 2 2

Req
2 2
ln 2
1 2
ln (1.31)

2

Resumiendo, el modelo de Velegol y Twar considera que:

La anchura de la barrera de potencial no depende de la longitud de
Debye k -1 . Como consecuencia, si se vara la fuerza inica no cambia
la fuerza de interaccin, tan solo modifica la distancia a la que ocurre
la interaccin mxima.
Usando la aproximacin de Derjaguin, se da una dependencia lineal

entre la anchura de la barrera con el radio de las partculas, de forma
que partculas ms grandes interaccionan ms que las pequeas y por
tanto la agregacin en las grandes queda inhibida.
max es cero cuando =0 y el lim H max 0 . Esto es consistente
0
con la no existencia de componente atractiva para partculas
uniformemente cargadas y un valor bajo de determina la interaccin
de corto alcance.
Partculas coloidales con pequeo radio de curvatura o alta anisotropa
respecto a la distribucin de carga, sern caracterizadas por una
agregacin ms rpida.
En los clculos generales, la contribucin de atraccin asociada a la
interaccin de Van der Waals entre dos partculas es despreci able. Para el
caso de liposomas formados por una bicapa cuyo interior es el disolvente, se
caracteriza por dos radios, interno y externo correspondiente a la bicapa. La
interaccin de Van der Waals puede describirse como:
AR1R2 1 2 1 A H H 2d
VrdW ln (1.32)
6 R1 R2 H 2d H d H 6 2 H d
donde A es la constante de Hamaker. Los resultados tpicos procedentes de

la resolucin de esta ecuacin para liposomas son para una atraccin entre
partculas a una distancia de 1-2 nm. Como la distancia es siempre ms
pequea que Hmax , la fuerza de van der Waals se desprecia en el proceso de
agregacin irreversible.
1.3.3 Clasificacin de liposomas

Para que los liposomas se formen es necesario que se alcance una
concentracin mnima, conocida como concentracin vesicular crtica,
cvc [84]. Adems de este parmetro, las disoluciones vesiculares se
caracterizan por la lamelaridad vesicular, la polidispersidad de tamaos y la
micropolaridad de los diferentes microentornos vesiculares. La clasificacin
de los liposomas se puede realizar en base a tres criterios: atendiendo a sus
caractersticas fisicoqumicas, al proceso por el que han sido elaborados y a
las aplicaciones de los liposomas.
Para la clasificacin de los liposomas en funcin de sus caractersticas

fisicoqumicas, se tiene en cuenta su tamao y el nmero de bicapas o
lamelas que conforman la pared del liposoma [97] .
En el caso de ser una sola bicapa la que separa el interior del disolvente
externo, segn se observa en la Figura 1.8, las estructuras se clasifican en
funcin de su tamao como vesculas unilamelares pequeas [98, 99] (SUV)
cuyo tamao puede ser desde 40 hasta 100 nm, grandes (LUV) cuyo tamao
puede ser hasta de 500 nm o gigantes [100, 101] (GUV) con un tamao mayor a
1 m. Tambin se ha encontrado que varias vesculas unilamelares estn
formando parte de una vescula mayor, a este tipo se denomina vescula
multivesicular (MVV) con tamao mayor a 1 m[102].
En la Figura 1.8 las vesculas con varias bicapas que atrapan en su
interior parte del disolvente se les llama multilamelares (MLV) y su tamao
ser mayor a 500 nm. Las vesculas multilamelares cuyo tamao est en el
rango de 100 nm hasta 1 m se denominan oligomelares (OLV) [9].
Figura 1.8 Diferentes tipos de vesculas: SUV o vesculas unilamelares pequeas,

LUV o vesculas unilamelares grandes y MLV [27, 28] o vesculas
multilamelares.
1.3.4 Tcnicas de obtencin de liposomas

Obtencin de Liposomas tipo SUV. Se utiliza el denominado mtodo de
dispersin simple [9], que es el ms conocido y sencillo, y se realiza en varias
etapas [54, 97, 103]:
Liofilizacin o evaporacin para la obtencin de la bicapa lipdica a
partir de disoluciones de lpido en medios no polares. Se parte de
lpidos disueltos en disolventes orgnicos como son el cloroformo o el
ciclohexano. Las disoluciones de los distintos lpidos que pretenden
utilizarse se mezclan en proporcin adecuada, dependiendo el tipo de
liposoma con el que se quiere trabajar, y en el caso de la mezcla, sta
queda optimizada. El disolvente se evapora mediante una bomba de
vaco o con ayuda de una corriente de N 2 o Ar obtindose una fina
pelcula formada por la bicapa lipdica sobre las paredes del vial con
el que se trabaja [104].
Hidratacin de la bicapa lipdica y dispersin en medios polares tales
como agua, o disolucin tampn, generalmente se regula la fuerza
inica para que la disolucin adquiera la conductividad elctrica
adecuada. La hidratacin debe hacerse por encima de la temperatura
de transicin del lpido durante 30 minutos y con ayuda de un agitador
mecnico. De esta forma parte del agua queda atrapada en la bicapa
lipdica y el resto queda inmerso en el interior del liposoma, el cual se
forma espontneamente en contacto con la disolucin acuosa. Los
liposomas obtenidos de esta forma son fundamentalmente SUV pero,
como al formarse espontneamente, no existe un control directo del
tamao obtenido, por ello hay que utilizar posteriormente la tcnica de
la extrusin para que el tamao de los liposomas sea ms
homogneo [105].
En la extrusin de fosfolpidos, las vesculas unilamelares y
multilameres se hacen pasar por un filtro de policarbonato de un
tamao de poro definido (en este trabajo se han utilizado de 50, 100,
200 y 1000 nm de dimetro), en el que al final quedarn retenidas
nicamente las bicapas que no han formado vesculas; la mayora de
los liposomas de la disolucin as obtenidos sern unilamelares [98, 106,
107]
.
Adems del mtodo de dispersin simple existen otros mtodos para
obtener este tipo de liposomas:
Inyeccin de etanol o ter: Los lpidos de partida se disuelven en

etanol o ter, y la disolucin se inyecta rpidamente en una disolucin
tampn con la que se quiere trabajar, dando lugar a la formacin
espontnea de vesculas, principalmente SUV, aunque tambin se
forman algunas MLV. Posteriormente se lleva a cabo una
ultrafiltracin para eliminar los posibles restos de etanol o ter segn
sea el caso [108] .
Dilisis del detergente: Este es el caso cuando las vesculas se
preparan mezclando detergente y fosfolpidos, lo que inicialmente da
lugar a la formacin de micelas mixtas, de forma que una vez que se
dializa el detergente se obtienen liposomas unilamelares [109].
Existen otros mtodos para obtener diferentes tamaos de liposomas , que
no van a utilizarse en esta tesis pero que es importante conocer.
Obtencin de Liposomas tipo LUV. El mtodo utilizado se denomina

evaporacin en fase reversa [110], y utiliza un volumen muy pequeo de fase
acuosa en la solucin orgnica en la que estn inmersos los fosfolpidos
(relacin molar 1:3). Tras la adicin de la fase acuosa por encima de la
temperatura de transicin del lpido, la mezcla se sonica dando lugar a una
emulsin. La fase orgnica se elimina a presin reducida dando lugar a
liposomas en una fase de gel intermedio. Finalmente tras una fuerte
agitacin se obtiene una disolucin concentrada de vesculas muy
polidispersa desde pocos nanmetros hasta 10 m segn la composicin y
concentracin de los lpidos, la temperatura, fuerza de sonicacin y tiempo.
Con este mtodo se obtienen liposomas, que durante el tiempo de
almacenamiento a una temperatura generalmente por debajo de la
temperatura de transicin, no son estables por su elevada curvatura por lo
que tienden a fusionarse. Un problema asociado a este mtodo es que las
Figura 1.9 Procedimientos para la obtencin de liposomas. El mtodo de

dispersin simple para obtener MLV. A partir de ellos, el mtodo de
extrusin para obtener SUV o el mtodo de sonicacin -
homogeneizacin para obtener LUV [14] .
condiciones de trabajo son difcilmente reproducibles.

Obtencin de Liposomas tipo MLV. Se trata de un protocolo que
incluye varios ciclos de evaporacin del disolvente y sonicacin [111]. Se
inicia con el proceso de evaporacin del cloroformo en el que se encuentran
los lpidos y una vez se tiene la bicapa de lpidos, se aade ciclohexano con
un pequeo volumen de etanol (1-2% del volumen total) para aumentar la
miscibilidad. Se liofiliza la muestra con ayuda de un sistema de vaco
durante al menos 5 horas. As, la pelcula de lpidos otra vez formada y es el
momento de pasar al proceso de hidratacin de la bicapa lipdica, por
encima de la temperatura de transicin de fase de los lpidos, se agita
enrgicamente mediante un sonicador. Este proceso permite obtener
vesculas multilamelares, pero el tamao y la lamelaridad es difcil de
controlar [112].
La relacin que existe entre los tres tipos de liposomas se observa en la
Figura 1.9, segn la cual tras la hidratacin de la bicapa lipdica se forman
de forma espontnea liposomas multilamelares de diferente tamao. Segn
se aplique energa mecnica, tipo vrtex o sonicacin se obtiene liposomas
unilamelares pequeos o grandes. La extrusin es el mtodo que obtiene un
tamao ms homogneo y controlado de los liposomas ya que depende del
nmero de extrusiones que se realizan, mientras que la sonicacin depende,
entre otros factores, del tiempo de sonicacin y generalmente no es
reproducible.
En todos los casos, una vez obtenidos los liposomas, se deben almacenar
a una temperatura entre 4-8C a pH 7. En general su estabilidad en
disolucin es de una semana [113].
1.3.5 Aplicaciones de los liposomas

En sus comienzos los liposomas fueron utilizados para mimetizar
membranas celulares. A medida que los estudios avanzaban se encontraron
nuevas aplicaciones, entre las que destaca la vehiculizacin de principios
activos en el sector farmacutico por su prolongado tiempo de
circulacin [114]. Su versatilidad los ha convertido en sistemas de gran inters
para bilogos, mdicos, farmacuticos y la industria (farmacutica,
cosmtica, alimentaria, etc) [115].
En el sector farmacutico los liposomas utilizados estn formados

principalmente por fosfatidilcolinas. Este lpido es el principal componente
de la membrana celular, por lo que los liposomas se difunden en los tejidos
con mucha facilidad. Se utilizan como va de encapsulacin de molculas y
principios activos ya sean hidrosolubles o liposolubles y para la diagnosis y
tratamiento de infinidad de enfermedades, como el cncer y ya en los
ltimos aos en la terapia gnica [116, 117] .
La liberacin de frmacos constituye un campo importante tanto por la
relacin dosis/actividad, como la aplicacin puntual del medicamento sin
tener que recurrir a la invasin generalizada del organismo cuando solo sea
necesario en un determinado punto del organismo [118]. En principio, un
sistema de liberacin de frmacos debe controlar el lugar apropiado para el
principio activo y el momento adecuado de dosificacin. Los primeros
sistemas se centraban en perfiles constantes (cinticas de orden cero) para
evitar problemas asociados a la administracin convencional necesaria en el
tratamiento de enfermedades crnicas. En la actualidad, los nuevos siste mas
de liberacin de frmacos incluyen la optimizacin en la accin hacia los
tejidos y de las formas de dosificacin para conseguir una respuesta
adecuada con mnimo efecto no deseable. Adems se intenta que cubran
otras necesidades como conseguir una liberacin lenta de frmacos
hidrosolubles, mejorar la biodisponibilidad de medicamentos poco solubles
en disoluciones acuosas, desarrollar unos contenedores biodegradables y
controlar la liberacin de medicamentos txicos [119] .
Para conseguir este tipo de sistemas, las investigaciones actuales siguen
tres criterios independientes: el tiempo de dosificacin, el punto de
aplicacin y la sensibilidad al estmulo-respuesta. Adems de tener en
cuenta cualquiera de los criterios comentados, hay que tener en cuenta
varios aspectos referentes a sus componentes y al mtodo de preparacin
que se pueden resumir en los siguientes:
Cuanto ms elevada es la concentracin del lpido, mayor es la
proporcin de la fase acuosa atrapada y adems su vida media
aumentar.
El ndice de encapsulacin aumenta al realizar la hidratacin
lentamente.
La adicin de fosfolpidos cargados que hace ms grande la distancia
entre las membranas lipdicas, aumenta la cantidad de sustancia
liposoluble que puede ser encapsulada en entre la bicapa lipdica.
El mtodo de preparacin se elegir en funcin de la composicin, tipo

de liposoma y naturaleza del principio activo que se pretende incluir en el
sistema [120] .
Desde el punto de vista de aplicaciones de los liposomas como
consecuencia de las modificaciones que, con diferentes fines, se hayan
podido introducir en su estructura, se distinguen los siguientes tipos de
liposomas:
Liposomas convencionales.
Liposomas de circulacin prolongada o stealth liposomas.
Liposomas catinicos.
Inmunoliposomas.
Liposomas convencionales Son los liposomas clsicos de superficie
hidrofbica, constituidos por ejemplo por fosfatidilcolina y colesterol que,
tras su introduccin en la membrana celular son rpidamente recubiertos por
las protenas plasmticas y a continuacin eliminados de la circulacin, tras
ser fagocitados por las clulas [121].
Liposomas de circulacin prolongada (Stealth liposomes), en los que la
presencia de PEG en su superficie incrementa su hidrofilia, dando lugar a
una reduccin en la interaccin con protenas plasmticas y lipoprotenas [122,
123]
. Esta modificacin de los liposomas a la cual, teniendo en cuenta el
material utilizado, se ha dado en llamar pegilacin, sirve para conseguir dos
funciones muy importantes: la primera, un incremento en la
biodisponibilidad de los frmacos encapsulados, y la segunda, que el
proceso de liberacin sea ms lento y que se minimice la toxicidad y los
efectos secundarios [124]. Adems del PEG, otros polmeros como la
poliacrilamida, el alcohol polivinlico o la polivinilpirrolidona, han sido
utilizados para logar los mismos objetivos [125] . Estos liposomas se utilizan
preferentemente para la liberacin de frmacos en zonas en las que hay un
proceso infeccioso o una inflamacin [121].
Inmunoliposomas tienen la capacidad de dirigirse especficamente y
reconocer algunas clulas y rganos del cuerpo. Esto se consigue mediante
la presencia de determinados elementos introducidos en el diseo de su
estructura, como pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos,
unidos a la superficie de los liposomas [126]. La eleccin del antgeno diana,
la funcin del anticuerpo y el tipo del entrecruzador utilizado para lograr su
unin a la superficie son factores que requieren un anlisis exhaustivo en el

diseo de este tipo de liposomas [127].
Liposomas catinicos, en los que su principal aplicacin es la
vehiculizacin de material gentico [116] . Los lpidos catinicos constitutivos
de estos liposomas neutralizan la carga negativa del ADN, formando as una
estructura compacta aunque diferente de la estructura vesicular tpica de los
liposomas. Estos complejos resultantes de la interaccin entre el ADN y los
lpidos catinicos proporcionan una proteccin al material gentico [121] .
1.3.6 Liposomas cargados

Esta tesis se centrar en vesculas fosfolipdicas cargadas [128] , por lo que se
proceder a una descripcin sucinta de las mismas.
La carga superficial de un liposoma crea un campo elctrico que afecta a
la estructura de la bicapa, a su fluidez y al transporte de molculas a travs
de la membrana [129]. Esta carga superficial es muy importante en la
estabilidad coloidal de los liposomas ya que los procesos de agregacin y
fusin de estos sistemas estn controlados, en gran parte, por la repulsin o
atraccin de sus superficies lipdicas.
La composicin fosfolipdica de la bicapa marca la carga su perficial de
los liposomas. En la Tabla 1.2 se muestra la carga de las cabezas polares
que es lo que proporciona la carga al mismo.
La agregacin de liposomas neutros se produce por interacciones de Van
Tabla 1.2 Nombres y estructuras de algunas cabezas polares ms utilizadas

Regin polar Nombre Abreviatura Carga
-OH cido fosfatdico PA Negativa
-CH2CH2N(CH3)3 Fosfatidilcolina PC Zwiterinico
+
-CH2CH2NH3 Fosfatidiletanolamina PE Zwiterinico
+ -
-CH2CH2NH3 COO Fosfatidilserina PS Negativa
-CH2CHOH CH2OH Fosfatidilglicerol PG Negativa
-HC6H5(OH)5 Fosfatidilinositol PI Negativa
1.4 Microgeles 49
der Waals. Es un fenmeno natural e inevitable para este tipo de liposomas

pero es posible vencerla si se introduce carga, es decir, se mezclan
lpidos [102]. La teora en la que se basa la estabilidad coloidal es la teora de
Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO) [60, 130] que describe las fuerzas
de interaccin que se producen. Se supone que el potencial de interaccin
total entre dos partculas es la suma del potencial repulsivo electrosttico y
el potencial atractivo de Van der Waals.
Teniendo en cuenta esta teora, un sistema es estable si la repulsin
electrosttica entre dos partculas es superior a las fuerzas de Van der Waals
existentes entre ellas. Desde el punto de vista termodinmico, los liposomas
son sistemas inestables y tienden de forma natural a agregarse o fusionarse
para as disminuir su energa libre y su rea. Si permanecen estables es
como consecuencia de la existencia de un mecanismo estabilizador
(repulsin electrosttica, impedimentos estricos). Por lo tanto, trabajar con
liposomas cargados almacenados a baja fuerza inica es recomendable y
ventajoso [9] .
La teora DLVO ha tenido aportaciones relacionadas con trminos
energticos asociados a parmetros que no haban sido tenidos en cuenta,
volvindose ms general [131] . Esto permite el desarrollo de nuevos mtodos
de estabilizacin de vesculas cargadas, incluyendo el ensamblaje de
polielectrolitos sobre el liposoma mediante reacciones qumicas muy
simples o combinando la interaccin electrosttica y la reaccin qumica, de
manera que se pueden obtener liposomas mucho ms verstiles [37] .
1.4 MICROGELES
Se denomina microgel a una red de polmeros formada por el
entrecruzamiento de cadenas que son capaces de absorber y retener
polmeros solubles en su interior [132] y cuyo tamao oscila de 100 nm a
1 m, lo que les diferencia de sus homlogos hidrogeles (Ver Figura 1.10).
Todos los microgeles absorben agua pero no todos dan una respuesta en
funcin del estmulo exterior. Teniendo esto en cuenta, en esta tesis tan solo
se va a hablar de los microgeles con un tamao inferior a 1 m que
responden a un estmulo externo (T, pH, etc.) denominados polmeros

inteligentes o smart materials.
Segn las bsquedas realizadas, la primera vez que se acu el trmino
smart material [133] fue en un artculo periodstico del ao 1988. En este
trabajo se describa el uso de fluidos electrorreolgicos (ER) para crear
materiales inteligentes. Estos fluidos tenan potencial para cambiar su
viscosidad casi instantneamente en respuesta a una corriente elctrica. El
hecho pona de manifiesto la existencia de un nuevo tipo de material con
capacidad para modificar sus propiedades en un momento determinado y
ajustarse a cambios en condiciones del entorno [134] .
En ese mismo ao, apareci un artculo de revisin sobre los polmeros
conductores funcionales, donde se vislumbraba su aplicacin potencial como
materiales inteligentes. Dos aos ms tarde, en 1991 se public un artculo
sobre hidrogeles y polmeros sensibles a estmulos externos y sus
aplicaciones como biomateriales inteligentes [135].
Los polmeros con memoria de forma se distinguen por su baja densidad
y presentan la capacidad de recuperarse de grandes tracciones impuestas por
cargas mecnicas, sin sufrir ningn tipo de degradacin material. Estos
materiales fueron patentados por primera vez por una compaa japonesa en
1984 [136] y desde entonces han sido numerosos los tipos de polmeros
comercializados.
Los polmeros que responden a estmulos externos, son materiales que
responden con cambios grandes y bien definidos a pequeos cambios fsicos
como pH [137] , temperatura [138, 139], fuerza inica, naturaleza y composicin
del medio [140]. En la mayora de estos materiales existe un valor en el que
ocurre un cambio estructural, y adems esta transicin que sufren es
completamente reversible. En 1998 Wu,C y Wang, X describieron por
primera vez una transicin trmica ovillo-glbulo de una cadena lineal de
Poli-(N-isopropilacrilamida), p-(NIPAM) de alto peso molecular [141].
Estos polmeros disueltos en disolucin acuosa, cuando se estimulan [142]
se hinchan aumentando considerablemente su volumen hasta alcanzar un
equilibrio qumico-fsico sin perder su forma. El estado hinchado es el
resultado del balance de fuerzas dispersivas y cohesivas intermoleculares
que actan en las cadenas hidratadas. Las fuerzas cohesivas se deben
principalmente a los entrecruzamientos covalentes y las f uerzas dispersivas
se deben ms a las interacciones dipolo-dipolo o fuerzas electrostticas [143].
1.4 Microgeles 51
Figura 1.10 Mecanismo de formacin de un microgel cuya temperatura consoluta

inferior, LCST, indica si ha absorbido agua mostrando una estructura
hinchada o no denominndose microgel colapsado [16] .
Los microgeles se clasifican en funcin del tipo de estmulo al que

responden, aunque en esta tesis tan solo se va a hablar de dos tipos, con
respuesta a la temperatura y con respuesta al pH. Estos estmulos son claves
en los procesos biolgicos. Es posible ver los dos efectos en un mismo
microgel si se copolimerizan polielectrolitos dbilmente ionizados con las
redes de microgel termosensible [144, 145] .
Los microgeles termosensibles entrecruzados covalentemente son quizs
los ms estudiados en el rea de polmeros sensibles a estmulos externos,
entre los que destacan los derivados de p-(NIPAM), que como son con los
que se ha trabajado en esta tesis nos referimos a ellos y a su comportamiento
a partir de ahora.
1.4.1 Geles sensibles a la temperatura

Microgeles sensibles a la temperatura son aquellos que en disolucin sufren
algn tipo de cambio en su conformacin al variar la temperatura. Dado que
forman enlaces de hidrgeno con el agua, las perturbaciones en los enlaces
producidas por la variacin de la temperatura causan separaciones de fase o
contracciones que desde el punto de vista termodinmico el proceso se
describe como
Gmez H mez T Smez 0 (1.33)
siendo la energa libre de mezcla del proceso negativa [17] para que el
microgel no precipite [146] . Si las molculas del microgel no estuvieran
entrecruzadas, ste se disolvera en el disolvente para mantener negativo el

valor de la energa de mezcla, Gmez , apareciendo una componente elstica,
Gelas que marca el lmite de la expansin que sufre el microgel en
disolucin [146, 147].
Como una primera aproximacin, podemos tomar como situacin de
referencia aquella en que S y H son positivos y las interacciones
polmero-polmero y disolvente-disolvente suelen ser preferidas a las
polmero-disolvente (aumento entlpico en la mezcla). Para este caso y
desde el punto de vista termodinmico hay una competencia entre el trmino
entrpico (que contribuye positivamente a la mezcla) y el entlpico (que
contribuye negativamente). La energa libre de mezcla est dada por la
teora de Flory- Huggings [148]:
V
Gmix kBT 1 ln 1 1 (1.34)
a3
donde V es el volumen del microgel, a es la longitud del segmento

monomrico, es la fraccin molar del polmero y es el parmetro de
interaccin de Flory- Huggings. Si V 0 es el volumen del microgel antes de la
expansin, 0 es la correspondiente fraccin del volumen, n c es el nmero
de las cadenas polimricas, la energa elstica viene dada por la ecuacin
(1.35)

2/3
3
Gelas nc kBT 0 (1.35)
2
Y la energa libre se convierte en:
V 3nc a3 0
2/3

G Gmez Gelast k BT 03 0 1 ln 1 1 (1.36)
a 2V0
En el equilibrio el potencial qumico del disolvente, s , debe satisfacer la

condicin de
s , P , T s 0, P, T (1.37)
donde es la presin osmtica que corresponde con la presin necesaria

para mantener el equilibrio de las molculas del disolvente [146, 149]. De
esta forma,
1.4 Microgeles 53
k T

1/3
1
B3 ln 1 2 0 (1.38)
N
a gel 2 0 0

donde N gel es el la media del grado de entrecruzamiento de las cadenas

polimricas. Una vez que el equilibrio se ha alcanzado, la presin osmtica
de las molculas del disolvente dentro del microgel debe ser cero asumiendo
condiciones isobricas, los cambios de volumen del microgel pueden ser
calculados [146, 150]. En esta situacin de equilibrio se obtiene la ecuacin
desarrollada por Flory-Rehner [151, 152] , quienes lo aplican a redes polimricas
simples en presencia de molculas pequeas.
Vemos en la ecuacin (1.33) que la temperatura, que est en el
componente entrpico puede jugar un papel importante en la solubilizacin
o mezcla. Si se supone que la situacin es H>0, S>0, se parte de
condiciones de mezcla (TS>H) y se disminuye la temperatura se llega a
un valor tal que el componente entlpico iguale al entrpico. Por debajo de
esta temperatura no habr mezcla completa o solubilizacin completa sino
que se producir una separacin de fases. Este proceso, por otra parte, es
reversible, de forma que si se calienta la solucin de nuevo se obtiene una
mezcla homognea. Hay que hacer varios comentarios a la descripcin
anterior. En primer lugar, la temperatura de separacin de fases depende de
la concentracin de polmero tal y como se muestra en la Figura 1.11 a),
Figura 1.11 Diagrama de fases para el comportamiento de un microgel ideal con:

a) temperatura consoluta superior o mxima a la que el microgel se
calienta para que se disuelva (UCST) y b) temperatura consoluta
inferior o mnima a la que hay que calentar para que el microgel no
precipite (LCST) [12] .
donde se ha dibujado un diagrama de fases ideal de un sistema

polmero/disolvente de este tipo. Por tanto, la solubilidad de un polmero
depende de la temperatura y de la concentracin. En segundo lugar,
separacin de fases no significa formacin de fases puras de polmero y
disolvente sino de fases ricas en uno y en otro, como tambin se indica en la
Figura 1.11 a). Al mximo de la curva en el diagrama de fases se le
denomina punto crtico, y tiene asociado una temperatura crtica y una
concentracin crtica. A este tipo de comportamiento se le identifica como
UCST (upper critical solution temperature), es decir, temperatura consoluta
superior entre la curva binodal y espinodal.
Sin embargo, no siempre los diagramas de fases son tan simples como el
mostrado en la Figura 1.11 a). Muchos de los polmeros solubles en agua
(como las poli-alquil-acrilamidas, familia a la que pertenece p-(NIPAM)
presentan intervalos de temperatura en los que las variaciones entlpicas y
entrpicas son negativas, por diferentes razones: H puede ser negativo
debido a la contraccin de volumen, y S puede ser negativa debido a
cuestiones relacionadas con el empaquetamiento molecular. En este caso, si
H<0, S<0, se est en una situacin inversa a la anterior: el componente
entlpico contribuye a la mezcla y el entrpico no, por lo que si se parte de
una situacin de mezcla homognea, es un aumento de la temperatura el que
da lugar a la separacin de fases puesto que se llegar a una temperatura en
que el trmino entrpico sea ms relevante que el entlpico. En este caso, el
diagrama de fases tiene la forma que se muestra en la Figura 1.11 b), y a
este comportamiento se le llama LCST [153] (lower critical solution
temperature) o temperatura consoluta inferior, ya que en este caso, el punto
crtico, definido de nuevo por una temperatura crtica y una concentracin
crtica, es el mnimo de la curva [12].
Figura 1.12 Diagrama de fases de p-(NIPAM) formado por dos regiones [12] .
1.4 Microgeles 55
En realidad, la UCST y la LCST suelen coexistir en el diagrama de fase s

como se observa en la Figura 1.12 ya que hay variaciones de signo de H y
S con la temperatura), siendo habitualmente UCST>LCST para los
polmeros solubles en agua, por lo que se definira en principio una regin
bifsica enmarcada por las dos curvas de separacin de fases.
La separacin de fases tipo LCST, es decir, temperatura consoluta
inferior se considera que est entrpicamente inducido (ya que es el factor
entrpico el que contribuye negativamente a la mezcla). Por el contrario, el
tipo UCST se dice que est entlpicamente inducido. En el caso del p-
(NIPAM), la UCST puede estar por encima del punto de ebullici n del agua
y no es observable. El comportamiento LCST est ntimamente relacionado
con el balance hidrfilo/hidrfobo de la cadena.
Podemos considerar que hay una competencia entre el componente
entrpico y el entlpico, estando este ltimo relacionado con el nmero de
molculas de agua unidas al polmero mediante enlaces de hidrgeno. Por
debajo de la LCST el componente entlpico es ms importante y predominan
las interacciones hidrfilas (enlaces de hidrgeno con el agua) y hay mezcla
homognea, mientras que por encima de la LCST es ms importante el
componente entrpico y se produce la separacin de fases en la que las
interacciones hidrfobas polmero/polmero son las preferidas. La capacidad
de formacin de enlaces de hidrgeno y por tanto la LCST se pueden
modular mediante copolimerizacin con monmeros hidrfilos (aumento de
LCST) o monmeros hidrfobos (disminucin de LCST).
El comportamiento descrito en la Figura 1.11 es el que corresponde a las
cadenas lineales de p-(NIPAM). En el caso de geles entrecruzados no hay
estrictamente separacin de fases sino contraccin de la red en el intervalo
Figura 1.13 Esquema de la respuesta estimulada de los microgeles. Cuando la

temperatura es mayor que VPPT o el pH es mayor que el pk a del
microgel, ste reduce su volumen, es decir, se colapsa.
de temperaturas marcado por las cadenas lineales. Por encima de la LCST el

gel est contrado, las molculas de agua son expulsadas de la red, y por
debajo, expandido y se hincha de forma que los lmites de variacin de
volumen vienen marcados por la existencia de la componenete elstica que
es la que marca el lmite para que el microgel no se disuelva completamente.
Este cambio en el volumen (ver Figura 1.13) ocurre a una temperatura
mayor de la temperatura de transicin de fase de volumen (VPPT) y permite
la liberacin de las molculas que se hubieran encapsulado de forma
reversible, si fuera el caso.
1.4.2 Geles sensibles al pH

Los polmeros sensibles al pH son polielectrolitos con grupos cido o bsico
que aceptan o ceden protones en respuesta a cambios en el pH del medio [133].
Los grupos funcionales como los cidos carboxlicos, el cido fosfrico y
las bases dbiles como las aminas, muestran cambios en su estado de
ionizacin bajo variaciones de pH (ver Figura 1.13). Esto conduce a un
cambio conformacional del polmero soluble y a un cambio en el
hinchamiento de los hidrogeles cuando los grupos ionizables estn unidos a
la estructura polimrica [154]. Los monmeros clsicos son el cido acrlico,
el cido metacrlico, anhdrido maleico, y N,N-dimetilaminoetil metacrilato.
Pero tambin se han descrito polmeros que contienen derivados del cido
fosfrico [145].
Los polmeros sensibles al pH se emplean en varias aplicaciones
biomdicas, siendo la aplicacin ms importante su uso en sistemas de
liberacin de frmacos y sensores de glucosa [155, 156] . El pH varia a lo largo
del tracto gastrointestinal entre 2 (estmago) y 10 (colon), lo que ocasiona
que los polmeros sensibles al pH sean ideales para la li beracin de
frmacos especficos del colon. La propuesta ms comn utiliza polmeros
entricos (ideales para el aparato digestivo), que resisten la degradacin en
medio cido y liberan el frmaco en medio alcalino debido a la formacin de
la sal [154].
Los microgeles sensibles al pH se utilizan con frecuencia en el desarrollo
de formulaciones para la liberacin controlada de frmacos con
administracin oral aprovechando las diferencias de pH entre la boca, el
estmago (<3), el intestino y el colon. Los microgeles policatinicos, por
1.4 Microgeles 57
ejemplo, se hinchan muy levemente a pH neutro, minimizando as la

liberacin del frmaco en el entorno neutro de la boca [157, 158].
Los microgeles de polianiones (por ejemplo, el cido poliacrlico)
entrecruzados con azoaromticos se desarrollaron para la liberacin de
frmacos especficos para el colon. En el estmago, su hinchamiento es
mnimo pero aumenta a medida que el hidrogel pasa por el tracto intestinal
debido al aumento del pH que conduce a la ionizacin de los grupos
carboxlicos [45]. Mohan, Y. y col. [45, 159] investigaron el hinchamiento o
dilatacin de estos microgeles frente a diversos estmulos: pH, diferentes
tensioactivos y disoluciones con polielectrolitos a diferentes temperaturas.
Este trabajo describi la cintica del hinchamiento y las caractersticas de
difusin del hidrogel en diferentes medios. La alta capacidad de
hinchamiento y el equilibrio acuoso de estos microgeles hacen de ello s
materiales idneos para ser aplicados en bioingeniera.
Dado que en gran nmero de aplicaciones se utilizan polmeros con
grupos cargados (polielectrolitos), describiremos brevemente algunas
caractersticas de su comportamiento.
1.5 POLIELECTROLITOS
Los polielectrolitos son polmeros con grupos ionizables que en disolventes
polares, como el agua, se disocian en cadenas de polmeros cargados y en
contraiones. En disolucin estos polmeros pueden adoptar distintas
conformaciones desde la de ovillo aleatorio a la de cadena estirada,
dependiendo de la naturaleza qumica del sistema polmero -solvente, de la
temperatura y de la fuerza inica de la solucin [159] . La solubilidad de los
polielectrolitos viene dada por las interacciones con el disolvente, y por una
ganancia muy grande de entropa cuando se liberan los contraiones.
Dependiendo de su origen se puede hablar de los polmeros naturales,
como el ADN, polmeros naturales modificados, como puede ser la celulosa,
y por ltimo sintticos, como puede ser el cido poliestirensulfnico
dependiendo de su origen.
En la Figura 1.14 se muestra la clasificacin en trminos de carga
dispuesta en sus cadenas para unas condiciones de pH dadas, as los
Figura 1.14 Clasificacin de los polielectrolitos atendiendo a su carga: a)

policationes, b) polianiones y c) anfolitos [7] .
polianiones poseen carga negativa, los policationes carga positiva, y

polianfolitos que poseen ambas cargas y dependiendo de las condiciones del
medio se comportan como policationes o polianiones. Por ltimo, se puede
hablar de una clasificacin en funcin de la densidad de carga y acidez de
los grupos funcionales. Al igual que se clasifican los electrolitos como
fuertes o dbiles, los polielectrolitos fuertes tienen todos sus iones
completamente disociados y las cargas no pueden migrar o desplazarse a lo
largo de la cadena, es decir, tienen alta densidad de carga. Por el contrario
los polielectrolitos dbiles tienen baja densidad de carga, donde la carga de
los grupos qumicos depende de condiciones externas, sea el pH o la fuerza
inica, por ejemplo [160].
Las interacciones electrostticas entre molculas cargadas controlan gran
diversidad de procesos a nivel biolgico, de ah el enorme inters que hay
en estudio, tanto experimental como tericamente [149, 161, 162].
La forma terica de tratar los polielectrolitos combina las leyes de la
electrosttica con la descripcin estadstica del medio lquido en el que los
iones y molculas se mueven.
Las interacciones entre dos polmeros neutros son en general de corto
alcance y dbiles. Sin embargo, un polielectrolito presenta adems
interacciones electrostticas de largo alcance, que deben ser tenidas en
cuenta ya que afectan a las propiedades conformacionales de los
1.5 Polielectrolitos 59
polielectrolitos [163] . Los modelos analticos para explicar la distribucin de

la carga ms conocidos son la teora de Poisson-Boltzmann [164] y la teora de
condensacin [165-167] , y son el punto de partida para modelos numricos ms
sofisticados.
De acuerdo con la teora de condensacin de Manning, se espera una
condensacin de contraiones sobre la cadena de polmero, lo que da lugar al
apantallamiento de las cargas de sta cambiando la conformacin del
polmero [165]. Para la teora de Manning, al igual que para la teora de
Poisson-Boltzmann, el disolvente es un continuo con constante dielctrica, ,
los iones son cargas puntuales con una densidad,, y densidad de carga, , y
el poli-in se considera una lnea de carga infinita caracterizada por el
parmetro de carga
e2
(1.39)
4 0Tb
siendo e la carga del electrn, la constante dielctrica, 0 la constante

dielctrica en el vaco, T la temperatura y b=1/N la distancia media entre las
cargas del polmero.
El punto de partida de la teora de Manning fueron las investigaciones
desarrolladas por L. Onsanger [168] en 1968 quien desarroll las primeras
ideas sobre condensacin de iones. G. Manning, mostr que la densidad de
carga de cadenas lineales de polielectrolitos no puede exceder un valor
crtico. El valor crtico se alcanza (=1) cuando la carga del polielectrolito
se reduce condensando algunos contra-iones. Por otro lado, en las
disoluciones de polielectrolitos se puede dar el fenmeno de asociacin
entre dos iones de carga contraria cuando la energa electrosttica iguala a la
energa trmica (k B T). Por ello, se define la longitud de Bjerrum [169] l B,
caracterstica del disolvente, que es la distancia permitida para dos cargas
electrostticas elementales en un disolvente en equilibrio y por tanto se
relaciona con la densidad de carga
lB
(1.40)
b
De acuerdo con la teora de condensacin de Manning, se puede decir que

los contraiones empiezan a condensarse si lB b .
1.5.1 Complejos de polielectrolitos

En disolucin, la interaccin electrosttica de tipo Coul omb entre
polielectrolitos con carga opuesta, conduce a la formacin de complejos de
inter-polielectrolito. La formacin de estos complejos est originada,
principalmente, por la ganancia de entropa del sistema al liberar los
contraiones retenidos en las cadenas.
Para formar un complejo de polielectrolitos, se mezclan disoluciones
acuosas de polianin y policatin. La formacin del complejo vendra
representada por el siguiente equilibrio:
A b B a

n

m
A B Ab
x n x
B a

m x
xa xb (1.41)
del complejo formado, donde A - y B + son los grupos con carga de los
polieletrolitos y b + y a - los contraiones; m y n son el nmero de grupos
aninicos y catinicos
La razn de mezcla ser igual a m/n o n/m y el grado de conversin
se define como x/n cuando nm n o x/m cuando mn. Este grado de
conversin depender del nmero de grupos inicos enlazados entre los dos
polielectrolitos, incluso con complejos estequiomtricamente preparados
se producen fenmenos conocidos como sobrecompensacin de cargas.
Tambin se forman complejos cuando uno de los polielectrolitos se
encuentra adsorbido tanto sobre superficies planas como esfricas. La
sobrecompensacin de cargas es responsable de que sobre una capa
adsorbida de un polielectrolito se adsorba una capa de poliel ectrolito de
carga opuesta, proceso que puede repetirse hasta formar multicapas con
numerosas capas de polielectrolitos, genera un espesor de cada bicapa
caracterstico de cada par de polielectrolitos estudiados y para unas
condiciones dadas de pH, fuerza inica y temperatura.
Esta formacin de complejos inter-polielectrolito es la base de la tcnica
de adsorcin alternada capa a capa que veremos ms adelante. Es importante
saber diferenciar entre dos conceptos que a partir de ahora se tratan : el
complejo polielectrolito formado por un par de polielectrolitos, y la
multicapa de polielectrolito que ocurre tras la adsorcin sucesiva de
polielectrolitos sobre una superficie cargada. La situacin
termodinmicamente ms estable para un par de polielectrolitos es la
formacin del complejo, si bien las multicapas son estructuras congeladas

desde el punto de vista cintico.
Existen pocas aproximaciones tericas para explicar la complejacin de
polielectrolitos. Para polielectrolitos dbiles se utiliza como base la te ora
de Deby-Hckel pero modificada por Castelnovo y Joanny [170]. En esta
teora se considera que las fluctuaciones de carga para la formacin de los
complejos es pequea y puede tratarse como un desarrollo truncado en el
segundo orden de la energa libre, que es consitente siempre y cuando la
fraccin de los monmeros cargados en los dos polmeros que forman el
complejo es pequea. Los complejos en disolucin se encuentran formados
al menos por cinco componentes, el disolvente, los dos polmeros a
concentraciones c + y c -, y los respectivos contraiones en la disolucin de
concentraciones n + y n -, considerando como contraiones todos los pequeos
iones que se encuentran en la disolucin incluidos los que provienen de las
sales aadidas. Aparece por tanto como nica limitacin la
electroneutralidad n + c + =n - c -. Como simplificacin para el estudio aqu
planteado, se consideran polmeros, N con igual nmero de monmeros
cargados f y con la misma concentracin c + =c -=c y n + =n -=n.
Los resultados que se obtienen son similares a los que se obtienen con la
teora estndar de Debye-Hckel; Las diferencias en la presin osmtica
entre el complejo y la fase diluida se expresa
k BT
el (1.42)
3
donde es la longitud de la correlacin electrosttica. En el equilibrio la

presin osmtica debe ser igual en ambas fases quedando la concentracin
del complejo definida por:
f2
ccompl 3
(1.43)
2 4
a nw
donde w hace referencia a la estequiometra del complejo. Cuando N es

pequeo, la entropa traslacional de las cadenas se incluye para el orden de
interaccin electrosttica atractiva y la formacin de complejos solo se
producir cuando
n 2 a 2 w3/ 4
1 (1.44)
f4
Si el peso molecular es demasiado pequeo o la fraccin de monmeros

cargados demasiado baja, la mezcla de poielectrolitos de distinta carga es
soluble en agua.
1.5.2 Capas de polielectrolitos. Sobrecompensacin

de cargas
Los modelos tericos utilizados para describir la interaccin de
polielectrolitos con partculas coloidales ayudan a entender los fenmenos
que aparecen cuando experimentalmente se ponen en contacto.
Ya se ha mencionado que la cantidad de polielectrolito adsorbido
depende, entre otros factores, de la flexibilidad de las cadenas de
polielectrolito y de la densidad de carga de la superficie que se recubre.
Existen aproximaciones tericas para describir la sobrecompensacin [171].
Para la mayor parte de poliiones, la relacin entre el espesor y el nmero
de capas es lineal [31] , aunque en el caso de la primera capa, sta siempre
depender del sustrato utilizado. Despus de un nmero determinado de
capas, el crecimiento alcanza un rgimen estacionario independiente del
sustrato [172].
Cuando el crecimiento que se produce es exponencial se relaciona con la
rugosidad de la superficie [173]. A medida que aumentan las capas, la
rugosidad aumenta y con ello el rea y las cargas disponibles para la
adsorcin. Visiones recientes han asociado este tipo de crecimiento a que se
produce una reorganizacin interna de las multicapas [174]. Esta
reorganizacin interna provoca que entre las cadenas de los distintos
polmeros no se de una interfase clara, de acuerdo a la teora de las capas
difusas [29], tal y como se muestra en la Figura 1.15.
Los modelos tericos planteados hasta ahora consideran solo la
interaccin entre capas adyacentes. Schlenoff y Dubas [175] describieron la
adsorcin en trminos de la distribucin de segmentos polimri cos
considerando dos parmetros: la sobrecompensacin y la longitud de la
multicapa, mostrando as el exceso de la ltima capa.
Para cadenas flexibles, J.F.Joanny [176] emple el mtodo del campo
autoconsistente para describir la adsorcin de una cadena de un
polielectrolito dbil: en un medio de fuerza inica baja, encontr que la
Figura 1.15 Modelo de capas difusas: Las multicapas estn representadas por un
perfil de concentracin de carcter sinusoidal (lneas negras) elegido
arbitrariamente. Para un sustrato con carga positiva, las curvas ms
oscuras corresponden a las capas de polianin y las curvas ms claras
corresponden a las capas de policatin.
sobrecompensacin se daba, pero que era poco significativa. Segn esta

teora unos pocos segmentos de cadena se extienden a lo largo de la
direccin z, perpendicular a la superficie, siendo stos los responsables de la
sobrecompensacin de la carga.
Por otro lado, J.F.Joanny [176] encontr que en el lmite de alta fuerza
inica, adems de las repulsiones entre los segmentos de una misma cadena
se producen fuertes interacciones atractivas de esos mismos segmentos con
la superficie. Como consecuencia, la adsorcin en estas condiciones de
fuerza inica no est dominada por la interaccin electrosttica, sino que es
dirigida por un potencial atractivo de corto alcance. En este momento las
cadenas comienzan a ser ms flexibles, provocando la sobrecompensacin
de la carga [29].
Una forma de ver el proceso de adsorcin-complejacin de las pelculas
polimricas es a travs de la dependencia del proceso con el tiempo [177, 178].
La cintica que habitualmente se observa se divide en dos etapas , la primera
se da en pocos segundos y la segunda ms lenta. La primera etapa implica el
transporte de las cadenas a la superficie y una deposicin rpida donde la
razn de deposicin queda determinada por la difusin de las cadenas hasta
que una repulsin las detiene [178, 179]. Despus, en la segunda etapa pueden
ocurrir reorganizaciones superficiales que permite la difusin de las cadenas

a la zona interna de la multicapa conduciendo a una complejacin
irreversible de cargas a una velocidad ms lenta hasta que se alcance la
saturacin [178, 180] .
1.5.3 Tcnica capa a capa (LbL)

La tcnica capa-a-capa (LbL) se basa en la adsorcin de polmeros con carga
opuesta sobre materiales cargados. Las ventajas de esta tcnica con respecto
a otras metodologas conocidas para la preparacin de pelculas delgadas, tal
como el autoensamblaje de una monocapa (SAM) [181] o el ensamblaje
Langmuir [76] -Blodgett [182],[183-185] son su versatilidad y simplicidad; con una
instrumentacin muy sencilla es posible formar estructuras complejas de
forma reproducible y con alta estabilidad.
El origen de esta tcnica puede encontrarse en el trabajo de Iler, quien en
1966 inform de la deposicin secuencial de partculas coloidales sobre
sustratos slidos [13] . En 1991, Decher y Hong [186] demostraron que los
polielectrolitos pueden ser ensamblados [177] sobre superficies slidas de
forma secuencial, estableciendo las bases para un rpido desarrollo de la
tcnica. El procedimiento consiste en la adsorcin alternada de especies con
mltiples cargas catinicas o aninicas sobre superficies macroscpicas
cargadas, observndose que cada paso de adsorcin conduce a la inversin
de la carga superficial, y que una serie de deposiciones consecutivas
conducen a un complejo estructurado en capas [187] . El espesor de una bicapa
de polielectrolitos y las propiedades fisicoqumicas de la pelcula se ven
influenciados por parmetros como el pH, fuerza inica, temperatura,
polaridad del disolvente, los cuales pueden controlarse ajustando las
condiciones experimentales [171, 188] .
Desde esta propuesta inicial [189] el mtodo LbL ha progresado
espectacularmente en el campo de la investigacin de materiales
nanoestructurados ya que el recubrimiento realizado es muy estable [190]. Por
ello, existen muchas lneas de investigacin en las que se describen el
ensamblaje de nanopartculas, cristales, protenas, cidos nucleicos,
polisacridos y una amplia variedad de materiales funcionales. En la
actualidad, no slo las fuerzas electrostticas [175, 191, 192] intervienen en el
proceso de ensamblado, sino que se estn utilizando otro tipo de fuerzas de
unin, como son los enlaces de hidrgeno, enlaces covalentes u otro tipo de
interacciones [193, 194] .
Numerosos estudios han demostrado que las biomolculas y otras
especies biolgicamente importantes pueden ser incorporados dentro de las
multicapas y siguen manteniendo o mejorando sus funciones biolgicas.
Algunos ejemplos incluyen la inmovilizacin de cidos nucleicos, vesculas
lipdicas, polipptidos y diferentes protenas bioactivas en el campo de la
medicina [190].
Experimentalmente, el proceso de adsorcin de los polielectrolitos en
disolucin acuosa sobre partculas coloidales se lleva a cabo con el mismo
procedimiento aplicado a sustratos macroscpicos planos [184] y se ilustra en
la Figura 1.16.
Para partculas coloidales aparecen algunas complicaciones adicionales:
tras la adsorcin de la primera capa de polielectrolito sobre la partcula , hay
que separar las partculas recubiertas de las que no lo estn. Tambin es
necesario eliminar el exceso de polielectrolito que no fue depositado antes
Figura 1.16 Tcnica LbL.a) Sobre una partcula se deposita un polielectrolito p or

interaccin electrosttica. (b) El polielectrolito de carga contraria es
depositado sobre la primera capa formada. (c) El exceso de materia no
adsorbida se elimina mediante ciclos de centrifugacin antes del
siguiente ciclo de adsorcin. (d) Repeticin de los pasos llevados en
(a) y en (b) por la exposicin repetitiva a polielectrolitos de carga
alterna dando lugar a multicapas adsorbidas sobre la partcula [29, 31] .
del siguiente paso de adsorcin, de lo contrario se formaran complejos

inter-polielectrolitos en la disolucin. Por todo ello, es necesario, tras la
adsorcin de la primera capa la disolucin se centrifuga al menos tres veces
para asegurarse la eliminacin del exceso de polielectrolito y las partculas
sin recubrir [30, 190].
Una gran ventaja de la adsorcin LbL desde una disolucin, es que
muchos materiales diferentes se pueden incorporar como pelculas
individuales, estando la estructura resultante determinada completamente
por la secuencia de deposicin [195, 196] .
Para caracterizar el crecimiento de las multicapas se suele monitorizar el
cambio de carga y tamao de cada capa en cada ciclo de adsorcin. La
adsorcin de un polielectrolito sobre una superficie coloidal pr oduce gran
cantidad de cambios en dicha superficie, de forma que la descripcin del
crecimiento de las multicapas debe distinguir entre la primera capa formada
entre la superficie coloidal y el polielectrolito, y las sucesivas multicapas
formadas entre polielectrolitos. Existen estudios en los que se compara la
adsorcin de polielectrolitos en sustratos planos y esfricos en diferentes
condiciones de pH, disoluciones de polmeros y concentracin de los
mismos [41, 197-201] .
La tcnica ms idnea que permite de forma cualitativa observar la
adsorcin de los polielectrolitos es la medida del potencial zeta de cad a una
de las capas adsorbidas. As los valores de potencial zeta cambian desde
valores positivos a negativos segn sea polianin o policatin el
polielectrolito adsorbido [30, 202].
Desde el punto de vista cintico en sustratos macroscpicos, la adsorcin
se puede dividir en dos etapas, una primera etapa rpida (minutos) en la
cual, se produce el transporte de las cadenas de polielectrolito hasta la
superficie de la partcula recubierta donde la cantidad depositada ser
directamente proporcional a la facilidad de difundir de las cadenas de
polmero; y una segunda etapa, mucho ms lenta que la anterior, que
consiste en un proceso de reorganizacin de las cadenas que puede implicar
la difusin de algunos segmentos hacia las capas internas. Este proceso
vendr ms o menos impedido en funcin de la rigidez del polielectrolito y
esto es lo que da lugar la formacin de complejos inter polielectrolito en la
superficie [177-180].
Hay que tener en cuenta que las disoluciones de polielectrolitos aadidas

deben tener siempre la misma fuerza inica [203] y concentracin del
polielectrolito para que las capas formadas tengan un mismo patrn. De
hecho es posible observar diferentes tipos de crecimientos de multicapas
para un par de polielectrolitos al cambiar la fuerza inica [204].
En la formacin de multicapas, la primera capa es la que mayor
influencia tiene del sustrato sobre el que se adsorbe pero a medida que
aumenta el nmero de capas, el crecimiento se vuelve independiente del
sustrato utilizado y se puede observar un espesor repetitivo en cada capa
sucesiva [30, 172], siempre que el crecimiento no sea exponencial.
En la adsorcin de polielectrolitos de carga contraria las interacciones
electrostticas son la base de la adsorcin pero esta adsorcin puede
favorecerse por contribuciones de otras fuerzas como pueden ser de Van der
Waals, cido-base o enlaces de hidrgeno [175, 191, 192].
En la actualidad, la tcnica LbL ha sido aplicada con xito en la
formacin de capas con polielectrolitos en los que se combinan la
interaccin electrosttica y reacciones qumicas entre las cadenas de los
polielectrolitos [190] . As la formacin de las capas puede seguir un modelo
ms controlable aumentando de este modo las aplicaciones de esta tcnica
en mayor nmero de campos en la medicina y en la industria.
Por ejemplo, la qumica del enlace covalente est dando paso a nuevos
sistemas ms estables en el desarrollo de cpsulas polimricas o la
incorporacin de propiedades pticas a las multicapas formadas para la
fabricacin de diodos emisores de luz [205].
1.5.4 Polielectrolitos funcionalizados

En la actualidad, existe un creciente inters en los polielectrolitos
sintticos biocompatibles con cadenas funcionalizadas. La industria busca
polielectrolitos que permitan la formacin de capas con una estructura ms
organizada y controlada y para conseguir este objetivo se suele introducir en
los polielectrolitos un nmero controlado de cadenas modificadas con
grupos funcionales. Con este tipo de polielectrolitos se combina la
sobrecompensacin de cargas y la formacin de enlaces entre los grupos
qumicos de las cadenas dando lugar a recubrimientos con mayor
estabilidad.
Hace un par de dcadas, Hoyle [206] aplic por primera vez la qumica de
la tiolizacin de polmeros y la extendi a otros materiales.
Para aplicaciones farmacuticas, principalmente en liberacin controlada
de frmacos, se ha utilizado la reaccin reversible tiol -sulfuro que es
fcilmente controlable. Algunas investigaciones ya aplicaban esta tcnica
para estabilizar cpsulas de polipptidos bajo condiciones altamente cidas,
pero no fue hasta 2001 cuando se fabricaron por primera vez cpsulas con
multicapas unidas por enlaces de hidrgeno y entrecruzadas a travs de
puentes disulfuro, que son muy estables a pH fisiolgico y sobre todo,
reversibles. Esto permite tener un muy buen control de la destruccin de las
capas incluso en el interior de una clula.
Hay muchos tipos de polmeros funcionalizados con el objetivo de crear
estructuras que sirvan de plataforma para aplicaciones biomdicas. Uno d e
ellos es el cido polimetacrlico modificado con grupos tiol(PMA SH) [207],[208]
que se utiliza en la formacin de cpsulas polimricas en la s que sus
multicapas se forman por enlaces de hidrgeno entre polivinilpirrolidona
(PVP) y PMA SH formando disoluciones moderadamente cidas. El
ensamblaje debe hacerse a pH 4 debido a que a este pH las molculas de
ambos polielectrolitos estn ms disociadas, y por tanto la interaccin entre
ellos es ms efectiva. Cuando el sistema se somete a las condiciones en que
los grupos tiol dan lugar a puentes disulfuros, las cadenas de PMA quedan
entrecruzadas (Ver Figura 1.17), se rompen los enlaces de hidrgeno entre
PMA SH y PVP, y sta difunde fuera de la multicapa. Este es un paso esencial
Figura 1.17 Ensamblaje de los capsosomas PMA c /(DMPC/DPPC)/PMAc /

PVP/(PMA SH /PVP) x. Transformacin de los enlaces de hidrgeno en
puentes disulfuro por cambio de pH [13] .
en la formacin de estas cpsulas ya que proporciona estabilidad en

condiciones fisiolgicas, y al mismo tiempo es una reaccin reversible pero
controlable para liberar el material que se hubiera encapsulado [209] . La
facilidad de formar los enlaces de hidrgeno en condiciones reductoras
(pH 5) las hace ideales para liberacin de frmacos [208], y este tipo de
cpsulas estn siendo empleadas, debido a su similitud con la estructura de
las clulas con pptidos, vacunas o depsitos de frmacos para su posterior
liberacin debido a su nula toxicidad y biodegradabilidad.
Otros grupos de investigacin han desarrollado multicapas basadas en
enlaces de hidrgeno a partir del cido policarboxlico utilizando reacciones
de amidacin, que mejora su estabilidad a pH 6 pH 7. Presentan una gran
estabilidad en un amplio margen de condiciones, incluso en presencia de
srum y protenas, y se degradan en presencia de un agente reductor que
existe en la naturaleza, glutationa (GSH), lo que confirma su naturaleza
biodegradable.
Otra funcionalizacin que se ha introducido en poli-lisina (PLL), PVP y
PMA han sido ramificaciones de colesterol, poli-lisina-co-colesterol (PLL c ),
polivinilpirroidona (PVP c ), poli-(cido metacrlico)-co-colesterol
metacrilato (PMA c ) mostrado en la Figura 1.18, que se acoplan a la cadena
del liposoma mediante enlaces no covalentes y facilitan el ensamblamiento
de liposomas al polmero. El colesterol es una cadena lipdica natural cuyo
Figura 1.18 Estructura que adopta el polmero funcionalizado PMA c cuando se

adsorbe sobre un liposoma [11] .
inters radica en que se incorpora al liposoma rpidamente y es insensible al

pH y a la fuerza inica. De esta forma, se pueden ensamblar liposomas entre
una capa precursora, PLL c y una capa denominada de capping porque evita
que los liposomas se vayan de la estructura, como el PMA c o poli-(cido
metacrlico)-co-colesterol metacrilato.
1.6 INTRODUCCIN A LAS CLULAS

ARTIFICIALES
El desarrollo de estructuras para poder subdividir el espacio disponible de
una manera controlable en diferentes subunidades en la escala nanomtrica
ha sido siempre un gran reto para los cientficos. La compartimentalizacin
es una de las tcnicas adoptadas por las clulas para alcanzar un elevado
nivel de control sobre procesos (bio)qumicos a la vez que el
subcompartimento sirve tambin para proteger a la clula de la accin
degradadora de sus contenidos (por ejemplo en el caso de los lisosomas) [42] .
Las clulas eucariotas desarrollaron esta estructura como una exitosa
alternativa para optimizar los procesos fsicos y qumicos utilizando
nicamente una bicapa lipdica. El uso de mltiples compartimentos, cada
uno encerrado por una bicapa lipdica diferente, ha demostrado ser una
buena manera de separar las diferentes funciones celulares protegien do al
mismo tiempo sus importantes contenidos internos de los alrededores [210,
211]
.
El tratar de mimetizar este complejo entramado arquitectnico de
orgnulos en el interior de una clula eucaritica ha llevado al desarrollo de
los capsosomas un tipo de estructura con multi -compartimentos que
consiste en vesculas unilamelares atrapadas en una capsula polimrica [212]
(Ver Figura 1.19). Este tipo de arquitecturas multi-vesiculares representan
una estructura bien controlada con potencial uso en aplicaciones
biomdicas.
De la misma manera que los rganos artificiales y la ingeniera de tejidos
han dado literalmente una nueva vida a sistemas macroscpicos vivos, se
espera que la creacin de clulas artificiales sirva para la sus titucin ante la
1.6 Introduccin a las clulas artificiales 71
Figura 1.19 Comparacin de una clula con la estructura de un capsosoma. i)

Multicapas polimricas que dan lugar a la membrana biolgicamente
biodegradable, i) Incorporacin de lisosomas para la degradacin de
ADN y iii) Liposomas cargados con un frmaco hidrofbico en su
interior [17] .
prdida o el mal funcionamiento de una funcin celular [15]. Los capsosomas

son una herramienta eficiente de encapsulacin para mimetizar entornos
biolgicos sin causar dao a los materiales frgiles de la clula y tambin
tienen un posible uso en el campo de los drug delivery systems [213] (sistemas
liberadores de frmacos) o como micro-reactores [214].
Mientras que el inters hacia los liposomas ha sido motivado por su bio -
compatibilidad y similitud con las membranas celulares, la cpsula de
naturaleza polimrica aprovecha sus propiedades de permeabilidad nicas,
las cuales le permiten la retencin de material biolgico como protenas y
otros biopolmeros mientras que otros sustratos de pequeo peso molecular
pueden permear fcilmente dentro y fuera de las paredes, haciendo de est as
micro-cpsulas candidatos particularmente atractivos como vehculos
transportadores o carriers de reacciones bio-catalticas.
La primera generacin de capsosomas consisti en la incorporacin de
liposomas insaturados, zwitterinicos y de un tamao aproximadamente de
unos 50 nm a una membrana polimrica no-biodegradable formada por el
par de polmeros poliestireno sulfonato sdico (PSS) y hidrocloruro de
polialilamina (PAH) los cuales interactan entre s mediante interacciones
electrostticas [17, 214] . La funcionalidad de los capsosomas tambin ha sido
demostrada por medio de una reaccin enzimtica cuantitativa utilizando la

enzima -lactamasa encapsulada en los liposomas situados en el interior de
la cpsula polimrica [17]. Los capsosomas son de gran inters debido a que la
capsula polimrica posee cierta permeabilidad, mientras los liposomas
dividen el interior de la capsula en sub-compartimentos, de manera que
tericamente sera posible realizar reacciones enzimticas en cadena en s u
interior de manera paralela.
Otra posible aplicacin de estos capsosomas sera como si stemas
administradores de frmacos, puesto que los liposomas pueden encapsular
tanto materiales hidrofbicos como hidroflicos, as que seran de gran
utilidad para la administracin de frmacos complementarios.
Los orgnulos artificiales se podran definir como pequeos sistemas (de
tamao sub-celular) de encapsulacin que combinan diferentes molculas
para crear funciones celulares complejas con los mnimos componentes. En
esta tesis, se describe el diseo de orgnulos artificiales basados en nano-
liposomas y nanocpsulas polimricas integrados en una cpsula polimrica
de tres micras de tamao. La fabricacin de orgnulos artificiales parece
estar indicada para aplicaciones biomdicas tales como el reemplazamiento
de una enzima en una enfermedad gentica o hablando de una manera ms
general, para aadir en una clula la funcionalidad bioqumica deseada. Sin
embargo, para sustituir a la funcin celular, las reacciones deben ocurrir
repetidamente y en forma de cascada, por lo que deben existir mltiples
compartimentos que contendrn diferentes enzimas. Adems, no solo las
molculas atrapadas en los compartimentos, sino tambin la selectividad
asociada a cada uno de ellos deben ser tenidos en cuenta mara simular la
biofuncionalidad de las clulas biolgicas.
Las primeras investigaciones del grupo de F. Caruso [214] comenzaron con
el ensamblaje de ms capas de liposomas separadas por capas polimricas y
todo ello formando parte de una membrana polimrica y biodegradable, y el
estudio del comportamiento de los liposomas cuando se cargan con
pequeas molculas hidrofbicas que incluye su estabilidad y liberacin.
1.6 Introduccin a las clulas artificiales 73
1.6.1 Hbridos con compartimentos polimricos y

liposomas
Los hbridos que se muestran en la Figura 1.20 se desarrollan como un paso
ms en las aplicaciones que se han mostrado para los capsosomas.
En los hbridos, la construccin de cpsulas de naturaleza polimrica que
contienen nanocpsulas y liposomas en su interior, son una nueva estructura
hacia la construccin de clulas artificiales. En el captulo de Materiales y
mtodos se presentan los aspectos fundamentales que se encuentran detrs
de la construccin de hbridos y basados en los capsosomas, los
denominados hbridos inversos.
Por primera vez se describe la encapsulacin de una capa de
nanocpsulas no degradables y una capa de liposomas en el interior de una
cpsula polimrica bio-degradable. La encapsulacin de las nanocpsulas se
consigue por ensamblaje electrosttico sobre partculas de slice; y la unin
de los liposomas se consigue gracias a la unin no covalente de los
liposomas con polmeros modificados con diversas unidades de colesterol,
tales como la polilvinilpirrolidona y el cido polilmetacrlico (Ver Figura
1.21).
Se han realizado numerosos experimentos con el fin de selec cionar la
combinacin de polmeros ms adecuada para incorporar la mxima
cantidad de liposomas. Las cpsulas polimricas se forman depositando
alternadamente dos diferentes polmeros que interactan entre s mediante
enlaces de hidrgeno, poli-(N-vinil pirrolidona) (PVP) y cido
poli(metacrlico) modificado con grupos tiol (PMA SH ). Una vez disuelto el
interior de las partculas, se obtienen unos sistemas muy estables [11].
Figura 1.20 Hbridos formados por cpsulas polimricas de 300 nm y liposomas de

50 nm y ambos recubiertos por cuatro bicapas de polmeros.
Figura 1.21 Obtencin de una cpsula polimrica: LbL aplicada sobre una
partcula de slice utilizando el par de polielectrolitos PMA SH /PVP y
eliminacin de la partcula con tratamiento de cido y lavado posterior
para mantenerlas a pH fisiolgico [15] .
El ensamblaje en los hbridos comienza con la deposicin de una capa

precursora denominada de sacrificio pues sirve de separacin entre la
plantilla coloidal, seguido de la incorporacin de liposomas y capas de
polmero como separacin. Despus de adsorber la capa de bloqueo que no
permite la liberacin de los liposomas durante el proceso de ensamblaje, y
de adsorber las cpsulas polimricas, se depositan ms capas polimricas
que dan lugar a una macroestructura formada por diferentes
compartimentos. Una vez formada la estructura se elimina la plantilla
coloidal mediante un tratamiento con cido que ser bastante ms suave que
el realizado en los capsosomas por su mayor complejidad.
Estas estructuras permiten dos tipos de estructuras para la liberacin de
carga que puedan tener en las cpsulas polimricas o en los liposomas. En el
caso de la encapsulacin de enzimas y sustratos en el interior de los
liposomas, la temperatura, el pH y/o la adicin de un tensioactivo
controlarn la reaccin enzimtica; en el caso de nanocpsulas polimricas
ser la degradacin de las mismas mediante la adiccin de algn agente que
rompa los enlaces formados y se libere la carga del inteior [215, 216].
Estos sistemas son el principio del desarrollo de esta clase de hbridos.
Se pueden plantear variantes como puede ser el tipo de liposoma utilizado,
nanocpsula polimrica e incluso diferentes polielectrolitos en busca de
otras aplicaciones. Combinando los resultados obtenidos para hbridos con
los obtenidos para los capsosomas se puede asegurar cierta estabilidad
frente cambios en el entorno, y abre la puerta para futuras mejoras [217].
1.7 Objetivos de la Tesis 75
1.7 OBJETIVOS DE LA TESIS

Uno de los objetivos importantes de esta tesis ha sido la fabricacin de
vesculas unilamelares pequeas monodispersas, de un radio
aproximadamente de 100 nm y su recubrimiento, con la tcnica capa a capa,
con polielectrolitos y nanopartculas de distinta naturaleza. Se han
preparado liposomas con diferentes composiciones lipdicas, centrndonos
principalmente en un profundo estudio de liposomas de carcter catinico
formado por 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y el tensioactivo
catinico bicatenario bromuro de dimetildioctadecilamonio (DODAB) con
distintas densidades de carga. Otros fosfolpidos utilizados han sido 1,2-
dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (en sal sdica), (DOPS), 1,2-dimiristoil-
sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-
serina (en sal sdica), (DPPC), y las combinaciones entre ellos fueron
DMPC: DPPC, DOPC: DOPS para conseguir liposomas saturados e
insaturados, respectivamente con carga negativa. Estos liposomas presentan
estructuras, propiedades y estabilidad que son independientes de las
variaciones de pH, temperatura y fuerza inica, y son por tanto plantillas
ideales en procesos de recubrimiento capa a capa.
Una vez estudiados estos sistemas plantilla y optimizados los mtodos de
fabricacin, se han realizado recubrimientos capa a capa con distintos pares
de polielectrolitos. Inicialmente se han utilizado los pares poli-
estirensulfonato sdico/poli-alilamina (PSS/PAH) y poli-estirensulfonato
sdico/poli-cloruro de dialil-dimetilamonio (PSS/PDADMAC); en el
primero, el ensamblaje se debe a interacciones electrostticas combinadas
con cido-base, mientras que en el segundo la interaccin es puramente
electrosttica. Tambin se ha utilizado el par de polielectrolitos
biocompatibles poli-L-lisina/poli-L-glutmico cido (PLL/PGA).
Adicionalmente se han utilizado en los recubrimientos nanopartculas de
ltex cargadas y polmeros cuyas caractersticas responden a estmulos tales
como pH o temperatura.
Otro de los objetivos de esta tesis ha sido la fabricacin y caracterizacin
de microgeles, sensibles a pH y temperatura, recubiertos de polielectrolitos
por la tcnica de capa a capa. Se han preparado microgeles de PNIPAM

entrecruzados con 1-Vinil-imidazol (VI) lo que aade a la sensibilidad a la
temperatura tpica de los microgeles de PNIPAM sensibilidad al pH. Estos
microgeles han sido recubiertos con el par de polielectrolitos independientes
del pH poli-estirensulfonato sdico/poli-cloruro de dialil-dimetilamonio
(PSS/PDADMAC) estudiados con dos fuerzas inicas distintas, 0.1 M NaCl
y 0.25 M NaCl y con el par de polielectrolitos biocompatibles PGA/PLL en
disolucin tamponada por ser dependientes del pH. Los estudios
desarrollados sobre estos nuevos sistemas se centraron en observar cmo
afectaba la temperatura al tamao y a la movilidad electrofortica con
medidas de ambos parmetros en los diferentes entornos creados.
Adicionalmente se han preparado liposomas recubiertos con Poli-(N-
isopropilacrilamida), con cadenas de cido carboxlico en posiciones
terminales (p-(NIPAM)-COOH) para inferir al liposoma un control de
temperatura y posteriormente se ha recubierto con una capa de p oli-
etilenglicol con terminaciones amina (PEG-NH) lo que le proporciona
biocompatibilidad. Dada la baja densidad de carga de ambos polielectrolitos
se ha utilizado una reaccin de condensacin para que ambos
polielectrolitos queden adsorbidos recubriendo el liposoma. Una vez
alcanzada la respuesta a la temperatura alcanzada y biocompatibilidad se
caracteriz el efecto de la misma sobre el tamao y sobre la movilidad
electrofortica antes y despus de la temperatura de trnasicin que
caracteriza al fosfolpido de partida, DPPC.
Otro objetivo importante ha sido la puesta a punto y el estudio de de
microestructuras (hbridos, hbridos inversos y capsosomas) que funcionan
como microcontenedores-reactores, mimetizando el comportamiento de las
clulas. Los hbridos y los hbridos inversos basan su estructura en la que se
desarroll para los capsosomas pero en este caso se realiza la adsorcin de
una capa de nanocpsulas no degradables y una capa de liposomas en el
interior de una cpsula polimrica bio-degradable donde la adsorcin ha
tenido lugar mediante la combinacin de la tcnica capa a capa por
adsorcin electrosttica y la aplicacin de una reaccin de entrecruzamiento
que tiene lugar entre los grupos tioles de uno de los polielectrolitos
adsorbidos, PMA SH , transformando los enlaces SH en enlaces disulfuro
ms estables. La diferencia entre los hbridos y los hbridos inversos es
principalmente la capa inicial que en el caso de los hbridos son
nanocpsulas polimricas y en el caso de los hbridos inversos son los
liposomas la primera capa adsorbida sobre las partculas de ltex.
1.7 Objetivos de la Tesis 77
Por ltimo, otro de los objetivos de esta tesis ha sido el estudio de la

funcionalidad de estos sistemas. Se han encapsulado dos tipos de frmacos,
Dextrano (DEX) y Doxorubicina (DOX) y una reaccin enzimtica
Nitrocefina/ -lactamasa. La liberacin de la enzima encapsulada produce la
reaccin del sustrato, nitrocefina, que puede seguirse colorimtricamente
despus de liberarse la enzima por la degradacin de los liposomas. En el
caso del DOX, introducido en los liposomas, la liberacin de este provoca
un aumento de fluorescencia en la disolucin en la que se encuentran
inmersos tras aumentar la temperatura hasta sobrepasar la temperatura de
transicin del fosfolpido. Del mismo modo que para el DOX, el DEX fue
introducido en los liposomas siguiendo la fluorescencia pero la diferencia
radica en la localizacin del frmaco dentro de los liposomas que para el
caso del DEX fue el interior del liposoma y para el DOX fue dentro de la
bicapa lipdica.

79
2 TCNICAS EXPERIMENTALES
80 Tcnicas experimentales
2.1 TCNICAS DISPERSIVAS

Las tcnicas dispersivas son una herramienta eficaz para determinar
caractersticas de la materia. Se hablar de diferentes tcnicas dispersivas:
de luz, rayos X y neutrones, y la informacin que se obtiene se considera
complementaria ya que los resultados derivan de la dispersin a distinta
longitud de onda. De forma general, la intensidad de luz dispersada puede
expresarse:
n
I q cm1 P q S q (2.1)
Vbicapa
donde n es el nmero total de partculas en la muestra, V el volumen de la

muestra, P(q) es el factor de forma de la partcula y S(q) es el factor de
estructura. La relacin n/ V bicapa puede expresarse como F/ V bicapa donde F es
la fraccin en volumen de los lpidos de la muestra y V bicapa el volumen total
de la bicapa de una vescula.
Esta relacin es la que se analiz en todas las tcnicas aqu presentadas y
que en funcin de la radiacin electromagntica que se disperse se resolvi
con diferentes mtodos.
2.1.1 Dispersin de luz dinmica (DLS)
Fundamentos
La dispersin de luz se encuentra dentro del amplio conjunto de tcnicas
experimentales basadas en la interaccin radiacin -materia. El campo
electromagntico de la luz incidente induce un momento dipolar oscilante en
las molculas del medio. La luz irradiada por el dipolo, que se denomina luz
dispersada o difundida, tiene la misma frecuencia que la radiacin incidente
(i) y una intensidad mucho menor, tpicamente 10 -4 a 10 -6 veces menor.
Los fundamentos tericos de la dispersin de la luz se basan en la teora
de Dispersin de Rayleigh [218] desarrollada en 1881, que al aplicar a
partculas pequeas y esfricas no vara la frecuencia en la dispersin de la
luz. Posteriormente Debye [219] aplic la dispersin de luz a partculas ms
grandes y no esfricas y ya en 1909 se plante la dispersin de Mie [220] ,
vlida para partculas esfricas de tamao muy superior a la longitud de
2.1 Tcnicas dispersivas 81
onda y con ndice de refraccin complejo. Smoluchowski [221] (1908) y

Einstein [222] (1910) desarrollaron una teora en la que no se considera
explcitamente la estructura molecular sino las fluctuaciones del ndice de
refraccin [223].
El mtodo de dispersin de luz dinmica, tambin conocido como
dispersin cuasi-elstica de luz (QELS) [224] o Espectroscopa de Correlacin
Fotnica (PCS) permite obtener informacin dinmica(coeficiente de
difusin, velocidad,) sobre las partculas que se mueven al azar
(movimiento Browniano). La luz dispersada por una disolucin polimrica o
coloidal contiene informacin sobre la estructura, interacciones y dinmica
de las macromolculas o coloides. Es por eso que la dispersin de luz es una
de las tcnicas ms ampliamente empleadas para la caracterizacin de
polmeros y coloides en disolucin.
En 1930 Gross obtuvo por primera vez el espectro de la luz difundida por
un lquido. Donde adems del doblete predicho por Brillouin en 1914,
mostraba la existencia de una banda central denominada Rayleigh con su
mximo centrado en la frecuencia de la radiacin incidente.
El fenmeno fsico que produce la dispersin de luz es la interaccin de
la radiacin electromagntica con la materia. La Figura 2.1 muestra cmo se
produce. Los campos elctrico y magntico que componen la radiacin
oscilan con la misma frecuencia, i . Como el efecto del campo magntico
sobre la materia es mucho menor que el del elctrico se puede despreciar el
primero. El campo elctrico incidente, Ei , desplaza las cargas de la molcula
creando en ella un dipolo inducido, :
Ei (2.2)
donde el tensor de polarizabilidad de la molcula. Dado que el campo

elctrico oscila con una frecuencia i , el dipolo tambin lo hace. Un dipolo
oscilante emite radiacin en todas direcciones y es a esta radiacin a lo que
se denomina dispersin Rayleigh [218].
En la Figura 2.1 se esquematiza un experimento de dispersin de luz. El
plano de dispersin viene definido por el rayo incidente y el dispersado,
entre los que se forma un ngulo . El campo elctrico de la radiacin
incidente est representado por un vector perpendicular al plano de
dispersin, su expresin en un punto cuyo vector de posicin es r viene
dada por:
Figura 2.1 Fenmeno de la dispersin. El plano de la dispersin viene dado por la

radiacin incidente (I i ) y la radiacin dispersada (I d ), y ambas
relacionadas mediante el ngulo de dispersin . La intensidad
dispersada por el volumen de dispersin de la muestra vara con el
tiempo y es esta fluctuacin la que llega al detector.

Ei t E0 exp i ki r i t (2.3)

donde k i es el vector de onda,
2 n0
ki (2.4)
i
siendo n 0 el ndice de refraccin del medio y i la longitud de onda de la

radiacin incidente en el vaco. El producto ki r representa la fase de la
onda en la posicin .
r
La teora electromagntica permite llegar a la siguiente expresin para el
campo dispersado a una distancia R d del volumen de dispersin de la
muestra:
1 2
Es t Ei r , t ' r , t ' d 3 r (2.5)
4 c Rd V t '2
2
siendo t el tiempo de retardo, definido como t=t-|R d -r|/c, y |R d -r|/c es el

tiempo que tarda la luz en viajar desde el volumen de dispersin en la
posicin r al detector situado en R d en el sistema de referencia del
laboratorio. r ,t ' Refleja el desplazamiento de la constante dielctrica de

su valor medio en un elemento de volumen situado en la posicin r y a un
tiempo t. Puesto que R d >>r y la constante dielctrica flucta lentamente
comparada con el tiempo de trnsito de la luz a travs del medio difusor, se
puede suponer que kr<< 0 t, y en estas condiciones la ecuacin anterior se

transforma en:
E0
Es t exp ii t r , t exp iq r d 3 r (2.6)
2 Rd V

donde q r representa el cambio de fase (diferencia de camino ptico
recorrido) en la luz dispersada por un elemento de volumen, situado en la

posicin r , respecto a un elemento de volumen situado en el origen r 0.

La diferencia entre los vectores de onda incidente y dispersada, q kd ki
se denomina vector de onda de dispersin o vector de transferencia de
momento. Puesto que la transferencia de momento es muy pequea o lo que
es lo mismo, las longitudes de las ondas incidente
y dispersada son
aproximadamente iguales, i d , esto es, ki kd k , es posible expresar
el vector de onda como:
16 n0
2 2
2
q kd ki 4k 2 sen
2
sen2 (2.7)
2 i2
2
siendo la magnitud del vector de onda:

4 n0
q sen (2.8)
i 2
Al contrario que en la dispersin de luz esttica, en la dispersin dinmica

no se promedian los fotones, sino que se correlacionan.
Como ya se ha mencionado anteriormente en el captulo de Introduccin
y objetivos, las partculas o macromolculas en disolucin estn chocando
continuamente con las molculas de disolvente, por lo que tienen un
movimiento constante al azar, llamado Browniano. Por efecto Doppler este
movimiento produce un ensanchamiento simtrico de la frecuencia de la luz
difundida respecto a la luz incidente. Este ensanchamiento tambin se puede
interpretar como variaciones en la intensidad de luz difundida provocadas
por el movimiento colectivo de las molculas que causa fluctuaciones
temporales de la constante dielctrica.
En el caso de disoluciones en que las molculas de soluto son grandes
comparadas con las del disolvente las fluctuaciones en la constante
dielctrica son debidas principalmente a variaciones en la concentracin.
Por tanto, la anchura de la banda Rayleigh est directamente relacionada con
el tiempo de relajacin caracterstico de las fluctuaciones de concentracin,

es decir con las propiedades dinmicas de las macromol culas o partculas
en la disolucin y las bandas Brillouin no son apreciables en el espectro.
El caso de las macromolculas y coloides implica ensanchamientos muy
pequeos y las tcnicas interferomtricas no alcanzan la resolucin
necesaria. Fue en 1955 cuando Forrester, Gudmunsen y Johnson 2
introdujeron lo que ellos llamaron tcnicas de mezcla ptica. Se basan en el
hecho de que los tubos fotomultiplicadores detectan el cuadrado del campo
elctrico de la radiacin, es decir, la corriente generada por stos es
proporcional a este cuadrado y las componentes oscilantes del campo se
mezclan de forma efectiva en el fotoctodo del detector, desplazando de esta
forma la frecuencia central a cero.
Cumming 3 y col. y Pecora 4 aplicaron, de manera independiente, esta
tcnica para estudiar el ensanchamiento de la banda Rayleigh producido por
una disolucin de partculas. En esta tcnica no se determina directamente el
espectro sino que se estudian las propias fluctuaciones en la intensidad de
luz difundida 11,12,13 , obtenindose la funcin de autocorrelacin de
intensidades, G2 (t), definida como el promedio temporal del producto de la
intensidad en dos tiempos discretos separados por un intervalo t
G2 (t ) I d (t ') I d (t ' t ) Ed (t ') Ed (t ' t )

2 2
(2.9)
donde los lmites de esta funcin son: si el intervalo de tiempo es igual a

cero, se est promediando el producto de la seal a tiempos idnticos y por
tanto determinando el promedio del cuadrado de la seal cuando t 0,
G2 (t ) I d (t ) I d (t ) I d2 (2.10)
En el caso de que el intervalo de tiempo sea muy grande, las seales que se
producen en los dos instantes dejan de estar correlacionadas. Los sucesos
que son responsables del valor de la seal en esos dos instantes son
independientes, por tanto, el promedio del producto es igual al producto de
los promedios, y cuando t , G2 (t ) I d (t ') I d (t ) I d (t ') I d (t ) I d
2
el correlador obtiene la funcin de correlacin de la intensidad de luz

difundida, G 2 (t), la relacin de Siegert [225] , nos proporciona la conexin que
existe entre sta y la funcin de correlacin del campo elctrico, G1 (t):
G2 (t ) I d G1 (t )
2 2
(2.11)
Normalizando se obtiene la funcin de autocorrelacin de intensidades

normalizada, g 2 (t):
G2 (t )
g 2 (t ) 1 g1 (t )
2
2
(2.12)
Id
siendo el denominado factor de coherencia porque est relacionado con el

nmero de reas coherentes que ve el detector y suele ser cercano a la
unidad. g 1 (t) es la funcin de autocorrelacin de la intensidad dispersada en
funcin de t normalizada [226, 227]:
Ed (t ') Ed (t ' t )
g1 (t ) 2
(2.13)
Ed (t )
Para terminar con las funciones de correlacin, se define el factor de

estructura dinmico, S(q,t), que es la forma no normalizada de g 1 (t). Para N
centros difusores correlacionados entre s, tenemos:
exp iq r (t ' t ) r (t ')

1
S ( q, t ) i j (2.14)
N2 i, j
Este factor de estructura es el que se relaciona con las propiedade s fsicas de

las partculas en disolucin ya que es proporcional a la transformada
espacial de Fourier [228] de las fluctuaciones de la densidad [229] .
Los mtodos de resolucin de la funcin de autocorrelacin son el
mtodo de cumulantes y los mtodos de regularizacin como CONTIN o
REPES. Ambos tipos de aproximacin permiten obtener el coeficiente de
difusin, D, a partir de la funcin de correlacin.
Mtodo de cumulantes
El mtodo de cumulantes es vlido para distribuciones lo suficientemente
estrechas, obteniendo los mismos resultados por cualquier mtodo de
anlisis si la muestra es monodispersa. El anlisis de la funcin de
correlacin se realiza ajustando a un polinomio de tercer orden.
2 3
ln g1 (t ) ln A t t2 t3 (2.15)
2 6
donde los parmetros de ajuste se denominan cumulantes, A es la amplitud,

el promedio de la velocidad de decaimiento, 2 es el segundo cumulante y
3 el cumulante de tercer orden. La desviacin estndar y el coeficiente de
regresin se calculan con las siguientes frmulas:
1/ 2
1 N 2
Std .Dev rij
N 1 i 1
(2.16)
donde r ij se denomina residuo y es igual a:
ri , j ln g 2 (ti ) 1 an tin
j
(2.17)
n 0
1 N 1
ri , j ri 1, j
N 1 i 1
rj 1
2
(2.18)
1 N 2
ri, j
N i 1
donde i es el ndice de los distintos canales de correlacin, N es el nmero

de canales usados en el ajuste y j es el orden del polinomio de ajuste.
El radio hidrodinmico, la anchura de la distribucin del radio y el ndice
de polidispersidad (PDI) se calculan a partir del ajuste al polinomio de
tercer orden, de acuerdo a las siguientes ecuaciones [230, 231] :
k BT 2
RH q (2.19)
6
2
Anchura RH w (2.20)

2
PDI (2.21)
2
Mtodo CONTIN [232]

Desarrollado por Provencher [233] , este mtodo de anlisis utiliza la
transformada de Laplace inversa de la funcin de correlacin y se cumple
para sistemas polidispersos y muestras multimodales que no se puedan
ajustar por cumulantes.
max
g1 (t ) et G()d (2.22)
min
donde G es la funcin de distribucin de la velocidad de decaimiento. La

funcin de correlacin se calcula a partir de la relacin de Siegert [225] , g 1 (t)
en funcin de t, el tiempo. Con el mtodo de ajuste no lineal se puede
calcular g 2 (t):

max 2
g 2 (t ) 1 et G()d (2.23)
min
1 1 Dq 2 (2.24)
g1 t et e Dq t
2
(2.25)
que relaciona directamente g 1 (t) con D. Este dependencia lineal de lng 1 (t)
con q 2 es caracterstico del comportamiento difusivo de la muestra.
Mediante este mtodo el anlisis de las funciones simula funciones de
autocorrelacin a varios ngulos, mediante este mtodo y el anlisis global
de todas ellas se realiza para obtener el coeficiente de difusin de la
muestra.
En la ecuacin (2.24)se ha sustituido para observar la relacin de la
funcin de correlacin con el coeficiente de difusin. As, se observa que el
tiempo del decaimiento es inversamente proporcional a q 2 . Si se representa
-1 vs q 2 [234], la ordenada en el origen ser D que es el coeficiente de
difusin. El promedio del coeficiente de difusin D puede ser obtenido a un
solo ngulo o a un rango de ngulos en funcin del vector de onda q.
Una vez determinado el coeficiente de difusin, es posible conocer el
tamao de las partculas en la disolucin. La variacin de la funcin de
correlacin con el tiempo est relacionada con el tamao de las partculas ya
que para partculas grandes, la velocidad de decaimiento es mayor que para
partculas pequeas. La velocidad de las partculas que se desplazan
siguiendo un movimiento browniano est relacionada con su tamao
mediante la ecuacin de Stokes-Einstein, que solo puede ser aplicada si se
considera que se est a dilucin infinita (no hay interaccin entre las
partculas) y para partculas esfricas
k BT
D (2.26)
6 Rh
donde D es el coeficiente de difusin, R H el radio hidrodinmico aparente,

la viscosidad del disolvente y T la temperatura absoluta. Si se cumplen las
condiciones consideradas, es posible conocer el tamao de la partcula ya
que el resto de parmetros son conocidos.
Instrumentacin para DLS

Las medidas se han realizado en un ALVLSE- 5003 (ALV-
Laser Vertriebsgesellschaft mbH, Alemania) montado sobre una mesa anti
vibratoria y equipado con un gonimetro ALV CG5-8F.
La clula de medida es de cuarzo con 1 cm de dimetro y un volumen de
3 ml. Para mantener termostatizada la muestra se dispone de un bao
termosttico de agua conectado al equipo. El equipo, mostrado en la Figura
2.2 utiliza como fuente de luz un lser de Ar + que trabaja a 514.5 nm y en
general se ha trabajado a una potencia de 200 mW. El ha z incidente se
divide en dos (divisor de haz 1:1), una parte se utiliza para monitorizar el
alineamiento y las fluctuaciones de intensidad del lser con un fotodiodo de
cuatro cuadrantes. La medida de la intensidad de luz dispersada se realiza
mediante dos detectores, dos fotomultiplicadores ALV/SO en modo de
pseudocorrelacin cruzada.
Figura 2.2 (a) Esquema del equipo de dispersin ALV -5003. (b) Foto del mismo.
La mayor parte del haz molecular pasa en lnea recta a travs de la

muestra, pero una parte es dispersada por las partculas en el interior de la
muestra. Se utiliza un detector (3) para medir la intensidad de la luz
dispersada, que en este caso es un fotomultiplicador ALV/SO -SIPD. La
intensidad de la luz dispersada dentro de la clula debe estar dentro de un
rango especfico para que el detector pueda medirla correctamente. D e ese
modo si la luz detectada es demasiado grande, se sobrecargar el detector,
por lo que es necesario utilizar un atenuador (4) que reduzca la intensidad
del lser. La intensidad de la dispersin de la seal para el detector pasa por
un procesador digital de seal llamado correlador (5). El correlador calcula,
a partir de la intensidad dispersada en intervalos de tiempos t, la funcin
de autocorrelacin de intensidades. Se utiliza un correlador digital mltiple
ALV-5000. La informacin del correlador se enva a un ordenador (6),
donde el software permite analizar los datos utilizando cualquiera de los
mtodos descritos anteriormente para obtener D y R H .
Metodologa
Se preparan las disoluciones acuosas muy diluidas de liposomas que se
transfirieron a una clula de dispersin termostatizada hasta alcanzar la
temperatura de 25C. Para cada muestra se obtienen por duplicado las
funciones de autocorrelacin a distintos ngulos de dispersin comprendidos
entre 30 y 150. El conjunto de funciones de autocorrelacin condujeron a
distribuciones de tasas de decaimiento similares con ambos mtodos de
anlisis. De cada funcin se calcularon los tiempos de decaimiento, cuya
inversa se represent frente al cuadrado del vector de onda. De la pendiente
de dicha representacin se obtuvo el coeficiente de difusin. Mediante la
ecuacin de Stokes-Einstein se calcul el radio hidrodinmico.
Para el estudio de la variacin de temperatura realizado para los
microgeles, se fij un ngulo de medida, 90, y la temperatura se increment
de 293 a 313K en pasos de 2K para luego bajar de nuevo hasta 293K, con el
fin de obtener un ciclo completo y comprobar la reversibilidad. Por
cumulantes se extrajo el valor del radio hidrodinmico para cada
temperatura.
2.1.2 Dispersin de rayos X de bajo ngulo (SAXS)

SAXS y SANS son tcnicas complementarias a la dispersin de luz esttica
(LS), que permiten extender a mayores valores de q las medidas de
dispersin. En dispersin de luz, el contraste se debe a variaciones en el
ndice de refraccin entre el objeto (partcula, macromolcula, etc) y el
disolvente. En SAXS el contraste se debe a la densidad electrnica y por
tanto los tomos ms pesados, con mayor densidad electrnica, dan lugar a
mayor contraste. Por el contrario, en SANS el contraste se debe a los
ncleos, y la longitud de dispersin, que fija el contraste, es similar para
casi todos los ncleos habitualmente utilizados excepto el H, que tiene una
longitud de dispersin negativa y el contraste generalmente se obtiene con
mezclas de material hidrogenado y deuterado.
Fundamentos de SAXS
La dispersin de rayos X a bajo ngulo es una tcnica analtica empleada en
la caracterizacin estructural de materiales de tamao nanomtrico. La
muestra es irradiada con un haz de rayos X monocromtico y se genera un
ensanchamiento del haz. Las heterogeneidades en un medio continuo son las
que dan lugar a la dispersin de rayos X a ngulos pequeos, sean
partculas, precipitados en las aleaciones, polmeros, etc. De la distribucin
de intensidades a bajo ngulo se obtiene informacin sobre tamao de las
partculas, morfologa y estructura interna [208].
La funcin de dispersin de los electrones puede ser calculada si
conocemos la forma del dispersante a partir de la transformada de Fourier de
la funcin:

senqr
I (q) 4 r dr (2.27)
0
qr

1
r rqI q sen rq dq (2.28)
2 2 0
La ecuacin (2.27) muestra la densidad electrnica, r , que se

considera uniforme para partculas pequeas. En el caso de una dispersin
de partculas, tanto el dispersante como el disolvente muestran densidades
electrnicas, por lo que la curva de dispersin es fruto de la diferencia entre
ambas densidades. A esta diferencia de densidad electrnica es a lo que se

denomina contraste.
La curva de dispersin ayuda a deducir el tamao, forma y densidad
electrnica de un sistema, como ya se ha comentado, pero para ello se ha de
elegir el modelo adecuado que describa a los datos experimentales.
Convencionalmente, la intensidad dispersada se suele analizar utilizando
dos aproximaciones. Por un lado, se ha propuesto una ecuacin exponencial
y, por otro, una frmula polinomial. La primera se conoce como la Ley de
Guinier y la segunda como la Ley de Porod. La Ley de Guinier coincide
bien con los datos experimentales en los ngulos muy pequeos, por lo que
ser muy til si las heterogeneidades dispersoras son relativamente grandes,
mientras que la Ley de Porod es la ms adecuada para ajustar los ngulos
mayores donde la intensidad decrece con una relacin de 1/4 con respecto a
q [235]. De estos dos modelos se hablar con ms detalle en el apartado de
metodologa.
En esta tcnica se trabaja normalmente en transmisin y con un haz de
rayos X muy fino para que pueda ser interceptado sin bloquear la luz
dispersada, y adems facilitar la medida a bajos ngulos. Para disminuir el
ruido de fondo se recomienda que la distancia del detector a la muestra sea
grande para que se separe el haz dispersado del incidente y que exista vac o
desde la fuente de los rayos X hasta el detector. El rango de tamao que
puede medirse con esta tcnica est comprendido ente 0.5 y 50 nm en
materiales como pelculas de polmeros, microemulsiones, protenas,
liposomas, etc.
Instrumentacin
El equipo de rayos X de bajo ngulo (SAXS) utilizado se muestra en la
Figura 2.3:
La longitud de onda utilizada en este equipo es 1.54 , el dimetro del
detector es de 200 mm y el dimetro de bloqueador del haz es 4 mm. El
rango accesible de vectores de onda, q, es de 0.011-0.5 , y por tanto el
tamao de partcula observable ser de al menos 60 nm.
Figura 2.3 Equipo de dispersin de rayos X (SAXS) localizado en la universidad

de Aachen (Alemania), RWTH.
Metodologa
Para la utilizacin del equipo de dispersin de rayos X, se deben introducir
tres capilares, uno vaco, otro en el que se encuentra el disolvente y otro con
la muestra cuyas caractersticas se quiere conocer. El tiempo de medida
depende mucho de la muestra a analizar y del contraste de densidad
electrnica, y puede ser desde unos minutos hasta horas.
Las disoluciones de liposomas presentan en general un alto contraste con
rayos X, por lo que es posible observar con facilidad las diferencias en s u
estructura qumica. Si se consideran liposomas unilamelares, en la Figura
2.4 se observan los parmetros estructurales que se obtienen con la tcnica
SAXS.
En la Figura 2.4, se muestra un liposoma unilamelar esfrico formado por
anillos concntricos, de radios R i y R 0, un espesor formado por las cabezas
polares de los lpidos igual a t h y un espesor de las colas de los lpidos igual
a t c . Como consecuencia, la intensidad dispersada en el rango de q se
describe, segn el modelo de Cant [236] mediante
2
4 t 2t t
4 c , e
I (q) h,e sen q c h,e s ,e sen q h c (2.29)
q 2 2
donde t c es el espesor de la capa hidrofbica y t h es el espesor de la capa de

las cabezas polares. La densidad de las bicapas formadas por mezclas de
Figura 2.4 Perfil de densidades obtenido segn la tcnica SAXS.
lpidos ha sido ya calculada por otros investigadores, tomando finalmente el

valor de 0.92 kg/dm 3 para la mezcla de lpidos.
En general, las curvas de SAXS expresan la variacin de la intensidad de
dispersin en funcin del vector de onda. La intensidad dispersada de una
partcula es mxima cuando q=0 y disminuye en una proporcin que
depende del tamao y de la conformacin de la partcula [237].
La curva de I(q) en funcin de q en la que se distinguen 4 zonas se
muestra en laFigura 2.5.
Las regiones 1, 2, 3 comprenden los dominios encontrados en las curvas
de SAXS y pueden dar informacin sobre el radio de giro (R g ) que se define
como el parmetro que da informacin sobre la distribucin de la masa de la
partcula alrededor del centro de gravedad, siendo un parmetro importante
especialmente cuando en la partcula se pueden adoptar varias
conformaciones. La regin 1 denominada de Guinier situada a valores bajos
de q permite la determinacin directa de R g [238].
Regla de Guinier: Asumiendo el caso ideal de partculas esfricas en
disolucin, Guinier mostr que para q=0, la curva de intensidades puede ser
descrita como una funcin exponencial. Asimismo, a valores muy bajos de
q, la intensidad dispersada depende directamente del radio de giro mediante
una aproximacin conocida como Ley de Guinier, vlida cuando se cumple:
1) q 2 Rg2 1 para una esfera y 2) regla del pulgar, q 2 Rg2 1.2 , para una
estructura globular.
Figura 2.5 Curva de la intensidad dispersada en funcin de q en la que se

distinguen las regiones marcadas y de las cuales se van a estudiar las
de mayor inters para nuestros sistemas: Guinier y Porod.
q 2 Rg2
I (q) I 0 exp
3
(2.30)

donde I 0 es la intensidad a ngulo cero y R g es el radio de giro. El grfico de

Guinier ln I(q) vs q 2 es una recta:
Rg2
ln I (q) ln I 0 q2 (2.31)
3
La pendiente de la recta es igual a Rg2 / 3 permitiendo determinar el

radio de giro de Guinier Rg 3 y la ordenada en el origen I 0 .
Si se ajusta a una recta en el intervalo seleccionado, el sistema de
partculas se considera monodisperso, en caso contrario es un sistema de
partculas polidisperso.
Adems de la curva de guinier existen otros mtodos para analizar la
curva de dispersin, como la obtencin de la funcin de distribucin de
distancias de la partcula (r ) [239]. Otros mtodos son aquellos que utilizan
el programa GNOM [240] que calcula el radio de giro, el cual puede ser
comparado con el obtenido por el mtodo de Guinier [235].
Funcin de distribucin de pares: Una funcin (r ) o funcin de

distribucin de distancias pares es utilizada para describir los conjuntos de
las distancias entre todos los tomos dentro de la partcula dispersada y es
una herramienta apropiada para detectar cambios conformacionales siendo
posible observar la forma adquirida de la partcula dispersada en diferentes
condiciones:
(r ) 4 r 2 0 (r ) (2.32)
donde (r ) es la funcin de correlacin, tambin llamada funcin

caracterstica que depende tan solo de la geometra de la partcula, 0 (0) 1
y 0 (r Dmax ) 0 donde D max es la mxima distancia intra-partcula.
La funcin de correlacin, (r ) , puede ser obtenida a partir de la
transformada indirecta de Fourier de I(q) y obtener informacin sobre la
forma de la partcula. Las partculas globulares poseen una (r ) con forma
gaussiana centrosimtrica con un mximo en Dmax /2. Las partculas
alargadas poseen una (r ) con el mximo a menores distancias. Las
partculas achatadas muestran el mximo deslocalizados para valores
menores de D max /2 [239, 241] . El radio de giro se puede calcular a partir de esta
ecuacin:
r r dr
2
Rg2 (2.33)
2 r dr
Y la intensidad I 0 se puede calcular con:
r dr
Dmax
I 0 4 (2.34)
0
La curva de dispersin es utilizada para evaluar estos dos parmetros, el

lmite angular de nuevo sern bajos ngulos pero los valores obtenidos son
ms fiables y menos sensibles a los efectos de interacciones, si se compara a
los obtenidos con la aproximacin de guinier.
El programa de clculo GNOM desarrolla una funcin de clculo (r ) a
partir de un modelo inicial, en este caso de una esfera formada por un gran
nmero de elementos esfricos. Basado en este modelo, un programa calcula
la funcin de dispersin y si se ajusta, el modelo es el correcto [242, 243].
Anlisis de Kratky: La curva de kratky es utilizada para analizar la
conformacin de los liposomas, aunque tambin es utilizada para analizar
polmeros y protenas. El grado de plegamiento de una partcula di spersada

puede ser cualitativamente determinada utilizando una curva de Kratky, si
se representa I(q)q 2 versus q [244] , segn la ecuacin:
limq q 2 I (q)

2 1 qRg
2
(2.35)
2
R g
En la Figura 2.6 se muestra un ejemplo del anlisis que se realiza segn

Kratky. El grado de plegamiento de la partcula ser desorganizado,
parcialmente organizado y organizado segn sea la tendencia de la curva
representada.
La forma producida por las hetetogeneidades responsables de la
dispersin de rayos X a ngulos pequeos se estim a partir del grfico de
Kratky, i.e. q 2I (q) frente a q. De sta curva se evalu si estas
heterogeneidades presentan una forma fibrilar, esfrica o laminar. Si la
curva obtenida es una parbola, las heterogeneidades muy probablemente
sean de conformacin esfrica, mientras que, si se obtiene una recta, la
forma es fibrilar. Por ltimo, si es media parbola, se trata de lminas [245].
Figura 2.6 Clasificacin segn Kratky cuando se representa el producto del

cuadrado del vector de onda por la intensidad dispersada con respecto
al vector de onda.
2.1.3 Dispersin de neutrones de bajo ngulo

(SANS)
Fundamentos
Es una herramienta bien establecida para la caracterizacin de
nanoestructuras [246, 247],[248],[249]. El rango de trabaj o es desde una escala
atmica (1 nm) hasta 600 nm. Desde su descubrimiento, hace ms de 40
aos [250-252] esta tcnica ha experimentado un aumento de su uso en
investigacin. El objetivo de una medida con dispersin de neutrones de
bajo ngulo es determinar la forma y la organizacin de las
heterogeneidades encontradas en un medio continuo. El uso de
macromolculas deuteradas y un entorno no deuterado permite un contraste
que a travs de un anlisis exhaustivo da informacin de los sistemas
estudiados.
La curva de la dispersin de la intensidad se calcula a travs de la
transformada de Fourier obtenida para una muestra, y que depende
directamente del vector de onda definido en la ecuacin (2.36). Para calcular
las caractersticas estructurales de la muestra se debe eliminar el ruido de
fondo debido al disolvente, y a la clula en la que se realiza la medida. Para
ello, se mide el disolvente solo, una clula vaca y la seal sin clula. Los
valores de intensidad obtenidos se consideran en todas las medidas de la
muestra que se mide en cada momento segn la expresin:
I q I cel q I solv q I cel q
I (q) sol (2.37)
M sol Tsol M cel Tcel M solvTsolv M cel Tcel
donde I sol , I cel , I solv son valores medios obtenidos para la funcin de
intensidad en la muestra, clula vaca y disolvente, respectivamente. M es la
intensidad del haz incidente y T la intensidad del haz transmitida por la
solucin.
Una vez realizados los ajustes necesarios, los datos que se obtienen
directamente con el equipo de dispersin, se utilizaron dos tipos de anlisis.
Uno de ellos se realiz aplicando un algoritmo que se basa en el modelo de
esfera hueca y el otro se realiz a partir de modelos propuestos por autores
como Guinier que se describe a continuacin.
Partiendo de la ecuacin (2.38), utilizando la aproximacin de Guinier
para ngulos pequeos, al representar ln I(q) frente a q 2 se pueden obtener
los valores de la intensidad dispersada a ngulo cero I 0 y el correspondiente

radio de giro o radio de Guinier (R g ), a partir de la pendiente en la ecuacin
(2.39). I 0 es bien conocido para disoluciones de muestras monodispersas.
I 0 s V V
2 2
(2.40)
Para las vesculas, al trabajar con contraste (H 2 O y D 2 O), la diferencia de

densidades de longitud dispersada ser del siguiente modo:
s V bicapaVbicapa coreVcore s Vbicapa Vcore (2.41)
La densidad que existe en el centro coincide con la del disolvente exterior,

por lo que no se considera en la ecuacin (2.41). La ecuacin (2.41) es
vlida para qR g 1 y para una esfera el radio de giro est relacionado con
el radio exterior, R, con la ecuacin de Lefmann [253]:
R
(r )r dr
4
Rg2 0
R
(2.42)
(r )r dr
2
donde (r ) es una funcin que expresa el interior de la partcula. Para

esferas (r ) 1 cuando 0 r R y para cero la ecuacin se reduce a
R 3
2
g R2 (2.43)
5
El radio de giro de la partcula se puede relacionar de forma directa con el

radio de partcula a partir de la ecuacin (2.43). En el caso de los liposomas
(r ) 1 cuando R-e r R donde e es el espesor de la bicapa lipdica, y para
cero, la ecuacin se convierte en
3 R R e
5 5
Rg2 3 (2.44)
5 R R e 3
El radio de giro obtenido de la aproximacin de Kratky-Porod depende de la

fraccin molar de agua en la disolucin. La aproximacin de Kratky y Porod
se ajusta bien en el intervalo de 0.1q 2 0.6 nm2 para liposomas unilamelares
pequeos. Al realizar un ajuste no lineal de los valores experimentales para
la intensidad dispersada, se obtiene el radio de giro y el valor de I(q)q 2 en
el lmite de q 2 0 . El aumento de la dispersin de los puntos

experimentales y de los errores experimentales cuando se vara la fraccin
molar de agua en la disolucin se debe a la disminucin de contraste de la
densidad dispersada entre la bicapa lipdica y la fase acuosa. As el valor del
radio de giro y el valor del lmite de I(q)q 2 sirven para obtener parmetros
de la estructura de la bicapa lipdica. Nosotros usaremos un mtodo
desarrollado en los 90 por Sadler y col.
Del mtodo de Sadler se van a utilizar los datos adimensionales que se
utilizan para el clculo de espesor de la bicapa lipdica y que se relaciona
con el radio de giro mediante la siguiente ecuacin:

Rg2 Rg2, ( xH ) (2.45)
media
Donde Rg2, es el radio de giro en el contraste infinito,

media xH liposoma agua ( xH ) es el valor del contraste en x H, y es un
parmetro adimensional tabulado. Este parmetro describe la variacin de la
densidad de longitud de dispersin de la bicapa alrededor de liposoma y est
influenciado por las diferencias entre la dispersin que se produce en la
regin polar de la bicapa y la regin hidrofbica.

z z dz
2
R g2,

(2.46)

z dz
donde z es el parmetro adimensional con valores entre 0 y 1 en la
direccin z perpendicular a la bicapa. Para este caso, en el que existe una
distribucin homognea de agua dentro de la bicapa, la ecuacin se resuelve
con z =1 y el espesor de la bicapa lipdica se obtiene
Rg , 120.5d g , (2.47)
Con esta ecuacin se puede calcular el espesor de la bicapa y comparar el

valor con los datos bibliogrficos obtenidos para otras disoluciones de
liposomas. Experimentalmente se ha encontrado que este valor as calculado
es mayor que el valor real debido a que la distribucin de agua dentro de la
bicapa no se distribuye de forma homognea y por lo tanto el clculo de la

densidad de longitud dispersada es una aproximacin del valor real.
Instrumentacin
Los experimentos de SANS en el reactor nuclear ORPHEE se realizaron con
un instrumento PAXY del Laboratoire Leon Brillouin en Saclay, Francia y
utilizan una fuente de neutrones con 93% de uranio enriquecido 235 U. El
flujo del haz directo fue medido usando un atenuador y la seal del agua fue
corregida a valores altos de q. Los datos obtenidos se redujeron a una escala
absoluta (Ver Figura 2.7).
Los experimentos en el ISIS, Inglaterra se realizaron en un equipo
denominado LOQ. Este instrumento est formado por 11 m de lnea de vaco
a travs de la cual fluyen los neutrones y se dirigen a la muestra. Tras ser
dispersados por la muestra, son recogidos por un detector en el que se puede
detectar la posicin de los neutrones y el tiempo que tardan en llegar. Esta
informacin es tratada con el software para obtener las caractersticas
estructurales de los liposomas en disolucin, P(q) y S(q).
Metodologa [254, 255]

Las vesculas en disoluciones diluidas no interaccionan, por lo que el valor
del factor de estructura S(q) se considera 1 en todo el rango de q estudiado.
El factor de forma de hasta tres capas concntricas con radio R i se calcula
segn la frmula de Pedersen (1997) [252].
Figura 2.7 Esquema de un equipo de SANS en el reactor de Saclay. El vector de

onda es de 1.2 nm y la distancia de la muestra al detector de 5 m para
la obtencin de valores de vectores de onda bajos. El detector es un
multidetector de He en 2D y el colimador situado antes de la muestra
es controlado al cambiar la posicin muestra-detector.
2
4
P(q) Vi i i 1 F q, Ri (2.48)
i 1
con
sen qri qri cos qri
F qri 3 (2.49)
qri
3

donde F(qr i ) es el factor de forma estndar para una esfera homognea. Los
mtodos de anlisis ya se han comentado en el apartado anterior.
2.1.4 Citometra de flujo
Fundamentos
El citmetro de flujo se utiliza para caracterizar clulas y orgnulos
celulares (partculas biolgicas) que fluyen en una suspensin celular. El
primer contador celular automtico fue desarrollado por Moldavan [246]
(1934) pero no fue hasta 1953 cuando se consigui un gran avance:
Crosland y Taylor [247] desarrollaron una cmara de flujo basada en la
inyeccin de la muestra en el seno de un fluido a travs de un capilar que se
estrecha. Durante los aos 60 y 70 se producen avances en la tecnologa y
en sus aplicaciones [248, 249] y ya a principios de los 80 aparecieron las
primeras aplicaciones en biologa como un importante avance en el proceso
de contar [20] y medir el tamao de partculas en poblaciones no
homogneas [256] y con fluorforos cuya longitud de onda de excitacin era
488 nm.
Instrumentacin
Para la lectura por citometra de flujo, las partculas son combinadas con
fluorforo [257] o sonda fluorescente. Se inyectan las partculas con flujo
laminar y pasan una a una por un punto de medida iluminado con luz de alta
intensidad. En la Figura 2.8 se observan los componentes principales del
citmetro y su funcionamiento. Las partculas con fluorforo entran en la
cmara de flujo y al pasar por delante de un haz lser emiten una luz
fluorescente y dispersada que es separada de acuerdo a su longitud de onda.
Figura 2.8 (a) Componentes principales de un citmetro de flujo formado

principalmente por una serie de detectores, espejos reflectores y la
fuente de luz lser. Los sistemas de inyeccin de muestra deben ser
isovolumtricos que permita una velocidad constante. (b) Datos
obtenidos del anlisis de una muestra [20] .
As, cuando la luz es dispersada, se registra en un fotodetector, situado

detrs de la muestra, enfrente de la fuente emisora que casi coincide con la
direccin de la luz incidente y da una medida proporcional al tamao de la
partcula que produce la dispersin en transmisin (FS). Existe otro detector
formando un ngulo de 90 con el haz lser (SS) que da informacin de la
luz dispersada y la fluorescencia a 90. La luz dispersada que llega a los
detectores es descompuesta mediante los filtros apropiados manteniendo
constante la longitud de onda de trabajo que en cada experimento depender
del fluorforo que se utiliza. Los parmetros de fluorescencia que se pueden
obtener son FL1, FL2 y FL3 y los fluorforos utilizados han sido NBD para
los liposomas, AF-488 y AF-633 para las cpsulas y capas de
polielectrolitos respectivamente.
Metodologa
Se ha utilizado un citmetro de flujo Partec Flowmax y para el anlisis de
los resultados, el ordenador posee el programa propio del equipo que
permite analizar los resultados obtenidos. El programa permite determinar la
concentracin de partculas en la muestra con la que se trabaja . Mediante
Figura 2.9 Fotografa del citmetro de flujo utilizado y esquema de los

componentes principales. Todas las medidas se realizaro n a
temperatura ambiente. [10]
histogramas biparamtricos la informacin almacenada pasa a llamarse dato

bivariante [258] debido a los dos parmetros de dispersin obtenidos, FSC y
SSC. En la Figura 2.9 se observa el citmetro utilizado.
2.2 POTENCIAL ZETA
2.2.1 Fundamentos
El concepto de potencial zeta se conoce desde hace ms de cien aos, pero
las medidas obtenidas eran poco precisas y con mucho error [235] . En 1985 la
Fundacin de Electroacstica Moderna (ESA) [236] patent esta tcnica y el
desarrollo, extendindola a muestras no diluidas y en todo tipo de
disolventes. En la actualidad [259], esta tcnica est bien establecida y cada
vez son mayores los investigadores que utilizan la medida del potencial zeta
como una herramienta imprescindible [250] . El potencial zeta es un buen
indicativo de las interacciones electrostticas entre las partculas y se usa
normalmente para predecir la estabilidad de una dispersin. Se obtiene a
partir de la movilidad electrofortica, e , concepto que se resume a
continuacin.
El efecto electrocintico ms estudiado y de especial relevancia en
suspensiones coloidales se llama electroforesis o microelectroforesis. La
electroforesis [19] es el movimiento que sufren las partculas cargadas en un
lquido tras aplicarse un campo elctrico externo y paralelo a la interfase

partcula-disolucin. La velocidad que adquieren las partculas, e , se
relaciona con el campo elctrico aplicado, E e , a travs de la movilidad
electrofortica, e, segn la expresin:
e e Ee (2.50)
En la frontera entre la fase mvil y la fase inmvil, conocida como plano de

deslizamiento, se genera un potencial denominado potencial electrocintico
o potencial zeta, [19, 260-262] , que no tiene por qu coincidir con el potencial
superficial, 0, aunque como este ltimo no se puede medir directamente , se
suele suponer que son iguales [19, 262, 263] . est relacionado con la movilidad
electrofortica y se puede calcular de distintas formas, en funcin del
tamao de la partcula. Las tres formas ms utilizadas para relacionar
potencial zeta y movilidad eletrofortica son tres: Aproximacin de
Smoluchowski, aproximacin de Hckel y ecuacin de Henry.
1. Aproximacin de Smoluchowski o de la doble capa fina [264] : es la
primera aproximacin que se desarroll para calcular el potencial
zeta a partir de medidas experimentales de movilidad electrofortica.
Considera que las partculas coloidales son esfricas y que su radio,
a, es mucho ms grande que el espesor de la doble capa elctrica,
k D1 , tal como se representa en la Figura 2.10 (a). Bajo estas
condiciones, el campo elctrico aplicado afecta al movimiento de la
partcula, ya que sta experimenta un campo distorsionado, y se
cumple la expresin:

(2.51)
r0 e
donde es la viscosidad del disolvente y 0 y r son las permitividad

del vaco y del disolvente, respectivamente.
2. Aproximacin de Hckel o de la doble capa gruesa [265] : considera
que las partculas coloidales son esfricas y que su radio, a, es
mucho ms pequeo que el espesor de la doble capa elctrica, k D1 ,
tal como se muestra en la Figura 2.10 (b). Bajo estas condiciones el
campo elctrico aplicado no provoca ningn movimiento del lquido
situado alrededor de la partcula, es decir, la partcula experimenta el
campo casi sin distorsionar, y se cumple:
2.2 Potencial Zeta 105
Figura 2.10 Distorsin del campo elctrico aplicado sobre una partcula coloidal.
a) para dobles capas finas, 1 o 1, existe una mayor
proporcin de iones de electrolito que experimentan un campo
distorsionado. b) para dobles capas gruesas, 1 o 1, existe
una mayor proporcin de iones de polieelctroito que experimentan el
campo original sin distorsionar [19] .
3
e (2.52)
2 r0
3. Ecuacin de Henry [266]: Henry fue el primero en resolver el problema

para esferas de cualquier radio, a, es decir, para cualquier valor de
k D a , llegando a la siguiente ecuacin:
3
e (2.53)
2 r 0 f (kD a)
siendo f (kD a) es la funcin de Henry, que incluye las deformaciones

en la polarizacin de la doble capa elctrica de la partcula debidas al
campo elctrico aplicado, y viene dado por la expresin:
f (kD a) 1 ekD a 5E7 (kD a) 2E5 (kD a) (2.54)
donde Ei (kD a) es una integral exponencial de orden i. Este factor se

puede calcular para partculas esfricas usando las siguientes
aproximaciones:
Para valores de kD a bajos ( kD a <1):
kD a kD a kD a
2 3 4
f kD a 1 5 ... (2.55)
16 48 96
en el lmite la ecuacin queda como, f kD a 1 , la ecuacin de

Hckel.
Para valores de kD a altos, que se dan en medios viscosos ( kD a
>1):
3 9 75 330
f kD a ... (2.56)
2 2 kD a 2 kD a 2 kD a 3
en el lmite la ecuacin queda como, f kD a 3 / 2 , la ecuacin

de Smoluchowski.
La magnitud del potencial zeta indica la estabilidad del sistema,
observndose que los sistemas coloidales no son estables en el intervalo
comprendido entre -30 y +30 mV.
Para medir el potencial zeta se ha utilizado la tcnica de Electroforesis
Laser Dopler, LDE, basada en el principio bsico del efecto Doppler [267] ,
que supone la variacin de frecuencia de cualquier tipo de onda emitida o
recibida por una partcula en movimiento. Esta tcnica implica la utilizacin
de un par de haces lser coherentes procedentes de una nica fuente y
enfocados, mediante unos espejos, hacia un punto concreto de la clula de
medida en la cual se cruzan, iluminando las partculas que pasan. Este punto
est localizado sobre la capa estacionaria, en el cual el efecto de la
electrosmosis es nulo y, por tanto, la velocidad de las partculas se debe
nicamente a su velocidad electrofortica. Adems, en este punto se generan
franjas de interferencia de Young, de espaciado conocido, con las que
interactan las partculas dispersando luz, cuya intensidad flucta con una
frecuencia que est relacionada con la velocidad de las partculas. La luz
dispersada se recoge mediante un detector enfocado hacia el punto de cruce
de los haces, el cual alimenta un correlador digital que determina la funcin
de autocorrelacin, a partir del cual se obtiene la movilidad electrofortica
de las partculas.
Esta tcnica permite determinar el potencial zeta de partculas muy
pequeas, desde 5 nm, obteniendo muy buenos resultados, comparados con
los obtenidos mediante instrumentos tradicionales, ya que el nmero de
partculas en el volumen de dispersin es muy grande [268] .
2.2.2 Instrumentacin
Los experimentos fueron realizados empleando un equipo Zeta Nanosizer
modelo ZS de Malvern Instruments (USA) que posee las siguientes
caractersticas tcnicas y cuyo esquema se muestra en la Figura 2.11:
1. Lser coherente de in He-Ne que opera a una longitud de onda de
632 nm y a una potencia mxima de 10 mW.
2. Un divisor de haz, que divide el haz procedente del lser en dos
rayos, uno de los cuales se emplea como haz de referencia y el otro
se modula para corregir la velocidad de las partculas que se mueven
en el sentido de las franjas de interferencia, lo que permite
determinar de forma inequvoca el potencial zeta de las partcula s.
3. Dos espejos que orientan los haces procedentes de la fuente hacia la
clula de medida. Uno de ellos es mvil y acta como modulador de
uno de los haces, as se mejora la relacin seal/ruido, y la seal
producida por las partculas de baja movilidad, de modo que la
medida sea tan precisa como para las partculas con alta movilidad.
4. Un fotomultiplicador que es un detector muy sensible y funciona en
modo de deteccin unitaria de los fotones.
5. Un correlador digital, que determina la funcin de correlacin
mediante una transformada de Fourier, a partir del cual se obtiene la
Figura 2.11 Componentes del equipo empleado para medir el potencial zeta.
Figura 2.12 Clula de medida y esquema del proceso de medida por LDV.
Representacin del movimiento de los iones hacia los electrodos en la
clula cuando se aplica un potencial, donde la velocidad de los iones
es la velocidad electrofortica.
movilidad electrofortica y el potencial zeta.

Posee un dispositivo de control de temperatura, que permite controlar la
temperatura de la clula de medida con una precisin de 0.1C.
La clula de medida es una clula desechable tipo ZEN1060 (Figura
2.12), que posee dos electrodos a travs de los cuales se aplica el campo
elctrico externo. Esta clula se ha calibrado con un patrn de ltex,
suministrado por el fabricante, de potencial zeta conocido (=-505 mV).
El equipo est conectado a un ordenador. Tanto el manejo del equipo
como el almacenamiento de los datos se llevan a cabo de forma automtica
mediante el programa suministrado por el fabricante, Malvern.
2.2.3 Metodologa
Se comienza con la preparacin de la disolucin coloidal con la
concentracin deseada y una vez preparada se introduce con ayuda de una
jeringa muy lentamente en la clula, evitando las burbujas de aire que se
hayan introducido o se puedan formar en la misma.
Una vez introducida la disolucin en la clula, todo el proceso est

controlado mediante un programa informtico. Este programa necesita como
parmetros iniciales el ndice de refraccin y la absorcin que se produce en
la disolucin a estudiar, la viscosidad y la constante dielctrica del
disolvente empleado (agua, en este caso), la temperatura de trabajo
(25.00.1C), el potencial aplicado, el nmero de medidas a realizar y la
funcin de Henry, f kD a , de las partculas estudiadas, que por defecto est
establecida en 1.5, es decir, en el lmite de Smoluchowski.
Cuando la disolucin se termostatiza a la temperatura seleccionada, se
procede a ejecutar la medida programada. El potencial zeta se obtiene como
un promedio estadstico de n medidas independientes, que el programa
almacena automticamente. De estas medidas se desestiman todas aquellas
que no se reproducen.
Para el estudio de la variacin de la movilidad electrofortica con la
temperatura realizado para los microgeles, la temperatura se increment de
293 a 313 K en pasos de 2 K para bajar de nuevo hasta 293 K, con el fin de
saber si la respuesta es reversible.
El potencial zeta depende del pH, de la fuerza inica (concentracin de
iones presentes en la disolucin) y de la concentracin de las molculas
cargadas en el dispersante. El efecto del pH o de la fuerza inica del medio
o la concentracin de cualquier aditivo dan informacin sobre la estabilidad
del sistema [251] . Dada por ejemplo una partcula en suspensin con un
potencial zeta negativo, al representar las adicciones de cido o base al
sistema coloidal frente al pH alcanzado para cada caso, se obtiene una curva
parecida a una curva de valoracin, en la cual los valores altos de pH
representarn una mayor carga negativa y, por lo tanto, un potencial
negativo, mientras que los pH bajos (cidos) resultarn en potenciales zeta
positivos. El punto en el que el potencial zeta es cero se conoce como punto
isoelctrico, IEP, y es el punto ms inestable del sistema coloidal. Para una
muestra electrostticamente estabilizada, este punto es aquel en el que la
estabilidad debido a las fuerzas repulsivas es muy dbil. En los dos
extremos de la curva (a pH muy cido y a pH muy bsico), las fuerzas
resultantes de la repulsin electrosttica deben ser suficientes para evitar la
floculacin de las partculas en la disolucin.
Estas medidas se pueden hacer con ayuda de una bureta automtica. El
equipo de potencial zeta permite hacer valoraciones automatizadas y
preparaciones de muestra completamente automatizadas. Realiza cambios en
las condiciones de muestreo como son el pH, la conductividad y la

concentracin de la muestra. En el caso del pH, los cambios vienen dados al
aadir un cido o una base. Las medidas estn automatizadas, de esta forma
se puede fijar el incremento del valor del pH o el volumen aadido de
valorante. El protocolo de medida es almacenado en el ordenador como
procedimiento de operacin estndar (SOP) para asegurar su
reproducibilidad [268] .
2.3 FLUORIMETRA O ESPECTROFOTOMETRA

DE FLUORESCENCIA
La fluorescencia permite usar parmetros para identificar la presencia y
cantidad de molculas especficas en el medio [269] . Adems, la polarizacin
de fluorescencia permite analizar perturbaciones en la orientacin y
movilidad de molculas fluorescentes que forman parte de los coloides que
se desean estudiar. En la actualidad, estas medidas se utilizan mucho para el
estudio de membranas en el campo de la biofsica.
2.3.1 Fundamentos
El fenmeno bsico en el que se basa la polarizacin de fluorescencia fue
descrito por Einstein en 1906 [270] mediante la ecuacin que responde al
movimiento Browniano de una partcula en un disolvente
RT
K (2.57)
6V
donde K es el coeficiente de difusin rotacional de la partcula, V el

volumen molar y la viscosidad del medio.
Para entender los principios de polarizacin fluorescente se debe tener en
cuenta que [271]:
2.3 Fluorimetra o Espectrofotometra de fluorescencia 111
La luz es preferentemente absorbida por las sondas cuando el

vector del campo elctrico de la luz de excitacin es paralelo al
momento de transicin de la sonda. La luz de emisin de la sonda
funciona de forma anloga.
Existe un intervalo de tiempo entre la absorcin de la luz y la
emisin fluorescente denominado tiempo de vida de fluorescencia
de la sonda que suele estar en el rango de nanosegundos,
picosegundos para la mayora.
Dicho esto, cuando una molcula se excita con luz polarizada (ver Figura
2.13), el vector del campo elctrico de la luz emitida ser paralelo al vector
del campo elctrico de la luz de excitacin si la sonda permanece
estacionaria durante el tiempo de vida del estado excitado, es decir,
rotaciones de la sonda durante su excitacin producirn una despolarizacin
de la luz emitida respecto de la luz de excitacin [99]. Esto es fundamental
para la determinacin de la movilidad de la sonda en una bicapa lipdica ya
que si la sonda tiene su orientacin restringida debido a la rigidez de la
membrana, la luz emitida ser siempre paralela a la luz de excitacin [272, 273].
El parmetro que se mide en espectroscopa por fluorescencia es el factor
de anisotropa, r, que refleja el grado de restriccin en la movilidad de las
sondas, que han sido excitadas, durante el tiempo que estn excitadas, r se
define como
Figura 2.13 Principios bsicos de la polarizacin por fluorescencia . Si la sonda

tiene su orientacin restringida debido a su localizacin provocar que
la luz emitida sea siempre paralela a la luz de excitacin.
I II I
r (2.58)
I II 2 I
donde I II es la intensidad de la luz cuando los polarizadores de emisin y

recepcin estn orientados paralelamente, e I es la intensidad de luz
cuando los polarizadores de excitacin y recepcin estn perpendiculares [274,
275]
. Cuando la molcula est totalmente libre, la diferencia entre I II I
ser nula y ser mxima cuando la sonda est inmvil. Las geometras de
medida posibles se muestran en la Tabla 2.1:
I = I VV. Intensidad de fluorescencia cuando el vector elctrico del campo
elctrico de luz polarizada y la emisin de fluorescencia son paralelos.
I = GI VH. Intensidad de fluorescencia cuando el vector del campo
elctrico de luz polarizada y la emisin son perpendiculares.
G= I HV/I HH . Es el cociente que determina la sensibilidad entre la luz
polarizada con vector horizontal y la emitida con vector vertical.
B VV y B VH Intensidades debidas a la muestra sin sonda fluorescente.
F= I + 2I . Intensidad de fluorescencia total de emisin de la muestra.
P= (I - I ) /( I + I ). ngulo de polarizacin de la muestra.
El valor mximo terico de la anisotropa, para una sonda es 0.4 y se
encuentra cuando la longitud de onda con la que se excita es prxima a la
longitud de onda a la que emite. Los valores experimentales son menores
debido a que se produce un solapamiento de los espectros de emisin y
excitacin de la sonda por la reabsorcin de la luz emitida [271] .
De forma general ser preciso realizar la correccin de blanco, cuya
intensidad del blanco se resta a la intensidad de excitacin y emisin . La
expresin de anisotropa, queda entonces como:
Tabla 2.1 Posiciones posibles de los polarizadores.
Smbolo Excitacin (Polarizador) Emisin (Analizador)

IVH 90 (Vertical) 0 (Horizontal)
IVV 90 (Vertical) 90 (Vertical)
IHH 0 (Horizontal) 0 (Horizontal)
IHV 0 (Horizontal) 90 (Vertical)
2.3 Fluorimetra o Espectrofotometra de fluorescencia 113
IVV BVV G( IVH BHV )

r (2.59)
IVV BVV 2G( IVH BHV )
La anisotropa est relacionada de forma sencilla con la viscosidad

aparente, ap , del entorno de la sonda. Para una fase homognea, la
viscosidad sigue una funcin logartmica del tipo 1/T y se relaciona con la
anisotropa con una ecuacin derivada de la ecuacin de Perrin [276]:
k B T
r0 r 1 (2.60)
ap (r )
Dnde r 0 es el valor de la anisotropa cuando la molcula est fija, r, en

un medio de viscosidad infinita; , el tiempo de vida medio del estado
excitado; , la viscosidad aparente y (r) el volumen molar rotacional de la
sonda, que se supone que sigue un movimiento browniano, k es la constante
de Boltzmann y T la temperatura absoluta. Se encontr el valor de r 0 para
NBD, 0.297.
2.3.2 Instrumentacin
El fluormetro utilizado es un modelo FP-6500 de Jasco, usa filtros para
controlar la longitud de onda del haz incidente. Tiene dos monocromadores,
uno que controla la eleccin de la longitud de onda de excitacin y otro que
controla el espectro de excitacin que va a ser registrado. Posee una ptica
de doble haz para compensar las fluctuaciones de corriente en la fuente. La
emisin fluorescente es medida a ngulos a la derecha del haz incidente y la
Figura 2.14 (a) Esquema del funcionamiento de un fluormetro [4] .

radiacin emitida pasa a travs de un segundo filtro para aislar el pico

fluorescente que se mide. El haz incidente pasa a travs de un atenuador
para reducir su energa hasta conseguir radiacin fluorescente. La Figura
2.14 muestra un esquema de su funcionamiento.
La fuente utilizada debe ser ms intensa que la utilizada en
espectroscopa UV-visible. Los filtros utilizados son lmpara de vapor de
mercurio a baja presin que da lneas intensas en algunas longitudes de
onda. La necesidad de tener una fuente de radiacin continua provoca que
un fluormetro est equipado con una lmpara de Xenon de alta presin con
una potencia de 75-450 W y como la radiacin producida es monocromtica
no hay necesidad de un monocromador de excitacin.
A pesar de poseer una fuente intensa, debido a la baja intensidad de la
fluorescencia, el equipo posee fotomultiplicadores que son utilizados como
detectores [277].
2.4 TCNICAS DE MICROSCOPA PTICA
2.4.1 Microscopa de contraste interferencial (DIC)
Fundamentos
La microscopa de contraste fue desarrollada fundamentalmente por
Zernike [278] en 1932 y se basa en el retraso que se produce en las ondas de
luz al atravesar objetos de distintos ndices de refraccin, aprovechando y
amplificando dichos retrasos. Un tipo de microscopa de contraste es la
interferencial que tambin se conoce como Nomarski por su descubridor [279].
El microscopio de interferencia es una modificacin de microscopios de
contraste. En este caso la muestra se ilumina con dos haces coherente cuyos
planos de polarizacin forman un ngulo de 90. En las zonas fronterizas
entre reas con diferente ndice de refraccin existen diferencias de fase
entre los dos haces de luz, de forma que pueden ser utilizados para
2.4 Tcnicas de microscopa ptica 115
incrementar el contraste. En este tipo de microscopios se separa por

completo la luz directa de la difractada utilizando prismas [280].
Instrumentacin
Las imgenes DIC fueron tomadas con un microscopio digital Olimpus
IX71 de amplio campo equipado con una placa de contraste de interferencia
diferencial (U-DICT Olympus), y los correspondientes filtros con un
objetivo 60X.
El principio del sistema es sencillo, como se observa en la Figura 2.15 el
rayo de luz monocromtico incide a travs del filtro en el condensador
completamente abierto y el prisma, que se encuentra dentro de l, genera
dos rayos. Estos dos rayos atraviesan de nuevo un segundo prisma colocado
despus de la muestra, y como su trayectoria ptica es desigual se forma una
imagen doble de la muestra lateral y longitudinalmente pero el filtro
analizador los transforma en un mismo plano. Es aqu donde ocurre la
interferencia, constructiva o destructiva, ocasionada por las diferencias en la
trayectoria ptica dentro de la muestra, lo que se manifiesta en la imagen
observando reas ms o menos oscuras [281]. Las partes oscuras de la imagen
muestran las porciones de la especie ms densas [282].
Figura 2.15 Esquema de funcionamiento de un microscopio de contraste

interdiferencial. Utiliza filtros de polarizacin, y prismas Wollaston
para separar los caminos de luz que evita cualquier tipo de protocolo
de preparacin de la muestra [5] .
2.4.2 Microscopa confocal (CLSM)
Fundamentos
La microscopa lser confocal es una tcnica de observacin que se utiliza
mucho en diversas ramas de la ciencia como medicina, biologa o geologa.
A pesar de ser patentada en 1957 por Minsk [283], la tcnica no empieza a
desarrollarse hasta principios de lo aos setenta [284, 285].
Es una tcnica cuya caracterstica fundamental es la capacidad para
obtener imgenes enfocadas con gran resolucin. Las imgenes son
obtenidas punto a punto y reconstruidas digitalmente, lo que permite la
reconstruccin tridimensional de muestras topolgicamente complejas [286] .
El microscopio confocal permite examinar muestras in vivo, en este caso
solo se ilumina el plano fijado por lo que la resolucin de la imagen es
mucho mejor.
Instrumentacin
Las imgenes se obtuvieron con un microscopio confocal LEICA TCS SP2
AOBS equipado con lser de in argn (A=488 nm) y usando un objetivo
LEICA 63X de inmersin de aceite. Se puede seleccionar una o varias
longitudes de onda del lser, en el caso de querer visualizar varias
sondas [287].
Figura 2.16 Principios de un microscopio confocal. Para obtener una imagen

completa, el punto de luz es movido a travs de la muestra con ayuda
de espejos dicroicos. La luz emitida/reflejada pasa a travs de la
apertura pinhole y es transformado en seal elctrica por un
fotomultiplicador para poder ser ledo en el ordenador [8] .
2.4 Tcnicas de microscopa ptica 117
En la Figura 2.16 se muestran los distintos componenetes de un

microscopio confocal. Parte de la luz procedente de la fuente de iluminaci n
atraviesa un primer diafragma y es reflejada mediante el espejo dicroico , y
con ayuda de la lente se enfoca en un punto de la muestra. La seal emitida
en el punto iluminado vuelve por el mismo camino ptico, pasa a travs del
espejo dicroico y es enfocada en el detector.
El principio del funcionamiento del microscopio confocal se basa en los
dos diafragmas o pinholes, uno situado entre la fuente de luz y el objetivo y
el otro entre el objetivo y el detector; ambos deben estar perfectamente
alineados de forma que el segundo de ellos deje llegar al detector solo la luz
del plano focal. La utilizacin de lser como fuente de iluminacin permite
observar una regin muy pequea de la muestra con mucha intensidad. La
luz emitida por la muestra es recogida por un fotomultiplicador donde se
transforma en seal de vdeo que se digitaliza [288]. Un microscopio de
confocal se utiliza para visualizar partculas fluorescentes de un tamao
menor a 5 m.
2.5 TCNICAS DE MICROSCOPA ELECTRNICA

E INICA
La microscopa electrnica se desarroll a principios del siglo pasado
debido a varios estudios entre los que destacan el descubrimiento del
electrn como partcula cargada con masa en reposo y sus caractersticas
con carcter corpuscular y ondulatorio [289]. A partir de ah, se comenzaron a
desarrollar ms estudios hasta construir el primer microscopio electrnico
en 1932 [290].
Pueden distinguirse dos tipos generales de microscopa electrnica: la de
transmisin, TEM, y la de barrido, SEM, si bien ambas tienen diferentes
variantes, entre las que se destacarn, por su utilizacin en es te trabajo;
crio-TEM, crio-SEM y FIB que se comentarn ms adelante. Para todos
ellos, la limitacin de resolucin ptica viene dada por el criterio de
Rayleigh que es una forma sucinta del principio de Abbe [291] y se expresa de
la siguiente forma [292]:
k
d 0.61 (2.61)
2nsen sen
donde d es la resolucin, distancia que debe existir entre dos puntos para
que puedan verse como dos entidades distintas, k es la constante del medio
de la lente, es la longitud de onda de la radiacin, n es el ndice de
refraccin del espacio lente-objeto y es el semingulo de incidencia [293] .
Para toda lente magntica que focaliza un haz de partculas cargadas la
constante de la lente es igual a 1.22. As se deduce, con la ecuacin (2.61)
[294]
, el lmite de resolucin que viene determinado por la longitud de onda
de la radiacin con la que se ilumina el objeto: cuanto menor sea la longitud
de onda de la radiacin, menor es d y por tanto mayor es la resolucin del
microscopio.
2.5.1 Microscopa de transmisin
Fundamentos
En la microscopa electrnica el haz de electrones ti ene una densidad de
corriente uniforme con una energa entre 100 y 200 KeV. Parte de estos
electrones son transmitidos, otros son dispersados y otros dan lugar a
interacciones que producen distintos fenmenos como emisin de luz o
rayos X. En esta tcnica se emplea la transmisin/dispersin de los
electrones para formar imgenes de la muestra [295].
Para que tenga lugar la formacin de la imagen, debe existir un contraste
mnimo o variacin de intensidad entre zonas prximas a la que se quiere
observar. El comportamiento ondulatorio de los electrones permite observar
variaciones tanto en la amplitud como en su fase de onda al atravesar la
muestra y ambos tipos de variacin dan lugar al contraste en la imagen.
En las imgenes de contraste de amplitud se obtiene imgenes de campo
claro o campo oscuro seleccionando mediante diafragmas o aperturas, el haz
directo o los haces dispersados, respectivamente. Dentro del contraste de
amplitud existen dos tipos de contraste debido al grosor o masa de la
muestra y el debido a la difraccin de electrones, de los cuales el primero es
el ms importante [296] .
2.5 Tcnicas de microscopa electrnica e inica 119
El contraste debido a la difraccin se produce a un determinado ngulo

Bragg[293] y por tanto solo aparece en muestras cristalinas con cierta
estructura y orientacin. El contraste debido al grosor de la muestra es causa
de la dispersin que sufre el haz de electrones al atravesar la muestra y
depende del nmero atmico y del grosor de la muestra [297] .
Instrumentacin
La fuente de electrones se produce al calentar un filamento de tungsteno
hasta 2700C a vaco y atraviesa toda la columna del microscopio hasta
llegar a la muestra. El condensador est formado por una serie de lentes
electromagnticas que actan de la misma forma que los espejos con la l uz
al incidir sobre un campo elctrico o magntico. El objetivo sirve para
obtener la mejor resolucin de la imagen [298]. En la Figura 2.17 se muestran
ls principales componentes.
Metodologa
La preparacin de la muestra es una de las etapas ms importantes del
procedimiento experimental. Para que se produzca la transmisin de
electrones a travs de la muestra es necesaria que sta sea delgada, es decir,
transparente a los electrones, como mximo de 100 nm para que la calidad
de las imgenes sea buena. En el caso de muestras biolgicas se produce un
contraste muy bajo ya que generalmente sus estructuras estn formadas por
tomos de nmeros atmicos bajos por lo que se preparan con especies
Figura 2.17 Principales componentes de un microscopio de transmisin. Se

observa la fuente de electrones, el condensador, el objetivo, el
magnificador y la cmara [2] .
qumicas ms grandes como son los metales pesados.

Despus de pasar los electrones a travs de la muestra, los qu e son
dispersados son recogidos por un objetivo. De esta forma, la imagen se
forma y con sistemas de lentes adicionales posibilita una imagen mejorada.
Se utiliza un recubrimiento muy delgado de algn metal pesado como
puede ser acetato de uranilo, cido fosfotungstnico o molibdato de amonio
para proteger la muestra y se evapora una gota de la muestra sobre una
rejilla de cobre recubierta de carbono. Este protocolo se conoce como
tincin negativa [299, 300].
2.5.2 Crio-microscopa electrnica de transmisin
Fundamentos
La crio-microscopa de transmisin electrnica se basa en vitrificar la
muestra para protegerla del vaco y disminuir el dao por radiacin. La
diferencia con TEM tradicional radica en la preparacin de la muestra pero
la base terica del microscopio es la misma.
Llevando a cabo congelaciones ultrarrpidas se consigue que el agua
permanezca en forma vtrea, con lo que no aparecen cristales de hielo que
daen la muestra. Adems no impone ninguna limitacin terica a la
resolucin y la muestra se mantiene en la disolucin fisiolgica inicial.
Instrumentacin
Con el fin de obtener informacin estructural de los liposomas estudiados se
llevaron a cabo experimentos de crio-microscopa de transmisin electrnica
(crio-TEM), para los que se ha usado un microscopio JEOL JEM-1230
(JEOL, Ltd., Japn) similar al mostrado en la Figura 2.18.
En la Figura 2.18 se observa el equipo de crio-TEM utilizado. La fuente
de electrones emite con una diferencia de potencial entre 40 y 120 kV.El
aumento que tiene las lentes proyectoras es desde 50 hasta 600000. Una vez
obtenidas las imgenes se graban en pelculas Kodak 4489 y Kodak SO-163.
A travs de toda la columna, los electrones se mueven en vaco para que
slo interaccionen con la muestra a analizar. Para digitalizar las pelculas
Figura 2.18 Fotografa del microscopio electrnico JEOL JEM -1230 con una
capacidad de operacin de hasta 120kV. Tiene un bioescner con
cmara. La muestra se coloca en un portamuestras que debe ser
criogenizado y para lo que se dispone de una cmara de
criogenizacin.
microfotogrficas se utiliza un escner tipo Dimage Scan Multi Pro (Konica

Minolta Europe GmbH, Alemania).
Metodologa
Mediante crio-TEM se han caracterizado los liposomas estudiados y la parte
principal en esta tcnica es la preparacin de la muestra , como ya se ha
dicho.
Una vez preparadas, las muestras fueron vitrificadas segn el mtodo
descrito por Dubochet y colaboradores [301] y por Llorca y col [302], que
consiste esencialmente en la correcta congelacin de la muestra. Durante
1min se aplica una descarga inica a una rejilla de microscopa electrnica
cubierta por una fina capa agujereada de carbn (Agar Scientific Ltd., Reino
Unido) con el fin de favorecer la adsorcin de la muestra en su superficie.
Una pequea alcuota (5 L) de muestra se deposita sobre la rejilla
descargada eliminndose el exceso de disolucin con papel de filtro durante
5 s. A continuacin, la rejilla se congela en etano lquido a -180C de
manera muy rpida (en 18 s aproximadamente) mantenindose esta
temperatura durante todo el procedimiento de medida, usando para ello un
portamuestras criogenizado Gatan (Gatan Inc., EE.UU.).
Realizando la congelacin en un tiempo tan pequeo se consigue que el

agua circundante a los liposomas no cristalice, sino que vi trifique de manera
amorfa y as no pueda alterar la estructura original de la muestra.
El microscopio se configur para operar a 100 kV y, con el fin de evitar
que la radiacin electrnica daase la muestra, las imgenes se obtuvieron
con un ngulo de inclinacin de 0 bajo condiciones de dosis mnima. Esta
tcnica de medida consiste en irradiar la muestra lo menos posible,
realizando enfoques previos y correcciones a las aberraciones de las lentes
electromagnticas en reas adyacentes a la de inters, de t al manera que slo
se irradie en el momento de tomar la micrografa [303].
Las imgenes obtenidas han sido procesadas y analizadas, que se
mostrarn ms adelante en Resultados y discusin.
2.5.3 Crio-microscopa electrnica de barrido
Fundamentos
Cryo-SEM es la tcnica de microscopa electrnica de barrido que fue
utilizada por primera vez en 1960 aunque no fue hasta los 80 en los que
comenz a comercializarse y estar a la disponibilidad de investigadores.
Crio-SEM es una tcnica que examina material biolgico por debajo de la
temperatura ambiente (entre -100 y -200C), permitiendo que la muestra
tenga la misma apariencia y preservando su estructura fsica y qumica que
posee a temperatura ambiente y as observar la micro y ultraestructura de
estos biomateriales sin daar mucho la muestra.
Las ventajas de tcnicas como el crio-SEM es la obtencin de imgenes
de las intactas estructuras de las partculas que se desean estudiar debido a
que cuando se congela la muestra lquida, esto es el agua contenida en el
interior de los liposomas, en este caso no le da tiempo a cristalizar tan
rpidamente y se mantiene en estado slido. Adems a la hora de preparar la
muestra no requiere de ningn tipo de protocolo que modifique la muestra,
tal como aadir un fluorforo por lo que la densidad observada ser la que
posee la muestra en condiciones normales de temperatura y presin [304-306].
En este modelo donde est equipado con la tcnica de crio-SEM como

con la tcnica FIB, y ambas se pueden aplicar simultneamente para una
misma zona de la muestra.
La tcnica Focused Ion Beam (FIB) [307] o haz de iones focalizados utiliza un
haz de iones Ga + para inspeccionar la superficie de la misma forma que el
haz de electrones utilizado en SEM. El haz primario de iones galio golpea la
superficie de la muestra y arranca una pequea cantidad del material,
provocando que se generen iones secundarios o tomos neutros sobre la
superficie de la muestra. Los electrones secundarios generados (iones) son
recogidos para formar una imagen de la superficie de la muestra que se
estudia [308].
Instrumentacin
El instrumento utilizado incluye dos columnas, una con el haz de electrones
para crio-SEM y otra con el haz de iones para FIB de la empresa ZEISS [309].
En la Figura 2.19 se obsera la columna de los electrones que est situada
Figura 2.19 (a) Equipo de crio-SEM en una columna GEMINI 4000 con una
resolucin de 1nm a 15 mV y una columna CANION para FIB con una
resolucin de 2.5nm a 30 mV. GIS es la estructura por la que se aade
el gas para el recubrimiento para medidas con FIB. A travs del
controlador se obtienen imgenes para ambas tcnicas. (b)
Representacin de cmo estn dispuestas la columna SEM y FIB, el
ngulo de separacin de una con respecto a la otra est establecido en
54 [23, 24] .
a 54 de la columna de iones. La distancia de trabajo desde el haz de

electrones o el de iones hasta la muestra debe ser al menos de 5 mm y la
columna GIS que es la responsable de la entrada del gas metlico para
recubrir la muestra va a tener cuatro puntos de actividad alrededor de la
columna de iones. El vaco al que est sometido la muestra una vez que se
introduce en la cmara ensamblada al microscopio es de hasta 10 mbares.
A la hora de movernos a travs de la muestra, este equipo posee una
rotacin posible para los tres ejes xyz. A travs de los ejes x e y nos
podemos mover hasta 100 mm con un ngulo que puede oscilar desde -10
hasta 60. En eje z el movimiento ser como mucho de 20 mm.
En el caso de la ptica para la columna de electrones, las lentes son de
inmersin magntica con un voltaje aplicado posible desde 30 hasta 200 kV.
La corriente aplicada ser menor a 20 nA y as la resolucin mnima ser de
0.8 nm.
El equipo de escner del que se dispone est controlado por el usuario
con una resolucin mnima de 512x512 hasta una resolucin mxima de
3584 x 3094 con una rotacin de hasta 360 y una velocidad de escaneo de
50 ns/pxel.
Las imgenes se muestran en un rea de 1024 x 884 pxel configurable
dependiendo de la resolucin que se desee. Las imgenes pueden ser
guardadas en formato .tiff, .bmp o jpg, y ya pueden ser analizadas o
seleccionadas para ser tiles en la investigacin que se lleva a cabo [310] .
Metodologa
Para la preparacin de muestras se utiliz un portamuestras como el que se
muestra en la Figura 2.20 en la que se pueden observar las etapas de
preparacin de la muestra. El primer paso que se realiza es la congelacin
de la muestra en un bao de nitrgeno o etano lquido cuyo punto de
congelacin es de -180C o etano lquido, y entonces es transferida a una
cmara de preparacin manteniendo el vaco en su interior para que est en
las mismas condiciones. En esta cmara se procede a recubrir la muestra con
un metal para aumentar la conductividad que suele ser generalmente platino.
Una vez que se ha recubierto de una forma controlada, ya que se fijan los
parmetros de espesor y tiempo digitalmente. Entonces es transferida a la
cmara del microscopio, manteniendo siempre la temperatura constante de -
180C con ayuda de N 2 y el vaco.
Figura 2.20 Preparacin de muestras para crio-SEM y FIB. 1. Portamuestras tipo

WSH-FLAT con anclajes para la fijar la muestra, con un volumen
mnimo es de 1 l de muestra que se ensambla en el dispositivo de
transferencia. 2. Anclaje del portamuestras sobre el dispositivo de
transferencia en la cmara de vaco. 3. Recubrimiento de platino sobre
la muestra con un espesor mnimo de 5 nm para aumentar la
conductividad de la muestra. 4. Transferencia de la muestra a la
cmara de criogenizacin ensamblado al microscopio para el anlisis
de la muestra con el microscopio. Todos estos procesos han sido
realizados en condiciones de muy baja temperatura pero constante en
todo momento [18] .
En la primera parte de la preparacin de la muestra, cuando se produce la

congelacin de la misma, toda el agua congelada queda cubriendo las
partculas que se desean observar, por lo que si se elimina parte de esa
superficie antes de ser recubierta con el metal es ms fcil observarlo, por
ello, con ayuda de una punta de metal, es araada por varias zonas del
volumen congelado de la muestra.
Este mtodo de preparacin de la muestra es relativamente fcil y
econmico, una vez que se dispone del equipo pero es la parte ms
importante del proceso para obtener imgenes de buena calidad con esta
tcnica, ya que cubre las limitaciones que SEM tiene para muestras
biolgicas, en los cuales, las imgenes que se obtienen son siempre de
muestras secas.
Una vez en el microscopio, todos los parmetros son controlados
digitalmente, de forma que se fija el haz de electrones que va a bombardear
la muestra y se comienza a explorarla, buscando los lugares ptimos donde
encontrar una estructura intacta de, en este caso liposomas. El software

utilizado es el propio del equipo denominado SmartSEM.
Permite obtener imgenes de estructuras delicadas tales como los
liposomas. Las imgenes sern almacenadas en formato de imagen y con
ayuda del programa Smartiff se puede determinar fcilmente el tamao de
las partculas y analizar propiamente todas las imgenes [311] .
2.6 TCNICAS DE SUPERFICIE
2.6.1 Balanza de cuarzo
Fundamentos
En los ltimos aos, se ha producido un gran progreso en el desarrollo y
aplicacin de la Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM) para el anlisis
de espesores y propiedades mecnicas de pelculas deposita das tanto desde
medios gaseosos como medios lquidos [312].
El origen de la balanza de cuarzo se debe a los estudios pionero s de
Gnter Sauerbrey [313] que emple resonadores de cuarzo como sensores
gravimtricos, el desarrollo posterior de este tipo de dispositivos ha
conducido a la aparicin de mltiples aplicaciones, cientficas y
tecnolgicas, de esta tcnica; tanto para estudios de sistemas en la interfase
gas/sensor como lquido/sensor.
La ecuacin de Sauerbrey contiene los elementos esenciales que permiten
entender la aplicacin en gravimetra de la QCM. Est ecuacin describe
una relacin lineal entre la masa depositada sobre el cristal y el cambio en la
frecuencia de resonancia, vlida para pelculas slidas y muy delgadas. La
ecuacin de Sauerbrey puede expresarse como,
f f
m f C Z q (2.62)
2 f f2
2.6 Tcnicas de superficie 127
donde m f es la masa depositada sobre el sensor, C = Z q /(2f 0 2 ) es una factor

de sensibilidad dependiente del cristal utilizado, siendo el valor 17.8 ng s -1
para los cristales usados en esta tesis, f es el cambio de frecuencia del
cristal de cuarzo al adsorberse material, es el nmero de armnico, f f es la
frecuencia fundamental del cristal de cuarzo (aproximadamente 5 MHz para
los cristales utilizados) y Zq = 8.810 6 kgm-2 s -1 es la impedancia del cristal
de cuarzo que se puede definir segn la siguiente expresin,
Z q q q (2.63)
donde q es la densidad del cuarzo (2.65 gcm -3 ) y q es el mdulo de cizalla

del cristal de cuarzo (2.9510 6 Ncm-2 ).
Los cristales de cuarzo experimentan tres modos acsticos, de diferente
velocidad, polarizacin y acoplamiento piezoelctrico, dichos modos se
suelen ordenar en funcin de la velocidad de la onda, siendo a el de
velocidad ms rpida y c el modo de velocidad ms lenta. Debido a la
existencia de dos electrodos en las superficies principales del cristal, se
puede excitar los tres modos acsticos, que estn asociados con propagacin
de ondas en la direccin normal al cristal. Las condiciones lmite
establecidas en la parte superior e inferior del cristal junto con la velocidad
del sonido en el cristal definen la frecuencia de resonancia.
La reflexin coherente de las ondas de sonido en las superficies superior
e inferior del cristal conduce a una serie de ondas acsticas estacionarias
entre estas dos superficies del cuarzo. Dada la naturaleza piezoelctrica del
cuarzo existen, por cada modo de oscilacin, dos juegos de frecuencias de
resonancia acstica, que dependen de las condiciones elctricas de contorno.
El primero denominado antiresonancia (resonancia en paralelo), corresponde
al cristal en condiciones de circuito abierto, mientras que el segundo juego
de frecuencias de resonancia corresponde al cristal en condiciones de
cortocircuito y corresponde a lo que propiamente se conoce como
resonancia (resonancia en serie). Las diferencias entre una y otra provienen
de la rigidez piezoelctrica, acompaada por diferencias en la velocidad del
sonido. Las frecuencias de antiresonancia de los tres modos acsticos se
encuentran completamente desacopladas y viene dadas por,
vm
fm (2.64)
2hq
donde v m es la velocidad de la onda correspondiente al modo m, h q es el

espesor del cuarzo, y es el nmero de armnico (en los cristales de cuarzo
al excitar la resonancia de la frecuencia fundamental, aparecen armnicos en
los mltiplos impares de dicha frecuencia), solo siendo vlidos los
armnicos impares, dado que los pares no pueden ser excitados bajo
condiciones de carga simtrica. La frecuencia resonante lleva a su vez
asociado una disipacin que va a ser medida [314] .
La disipacin del cristal o inversa del vector de onda es medida para grabar
la respuesta del cristal oscilando libremente. En 1966 Spencer y Smith [315]
estudiaron la amplitud de la oscilacin del cristal de cuarzo y su
decaimiento tena forma de exponencial sinoidal. Como las capas estudiadas
son delgadas, el efecto es mucho mayor y de esta forma se podr obtener
informacin sobre las propiedades viscoelsticas de las capas adsorbidas. El
cambio en la disipacin es la diferencia de espesor de la superficie antes y
despus de la adicin de la muestra, sea polmero o liposoma en el caso de
esta tesis [316].
Instrumentacin
El equipo empleado en esta tesis ha sido una Microbalanza de Cristal de
Cuarzo Disipativa (D-QCM) modelo Z-500 de KSV (Finlandia) que permite
Figura 2.21 Esquema del funcionamiento de la QCM [6] . Por la entrada se introduce
la disolucin a estudiar y tras el tiempo necesario de estabilizacin se
introduce el disolvente de lavado. La cantidad adsorbida antes y
despus del lavado es lo que se va a medir.
Figura 2.22 a) Cristal de cuarzo recubierto con dos electrodos de oro en la cara
inferior y superior. (b) Funcionamiento de una balanza con electrodo
de oro formando el circuito.
realizar medidas del proceso de adsorcin y crecimiento de pelculas en

disolucin. La Figura 2.21 muestra un esquema de su funcionamient o.
La parte esencial del electrodo es un cristal de cuarzo que se encuentra
entre dos electrodos, uno en la parte superior y otro en la parte inferior del
cristal, que generalmente son de oro, siendo la parte activa del equipo. El
electrodo inferior acta como contacto elctrico con el resto del circuito
oscilador y el superior es la zona donde se deposita el material (Figura
2.22).
Utiliza cristales con dimetro de 14 mm (corte AT) y permite hacer
medidas de la frecuencia fundamental, alrededor de 5 MHz, y de sus
correspondientes armnicos impares hasta el 11. Al aplicar una diferencia
de potencial sobre este tipo de cristales se excita su oscilacin en el modo
de cizalla con una longitud de onda, , propagndose a lo largo del espesor
del cristal. Se han utilizado electrodos con recubrimiento de slice
comerciales, con un espesor aproximado de 5 nm[317, 318].
Metodologa
Inicialmente se hablar de los sustratos planos utilizados y los tratamientos
previos que deben hacerse antes de las medidas. Uno de los sustratos son los
electrodos con recubrimiento de oro que no presentan carga superficial
apreciable, siendo preciso realizar un proceso de tiolizacin de los mismos,
previa a la construccin de las pelculas. Este proceso se llev a cabo
mediante el autoensamblado (SAM) de una capa de tiol sobre el oro. En los
estudios realizados se emple 3-mercaptopropanosulfonato de sodio (HS-
(CH 2 ) 3 -SO 3 - Na + . Para la disolucin del tiol (saturada) se emple etanol

absoluto (Quimivita). La funcionalizacin se produce por inmersin del
sustrato en la correspondiente disolucin durante un periodo de al menos 24
horas; la adsorcin es casi completa tras la primera hora, pero alargando el
tiempo de adsorcin se obtiene un SAM con menor nmero de defectos y
por lo tanto con una densidad de carga ms homognea 1 . La densidad de
carga de nuestras superficies tiolizadas es del orden de 10 5 cargas*cm -2
(determinada, empleando la microbalanza de cristal de cuarzo para obtener
la masa de tiol depositada). Tras el proceso de tiolizacin del oro, la
superficie se lava con una disolucin de HCl y despus abundantemente con
agua de mili-Q. El otro electrodo utilizado posee una capa muy fina de
silicio, donde la carga superficial se consigue generalmente con un
tratamiento con mezcla piraa (altamente oxidante) previo a su empleo.
El anlisis de los datos experimentales obtenidos con la tcnica D-QCM
se realiz empleando el paquete comercial QCM-Z Browse. Este software
realiza una minimizacin de las diferencias existentes entre la impedancia
experimental y la calculada, mediante el algoritmo de Levenberg-
Marquard [319-321] .
2.6.2 Elipsometra
Fundamentos
La elipsometra es una tcnica ptica utilizada desde finales del siglo XIX,
para el estudio de capas y de propiedades pticas de un material, aunque el
nombre de elipsometra fue dado por Alexander Rothen [322] en 1945. Las
propiedades medibles con esta tcnica son el ndice de refraccin y la
absorcin de la luz o coeficiente de absorcin, mediante el cambio de
polarizacin que sufre la luz reflejada por la muestra [323].
La elipsometra se basa en la irradiacin (fuente de luz bien definida) de
un material y la captura de la reflexin que en el material se produce. El
rayo incidente pasa a travs de un polarizador para asegurar que es luz
coherente y justo despus atraviesa el compensador que sirve para que la luz
polarizada sea elptica [324].
El anlisis se realiza teniendo en cuenta la ley de Snell que describe que
cuando un haz incide sobre un material, parte de ella se refleja. La
diferencia entre la que se refleja inmediatamente y la que se transmite nos

da la informacin del espesor de la muestra objeto de estudio.
En la radiacin, tanto incidente como reflejada, existe una diferencia de
fase entre las componentes paralela y perpendicular, dicha diferencia de fase
se denota por , utilizando el subndice 1 para el haz incidente y 2 para el
haz reflejado. La diferencia en la fase, entre el haz incidente y el reflejado,
permite definir el primer ngulo elipsomtrico delta, , que puede tomar
valores entre 0 y 360.
Adems de la diferencia de fase, tambin la amplitud de las componentes
de la luz puede cambiar tras la reflexin y este cambio se defi ne con el
ngulo psi,, segn la (2.65). Este ngulo elipsomtrico puede variar entre
0 y 90.
Rp
tan (2.65)
Rs
Estos dos ngulos son los que se obtienen en las medidas experimentales de
elipsometra.
La ecuacin fundamental de la elipsometra viene dada por la razn
compleja de los coeficientes de reflexin totales, , segn la expresin que
se muestra a continuacin,
Rp
e tan (2.66)
Rs
Esta ecuacin relaciona los ngulos elipsomtricos y con los

coeficientes de reflexin total [325].
Instrumentacin
Todos los experimentos fueron realizados empleando el elipsmetro modelo
EP 3 de la empresa Nanofilm (Alemania). La fuente de radiacin del
elipsmetro es un lser de Nd-YAG con una longitud de onda de 532nm
(verde) y potencia mxima de 50 mW (en los experimentos realizados en la
interfase lquido/slido se emple una potencia del 2%).
En este equipo las medidas elipsomtricas se pueden realizar en funcin
del ngulo de incidencia, pero para los experimentos realizados durante la
construccin in situ de las multicapas, las medidas han sido realizadas a un
Figura 2.23 Esquema de un elipsmetro. Los ngulos que se obtienen del

polarizador y del analizador se denominan como P y A,
respectivamente [1] .
ngulo fijo de 60, impuesto por el diseo de la clula de medida. En la

Figura 2.23 se muestra un esquema del elipsmetro empleado.
Como podemos observar en la Figura 2.23, el elipsmetro est formado
por una fuente de luz; polarizadores que son elementos pticos que tienen
un eje preferente de polarizacin; el analizador que es igual que el
polarizador pero se emplea para determinar el estado de polarizacin; la
cmara CCD que servir como detector y QWP o placa de cuarto de longitud
de onda (tambin se denomina retardador o compensador) que es un
elemento ptico anisotrpico, lo que implica que en funcin de su
orientacin las componentes de la onda incidente salen a distinta velocidad.
Generalmente antes de llegar las componentes de la onda al compensador
estn en fase, sin embargo, al salir emergen fue ra de fase (elpticamente
polarizadas).
Metodologa
El equipo utilizado en esta tesis es del tipo de anulacin, as la luz
monocromtica y linealmente polarizada procedente del lser se hace pasar a
travs del polarizador y de la placa /4. La elipticidad provocada por la
placa /4 compensa la producida por reflexin en la superficie, de tal forma
que la luz que llega al analizador ser linealmente polarizada, ocurriendo lo
mismo en el polarizador, por lo que en la prctica se usar el valor promedio
de las distintas zonas del polarizador y del analizador donde la intensidad de
la luz en el detector es mnima.
Figura 2.24 Modelo de cuatro capas empleado para el anlisis de los datos
elipsomtricos.
Para el anlisis de los datos, se realiza un ajuste de los ngulos

elipsomtricos y a un modelo de interfase concreto (una o varias capas)
caracterizado por el espesor e ndice de refraccin de cada capa. En esta
tesis se ha utilizado un modelo de cuatro capas (ver Figura 2.24) para
describir las pelculas depositadas desde disolucin sobre un substrato
slido.
La primera capa corresponde al substrato de los experimentos
elipsomtricos que es el Si, con un ndice de refraccin n=4.1653 -0.049i, la
segunda capa es la capa de xido nativa cuyo ndice de refraccin es
n=1.4653 [326] , y su espesor se obtiene del anlisis de los datos
elipsomtricos antes de la adsorcin. La capa externa (capa cuarta) fue la
disolucin para la que se supone un ndice de refraccin constante e igual al
de la disolucin polimrica. La capa 3 corresponde a la capa de polmero o
liposoma (monocapa o multicapa) que se adsorbe sobre el substrato.
Una vez seleccionado el modelo se pas a la resolucin numrica y para
lo cual se emple una rutina de minimizacin numrica tipo Simplex,
ajustando la elipticidad a partir de las ecuaciones de Fresnel, siguiendo el
formalismo planteado por Drude [327] . El programa iterativo resuelve dichas
ecuaciones minimizando las diferencias entre los valores de y
experimentales y calculados, y a partir de esta minimizacin se extraen los
mejores valores para el espesor y el ndice de refraccin [328, 329].

3 MATERIALES Y MTODOS
136 Materiales y mtodos
3.1 MATERIALES
3.1.1 Fosfolpidos
Todos los fosfolpidos utilizados en este trabajo fueron comprados a Avanti
Polar Lipids Inc. con una pureza del 99%. A temperatura ambiente son
slidos en forma de polvo y son solubles en disolventes orgnicos; tienen
una temperatura de almacenamiento de -20C.
Los lpidos usados se muestran en la Figura 3.1, y sus caractersticas
principales se numeran en la Tabla 3.1. Como se observa en la figura, los
Figura 3.1 Fosfolpidos utilizados en este trabajo. La diferencia entre ellos radica
principalmente en la existencia o no de dobles enlaces en su cadena y
en el tipo de cabeza polar. Los nombres de los lpidos se dan en la
Tabla 3.1.
3.1 Materiales 137
Tabla 3.1 Caractersticas principales de los lpidos usados.

Nombre fosfolpido Acrnimo Cadena Tm Mw Tipo
-
molecular (C) (gmol
1
)
1,2-dioleoil-sn-glicero-3- DOPC C44H84NO8P -20 786.113 Insaturado
fosfocolina zwiterinico
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L- DOPS C42H77NO10PNa -20 810.025 Insaturado
serina negativo
(en sal sdica)
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3- DMPC C36H72NO8P 23 677.933 Saturado
fosfocolina negativo
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo- DPPS C38H73NO10PNa 54 757.950 Saturado
L-serina negativo
(en sal sdica)
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- DPPC C40H80NO8P 41 734.039 Saturado
fosfocolina zwiterinico
lpidos DPPC, DPPS y DMPC poseen cadena de carbonos sin ninguna

insaturacin, es decir, sin dobles enlaces mientras que el DOPC y el DOPS
poseen una insaturacin en cada una de las cadenas. Se han elegido estos
fosfolpidos por las importantes diferencias en su temperatura de transicin,
Tm, lo que confiere diferencias notables en la flexibilidad de las membranas
liposomares. La combinacin de dos de ellos permite un alto margen para
variar dicha flexibilidad, as como la carga superficial del liposoma, lo que
resulta de gran importancia al recubrirlos con polielectrolitos.
Dadas las caractersticas de estos lpidos se han combinado para formar
distintos tipos de liposomas. Por un lado se han formado liposomas de
DOPC y DPPC, y por otro lado las siguientes combinaciones: DOPC:DOPS,
DMPC:DPPC, DMPC:DPPC:DPPS y DOPC:DODAB. De esta forma se ha
conseguido estudiar liposomas en funcin de la carga y de la insaturacin de
las cadenas, lo que ha dado lugar a liposomas de los siguientes tipos:
insaturados positivos, insaturados zwiterinicos, insaturados negativos,
saturados negativos y saturados zwiterinicos. Los lpidos derivados de las
colinas han sido seleccionados por su mayor inters biolgico y las mezclas
han sido realizadas para que sirvan de modelo de comportamiento.
3.1.2 Tensioactivos
Los tensioactivos utilizados en este trabajo han sido dos: Triton X-100 que
nos sirve de ayuda para destruir los liposomas en el estudio de funcionalidad
de los mismos y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DODAB) para
formar liposomas en combinacin con DOPC y proporcionar al liposoma
carga positiva. Ambos se muestran en la Figura 3.2.
El DODAB, disponible en Avanti Polar Lipids Inc. con una pureza del
99%, es una sal de amonio cuaternario de doble cadena con una temperatura
de transicin a 45C y una de pre-transicin a 36C.
El Triton X-100 proporcionado por Sigma-Aldrich (con grado de pureza
de laboratorio) es un tensioactivo no inico con un grupo hidroflico de
xido de polietileno y una cadena hidrofbica que a temperatura ambiente es
muy viscoso. Es un producto muy utilizado en la degradacin de liposomas
ya que cuando entra en contacto con los mismos rompe con facilidad las
estructuras formadas por los lpidos.
Figura 3.2 Tensioactivos utilizados, DODAB para formar liposomas y

TRITON X -100 para disolver los liposomas.
3.1.3 Polmeros y microgeles

Hablaremos inicialmente de los polmeros utilizados para el
recubrimiento de los liposomas, que se muestran en la Figura 3.3 y cuyas
caractersticas principales se detallan en la Tabla 3.2. Las multicapas se han
formando usando pares de estos polielectrolitos: PSS/PAH,
PSS/PDADMAC.
3.1 Materiales 139
Figura 3.3 Polmeros utilizados para el recubrimiento de los liposomas por la

tcnica capa a capa.
Para los experimentos de dispersin de neutrones se emple la forma

deuterada del PSS, poli(4-estirensulfonato de sodio perdeuterado), obtenida
de Polymer Source (Canad); dicho polmero se representa abreviadamente
como d 7 -PSS, teniendo un peso molecular de 55000 g/mol.
Los estudios ms detallados fueron realizados con el par PSS/PAH. El
PSS presenta un aspecto pulverulento de coloracin blanca, con peso
molecular de 70000 gmol -1 , y con 340 monmeros por mol y cada
monmero con un peso de 206.1 gmol -1 , adems es soluble en agua y en
algunos glicoles, con una pureza del 99%. El PAH, cuyo aspecto es
amarillento cuando est en disolucin acuosa, est disponible en forma de
Tabla 3.2 Polielectrolitos independientes del pH.

Nombre polielectrolito Acrnimo Frmula molecular MW Tipo
-1
(gmol )
Poli-estirensulfonato de PSS (C8H7NaO3S)n 70000 Anin fuerte
sodio
Poli-alilamina PAH (CH2CH(CH2NH2))n 65000 Catinico
dbil
Poli-dialil-dimetilamonio PDADMAC (C8H16NCl)n 100000 Catinico
de cloro fuerte
Tabla 3.3 Polielectrolitos dependientes del pH.

Nombre Acrnimo Frmula molecular Mw Tipo
polielectrolito (Da)
cido L- PGA HO2CCH2CH2CH(NH2)CO2H 17000 Aninico
poliglutmico
Poli-L-lisina PLL H2N(CH2)4CH(NH2)CO2H 32600 Catinico
Polivinilpirrolidona PVP (C6H9NO)n 10000 Catinico
Poli-etilenimina PEI H(NHCH2CH2)nNH2 75000 Catinico
disolucin con una concentracin de 20%w en agua. Cada monmero de

PAH pesa 57.09 gmol -1 . PDADMAC, est disponible en disolucin acuosa
con una concentracin de 35%w en agua.
La Tabla 3.3 muestra los otros polielectrolitos usados son dbiles, y por
tanto su densidad de carga depende del pH. Los pares de electrolitos usados
han sido PGA/PLL (en este caso fue preciso usar PEI en uno de los sistemas
como primera capa adsorbida), PMA/PVP estudiados a diferentes pH y
concentraciones salinas. Todos estos polmeros fueron suministrados por
Sigma-Aldrich y sin ningn tratamiento previo a su utilizacin.
Figura 3.4 Polielectrolitos sintetizados en el laboratorio. PMA c o cido de

polimetacrilato con 12%w colesterol, M w = 11560 Da; es un polmero
con cadenas de colesterol que sirve para formar parte de la bicapa
lipdica que forma los liposomas, es sintetizado por el Dr. Alexander
Zelikin [13] . PMASH o cido de polimetacrilato con 12-14%w grupos
tioles que es otro polmero que se sintetiza en el laboratorio, pero que
debe obtenerse en el momento en que se va a utilizar ya que pierde
actividad con el tiempo.
3.1 Materiales 141
Tabla 3.5 Reactivos necesarios para la fabricacin de PMA SH

Nombre reactivo Acrnimo Frmula Mw/ Casa comercial
1
molecular gmol
cido polimetacrlico en sal sdica PMA (C4H6O2)n 15000 Polysciences
(30%w en agua)
Piridina ditioetilenamina PDA-HCl C7H11ClN2S2 222.8 Shanghai Speed
hidroclorada Chemical
1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil] EDC C8H17N3HCl 191.7 Sigma-Aldrich
carbodiimida hidroclorado
Otros polmeros utilizados contienen cadenas modificadas y dependientes

del pH, son (PMA SH) [330] , preparado in-situ, y PMAc , sintetizado en el
laboratorio [13] y se muestran en la Figura 3.4.
El polmero modificado con grupos tioles, PMA se sintetiz a part ir de
los reactivos que se muestran en la Tabla 3.5.
Las caractersticas del polmero derivado del p-(NIPAM), utilizado para
conferir termorrespuesta tras ser incorporado mediante en la bicapa lipdica,
y del PEG adsorbido mediante una reaccin qumica se resumen en la Tabla
3.4. Fueron adquiridos en Sigma-Aldrich y sin tratamiento previo.
Para la fabricacin del microgel se utilizaron los reactivos mostrados en
la Figura 3.5 y sus caractersticas se detallan en la Tabla 3.6. Todos estos
reactivos fueron utilizados sin ninguna purificacin previa.
Tabla 3.4 Polmeros comerciales de Sigma-Aldrich derivado del p-(NIPAM) con cadenas
terminales de -COOH y derivado del polietilenglicol.
Nombre polmero Acrnimo Frmula molecular Mw

(Da)
Poli-(N-isopropilacrilamida), con cadenas de p-(NIPAM)- (C6H11NO)nSCH2CH2CO2H 2000
cido carboxlico en posiciones terminales COOH
Amino poli-etilenglicol NH2-PEG H2NCH2CH2(CH2CH2O)nCH3 2000

Figura 3.5 Reactivos utilizados para la fabricacin del microgel donde (a) es el
co-monmero VI, (b) es el NIPAM, (c) es BIS que acta como
entrecruzador, (d) es el surfactante, CTAB, (e) es V50 que acta como
iniciador de la polimerizacin.
Tabla 3.6 Descripcin detallada de los reactivos necesarios para la fabricacin del
microgel p-(NIPAM)-co-VI
Nombre reactivo Acrnimo Frmula molecular Mw Casa Pureza
(g/mol) comercial (%)
1-Vinil-imidazol VI C5H6N2 94.11 Sigma- 99
Aldrich
2,2-Azobis(2- V50 [=NC(CH3)2C(=NH)NH2]22HCl 271.19 Sigma- 97
metilpropionamidina) Aldrich
dihidrocloruro
granular
Bromuro de N-Cetil- CTAB ((C16H33)N(CH3)3Br 364.46 AppliChem
N,N,N-trimetilamonio
N,N- BIS (CH2=CHCONH)2CH2 154.17 Merck 99.5
Metilenbisacrilamida
N-isopropil- NIPAM H2C=CHCONHCH(CH3)2 113.16 Acros 99
acrilamida Organics
3.1.4 Sondas fluorescentes

Las sondas fluorescentes han sido utilizadas para tcnicas como el
microscopio confocal y citometra de flujo. Del grupo de las Alexa Flor,
AF maleimida -633 (Alexa Flor cido carboxlico succimidol, 1200 g/mol), y
AF maleimida -488, ambos suministrados por Invitrogen, fueron elegidas para
visualizar las nanocpsulas polimricas de 300 nm. Los Quantum Dots son
la mejor forma de observar los liposomas incluso en microscopa de
contraste. Las otras sondas utilizadas se muestran en la Figura 3.6.
3.1 Materiales 143
Figura 3.6 Sondas fluorescentes, de las cuales FITC acompaa al frmaco

encapsulado, Rodamina B (Sigma-Aldrich, contenido de sonda 95%)
a los microgeles y NBD-PC (Avanti Lipids) es una fosfocolina con la
sonda fluorescente verde NBD que facilita la observacin de los
liposomas con el microscopio de confocal
3.1.5 Productos encapsulados

Se han encapsulado los siguientes frmacos suministrados por Sigma-
Aldrich y cuya estructura se muestra en la Figura 3.7:
DEX-FITC, (relacin de componentes DEX:FITC, 1:250) es un
polisacrido complejo y ramificado formado por molculas de glucosa. Se
utiliza en medicina para el tratamiento de enfermedades hematolgicas y en
aplicaciones biomdicas, debido a su biocompatibilidad, a su coste
relativamente bajo, a su carcter hidroflico y a su facilidad de
modificacin.
DOX-HCl: Doxorubicina hidroclorada (Sigma-Aldrich, 98-102% HPLC),
es un medicamento que inhibe la multiplicacin de clulas tumorales ya que
se intercala entre las parejas de bases de la doble hebra de ADN para inhibir
la sntesis de cidos nucleicos. Se utiliza para el tratamiento del carcinoma y
diferentes tipos de leucemias. A pesar de sus propiedades teraputicas, es
muy txico cuando entra en contacto con el cuerpo humano, provocando
Figura 3.7 Estructura molecular de la doxorubicina y del dextrano
numerosos efectos secundarios. Por esta razn se investiga sobre diferentes

tipos de encapsulacin del mismo. Un ejemplo de frmaco encapsulado es
Doxil, que en los aos 90 se encontraba en el mercado americano.
La enzima encapsulado en liposomas utilizado como modelo de
encapsulacin es la -lactamasa (Sigma-Aldrich con 67.84% de protena),
que constituye un grupo heterogneo de enzimas, que reacciona con el
sustrato nitrocefina (proporcionado por Calbo Chem.). La -lactamasa
produce la reaccin de hidrlisis, y da lugar a un cambio de color que
permite el seguimiento de la reaccin (Figura 3.8).
Figura 3.8 Estructura molecular del sustrato, nitrocefina que reacciona con -
lactamasa.
3.1.6 Entrecruzadores
Se han utilizado tres entrecruzadores: 1,4-ditio-DL-treitol, DTT (Sigma-
Aldrich, 99%), para activar los grupos tioles del polmero; el reactivo
homobifuncional bismaleimidodietiletilenglicol, BM(PEG) 2 , (proporcionado
por Piercenet y utilizado sin purificacin posterior) que no es biodegradable,
3.1 Materiales 145
Figura 3.9 Entrecruzadores ms utilizados en este trabajo. BM(PEG) 2 es un

reactivo homobifuncional no degradable y CAT, entrecruzador
biodegradable. Ambos utilizados para formar enlaces disulfuro a partir
de los enlaces SH. DTT rompe los enlaces disulfuro formados para
activar los enlaces -SH.
y N-cloro-p-tolueno sulfonamida sdica hidratada, CAT (Sigma-Aldrich,

98%w), que s lo es. Estos dos ltimos se usan para crear enlaces disulfuro.
Las estructuras de estos compuestos se muestran en la Figura 3.9.
Para el estudio funcional de los sistemas formados, (degradacin de las
nanocpsulas), se us glutationa, GSH (C 10 H17 N 3 O 6 S), proporcionado por
Sigma-Aldrich con una pureza 98%. Con un peso molecular de
1
M = 307.32 gmol .
GSH sirve como reductor, se conjuga con los frmacos para hacerlos ms
Figura 3.10 GSH o glutationa es un tripptido compuesto de glutamato, cistena y

glicina que sirve como cofactor para algunas reacciones enzimticas y
ayuda en la reconfiguracin de los enlaces disulfuro de las protenas.
solubles en agua. Adems est implicado en el transporte de aminocidos a

travs de las membranas celulares (ciclo del -glutamil).
3.1.7 Otros materiales

En la preparacin de todas las disoluciones empleadas y en todos los
procesos de lavado, centrifugado y diluciones se ha empleado agua de
calidad mili-Q (modelo RG, Millipore), con una resistividad superior a
18 Mcm y un contenido orgnico total (TOC) inferior a 10 ppb.
Para controlar la fuerza inica en las disoluciones preparadas se ha
utilizado cloruro sdico (NaCl), adquirido en Laboratorios Merck con un
99.5% de pureza.
Tabla 3.7 Otros materiales utilizados en los experimentos:

Frmula molecular Nombre largo Casa M Pureza
-1
comercial (gmol ) (%)
CH3Cl Cloroformo Sigma- 119.38 99.5
Aldrich
HF cido fluorhdrico Sigma- 20.01 48
Aldrich
HCl cido clorhdrico Sigma- 36.46 32
Aldrich
NaOH Hidrxido sdico Sigma- 40.0 97
Aldrich
HClO4 cido perclrico Sigma- 100.46 70
Aldrich
KOH Hidrxido potsico Sigma- 56.11 85
Aldrich
(NH4)8Mo7O244H2O Molibdato amnico Sigma- 1235.86 99
Aldrich
C6H8O6 cido L-ascrbico Sigma- 176.1 99
Aldrich
+
(HS-(CH2)3-SO3- Na 3-mercaptopropanosulfonato Sigma- 178.21 90
sdico Aldrich
C2H6OH Etanol Absoluto Quimivita 46.07 100
C7H8 Tolueno Sigma- 92.14 99.9
Aldrich
C3H6O Acetona pura Quimivita 58.08 99.9
3.1 Materiales 147
Figura 3.11 Disoluciones tampn utilizadas durante la tesis.
En la Figura 3.11 se muestran las principales caractersticas de los

tampones utilizados durante toda la tesis.
En los experimentos de neutrones se emple agua deuterada, D 2 O (pureza
99%, Sigma-Aldrich), con el objetivo de variar las condiciones de contraste.
Se utilizaron partculas de slice aminadas (5% w) de 300 nm y de 3 m
(MicroParticles GmbH) y partculas de ltex de poliestireno de 20 nm de
dimetro y con un potencial zeta medido igual a -50 5 mV.
La limpieza y/u oxidacin de todos los sustratos se realiz mediante su
exposicin a disolucin Piraa preparada in-situ con una relacin
aproximada 70:30 de H 2 SO4 concentrado (Sigma Aldrich, pureza 98%) y
H 2 O2 (Sigma Aldrich, 30% en agua).
Finalmente, en la Tabla 3.7 se presentan otros compuestos utilizados en
este trabajo.
Tabla 3.8 Caracterticas de los tampones utilizados

Frmula molecular Acrnimo Casa comercial M Pureza (%)
-1
(gmol )
C8H18N2O4S HEPES Sigma-Aldrich 238.3 99.5
CH3COONa NaOAc Sigma-Aldrich 82.03 99
C6H13NO4S MES Sigma-Aldrich 195.2 99.5
C7H15NO4S MOPS Sigma-Aldrich 209.26 99.5
C4H11NO3 TRIS Sigma-Aldrich 121.14 99.9
KCl + Na2HPO4H2O + PBS Sigma-Aldrich 239.27 99.9
KH2PO4
3.1.8 Disoluciones tampn

Los estudios de las disoluciones han sido realizados en disoluciones tampn,
con el objeto de poder estudiar las condiciones fisiolgicas, como es el caso
de HEPES, PBS o TRIS. Las concentraciones de las disoluciones tampn
han sido de 10 mM y 150 mM de NaCl, por ser la concentracin fisiolgica
de sal. Los componentes usados en los distintos tampones se muestran en la
Figura 3.11 y sus caractersticas se resumen en la Tabla 3.8.
3.2 METODOLOGA
3.2.1 Preparacin de los liposomas por extrusin

Las caractersticas del lpido pueden variar dependiendo de su composicin
(catinico, aninico, neutro). Sin embargo, podemos utilizar el mismo
mtodo de la preparacin para todas las vesculas de lpido sin importar su
composicin. Los elementos generales del procedimiento, que
desarrollaremos posteriormente se muestran en la Figura 3.12, e implican la
3.2 Metodologa 149
Figura 3.12 Esquema de la formacin de vesculas paso por paso: preparacin de

la disolucin, formacin de la pelcula, hidratacin y extrusin.
preparacin del lpido en forma de pelcula, la hidratacin con la agitacin,

y la extrusin para tener un tamao de partcula homogneo.
En nuestro caso el liposoma formado es una mezcla de DODAB y DOPC,
en la que hemos ido variando la concentracin relativa de cada uno con el
fin de observar si existe algn cambio en la formacin y propiedades de las
vesculas. Tanto el lpido DODAB como el DOPC se deben disolver
previamente en cloroformo para posteriormente realizar la mezcla de los dos
lpidos.
El clculo para cada porcentaje se hizo de la misma forma, la cual se
explica a continuacin tomando como ejemplo el caso de 40% de DODAB,
60% de DOPC.
Lo primero que se necesita saber es el peso molecular promedio que
presenta nuestra disolucin, que viene dada por la suma de los productos del
peso molecular por el porcentaje en el que se encuentra:
Pmmedio PmDODA%DODA PmDOPC %DOPC (3.1)
Con la mezcla de estos dos volmenes en la disolucin, podemos obtener

la disolucin de los dos lpidos en la proporcin que se est buscando. As
se ha trabajado en la optimizacin del sistema DOPC:DODAB de tal forma
que se ha estudiado desde un 5% de DOPC hasta un 100% de DOPC en
diferentes tamaos, principalmente 100 nm, pero tambin de 1 m.
Adems de los liposomas de carcter catinico, han sido estudiados otros
liposomas con relacin molar fijada 1:1 y con una concentracin de
1mgmL -1 :
Insaturado, zwiterinico, DOPC:NBD_PC.
Insaturado, con carga negativa: DOPC:DOPS:NBD_PC.
Saturado, zwiterinico: DMPCDPPC:DPPS:NBD_PC.

Saturado, de carga negativa: DMPC:DPPC:NBD_PC.
1. Preparacin del lpido en forma de pelcula.

Para poder formar la pelcula se necesita eliminar el disolvente, de tal forma
que para volmenes pequeos de disolvente orgnico (<1 ml), podemos
evaporarlo con una corriente seca de nitrgeno o argn en un vial; sin
embargo, para volmenes ms grandes, el disolvente orgnico s e debe quitar
con el rotavapor. En nuestro caso al tener un volumen de alrededor de unos
200 l, usaremos una corriente de nitrgeno. En el caso de no utilizar
inmediatamente la pelcula formada, se congela hasta el momento en el que
vaya a ser hidratada.
2. Hidratacin de la pelcula
La hidratacin de la pelcula se logra aadiendo un lquido y a gitando. La
temperatura del medio de hidratacin debe ser cercana a la temperatura de
transicin cristalina del gel-lquido (T c o T M ). Despus de la adicin del
lquido, la suspensin formada se debe mantener a esa temperatura durante
un periodo de tiempo de hidratacin. Este tiempo puede ser levemente
distinto en funcin de la especie y estructura del lpido; sin embargo se
recomienda en general un tiempo aproximado de una hora con una fuerte
agitacin.
Los medios de hidratacin ms utilizados son el agua destilada, las
disoluciones salinas, y los tampones. En este trabajo se ha utilizado una
disolucin de cloruro sdico 10 mM para producir la hidratacin y formar
las vesculas. A cada muestra le hemos aadido el mismo volumen de
disolucin de NaCl, de tal forma que la fuerza inica permanecer constante
en todas las muestras.
3. Extrusin de la disolucin de vesculas

La extrusin del lpido es una tcnica mediante la cual una suspensin del
lpido es forzada a pasar a travs de un filtro de policarbonato, con un
tamao de poro bien definido, en un nmero de veces superior a once. Este
procedimiento da lugar a partculas que tienen un dimetro igual al tamao
del poro del filtro usado.
3.2 Metodologa 151
Figura 3.13 Partes de un mini-extrusor y detalle del ensamblaje de cada una de

ellas. Una vez ensambladas se coloca la pieza en el interior del
estabilizador de temperatura donde van perfectamente sujetas las dos
jeringuillas en cada uno de los extremos. Esto permitir tener una
temperatura constante durante todo el proceso de extrusin.
El motivo de llevar a cabo este procedimiento para formar las vesculas

es que stas no estn en equilibrio con ninguna otra especie en la disolucin,
de tal manera que, cuando se produzca el recubrimiento, se tenga la certeza
de que nicamente se estn recubriendo las vesculas. Adems se consigue
que el tamao de las vesculas sea homogneo.
El Mini-extrusor de Avanti Polar lipids (Figura 3.13) permite preparar
vesculas unilamelares por extrusin de una forma eficiente y rpida. En el
caso en que se necesite producir vesculas de fosfolpidos con una
temperatura de transicin de fase (T M ) por encima de la temperatura
ambiente se utilizar una manta calefactora que homogeniza la temperatura
del mini-extrusor y la mantiene constante durante todo el proceso.
Construido de acero inoxidable y de tefln, permite una limpieza rpida de
todas las partes, lo que reduce el tiempo perdido entre la produccin de
vesculas de diferentes especies de lpidos.
En este mtodo, los fosfolpidos son suspendidos inicialmente en una
solucin salina tamponada a dar vesculas multilamelares. La disolucin con
vesculas pasar repetidas veces a travs de un filtro de policarbonato de
100 nm de dimetro de poro. El resultado son vesculas unilamelares de un
tamao uniforme. Se utilizan unas jeringas que permiten preparar 1 ml de
fosfolpidos cada vez. En las primeras pasadas a travs de una membrana, la
distribucin de tamao de partcula tiende hacia una distribucin bimodal.
Despus de suficientes pasos a travs de la membrana, se obtiene una
distribucin normal unimodal. En este trabajo, la extrusin con este equipo
se ha realizado con 15 pasos a travs de la membrana. Es esencial un
Figura 3.14 Extrusor tipo thermo barrel extruder de Northern Lipids con capacidad
de 10 ml de muestra.
nmero impar de veces para que el producto acabe en la jeringa vaca

inicialmente, y as evitar que las vesculas multilameras contaminen el
producto final. El producto final se almacena a 4C.
La Figura 3.14 muestra el extrusor con mayor capacidad. La forma de
colocar la membrana sigue el mismo proceso descrito para el mini-extrusor
pero en este caso el dimetro de la membrana y de los filtros es mayor. La
presin de trabajo ptima es 14-21 bar, aunque si fuera insuficiente, se
puede aumentar hasta un mximo de 55 bar. El tanque de reserva de
nitrgeno debe tener al menos 10 bar de reserva antes de comenzar con el
proceso de extrusin. En este extrusor se recomienda que la disolucin
atraviese la membrana al menos 30 veces con una velocidad constante para
que la homogeneidad est asegurada.
3.2.2 Determinacin de la concentracin de fsforo

El problema que presenta la preparacin de vesculas es que es difcil saber
qu concentracin de lpido se tiene tras el proceso de extrusin. Un mtodo
que nos permite conocer esta concentracin es valorar el fsforo que hay en
la disolucin, de forma que se puede relacionar la concentraci n de fsforo
con la concentracin de lpido en los liposomas formados.
3.2 Metodologa 153
Existen varios mtodos para cuantificar la concentracin de liposomas. El

primer mtodo conocido es el desarrollado por Bartlett [331], ampliamente
utilizado cuando la disolucin (en la que se encuentra inmerso el
fosfolpido) no contiene fosfatos. Entre los mtodos espectrofotomtricos
ms verstiles cabe destacar el mtodo de Rouser desarrollado en 1970 [332] y
modificado posteriormente por diferentes autores como Stewart [333],
ampliamente utilizados para concentraciones pequeas de fsforo y todo
tipo de disoluciones tampn. Estos mtodos se basan en la determinacin
colorimtrica del fosfato inorgnico. El fosfolpido contenido en l os
liposomas puede ser determinado tras convertirlo en fosfato inorgnico al
aadir a la muestra cido perclrico. Una vez convertido el fosfolpido se
forma un complejo con molibdato, que permitir la determinacin
colorimtrica del fsforo presente en la muestra. El mtodo de Rouser se va
a explicar con todo detalle a continuacin dado que es el que ha sido
utilizado en este trabajo.
1. Valoracin del Fsforo

Para valorar el fsforo es preciso disponer de una recta de calibrado. Se
prepara una disolucin a 1 mgml -1 de KH 2 PO 4 , y se diluye 1:20, es decir,
hasta 0.05 mgml -1 . Para ello se toma 100 l de la disolucin madre y se
aade 1.9 ml de agua.
Preparada esta disolucin, se toman, por duplicado, distintos volmenes
de KH 2 PO 4 para preparar las disoluciones indicadas en la Tabla 3.9,
midindose los valores de absorbancia, A, y representando A fente a la
concentracin.
La muestra de las vesculas se pone por duplicado en un volumen de 100-

200 l, y se dejan secar a 80C hasta evaporar el lquido completamente.
Una vez evaporado todo el lquido, a cada tubo se le aade 450 l de
HClO 4 , y se incuba en un bao de arena atemperado a 250-260C durante
30 minutos, con los viales tapados con las ampollas de vidrio, con el fin de
que se produzca la mineralizacin del fsforo. Es importante subrayar que
es una temperatura de la que no puede pasar para que las posteriores
reacciones se realicen de la forma correcta y as conseguir una medida
exacta de la concentracin de fsforo.
Transcurrido este tiempo, a las muestras se les aaden 3.5 mL de agua
miliQ, 500 L de molibdato amnico 2.5% p/v y 500 L de cido ascrbico
(para reducir el complejo). Se agita rpidamente con el vrtex, para evitar
desfase entre unas muestras y otras, y se incuba en un bao de agua a 100C
durante 7 minutos, tiempo en el que se produce la reduccin completa del
fsforo, lo que viene indicado por un cambio de la coloracin (pasa a azul).
Despus de este tiempo se enfra con hielo y se mide la absorbancia del
fsforo a una longitud de onda de 820 nm.
3.2.3 Sntesis de microgeles

Hemos estudiado un microgel con carga positiva, formado por poli(N-
Tabla 3.9 Volmenes para la preparacin de la recta patrn

-1 -1 -1
Vial Volumen KH2PO4 (0.05 mgml ) l n fosfato moles
0 0 0
1 4 0.0015
2 6 0.00225
3 10 0.0037
4 40 0.015
5 70 0.026
6 100 0.037
7 250 0.092
8 400 0.147
3.2 Metodologa 155
isopropilacrilamida) p-(NIPAM), sensible a la temperatura y que contiene 1-

vinilimidazol (VI) y rodamina, un florforo que permite obtener espectros
de fluorescencia. Aqu, el monmero principal, NIPAM, presta
termosensibilidad al sistema, mientras que el co-monmero, vinilimidazol,
permite controlar el pH. Por lo tanto, los microgeles, a diferencia de
sustratos convencionales, duros y rgidos, ofrecen una amplia gama de
plantillas cuyo diseo arquitectnico es en s mismo un parmetro a
considerar. En este sentido la adiccin del surfactante conduce a la
formacin de microgeles ms pequeos y asegura su reproducibilidad. El
mtodo de sntesis elegido permite obtener microgeles cargados, en los que
la carga se sita en el exterior y el interior permanece neutro, es
denominado core-shell y se detalla a continuacin.
El microgel p-(NIPAM)-co-VI fue sintetizado por polimerizacin
precipitacin radical (Ver Figura 3.15). La polimerizacin se llev a cabo en
un frasco de 2 L de fondo redondo equipado con un agitador mecnico,
condensador de reflujo, termmetro, y la entrada del gas. 15.000 g de
NIPAM, 0.398 g del entrecruzador BIS, 0.163 g del surfactante CTAB y
0.738 g del co-monmero VI fueron disueltos en 1 L de agua purgados con
nitrgeno durante al menos 1 h.
La polimerizacin se inici con 0.453 g V50 y se llev a cabo durante 6 h
Figura 3.15 Sntesis del microgel p-(NIPAM)-co-VI que comienza con la mezcla
de oligmeros para dar lugar a la partcula precursora y
posteriormente el crecimiento que de lugar al microgel [21] .
a 60C bajo una corriente de nitrgeno y agitacin constante a 400 r.p.m. La

dispersin se pasa a travs de lana de vidrio con el fin de eliminar las
partculas y purificar ms de cinco ciclos de centrifugacin a 50000 r.p.m. y
25C.
El microgel se estudi en una disolucin acuosa, los polielectrolitos
fueron disueltos en sal haciendo un estudio de diferentes fuerzas inicas. Sin
embargo, se hizo un pequeo estudio tanto para microgeles en agua como en
una disolucin salina: 0.1, 0.25 M de NaCl.
3.2.4 Sntesis del polmero funcionalizado con

grupos SH.
En un vial de fondo redondo se mezcla PDA-HCl con una disolucin de
EDC de 20 gl -1 en DPBS a pH7 y una vez todo est mezclado se aade
PMA en funcin del grupo de tioles que se quiera crear, como se observa en
la Figura 3.16. En este caso, el grupo de tioles es del orden de 12-14%.
Todo se mezcla con ayuda de un vrtex durante al menos 2 minutos y se
deja toda la noche en agitacin.
De la Figura 3.16 se deduce que la formacin de este polmero es debido
a dos pasos, el primero a la reaccin de PMA con PDA en presencia de
EDC, y una segunda parte para activar las terminaciones en grupos tioles
con ayuda de DTT.
Figura 3.16 Formacin de PMA con grupos tioles. Con la ayuda del EDC se activa
el grupo NH 2 para rpidamente formar un enlace con el grupo
carboxlico del PMA obteniendo una molcula con el nmero de
grupos tioles deseados.
3.2 Metodologa 157
En el primer paso se realiza una dilisis de al menos 24 horas para

purificar el polmero formado por PMA-PDA utilizando una membrana para
dilisis con una longitud de 20-25 cm (12 KDa de peso molecular). Tras la
dilisis, todo el polmero que ha reaccionado ser atrapado en el interior y
los restos de monmeros no reaccionados difunden hacia fuera. Y en este
momento se evapora el lquido en el que se encuentra inmerso el polmero
para ser almacenado finalmente en el frigorfico.
En el segundo paso, se activan los grupos tioles del polmero aadiendo
DTT en MOPS (pH 8) a 37C durante 15 minutos.
3.2.5 Sntesis de nanocpsulas polimricas

Para formar la capsula polimrica se depositan los polmeros que interactan
entre s mediante enlaces de hidrgeno, poli (N-vinil pirrolidona) (PVP) y
cido poli (metacrlico) modificado con grupos tioles (PMA SH). Las
partculas de slice (=3 m) se recubrieron con un total de diez capas.
La adsorcin de las distintas capas se llev a cabo mediante incubacin
de las partculas con el polmero, sea PVP o PMA SH a pH 4 durante
15 minutos y con agitacin continua. Una vez incubadas, la mezcla se
centrifuga tres veces, lavando el slido depositado en las paredes del vial
con disolucin tampn a pH 4, as hasta conseguir cinco bicapas de
polmeros alternados PVP/PMA SH . Una vez recubierta la partcula, los
enlaces de hidrgeno creados por el PMA SH se convierten en enlaces
disulfuro al aadir CAT, un entrecruzador biodegradable. Esto proceso se
realiza aadiendo una disolucin de CAT 2 mM en cido 2 - (N-morfolino)-
etano, MES, (tampn preparado con una concentracin de 50 mM y pH 6)
sobre la disolucin de partculas recubiertas durante un minuto.
Inmediatamente se centrifuga y se deja a pH 4 (20 mM de NaOAc).
Al acabar el recubrimiento de las partculas de 300 nm se aadi una
sonda fluorescente, AF mal -633 que permiti observarlas con el microscopio
y caracterizarlas con citometra de flujo.
Figura 3.17 Formacin de las cpsulas polimricas va la tcnica LbL por

interacciones electrostticas. Una vez disuelta la particular tras formar
las capas, se obtiene una cpsula con coraza semipermeable que puede
albergar diferentes sustancias.
Tras el recubrimiento, las partculas de slice se disolvieron mediante

tratamiento con una disolucin acuosa de cido fluorhdrico HF 5 M durante
5 minutos. Una vez se ponen en contacto con la disolucin cida se
centrifugan y se deja la disolucin a pH 4 (acetato de sodio, 20 mM). En
este momento, se eliminan las partculas dando lugar a una cpsula
polimrica formada por los polmeros unidos por puentes di-sulfuro estable
a 4 pH 7 (evitando la hidrlisis cida o bsica). Este proceso se muestra
en la Figura 3.17.
3.2.6 Tcnica capa a capa sobre sustratos esfricos
Liposomas
La aplicacin de esta tcnica sobre los liposomas requiere modificaciones
respecto a lo explicado anteriormente. Cuando se aade a la solucin de
liposomas un volumen de concentracin conocida de disolucin de
polielectrolito de la misma concentracin salina y se agita la mezcla con
ayuda de un vrtex durante al menos cinco minutos se produce la primera
capa de polielectrolito sobre los liposomas; en la disolucin se encuentran
liposomas recubiertos, no recubiertos y polielectrolito libre debido al exceso
aadido, pero aun as el resto de agregados presentes en la disolucin no
afectan a las medidas de dispersin de los liposomas recubiertos. El mayor
problema viene con la segunda capa con la que se van a producir agregados
3.2 Metodologa 159
no deseados que son los complejos inter-polielectrolito, los cuales

interfieren en las medidas obtenidas y por ello deben ser eliminados. Un
proceso puesto a punto en este trabajo ha sido la centrifugacin de las
mezclas de forma que los complejos de polielectrolito quedan depositados
en las paredes del vial, clarificndose as la disolucin. Si bien es cierto que
con la centrifugacin tambin se pierden liposomas que hayan sido
arrastrados por el complejo inter-polielectrolito pero el porcentaje es tan
pequeo que fue el mtodo elegido para obtener nuestros sistemas.
As, una vez realizada la mezcla formada por los liposomas y el segundo
polielectrolito, tras ser depositado el primero, sta se centrifuga tres veces
para eliminar el exceso de complejo de polielectrolito. La Figura 3.18
muestra el proceso del recubrimiento. El equipo de potencial zeta confirma
la inversin de carga y el equipo de dispersin de luz confirma el tamao.
Bien es cierto que a medida que aumentas las capas de polielectrolito, ms
prdidas de liposomas se producen debido a las numerosas centrifugaciones.
Por esta razn, en los sistemas estudiados, se puede asegurar las mnimas
prdidas de liposomas para un nmero total de ocho capas. El objetivo en
este trabajo ha sido conseguir el mayor nmero posible de capas de
polielectrolitos de carga opuesta aadidas sobre el lpido, pero a su vez
intentando mantener la mxima estabilidad posible del sistema. Esto se ha
realizado con diferentes polielectrolitos por dos vas. Una va comienza con
una primera capa de PLL, PSS, PEI seguida de otra de PGA, PAH,
PDADMAC o PLL repitiendo el proceso varias veces; mientras que la otra
opcin es empezar con una capa de PEI seguida de otra de PGA, y continuar
aadiendo capas de PLL y PGA. Se ha comprobado cul de las dos vas es
ms eficaz y proporciona mayor estabilidad mediante medidas de tamao y
de potencial zeta. Cabe destacar que es necesario un tiempo adecuado en
cada deposicin para que la adsorcin se complete antes de realizar las
correspondientes medidas de potencial y/o tamao.
Figura 3.18 Recubrimiento de liposomas con una primera capa de polielectrolito

PSS y una segunda de PAH.
A medida que se van adsorbiendo ms capas, la posibilidad de que se

formen agregados de partculas debido a excesos de polielectrolitos no
adsorbidos, es mayor. Es por ello muy importante centrifugar la muestra
cada vez que se aade una nueva capa de polielectrolito para eliminar dicho
exceso, que falseara las medidas realizadas. Este paso se realiza en una
centrfuga durante 30 minutos aproximadamente, a 6000 r.p.m.
Microgeles
Un volumen de la dispersin acuosa de microgel fue aadido a un mayor
volumen de una solucin acuosa de 1 gL -1 de polielectrolito, con diferentes
concentraciones de NaCl (0, 0.10, 0.25M). La relacin de volumen fue 1:4.
Los polielectrolitos estudiadas fueron: PSS, y PDADMAC, ambos con
densidad de carga independientes del pH.
Por otra parte, se utiliza poli-L-Lisina marcado con fluorescena (FITC),
disuelto en 0.1 M de NaCl, que dar lugar a una capa de carga positiva entre
el sistema PSS-PDADMAC. El otro par de polielectrolitos utilizado fue PLL
y PGA, que se disolvieron en una solucin tampn para mantener un pH
constante de 7.4 durante la formacin de las capas. La disolucin tampn se
prepar con: MES y TRIS en disolucin salina 0.15 M de NaCl. El pH se
regula mediante la adicin de KOH.
3.2 Metodologa 161
En el microgel con carga negativa, la primera capa depositada es siempre

positiva. La mezcla se mantuvo en agitacin constante durante toda la
noche. Los polielectrolitos en exceso se eliminan con tres ciclos de
ultracentrifugacin a 50000 rpm durante 30 minutos. Entre cada
centrifugacin, se ha eliminado cualquier resto de lquido, y el slido se
volvi a dispersar de nuevo en agua desionizada. Esta secuencia se repite
hasta que se alcanza el nmero de capas deseado. Antes de cualquier
caracterizacin, la microgeles con distinto nmero de capas se dejaron toda
la noche y las soluciones se filtraron a travs de un micrn 1,20 micras con
un filtro de Minisart.
El aumento de las capas provoca un aumento en el radio hidrodinmico
(R H), influenciado por la naturaleza del polielectrolito utilizado en la capa.
Sistemas Hbridos
Estos sistemas se desarrollan en Australia, en el grupo de Caruso y col., tras
los numerosos estudios realizados con capsosomas [217]. Se ha intentado
conseguir nuevos sistemas de encapsulacin de frmacos ms verstiles que
contengan partculas polimricas y liposomas (de ah el nombre de
hbridos). En la Figura 1.20 se puede observar el hbrido despus de haber
sido eliminada la partcula de slice.
La capa precursora es un polielectrolito funcionalizado con colesterol,
sea PLLc o PMAc, dependiendo del sistema estudiado con el objeto de
mantener ms eficazmente anclados los liposomas. Los polielectrolitos que
sirven como capas de separacin sern PMA, PLL y PMAc en funcin del
tipo de fosfolpido que forma parte del liposoma. La formacin de estos
sistemas se realiza mediante la tcnica LbL y al mismo tiempo, para reforzar
las uniones se utiliza el entrecruzamiento de las capas exteriores dando
lugar a un sistema cuya parte externa no es biodegradable, si bien c ontiene
nanosistemas que s lo son. El proceso se va a explicar con ms detalle:
Una suspensin de partculas de slice (5%w) lavada tres veces con
HEPES (10 mM HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7.4) fue utilizada como la
base de estas estructuras. Se comenz con la adsorcin por interacciones
electrostticas de nanocpsulas de 300 nm, (a pH 5 con tampn MES
100 mM) previamente sintetizadas, durante 10 minutos de constante
agitacin y a pH 5. Pasados 10 minutos, la muestra se lava tres veces con
tampn HEPES a pH 7. En este momento se aade PMA cuya concentracin
final en la disolucin es de 1gL -1 , mezcla que se incub durante 10 minutos.
Se lava de nuevo tres veces con HEPES y se aade la capa de polmero

precursora, (PMAc o PLL) de concentracin 1g L -1 incubndose durante
15 minutos con un lavado posterior a 1000 rcf durante 30 segundos.
Los liposomas entonces son aadidos con una concentracin de 1gL -1 y
la muestra se mantiene agitando durante 40-60 minutos para permitir que las
partculas recubiertas con polmero interaccionen con los liposomas. Se para
la agitacin y se centrifuga tres veces. La denominada capa de proteccin,
de anclaje o capping layer ms conveniente encontrada es la formada por
PMA c , que evita la desorcin del liposoma ya que el colesterol se introduce
en la bicapa del liposoma haciendo ms fuerte la unin. En este momento la
muestra se centrifuga al menos una vez con disolucin tampn a pH 4, con
NaOAc (20 mM) para cambiar el pH de la disolucin.
Es en este momento en el que se forman hasta 10 capas para proteger los
liposomas. Los polmeros son PVP y PMASH a pH 4. La concentracin de
los polmeros adsorbidos es de 1gL -1 , cada adsorcin se realiz durante
10 minutos en constante agitacin y se centrifug tres veces con pH 4 cada
una de las capas.
Una vez formado el sistema, se busca que se forme un ensamblaje ms
resistente. Para ello, se aade el entrecruzador a la muestra, en este caso es
Bis-malemeida-poli-etilenglicol, BM(PEG) 2 , con una concentracin de
2 mM durante 15 horas tamponado con MES (50 mM, pH 6). Este xido de
poli-etileno bifuncional con maleimida va a provocar la formacin de
enlaces disulfuro muy estables entre los grupos tioles presentes en el
polmero modificado.
Finalmente, la muestra se centrifuga (1 minuto a 1000 rcf) y tras un
primer lavado con la misma disolucin tampn en la que se encuentra el
hbrido, se realizan dos lavados ms para dejarlos en disolucin tamponada
de NaOAc 20 mM a pH 4.
Para formar la cpsula polimrica se hizo un tratamiento con cido
fluorhdrico (HF) menos agresivo que el utilizado para las partculas
pequeas por ser un sistema ms complejo: Una mezcla de HF 5 M y
NH 3 HF (3:4) se puso en contacto con la muestra durante 2 minutos y
rpidamente se centrifug, lavando la muestra con disolucin tampn a pH 4
al menos tres veces. Parte de la muestra se deja a pH 4 y otra parte se puede
centrifugar otra vez para cambiar la disolucin tampn y mantener la
muestra a pH 7.
3.2 Metodologa 163
Una variedad ya nombrada pero no explicada hasta ahora, y que tambin

se investig, fueron los hbridos invertidos, que se desarrollaron de la
misma forma que los hbridos pero ensamblando primero los liposomas para
conseguir liposomas flotando en la cpsula cuando se cambia el pH. Estos
hbridos invertidos, cuyo proceso de formacin se muestra en la Figura 3.19,
pretenden simular los capsosomas pero ms complejos, de forma, que al
cambiar el pH, los liposomas y las cpsulas polimricas quedan flotando en
el interior de la gran cpsula polimrica, permitiendo as reacciones en
cascada [334] .
3.2.7 Funcionalizacin de los liposomas. Ensayo

cuantitativo
Reaccin enzimtica
La eleccin de la enzima -lactamasa como modelo de enzima permite
Figura 3.19 Esquema que muestra el proceso de ensamblaje para hbridos

invertidos. De esta forma, sobre la partcula de slice se aade la capa
precursora de PMA c seguido de la deposicin de los liposomas y la
siguiente adsorcin secuencial de capas separadoras PMA c y PLL. A
continuacin se aaden las cpsulas de 300 nm y se finaliza con el
ensamblaje electrosttico de los polmeros PVP/PMA SH . Con un
tratamiento de HF se consigue vaciar la partcula de slice .
visualizar y cuantificar su actividad controlando la conversin de nitrocefina

(amarillo) en producto hidrolizado (rojo) mediante un ensayo colorimtrico,
segn se puede observar en la Figura 3.20. Para confirmar la presencia, la
encapsulacin y la actividad de la enzima en el interior del liposoma, se
aadi TRITON X-100 (T X-100) como tensioactivo usado para liberar las
molculas de la enzima del liposoma y as hacerlas accesibles a la
nitrocefina.
Es importante conocer la reaccin que tienen lugar entre la nitrocefina y
por tanto poder entender lo que ocurre cuando se encuentra en disolucin.
De forma general la nitrocefina se encuentra en forma de polvo que es
soluble en agua y adquiere un color amarillo ms o menos intenso en
funcin de su concentracin. El cambio de color al entrar en contacto con la
enzima se atribuye a la conjugacin del sustituyente dinitroestireno con el
anillo -lactmico y el doble enlace en el anillo dihidrotiazina, lo cual se
puede observar a 386nm [113, 335, 336] . Al ser rpidamente hidrolizado por la
enzima, la absorcin a 386nm disminuye para aparecer en una longitud de
onda mayor, tal como puede observarse en la Figura 3.22.
El ensayo consiste en aadir 5 L de nitrocefina en 45 L de tampn
PBS (NaH 2 PO4 + Na 2 HPO4 a pH fisiolgico, 7.4 y de concentracin 0.1 M)
a la muestra de hbridos. Se realiza en dos tubos, uno que sirve de control y
el otro donde se produce la reaccin enzimtica. En uno de ellos, los
liposomas contienen la enzima confinada en el interior. A ambos tubos se
aade el tensioactivo y se deja reaccionar durante 3 horas. El resultado ser
que en uno de ellos el color se torna a rojo, debido a que la enzima liberada
por accin del tensioactivo reacciona con la nitrocefina, hidrolizndola y
Figura 3.20 Transformacin estructural sufrida en la nitrocefina al ponerse en

contacto con la enzima en disolucin acuosa.
3.2 Metodologa 165
Figura 3.22 Ensayo enzimtico que consiste en la liberacin del frmaco que con
el contacto del sustrato se produce el cambio de color de amarillo a
rojo confirmando la encapsulacin del frmaco en el interior de los
liposomas.
volvindola de color rojo. En el otro tubo como no existe enzima, el color se

mantiene amarillo, ya que a pesar de aadir el tensioactivo y romper los
liposomas no libera nada ya que no se ha encapsulado nada.
Degradacin de capsulas polimricas.

Una ventaja significativa de los hbridos o de los hbridos invertidos es la
posibilidad de encapsular diferentes tipos de frmacos y poseer diferentes
tipos de respuestas segn el estmulo aplicado. Para ilustrar esta posibilidad,
se ha utilizado el entrecruzador no degradable para entrecruzar las capas del
hbrido y que no pueda ser afectado por ningn estmulo.
Figura 3.21 Reaccin de GSH con capsula polimricas de PMA SH /PVP.

El agente reductor, utilizado para ello, es la glutationa, GSH y DTT para

previos experimentos, confirmando as su degradacin. Es posible
degradarlos por haber utilizado el entrecruzador degradable CAT (agente
oxidante que convierte los enlaces de hidrgeno en puentes disulfuro), tal y
como muestra la Figura 3.21.
La degradacin de las nanocpsulas fue realizada introduciendo en una
disolucin de GSH 5 mM en PBS a pH 7.4 un volumen de 5 L de la
disolucin que contiene hbridos. La disolucin mezcla se calent hasta
37C en constante agitacin (al menos 1000 rpm). La muestra se mantuvo
as toda la noche para asegurar la completa degradacin de las cpsulas. La
muestra control estaba formada por la disolucin de hbridos sin GSH
calentada y tratada de la misma forma para observar la diferencia. La
degradacin fue caracterizada por citometra de flujo y por microscopa.

4 RESULTADOS Y DISCUSIN
168 Resultados y discusin
4.1 ESTUDIO DEL RECUBRIMIENTO DE

LIPOSOMAS
4.1.1 Liposomas
En este captulo se han estudiado suspensiones de liposomas recubiertos. El
estudio se ha estructurado en dos etapas. La primera etapa es la
caracterizacin del sistema plantilla, es decir, de las suspensiones de
liposomas sobre los que se va a producir el recubrimiento. La segunda etapa
es el estudio detallado y la puesta a punto del mtodo de recubrimiento de
liposomas.
Como sistema plantilla se han utilizado liposomas formados por
diferentes fosfolpidos. Los estudios principales se han centr ado en dos
tipos: Liposomas catinicos formados por la mezcla del fosfolpido (DOPC)
y el tensioactivo catinico bicatenario (DODAB), y liposomas de carcter
zwiterinico formados por DOPC y DPPC.
En el caso de liposomas catinicos (DOPC:DODAB), ha sido necesario
realizar un estudio de la variacin de la densidad de carga en funcin de la
contenido de DODAB en la mezcla. La densidad de carga determina la
cantidad de polielectrolito que se debe aadir a la suspensin para que tenga
lugar el recubrimiento del liposoma mediante interaccin electrosttica
liposoma-polielectrolito.
Se han realizado tambin estudios de liposomas zwiterinicos puros
(DOPC) con objeto de poder ampliar el marco de plantillas disponibles para
recubrimientos y formacin de estructuras ms complejas, tipo
coloidosomas.
Se puede definir coloidosoma como aquella estructura formada por la
adsorcin de nano o micropartculas en la interfase de microgotas formadas
en sistemas de lquidos inmiscibles [337-339] . Hasta ahora, se han desarrollado
sistemas formados por slidos porosos [340], espumas [341] o partculas
nanocompuestas [342] para diversas aplicaciones, principalmente en bio-
medicina [343-348]. En nuestro caso nos hemos centrado en los coloidosomas
formados por partculas de poliestireno cargadas [349-353] y liposomas
cargados que mediante la tcnica capa a capa son adsorbidos en la superficie
(Figura 4.1).
4.1 Estudio del recubrimiento de Liposomas 169
Figura 4.1 Coloidosomas donde (a) representa la adsorcin de liposomas

unilamelares pequeos sobre la superficie de micropartculas de
polielestireno y (b) la adsorcin de nanopartculas de poliestireno
sobre liposomas unilamelares pequeos.
Determinacin de la concentracin de fsforo

Para comenzar con este estudio, es importante conocer la concentracin
del sistema plantilla que se utiliza. Inicialmente se conoce la cantidad de
lpido que se introduce para formar la bicapa lipdica. Sin embargo, el
problema que presenta la preparacin de vesculas es que no se sabe qu
cantidad de lpido se pierde en la extrusin, y por lo tanto se desconoce la
concentracin de liposomas despus de la misma. Aplicando el mtodo
descrito en el captulo de Materiales y mtodos para la determinacin de
contenido en fsforo, es posible estimar las prdidas y el contenido lipdico
de las vesculas formadas. Para vesculas unilamelares pequeas formadas
por un nico lpido se estima una prdida de alrededor de un 10% en el
proceso de extrusin [354] . La determinacin de la concentracin [331, 355] de
lpido en los liposomas se ha desarrollado para el sistema de liposomas de
carcter catinico formado por mezclas DOPC:DODAB.
En la Figura 4.2 (a) se ha realizado un ajuste lineal con ordenada en el
origen nula para las vesculas formadas despus de la extrusin cuya
pendiente resultante es 7.52106 1107 molL -1 . El nmero de moles de
fosfato es igual al nmero de moles de fsforo y por tanto del fosfolpido
que forma parte de la vescula.
Figura 4.2 (a) Variacin del contenido en fsforo con respecto al % m de DOPC
presente en los sistemas estudiados. Anlisis del contenido en fsforo
de liposomas de carcter catinico DOPC:DODAB con un tamao de
100 nm, obtenidos mediante extrusin en disolucin 10 mM de NaCl
frente al porcentaje de DOPC en vesculas formadas por mezclas de
DOPC:DODAB. La lnea continua representa los valores esperados sin
prdidas. (b) Variacin de las prdidas despus del proceso de
extrusin. La lnea discontinua representa el ajuste de los datos.
Dispersin de luz para liposomas formados por DOPC y

DODAB
Como se dijo en el captulo de Metodologa, para que se de la formacin de
vesculas, la disolucin de la bicapa lipdica hidratada debe pasar a travs de
una membrana. En la Figura 4.2 (b) se presenta la concentracin terica con
respecto a la calculada experimentalmente y la pendiente obtenida es 0.9
(adimensional) y como consecuencia se confirma lo observado en otros
sistemas [354]: la prdida sufrida en nuestro sistema tras la extrusin asciende
a un 10-12%.
En principio a partir del dato de concentracin lipdica, junto con datos
de densidad de la membrana y radio externo e interno de la misma obtenida
Tabla 4.1 Radio hidrodinmico obtenido al extruir la disolucin de vesculas y utilizando

una membrana de tamao de poro de 100 nm.
Nmero de extrusiones RH/nm
3 80.43
4 59.40
6 58.19
7 54.15
8 53.25
9 50.42
10 51.00
11 47.74
mediante las Tcnicas dispersivas es posible estimar la concentracin de

vesculas.
En nuestro estudio todos los sistemas de liposomas son obtenidos
mediante la tcnica de extrusin, con lo que el tamao de los mismos queda
determinado por la membrana elegida a travs de la cual se hace pasar la
disolucin. El tamao del liposoma ms estudiado durante esta tesis ha sido
100 nm de dimetro, pero se ha realizado un pequeo estudio con
membranas de tamao de poro superior para comprobar el efecto en la
polidispersidad. La polidispersidad se refleja en el valor numrico del ndice
de polidispersidad (PDI). El valor mximo para el PDI es 1 y, cuanto ms se
aproxime a cero, ms monodispersa es la disolucin, y por tanto la
distribucin es unimodal.
En la tabla Tabla 4.1 se muestra el tamao obtenido con el equipo de
menor volumen, el mini-extrusor, observando que desde la primera
extrusin el tamao se homogeneiza fcilmente, adquiriendo el tamao
deseado tras realizar once extrusiones. Como el volumen obtenido con este
equipo es muy pequeo, 1 mL, se comenz a utilizar uno de mayor volumen,
el cual tambin se optimiz para determinar el mnimo nmero de
extrusiones que son necesarias para obtener siempre el mismo tamao.
En la Figura 4.3 se puede observar la evolucin de un proceso de
extrusin ( = 100 nm) utilizando el equipo extrusor de mayor volumen y
donde se utiliza una corriente de nitrgeno para generar la presin necesaria
para que la disolucin atraviese la membrana.
Figura 4.3 Variacin de la distribucin de tamaos en funcin de la intensidad a

medida que aumenta el nmero de extrusiones para liposomas de
= 100 nm.
Para la primera extrusin, el valor del PDI es 1, pues la distribucin de

tamaos es muy amplia. La siguiente imagen corresponde a la sptima
extrusin, dnde el PDI = 0.2. En este caso, a excepcin del mximo
relativo a la derecha de la imagen, todas las vesculas tienen el mismo
tamao (67.2 nm de radio). Por ltimo, en la decimoquinta extrusin, se
obtiene un resultado apropiado, un nico pico de radio 46.4 nm y un
PDI = 0.08.
La funcin de correlacin de la intensidad de la luz dispersada por la
muestra es sensible a estos cambios, segn se observa en laFigura 4.4 . La
funcin que decae antes (en negro) corresponde a la ltima extrusin. La
primera extrusin decae lentamente y en la funcin debido a la
polidispersidad de la muestra se observa ruido.
Figura 4.4 Funcin de correlacin frente al tiempo de decaimiento medidas en las

muestras obtenidas tras un nmero diferent e de extrusiones.
En ocasiones, se puede intentar deshacer los agregados incrementando la

temperatura (sin llegar a alcanzar la temperatura de transicin) y sonicando
las muestras. Los resultados no son siempre satisfactorios porque parte de
los agregados desaparecen, sobre todo si las vesculas no estn recubiertas y
no hay repulsin entre ellas, pero al mismo tiempo parte de ellas se rompen
quedando en la disolucin en forma de bicapas lipdicas.
A continuacin se caracterizaron los liposomas obtenidos tras la
extrusin a traves de membranas con diferente tamao de poro . En este
sentido, se utilizaron disoluciones formados por DOPC:DODAB (30:70) y
DOPC puro que se extruyeron el mismo nmero de veces, utilizando
membranas con distintos tamaos de poro: 100, 200 y 400 nm. Tras la
extrusin, se ha medido el tamao aparente de los liposomas en disolucin
mediante la tcnica de dispersin de luz dinmica. En la Figura 4.5 se
observa la variacin del ndice de polidispersidad para los liposomas en
funcin del tamao y del tipo de fosfolpido que se utiliza. En ambos casos
se ha comprobado que el ndice de polidispersidad aumenta a medida que las
vesculas son mayores. Se observa que para el caso de vesculas de 100 nm
el ndice de polidispersidad se reduce por debajo de 0.1 mostrando una

distribucin muy estrecha. Al fabricar liposomas de 200 nm y de 400 nm el
ndice de polidispersidad se hace mayor hasta valores que son casi tres
veces el obtenido para liposomas de 100 nm.
Los liposomas catinicos permiten una extrusin ms cercana al tamao
de poro seleccionado si se compara con los liposomas formados por tan solo
fosfolpido puro, como es el caso de liposomas formados por DOPC y
liposomas formados por DPPC. El tamao obtenido para estos liposomas es
un poco ms grande ya que la membrana lipdica es ms flexible. El proceso
de extrusin es mucho ms fcil pero el proceso de reduccin de tamao e s
mucho ms difcil ya que los liposomas pueden atravesar con facilidad la
membrana. Al aumentar el nmero de extrusiones la polidispersidad
disminuye, sea cual sea el lpido del que estn formados. Pero al mismo
tiempo se pierde ms fosfolpido que queda retenido en la membrana del
extrusor, por lo que el sistema de extrusin se optimiz para liposomas
Figura 4.5 Radio hidrodinmico R H de las vesculas formadas por: (a)

DOPC:DODAB (3:1) y (b) DOPC. Las medidas de DLS han sido
realizadas a pH 7.4, a 25 C y a un ngulo de dispersin de 90
utilizdo membrans con diferente tamao de poro. La lnea azul para
100 nm, la lnea negra para 200 nm y la lnea roja para 400 nm.
formados con un solo fosfolpido. En este caso, el nmero de extrusiones

pasa de 30 a 40 para poder asegurar la mnima polidispersidad.
Potencial zeta para liposomas formados por DOPC y DODAB

Este sistema se caracteriza por una densidad de carga independiente del
pH del medio con un potencial zeta siempre positivo que tan solo depende
de la concentracin, tal y como se muestra en la Figura 4. 6 obtenida para
liposomas formados por mezclas DOPC:DODAB. Se observa un aumento de
potencial zeta cuando la mezcla de DOPC:DODAB est en torno 90:10. Una
vez que el valor del potencial aumenta hasta 602 mV el potencial zeta de
los liposomas es prcticamente constante hasta que se alcanza la relacin
30:30. Es a partir de esta relacin cuando de nuevo el potencial zeta del
liposoma vuelve aumentar hasta valores en torno a 75 mV. La estabilidad
mostrada nos permite trabajar con estos liposomas co mo plantilla para los
posteriores recubrimientos.
Figura 4. 6 Variacin del potencial zeta para liposomas formados por

DOPC:DODAB con variacin de concentracin de DODAB. Medidas
realizadas a temperatura ambiente, 25C y en disolucin salina 10 mM
despus de ser extruidos con un tamao medio de 100 nm de dimetro.
Dispersin de luz y potencial zeta para liposomas con carcter

zwiterinico
En la Figura 4.7 se muestra el dimetro hidrodinmico para liposomas
formados por DPPC extruidos a travs de dos membranas de dos tamaos de
poro distintos, 100 nm y 1 m con el correspondiente ndice de
polidispersidad. La curva obtenida para vesculas de 1 m posee mayor
ndice de polidispersidad, la curva tiene una anchura mucho mayor, a pesar
de haber seguido el mismo procedimiento durante el proceso de extrusin.
En ambos casos se tuvo especial cuidado con la temperatura de extrusin
que siempre fue 50C, por encima de la temperatura de transicin del
fosfolpido.
El punto isoelctrico caracteriza a todos los liposomas con carcter
zwiterinico y nos da informacin sobre la estabilidad del sistema. En esta
regin, la disolucin de liposomas se muestra ms inestable y pueden
Figura 4.7 Radio hidrodinmico normalizado para liposomas formados por DPPC
extruidos en disolucin tampn a pH 7.4. La curva roja se corresponde
a liposomas de 100 nm de dimetro y la curva negra para liposomas de
1 m obtenidos tras la extrusin a travs de membranas de
policarbonato del tamao mostrado.
aparecer agregados. Por esta razn a continuacin se muestran los estudios

de pH solo para liposomas cuya carga depende del pH del medio.
En la Figura 4.8 se muestra el comportamiento de tres sistemas formados
por liposomas zwiterinicos: DPPC, DOPC y DPPC:DOPC (70:30). En la
mayora de disoluciones electrolticas, el potencial de las fosfocolinas
tiende a ser negativo a pH bsicos debido a la presencia de una capa de
aniones adsorbida a los dipolos originados en la cabezas polares
zwiterinicas [66]. El punto isoelctrico calculado para liposomas de DP PC es
a un pH 7.0, muy cerca del pH fisiolgico, que es al que se trabaja
normalmente, para DOPC es 6.5 y para una combinacin de DOPC:DPPC
(30:70) est entre ambos y corresponde a 6.8, ms cercano al valor obenido
para el DPPC ya que contribuye ms por estar en mayor proporcin. Se
observa que la regin inestable de estas disoluciones est muy cercana al pH
Figura 4.8 Potencial zeta obtenido mediante movilidad electrofo rtica en funcin
del pH para determinar el punto isoelctrico en liposomas
zwiterinicos en disolucin acuosa con concentracin salina igual a
10 mM. El tamao de los liposomas es 100 nm de dimetro y las
medidas estn realizadas a 25C. Comparacin con el punto
isoelctrico observado para DPPC (), DOPC () y DOPC:DPPC
(30:70) (). El crculo indica la regin en la que se sita el IEP.
de trabajo, por lo que se debe acudir a alternativas que mejoren la

estabilidad en las condiciones de trabajo. Entre las posibilidades se ha
estudiado este tipo de sistemas manteniendo el pH constante y utilizando
recubrimientos.
Calorimetra diferencial de barrido y Anisotropa

Cuando se trabaja con liposomas formados por DPPC se debe conocer la
temperatura de transicin de fase gel cristalina a lquido que facilite el
poder trabajar con ellos. Esta temperatura, de la que ya se ha hablado en la
secin de Los lpidos es sensible a la presencia de polmeros,
impurezas [105], y es muy importante para el caso en que su valor est cerca
de la temperatura de trabajo. Por esta razn se caracterizaron estos sistemas
con dos tcnicas. La calorimetra diferencial de barrido (DSC) es la tcnica
ms directa y precisa para determinar transiciones conformacionales [356, 357]
y/o cambios de fase al modificar la temperatura [358]. Permite medir la
Figura 4.9 Calor liberado en liposomas de 1 m formados por DPPC () y

encapsulando DOX (). Los experimentos han sido relaizados en
disolucin tamponada HEPES a pH 7.4 con fuerza inica igual a
10 mM NaCl.
capacidad calorfica aparente de una disolucin como funcin continua de la

temperatura, a partir de la cual se puede conocer parmetros
termodinmicos [359] asociados a la transicin inducida por la temperatura
como la entalpa, entropa, energa de Gibbs y capacidad calorfica [102].
En la Figura 4.9 se observa que la transicin trmica de DPPC tiene lugar
aproximadamente a 41C, valor que est de acuerdo con los datos
bibliogrficos. Adems se observa la pre-transicin, caracterstica en este
lpido, que corresponde a valores de 34-36C [360].
Otra forma de determinar esta temperatura de transicin es median te el
valor de la anisotropa, obtenido mediante la tcnica de despolarizacin, de
la que ya se ha hablado en el captulo de Tcnicas experimentales. Esta
tcnica necesita la presencia de una sonda y la elegida es NBD -PC incluida
en todos los sistemas estudiados para que permita su comparacin. Las
medidas se realizaron en el intervalo de temperaturas 12 -55C con una
velocidad de aumento de temperatura de 20C/hora. De los resultados
Figura 4.10 Variacin de la anisotropa, r, para liposomas formados por DPPC ()

y liposomas formados por DPPC:DOPC() en disolucin tamponada a
pH 7.4 y con una concentracin de 10 mM NaCl. El tamao de los
liposomas es de 100 nm de dimetro.
obtenidos se representa el inverso de anisotropa frente al inverso de

temperatura, y con la ecuacin de Perrin [276] se determina la temperatura
buscada. Para el caso de DPPC, se ha encontrado en la bibliografa el valor
de r 0 que es 0.297 [360].
Para calcular grficamente la temperatura de transicin se realiza el
ajuste lineal para cada una de las pendientes y el punto de corte de ambos
ajustes es el valor buscado. Para el caso de DPPC la temperatura de
transicin obtenida experimentalmente es 443 C y para la mezcla
DPPC:DOPC T M =393 C (Figura 4.10). Considerando que
T M (DPPC puro )=41C, el resultado obtenido es coherente, adems de que su
grfica presenta un cambio brusco donde se produce el cambio de fase.
En la Figura 4.11 se muestra la variacin de anisotropa para el sistema
de DPPC, de nuevo, y cargado con DOX. Se muestra la diferencia en la
pendiente al llegar a la temperatura de pre-transicin que afecta mucho ms
a liposomas sin ningn aditivo que al aadir polmero en la bicapa y
Figura 4.11 Variacin de la anisotropa, r, para liposomas formados por DPPC ().
Comparacin de la variacin de temperatura de transicin para
liposomas modificados por polmero y cargados de DOX (). Las
disoluciones son de disolucin tamponada HEPES a pH 7.4.
frmaco en el interior del liposoma. Cuando el frmaco se encuentra en el

interior del liposoma que sirve como apantallamiento [361] es difcil obtener
la temperatura de transicin. Adems, el no tener el valor de r 0 para esta
sonda se trabaja con el valor obtenido a partir de los experimentos con DSC.
4.1.2 Adsorcin alternada capa a capa de PSS/PAH
Dispersin de luz y Potencial zeta

Los polielectrolitos adsorbidos sobre la superficie de los liposomas
proporcionan capas que modifican la superficie del liposoma y con ello
algunas propiedades fisicoqumicas. El nmero de capas adsorbidas sobre el
liposoma depender del tamao, tipo de liposoma, de los polielectrolitos, y
Figura 4.12 Coeficientes de difusin para disoluciones de liposomas

DOPC:DODAB con un radio medio de 50 nm sin capas (), con una
capa () y con cuatro capas ().Las medidas han sido realizadas a
temperatura ambiente, en agua miliQ y en muestras diferentes para
cada dilucin. La lnea roja punteada indica el ajuste de los datos para
todos los casos.
Tabla 4.2 Coeficiente de difusin a dilucin infinita para el sistema de liposomas

DOPC:DODAB (30:70)
-15 -15
Liposomas DOPC:DODAB Coeficiente de dilucin D010 Desviacin estndar ()10
(30:70)
Sin recubrimiento 5.20 0.02
(PSS/PAH)0.5 4.28 0.007
(PSS/PAH)2 2.65 0.02
de otras variables que han de ser tenidas en cuenta al disear nuestro

sistema. Este estudio se ha centrado en liposomas catinicos que se recubren
con polielectrolitos de carga contraria y donde la tcnica capa a capa ha sido
aplicada hasta obtener liposomas recubiertos con cuatro bicapas de
polielectrolitos. Pero antes de presentar los resultados sobre los radios
obtenidos para liposomas con un nmero de capas se realiz un estudio para
ver si las diluciones de vesculas influyen en el clculo del coeficiente de
difusin, y con ello en el valor del radio hidrodinmico. Se ha observado
que para liposomas unilamelares pequeos, la dilucin no afecta al valor
obtenido, como se puede observar en las diluciones que aparecen en la
Figura 4.12:
A partir de la Figura 4.12 se puede obtener el coeficiente de dilucin
infinita, D0 , del punto de corte con el eje y a partir del ajuste realizado. Los
resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.2 y se observa que la
dilucin no afecta a los resultados obtenidos. El tamao antes de la
adsorcin del polielectrolito obtenido en todos los casos, utilizando la
ecuacin de Stokes-Einstein, es de 50 nm de radio, que coincide con el
tamao de poro utilizando para estos liposomas.
El problema es que cuando hay contribuciones de liposomas de varios
tamaos, si las distribuciones de los dos tamaos no son muy diferentes,
pueden solaparse y, por lo tanto, no se puede conocer exactamente el valor
de los radios. Con el fin de evitar esto, se estudia la funcin de correlacin
en cada muestra y se analiza con los mtodos descritos en la seccin
2.1 Tcnicas dispersivas . Con este procedimiento se puede separar todas
las contribuciones de los distintos tamaos que puede haber en las
dispersiones.
De este modo, si se representa la inversa del tiempo de decaimiento con
respecto al vector de onda, se obtiene una relacin lineal en la que la
pendiente es el coeficiente de difusin de la muestra. Las medidas se

realizan a varios ngulos, y se hacen medidas por duplicado cada 5 para
evitar errores sistemticos. A continuacin se muestra el proceso de
obtencin del radio hidrodinmico a partir del coeficiente de difusin. Si se
representa el inverso del tiempo frente al cuadro del vector de onda se puede
determinar, el coeficiente de difusin a travs de la ecuacin (4.1).
En la Figura 4.13 se describe el proceso de obtencin de los coeficientes
de difusin. Para vesculas sin recubrimiento la pendiente es mayor que para
Figura 4.13 Obtencin del coeficiente de difusin: (a) representa las funciones de
correlacin de una muestra a diferentes ngulos; (b) representa la
funcin de correlacin para varias muestras a 90; (c) Tiempo d
decaimiento a 90 para diferentes muestras; (d) Variacin del tiempo
de la inversa del tiempo de decaimiento frente al cuadrado del vector
de onda para diferenctes muestras. Los errores rep resentan las
anchuras de las distribuciones de tiempos de relajacin.
Figura 4.14 Coeficiente de difusin para vesculas de 100 nm formadas por

DOPC:DODAB en una relacin 70:30 en disolucin salina con 10 mM
de NaCl a 25C a medida que se aade PSS.
el caso de las vesculas con una capa. De la pendiente se obtiene el valor del
coeficiente de difusin, y se calcula, a partir del coeficiente de difusin el
radio hidrodinmico, teniendo en cuenta la temperatura y viscosidad
obtenidas del equipo en cada medida.
Esta parte se va a centrar en el estudio de vesculas formadas por
DOPC:DODAB (30:70) y de su recubrimiento con PSS. Si en el proceso del
recubrimiento se estudia la variacin del coeficiente de difusin a medida
que se aade polielectrolito, se observa cmo el coeficiente de difusin pasa
por un mnimo hasta que se produce el recubrimiento completo. En la Figura
4.14 se observa la concentracin a la que el coeficiente de difusin adquiere
un valor mnimo, y por lo tanto, un valor de radio hidrodinmico mximo.
Con estas medidas de dispersin de luz (DLS) el radio hidrodinmico de
calculado est relacionado con la carga del sistema a estudiar, segn lo
planteado por Velegol y colaboradores [95] . En la Figura 4.15 se muestra la
variacin del radio hidrodinmico y de carga en funcin de la concentracin
del polielectrolito. Es una evidencia experimental de los dos fenmenos que
Figura 4.15 (a) Potencial zeta o y (b) radio hidrodinmico de una suspensin de
vesculas formadas por DOPC:DODAB (30:70) en funcin de la
concentracin del polielectrolito aninico, PSS. La barra horizontal en
(a) indica el error debido al equipo utilizado y que debe tenerse en
cuenta a la hora de considerar la densidad de carga positiva o
negativa.
ocurren en la disolucin de vesculas formadas por DOPC:DODAB (30:70)

cuando se ponten en contacto con el polielectrolito aninico, PSS y se
denominan inversin de carga y condensacin.
La Figura 4.16 representa el valor del radio hidrodinmico en funcin de
potencial zeta para el sistema formado por DOPC:DODAB (30:70). En la
figura tambin se han representado los valores obtenidos para vesculas
formadas por otros lpidos con recubrimientos desde el par PSS/PAH hasta
PGA/PLL. Los puntos que se sitan en valores ms altos de radio
hidrodinmico representan liposomas recubiertos hasta con cuatro capas. El
potencial terico representado se ha construido a partir de las relaciones
matemticas, establecidas por Velegol Twar, entre radio hidrodinmico y

potencial zeta.
El estudio del recubrimiento con PSS para liposomas formados por la
mezcla de DOPC:DODAB se ha extendido para diferentes proporciones de
ambos con lo que la carga positiva que caracteriza el sistema depender de
la cantidad de DODAB presente en el liposoma y esta carga a su vez, afec ta
a la cantidad de polielectrolito adsorbido. De esta forma, cuando en las
disoluciones de liposomas de carga positiva se aade un polielectrolito de
carga contraria, por interacciones electrostticas se produce una adsorcin
del polielectrolito sobre la superficie del liposoma que se traduce con una
inversin de carga del sistema observndose una variacin de potencial zeta
de un valor positivo a un valor negativo. Durante este proceso de inversin
de carga existe un momento en el que el valor de la carga se iguala y la
medida del potencial zeta es igual a cero y como en el punto de
neutralizacin de los liposomas el sistema es inestable y tienden a agregarse.
Figura 4.16 Radio hidrodinmico frente al potencial zeta para vesculas formadas
por fosfolpidos recubiertas con polielectrolitos en disolucin salina
con una concentracin de 10 mM. Las lneas contnuas simtricas
indican el intervalo inestable de las disoluciones que encierran la zona
denominada Potencial de Velegol-Twar.
Figura 4.17 Potencial zeta frente a la concentracin de PSS. Las vesculas estn
formadas por DOPC y DODAB: 10% DODAB (), 30% DODAB, (),
50% DODAB, (), 70% DODAB () y 80% DODAB, ().Todos los
datos corresponden a 25C y a un volumen total de 2 mL.
Inicialmente se discutir en detalle la adsorcin de la primera capa. Se

comienza con potencial zeta positivo, propio de los liposomas con los que se
est trabajando y se va aadiendo disolucin de polielectrolito de carga
contraria inmerso en el mismo disolvente y con la misma fuerza inica. A
medida que se aade ms polielectrolito, el potencial zet a va disminuyendo
hasta hacerse negativo pasando por cero. Si se contina adicionando
polielectrolito con carga negativa, provocaremos que el potencial sea ms
negativo, hasta llegar a un punto en el cual el potencial permanece constante
a pesar de seguir aadiendo ms polielectrolito. En este punto, en el que se
producir la inversin de la carga, ser en el que la vescula se considere
completamente recubierta.
La metodologa es la siguiente: se aade un volumen de disolucin de
polielectrolito a la dispersin de vesculas, se calcula la concentracin de
polielectrolito aadido en cada momento a partir del volumen aadido. En el
proceso de adsorcin alternada la separacin del polielectrolito en exceso no
adsorbido se realiza por centrifugacin. Finalmente la concentracin de

polielectrolito se representa frente al potencial zeta. En la Figura 4.17 se
observa que el valor para el cual el potencial zeta es cero se encuentra en
torno a un valor de concentracin de polielectrolito dependiente de la carga
de la vescula que se est recubriendo. El estudio incluye la mnima cantidad
de DODAB aadida (5% m) hasta el mximo (90% m) pero por claridad en la
grfica nicamente se muestran los datos ms representativos. El punto de
neutralizcin se produce a mayor concentracin de polielectrolito a medida
que aumenta la carga positiva de la vescula. Una vez obtenidas las grficas
de recubrimiento para vesculas con diferente carga inica, se selecciona el
punto de neutralizacin para cada proporcin de carga positiva. Se observa
que alrededor del punto de neutralizacin no hay medidas de potencial zeta
ya que el sistema es inestable y las vesculas agregan (zona rayada
representada en la grfica).
Si se representa la proporcin de DODAB con respecto a la
Figura 4.18 Variacin de la concentracin de polielectrolito aninico PSS

necesaria para alcanzar el punto de neutralizacin en funcin del % m
de DODAB en la vescula. La concntracin de las vesculas es
constante y la temperatura de medida es 25C. La recta punteada
representa el ajuste lineal de los puntos pasando por cero.
concentracin de PSS que corresponde al punto neutralizacin de cada tipo

de vescula, se observa una evolucin lineal cuya ordenada en el origen es
igual a cero. La Figura 4.18 muestra que la concentracin de PSS a la cual
= 0 crece linealmente con la proporcin de DODAB, por lo que es posible
calcular la cantidad de PSS a partir de medidas de y la proporcin de
DODAB.
Para el segundo recubrimiento se ha realizado un estudio similar. Al
aadir PAH se produce una compensacin de cargas, de forma que recubre
la vescula, obteniendo los resultados que se muestran en la Figura 4.19.
Para el caso de la segunda capa, la inversin de carga requiere
prcticamente la misma concentracin de PAH independientemente de la
carga original de la vescula plantilla. Este resultado confirma que el
sistema Liposoma-PSS tiene una carga independiente del contenido en
DODAB del liposoma plantilla inicial y sugiere que formadas las dos
Figura 4.19 Variacin de la concentracin de polielectrolito catinico, PAH en

funcin de la carga del liposoma formado por DOPC y DODAB. Las
relaciones DODAB:DOPC representadas son: 30:70, (), 40:60, (),
50:50, (), 60:40, (), 80:20, (). Las medidas han sido realizadas en
disolucin salina 10 mM NaCl y tras centrifugar las muestras y
eliminar el complejo inter-polielectrolito.
Figura 4.20 Variacin del potencial zeta en funcin del nmero de capas de
PSS/PAH adsorbidas sobre los liposomas formados por DOPC y
DODAB y medidos a 25C. Las relaciones DODAB:DOPC
representadas son: para 30:70, para 40:60, para 50:50, para
60:40, para 70:30 y para 80:20.
primeras capas, la formacin de la tercera capa debera producirse siguiendo

el mismo protocolo.
En la Figura 4.20 se puede observar la alternancia en el potencial zeta
con el nmero de capas para las vesculas con distintos porcentajes de
DODAB.
Este es el momento de mostrar los resultados con dispersin de luz. En la

Figura 4.21 se recogen los coeficientes de difusin de las vesculas plantilla
de distinta carga (DOPC:DODAB) durante la adsorcin alternada capa a
capa de PSS/PAH. Los coeficientes de difusin obtenidos disminuyen al
aumentar el nmero de capas lo que corresponde a un aumento del tamao
de la cpsula, como es de esperar. Los coeficientes de difusin despus del
primer recubrimiento, son muy similares lo que indica que el sistema
liposoma-PSS formado es estable, reproducible e independiente del
contenido de DODAB en el liposoma plantilla. Las medidas de DLS se
realizaron a 90 para las vesculas formadas por mezclas de DODAB y
DOPC.
Figura 4.21 Coeficiente de difusin para vesculas con diferente densidad de

carga. Medidas realizadas a 25C para vesculas de 100 nm de
dimetro en disolucin salina 10 mM NaCl. Las relaciones
DODAB:DOPC representadas son: para 30:70, para 40:60, para
50:50, para 60:40, para 70:30 y para 80:20.
Figura 4.22 Evolucin del radio hidrodinmico en funcin del nmero de capas
para vesculas con 30% m de DODAB y 70% m de DOPC.
En la Figura 4.22 se ilustra la variacin del radio hidrodinmico en la

adsorcin alternada del sistema (DOPC30%DODAB70%)-((PSS) n -(PAH) m )
desde n=1, m=0 hasta n=m=4. Como se puede observar, aparece un efecto
par-impar como consecuencia de que las capas de PSS tienen espesores de
3-4 nm mientras que las capas formadas por PAH el espesor es del orden de
12-15 nm.
Microscopa crio-electrnica
La tcnica de microscopa crio-electrnica ha permitido confirmar la
forma y la estructura de liposomas obtenidos por extrusin. En estos
experimentos hemos utilizado liposomas de tamao de 100 nm. Las
muestras preparadas estaban en disolucin salina con una concentracin de
10 mM. Todas las imgenes pertenecen a liposomas catinicos formados por
DODAB:DOPC, con una relacin molar de 30:70 y los polielectrolitos
elegidos para recubrir estos liposomas son PSS/PAH en disolucin acuosa
con una concentracin de 1 mgmL -1 de polielecrolitos caracterizada
mediante DLS.
Figura 4.24 Crio-TEM de vesculas formadas por DODAB:DOPC (relacin 30:70)

sin recubrir con una concentracin de 1 mgmL -1 .
En la Figura 4.24 se muestra una fotografa del sistema DOPC:DODAB

tomada con crio-TEM en la que se observan liposomas unilamelares
esfricos con un tamao medio de 100 nm de dimetro con baja
polidispersidad. La lnea ms ntida que se observa en la fotografa con
forma esfrica y que separa el fondo del interior corresponde a la bicapa
lipdica del liposoma. Esta bicapa lipdica separa dos zonas que poseen la
misma densidad electrnica, ya que tanto dentro como fuera de la membrana
Figura 4.23 Crio-TEM de (a) vescula sin recubrimiento y (b) vescula con cuatro
capas de PSS/PAH en disolucin acuosa con una concentracin de
10 mM NaCl a pH 7.4. La concentracin tanto de la vescula como de
los polielectrolitos es de 1 mgmL -1 .
la disolucin acuosa en la que estn inmersos los liposomas presenta la

misma fuerza inica.
En la Figura 4.23 se pueden observar las diferencias existentes entre
liposomas recubiertos por polielectrolitos y liposomas sin capas. Para que se
puedan observar las diferencias con mayor claridad, se ha recubierto el
liposoma con dos bicapas de polielectrolitos, pero es apreciable la diferencia
de espesor entre ambas membranas debido a la existencia de los
polielectrolitos adsorbidos. Si hacemos uso de los datos obtenidos por DLS,
el incremento de espesor es de 18 nm para dos bicapas de PSS/PAH, lo que
confirma, junto a los datos de potencial zeta que los polielectrolitos han sido
adsorbidos. El procesado de las imgenes y el posterior anlisis muestra un
incremento en el espesor de la bicapa de 144 nm, que entra dentro del error
experimental.
En la Figura 4.25 se da una visin general de liposomas de 100 nm de
tamao inmersos en disolucin acuosa tamponada y con una fuerza inica de
10 mM. Al comenzar las medidas con el microscopio de barrido se ha de
seleccionar la zona a estudiar en profundidad por lo que esta imagen es el
primer paso para posteriormente obtener imgenes de mayor resolucin. Con
esta imagen se observa una muestra muy monodispersa en la que los
liposomas se encuentran libremente en la disolucin sin apreciar agregados.
Al analizar esta imagen y determinar el tamao de las estructuras esfricas
observadas, el tamao determinado es de 9510 nm.
Figura 4.25 (a)Vista total de la muestra depositada sobre el portamuestras con

crio-SEM a pH 7.4 y de 100 nm de tamao. (b)Vista de la poblacin
total de liposomas en la muestra observada.
Figura 4.26 Crio-SEM para liposomas de 100 nm donde se observa la tendencia de

los liposomas a agregarse con el tiempo. Al mismo tiempo es fcil
deducir el tamao de los liposomas con una gran estadtica. (a) y (b)
representan la misma zona pero la figura (b) fue tomada con ms
resolucin.
En la Figura 4.26 se muestran liposomas de 100 nm en forma de

agregados pero aun as se ha podido medir el tamao de los mismos que
corresponde a 98 4 nm en el 90% de los liposomas medidos.
En la Figura 4.27 se muestran las imgenes obtenidas por microscopa de
barrido de los liposomas obtenidos por extrusin con membrana cuyos
tamaos de poro son 100 nm y 1 m empleando los fosfolpidos estudiados
en este trabajo. Ambas muestras de liposomas se encuentran en disolucin
Figura 4.27 Crio-SEM para liposomas de 100 nm y de 1 m en disolucin tampn

HEPES regulando el pH a 7.4. Para proteger las muestras, durante el
proceso de preparacin se cubrieron con 5nm de platino en una cmara
en la que se controla que la temperatura se mantenga a la misma que
posteriormente se va a medir, que es -196C.
acuosa con una fuerza inica de 10 mM. Se aprecia la forma esfrica

caracterstica de estas estructuras y del tamao esperado. Para el caso de
liposomas de 100 nm, la muestra es ms monodispersa. Adems, pueden
observarse estructuras en forma de polgonos propias de la congelacin de
las sales. En la muestra de liposomas de 1 m se observa mayor
polidispersidad. Las estructuras son esfricas ya que corresponden a
liposomas pero de tamaos menores al que se desea por extrusin. Esto es
normal, ya que a travs de la membrana van a pasar liposomas peque os y
no mayores al lmite del tamao del poro, muchos de estos liposomas
pequeos se agregan alrededor de los liposomas grandes, pero a pesar de
estos agregados es posible observar con claridad los liposomas de mayor
tamao. Estos resultados son coherentes con los datos obtenidos por DLS en
los que se observa que el ndice de polidispersidad es mayor que para
liposomas menores.
FIB es una tcnica de microscopa acoplada en el microscopio de barrido
de SEM pero en este caso el haz que incide sobre la muestra es de iones. Las
muestras que se ha utilizado para crio-SEM se pueden utilizar para medir
posteriormente con esta tcnica por lo que es interesante a la hora de poder
comparar la informacin obtenida mediante esta tcnica.
En la Figura 4.28 se observa el corte transversal realizado a la muestra
observada por FIB. Una vez obtenidas las imgenes de liposomas de 100 nm
con el haz incidente de electrones, se procede al cambio del tipo de haz que
incide sobre la muestra. Con ayuda del software del equipo se establece la
potencia de este haz y la seleccin de la zona en la que se va a producir el
corte optimizando la profundidad a la que se desea llegar para observar estas
Figura 4.28 Focused Ion Beam (FIB) de liposomas de 100nm en disolucin tampn
HEPES a pH 7.4 y con una fuerza inica de 10mM.
estructuras. Ha sido imposible obtener un corte de un liposoma p ara poder

obtener la estructura interna y as confirmar lo observado por crio -TEM ya
que incluso trabajando con la menor potencia posible, el liposoma queda
destruido pues el haz lo calienta y no es capaz de resistir este calentamiento
fundindose y formndose bicapas lipdicas. En esta figura se observa el
corte desarrollado en una zona mayor, en la que se observan varios
liposomas; al realizar el corte con el haz de iones se observa la forma
esfrica de los liposomas recubiertos con la espesa capa de plat ino que
protege la muestra. Al realizar el clculo del tamao de estos liposomas se
ha obtenido un tamao inferior al obtenido por crio-SEM, que corresponde a
6015 nm, lo cual es debido a que no se est observando la mitad o el
liposoma completo sino parte de l.
Estabilidad
Finalmente, presentaremos algunos experimentos para discutir la estabilidad
de estos sistemas. Se ha realizado un estudio con respecto al tiempo para
liposomas pequeos de 100 nm, recubiertos con el par de polieletrolitos
PSS/PAH. Si el potencial zeta y el radio hidrodinmico permanecen
constantes, indica que la vescula sigue recubierta, y que el sustrato no se ha
desorbido, sin embargo una variacin del potencial zeta y del radio
hidrodinmico indica que el sustrato se est desprendiendo, y que las capas
de polielectrolito de la vescula no estn enlazadas fuertemente. Este punto
es uno de los ms importantes, porque para poder desarrollar todas las
aplicaciones posibles de las vesculas es necesario, no slo que se recubran
y se forme la multicapa, sino que sean estables durante largos periodos de
tiempo.
En este caso, la Figura 4.29 (a) representa la intensidad en liposomas
recubiertos con tan solo la primera capa. En este caso se observa un valor
del potencial zeta que se mantiene constante hasta siete semanas. Ya en la
sptima semana, el valor empieza a variar, debido a que comienza a
agregarse el polielectrolito. En la Figura 4.29 (b) se muestra, a partir de los
resultados obtenidos mediante DLS, la variacin del radio hidrodinmico en
los mismos periodos observando para el mismo sistema un tamao
invariable hasta la sptima semana. Despus de este tiempo se confirma la
formacin de estructuras de agregados.
Cuando las vesculas con cuatro capas fueron analizadas (Figura 4.30), el
potencial zeta presentaba un valor de 34.90 mV cuyo valor se mantuvo
Figura 4.29 (a) Variacin de la intensidad normalizada en funcin del potencial

zeta, , en diferentes tiempos y (b) Variacin de la intensidad
normalizada con el radio hidrodinmico, R H , en diferentes tiempos
despus de la sntesis. Las vesculas estaban formadas por 40% m
DODAB con una capa de PSS en disolucin salina 10 mM NaCl.
constante hasta que no vari en la segunda medida hasta la tercera semana

donde el valor descenda unas dcimas, 34.59 mV, y al final alcanz un
valor del potencial zeta de 20.32 mV. Estos valores son un indicacin de la
estabilidad de la muestra, de forma que la medida a partir de tres semanas
disminuye por la formacin de agregados en la mezcla. Al mismo tiempo el
tamao tambin vara, estos agregados son de mayor tamao aumentando la
polidispersidad y por tanto el tamao medio obtenido a partir de la tercera
semana..
Se observa que las vesculas recubiertas con polielectrolito aninico son
ms estables que las que quedan recubiertas con el catinico, posiblemente
debido a que el PAH es muy sensible a la temperatura y al pH. Esta
sensibilidad del PAH a parmetros externos se refleja en numerosos estudios
desarrollados para este par de polielectrolitos [362].
Figura 4.30 (a) Variacin de la intensidad normalizada con el potencial zeta, , en

diferentes tiempos y (b) Variacin de la intensidad normalizada con el
radio hidrodinmico, R H , en diferentes tiempos para vesculas
formadas por 40% m DODAB con cuatro capas del par de
polielectrolitos PSS/PAH en disolucin salina 10 mM NaCl.
4.1.3 Sistema tipo coloidosoma: Adsorcin de

partculas y PSS/PAH
Dispersin de luz y Potencial zeta

Adems de sistemas basados en liposomas sobre los que se adsorben
polielectrolitos, se han obtenido coloidosomas formados por partculas de
ltex de poliestireno, que recubren la superficie del liposoma. El objetivo de
este recubrimiento es un mayor control de la difusin a travs de la
membrana lipdica y la obtencin de sistemas complejos en busca de
potenciales aplicaciones en liberacin de frmacos. Durante toda esta
seccin se van a comparar los sistemas tipo coloidosoma con los sistemas ya
estudiados formados por liposomas recubiertos con el par de polielectrolitos
Figura 4.31 Variacin del coeficiente de difusin a medida que aumenta la

concentracin de partculas de ltex en la disolucin junto a los
liposomas sobre los que se adsorbe.
para conocer la existencia o no de un patrn de adsorcin y si en ambos

casos se sigue, es decir, en el recubrimiento con polielectrolitos y en el
recubrimiento con una capa inicial de partculas de ltex sobre los
liposomas.
En el caso de la adsorcin de la primera capa, la cual est formada por
partculas de ltex de 20 nm de dimetro, el mtodo seguido se basa en la
tcnica capa a capa. Este mtodo consiste en mezclar la disolucin de
liposomas y la disolucin de partculas de ltex y, despus de una continua
agitacin, la mezcla se centrifuga para eliminar el exceso aadi do. Como
inicicialmente se desconoce la cantidad necesaria para recubrir
completamente a los liposomas, se procede aadiendo diferentes
concentraciones de la disolucin de partculas de ltex sobre una
concentracin constante de liposomas. Despus de cada adiccin se
determina el coeficiente de difusin y con ello el tamao. La Figura 4.31
muestra la variacin del coeficiente de difusin durante el proceso de
adsorcin de las partculas sobre la superficie de los liposomas donde se
observa que a medida que aumenta la concentracin de partculas, el
coeficiente de difusin se hace menor y con ello el tamao mayor. Que el

tamao aumente es indicativo de la presencia de agregados, cada vez
mayores. Existe un lmite en la formacin de estos agregados de forma que a
pesar de seguir aadiendo ms partculas a la disolucin de liposomas, el
tamao de los agregados no aumenta. A partir de este valor, el coficiente de
difusin aumenta de nuevo hasta valores cercanos al obtenido inicialmente.
Cuando ocurre esto, los agregados disminuyen su tamao y es un indicativo
de la formacin de una capa estable alrededor del liposoma y que genera un
aumento del tamao correspondiente al tamao de las partculas de ltex
aadidas.
En la Figura 4.32 se muestra la variacin del radio hidrodinmico y del
Figura 4.32 (a) Radio hidrodinmico y (b) potencial zeta de una suspensin de
concentracin de partculas de ltex. Se observan claramente las zonas
de inversin de carga y de condensacin. La zona rayada indica la
zona de inestabilidad del sistema donde las medidas no son
reproducibles.
potencial zeta con el eje x comn, el cual corresponde a la concentracin de

partculas de ltex en la disolucin. En este caso, de nuevo se repite el
mismo comportamiento observado para la adsorcin de polielectrolitos:
cuando el potencial zeta alcanza valores cercanos a cero, el tamao de
agregados presentes en la disolucin es mximo y es en este punto inestable
del sistema donde las medidas no son reproducibles debido a que su es tado
de agregacin cambia con el tiempo y no deben ser tenidas en cuenta para
ningn clculo referido al tamao del sistema. Lo importante de esta figura
es el patrn de adsorcin que han seguido las partculas de ltex y que
coincide conel ya observado con los polielectrolitos.
As, en la Figura 4.33 se comparan los valores del potencial zeta, ,
obtenidos en dos tipos de recubrimientos: uno de ellos, las partculas de
poliestireno de 20 nm de dimetro y el otro con un polielectrolito, en este
caso PSS. Ambos se han realizado a la misma fuerza inica y a la misma
temperatura, 10 mM NaCl y 25C. Se observa que se necesita ms
concentracin de partculas que de polielectrolito y mayor tiempo de
Figura 4.33 Potencial zeta en funcin de la concentracin de PSS () y de ltex

() sobre liposomas catinicos formados por 30%m DODAB.
Dependencia del potencial zeta con la concentracin de partculas de
ltex.
adsorcin para legar a producirse un recubrimiento completo del liposoma.

En la Figura 4.34 se muestra la concentracin de partculas de ltex
necesaria para recubrir vesculas con diferente densidad de carga. Se obsera
que al aumentar la carga positiva del liposoma, se requiere mayor nmero de
partculas de carga contraria que recubran el liposoma. En todos los
sistemas se reproduce el valor final del potencial zeta, indicativo de que
todos los sistemas de liposomas, independientemente de su carga inicial
alcanzan un valor final afectado por el recubrimiento utilizado. El valor
final alcanzado es el que corresponde a la carga medida para las partculas
en disolucin. El proceso de recubrimiento debe realizarse en funcin de la
carga inicial que tenga el sistema, cuanto ms cargada est la vescula,
mayor concentracin de partculas ser necesaria para invertir este valor.
Los valores cercanos a cero no son reproducibles ya que el estado de
agregacin es mximo pero sirven de gua para observar la tendencia que
Figura 4.34 Variacin del potencial zeta con la concentracin de partculas de

ltex para sistemas formados por liposomas catinicos con distinta
carga inica. Medidas realizadas en disolucin de HEPES 10 mM
pH 7.4 a 25C. Los resultados corresponden a vesculas de
DOPC:DODAB (20:80) (), DOPC:DODAB (70:30)(),
DOPC:DODAB (90:10) (), DOPC:DODAB (95:5) ().
sigue la curva del potencial zeta al variar la concentracin de partculas de

ltex en este caso.
Finalmente, en la Figura 4.35 se muestra el potencial zeta, , obtenido
para sistemas formados por liposomas catinicos recubiertos inicialmente
con una primera capa de partculas de ltex, y las tres posteriores del par de
con capas intermedias de polielectrolitos, PSS y PAH hasta que finalmente
todos los sistemas son acabados con una capa de nuevo de partculas de
ltex. Como se puede observar se obtienen valores del potencial zeta, ,,
indicativo de la formacin de la capa, muy cercanos dentro del error
experimental, para todos los sistemas estudiados. Se puede decir que el
sistema se vuelve independiente del tipo de liposoma del que se parte una
vez que se produce el recubrimiento del mismo.
En la Figura 4.36 se observa cmo vara la concentracin de ltex
Figura 4.35 Variacin del potencial zeta en funcin del nmero de capas para
liposomas catinicos con distinta carga inica donde la primera capa
son partculas de ltex. La segunda, tercera y cuarta son capas
alternadas de PSS/PAH y finalmente de nuevo otra capa de ltex. Las
medidas son realizadas en tampn HEPES pH 7.4 a 25C y las grficas
representadas son para DOPC:DODAB 90:10 (), DOPC:DODAB
70:30 (), DOPC:DODAB 30:70 (), DOPC:DODAB 20:80 ().
Figura 4.36 Variacin de la concentracin de ltex necesaria para obtener el punto

de neutralizacin con el % de DODAB que forma el sistema de
liposomas DOPC:DODAB.
necesaria para neutralizar la carga de los liposomas. La tendencia de la

curva se aproxima a una relacin lineal con la densidad de carga propia de
los sistemas recubiertos. Con estos resultados se puede calcular la
concentracin de partculas de ltex necesaria para el recubrimiento de los
liposomas con mayor exactitud.
Dispersin de rayos X (SAXS) y de neutrones (SANS)

La confirmacin del tamao medido por dispersin de luz se ha llevado a
cabo mediante otras tcnicas de dispersin pero con medidas desarrolladas a
bajo ngulo. Una de ellas es dispersin de Rayos X (SAXS). SAXS permite
la medicin de soluciones que contengan partculas ms pequeas, incluidos
los recubiertos, pero sin exceder el mximo permitido por la tcnica
(dependiente del vector de onda) para que la tcnica pueda ser ms exacta.
Las medidas de SAXS permiten realizar un anlisis estructural incluida
forma y tamao de los materiales [235]. El desarrollo del anlisis de las
funciones obtenidas mediante esta tcnica permite obtener informacin muy
valiosa de los sistemas estudiados. En la Figura 4.37 se muestra la funcin
de correlacin de la intensidad dispersada obtenida por el equipo de SAXS y
considerando que los liposomas son esferas huecas. Ha habido varias
Figura 4.37 Variacin de la intensidad dispersada por liposomas de 100 nm de

dimetro con diferentes capas en disolucin acuosa con una fuerza
inica de 10 mM NaCl medidos a 25C. (a) Liposomas catinicos
formados por DOPC:DODAB (50:50) () y por (90:10) recubiertos
con una capa de partculas de ltex de 20 m de dimetro ( ); (b)
DOPC:DODAB (6:4) recubiertos con una capa de poli-estiren
sulfonato (PSS) () y DOPC:DODAB (50:50) ().
consideraciones que han sido fijadas antes del desarrollo del experimento
como son la densidad uniforme y la consideracin de muestras diluidas.
Se observa que la intensidad dispersada va disminuyendo a medida que
aumenta el vector de onda. Dado que en las funciones representadas no se
observan picos durante la cada se confirma el modelo elegido de esfera
hueca es el correcto, slo en el caso de liposomas recubiertos con partculas
de ltex de 20 nm de dimetro aparece una variacin de la funcin a valores
de q bajos. Con la funcin de distribucin espacial de la muestra dispersada
se determina el dimetro mximo posible, y al mismo tiempo esta
informacin puede cuantificarse para dar idea sobre la heterogeneidad del
sistema. Pero para conocer estos valores es necesario aplicar un modelo que
describa el sistema y cuya curva de dispersin coincida con la obtenida
experimentalmente. El mtodo de anlisis utilizado es el denominado
Figura 4.38 Funcin de distribucin de densidad electrnica en funcin de la

distancia mxima, d max , calculada a partir de los resultados SAXS para
las muestras de liposomas de DOPC con DODAB en disolucin acuosa
y 10 mM NaCl donde se muestran: (a) DOPC:DODAB (50:50) () y
por (90:10) recubiertos con una capa de partculas de ltex de 20 m
de dimetro (); (b) DOPC:DODAB (6:4) recubiertos con una capa de
poli-estiren sulfonato (PSS) () y DOPC:DODAB (50:50) ().
mtodo bayesiano IFT (inverso de la transformada de Fourier). Los

parmetros de anlisis son los siguientes: temperatura de la muestra a 20C
y el tiempo de medida de 810 4 ms y quedan fijados para el clculo
automtico que se realiza en el equipo. En la Figura 4.38 se representa la
funcin de distribucin de probabilidad del valor posible del tamao del
liposoma formado por extrusin y una vez aplicado este mtodo de anlisis.
La informacin obtenida de este estudio para las tres muestras analizadas
se muestra en la Tabla 4.3 y corresponden a los valores del radio de giro,
dimetro mximo e intensidad inicial.
Con estos resultados, el tamao del liposoma obtenido, dentro del e rror
experimental, se corresponde con los valores esperados, ya que la vescula
se ha extruido con membranas cuyo tamao de poro es 100 nm. Al aadir un
Tabla 4.3 Radio de giro, Dimetro mximo e Intensidad inicial para muestras de
liposomas en diolucin acuosa con fuerza inica de 10mM NaCl.
Nombre de muestra Rg/nm Dmax /nm Io
DODAB:DOPC1:1 23.830.5 84 5 0.617 0.007
DODAB:DOPC1:9-Ltex 42.990.2 119 9 0.452 0.002
DODAB:DOPC4:6-PSS 28.80.5 93 4 1.01 0.01
polielectrolito sobre la vescula aumenta el valor del dimetro en 10 nm y al

aadir partculas de ltex el aumento del dimetro es de 20 nm, que
corresponde exactamente con el dimetro de dichas partculas.
La forma de la curva de dispersin tiene dos zonas, aquella que se sita a
valores bajos de q donde se aplica la Ley de Guinier y a valores altos de q
en los que se aplica la Ley de Porod. Se van a obtener datos experimentales
a bajos ngulos y as poder comparar con los proporcionados por el equipo.
Figura 4.39 (a) Variacin experimental de la intensidad con respecto al vetor de

onda. (b) Representacin del cuadradado del vector de onda frente al
logaritmo de la intensidad por el vector de onda. Aplicacin de la ley
de Guinier para vesculas DOPC:DODAB (50:50).
En la Figura 4.39 se muestran los valores experimentales obtenidos a

20C para una disolucin de liposomas formados por DOPC:DODAB
(50:50) de 100 nm de dimetro. El intervalo de q seleccionado para aplicar
la Ley de Guinier corresponde a valores de hasta 0.015 -1 y se obtiene una
lnea recta con pendiente negativa. Esta linealidad indica que la
consideracin de muestras monodispersas de las disoluciones liposomares
ha sido correcta.
A partir de la ecuacin 2.30 se obtiene el valor del radio de giro que
puede ser comparado con el resto de los sistemas. Una vez obenido este
valor se aplica la ecuacin (4.2) vlida para esferas (ya mostrada en el
captulo de Tcnicas experimentales) y as poder conocer el espesor de la
bicapa lipdica de los liposomas:
R 3
1/ 2
2
R (4.3)
g
5
En la Figura 4.40 (a) se muestra el perfil de la densidad electrnica para

el mismo sistema, es decir DOPC:DODAB (50:50) en funcin de la
Figura 4.40 (a) Densidad electrnica en funcin de la distancia, r para vesculas

DOPC:DODAB (50:50). (b) Representacin de Iq 2 frente a q.
Tabla 4.4 Radios obtenidos experimentalmente mediante dispersin de rayos X para

liposomas con diferentes recubrimientos a 20C.
Nombre de muestra Rg/nm Espesor /nm R/nm
DODAB:DOPC1:1 28.30.5 3.2 0.5 36.5 0.5
DODAB:DOPC1:9-Ltex 42.990.2 23.9 0.2 55.5 0.2
DODAB:DOPC4:6-PSS 30.20.5 5.3 0.5 38.9 0.5
distancia r. Se observa una gaussiana que es caracterstica de formas

globulares como ya se explic en el captulo de Tcnicas experimentales
cuyo centro se corresponde con el valor de D max /2. El anlisis de la
conformacin de los liposomas viene dado en la Figura 4.40 (b) en la que se
muestra un anlisis de los datos experimentales para conocer el tipo de
plegamiento por la Ley de Kratky. Al representar Iq 2 frente a q se puede
observar un alto grado de organizacin del liposoma, las herogeneidades
presentes en la disolucin son esfricas que para este tipo de estructuras est
de acuerdo con la teora. Con este procedimiento se calcularon para el resto
de muestras y los valores obtenidos se presentan en la Tabla 4.4.
Otra tcnica de bajo ngulo utilizada es SANS que utiliza un haz de
neutrones para bombardear la muestra. El uso combinado de los rayos X y
los neutrones utilizando diferentes mecanismos de contraste muestra ms
informacin sobre la estructura interna de los liposomas, consiguiendo
descripcin exhaustiva sobre morfologa y forma que con tcnicas basadas
en dispersin de luz no se puede obtener.
Los experimentos con SANS fueron realizados con fuente de luz
sincrotn, de forma que as es posible obtener un haz monocromtico bien
colimado puntual e intenso, inmejorable para las medidas a bajos ngulos.
Los liposomas formados por fosfolpidos, los cuales a su vez poseen una
parte polar con alta densidad electrnica, nos permite investigar la regi n
hidroflica del liposoma mediante dispersin de rayos X [363] , mientras que
los neutrones son ms sensibles al interior hidrofbico. Para asegurarse unas
medidas que proporcionen valores reales, se suprime la consideracin de
densidad electrnica uniforme utilizada para SAXS ya que en este caso se
obtiene la curva de dispersin mediante la diferencia de densidades. Por
ello, a la hora de preparar muestras para SANS se hace uso del contraste de
los dispersantes utilizados que son agua deuterada y agua miliQ. Si no
Figura 4.41 Fotografa del patrn de difraccin de neutrones para vesculas

obtenido con cmara del equipo de SANS en el LLB. Vesculas
30%DODAB-70%DOPC en disolucin acuosa con una concentracin
de 10 mM NaCl.
existiera contraste no se produce dispersin alguna por la muestra o se

produce con una intensidad muy pequea imposible de analizar. Este
contraste se forma con agua deuterada para producir un cambio isotrpico
de composicin sustituyendo protones por deuterones. El contraste puede ser
maximizado en ciertas regiones que nos resulten de inters como puede ser
la bicapa o el interior de la vescula. Para las muestras de liposomas con
recubrimiento se utilizan polielectrolitos deuterados, como es el caso de
PSS deuterado para que la sustitucin de protones slo se produzca en la parte
exterior del liposoma y la estructura se puede modelizar como multi -core-
shell.
En la Figura 4.41 se muestra la fotografa de una muestra de liposomas
cuando el haz de neutrones incide sobre el liposoma. Los diferentes colores
muestran el diferente patrn de difraccin creado en funcin de la naturaleza
del liposoma.
En ambas experiencias, las muestras se midieron a una longitud de onda
que depende de la distancia a los detectores. La distancia a los detectores
fue de 4.5 m para una longitud de onda de 12 y de 1 m para una longitud
de onda de 6 .
La densidad de longitud de dispersin de neutrones (SLD) se define
como:
n
b c n
NA
SLD i 1
bi (4.4)
Vm i 1 Mw
donde b c es la longitud de dispersin coherente de n tomos que forman una

molcula en un volumen molecular dado (V m).
Para el caso de H 2 O
g NA
(2 (0.374) 1 (0.581)) 1012 1 0.561010 cm2
mol 18
Para el caso del agua deuterada:

(2 (0.6674) 1 (0.5805)) 1012 1.1 gmol 1N A201 6.341010 cm2
Para el fosfolpido se calcula de la misma forma. Los valores de las
longitudes de dispersin estn tabulados para los tomos por lo que no es
difcil el acceso a ellos (Tabla 4.5).
Para calcular el contraste obtenido cuando se realiza la disolucin de los
liposomas y se calcula por ello en funcin de la cantidad de la relacin en la
que se aadieron. En nuestro caso la relacin es 91:9 por lo que el SLD de la
mezcla
mezcla
liposoma D O
2
El contraste es simplemente la diferencia entre la parte de la mue stra de

inters, el liposoma, y los alrededores, el medio. Por ejemplo en el estudio
de capas adsorbidas es bastante comn un contraste del sustrato con el
medio, al mezclar formas hidrogenadas y deuteradas del medio en apropiada
proporcin para que se pueda observar tan solo la dispersin debida a las
capas adsorbidas. Las mezclas se calculan con la ecuacin que hace media
entre los valores de SLD de cada uno de los lpidos.
Tabla 4.5 Datos principales de los compuestos utilizados en SANS

3 3
Muestra Frmula molecular Mw (g/mol) bi (fm) V ( ) SLD (fm/ )
D2O D2O 20 19.15 29.29 0.64
H2O H2O 18 -1.68 30 -0.056
DOPC C44H84NO8P 786.13 39.22 1303 0.03
DODAB C38H80BrN 630.95 -30.49 1106 -0.34
PSS (C8H7NaO3S)n 70000 65.86 153.2 0.43
PAH (CH2CH(CH2NH2))n 17000 3.12 7 0.45
PSSd (C8D7NaO3S)n 55000 123.79 200 0.62
mezcla DOPC DOPC 1 DOPC DODAB
Se realiza el mismo clculo para el par de polielectrolitos y la mezcla de

agua, de tal forma que se obtiene PSS / PAH 2.90 0.15106 -2 ; para la
mezcla de agua miliQ y aga deuterada 91:9, H2O / D2O 1.13 0.210 -2 .
6
Finalmente para los liposomas formados por DOPC y DODAB en una

relacin 50:50 DOPC / DODAB 11.3 0.02106 -2 . Para las medidas
realizadas se obtiene el contraste igual a
liposoma disolvente PSS / PAH 7.27106 -2.
El modelo utilizado para el ajuste de los datos obtenidos directamente del

equipo es el modelo de esfera hueca y de esta forma se obtuvieron los
parmetros propios proporcionados por el mismo. En la Figura 4.42 se
representa los valores obtenidos para algunas muestras formadas por
fosfolpidos. En este caso se compara el liposoma sin recubrimiento y con
dos bicapas para que con el mismo contraste se determinen las diferencias
debido a la adsorcin de polielectrolitos en la superficie del liposoma.
Figura 4.42 Variacin de la intensidad dispersada con el vector de onda en escala

logartmica. Resultados de neutrones para vesculas sin recubrimiento
() y vesculas con dos bicapas ().
Tabla 4.6 Radios obtenidos para liposomas con diferentes recubrimientos

Muestra RSANS / nm Condiciones de contraste H2O/
D2O
DOPC:DODAB (liposoma,L) 47.86 91:9
L-(PSS/PAH) 49.56 91:9
L-(PSS/PAH)-PSSdeuterado- 61.4 91:9
(PSS/PAH)
L-(PSS/PAH)2-PSSdeuterado- 78.56 91:9
(PSS/PAH)
L-(part. Poliestireno)-PAH 77.85 91:9
En la Tabla 4.6 se muestran los radios calculados para algunas muestras

analizadas. Se observa un aumento en el radio exterior, proporcional al
nmero de capas y ha sido posible gracias a los contrastes realizados con
Figura 4.43 (a) Variacin de la Intensidad dispersada por neutrones por el vector
de onda en funcin del cuadrado del vector de onda, frente
a (b) Misma representacin pero en el intervalo seleccionado, en
el que se aplica la Ley de Guinier y obtener el radio de giro en
vesculas recubiertas con (Ltex/PAH).
Tabla 4.7 Radios obtenidos experimentalmente para liposomas con diferentes

recubrimientos aplicando la Ley de Guinier
Muestra RSANS / nm EspesorSANS / nm
DOPC:DODAB (liposoma,L) 56.6 4.4
L-(PSS/PAH) 71.80 14.7
L-(PSS/PAH)-PSSdeuterado-(PSS/PAH) 84.70 28.3
L-(PSS/PAH)2-PSSdeuterado-(PSS/PAH) 88.28 31.6
L-(part. Poliestireno)-PAH 79.13 22.5
agua deuterada y PSS deuterado.

Los datos experimentales pueden ser evaluados usando la aproximacin
de Kratky-Porod. Se representa ln I q frente a q 2 donde I(q) es la
intensidad SANS y as obtener el radio de giro de la bicapa [364]. El espesor
fue calculado a partir de R g extrapolado en la Figura 4.43 (a), para dilucin
infinita con la aplicacin de la ley de Guinier a bajo ngulo y que a modo de
ejemplo se muestra en la Figura 4.43. De la Figura 4.43 (a) se selecciona la
parte de la curva a q ~0.015 nm, donde se obtiene una recta y es de ah de
donde se extrae el valor del radio de giro para todas las muestras . Con este
valor se calcula, por tanto, el radio de los liposomas con y sin
recubrimiento. En la Tabla 4.7 se presentan los radios obtenidos
experimentalmente.
Finalmente la Tabla 4.8 muestra una comparacin de los valores de
radios obtenidos hasta ahora para este tipo de liposoma catinico con las
diferentes tcnicas utilizadas de dispersin y de microscopa. Los resultados
indican que las tcnicas de dispersin son el mtodo conveniente para
determinar el tamao para el caso de disoluciones de liposomas
monodispersos. La combinacin de dispersin de luz, dispersin de rayos X
y dispersin de neutrones cubren as un amplio rango de longitudes de onda

recubrimientos utilizando distintas tcnicas
Muestra RDLS (nm) RSANS (nm) RSAXS (nm) Rcrio-TEM (nm) Rcrio-SEM (nm)
DOPC:DODAB 48.5 47.86 42.0 38.0 60.0
(liposoma,L)
Figura 4.44 (a) Imagen de FIB de partculas de poliestireno de 3m recubiertas

con liposomas de 100 nm. La adsorcin de los liposomas sobre estas
partculas se ha realizado mediante la tcnica capa a capa por
interacciones electrostticas. (b) Corte del sistema obtenido con FIB.
que permite caracterizar propiamente estos sistemas de tamao nanoscpico.

Por su parte, la microscopa aporta otro tipo de detalles como son la
morfologa y estructura interna del liposoma, adems del radio
convirtindose en tcnicas complementarias a la hora de describir un
sistema.
Con esta tcnica queda mucho trabajo, siendo esto el principio para
seguir optimizando en las medidas de liposomas que se han de realizar y as
permitir que sea una tcnica ms en la caracterizacin de los liposomas. Un
experimento que se llev a cabo con xito es el que se muestra a
continuacin. En la Figura 4.44 se observa el sistema formado por partculas
de ltex cuya superficie se encuentra recubierta por liposomas de 100 nm.
En la Figura 4.44 (a) se observan los liposomas alrededor de la partcula
obtenido con FIB y esta misma muestra en la que se aplica un corte
aproximadamente de la mitad de la partcula para observar cmo se
estructuran los liposomas sobre la partcula (Figura 4.44 (b)). A pesar de
haberse producido fusin de la partcula, es posible observar que parte de
los liposomas adsorbidos permanecen intactos sobre la partcula, algunos de
ellos deformados, lo cual es debido al proceso de optimizacin de espacio
que tiene lugar cuando los liposomas entran en contacto con una superficie.
Con la informacin proporcionada con esta tcnica y combinado con
SEM podemos confirmar con mayor exactitud el tamao y la polidispersidad
de los liposomas obtenidos por extrusin adems de conocer la forma que
algunos liposomas adoptan cuando entran en contacto con otras superficies.
Figura 4.45 CLSM: Partculas de ltex recubiertas de liposomas de 1 m con

Quantum Dots en la bicapa lipdica.
Estos sistemas se han caracterizado con microscopa de confocal, de tal

forma que los liposomas son observados cuando quedan adsorbidos sobre las
partculas de poliestireno. Se fabricaron liposomas con Quantum Dots
depositados en la bicapa lipdica durante la etapa de la formacin de la
misma. Despus de la etapa de extrusin, la dispersin se centrifuga para
eliminar el exceso que no forma parte de los liposomas y que est libre en la
disolucin. El objeto de aadir Quantum Dots como marcador fluorescente
en las vesculas fue la observacin de liposomas con un tamao tan pequeo
que no es posible observarlo con una microscopa convencional y tan solo es
posible con CLSM. Es por ello, por lo que una vez fabricados se adsorben
sobre la superficie de partculas de ltex por interacciones electrostticas.
En la Figura 4.45 se muestran las imgenes de partculas de ltex de 3m
con una capa de liposomas de 100 nm de dimetro adsorbida por
interacciones electrostticas a pH 7.4 en disolucin tampn y con una fuerza
inica de 10 mM. Se observ que los liposomas quedan intactos,
deformndose un poco para poder conseguir una capa homognea alrededor
de la partcula.
4.1.4 Adsorcin alternada capa a capa de sistema

PGA/PLL
Liposomas formados por DOPC y DODAB

Siguiendo con el estudio detallado de la adsorcin capa a capa de
polielectrolitos sobre liposomas como plantilla, se va a describir en detalle
el sistema formado por liposomas formados por la mezcla DOPC:DODAB
(30:70), elegido tras los previos resultados de estabilidad obtenidos
anteriormente y el par de polielectrolitos biocompatibles PGA/PLL. La
eleccin de este nuevo sistema busca que este estudio se acerque ms al
campo de los bio-materiales. Las tcnicas que se utilizan son dispersin de
luz y potencial zeta.
En la Figura 4.46 se muestra la variacin del radio hidrodinmico cuando
se adsorbe un polielectrolito. Se comienza con PGA y se contina con PLL,
son polielectrolitos dependientes del pH, por lo que para mantener el pH
siempre constante se trabajar en disoluciones tamponadas . El espesor en
para vesculas catinicas DOPC:DODAB (70:30) en tampn HEPES
pH 7.4 medidas a 25C.
este caso para PGA es de 10-12 nm y para PLL de 4 nm dentro de los

errores experimentales, la tendencia de crecimiento se reproduce para todos
los pares de polielectrolitos estudiados para este tipo de liposomas.
En la Figura 4.47 se observa la inversin de carga en cada capa para
vesculas formadas por la mezcla de DOPC:DODAB (30:70). En este caso
tambin, como cabe esperar, se produce el efecto par-impar de las capas.
Aunque en la primera capa la carga negativa obtenida sea mayor, en el resto
de las capas los valores positivos y negativos de la densidad de carga en
funcin del polielectrolito adsorbido son los mismos, e independiente del
sustrato.
Liposomas de carcter zwiterinico formados por DOPC

En este punto se contina con el par de polielectrolitos PGA/PLL y la
diferencia es el tipo de liposoma utilizado, que est formado por DOPC puro
confiriendo al liposoma carga dependiente del pH. Con este tipo de
liposomas se quiere estudiar si la flexibilidad del mismo afecta al patrn de
Figura 4.47 Variacin del potencial zeta para vesculas formadas por DODAB en
relacin a DOPC (3:1) recubiertas con el par de polielctrolitos
PGA/PLL en disolucin tampn a pH 7.4.
adsorcin de los polielectrolitos sobre la vescula.

La Figura 4.48 muestra la variacin del radio hidrodinmico con el
nmero de capas. Los dos sistemas representados difieren en la primera capa
adsorbida sobre los liposomas con el objetivo de optimizar uno de ellos. El
PEI acta como un pegamento que produce ms compactacin de las
cadenas polimricas que se adsorben posteriormente, y la adsorcin de agua
entre dichas capas ser menor en los sistemas que no estn formados por
PEI. En ambos casos se produce un aumento en el espesor debido al
recubrimiento pero para el sistema de PLL/PGA, el aumento del espesor es
mayor. Si se compara el tamao de los liposomas recubiertos con cuatro
capas, el sistema con PLL/PGA llega a tener 30 nm ms de tamao que el
sistema con PEI/PGA/PLL.
El clculo del punto de neutralizacin para el recubrimiento con PLL y
con PGA como segunda capa se muestra en la Figura 4.49.
para vesculas zwiterinicas formadas por DOPC en tampn HEPES
pH 7.4 medidas a 25C.
Figura 4.49 (a) Variacin del potencial con la concentracin de PLL aadido a la
disolucin tamponada a pH 7.4 de liposomas formados por DOPC y
(b) Variacin del potencial con la concentracin de PGA aadido a la
disolucin tamponada a pH 7.4 de liposomas formados por DOPC
El primer recubrimiento de la vescula es el que mayor influencia tiene

de la misma. Se comienza con una carga negativa muy dbil debida al
liposoma zwiterinico y al final del recubrimiento se obtiene una carga
positiva bastante ms alta correspondiente a casi 30 mV, debido al PLL
mostrando as una mejora de la estabilidad del sistema. En la Figura 4.49 (b)
se muestra el recubrimiento con una segunda capa de polielectrolito del
liposoma zwiterinico formado por DOPC. El polielectrolito adsorbido
mediante interacciones electrostticas es PGA y los resultados de inversin
de carga tras una primera capa de polielectrolito de carga contraria sern
independientes de la plantilla y los resultados mostrarn un sistema con
mayor estabilidad debido a que la carga obtenida es bastante alta, si se
compara con la carga inicial del liposoma.
Se muestra a continuacin el sistema estudiado con el mismo tipo de

liposomas, formados por DOPC, pero en este caso la primera capa adsorbida
es de PEI. En la Figura 4.50 (a) se observa la inversin de carga una vez
recubierto el liposoma con PEI, incrementando su estabilidad al alcanzar
valores de carga altos. Tras la adsorcin del PEI, el polielectrolito adsorbido
es PGA con el objeto de poder comparar con el anterior sistema en el que se
estudiaron el par de polielectrolitos PGA/PLL. En la Figura 4.50 (b) se
muestra la inversin de carga a medida que se aade ms cantid ad de PGA
hasta que finalmente se obtiene la inversin de carga. De nuevo, los valores
alcanzados son mucho ms altos que antes de la adsorcin de los
polielectrolitos y por tanto mayor estabilidad.
En la Figura 4.51 se muestra la variacin del potencial zeta con el
nmero de capas. El liposoma estudiado est formado por DOPC puro que a
pH 7.4 adquiere carga negativa y sobre el que se han depositado
inicialmente PLL en un caso y PEI en el otro como primera capa, pero el
estudio en ambos sistemas contina con el par de polielectrolitos PGA/PLL.
Figura 4.51
4.50 Evolucin del potencial
(a) Recubrimiento zeta en
de DOPC confuncin
PEI endeldisolucin
nmero detamponada
capas paraa
liposomas
pH 7.4. (b) zwiterinicos
Recubrimientocomo el formado
con PGA tras PEI por
paraDOPC
DOPC para sistemas
en disolucin
con los pares
tamponada polielectrolitos
a pH 7.4. PLL/PGA () y PEI/PGA/PLL ()
Para ambos casos, el potencial zeta sigue la misma tendencia en los

valores, positivo cuando el polielectrolito es positivo y negativo cuando el
polielectrolito es aninico. Al adsorber PEI inicialmente sobre el liposoma,
la carga adquirida es menor que si se adsorbe PLL y a medida que se
adsorben la secuencia de polielectrolitos, la carga que adquiere el sistema de
PEI-(PGA-PLL) n va a tener un valor de carga menor.
4.1.5 Liposomas recubiertos con cadenas de poli-

etilenglicol (PEG)
Una alternativa elegida ha sido el recubrimiento de liposomas a partir de
fosfolpidos modificados con cadenas polimricas de PEG y que al formar el
liposomas por extrusin, las cadenas recubren a los liposomas y se sitan
tanto dentro del mismo como fuera. Se va a estudiar cmo afectan estas
cadenas a la estabilidad y a la polidispersidad del sistema y para ello el
liposoma se va a modificar con varias proporciones de este lpido. A su vez
se va a estudiar con lpidos modificados con PEG de diferente peso
Figura 4.52 Variacin del radio hidrodinmico en funcin de la temperatura para

liposomas formados por DMPC y de tamao 100 nm.
molecular porque el tamao de estas cadenas tambin influye en el

comportamiento del liposoma. Se ha estudiado la evolucin del radio
hidrodinmico cuando la temperatura vara. El intervalo elegido ha sido una
temperatura menor a la temperatura de transicin, asegurando el estado
slido del lpido hasta una temperatura muy superior a la temperatura de
transicin para que el estado sea de gel, como se muestra en la Figura 4.52.
En la Figura 4.53 se muestra la variacin del radio hidrodinmico con la
temperatura para todos los sistemas estudiados con este tipo de lpidos. Es el
sistema formado por DMPC el que muestra mayor variacin del tamao con
la temperatura.
Cuando el liposoma queda recubierto por cadenas de PEG, la densidad de
carga aparente disminuye debido a la estabilidad estrica a la que da lugar.
Figura 4.53 Variacin del radio hidrodinmico con la temperatura para todos los
sistemas liposomares formados por DMPC y DMPE-PEG medidos en
disolucin tamponada con una fuerza inica igual a 10mM y pH7.4
donde () son liposomas formados por DMPC puro, () son los
formados por DMPC:DMPE_PEG 1000 (96:4), () son los formados por
DMPC:DMPE_PEG 1000 (92:8), () son los formados por
DMPC:DMPE_PEG 5000 (96:4), y finalmente () que son los formados
por DMPC:DMPE_PEG 5000 (92:8).
De esta forma aunque se varen parmetros como pH, la densidad de carga

prcticamente es constante, observando una variacin de carga menor
(prcticamente cero en todos los intervalos de pH) de la observada para
liposomas sin recubrir.
El parmetro utilizado para medir la densidad de la carga es el potencial
zeta . El potencial zeta es sensible a las transiciones de fase de los
lpidos, a la adsorcin de polmeros, protenas, a la estabilizacin estrica
con PEG y a las modificaciones superficiales en general. La concentracin
de cadenas de PEG en los liposomas debe ser optimizada, lo sufic iente para
recubrir al liposoma.
En la Figura 4.54 se observa la variacin del punto isoelctrico al
mezclar un fosfolpido zwiterinico, DMPC, y un fosfolpido con cadenas
de PEG de diferente peso molecular, 5000 y 1000 Da. La mayor variacin
observada es cuando se combina con PEG de mayor peso molecular, 5000,
en los que el punto isoelctrico se reduce drsticamente hasta pH bajo y con
Figura 4.54 Variacin del potencial zeta con el pH para liposomas zwiterinicos
formados por DMPC, y DMPC:DMPE_PEG. Las cadenas de PEG
estudiadas son dos, con distinto peso molecular, por lo que sen
estudiado dos ratios para cada uno de los PEG utilizados que permitan
ser separados.
Tabla 4.9 Valores del punto isoelctrico para liposomas de 100 nm en disolucin salina
de 10 mM formado por DMPC y DMPE modificado con cadenas de PEG de distinto peso
molecular
Muestra Relacin molar IEP0.2
DMPC 1 7.2
DMPC:DMPE-PEG1000 96:4 6.6
una densidad de carga prcticamente nula. Esto implica que a pesar de

disminuir el punto isoelctrico para observar mayor estabilidad a pH
fisiolgico, los sistemas no son estables en todo el intervalo de pH. De
forma general, la preparacin de liposomas sin carga y recubiertos con
polmeros hidroflicos no inicos como el polieltilenglicol (PEG) produce
sistemas ms estables que muestran menor nmero de interacciones no
especficas y de agregacin, debido a que las barreras estricas previene n la
proximidad y el contacto [66]. Liposomas recubiertos con cadenas de PEG de
bajo peso molecular dan lugar a sistemas ms estables, con suficiente
densidad de carga y con la regin inestable alejada de la regin de trabajo.
Con la Tabla 4.9 se confirma la teora expuesta en el prrafo anterior. De
forma general, para estas relaciones, el sistema ms interesante para
desarrollar aplicaciones es el formado por PEG 1000 , cuyo punto isoelctrico
se sita justo por debajo del pH fisiolgico que adems ha demostrado
mayor estabilidad con el tiempo, tal y como se muestra ms adelante.
Ensayo enzimtico
Se ha realizado la encapsulacin de una enzima en el interior del
liposoma, -lactamasa que dado su pequeo peso molecular se esperaba que
no afectara al punto isoelctrico del sistema y es lo que se ha demostrado
tras variar el pH de la disolucin. El punto isoelctrico se sita en 3.9 0.2 y
se observa en la Figura 4.55 (a). Por ello, la estabilidad del sistema est
asegurada ya que se trabaja a un pH muy por encima del punto isoelctrico.
El estudio de la variacin del tamao y del potencial zeta con la
temperatura se muestra en la Figura 4.55 (b). Se observa que a temperatura
por debajo de la temperatura de transicin ambos parmetros aumentan
Figura 4.55 (a) Variacin del potencial zeta con el pH para liposomas formados
por DMPC:DMPE_PEG 1000 (98:2) en disolucin tamponada a pH 7.4 y
medido a temperatura ambiente, 25C. (b) Variacin del potencial zeta
() y del radio hidrodinmico () con la temperatura cuando el
Figura 4.56 (a) Absorbancia frente a longitud de onda para la nitrocefina. (b)
liposoma formado por DMPC:DMPE-PEG 1000 (98:2) encapsula la
Absorbancia frente a longitud de onda para los liposomas obtenidos de
enzima en su interior.
DMPC y un 1.7% de PEG 1000 con -lactamasa en su interior.
aunque no de forma significativa. Una vez alcanzada aproximadamente la

temperatura de transicin (aproximadamente 20-22C) los valores del
tamao y potencial zeta permanecen constantes, independientes de la
temperatura hasta que se alcanza la temepratura de 40C, y a partir de aqu
se obtienen de nuevo los valores inciales de estos dos parmetros.
Para hacer un seguimiento de la reaccin que tiene lugar entre la -
lactamasa y la nitrocefina, se han hecho medidas con un espectrofotmetro
de manera que los espectros obtenidos en el tiempo, a medida que
transcurra la reaccin. Como se ve en la Figura 4.56 (a) a medida que
aumenta el tiempo, la banda caracterstica de la nitrocefina que aparece a
392 nm, disminuye y va aumentando una banda a 492 nm correspondiente al
producto hidrolizado de la reaccin. Esto nos conduce a pensar que se est
produciendo la liberacin del frmaco encapsulado. Cuando la liberacin del
frmaco encapsulado se provoca con la adicin de TRITN-X a la muestra,
el espectro que se obtiene es el que se muestra en la Figura 4.56 (b), donde
se comprueba que la banda a 392 nm ha desaparecido y aparece una banda
correspondiente a la absorcin del surfactante a 275 nm.
Figura 4.57 (a) Variacin del espectro de absorcin a medida que transcurre la
reaccin. El subndice 0 indica el tiempo antes de aadir el sustrato y
cada una de las medidas posteriores se realizaron cada cinco minutos
una vez aadido el sustrato y agitado la mezcla.. (b) Espectro obtenido
despus de aadir TRITON-X100 medido a temperatura ambiente,
25C. En la disolucin est la enzima, el sustrato, el surfactante y la
disolucin de liposomas DMPC:DMPR_PEG.
La Figura 4.57 muestra cmo vara el espectro de absorcin de la uestra a

medida que se aade la nitrocefina y la muestra es calentada por enc ima de
la temperatura de transicin del lpido. La disolucin de liposomas se ve
afectado por la temperatura provoando que la carga encapsulada por los
liposomas, en este caso la enzima, se libere.
En la Figura 4.58 se ha representado la absorbancia frente al tiempo a
una longitud de onda de 492 nm para el caso de la muestra dializada a la que
se le aadi nitrocefina, la muestra dializada aadindole nitrocefina y
TRITN-X y para la muestra sin dializar a la que tambin se le aadi
nitrocefina.
Haciendo un anlisis cualitativo de los resultados obtenidos, se puede
concluir que cuando la muestra no se somete al proceso de dilisis, la
Figura 4.58 Representacin de la variacin de la absorbancia frente al tiempo.
cantidad de enzima que presenta es mucho mayor que cuando se dializa. Por
eso mismo la velocidad de la reaccin es mucho mayor en el caso de la
muestra que no se ha dializado con respecto a las que si se dializaron, por lo
que el cambio de color de la muestra se produce prcticamente nada ms
aadir nitrocefina. El estudio realizado para la muestra di alizada, se ha
realizado a una temperatura superior a la temperatura de transicin del
lpido (T=25.0C). Esto hace que la enzima encapsulada se libere y
reaccione con la nitrocefina. Para comprobar que efectivamente se ha
liberado el frmaco, se ha repetido el estudio aadiendo TRITN-X. Las
velocidades obtenidas son prcticamente las mismas que antes de esta
adiccin, hecho que nos confirma que por encima de la temperatura de
transicin de fase se produce la liberacin de la totalidad de la enzima
encapsulada.
El estudio con el tiempo para confirmar algn dato sobre su estabilidad
ha sido desarrollado midiendo el tamao de los sistemas, de forma que los
resultados se muestran en la Tabla 4.10 donde se observa el ndice de
polidispersidad (PDI) para cada una de las muestras:
Tabla 4.10 Valores del PDI para liposomas de 100 nm en disolucin salina de 10 mM
formado por DMPC y DMPE modificado con cadenas de PEG de distinto peso molecular
Muestra Relacin PDIinici PDI1da PDI7da PDI14das PDI30das PDI60das
molar al s
DMPC 1 0.071 0.079 0.093 0.095
DMPC:DMPE- 96:4 0.113 0.123 0.132 0.175
PEG1000
DMPC:DMPE- 92:8 0.104 0.110 0.117 0.171
PEG1000
DMPC:DMPE- 96:4 0.089 0.094 0.120 0.121
PEG5000
DMPC:DMPE- 92:8 0.103 0.116 0.137 0.175
PEG5000
Se observa la mayor estabilidad para liposomas formados por cadenas de

PEG del menor peso molecular y con el mayor porcentaje de las mismas, ya
que tras dos meses, el ndice de polidispersidad apenas vara.
4.1.6 Adsorcin de un homopolmero, p-(NIPAM)-

COOH, y cadenas de PEG
Existen muchas ms modificaciones utilizando de base los liposomas, en
este caso se ha estudiado la adiccin de un homopolmero, tanto dentro de la
bicapa como adsorbido en la superficie, y con la adiccin de frmacos,
hidroflico como es dextrano y que queda depositado en el interior del
liposoma por su afinidad con el agua. La modificacin de la bicapa lipdica
produce cambios estructurales y por tanto la respuesta a parmetros como la
temperatura o el pH van a ser diferentes.
Para comenzar con el estudio de estos nuevos sistemas se obtuvo el punto

isoelctrico de estos sistemas. En estos tres casos se ha observado que
apenas existe una variacin del punto isoelctrico si se comparan entre ello s
aunque al compararlo con el liposoma sin ningn aditivo, el punto
isoelctrico se desplaza hacia valores ms pequeos. Estos resultados son
mostrados en laFigura 4.59. Se observa cmo vara el punto isoelctrico con
respecto al liposoma sin ningn aditivo. Al aadir el polmero a la bicapa, el
punto isoelctrico se sita a pH 5, con casi dos unidades menor comparado
con el liposoma solo. Al cargar los liposomas con un frmaco de carcter
hidroflico, las variaciones no son grandes, del mismo modo ocurre al aadir
tanto a la bicapa el polmero como el frmaco en el interior del liposoma. Se
observa que las cargas son menores, aunque no demasiado, con cualquier
aditivo, disminuyendo las interacciones electrostticas con el agua ya q ue
estas interacciones se comparten con las que se han formado con los nuevos
sistemas. De esta forma se puede decir que la adicin del homopolmero
Figura 4.59 Variacin del punto isoelctrico para liposomas formados por DPPC
en funcin del tipo de compuesto aadido en la bicapa o en el interior
de los liposomas. Las medias han sido realizadas a temperatura
ambiente y en disolucin acuosa con una fuerza inica igual a 10mM
para todas las muestras.
Figura 4.60 Imagen de Crio-SEM para liposomas de 1 m a pH 7.4 en disolucin

tampn HEPES. La medida de los hueco que dejan las vesculas y
cambiar su posicin. El tamao estimado es de 917.592.5 nm.
estabiliza el liposoma y como a pH fisiolgico la carga que adquieren es

ms negativa, se convierten en sistemas de mayor inters para aplicaciones
de liberacin.
Los estudios en estos sistemas han sido anlogos a los realizados para
todos los sistemas, desde la determinacin del radio hidrodinmico, valor
del potencial zeta y medidas con microscopa electrnica con el objeto de
poder conocer los mismos parmetros. Al ser un liposoma con una
temperatura de transicin caracterstica se ha realizado un anlisis con
calorimetra, resultados mostrados en la secin 4.1.1 Liposomas.
En este apartado se muestra la principal tcnica de caracterizacin que se
utiliz para estos sistemas. Crio-SEM es la tcnica que ha ayudado a dirigir
las investigaciones a la hora de decidir el mejor camino para obtener
sistemas basados en liposomas cuya respuesta a la temperatura fuera
controlada mediante una capa de polielectrolito que modificaba
principalmente su temperatura de respuesta.
Y ya finalmente en este trabajo se han estudiado adems liposomas
recubiertos, por ello se desarrollaron varios experimentos para observar
mediante esta tcnica los liposomas con la variedad de modificaciones a las
que se les someti. Inicialmente se muestra la Figura 4.60 con una vista
general de liposomas fabricados de 1m. Se observan zonas en las que no
aparece el liposomas pero s la huella de que en su momento estuvo. El
valor del dimetro medido (en el hueco dejado por los liposomas tras el
proceso de congelado) se corresponde con el tamao de poro utilizado en la
extrusin.
Figura 4.61 Crio-SEM con liposomas de 1 m como control y liposomas

recubiertos con polmero mediante la tcnica capa a capa a pH 7.4 en
disolucin tampn HEPES. La medida de las vesculas es
917.592.5 nm.
En la Figura 4.61 se observan las modificaciones realizadas con estos

sistemas. Este caso muestra la aplicacin de la tcnica capa a capa sobre los
liposomas por interacciones electrostticas. Una vez adsorbido el polmer o
se centrifuga tres veces para eliminar el complejo inter -polielectrolito
formado pero en este caso observado se distinguen los liposomas recubiertos
pero se observa que todava en la disolucin queda elevada cantidad de
polielectrolito no adsorbido debido a que en esta muestra no han tenido
lugar ms adsorciones y por ello no se forman todos los complejos que se
pretenden eliminar. Este experimento se ha desarrollado con una muestra
control de forma que la misma muestra ha sido fotografiada sin estar en
contacto con el polielectrolito y posteriormente tras la adsorcin y el
proceso de centrifugacin. Realizando las pertinentes medidas de tamao de
los liposomas se ha observado un aumento en el tamao del liposoma de
unos pocos nanmetros.
Otro de las modificaciones realizadas en los liposomas ha sido la que se
observa en la Figura 4.62. Aqu se observan liposomas sin ningn polmero
aadido, como control, y liposomas con parte del polmero formando parte
de la bicapa lipdica.
Al comparar las muestras de la Figura 4.62 se observa que la superficie
es ms heterognea para liposomas con polmero pero sigue manteniendo
tanto la forma esfrica como el ndice de polidispersidad caracterstico para
liposomas de este tamao. Esto nos indica que esta forma de obtener

recubiertos con polmero en la bicapa lipdica extruidos con membrana
de tamao de poro idntico a pH 7.4 en tampn HEPES.
liposomas ha sido un xito y con ayuda de otras tcnicas se puede esclarecer

si adems son interesantes en aplicaciones biomdicas.
4.1.7 Estudios en sustratos planos

La microbalanza de cuarzo (QCM) se ha utilizado frecuentemente para el
estudio del crecimiento de multicapas por el mtodo capa a capa sobre
sustratos planos [365]. En esta seccin se va a utilizar para seguir la adsorcin
de liposomas sobre dos electrodos de cuarzo de diferente naturaleza y que
fueron tratados segn se describe en la seccin de Tcnicas de superficie.
Los objetivos perseguidos en esta secin sern la observacin del patrn de
adsorcin seguido por los liposomas sobre sustratos planos de diferente
naturaleza y obtener ms informacin sobre la formacin de multicapas de
polielectrolitos una vez depositada la vescula. Por estas razones se
muestran dos de los sistemas ms estudiados en esta tesis que son
dispersiones de liposomas unilamelares pequeos, con un dimetro de
100 nm con carcter catinico, como es el caso de DOPC:DODAB y con
carcter zwiterinico como es DOPC, ambos con una concentracin de
1 mgmL -1 . Tras estudiar con detenimiento el proceso para los liposomas
depositados sobre el sustrato plano se adsorbieron los polielectrolitos y los
pares elegidos han sido PSS/PAH en disolucin acuosa con la misma fuerza
inica y concentracin; PGA/PLL estudiados en disolucin tamponada y
misma fuerza inica.
Figura 4.63 Adsorcin de liposoma unilamelar sobre una superficie hidroflica [22] .
Se han observado tres pasos desde que se pone en contacto la
disolucin de liposomas con el sustrato hasta que se forma la bicapa
de lpidos y se comentan en el texto.
Inicialmente, tras estabilizar la medida, se ha estudiado la cintica de

adsorcin de liposomas y polielectrolitos con el objeto de poder conocer
ms en profundidad si la adsorcin de los liposomas sigue algn proces o que
pueda afectar al tiempo en que quedan depositados sobre el substrato plano.
Una vez determinada la cintica de cada proceso, se estudiar el espesor de
las capas depositadas que, en el caso de los polielectrolitos debiera
corresponder con los datos obtenidos por tcnicas como DLS.
La primera capa depositada es de liposomas en disolucin acuosa, que en
contacto con una superficie dan lugar a una bicapa de lpidos que ha de ser
estudiada con detenimiento en los dos tipos de sustratos. La forma de
obtener esta bicapa sigue los principios desarrollados por McConnell [365] y
consiste en el contacto directo de la superficie plana con los liposomas
unilamelares induciendo a la ruptura y fusin de los liposomas adsorbidos
para formar una continua bicapa de lpidos. Entre estudios tericos
desarrollados hace dcadas y varios desarrollos experimentales [366-370] se ha
podido concluir que la formacin de la bicapa ocurre en tres fases
principalmente que pueden mostrarse de una forma ms o menos
pronunciada [371, 372] y son: Adsorcin inicial de los liposomas intactos a la

superficie, recubrimiento crtico de liposomas que da lugar al inicio de la
ruptura de los liposomas para dar lugar a una bicapa, si bien el sustrato no
queda totalmente recubierto, y ruptura completa de los liposomas formando
la bicapa que recubre la superficie del sustrato (Figura 4.63.
Para comenzar las medidas, la disolucin de liposomas o de
polielectrolitos, segn sea el caso se pone en contacto con el electrodo a
travs de un sistema de inyeccin con flujo constante para que el electrodo
se recubra con la primera capa. En la Figura 4.64 se muestran los
comportamientos descritos en la figura anterior. Se ha observado que sobre
el electrodo de oro modificado con grupos tiol se adsorbe ms rpidamente
formando un bicapa mientras que sobre el electrodo de silicio la adsorcin
es ms lenta y las vesculas se adsorben como vesculas siendo ms lenta la
formacin de la bicapa sobre el electrodo.
Figura 4.64 Adsorcin de vesculas catinicas sobre diferentes sustratos ant es del
lavado con disoucin salina con la misma fuerza inica. Ambas
disolucin tienen una fuerza inica de 10 mM NaCl y las medidas se
hicieron a 25C.
En relacin a estos datos experimentales, la primera informacin que se

puede extraer de los datos experimentales est de acuerdo al patrn
observado de decaimiento monotnico para la frecuencia y de crecimiento
para la disipacin durante el proceso de adsorcin y siguiendo las
correlaciones propuestas por Richter [373] entre el patrn de adsorcin
obtenido usando D-QCM y la estructura de la vescula adsorbida es posible
asumir que la vescula de DOPC/DODAB queda adsorbida sobre el substrato
en forma de vescula integra formando lo que se conoce como una capa
formada por vesculas simples (VSL, vesicle single layer). La ausencia de
fusin observada para la adsorcin de las vesculas de DOPC/DODAB en las
condiciones utilizadas debe ser atribuida a un efecto de la densidad de carga
del sistema de forma que existe un recubrimiento umbral por debajo del cual
la capa contiene vesculas muy separadas no existiendo interaccin
suficiente entre ellas para conducir a la fusin [372, 374] .
Para el caso del ensamblaje de polielectrolitos, el tiempo medio que se
deja para asegurarse que se ha realizado con xito, es una hora. La
determinacin del punto de saturacin, es decir, el momento en que se
considera el electrodo completamente recubierto es observando el valor de
la frecuencia dado en cada adsorcin y que es constante cuando se depositan
sobre la superficie en su totalidad.
En este momento se debe calcular la variacin de frecuencia real que
supone la adsorcin del polielectrolito, ltex o liposomas que tiene en
cuenta el efecto viscoso del disolvente, que en todos nuestro caso no va a
ser muy importante pues se trabaja con disoluciones acuosas. Y con este
valor, mediante la ecuacin de Sauerbrey se obtiene la canti dad de masa
depositada sobre el electrodo.
Los resultados obtenidos mediante elipsometra, combinados con los
anlisis realizados con balanza de cuarzo son el punto de partida como
tcnicas de caracterizacin cuantitativas [375] para analizar los procesos de
adsorcin que tienen lugar sobre liposomas unilamelares pequeos (100 nm
de dimetro).
La elipsometra es una tcnica indirecta de la que se extrae informacin
fsica relevante sobre muestras que necesitan modelos pticos basados en la
teora magntica y el modelo ptico elegido se describe en Tcnicas de
superficie que corresponde a un modelo de capas paralelas caracterizadas
por el ndice de refraccin. Cuanto mejor es la aproximacin obtenida con el
modelo elegido ms nos acercaremos a la estructura real de la muestra

estudiada [324, 376, 377].
La combinacin de Microbalanza de Cuarzo Disipativa (D-QCM) sobre
una superficie de silicio y Elipsometra permite analizar junto al proceso de
deposicin ciertas propiedades de las multicapas obtenidas (propiedades
mecnicas y contenido en agua) [378] . El anlisis de los datos de los
experimentos se realiz para la D-QCM usando el modelo propuesto por
Johannsmann et al. [317] y para el caso de la elipsometra usando un modelo
de cuatro capas [379, 380]. Se muestra a continuacin dos de los sistemas
estudiados que difieren en el tipo de liposoma y polielectrolitos adsorbidos.
Figura 4.65 Secuencia de adsorcin para (PSS+PAH) sobre una vescula de

DOPC+DODAB (70:30) adsorbida sobre un substrato plano. La lnea
continua representa la variacin de frecuencia, f, normalizada por el
nmero de armnico, , para el tercer armnico, ( f / ) 3rd , y la lnea
discontinua indica la variacin de disipacin para el mismo armnico,
D. Las flechas indican la inyeccin del material que se adsorbe y los
procesos de lavado, flechas continuas para inyeccin de material y
flechas discontinuas para la introduccin de las diso luciones de
lavado.
Multicapa (PSS+PAH) 2 -ltex sobre Vesculas de DOPC+DODAB

(70:30)
La Figura 4.65 muestra la variacin temporal de frecuencia normalizada y
disipacin debida a la adsorcin de las vesculas que forman la capa
precursora y de las dos primeras capas (PSS+PAH). Una informacin
relevante que se puede extraer hace referencia a la irreversibilidad de los
procesos de adsorcin de material como muestra la pequea variacin de la
seal por los procesos de lavado [381]. La adiccin produce rpidas
variaciones en la seal durante el procesos de inyeccin observadas en los
datos experimentales, por lo que dichos saltos deben ser considerados como
un artefacto de la medida y no son tenidos en cuenta para el anlisis de los
procesos de adsorcin [382, 383].
Un anlisis detallado del proceso de adsorcin de las capas de
polielectrolito en la Figura 4.65 permite inferir la estructura de la capa
adsorbida. Es posible suponer dos motivos por los que el par de
polielectrolitos quedan adsorbidos: la expulsin de agua debido a la
Figura 4.66 Dependencia con el nmero de capas, N, de la variacin de frecuencia

para los distintos armnicos del cristal de cuarzo, -( f / ). La figura
del interior muestra la dependencia en N de la variacin del factor de
disipacin para el tercer armnico, D.
complejacin de las capas adyacentes o a la desorcin de parte del material

previamente adsorbido por la formacin de complejos interpolielectrolito.
La Figura 4.66 presenta la dependencia con el nmero de capas, N, de la
variacin de frecuencia para los distintos armnicos del cristal de cuarzo,
-( f / ). De las variaciones de frecuencia es posible confirmar que la
adsorcin de las capas de PSS lo hacen con una estructura bastante difusa
con una fuerte variacin de la disipacin que se ve reducida con la adsorcin
de las capas de PAH, esto puede ser atribuido a la compactacin de la
pelcula obtenida debido a la complejacin de las cadenas de las dos capas
consecutivas. Especialmente significativo es el caso de la capa de PSS
adsorbida sobre la capa de vesculas donde debido a la reducida carga de las
vesculas adsorbidas la disipacin tiene mayor variacin. Adicionalmente la
adsorcin de la capa formada por las partculas de ltex (=22 nm) provoca
un fuerte descenso en la frecuencia de resonancia y en la disipacin lo que
puede estar correlacionado con la formacin de una capa don de la rugosidad
Figura 4.67 (a) Dependencia con el nmero de capas, N, de los espesores acstico,
h ac , y el espesor ptico, h op , obtenido por el anlisis de los datos de los
experimentos realizados usando D-QCM y elipsometra,
respectivamente. (b) Dependencia con el nmero de capas, N, del
contenido en agua, X W , de la multicapas obtenido por la comparacin
de los datos obtenidos usando D-QCM y elipsometra,
respectivamente.
es elevada debido a la forma esfrica de las partculas.

La Figura 4.67 (a) muestra las dependencias de h ac y h op con el nmero de
capas, N y (b) muestra el contenido en agua asociada a la multicapa.
Lo primero que se puede observar de los datos en la Figura 4.67 (a) es
que h ac >h op , esto es debido a la distinta sensibilidad de las tcnicas
consideradas a la cantidad de materia adsorbida [384]. Mientras que la D-
QCM no distingue si la cantidad de materia adsorbida sobre el cristal es
debida al material adsorbido o al agua asociado, la elipsometra como es t
basada en las diferencias de ndice de refraccin solo da informacin de la
cantidad de material adsorbido sin considerar el agua, dado que el ndice de
refraccin del agua asociada a la multicapa y al agua libre no son lo
suficientemente distintos para ser distinguidos. La diferencia en la tendencia
de los datos de elipsometra y D-QCM, es principalmente un efecto par-
impar observado mediante QCM, aunque poco pronunciado puede ser
considerada como una confirmacin de que no existe desorcin durante el
proceso de complejacin sino simplemente una compactacin de la pelcula
formada con posible liberacin de molculas de agua atrapadas en la
multicapa.
Del anlisis de los datos obtenidos mediante microbalanza de cuarzo (D -
QCM) y elipsometra es posible realizar una estimacin de la cant idad de
materia adsorbida, obtenindose el espesor acstico, h ac , y el espesor ptico,
h op , respectivamente. Para ello se debe utilizar el formalismo propuesto por
Vo ro s [384] donde el porcentaje de agua, X W, en peso en la multicapa se
calcula como,
hac hop
XW (4.5)
hac
Este mtodo de clculo del contenido en agua de multicapas conduce a

valores concordantes con los que se pueden obtener usando reflectividad de
neutrones [379] . En la Figura 4.67 (b) los valores del contenido en agua de la
pelcula oscilan entre el 50-90 % a lo largo de las distintas fases del
crecimiento estudiadas. El contenido en agua decrece al incrementar el
nmero de capas con una excepcin en el caso de la adsorcin de la capa de
PSS directamente anclada a las vesculas donde el contenido en agua
aumenta ligeramente lo que parece confirmar el escenario donde el polmero
forma una especie de capa sobre las vesculas que posteriormente es
compactada. El efecto de compactacin inducido por el PAH es evidenciado
Figura 4.68 Representacin D vs. -( f / ) para el sistema formado por vesculas

formadas por DOPC:DODAB (70:30) sobre sustrato plano y con capas
sucesivas de partculas de ltex y el par de poielectrolitos PSS/PAH en
disolucin con 10 mM NaCl.
en la adsorcin de las capas 4 y 5 donde la adsorcin de PSS (capa 4)

provoca una menor reduccin en el contenido en agua que la capa de PAH
(capa 5).
La Figura 4.68 muestra la representacin de D vs. -( f / ). Los
resultados estn en concordancia a lo discutido anteriormente. La adsorcin
de una capa de ltex produce un marcado incremento de la disipacin debido
a la formacin de una estructura homognea que es una consecuencia de la
naturaleza esfrica de estas partculas.ll
Del anlisis de los experimentos realizados usando D-QCM es posible
obtener informacin de las capas depositadas en forma de las componentes
real e imaginaria del mdulo de cizalla, G y G. La Figura 4.69 muestra las
dependencias con N de G y G. Los resultados correspondientes a las
propiedades mecnicas de la multicapa estudiada presentan valores del
orden de los MPa. Los resultados muestran una ligera mayor contribucin de
Figura 4.69 Dependencia con el nmero de capas, N, del las componentes del
mdulo de cizalla, G y G para el sistema formado por vesculas
formadas por DOPC:DODAB sobre sustrato plano y con capas de
polielectrolitos PSS/PAH con la penltima capa adsorbida sobre los
liposomas de partculas de ltex en disolucin tamponada a pH 7.4
con 10 mM NaCl.
G en buena concordancia los efectos debido a la importancia de las

propiedades viscoelsticas del sistema considerado.
Multicapa PEI-(PGA+PLL) 2 sobre Vesculas de DOPC

A continuacin se muestran los resultados correspondientes al sistema
formado por liposomas de carcter zwiterinico adsorbidos sobre el sustrato
y sobre el cual se depositan los polielectrolitos PEI y el par alt ernado
PGA/PLL. Este estudio permite mostrar ciertas diferencias a la hora de
adsorber diferentes sistemas y por ello es importante que el estudio se
detalle de la misma forma que el anterior sistema.
La Figura 4.70 muestra la variacin temporal de frecuencia normalizada
y disipacin debida a la adsorcin de las vesculas que forman la capa
precursora y de las tres primeras capas PEI-(PGA+PLL). Se muestra la
adsorcin intacta de la vescula sobre el sustrato plano, y como
Figura 4.70 Secuencia de adsorcin para PEI(PGA+PLL) sobre una vescula de

DOPC adsorbida sobre un substrato plano. La lnea continua
representa la variacin de frecuencia, f, normalizada por el nmero
de armnico, , para el tercer armnico, ( f / ) 3rd , y la lnea
flechas discontinuas para la introduccin de las disoluciones de
lavado.
consecuencia la adsorcin de los polielectrolitos sufrir algunas

modificaciones, si se compara con el sistema anterior, como se observa a
continuacin.
Un anlisis detallado del proceso de adsorcin de las capas de
polielectrolito evidencia un patrn de adsorcin de las capas de policatin
(PEI y PLL) similar al esperable con un decaimiento monotnico de la
frecuencia lo que confirma un mecanismo de deposicin con una adsorcin
efectiva de material en la multicapa, sin embargo, para la adsorcin de las
capas de polianin un crecimiento en la frecuencia de resonancia es
observada lo que puede ser atribuido a dos posibles motivos: la expulsin de
agua debido a la complejacin de las capas adyacentes o a la desorcin de
parte del material previamente adsorbido por la formacin de complejos

insertada muestra la dependencia en N de la variacin del factor de
disipacin para el tercer armnico, D.
interpolielectrolito entre el PGA y la capa de policatin previamente

adsorbida, esto no indica que no haya deposicin de cadenas de polianin
sino que el balance global es de una desorcin. Este fenmeno de desorcin
parece ser el que existe en el sistema considerado dado que junto al
crecimiento de la frecuencia de resonancia del cristal de cuarzo, es posible
observar un fuerte crecimiento en la disipacin lo que parece indicar la
formacin de una capa con estructura difusa o fuzzy. Un estudio ms
detallado de los datos puede ayudarnos a entender la fenomenologa
implicada en la formacin de las multicapas aqu estudiadas.
La Figura 4.71 presenta la dependencia con el nmero de capas, N, de la
variacin de frecuencia para los distintos armnicos del cristal de cuarzo,
-( f/ ). Lo que se observa es la ausencia de solapamiento entre las curvas
correspondientes a los diferentes armnicos e indica que la ecuacin de
Sauerbrey [313] no es aplicable para obtener la cantidad de materia adsorbida
y es necesario la aplicacin de modelos que consideren las propiedades
viscoelsticas de la multicapa formada [385]. Los resultados ponen de
manifiesto un efecto de la naturaleza del polielectrolito adsorbido en el

cambio de frecuencia, existiendo un claro efecto par -impar en la deposicin
de la capas. En este caso el efecto es ms acusado con respecto al anterior
sistema.
De la misma forma que para el anterior sistema, la Figura 4.72 (a)
muestra h ac > h op. Los resultados muestran un efecto par-impar con adsorcin
efectiva durante la deposicin de las capas de polication, mientras que un
decrecimiento en el material adsorbido es observado en el caso de la
deposicin de capas de polianin, lo cual est de acuerdo a los resultados
obtenidos en D-QCM con el anterior sistema. El hecho de que este
fenmeno sea observado para este sistema tanto en los datos obtenidos
mediante D-QCM como en elipsometra (aunque estos resultados muestran
una tendencia ms suave) es una indicacin de que el descenso en la masa
adsorbida se debe a un proceso de adsorcin de PGA. En la Figura 4.72 (b)
se calcula el contenido en agua de la pelcula que oscila entre el 30 -50 % a
respectivamente.

formadas por DOPC sobre sustrato plano y con capas sucesivas del par
de polielectrolitos PGA/PLL con una capa inicial adsorbida sobre los
liposomas de PEI en disolucin tamponada a pH 7.4 con
10 mM NaCl.
lo largo de las distintas fases del crecimiento estudiadas, estos valores estn
de acuerdo con los encontrados para otras multicapas formadas por
biopolmeros [378, 386] . Sin embargo es importante indicar que a diferencias de
las multicapas simplemente constituidas por polielectrolitos, la presencia de
vesculas como capa precursora inducen valores iniciales de contenido en
agua inferiores a aquellos encontrados en multicapas formadas solo por
polielectrolitos.
La Figura 4.73 muestra la representacin de D vs. -( f / ). Esta figura
puede ayudar a entender la fenomenologa asociada a la c onstruccin de la
multicapa [387] . Los resultados evidencian un incremento de la disipacin
durante todo el crecimiento de la multicapa lo que indica que la estructura
de la multicapa tiene un alto grado de desorganizacin estructural,
especialmente interesante es el caso de la adsorcin de PGA.
De nuevo, el anlisis de los experimentos realizados usando D-QCM

permite obtener informacin de las capas depositadas en for ma de las
componentes real e imaginaria del mdulo de cizalla, G y G. La Figura
4.74 muestra la dependencia con N de G y G. El estudio de estas
magnitudes confirma las diferencias en el proceso de adsorcin sobre el
sustrato plano. Se muestra que G y G presentan valores del orden de MPa
lo que les confiere el comportamiento similar a polmeros en estado de
caucho o rubber [388] , este tipo de comportamiento ha sido anteriormente
observado para diversas multicapas de polielectrolitos [389]. Los resultados
muestran una ligera mayor contribucin de G en buena concordancia con
lo comentado anteriormente sobre la importancia de las propiedades
viscoelsticas del sistema considerado. Es importante indicar que el mismo
efecto par-impar observado en la cantidad de materia adsorbida es
observado en la variacin de G y G, considerando esto en valores
relativos, la importancia de G aumenta en los ciclos de deposicin de PGA
lo que parece confirmar un escenario donde el PGA arranca parte del
polielectrolito adsorbido en la capa previa conduciendo a una multicapa con
una estructura ms difusa o fuzzy.
Figura 4.74 Dependencia con el nmero de capas, N, de las componentes del

formadas por DOPC sobre sustrato plano y con capas de
polielectrolitos PGA/PLL con una capa inicial adsorbida sobre los
10 mM NaCl.
Se finaliza esta seccin realizando una comparacin de los espesores

obtenidos para estos dos sistemas por Dispersin de luz, Balanza de cuarzo
y Elipsometra que se muestra en la Figura 4.75. Estos resultados que
indican la posibilidad del uso de cualquiera de las tres tcnicas para estudiar
el crecimiento de las multicapas sobre los liposomas. La idea principal de
esta figura es facilitar la comparacin y comprobar las diferencias entre la
adsorcin sobre sustratos esfricos y sobre sustratos planos. El hecho es que
con la tcnica de dispersin se obtienen resultados cercanos a los obtenidos
mediante elipsometra, y con la misma tendencia que los obtenidos con
Balanza de cuarzo. Esto conduce a facilitar la labor investigadora con los
liposomas y sus recubrimientos dado que el estudio con sustratos planos se
realiza con mayor rapidez y sobre todose minimiza el uso de reactivos. De
este modo se plantea un nuevo mtodo de trabajo que consiste en optimizar
los sistemas de inters mediante estudios sobre sustratos planos alternando
con algunos estudios sobre sustratos esfricos. Este mtodo que comienza
con la utilizacin de tcnicas de superficie, permite determinar el tiempo de
Figura 4.75 Variacin del espesor con el nmero de capas mediante Dispersin de
luz(), Balanza de cuarzo, () y Elipsometra,(), para los sistemas
formados por (DOPC:DODAB)-(PSS/PAH)-Latex-PAH, (a), y DOPC-
PEI-(PGA/PLL) 2 , (b).
adsorcin de los polielectrolitos sobre la bicapa o vescula lipdica, el

espesor para cada capa y la cantidad adsorbida de agua al utilizar
polielectrolitos de diferente naturaleza. Finalmente es la tcnica de
Dispersin de luz, en este caso, la que confirma el tamao del sistema
creado, determina la existencia de agregados y puede dar una idea sobre los
factores que pueden afectar al sistema, tal como pH, temperat ura, fuerza
inica, etc.
4.1.8 Ensayos de liberacin para los sistemas

formados
Liberacin de DEX-FITC
El trabajo descrito en esta seccin ha sido realizado en el laboratorio de la
profesora Dr.Bridgette Boudhlal en la Universidad de Massachusetts. El
estudio final realizado para observar la funcionalidad de los sistemas de
liposomas estudiados ha sido la liberacin de un frmaco. Inicialmente se ha
probado con dextrano, que sirve de modelo para el estudio de muchos
sistemas de liberacin. Este frmaco posee un marcador fluorescente que
nos permite controlarlo con el fluormetro. Se ha medido inicialmente el
sistema para comprobar que no exista fluorescencia, ya que en el caso que
hubiera, significa que no se ha lavado bien la muestra pues tan solo se busca
que la cantidad de frmaco en la disolucin est en el interior de los
liposomas.
En la Figura 4.76 se realiza una comparativa de los resultados obtenidos
para la fluorescencia emitida tras la degradacin de los liposomas formados
por DPPC. La temperatura mxima a la que se han desarrollado los
experimentos ha sido 45C alcanzando la temperatura de transicin
caracterstica del fosfolpido que forma el liposoma. Se observa que el
liposoma sin recubrimiento libera rpidamente su carga, comienza a 26C
con ms de un 20% liberado. Al modificar el liposoma con polmero, la
liberacin se hace ms lentamente, alcanzando ese mismo porcentaje a 35C.
Si adems al liposoma modificado con el polmero se recubre con PEG la
liberacin queda controlada, la temperatura a la que el 20% est liberado
coincide con la temperatura de transin del homopolmero y una vez
alcanzada esa temperatura se libera el 80% de la carga. hasta llegar a 42C,
temperatura a la que se ha liberado el 100%.
Figura 4.76 Comparativa de la liberacin de DEX marcado con FITC en liposomas

zwiterinicos de DPPC de 1 m a pH 7.4. Se observa la cantidad de
frmaco liberado para liposomas con polmero en la bicapa y para
liposomas con una capa adicional de PEG ensamblado mediante la
tcnica denominada pegylation post-coating.
Para conocer si realmente se haba liberado todo el frmaco, estas

disoluciones se pusieron en contacto con un surfactante, TRITON X-100
diluido al 10% en agua. Aadiendo un exceso de este tensioactivo se ha
observado que la seal de fluorescenciano vara con el tiempo, lo que parece
indicar que es punto final de la liberacin.
Liberacin de DOX-FITC
DOX-FITC es un frmaco muy utilizado para el tratamiento de cncer. Dada
su alta toxicidad y para que el tratamiento resulte ms efectivo se encapsula
en diferentes sistemas tales como micropartculas, micelas polimricas,
dendrmeros y liposomas. En el mercado ya se encuentran comercializados
sistemas liposomares que encapsulan este frmaco, el ms conocido es
Doxil TM.
Esta ha sido una de las razones por las que se ha seleccionado para
comprobar la eficacia de nuestros sistemas en el campo de la medicina. De
todos los tipos de liposomas estudiados se ha seleccionado aquel que posee
una temperatura de transicin por encima de la temperatura corporal, es el
mismo utilizado para la liberacin de dextrano tras observar el xito con el
mismo. Los liposomas estudiados estn formados por DPPC que han sido
modificados con un homopolmero derivado de p-(NIPAM) para formar lo
que se conoce como liposomas con termorrespuesta de una forma c ontrolada
y al mismo tiempo aumentar su estabilidad con respecto al medio.
Una vez optimizado el sistema con este polmero se ha ensamblado una
capa de PEG y as, adems de poseer esta termorrespuesta mencionada se
convierte en un sistema biocompatible que puede ser dirigido hacia la clula
enferma sin ser destruido por el camino. Para asegurar el ensamblaje de
PEG se ha realizado una condensacin, de forma que la terminacin cida
del homopolmero COOH reacciona con la terminacin -NH del PEG
Figura 4.77 Comparativa de la liberacin de DOX marcado con FITC en liposomas

zwiterinicos DPPC de 1 m a pH 7.4. Se observa la cantidad de
liposomas con adems una capa de PEG ensamblado mediante la
tcnica denominada pegylation post-coating.
formndose un enlace lo suficientemente estable como para que no sea

degradado. Esta forma de ensamblar PEG a cualquier superficie se
denomina post-coating y la reaccin es muy usada cuando se busca un
enlace estable bajo condiciones de degradacin.
El procedimiento seguido para la liberacin de este frmaco ha sido
cuidadosamente realizado y desarrollado por triplicado para asegurar su
eficacia. En la Figura 4.77 se muestra el porcentaje normalizado del frmaco
liberado para liposomas de 1m. Se observa que para liposomas con DOX la
liberacin se realiza lentamente, cuando el liposoma se encuentra
modificado con el homopolmero, es decir situado en la bicapa junto al
frmaco, la liberacin se realiza rpidamente, a 27C ya se ha liberado el
20%, pero ya en el caso del liposoma modificado con PEG, la liberacin
sigue la misma tendencia que sin ningn aditivo con la diferencia que a
36C prcticamente se ha liberado el 100%. Se puede decir que el PEG ha
mejorado la capacidad de liberacin y queda probada su eficacia a
temperatura fisiolgica.
4.2 MICROGELES
En este trabajo se ha desarrollado un estudio completo de microgeles de
poli-(isopropilacrilamida)-co-vinilmidizol, p-(NIPAM)-co-VI, desde su
sntesis hasta su caracterizacin en este trabaj o. La eleccin del
vinilimidazol se debe al gran nmero de aplicaciones mdicas en las que
est involucrado por su respuesta al pH del medio [390, 391]. Los microgeles
son otra alternativa a los liposomas cuando se desean utilizar en
aplicaciones biomdicas donde una de sus ventajas con respecto a los
liposomas puede ser la mayor estabilidad.
El microgel p-(NIPAM)-co-VI fue sintetizado por polimerizacin

precipitacin radical, tal y como se explica con detenimiento en el
subapartado de Sntesis de microgeles, con el fin de obtener microgeles
catinicos en los que la carga se sita en el exterior del mis mo [392]. Una vez
formado se almacena en forma slida y en un recipiente esmerilado y lo ms
hermtico posible con el fin de evitar que la luz y el entorno provoquen
variaciones en sus propiedades iniciales. El fluorforo que se eligi para
estudios de fluorescencia fue rodamina cuyas caractersticas se han
detallado en el captulo de Materiales y mtodos y da al microgel el
aspecto rosado (Figura 4.78).
4.2.1 Variacin del tamao con la temperatura y pH

Se ha realizado un estudio de la influencia de la temperatura [393, 394] , fuerza
inica [148] y pH en el tamao [390] , centrndonos en las condiciones relevantes
para posibles aplicaciones bio-mdicas. [391, 395]
El comportamiento de este microgel en disolucin acuosa fue
inicialmente estudiado a diferentes pH. El estudio principal se ha centrado
en el rango de pH 5-9 debido a su relevancia en el proceso endosomal y en
la acidificacin extracelular de tumores. La incorporacin de VI en el
microgel modifica los enlaces de hidrgeno entre la estructura del microgel
y las molculas de agua [396] , y por tanto es importante conocer la variacin
de tamao con la temperatura a diferentes pH,
La interaccin tamao-temperatura de gran importancia en estos sistemas
ha sido estudiada mediante la dispersin de luz dinmica.
Figura 4.78 Aspecto del microgel sintetizado denominado p-(NIPAM)-co-VI.

4.2 Microgeles 255
En la Figura 4.79 se representa la variacin del radio hidrodinmico

aparente con la temperatura para tres valores de pH (3.3, 8.5 y 9.2). En
todos los casos se observa un comportamiento reversible (calentamiento/
enfriamiento) a pesar de las notables diferencias de tamao para los
distintos pH. La temperatura de transicin no se ha observado en el rango de
temperaturas estudiadas a pH bajo, el microgel se resiste al colapso incluso
por encima de la temperatura de transicin por lo que se espera que sea
mayor que en los otros casos.
En primer lugar, el microgel p-(NIPAM)-co-VI en agua, a un pH 8.5,
tiene un R H de 230 nm, presenta la temperatura de transicin alrededor de
34-36C, y disminuye hasta los 96 nm. Se ha podido observar que cuando el
pH es cido, el radio inicial es mayor que en soluciones con pH bsico. De
forma general, cuando el pH tiene valores pequeos, el vimilmidizol se
desprotona y se produce una repulsin entre las cadenas polimricas dando
lugar a una expansin en el volumen del microgel, por lo q ue se observa que
fijada la temperatura, a medida que aumenta el pH el tamao es menor ya
Figura 4.79 Variacin del radio hidrodinmico del p-(NIPAM)-co-VI sin recubrir
en funcin de la temperatura en disolucin acuosa a diferentes pH:
pH 3.3 (), pH 8.5 () y pH 9.2 (). Los smbolos rellenos
indican calentamiento y los smbolos huecos indican enfriam iento.
Figura 4.80 Variacin del radio hidrodinmico del microgel p-(NIPAM)-co-VI con
la temperatura a diferentes valores de fuerza inica: sin adiccin de
sal (), con 0.1 M NaCl (), con 0.25 M NaCl () y con disolucin
tampn y 0.15 M NaCl ().
que disminuye la hidrofobicidad entre las cadenas del microgel.

En este tipo de microgeles se ha logrado combinar perfectamente la
respuesta a la temperatura por parte del p-(NIPAM) y la respuesta al pH por
parte de VI. Esta terminacin favorece los enlaces de hidrgeno con el agua,
con lo que se facilita la disolucin en la misma adems de aumentar la
temperatura de colapso del microgel.
La fuerza inica, otro parmetro importante a la hora de fijar en el
estudio de estos sistemas produce una gran influencia en la distribucin de
las cadenas del microgel, como se observa en la Figura 4.80. Por debajo de
la temperatura de transicin, el microgel p-(NIPAM)-co-VI es independiente
de la fuerza inica, al llegar a temperaturas mayores, alrededor de 34C, se
produce la formacin de agregados. Tan solo para el microgel en disolucin
acuosa sin sal aadida, al llegar a dicha temperatura se colapsa dan do lugar
a un tamao ms pequeo que es el comportamiento tpico para un microgel
de estas caractersticas.
4.2 Microgeles 257
Si se fija la temperatura, el valor del R H con diferentes fuerzas inicas

apenas vara, dentro del error experimental, pero se observa una ligera
disminucin del mismo con y sin presencia de fuerza inica. Esto est de
acuerdo con el efecto de la sal en la temperatura de transicin de p-
(NIPAM) [397], el apantallamiento de las cargas en el microgel por los
contraiones presentes en la disolucin reduce la repulsin electrosttica, por
lo que el tamao del microgel es menor R H ( 170 nm) en presencia de la sal
que en su ausencia (R H190 nm).
4.2.2 Recubrimiento capa a capa con

polielectrolitos
Una vez disuelto el microgel en agua miliQ se procedi a recubrirlo con
diferentes pares de polielectrolitos y se estudi el efecto de la temperatura
en el tamao y en la movilidad electrofortica para distintas fuerzas inicas
(Ver Figura 4.81). Los polielectrolitos elegidos fueron, por un lado
PSS/PDADMAC y por otro lado PGA/PLL. El mtodo utilizado para los
recubrimientos es el ensamblamiento capa a capa por interacciones
electrostticas, detallado en el apartado 1.5.3 del captulo de Introduccin y
objetivos y consiste en aadir la disolucin del polielectrolito a la
disolucin de microgel y una vez mezcladas se centrifuga tres veces a
50.000 rpm durante 30 minutos.
Inicialmente se muestran los datos correspondientes al efecto de la
temperatura en el tamao del microgel a medida que se aaden las c apas de
Figura 4.81 Ilustracin de la respuesta que muestra un microgel recubierto con

diferentes polielectroitos al aumentar la temperatura [390] .
los pares de polielectrolitos estudiadas y para evitar confusin se muestra en

el apartado los valores de la movilidad electrofortica en funcin de la
temperatura donde se hace una comparacin de los valores obtenidos para
todas las capas.
PSS/PDADMAC
Se comenz estudiando la adsorcin del par de polielectrolitos
PSS/PDADMAC. Este sistema se ve afectado por la fuerza inica y por esta
razn se realiza con ella fija. En la Figura 4.82 se muestras las curvas de
termorrespuesta medidas por DLS para el microgel sin recubrir en funcin
de la temperatura comparada con las curvas obtenidas para las muestras con
varias capas adsorbidas sobre el mismo de PSS y PDADMAC en disolucin
con una fuerza inica de 0.1 M NaCl. La temperatura de transicin a la que
Figura 4.82 Variacin del radio hidrodinmico con la temperatura para p -

(NIPAM)-co-VI Rodamina -(PSS/PDADMAC). El microgel en agua miliQ
y los polielectrolitos disueltos en 0.1M NaCl sin recubrimiento (),
con una capa de polielectrolito () y tres capas de polielectrolitos
(). Los smbolos rellenos indican calentamiento y los smbolos
huecos indican enfriamiento. Las flechas grises muestran la tendencia
lineal, el crecimiento, de las multicapas.
4.2 Microgeles 259
Figura 4.83 Variacin del radio hidrodinmico con la temperatura para el microgel
p-(NIPAM)-co-VI Rodamina -(PSS/PDADMAC). El microgel est en agua
miliQ y los polielectrolitos disueltos con una fuerza inica de 0.25 M
NaCl sin recubrimiento (), con la primera capa de polielectrolito
() y segunda capa de polielectrolitos (), cuarta capa (), quinta
capa (), seis capas ().Los smbolos rellenos indican calentamiento
y los smbolos huecos indican enfriamiento. Las flechas grises
muestran la tendencia lineal, el crecimiento, de las multicapas.
tiene lugar el colapso del microgel tiende a ser de 32-34C.

En la Figura 4.83 se presenta el microgel p-(NIPAM)-co-VI con un R H de
190 nm; pero se produce un disminucin grande del radio, con la adsorcin
de la primera capa de PSS en 0.25 M NaCl, pasando a 140 nm. La
temperatura de colapso no se ve afectada por la presencia de la capa, y el
microgel con PSS ya recubierto se colapsa hasta un radio de 90 nm. Tras la
adsorcin de la segunda capa (PDADMAC) hay un pequeo aumento en el
R H a 204 nm. Una vez ms la temperatura de transicin no se ve afectada, y
el R H de la microgel de dos capas recubiertas en el estado colapsado es
ligeramente superior a la del microgel. Segn se va produciendo el
recubrimiento de la segunda capa, hay una disminucin notable del R H con
cada capa ms externa de PSS y hay un aumento significativo del R H de la

capa ms externa es PDADMAC.
Al acercarse la carga positiva PDADMAC a la superficie, el microgel con
PSS, tendr que compartir el nmero de cargas negativas entre el microgel y
la capa adsorbida de PDADMAC. El fortalecimiento de la interaccin
atractiva entre PSS y el acercamiento del PDADMAC se hace a expensas de
la atraccin entre el microgel y la capa de PSS ya adsorbido. Se ha
demostrado previamente que los microgeles recubiertos y que acaban con
una capa de PSS son ms hidroflicos y por lo tanto absorben ms agua que
cuando se terminan las capas con PDADMAC [398] , as la capacidad de las
capas para contener ms agua conduce a una disminucin en el
entrelazamiento de las cadenas de polielectrolitos, permitiendo adoptar una
conformacin ms compacta [390].
Con la Figura 4.84 se muestra un comportamiento que solo se produce a
alta fuerza inica, la variacin de la temperatura de transicin en funcin del
nmero de capas. Con el polianin, la temperatura a la que la conformacin
Figura 4.84 Temperatura de transicin para p-(NIPAM)-co-VI Rodamina en H 2 O y

recubierto con los polielectrolitos (PSS/PDADMAC) en 0.25M NaCl y
a 20C.
4.2 Microgeles 261
del microgel cambia, se colapsa, aumenta a medida que aumentan las capas,
pero con el policatin, esa temperatura se mantiene constante en
aproximadamente 38C, por el momento no tenemos ninguna explicacin
para este peculiar resultado.
El comportamiento del microgel en funcin de la temperatura es
completamente reproducible independientemente del nmero de capas y tras
varios experimentos con muestras que tienen las mismas caractersticas.
Cuando durante la aplicacin de la tcnica LbL, el microgel en disolucin
acuosa est expuesto a un exceso del polielectrolito con adems mayor
concentracin salina, el microgel tambin responde a la presencia de sal en
la solucin. Esto significa que cuando las multicapas de PSS /PDADMAC se
adsorben sobre el microgel sin fuerza inica presente, se estn depositando
en una plantilla que es 190 nm, mientras que para los preparados a partir
de diferentes concentraciones de NaCl (0.1 M y 0.25 M), los polielectrolitos
son depositados en una plantilla que tiene una disminucin del tamao
efectivo debido a las interacciones electrostticas entre la sal y el
microgel [148, 399]. Por tanto, esta es una posible razn por la que a 0.25 M
NaCl se obtiene un aumento lineal de los espesores pero menor al que se
debiera obtener si se compara con 0.1 M NaCl de fuerza inica. A esto se
suma la variacin del pH que sufren los sistemas al aadir ms capas de
polielectrolitos tras el lavado que como se ha observado en la Figura 4.83, al
aumentar el pH, disminuye el tamao. Por esta razn no es posible comparar
cuantitativamente los resultados obtenidos para ambos sistemas, aunque s
que podemos hacer un estudio cualitativo referido a cmo vara el radio y la
movilidad electrofortica en funcin de las capas.
Se define razn de hinchamiento a la relacin que existe entre el volumen
en estado de hinchado y el menor volumen obtenido en el estado de colapso
tras superar la temperatura de transicin del sistema, segn se observa en la
ecuacin (4.6).
3
RHhinchado
r colapsado (4.6)
RH
Se ha comparado la razn obtenida en este estudio y se observa un

aumento de la razn de hinchamiento a medida que aumenta la fuerza inica
del medio, lo que est de acuerdo con la teora [400] . Para el caso de sistemas
estudiados a 0.1 M NaCl esta razn es del orden de 3 que aumenta al
aumentar el nmero de capas; lo mismo ocurre con la razn a 0.25 M NaCl

que ser del orden de 13.0 y que tambin aumenta pero ms rpidamente a
medida que crecen las capas debido a la mayor presencia de contraiones.
Se han estudiado por DLS microgeles recubiertos con cuatro bicapas. La
Figura 4.85 muestra que la evolucin del radio hidrodinmico durante el
calentamiento es consistente con la teora. En estos resultados no se ha
fijado el pH de las disoluciones de los polielectrolitos pero se comprob
siempre antes y despus del ciclo de centrifugacin y se muestran en la
Tabla 4.11. Se observa que el pH apenas vara antes y despus del lavado,
manteniendo aproximadamente el mismo pH durante el ensamblaje y por
tanto los datos obtenidos pudieran ser comparados a diferentes pH.
Por el contrario, en la adsorcin de polielectrolitos a mayora fuerza
inica el pH vara desde su lavado mediante centrifugacin y despus de
estos lavados (Tabla 4.12). Los datos as obtenidos reflejan la inestabilidad
a altas fuerzas inicas y por tanto no existe un control que permit a la
comparacin con los otros resultados. Se observa una variacin del pH antes
y despus del lavado para los sistemas a medida que aumentan las capas de
los polielectrolitos y con una fuerza inica de 0.25M, lo cual pudiera estar
afectando a los valores que se obtienen de tamao aparente y por tanto
Tabla 4.11 pH medido antes y despus del ciclo de centrifugacin medidos a 20C.
Sustrato Nmero de Antes del Despus del segundo
capas lavado lavado
p-(NIPAM)-co-VI/PSS 1 7.6 8.8
p-(NIPAM)-co- 2 7.0 7.0
VI/(PSS/PAH)1.0
p-(NIPAM)-co- 3 7.3 8.3
VI/(PSS/PAH)1.5
p-(NIPAM)-co- 4 7.4 7.8
VI/(PSS/PAH)2.0
p-(NIPAM)-co- 5 7.8 8.1
VI/(PSS/PAH)2.5
p-(NIPAM)-co- 6 7.0 7.2
VI/(PSS/PAH)3.0
p-(NIPAM)-co- 7 7.4 7.8
VI/(PSS/PAH)3.5
p-(NIPAM)-co- 8 6.7 6.8
VI/(PSS/PAH)4.0
4.2 Microgeles 263
Tabla 4.12 pH medido antes y despus del ciclo de centrifugacin medidos a temperatura
ambiente, 20C y a la mayor fuerza inica.
Sustrato Nmero de Antes del Despus del segundo
capas lavado lavado
p-(NIPAM)-co-VI/PSS 1 6.3 8.5
p-(NIPAM)-co- 2 5.6 6.6
VI/(PSS/PAH)1.0
p-(NIPAM)-co- 3 5.9 7.7
VI/(PSS/PAH)1.5
p-(NIPAM)-co- 4 5.2 7.2
VI/(PSS/PAH)2.0
p-(NIPAM)-co- 5 7.0 8.0
VI/(PSS/PAH)2.5
p-(NIPAM)-co- 6 5.5 6.5
VI/(PSS/PAH)3.0
p-(NIPAM)-co- 7 5.9 7.3
VI/(PSS/PAH)3.5
p-(NIPAM)-co- 8 5.4 6.7
VI/(PSS/PAH)4.0
indica que estos estudios deben hacerse con el pH controlado para permitir
comparaciones ya que pierde sensibilidad al pH a partir de la segunda capa
adsorbida.
PGA/PLL
La utilizacin de estos polielectrolitos implica que las disoluciones de los
mismos sean tamponadas para mantener el pH constante durante el proceso
de recubrimiento. En este caso no se ha variado la fuerza inica ya que
seran demasiados parmetros a controlar y se fija en 0.15 M NaCl. La
disolucin reguladora est formada por la mezcla de TRIS y MES, detallada
en el apartado de Tcnica capa a capa sobre sustratos esfricos y el pH
seleccionado es 7.4.
La Figura 4.85 muestra el comportamiento de polielectrolitos en
disolucin tamponada de PGA y PLL basado en el nmero de capas.
Podemos ver que a medida que aumentan las capas, el aumento del radio
hidrodinmico es muy diferente de la conducta observada hasta ahora. Este
tipo de polielectrolitos son fuertemente dependientes del pH y a este pH 7.4
adopta una conformacin ms expandida y por lo tanto, y por lo tanto el
Figura 4.85 Variacin del radio hidrodinmico con la temepratura del sistema p-
(NIPAM)-co-VI (Rodamina)- (PLL/PGA) n . El microgel est en agua y los
polielectrolitos en disolucin tampn a pH 7.4 y con 0.15M NaCl. Las
flechas azules muestran la tendencia lineal, el crecimiento, de las
multicapas.
incremento del radio es mayor. En todas las capas depositadas se observ el

efecto "par-impar" con un aumento lineal a medida que crecen las capas.
Una vez observado el efecto de los polielectrolitos sobre el tamao del
microgel, se pasar a observar el mismo efecto sobre la movilidad
electrofortica. Ambos comportamientos son reversibles, independientes de
la concentracin salina presente en la disolucin, es un detalle importante en
la posible aplicacin de estos sistemas como biotransportadores teniendo en
cuenta su respuesta en funcin de las condiciones del medio en que se
encuentren inmersos.
Una vez obtenido el radio hidrodinmico en funcin de la temperatura se
han comparado todos los sistemas estudiados observando que el aumento del
espesor es lineal para todos los casos. Cuando el pH no es controlado se
espera que como en estudios anteriores desarrollados en el grupo de
Richtering, el microgel se vuelva independiente del mismo y como no es as,
4.2 Microgeles 265
se debe trabajar fijando el pH y es as como se puede comparar los espesores

obtenidos en todos los sistemas.
4.2.3 Variacin de la Movilidad electrofortica con T

En el caso de los microgeles se ha optado por mostrar los datos obtenidos
en el equipo de potencial zeta como movilidad electrofortica y no de
potencial zeta por dos razones principalmente, una de ellas son la vari acin
del tamao que se obtiene cuando parmetros como temperatura, pH y
fuerza inica cambian [401], y la segunda la posibilidad de que no se cumplan
Figura 4.86 (a) Variacin de la movilidad electrofortica con la temperatura para

el microgel de carga positiva p-(NIPAM)-co-VI Rodamina en 0.1M NaCl
donde los smbolos () representan al microgel sin recubrimiento,
con la primera capa de polielectrolito (), segunda capa de
polielectrolitos (), cuarta capa (), quinta capa (). Los smbolos
rellenos indican calentamiento y los smbolos huecos indican
enfriamiento. (b) Variacin de la movilidad electrofortica en funcin
del nmero de capas que recubren el microgel donde () indica la
movilidad electrofortica medida a 25C y () la movilidad
electrofortica medida a 44C despues de la temperatura de colapso.
las aproximaciones de Smoluchowski y Hckel que se detallan en el captulo

de Tcnicas experimentales, en el apartado de Potencial Zeta.
Para cada capa, se represent la movilidad electrofortica en funcin de
la temperatura (la temperatura aument de 293 a 313 K y enfriamiento de
313 K a 293 K, con un aumento de la temperatura de 2 K). Cada punto es la
media de diez medidas, y la muestra se mantuvo en equilibrio durante
10 minutos a cada temperatura. La Figura 4.86 muestra la movilidad
electrofortica del microgel cargado positivamente, y la respectiva a las
capas de PSS/PDADMAC que van recubrindolo con una fuerza inica de
0.1 M NaCl. El xito de inversin de carga se observ en cada paso de la

el microgel p-(NIPAM)-co-VI Rodamina en 0.25 M NaCl sin
recubrimiento y con diferente nmero de capas donde los smbolos
() representan al microgel sin recubrimiento, con la primera capa de
polielectrolito (), segunda capa de polielectrolitos (), cuarta capa
(), quinta capa (). Los smbolos rellenos indican calentamiento y
los smbolos huecos indican enfriamiento. Variacin de la movilidad
electrofortica en funcin del nmero de capas que recubren el
microgel donde () indica la movilidad electrofortica medida a 25C
y () la movilidad electrofortica medida a 44C despues de la
temperatura de colapso.
4.2 Microgeles 267
adsorcin, indicando claramente la acumulacin de mltiples capas [400, 402] .

La Figura 4.87 muestra la movilidad electrofortica del microgel medida
en funcin de la temperatura y para el total de capas adsorbidas sobre el
microgel. El polianin y policatin se encuentran en una solucin de 0.25 M
de NaCl. El xito de inversin de carga se observ en cada paso de la
adsorcin observando un anlogo comportamiento al obtenido para 0.1 M
NaCl.
Se sabe que durante la formacin de capas de polielectrolito, la adsorcin
sobre la superficie es irreversible, pero su forma de estructurarse depende de
la fuerza inica de la disolucin de polielectrolito, tal como muestra la
Figura 4.88como vara la movilidad electrofortica para lossistemas
estudiados con PSS/PDADMAC con distinta fuerza inica. En este caso se
observa que la movilidad electrofortica apenas se ve afectada por la fuerza
inica dentro del error experimental.
Se ha estudiado la variacin de la movilidad electrofortica para los
sistemas formados por el microgel y el par de polielectrolitos PGA/PLL en
Figura 4.88 Variacin de la movilidad electrofortica con el nmero de capas de

polielectrolitos para el microgel de carga positiva p-(NIPAM)-co-
VI Rodamina en 0.1M NaCl, 0.25M NaCl. Temperatura medida 25C.
disolucin tampn y con el pH 7.4. Se comenzar mostrando el

comportamiento de los polielectrolitos ya que son sensibles al pH: A pH 7.4,
condiciones de un medio fisiolgico, PLL (pKa 10.6) y PGA (pKa 4.3) estn
ionizados 32 . El grado de ionizacin de ambos polielectrolitos depende de la
fuerza inica del medio, de forma que con esta fuerza inica, el pKa de PLL
en disolucin salina se ve disminuido mientras que el de PGA aumenta.
En la Figura 4.89 se puede observar que la movilidad del microgel
revestido, en todos los casos, aumenta con la temperatura. La principal
razn de este efecto se debe simplemente al hecho de que cuando se produce
el colapso del microgel, el volumen ocupado por el mismo es menor y por
tanto la densidad superficial de carga aumenta. Un aumento de temperatura
promueve la ruptura de los enlaces de hidrgeno, lo que lleva al colapso del
microgel y el agua es expulsada hacia fuera. Por encima de la temperatura
de transicin, enlaces de hidrgeno inter e intracadena e interacciones
hidrofbicas son dominantes. Al enfriarse, el agua se convierte en un buen
disolvente de nuevo y los segmentos son capaces de reorganizarse en el

polielectrolitos para p-(NIPAM)-co-VI con el par de polielectrolitos
PGA/PLL en disolucin tamponada a pH 7.4 y medido a 25C,(), y a
44C,(), despues de la temperatura de colapso.
4.2 Microgeles 269
Figura 4.90 Variacin del tamao a medida que aumenta la temperatura par a el
recubrimiento del microgel en disolucin con fuerza inica 0.1M
NaCl. Estabilidad temporal del microgel recubierto por la tcnica capa
a capa donde los smbolos rellenos indican calentamiento y los
smbolos huecos indican enfriamiento.
microgel, de forma que vuelve a recuperar su forma inicial y el

comportamiento ser reversible.
4.2.4 Estabilidad del microgel

A la hora de estudiar la estabilidad de estos sistemas formados por el
microgel recubierto con pares de polielectrolitos solo se considera la
variacin del tamao con la temperatura ya que aunque la movilidad sea un
parmetro muy utilizado en los estudios de estabilidad, aqu no se ha
considerado 33 , siguiendo las pautas del grupo en le que trabaj. Se ha
seguido durante tres meses la variacin del radio hidrodinmico con
respecto a la temperatura para observar si con el tiempo esta respuesta sufre
alguna modificacin.
La Figura 4.90 y la Figura 4.91 muestran experimentos equivalentes a la

variacin del radio hidrodinmico con la temperatura para microgel es
recubiertos con una y dos capas y realizados a fuerza inica 0.1 M NaCl y
0.25 M NaCl, respectivamente, donde el tiempo cero corresponde al
momento de la preparacin.
En la Figura 4.90 se muestra cmo vara el radio con la temperatura para
dos sistemas a medida en disolucin pasa el tiempo con fuerza inica igual a
0.1 M NaCl que. Cuando han transcurrido tres meses, el radio del sistema
estudiado se hace mayor y su temperatura de colapso tambin. Aun con esta
variacin de tamao, la variacin con la temperatura sigue la misma
tendencia pasado el tiempo. La primera capa, PSS, aumenta mucho el
tamao cuando pasan tres meses. Se han considerado varias razones para
explicar estos cambios, una de ellas es que al aumentar el tiempo d e
almacenaje, las cadenas de microgel se extienden ms de forma irreversible,
lo que hace que nunca recupere su tamao inicial.
Figura 4.91 Variacin del tamao a medida que aumenta la temperatura para el
recubrimiento del microgel en disolucin acuosa con fuerza inica
0.25M NaCl. Estabilidad temporal del microgel recubi erto por la
tcnica capa a capa donde los smbolos rellenos indican calentamiento
y los smbolos huecos indican enfriamiento.
4.2 Microgeles 271
Por el contrario la estabilidad mostrada por microgeles recubiertos con

una y dos capas en un entorno cuya fuerza inica es de 0.25 M NaCl es
menor. La Figura 4.91 muestra la variacin del tamao con la temperatura
en funcin del tiempo y se observa la prdida de irreversibilidad de los
ciclos de temperatura estudiados, es decir, cuando los ciclos de
calentamiento y de enfriamiento no siguen la misma tendencia perdiendo as
una de las caractersticas fundamentales para posibles aplicaciones.
En la Figura 4.92, se ha representado para una capa, PGA y dos capas,
PGA y PLL. Para todas las curvas representadas, la temperatura de
transicin es siempre la misma, independientemente del tamao obtenido.
Para los dos sistemas representados no existe una variacin brusca del
tamao con el tiempo incluso despus del mximo tiempo medido.
Con resultados de tamao, movilidad y estabilidad, el sistema formado
por el microgel recubierto con el par de polielectrolitos PGA/PLL
tamponado a pH 7.4 es el ms viable si se continuaran los estudios para la
bsqueda de aplicaciones.
recubrimiento del microgel en disolucin con fuerza inica de 0.15M
NaCl y tamponado a pH 7.4. Estabilidad temporal del microgel
recubierto mediante la tcnica capa a capa donde los smbolos rellenos
indican calentamiento y los smbolos huecos indican enfriamiento.
4.3 HBRIDOS
La formacin de estos hbridos tiene como referencia principal los sistemas
ya ideados por el grupo del profesor Frank Caruso con el objeto de
conseguir nuevos microrreactores cuya aplicacin principal es mimetizar
una clula [15, 214] .
La metodologa utilizada ha sido denominada aproximacin bottom-up
que consiste en obtener sistemas de encapsulacin en los que se combinan
molculas grandes individuales para crear un complejo con funcin celular
que est formado por el mnimo nmero de componentes [403] . Se han
desarrollado gran nmero de avances en lo que respecta a la formacin de
compartimentos, como son membranas lipdicas encerradas en molculas
activas [404], lo cual proporciona la habilidad de generar funcionalidades
especficas relevantes en funciones bioqumicas de procesos fisiolgicos [405,
406]
. Las principales aplicaciones de esta metodologa hasta ahora han sido
en terapia gnica y terapia enzimtica, pero que abre el camino a dar ms
respuestas en el campo de la medicina [407].
Los primeros sistemas desarrollados fueron denominados capsosomas [214],
formados por partculas de slice, modificadas en el propio laboratorio con
carcter catinico que han sido recubiertas por polmeros y una primera capa
de liposomas utilizando la tcnica capa a capa [408, 409]. Ms adelante se
desarrollaron capsosomas con varias capas de liposomas, los cuales quedan
unidos gracias a la unin no covalente de los liposomas con polmeros
modificados con un nmero determinado de unidades de colesterol, como es
en el caso de PLL y PMA [215] . El estudio de la adsorcin se desarroll en
sustratos planos con tcnicas de superficie y su viabilidad mediante varios
ensayos celulares [334, 410, 411].
Otro tipo de sistemas estudiados en este grupo fueron sistemas formados
por compartimentos diferentes, es el caso de cpsulas polimricas
recubiertas adems de una capa de nanocpsulas biodegradables, de forma
que las nanocpsulas pueden ser utilizadas como bio-transportadores de
diversos frmacos [216, 412] .
4.3 Hbridos 273
Figura 4.93 Mtodo de obtencin de los hbridos donde (1) preparacin de

partcula de slice a pH 7, (2) adsorcin de nanocpsulas polimricas
por interacciones electrostticas, (3) capas de proteccin, se
distinguen tres casos: PLL, PLL/PMA c o PVP/PMA c (4) adsorcin de
liposomas (5) capa de proteccin, PMA c , (5.a) disposicin de los
polmeros si es el caso de dos capas de proteccin formadas por
cadenas laterales de colesterol, (5.a.1) vista de cerca de la estructura
que adoptan las cadenas de colesterol entre las cadenas de lpido (6)
Adsorcin capa a capa de los pares de polielectrolitos PMA SH /PVP y
entrecruzamiento con BM(PEG) 2 (7) Vaciado de la partcula dando
lugar a los hbridos.
Con toda esta informacin previa, se desarrollaron los hbridos y los

hbridos invertidos que consisten en la formacin de una cpsula polimrica
sobre la que queda adsorbida una capa de liposomas y otra capa de
nanocpsulas biodegradables. Dos tipos de nano-transportadores que
permitirn el transporte de dos enzimas, frmacos o sustancias diferentes
con el objeto de poder desarrollar en el interior de la microcpsulas tanto
reacciones qumicas en cascada como en paralelo.
Como ya se ha comentado, la base de los hbridos son los capsosomas,
por lo que el estudio se centr en la caracterizacin de la formacin y no
tanto en la estructura. Las capas previas a la capa de liposomas son PLL y el
polmero modificado con cadenas de colesterol [11], PMA c ; la denominada
Figura 4.94 Entrecruzamiento realizado para dar lugar a enlaces disulfuro que
proporciona al hbrido formado mayor estabilidad.
capa de sacrificio estudiada ha sido de PMA y PVP y posteriormente los

polmeros ensamblados tras los liposomas fueron PVP/PMA SH [13], que
fueron depositados un total de cuatro veces debido a que ya es conocido,
con este tipo de sistemas el mnimo nmero de bicapas necesario para evitar
la formacin de agregados [13, 209] . Los resultados que se exponen
corresponden a la optimizacin de estos sistemas. La estructura de hbridos
estudiados ha sido la que se muestra en la Figura 4.93. Y finalmente el
entrecruzamiento se realiz de la forma mostrada en la Figura 4.94.
4.3.1 Citometra de Flujo

Se ha utilizado esta tnica para estudiar los sistemas formados [413], con el fin
de poder determinar la opcin ms viable tanto del tipo de liposoma a
utilizar como del tipo de polielectrolito que confiera mayor estabilidad al
sistema completo.
La disolucin de partculas se introduce en el equipo mediante un sistema
de aspiracin que permite fijar la velocidad para que el flujo medido se
mantenga constante durante todo el experimento. A medida que las
partculas atraviesan el haz de lser, la trayectoria de la luz se ve
interrumpida, de forma que parte es dispersada y es sta luz dispersada la
4.3 Hbridos 275
que se recoge por los detectores situados a 180 y 90 de la luz incidente. Se

recoge la dispersin perpendicular al haz de luz (FSC) y la dispersin
paralela al haz de luz (SSC) y con ellas se puede obtener informacin de la
concentracin de la muestra analizada [414].
En este caso van a ser los fluorforos los que sean excitados por el lser,
y esta fluorescencia se recoge por los filtros apropiados, en funcin de la
longitud de onda requerida. Uno de ellos es Alexa flor que acompaa a la
capa de nano-partculas adsorbidas sobre la micro-partcula de slice, y el
otro fluorforo es un lpido fluorescente, NBD-PC que corresponde al
liposoma y que ser medido en el momento en que se adsorben los
liposomas.
Para comenzar el proceso de formacin de los hbridos lo primero es
conocer las concentraciones iniciales y con el equipo de citometra de flujo,
esto se puede conocer. Para las partculas de slice de 3 m se mide la
cantidad de partculas por mL que se registran en el equipo que corresponde
al valor de 3.19 108 partculasmL1 , para las nanocpsulas de PMA SH/PVP es
necesario el clculo de la concentracin cada vez que se vayan a utilizar ya
que a pesar de ser sintetizadas de forma rigurosa, en cada muestra obtenida
un pequeo cambio en el mtodo de fabricacin provoca variaciones muy
grandes en la concentracin final. Gracias a estudios previos realizados en el
Figura 4.95 Resultados del citmetro de flujo tras introducir la muestra y fijar los
parmetros estudiados en estos sistemas previamente.
grupo [216], se sabe que una partcula de 3 m adsorbe un total de

200 nanocpsulas de 300 nm y es con esta relacin 1:200 con la que se
trabaja en el proceso de formacin de los hbridos. Para determinar el
volumen de liposomas adsorbidos sobre la plantilla se parte de la
informacin proporcionada en los estudios anteriores sobre capsosomas en
los que determinaron que 8 103 liposomas [15] en el volumen utilizado son
suficientes para el recubrimiento total de una partcula de este tamao.
Como en este caso se han adsorbido las cpsulas polimricas de 300 nm
previamente, se aade un exceso del volumen que se consideraba y as
asegurar el recubrimiento completo que tras el proceso de centrifugacin el
exceso de liposomas es eliminado. Una vez obtenido el hbrido, las medidas
han permitido obtener la intensidad fluorescente de ms de
20000 partculasmL -1 y se obtienen medidas mostradas en la Figura 4.95.
Una vez obtenidos los datos para cada una de las muestras , se observan
las combinaciones cuya intensidad fluorescente es mayor. La diferencia
Figura 4.96 (a) Intensidad de fluorescencia en lser rojo tras el ensamblamiento de

las cpsulas de 300 nm y (b) en lser verde, tras el ensamblamiento de
los liposomas DMPC:DPPC (40:10); Las medidas se realizaron a 25C
y un volumen de 2 mL.
4.3 Hbridos 277
entre estas combinaciones es el tipo de lpido usado para cada uno de los
sistemas, lo que permiti clasificarlos en funcin del lpido, es decir,
saturado e insaturado. Ha sido interesante estudiar liposomas formados por
lpidos insaturados ya que aportan importante informacin sobre la
interaccin liposoma-polmero [334] pero si adems se desea estudiar sus
potenciales aplicaciones es mejor poder conocer cmo responden los
liposomas saturados ya que son los ms usados en aplicaciones de liberacin
de frmacos puesto que se aprovecha la temperatura de transicin
caracterstica para facilitar la liberacin de cualquier tipo de carga. Adems,
a temperatura ambiente y durante su almacenamiento los liposomas
saturados poseen una estructura ms rgida que evita la prdida de la carga o
al menos la minimiza si se compara con los liposomas insaturados que a la
misma temperatura poseen una estructura ms flexible.
En la Figura 4.96 se muestran las combinaciones realizadas para el
liposoma formado por DMPC y DPPC en las cuales se ha buscado cual de
ellas da mayor intensidad de fluorescencia en cuatro etapas del proceso: al
Figura 4.97 (a) Intensidad de fluorescencia en rojo tras el ensamblamiento de las

cpsulas de 300 nm y (b) en lse verde, tras el ensamblamiento de los
liposomas DOPC:DODAB (30:70); Las medidas se realizaron a 25C y
un volumen de 2 mL.
adsorber el liposoma, tras el proceso completo de adsorcin de capas y

finalmente tras la formacin de la cpsula a pH 4.0 y a pH 7.0, Las medidas
se han realizado para los dos fluorforos con el fin de seleccionar aquella
combinacin ptima para ambos.
La nica excepcin es para el liposoma catinico estudiado,
DOPC:DODAB (70:30) el cual se ha utilizado en dos combinaciones ya que
la combinacin con el polielectrolito PVP no mostraba buenos resultados, de
forma que se puede observar en la Figura 4.97.
Se desarrollaron estas combinaciones para todos los tipos de liposomas
estudiados y al final se seleccionaron las combinaciones que ms intensidad
de fluorescencia mostraban y es lo que se muestran en la Figura 4.98 para la
Figura 4.98 Intensidad de la fluorescencia con lser rojo, tras el ensamblamiento

de las capsulas de 300 nm; Las medidas se realizaron a 25C y con el
mismo volumen total medido igual a 2 mL. La primera columna de la
izquierda (ms oscura) corresponde a la medida despus de adsorberse
las cpsulas de 300 nm; la segunda columna al momento en que se
forma el core-shell a pH 4, la tercera columna es el hbrido tras el
tratamiento cido para disolver la partcula de slice a pH 4 y la ltima
columna (color blanco) corresponde al hbrido tras el tratamiento
cido pero a pH 7.4.
4.3 Hbridos 279
fluorescencia de las nanocpsulas adsorbidas y la Figura 4.99 para la

fluorescencia debida a la adsorcin de los liposomas.
Los datos expuestos corresponden primero a la intensidad de
fluorescencia medida despus de adsorber los liposomas; segundo, una vez
adsorbidos los polmeros que protegen el hbrido completo, se denomina
core-shell. Los datos finales corresponden al paso de la formacin de la
cpsula y medido a diferentes pH, 4 y 7. Esta lectura es importante y puede
dar una idea de la estabilidad del sistema al variar el pH.
La adsorcin de nanocpsulas, segn se puede observar en la Figura 4.98
ha sido posible en todos los sistemas estudiados. El fluorforo ha sido
aadido en las nanocpsulas una vez formadas ya que se ha comprobado que
antes de formar la cpsula se pierde mucha intensidad de fluorescencia [413].
Figura 4.99 Intensidad de la fluorescencia con lser verde, tras el ensamblamiento

de los liposomas. Medidas realizadas a 25C y en un volumen de
muestra igual a 2 mL. La primera columna de la izquierda (ms
oscura) corresponde a la medida despus de adsorberse los liposomas;
la segunda columna al momento en que se forma el core-shell a pH 4,
la tercera columna es el hbrido tras el tratamiento cido para disolver
la partcula de slice a pH 4 y la ltima columna (color blanco)
corresponde al hbrido tras el tratamiento cido pero a pH 7.4.
Las nanocpsulas han sido ensambladas directamente sobre la partcula de

slice, segn el protocolo ya descrito en el captulo de Materiales y
mtodos y para asegurarnos de dicho ensamblaje se observ por
microscopio con el filtro adecuado adems de ser medidos con el citmetro
de flujo para comprobar la intensidad de fluorescencia antes de ensamblar
los liposomas.
En los hbridos con lpidos insaturados se ha comprobado que la
intensidad de fluorescencia disminuye al aumentar el nmero de capas de
polmero. Por esta razn, el ensamblaje en estos hbridos posee una capa
menos de PMA c .
La mayor intensidad de fluorescencia obtenida fue para el sistema con
liposomas saturados negativos, es decir, los formados por DMPC -DPPC-
DPPS en todas las medidas de intensidad de fluorescencia.
El ensamblamiento de los liposomas, tal y como se observa en la Figura
4.99 ha sido posible en todos los sistemas estudiados. La confirmacin de la
adsorcin de los liposomas sobre los polmeros estudiados ha sido posible,
gracias a la microscopa que nos ha permitido observar, con el filtro
adecuado, que los liposomas pasan a formar parte del hbrido que se est
fabricando. En este caso, la seal de fluorescencia mayor ha sido observada
para los liposomas formados por lpidos insaturados negativos. Finalmente,
con ambos resultados, se puede decir que estos son los sistemas deseados
para su posterior utilizacin en aplicaciones bio-mdicas.
Las combinaciones que mejor respuesta mostraron son:
PLL/(DOPC/NBD)/PMA c /PVP/(PMA SH /PVP) 5
PLL/(DOPC/DOPS/NBD)/PMA c /PVP/(PMA SH/PVP) 5 .
PLL/PMA c /(DMPC-NBD)/PMA c /PVP/(PMA SH/PVP) 5
PLL/PMA c /(DMPC-DPPS-NBD)/PMA c /PVP/(PMA SH /PVP) 5
PLL/PMA c /(DMPC-NBD)/PMA c /PMA/PVP/(PMA SH/PVP) 5 .
Las cadenas laterales de colesterol que modifican el PMA permiten que
los liposomas se adsorban manteniendo su forma intacta una vez que forman
parte del hbrido, y al mismo tiempo es un anclaje para los liposo mas que
evita la desorcin cuando estn afectados por cualquier cambio externo, sea
pH o temperatura.
4.3 Hbridos 281
Figura 4.100 Isotermas a T= 25C para distintas combinaciones medidas tras

realizar la adsorcin de los liposomas. Indica el tiempo necesario para
que se asegure la adsorcin completa de los liposomas sobre la
superficie. Se ha aadido la isoterma para liposomas insaturados
catinicos para mostrar todos los casos estudiados.
En la Figura 4.100 se muestra la variacin de la seal de fluorescencia en

funcin del tiempo. Con estos datos es posible conocer el tiempo de
adsorcin de los liposomas sobre las partculas de slice que llevan a su vez
ensambladas las nanocpsulas polimricas de 300 nm de tamao. Para el
caso de liposomas formados por DMPC es necesario calentar hasta 41C
durante el tiempo de adsorcin, que suele oscilar de 40 a 60 minutos. La
razn por la que se debe aumentar la temperatura para producirse su
adsorcin es conseguir que el lpido est en la fase fluida tras sobrepasar la
temperatura de transicin que caracteriza al DMPC. La adsor cin del lpido
formado por DOPC se realiza muy rpido, casi a los diez minutos de poner
en contacto los liposomas con la primera parte del hbrido, el 80% de los
liposomas han sido adsorbido, aunque no es hasta pasados 60 minutos
cuando se mantiene la intensidad de fluorescencia constante, indicando que
ya se ha producido la adsorcin completa. La isoterma correspondiente al
Figura 4.101 Imgenes obtenidas mediante microscopa de contraste en la s que

inicialmente se observa la adsorcin de las cpsulas polimricas y tras
adsorber dos capas de polmeros, una de ellas con las cadenas de
colesterol se adsorben los liposomas de 50 nm de dimetro. Todo este
proceso se desarrolla a pH 4 en disolucin tamponada.
hbrido con liposomas catinicos es descartado para continuar los estudios

con l debido al mayor tiempo de adsorcin que supone al utilizarlos.
4.3.2 Microscopa ptica: Confocal y de contraste

La utilizacin de tcnicas de microscopa en estos sistemas ha sido un gran
apoyo para poder observar la adsorcin de las distintas capas de liposomas y
de nanocpsulas polimricas sobre la partcula de slice de 3 m. Las
nanocpsulas poseen AF-633 como fluorforo que no interfiere con la
fluorescencia emitida por los liposomas cuya sonda incorporada es NBD
situado en la bicapa lipdica.
Se comienza con la adsorcin de las nanocpsulas polimricas par a
despus ensamblar los liposomas. Mediante microscopa de contraste fueron
observados y se muestran en la Figura 4.101.
El paso a la formacin de la cpsula se realiza con el tratamiento cido al
hbrido completo pero en este caso, a diferencia de las nanocpsulas
polimricas, el tratamiento ser menos agresivo y ms rpi do para evitar la
ruptura de los sistemas formados.
Antes de obtener imgenes con el microscopio confocal, las pruebas
iniciales de la formacin de estos sistemas fueron obtenidas con un
4.3 Hbridos 283
Figura 4.103 Imagen obtenida mediante microscopa de contraste, campo claro que
muestra el paso de hbridos en forma de core-shell a cpsulas por el
tratamiento cido tamponado y tras el lavado con disolucin tampn a
pH 7.
microscopio de contraste. De esta forma, se confirm, tras el tratamiento

cido que produce el vaciado de la partcula de slice, la obtencin del
hbrido manteniendo su estructura de ensamblado de liposomas y de
nanocpsulas polimricas. En la Figura 4.103 se observa el vaciado para
todas las partculas presentes. Se ha mostrado a pH 7 que los agregados
disminuyen, y es una de las razones para continuar con los ensayos en
bsqueda de posibles aplicaciones.
Las imgenes mostradas en la Figura 4.102 corresponden a hbridos en
Figura 4.102 Imagen de Confocal de los hbridos con la primera capa de

nanocpsulas polimricas de PVP/PMA SH (en rojo) y otra capa, tras
varios polmeros sin sonda, de liposomas con NBD en la bic apa de los
liposomas. Imgenes obtenidas a pH 7.4 en disolucin tampn de
HEPES 150 mM con una concentracin de 10 mM NaCl. La
temperatura de medida fue de 25C.
pH fisiolgico. Son necesarias al menos las tres bicapas polimricas

ensambladas, tras la adsorcin de los liposomas, para evitar la agregacin de
estos sistemas tan complejos. Ha sido necesario hacer el entrecruzamiento
entre el polmero modificado con grupos -SH formando enlaces de sulfuros
para que se mantenga intacto el hbrido. Este procedimiento de
entrecruzamiento elegido es muy estable respecto a agentes externos
evitando la prdida de actividad funcional.
En la Figura 4.104 se observa el mismo sistema a pH 4 tras el vaciado de
la partcula de slice, la disolucin es lavada con disolucin tampn a pH 4
al menos tres veces y se observan hbridos que no sufren agregacin a este
pH.
Y ahora se muestran los primeros resultados obtenidos para hbridos
invertidos. Los hbridos invertidos, de cuya sntesis se ha hablado en el
captulo de Metodologa y cuyo mtodo de preparacin se detalla en la
Figura 3.19, se muestran en la Figura 4.105 . El pH de estudio en el que se
encuentran es 7, al cual pueden ser ms inestables estos sistemas. Se
observa que los liposomas han sido ensamblados sobre la partcula de slice,
su tiempo de adsorcin ha sido el mismo que se necesit para los hbridos
que se han desarrollado hasta ahora. Las cpsulas han sido ensambladas
despus, y se adsorben sin dar lugar a la agregacin del sistema completo.
El objeto de los hbridos invertidos es la obtencin de un capsosoma ms
complejo, con los liposomas y la nanocpsulas embebidas en el interior de
Figura 4.104 Imagen obtenida mediante CLSM de los hbridos que contienen como
primera capa, adsorbida electrostticamente, las nanocpsulas
polimricas de PMA SH /PVP marcadas con Alexa-Fluor-633 y con otra
capa, posterior a esta y tras dos capas de sacrificio, los liposomas de
50 nm de dimetro marcados con el fluorforo NBD. Estas imgenes
de los hbridos fueron tomadas en disolucin tampn a pH 4.
4.3 Hbridos 285
Figura 4.105 Imagen obtenida mediante Microscopa de contraste (DIC) de hbridos

invertidos, conteniendo en primer lugar los liposomas marcados con el
fluorforo NBD y como capa ms externa, las nanocpsulas
polimricas de PMA SH /PVP marcadas con Alexa-Fluor-633 y todo ello
en disolucin tampn a pH 7 en la etapa de core-shell. Se muestran
formas esfricas y partculas no agregadas.
la cpsula polimrica y es lo que aparentemente se tiene, ya que no se

observan anillos alrededor de la cpsula polimrica sino que la cpsula
queda completamente coloreada de verde o de rojo indicando que a este pH
ambos nano-contenedores estn en el interior del sistema.
Estos resultados iniciales son prometedores y es necesario continuar
investigando estos sistemas ya que son potencialmente tiles en reacciones
en cascada y son un paso ms en la mimetizacin de sistemas celulares .
4.3.3 Microscopa electrnica de transmisin

Una vez se han caracterizado estos sistemas con las dos tcnicas anteriores,
se ha explorado la posibilidad de obtener informacin estructural de estos
sistemas mediante la utilizacin de la microscopa electrnica . La
preparacin de la muestra ya se ha explicado en el captulo de Tcnicas
experimentales, de esta forma, lo primero es agitar la muestra con ayuda de
un vrtex, se depositan gotas de la disolucin en la que se encuentran los
hbridos a un pH 7.4 sobre una plantilla de cobre recubierto de carbono y se
deja secar.
En la Figura 4.106 se observan una cpsula polimrica rodeada de
liposomas que corresponden a las zonas ms oscuras de la imagen y las
nanocpsulas polimricas de 300 nm que corresponden a la zona clara que
Figura 4.106 Imgenes obtenidas por microscopa de transmisin electrnica (TEM)

de una cpsula polimrica con liposomas y nanocpsulas polimricas
alrededor a un pH 7.4. La escala es de 1 m.
rodea la cpsula polimrica y que quedan delimitadas por el polmero que

forma parte de la cpsula y que da el color ms oscuro en la imagen. Se
observa una gran densidad de ambos tipos de partculas alrededor de la
cpsula polimrica, lo que confirma la formacin de estos sistemas y
asegura que los liposomas y las nanocpsulas polimricas estn intactas, sin
modificacin de forma cuando son adsorbidas para formar una capa
adicional en los hbridos. El anlisis de las imgenes proporciona un tamao
del hbrido de 3.8 m, debido principalmente a las partculas de slice
(3 m) sobre las que se adsorben los liposomas de 50 nm y las cpsulas
polimricas de 300 nm.
4.3.4 Ensayos de liberacin
Liberacin de -lactamasa
Para la deteccin de -lactamasa se han desarrollado muchos mtodos pero
el ms inmediato y visual es el que se ha utilizado. Este mtodo se basa en
la reaccin colorimtrica que tiene lugar cuando se pone en contacto el
sustrato, la nitrocefina, y la enzima.
La tcnica utilizada para seguir la reaccin enzimtica es espectroscopa
UV-Visible. El equipo en el que se ha medido la absorbancia se denomina
Nanodrop ND-1000: e s un espectrofotmetro utilizado para medidas donde
la cantidad de muestra necesaria es de 1 L de la disolucin con una
4.3 Hbridos 287
concentracin mxima de 3700 ng/L, no requiere el uso de cubeta y la

medida es rpida, conseguida en un mximo de 10 segundos [415].
El ensayo enzimtico se ha realizado con un solo tipo de liposoma, el
formado por DMPC-DPPC-NBD/PC. Este tipo de liposoma fue el utilizado
en el ensayo enzimtico realizado en capsosomas [334] por lo que es posible
comparar los resultados. Se ha comprobado que estos liposomas son capaces
de atrapar la -lactamasa durante el proceso de formacin de los mismos, y
una vez dentro, la enzima puede ser liberada al aumentar la temperatura por
encima de la temperatura de transicin del lpido que hace que la bicapa
cambie a un estado fluido.
En dichos liposomas se va a incorporar -lactamasa. As pues, se formar
la pelcula de DMPC-DPPC-NBD (40:10:40) y es en el momento de la
disolucin cuando se aadir para que quede atrapada en el interior del
liposoma.
Se prepara una disolucin de 3 mg/ml de -lactamasa en HEPES. Se
aaden 200 L de esta disolucin a la pelcula de lpidos, con un previo
calentamiento a 37C. Si no se disolviera la pelcula seguir calentando sin
sobrepasar la temperatura de 37C, debido a que la enzima puede
desnaturalizarse y no poseer la actividad suficiente para que pueda ser
desarrollado el ensayo enzimtico. Se calienta agua hasta 37C y es en este
bao donde mejora la disolucin de la pelcula. Se disuelve prcticamente
toda la pelcula y entonces se aaden 800 L de disolucin tampn HEPES a
pH 7.4. En este momento se realiza la extrusin con una membrana de
tamao de poro 50 nm. Una vez formados este tipo de liposomas se procede
a formar el hbrido de la forma expuesta en el captulo de Metodologa.
Para los hbridos utilizados en los ensayos de liberacin se ha sustituido
el HF 5 M utilizado para la disolucin del core de slice, por una mezcla
HF/NH 4 F (2:3). Las disoluciones acuosas de esta mezcla presentan pH 5 con
lo que se evita la desnaturalizacin de la enzima encapsulada. Tras el
procedimiento de la formacin del hbrido se obtuvo un volumen final de
20 L.
El procedimiento utilizado en estos ensayos de liberacin fue el
siguiente: se prepar una disolucin de 45 L de tampn de fosfato 0.1 M
(pH 7.4) y 5 L de nitrocefina en PBS 0.1 M (pH 7.4) de concentracin
500 mgmL -1 . A la mezcla anterior se aaden 5 L de la disolucin de
hbridos (corresponde a la lectura en el citmetro de flujo de
1.5610 6 cuentas/L) a pH 7, se preparan tres tubos, dos de control y el

tercero en donde se producir la reaccin y se calientan a temperatura
constante de 37C. Los tubos de control contienen hbridos donde no se ha
encapsulado -lactamasa y tiene color amarillo debido a la disolucin de
nitrocefina, mientras que el tercer tubo contiene hbridos con -lactamasa
encapsulada y adopta una coloracin rojiza, cuando esta es liberada y se
produce la reaccin enzimtica con la nitrocefina dando un producto de
reaccin que presenta un mximo de absorcin a 492 nm.
Las medidas cuantitativas de absorcin en funcin del tiempo a 492 nm
se han realizado en el Nanodrop. El control de liberacin total de -
lactamasa se realiza mediante la adicin del tensioactivo no inico Tritn X -
100 que promueve la degradacin de la membrana del liposoma y por tanto
la liberacin total del material encapsulado. El procedimien to consisti en la
adicin de 2 L de Tritn X-100 al 10% w/w sobre la disolucin de hbridos
manteniendo la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas. Todos los
experimentos se han realizado por triplicado y con muestras recin
preparadas. La reaccin enzimtica ha sido, previamente, ensayada c on
sistemas simples de liposomas y se ha comprobado que no se produce a una
velocidad apreciable a temperatura ambiente.
La Figura 4.107 muestra medidas cuantitativas de la variacin de
absorbancia a 492 nm, con el tiempo, se observa cmo la adicin de Tritn
X-100 produce en dos horas la liberacin total de la enzima encapsulada, la
cada posterior de absorbancia es consecuencia de reacciones posteriores
que tienen lugar a partir del producto de hidrlisis de la nitrocefina. Las
otras dos medidas que se muestran sirven de control y corresponden a una
muestra con enzima encapsulada y sustrato en ausencia de tensioactivo y
otra muestra sin enzima encapsulada.
Adicionalmente podemos decir a partir de estos ensayos que la actividad
de la -lactamasa (M w =31.000 Da), enzima que presenta un punto
isoelctrico de 6.1 no se ve afectada por las capas polimricas aadidas a los
hbridos, tras la adsorcin formadas tras ensambla de los liposomas
cargados con la enzima, en la formacin del capsosoma. Esto indica que la
encapsulacin de la enzima ha sido eficiente y que los liposomas
permanecen intactos en el proceso posterior de fabricacin del hbrido,
puede ser realizado por efecto de la temperatura o por la adicin de un
tensioactivo.
4.3 Hbridos 289
Figura 4.107 Representacin de la absorbancia a 492 nm frente al tiempo que

corresponde a la longitud de onda a la que el producto de la reaccin
enzimtica absorbe. Un control negativo es aquel en el que los
liposomas estn en disolucin con el surfactante pero no poseen en el
interior la enzima y otro control negativo que corresponde a liposomas
con la enzima pero sin la presencia del surfactante. En la centro de la
grfica se observa (a) que es la muestra control de liposomas con
enzima en presencia del sustrato sin Tritn X-100, (b) es la muestra
sin enzima, en presencia del sustrato al que se le aade Tritn X -100 y
(c)la muestra con liposomas con enzima encapsulada que lo liberan al
aadir Tritn X-100 dando lugar al cambio de color a rojo y al
aumento de absorbancia.
Degradacin de cpsulas de 300 nm

Una vez estudiada la eficiencia de los liposomas dentro del hbrido formado
se da paso a los estudios realizados sobre las nanocpsulas adsorbidas sobre
la partcula de slice y que forma la primera capa que la rodea. Para ello s e
ha buscado la posibilidad de degradarlas cuando forman parte del sistema de
hbridos. Si esto es posible, cabe la posibilidad de introducir un frmaco,
enzima,actuando como otro tipo de transporte, distinto a los liposomas
dentro de un mismo sistema.
Las nanocpsulas han sido entrecruzadas con un agente oxidante,

cloramina-T, CAT, con el objeto de conseguir nanocpsulas fcilmente
degradables. El ensayo de degradacin consiste en utilizar un agente
reductor, en este caso, glutationa, GSH [416] , que rompe los enlaces disulfuro
formados tras el entrecruzamiento de las cadenas polimricas de PMA.
El procedimiento utilizado en este caso fue el siguiente: se prepar una
disolucin de GSH 1 M en NaOH 1 M y se tom una alcuota de 1 mL para
diluirla en PBS hasta obtener una concentracin final de 5 mM. En esta
disolucin se aadi 5 L de hbridos y fue calentada a 37C durante
12 horas. Para llevar a cabo un control se prepar una muestra de hbridos
en disolucin tamponada PBS y se calent a la mis ma temperatura y durante
el mismo tiempo.
Las medidas cualitativas de la variacin de la intensidad de fluorescencia
se han realizado en el citmetro de flujo para mostrar la disminucin de la
seal de fluorescencia con el tiempo; Cuando los hbridos entr an en contacto
Figura 4.108 Intensidad de fluorescencia en funcin del tiempo para el proceso de

degradacin de las cpsulas de 300 nm formadas por PMA SH y PVP en
pH 7.4, donde se muestra el mximo de intensidad tras su degradacin
() y los datos de la muestra control que es la disolucin de hbridos
sin la presencia de GSH().
4.3 Hbridos 291
con el agente reductor se produce una reduccin de los enlaces disulfuro y

provoca la desorcin y desaparicin de las cpsulas de 300 nm dando lugar a
un valor mximo de intensidad de fluorescencia que corresponde a la
cantidad total de cadenas polimricas con seal de fluorescencia que ya no
forman parte de las cpsulas porque stas han sido degradadas. Parte de
estas cadenas quedan dentro de la estructura del hbrido, el resto sale y
queda en la disolucin y dando lugar a una mayor seal de fluorescencia.
En la Figura 4.108 se muestra la intensidad de fluorescencia con el
tiempo para el canal de absorcin de la sonda fluorescente AM -633, que es
la que acompaa a las cpsulas de 300 nm. Se ha considerado tiempo cero a
Figura 4.109 Micrografas obtenidas con cmara en blanco y negro de los hbridos
antes y despus de la reaccin con GSH como prueba de la desorcin
de las nanocpsulas del complejo completo hbrido. Imgenes de
arriba fueron tomadas sin excitar la fluorescencia de las nanocpsulas
de 300 nm y las imgenes de abajo se tomaron excitando el
fluorocromo que poseen dichas nanocpsulas.
la medida de las muestras antes de empezar la incubacin a 37C, se

tomaron datos durante el tiempo de incubacin y ya el ltimo punto es
despus de 12 horas a esa temperatura. Se realizaron medidas en el canal en
el que los liposomas absorben y se observ que el valor de la seal de
fluorescencia para ellos no variaba con el tiempo.
Finalmente con ayuda de la microscopa de contraste se ha podido
observar un cambio en la morfologa del hbrido al entrar en contacto con la
GSH, tal y como se muestra en la Figura 4.109.
Se ha observado que la degradacin de las nanocpsulas polimricas ha
ocurrido pero transcurri lentamente debido a que los liposomas han actuado
como una barrera que no deja pasar al agente reductor que acte sobre las
cpsulas. Por esta razn se est trabajando en la degradacin de las mismas
en el sistema pero para el caso de los hbridos invertidos donde los
liposomas se sitan antes que las nanocpsulas y as desarrollarse la
degradacin como se espera y como se desarroll en estudios
anteriores [415][413][412][405].
4.3 Hbridos 293
5 CONCLUSIONES
296 Conclusiones
La principal finalidad de este trabajo fue poner a punto un mtodo de

fabricacin de liposomas unilamelares monodispersos y desarrollar el
proceso de recubrimiento de los mismos mediante polielectrolitos de
diferente naturaleza. El estudio de los parmetros que afectan a su
estabilidad y los ensayos realizados posteriormente para probar su
funcionalidad nos ha llevado a conseguir unos sistemas con potenciales
aplicaciones en liberacin de frmacos y enzimas.
El mtodo elegido para la fabricacin de los liposomas fue la extrusin,
con el fin de obtener liposomas unilamelares y suficientemente
monodispersos. El tamao de poro de la membrana utilizada fue
principalmente de 100 nm, las primeras muestras fueron obtenidas con el
mini-extrusor manual, pero la necesidad de mayores volmenes para un
estudio detallado de estos sistemas condujo a la utilizacin de un extrusor
de alta presin con mayor capacidad (10 mL). Con este mtodo la
polidispersidad de las muestras es mucho menor y se obtienen valores de
PDI < 0.1 despus de alrededor de 20 extrusiones para cada muestra. La
optimizacin fue seguida a travs de la tcnica de dispersin de luz,
observndose que a medida que aumentaba el nmero de extrusiones,
disminua el PDI hasta llegar a un valor constante.
Esencialmente se utilizaron liposomas catinicos formados por mezclas
del fosfolpido DOPC y el surfactante bicatenario catinico DODAB. La
densidad de carga superficial del liposoma viene determinada por el
contenido de DODAB y por ello se estudiaron distintas composiciones,
observndose que a partir de un porcentaje relativamente pequeo de
DODAB, alrededor de un 15%, el valor del potencial zeta se muestra
invariable y estable a pesar de seguir aumentando el porcentaje de
surfactante dentro del sistema. Se ha optimizado la fabricacin de este tipo
de liposomas y caracterizado los distintos sistemas en cuanto a sus
propiedades y estabilidad, adicionalmente se ha utilizado un mtodo de
determinacin de contenido total en fsforo para determinar cantidades
lipdicas totales en disolucin y por tanto prdidas en los procesos de
extrusin.
El mtodo de obtencin de los liposomas, una vez optimizado se extendi
para el estudio de liposomas con otras caractersticas. Liposomas formados
por lpidos zwiterinicos saturados como el DPPC y el DMPC, lpidos
zwiterinicos insaturados como el DOPC, mezcla de lpidos saturados para
formar liposomas negativos como DMPC:DPPC, DPPC:DPPS:DMPC,
Conclusiones 297
mezcla de lpidos insaturados para formar liposomas negativos como DOPC:

DOPS, liposomas con lpidos modificados con cadenas de polmero como
DMPC:DMPE_PEG de diferente peso molecular.
En el caso de liposomas zwiterinicos se estudi cmo afectaba el pH al
potencial zeta y al tamao para buscar la situacin ms estable para estos
sistemas. Para liposomas formados por lpidos modificados con cadenas de
PEG tambin se estudi el efecto del pH pero principalmente el efecto de la
temperatura en el tamao de los mismos. Estos agregados lipdicos
pegilados son una prometedera clase de membranas para la liberacin de
frmacos, el PEG estabiliza al liposoma y prolonga el tiempo de residencia
en la circulacin sangunea.
Tras caracterizar los liposomas estudiados se realiz un estudio del
recubrimiento capa a capa de los mismos utilizando distintas parejas de
polielectrolitos. Conviene sealar que los estudios realizados confirman el
aumento de estabilidad de los liposomas tras el recubrimiento, incluso con
tan solo una capa.
El primer sistema estudiado fue el recubrimiento capa a capa de las
plantillas de liposomas catinicos con el par de polielectrolitos PSS/PAH. El
nmero de capas mximas fueron ocho y se estudiaron cada uno de los
sistemas intermedios mediante dispersin de luz y movilidad electrofortica.
El mtodo puesto a punto para el recubrimiento del liposoma se basa en
eliminar el exceso del complejo inter-polielectrolito que se forma mediante
ciclos de centrifugacin. Su viabilidad se confirm con medidas de
dispersin de luz que indican que la prdida de liposomas en los procesos de
centrifugado es mnima, que no se observa agregacin y por tanto la muestra
se mantiene monodispersa, con el correspondiente auento de tamao debido
a las sucesivas capas adsorbidas.
Los datos de dispersin de luz indican que el crecimiento de las capas es
esencialmente lineal y alternado, de forma que para las capas del
polielectrolito aninico, PSS, se obtuvo un espesor promedio de 10 nm y
para el catinico, PAH, un poco menor del orden de 4 nm. La inversin de
carga, obtenida mediante la tcnica de movilidad electrofortica, indica la
eficacia del proceso del recubrimiento y permite determinar las cantidades
necesarias de polielectrolitos para el recubrimiento total.
Del estudio de la relacin potencial zeta/tamao, en trminos del
potencial de Velegol-Twar se desprende que todas las muestras preparadas
298 Conclusiones
estn dentro del intervalo de estabilidad. Tanto los sistemas plantilla,

liposoma formados por DOPC/DODAB sin recubrimiento, como los
sistemas recubiertos, incluso con tan solo una capa. La adsorcin de
partculas de ltex sobre la superficie del liposoma, formando estructuras
tipo coloidosoma mejora la estabilidad de los sistemas con valores de
potencial zeta cercanos a los valores que se obtienen para las partculas en
disolucin.
El segundo sistema ms estudiado es el formado por el par de
polielectrolitos dependientes del pH, PGA/PLL que fueron utilizados para
recubrir liposomas formados por DOPC dando lugar a liposomas con
carcter dependiente del pH, y DOPC/DODAB cuya densidad de carga es
independiente del pH mediante la tcnica capa a capa. Para el sistema con el
liposoma formado por tan solo DOPC, se hicieron dos estudios paralelos, en
uno de ellos se utiliz como primera capa PEI, que mejora la adsorcin de
las posteriores capas de PGA/PLL para ambos sistemas. Los datos de
dispersin, en los tres casos, indican la misma tendencia en el crecimiento
de las capas que recubren los liposomas, pero difiere en los valores
obtenidos para los espesores de las capas. Para el sistema formado por el
liposoma de DOPC/DODAB, el recubrimiento con el polielectrolito
aninico, PGA, dio lugar a un espesor promedio de 12 nm y para el
catinico, PLL, de 4 nm. En el sistema formado por el liposoma de DOPC,
el espesor para todas las capas, sea PEI, PGA o PLL es del orden de 10 nm.
El sistema de liposomas de DOPC/DODAB fue caracterizado mediante
otras tcnicas de dispersin, en este caso son SANS y SAXS que desde un
punto de vista fsico, dieron informacin complementaria a lo aportado por
las tcnicas de dispersin a ngulos altos. Con ambas tcnicas se determin
el espesor de la bicapa del lipososoma que corresponde a valores de 4 nm y
se confirm de nuevo el tamao obtenido por las otras tcnicas. Para la
determinacin de estos datos se aplic el modelo de esfera hueca y la ley de
Guinier a bajos ngulos lo que dio lugar a una concordancia en los
resultados.
El estudio de estos sistemas formados por DOPC/DODAB y por DOPC
fue ampliado mediante dos tcnicas de superficie, la balanza de cuarzo y
elipsometra de forma que en este momento se comenz a tratar con
sistemas planos. El objeto de este estudio es obtener ms informacin sobre
la adsorcin de los liposomas sobre sustratos planos; a su vez determinar el
porcentaje de agua que queda atrapado en la bicapa lipdica y en las
Conclusiones 299
posteriores capas de polielectrolitos adsorbidos sobre dicha bicapa. Se

observ que la adsorcin y formacin de la bicapa lipdica sobre el sustrato
plano depende de la naturaleza del mismo; mientras que para sustratos de
oro la formacin de la bicapa es ms rpida, para el silicio es mucho ms
lenta. Para la formacin de la parte polimrica de la multicapa, existe un
patrn de adsorcin con un efecto par-impar ms o menos acusado pero
observado con ambas tcnicas y para los dos tipos de sistemas. Este hecho
nos permite determinar la cantidad de agua absorbida en ambos casos y que
corresponde a valores entre el 50-90 % a lo largo de las distintas fases del
crecimiento estudiadas para el caso del sistema formado por PSS/PAH y de
un 30-50% para el caso de los biopolmeros PGA/PLL. En el primer caso, la
cantidad de agua adsorbida decrece al aumentar las capas, lo que se atribuye
a una compactacin de las capas, algo que no ocurre para el segundo sistema
que mantiene el mismo % durante todas las capas adsorbidas.
El estudio desarrollado para el microgel de carcter catinico
dependiente del pH y de la temperatura, p-(NIPAM)-co-VI comenz desde
la sntesis del mismo en el laboratorio hasta la adsorcin alternada mediante
la tcnica capa a capa del par de polielectrolitos dependientes del pH,
PGA/PLL, tambin utilizado en los liposomas y adems el par
PSS/PDADMAC. La eleccin de esta nueva plantilla y la obtencin de
resultados relevantes confirman la confianza puesta en la tcnica capa a
capa utilizada en todos los sitemas. El uso del microgel permite superar
algunas limitaciones que se pueden presentar con los liposomas referidas a
estabilidad.
Para este caso, microgeles con recubrimientos, de nuevo las tcnicas de
dispersin de luz y potencial zeta confirman la adsorcin de los
polielectrolitos sobre el microgel de carcter catinico y se observa el efecto
par-impar en el total de las capas adsorbidas sobre el mismo.
El posterior desarrollo de estructuras ms complejas en las que los
liposomas forman parte jugando el papel de nano-reactores nos ha ampliado
las posibilidades en cuanto a sus aplicaciones. La formacin de estructuras
ms complejas comienza con el recubrimiento de liposomas con
nanopartculas de poliestireno o ltex, el recubrimiento de partculas de
ltex con liposomas, el recubrimiento de liposomas con homopolmeros,
formacin de hbridos en los que los liposomas y nanocpsulas polimricas
son capas que recubren la partcula de slice. Los hbridos, un sistema
derivado de los capsosomas, fueron estructurados con una primera capa de
300 Conclusiones
nanopartculas polimricas, capas de polmeros intermedias para

posteriormente adsorber los liposomas y finalmente recubrir el conjunto con
bicapas de PMA SH/PVP para obtener una microcpsula con diferentes
nanotransportadores en su interior. Los ensayos desarrollados para
comprobar la funcionalizacin de estos sistemas fueron la encapsulacin de
un enzima en el interior del liposoma y la posterior degradacin de la
nanocpsula. A travs de estos ensayos se observ el potencial que poseen
para futuras aplicaciones.
6 CONCLUSIONS
302 Conclusions
The main purpose of this work was the developement of a method of

producing monodisperse unilamellar liposomes and to coat them using a
newly developped coating process using polyelectrolytes of different nature.
The study of its stability and the later trials to test their functionality has led
us to get a system with potential applications in drug delivery.
The method chosen for the fabrication of liposomes was extrusion
technique for obtaining unilamellar and sufficiently monodispersed
liposomes. The pore size of the membrane used was mainly 100 nm, the first
samples were obtained with the mini-extruder, but the larger volumes
needed for a detailed study of these systems led to the use of a high pressure
extruder with greater capacity (10 mL). With this method the polydispersity
index (PDI) of the samples got was much lower with PDI < 0.1 after about
20 extrusions for each sample. The optimization was followed by dispersion
light scattering, showing that when we increased the number of extrusions,
the PDI decreased until it reached a constant value.
Cationic liposomes were used essentially and they consist in mixtures of
phospholipid 1,2-dioleoyl-glycero-phophocholine, DOPC, and the cationic
surfactant dioctadecyldimethylammonium bromide, DODAB. The surface
charge density of the liposome is determined by the content of DODAB .
Therefore different compositions were studied, showing that after a relative
small percentage of DODAB, about 15%, the value of the zeta potential is
shown unchanged and stable despite the further increase in the percentage of
surfactant in the system. This system was optimized and characterized for
the different techniques and their stability properties were verified.
Additionally we used a method to calculate the total phosphorus content to
estimate the total lipid quantities in solution and thus the losses in the
extrusion process.
The method of production of the liposomes was extended to other
systems. Liposomes composed of saturated lipids as DPPC and DMPC,
zwitterionic lipid such as DOPC, saturated lipid mixture to form liposomes
negative as DMPC: DPPC, DPPC: DPPS: DMPC, unsaturated lipid mixture
to form liposomes negative as DOPC: DOPS, lipid modified with polymer
chains as DMPC: DMPE_PEG of different molecular weight. All of them
showed in Figura 3.1.
Zwitterionic liposomes were studied to find the most stable situation for
these systems, so we studied how pH affected zeta potential and size. For
lipid-modified liposomes formed with poly-ethyleneglycol, PEG chains we
Conclusions 303
also studied both the effects of temperature (mainly) and pH on liposomes

size. These aggregates are a promissing pegylated lipid class of membranes
for drug delivery; PEG chains stabilize the liposomes and it prolongs the
residence time of the liposomes in the bloodstream.
After characterizing the studied liposomes, a study of the coating layer
by-layer browsed with different pairs of polyelectrolytes. This confirmed
the increased stability of the liposomes after coating, even with just one
layer.
Cationic liposomes, DOPC:DODAB was the first system studied. This
system was used as a templates for covering the liposomes with
polyelectrolytes poly(styrensulfonate) sodium salt / poly(diallyldimethyl
ammonium), PSS/PAH. The maximum number of studied layers by light
scattering and electrophoretic mobility was eight. The developped method
for coating the liposome was based on eliminating the excess of the inter-
polyelectrolyte complex formed by centrifugation cycles. Their viability
was confirmed by light scattering measurements which indicated that the
loss of liposomes in the centrifuge process was minimal. There was not
observed aggregation, therefore the sample remains monodisperse with a
corresponding increase in size due to successive adsorbed layers.
The light scattering data indicated that the growth of the layers was
essentially linear and alternated. We obtained an average thickness of 10 nm
for the anionic polyelectrolyte layers (PSS), and for the cationic
polyelectrolyte poly-allylamine hydrochloride (PAH) slightly less than 4 nm
thicknesses. The charge reversal obtained using the electrophoretic mobility
technique was indicatived the coating process efficacy and it made possible
to determine the quantities of the polyelectrolytes needed.
The study of the relationship between zeta potential and size, in terms of
the Twar Velegol potential indicated that all the samples prepared were
within the stability range. Both systems (like templates), (1) liposome
formed by DOPC and (2) DOPC/DODAB liposomes uncoated, it was
studied some coated systems with different polyelectrolyte. The adsorption
of latex particles onto the surface of the liposome formed structures like
coloidosomes, with stability enhancement.
The second most important system that we studied was the pair of
polyelectrolytes which depended on pH, poly(glutamic acid / poly-L-lisine),
PGA / PLL. For DOPC liposomes were made two studies, in one of them the
304 Conclusions
first layer was poly(ethyleneimine), PEI, which enhances the adsorption of

subsequent layers of PGA / PLL and the other one was with PGA/PLL
system. Dispersion data showed the same layer grown in all three cases
cases but the layer thickness values were diferents. We covered the
DOPC:DODAB liposomes system with the anionic polyelectrolyte, PGA,
coating which resulted in an average thickness of 12 nm and with the second
layer, cationic polyelectrolyte, PLL, the thickness resulted of 4 nm. In the
system formed by DOPC liposomes, the thickness for all the layers, either
PEI or PLL PGA was approximately 10 nm.
The DOPC/DODAB liposomes system was characterized by other
scattering techniques, in this case SANS and SAXS that from a point of
view general, they gave complementary information provided by other
dispersion techniques. With both techniques the liposome bilayer thickness
was determined, which resulted values of 4 nm. For the determination of
these data we applied the hollow sphere model and Guinier Law at low
angles which resulted in an agreement between the results.
The study of these systems formed by DOPC:DODAB and DOPC was
expanded using two surface tehniques, (1) quartz balance (QCM) and (2)
ellipsometry so that in this moment the study was on planar systems. The
purpose of this study was to obtain more information on the adsorption of
the liposomes on planar substrates, and determine the percentage of water
trapped in the lipid bilayer. It was observed that the adsorption and the lipid
bilayer formation on the substrate depended on sustratenature. For the gold
substrates, the bilayer formation was faster while for the silicon substrate
was much slower. The polymer multilayer adsorption showed a more or less
pronounced odd-even effect. This fact allowed us to determine the amount
of water absorbed in both cases and corresponded to the 50-90% growth
values studied for the case of the system formed by the polyelectrolytes
PSS/PAH and of 30-50 % in the case of biopolymers PGA/PLL system. In
the first case, the amount of water adsorbed decreased as the layers
increased, which is attributable to layers compaction, which is not true for
the second system that maintains the same % during all adsorbed layers.
We developed the study of pH and temperature for a cationic microgel ,
pNIPAm-co-(1-vinyl-imidazole), p-(NIPAM)-co-VI. First, the microgel was
made in the laboratory and we characterized it by DLS and by Zeta Potential
technique. Onto microgel were adsorbed polyelectrolytes by the Layer-by-
Layer technique. These polyelectrolites were PGA/PLL and
Conclusions 305
PSS/PDADMAC. The relevant results showed with this new template

confirmed the realibility in the Layer-by layer-technique used in all systems.
For this case, microgels, the light scattering techniques and zeta potential
again confirmed the adsorption of the polyelectrolyte onto the cationic
microgel and the effect observed was an odd-even pattern in total adsorbed
layers. Stability studies showed that this system is very stable along time
and thus it is a good candidate like a drug delivery system.
The further development of complex structures of which the liposomes
were part, playing the role of nano-reactors, has expanded the possibilities
in their applications. The formation of more complex structures started with:
(1) liposomes coated with latex nanoparticles, (2) latex particles coated with
liposomes, (3) liposomes coated with homopolymers, (4) hybrid formation
in which the liposomes and (5) nanocapsules coated polymer layers. The
hybrid system derivated from the capsosomes and was structured with a first
layer of polymeric nanoparticles, intermediate polymer layers and finally
adsorbed liposomes coated all of them with PMAS SH/PVP bilayers to obtain
a microcapsule with different internal nanocarriers. The tests developed to
ascertain the functionalization of these systems were the encapsulation of an
enzyme into the liposome and subsequent degradation of the nanocapsule.
Through these experiments we observed that it posseses the potential for
future applications.
306 Conclusions
7 SUMMARY
308 Summary
In the last few years, the development of nanoscience and nanote chnology
has attracted great interest in different fields. Nanoscience is the science
that studies the systems that have at least one of their dimensions of
nanometer-size. The study, design, creation, synthesis, manipulation and
application of materials, devices and functional systems through control of
matter at the nanoscale is known as Nanotechnology. It is frequently
considered that the birth of Nanoscience and Nanotechnology goes back to a
sentence in a famous conference by Richard Feinman in 1959: There is
plenty of room at the bottom. In this conference he suggested the possibility
of manufacturing products based on the rearrangement of atoms and
molecules. As soon as scientist has begun to manipulate matter at a small
scale, new phenomena and properties were founded and nanotechnologiclal
methods are used to create inexpensive systems with unique properties. In
this way, materials, devices and systems, whose new properties make them
useful at physical, chemical and biological levels, are being studied and
developed. In 1980 Eric Drexler proposed the concept of "molecular
nanotechnology", which focuses on the construction of nanomachines made
of atoms that are able to build other molecular components themselves.
With the aim of using nanomaterials as carriers of molecules, various
types of nanomaterials have been developed such as nanoparticles or carbon
nanotubes; and different types of biomaterials such as dendrimers,
liposomes or biodegradable polymers. More recently the design of
"nanocapsules" has been the object of intense activity. They are hollow
nanoscale objects with a roughly spherical shape able to trap small
quantities of drugs, enzymes and other catalysts in their interior. Two
different regions can be distinguished: the cavity and the coating, which is
frequently made of polyelectrolyte multilayers. The best known technique to
obtain these systems is by the Layer-by-layer (LbL) or electrostatic self-
assembly technique.
The LbL technique, which is based on the sequential adsorption of
interacting polymers on a template, has been used in the preparation of
functional and highly tailored thin films. This technique is simple,
inexpensive and extremely versatile; thus a large number of materials and
functional groups can be incorporated into the film structure. In 1998 the
LbL technique was applied in the preparation of polymer capsules using
colloidal templates. Since then, the interest in LbL-assembled capsules has
grown, largely because of the ability to readily tailor their properties (e.g.,
size, composition, porosity, stability, surface functionality, colloidal
Summary 309
stability) for various biological applications, including sensing, diagnostics

and drug delivery.
Obtaining nanocapsules by technical layer-by-layer has advantages over
other known techniques, such as the technique of self-assembled monolayers
(SAM) or Langmuir-Blodgett, since it is a more simpler and less expensive
and allows the obtaining stable complex structures with nanoscale contro l of
structure and composition.
LbL technique consists in adsorbing species with multiple charges,
generally polyelectrolyte, on macroscopic charged surfaces, so that
adsorption of each layer causes the inversion of surface charge, finally
obtaining a multilayer complex. In this way the internal space for med
provides the place in which various molecules may be encapsulated and
protected from the environment in which they are found.
In general steps, for the production of nanocapsules, charged templates
used, which may be organic or inorganic, and on its surface adsorbing layers
are oppositely charged species, such as polyelectrolyte, and finally the
template is being eliminated.
The polyelectrolytes are polymers formed by groups of hydrocarbon
monomers, resulting in a hydrophobic chain to which they ionic groups with
highly charged are attached.The vast majority have been assembled by the
alternate deposition of synthetic polycations and polyanions, including
poly(ethyleneimine) (PEI), poly(allylamine hydrochloride) (PAH),
poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDADMAC), poly(sodium-4-
styrenesulfonate) (PSS) and poly(acrylic acid) (PAA). Electrostatic binding
remains the main driving force used in multilayer formation, but capsules
can also be prepared from films held together by disulfide linkages, click
chemistry, and hybridization of complementary DNA strands. In addition, as
the interest in the use of the capsules as delivery vehicles grows, capsules
composed of polypeptides such as poly(L-Lysine), poly(L-glutamic acid),
poly(L-arginine) and poly(L-histidine) and carbohydrates , including
chitosan, dextran and their derivatives, have been used.
Depending on the type of template used, the charging process of the
molecule that is to encapsulate varies and could be performed in the final
step with the dissolution of the template by a pH change, the polarity of the
solvent, ionic strength or temperature change, which implies a change in
permeability of the multilayer. In some cases the molecules to be
310 Summary
encapsulated mixed with the colloid particle precursors at the time of its
synthesis. Furthermore, the layers of the nanocapsule obtained can be
modified by the addition of metal, fluorescent or magnetic nanoparticles,
thereby important functions are introduced in the nanocapsule, including the
method of triggering the release of its content.
One of the materials used as carriers of different molecules , and as
templates for building nanocpsulas, are liposomes. Liposomes were
discovered in 1965 by Alec D. Bangham and coworkers, who showed that
certain lipids may form artificial membrane structures when they are in the
presence of excess water. These vesicular highly organized structures are
constituted by a wall formed by lipid bilayers (lamella) and an aqueous core.
Usually phospholipids are used for their preparation.
Liposomes can be obtained from different methods. Depending on the
method used, the liposomes obtained present different characteristics such
as size, polydispersity, lamellarity, etc. To prepare the liposomes, the first
step is to dissolve the lipids in an organic solvent, usually chloroform, so as
to obtain a solution of the desired lipid. An aliquot of this solution was
taken, usually not exceeding 1 mL, and the solvent was evaporated using a
nitrogen stream. Afterwards the lipid film was hydrated by adding water and
stirring above the phase transition temperature of the lipid used. For this
hydration we have used a buffer or saline solution that spontaneously had to
relatively large and heterogeneous multilamellar vesicles (MLV). Using this
suspension of multilamellar vesicles and applying ultrasound, small
unilamellar liposomes were obtained.
Later on the suspension of multilamellar vesicles was extruded by
passing it through a polycarbonate membrane filter with a pore size well
defined. In this way, the diameter and homogeneity of the liposomes
obtained was controlled in a precise way.
In this work we have shown, by carrying out different studies, which
liposomes containing on its surface polymer chains can be obtained by
hydration-extrusion method. For its characterization, we performed
measurements of dynamic light scattering; this technique has given us the
information required for the liposomes
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9 ANEXOS
338 Anexos
9.1 ABREVIATURAS
ALV: Laser Vertriebsgesellschaft mbH
BM(PEG) 2 : Bis-maleimida poli-etilenglicol
CLSM: Microscopa Confocal de fluorescencia
Crio-SEM: crio- Microscopa electrnica de emisin
Crio-TEM: crio- Microscopa electrnica de transmisin
DEX-FITC: Dextrano con fluorescena de isotiocianato
DIC: Microscopa de contraste interdiferencial
DLS: Dispersin de luz dinmica
DMPC: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina
DODAB: Bromuro de dioctadecil dimetil amonio
DOPC: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
DOPS: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-serina (en sal sdica)
DOX: Doxorubicina
DPPC: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-Lcolina-serina
DPPS: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina
DSC: Calorimetra diferencial
HEPES: cido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfnico
GSH: Glutationa
LUV: Vesculas unilamelares grandes
MES:cido 2-(N-morfolino)etano sulfnico
MOPS: cido 3-morfolinopropano-1-sulfnico
NaCl: Cloruro sdico
NBD-PC: 1- Me encanta empezar los lunes desendote un feliz
damiristoil-2-(12-((7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4il(amino)lauroil)-
sn-glicero-3-fosfocolina.
PAH: Poli(alilamina)
PBS: Disolucin salina tamponada de fosfato de sodio y de potasio.
PDADMAC: cloruro de poli(dialil-dimetilamonio)
PEI: polietilenamina
PGA: cido poliglutmico
9.1 Abreviaturas 339
PLL: Poli(lisina)
PMA: cido polimetacrlico
PMASH : cido polimetacrlico con grupos tioles
PMAc : cido polimetacrlico con cadenas de colesterol.
p-(NIPAM): Poli(N-isopropilacrilamida)
p-(NIPAM)-COOH: Poli(N-isopropilacrilamida), con cadenas de cido
carboxlico en posiciones terminales.
p-(NIPAM)-co-VI: Poli(N-isopropilacrilamida) con vinil amidizol.
PSS: Poli(4-estirensulfonato) de sodio
PVP: poli vinil pirrolidona
SUV: Vesculas unilamelares pequeas
QCM: Balanza de cuarzo
SANS: Dispersin de rayos X de bajo ngulo
SAXS: Dispersin de neutrones de bajo ngulo
TEM: Microscopa electrnica de transmisin
T m : Temperatura de transicin
TRIS: Tris(hidroximetil)amino-metano
TRITON-X: Poli(etilenglicol) p(1,1-3,3-tetrametil) fenil ter
UV-Vis: Ultravioleta-visible
340 Anexos
9.2 LISTADO DE FIGURAS

Figura 1.1 Formacin de materiales core-shell y microcpsulas por ensamblaje
electrosttico capa a capa de polielectrolitos [29, 30] . Una partcula de
slice es recubierta por interacciones eletrostticas con polielectrolitos
y posteriormente se elimina la partcula plantilla dando lugar a una
cpsula polimrica. ......................................................................... 17
Figura 1.2 Clasificacin estructural de los lpidos [3] . Se distinguen lpidos de
almacenamiento de energa como los triglicridos y los lpidos de
membrana como los fosfolpidos y glicolpidos. .............................. 18
Figura 1.3 Estructura tpica de la fosfocolina formada por una cabeza hidrfila y
una cola hidrfoba........................................................................... 19
Figura 1.4 Fases del lpido en funcin de la temperatura. El cambio de fase se
debe a un desorden de las cadenas hidrocarbonadas que forman parte
de los lpidos debido a un cambio de temperatura [25, 26] . ................... 20
Figura 1.5 Determinacin del rea ptimo de las cabezas polares, a 0 , mediante el
balance entre las fuerzas interfaciales atractivas y las fuerzas
repulsivas entre las cabezas polares. ................................................ 27
Figura 1.6 a) Representacin esquemtica de una bicapa de lpidos. b)
Representacin de una vescula unilamelar [9] formada por una bicapa
de lpidos. c) Representacin de una micela formada por una
monocapa de fosfolpidos. ............................................................... 31
Figura 1.7 Variables que interviene en la aproximacin de Derjaguin para dos
partculas prximas de radio R A y R B , respectivamente. ................... 37
Figura 1.8 Diferentes tipos de vesculas: SUV o vesculas unilamelares pequeas,
LUV o vesculas unilamelares grandes y MLV [27, 28] o vesculas
multilamelares. ............................................................................... 41
Figura 1.9 Procedimientos para la obtencin de liposomas. El mtodo de
dispersin simple para obtener MLV. A partir de ellos, el mtodo de
extrusin para obtener SUV o el mtodo de sonicacin-
homogeneizacin para obtener LUV [14] . ........................................... 44
Figura 1.10 Mecanismo de formacin de un microgel cuya temperatura consoluta
inferior, LCST, indica si ha absorbido agua mostrando una estructura
hinchada o no denominndose microgel colapsado [16] . ..................... 51
Figura 1.11 Diagrama de fases para el comportamiento de un microgel ideal con:
a) temperatura consoluta superior o mxima a la que el microgel se
calienta para que se disuelva (UCST) y b) temperatura cons oluta
inferior o mnima a la que hay que calentar para que el microgel no
precipite (LCST) [12] . ........................................................................ 53
Figura 1.12 Diagrama de fases de p-(NIPAM) formado por dos regiones [12] . ....... 54
9.2 Listado de figuras 341
Figura 1.13 Esquema de la respuesta estimulada de los microgeles. Cuando la

temperatura es mayor que VPPT o el pH es mayor que el pk a del
microgel, ste reduce su volumen, es decir, se colapsa. .................... 55
Figura 1.14 Clasificacin de los polielectrolitos atendiendo a su carga: a)
policationes, b) polianiones y c) anfolitos [7] . .................................... 58
Figura 1.15 Modelo de capas difusas: Las multicapas estn representadas por un
perfil de concentracin de carcter sinusoidal (lneas negras) elegido
arbitrariamente. Para un sustrato con carga positiva, las curvas ms
oscuras corresponden a las capas de polianin y las curvas ms claras
corresponden a las capas de policatin. ........................................... 63
Figura 1.16 Tcnica LbL.a) Sobre una partcula se deposita un polielectrolito por
interaccin electrosttica. (b) El polielectrolito de carga contraria es
depositado sobre la primera capa formada. (c) El exceso de materia no
adsorbida se elimina mediante ciclos de centrifugacin antes del
siguiente ciclo de adsorcin. (d) Repeticin de los pasos llevados en
(a) y en (b) por la exposicin repetitiva a polielectrolitos de carga
alterna dando lugar a multicapas adsorbidas sobre la partcula [29, 31] . 65
Figura 1.17 Ensamblaje de los capsosomas PMA c /(DMPC/DPPC)/PMA c /
PVP/(PMA SH /PVP) x . Transformacin de los enlaces de hidrgeno en
puentes disulfuro por cambio de pH [13] . ........................................... 68
Figura 1.18 Estructura que adopta el polmero funcionalizado PMA c cuando se
adsorbe sobre un liposoma [11] . ......................................................... 69
Figura 1.19 Comparacin de una clula con la estructura de un capsosoma. i)
Multicapas polimricas que dan lugar a la membrana biolgicamente
biodegradable, i) Incorporacin de lisosomas para la degradacin de
ADN y iii) Liposomas cargados con un frmaco hidrofbico en su
interior [17] . ...................................................................................... 71
Figura 1.20 Hbridos formados por cpsulas polimricas de 300 nm y liposomas de
50 nm y ambos recubiertos por cuatro bicapas de polmeros. ........... 73
Figura 1.21 Obtencin de una cpsula polimrica: LbL aplicada sobre una
partcula de slice utilizando el par de polielectrolitos PMA SH /PVP y
eliminacin de la partcula con tratamiento de cido y lavado posteri or
para mantenerlas a pH fisiolgico [15] . .............................................. 74
Figura 2.1 Fenmeno de la dispersin. El plano de la dispersin viene dado por la
radiacin incidente (I i ) y la radiacin dispersada (I d ), y ambas
relacionadas mediante el ngulo de dispersin . La intensidad
dispersada por el volumen de dispersin de la muestra vara con el
tiempo y es esta fluctuacin la que llega al detector. ........................ 82
Figura 2.2 (a) Esquema del equipo de dispersin ALV-5003. (b) Foto del mismo.
....................................................................................................... 88
Figura 2.3 Equipo de dispersin de rayos X (SAXS) localizado en la universidad
de Aachen (Alemania), RWTH. ....................................................... 92
Figura 2.4 Perfil de densidades obtenido segn la tcnica SAXS. ..................... 93
Figura 2.5 Curva de la intensidad dispersada en funcin de q en la que se
distinguen las regiones marcadas y de las cuales se van a estudiar las
de mayor inters para nuestros sistemas: Guinier y Porod. ............... 94
342 Anexos
Figura 2.6 Clasificacin segn Kratky cuando se representa el producto del

cuadrado del vector de onda por la intensidad dispersada con respecto
al vector de onda. ............................................................................ 96
Figura 2.7 Esquema de un equipo de SANS en el reactor de S aclay. El vector de
onda es de 1.2 nm y la distancia de la muestra al detector de 5 m para
la obtencin de valores de vectores de onda bajos. El detector es un
multidetector de He en 2D y el colimador situado antes de la muestra
es controlado al cambiar la posicin muestra-detector. .................. 100
Figura 2.8 (a) Componentes principales de un citmetro de flujo formado
principalmente por una serie de detectores, espejos reflectores y la
fuente de luz lser. Los sistemas de inyeccin de mue stra deben ser
isovolumtricos que permita una velocidad constante. (b) Datos
obtenidos del anlisis de una muestra [20] . ....................................... 102
Figura 2.9 Fotografa del citmetro de flujo utilizado y esquema de los
componentes principales. Todas las medidas se realizaron a
temperatura ambiente. [10] ............................................................... 103
Figura 2.10 Distorsin del campo elctrico aplicado sobre una partcula coloidal.
a) para dobles capas finas, D a 1 o a 1, existe una mayor
proporcin de iones de electrolito que experimentan un campo
distorsionado. b) para dobles capas gruesas, D a 1 o a 1, existe
una mayor proporcin de iones de polieelctroito que experime ntan el
campo original sin distorsionar [19] . ................................................ 105
Figura 2.11 Componentes del equipo empleado para medir el potencial zeta. .... 107
Figura 2.12 Clula de medida y esquema del proceso de medida por LDV.
Representacin del movimiento de los iones hacia los electrodos en la
clula cuando se aplica un potencial, donde la velocidad de los iones
es la velocidad electrofortica. ...................................................... 108
Figura 2.13 Principios bsicos de la polarizacin por fluorescencia. Si la sonda
tiene su orientacin restringida debido a su localizacin provocar que
la luz emitida sea siempre paralela a la luz de excitacin. .............. 111
Figura 2.14 (a) Esquema del funcionamiento de un fluormetro [4] . .................... 113
Figura 2.15 Esquema de funcionamiento de un microscopio de contraste
interdiferencial. Utiliza filtros de polarizacin, y prismas Wollaston
para separar los caminos de luz que evita cualquier tipo de protocolo
de preparacin de la muestra [5] . ..................................................... 115
Figura 2.16 Principios de un microscopio confocal. Para obtener una imagen
completa, el punto de luz es movido a travs de la muestra con ayuda
de espejos dicroicos. La luz emitida/reflejada pasa a travs de la
apertura pinhole y es transformado en seal elctrica por un
fotomultiplicador para poder ser ledo en el ordenador [8] . .............. 116
Figura 2.17 Principales componentes de un microscopio de transmisin. Se
observa la fuente de electrones, el condensador, el objetivo, el
magnificador y la cmara [2] . .......................................................... 119
Figura 2.18 Fotografa del microscopio electrnico JEOL JEM -1230 con una
capacidad de operacin de hasta 120kV. Tiene un bioescner con
cmara. La muestra se coloca en un portamuestras que debe ser
criogenizado y para lo que se dispone de una cmara de

criogenizacin. .............................................................................. 121
Figura 2.19 (a) Equipo de crio-SEM en una columna GEMINI 4000 con una
resolucin de 1nm a 15 mV y una columna CANION para FIB con una
resolucin de 2.5nm a 30 mV. GIS es la estructura por la que se aade
el gas para el recubrimiento para medidas con FIB. A travs del
controlador se obtienen imgenes para ambas tcnicas. (b)
Representacin de cmo estn dispuestas la columna SEM y FIB, el
ngulo de separacin de una con respecto a la otra est establecido en
54 [23, 24] . ....................................................................................... 123
Figura 2.20 Preparacin de muestras para crio-SEM y FIB. 1. Portamuestras tipo
WSH-FLAT con anclajes para la fijar la muestra, con un volumen
mnimo es de 1 l de muestra que se ensambla en el dispositivo de
transferencia. 2. Anclaje del portamuestras sobre el dispositivo de
transferencia en la cmara de vaco. 3. Recubrimiento de platino sobre
la muestra con un espesor mnimo de 5 nm para aumentar la
conductividad de la muestra. 4. Transferencia de la muestra a la
cmara de criogenizacin ensamblado al microscopio para el anlisis
de la muestra con el microscopio. Todos estos procesos han sido
realizados en condiciones de muy baja temperatura pero constante en
todo momento [18] . .......................................................................... 125
Figura 2.21 Esquema del funcionamiento de la QCM [6] . Por la entrada se introduce
la disolucin a estudiar y tras el tiempo necesario de esta bilizacin se
introduce el disolvente de lavado. La cantidad adsorbida antes y
despus del lavado es lo que se va a medir. ................................... 128
Figura 2.22 a) Cristal de cuarzo recubierto con dos electrodos de oro en la cara
inferior y superior. (b) Funcionamiento de una balanza con electrodo
de oro formando el circuito. .......................................................... 129
Figura 2.23 Esquema de un elipsmetro. Los ngulos que se obtienen del
polarizador y del analizador se denominan como P y A,
respectivamente [1] . ........................................................................ 132
Figura 2.24 Modelo de cuatro capas empleado para el anlisis de los datos
elipsomtricos. .............................................................................. 133
Figura 3.1 Fosfolpidos utilizados en este trabajo. La diferencia entre ellos radica
principalmente en la existencia o no de dobles enlaces en su cadena y
en el tipo de cabeza polar. Los nombres de los lpidos se dan en la
Tabla 3.1. ...................................................................................... 136
Figura 3.2 Tensioactivos utilizados, DODAB para formar liposomas y
TRITON X -100 para disolver los liposomas. ................................ 138
Figura 3.3 Polmeros utilizados para el recubrimiento de los liposomas por la
tcnica capa a capa. ....................................................................... 139
Figura 3.4 Polielectrolitos sintetizados en el laboratorio. PM A c o cido de
polimetacrilato con 12%w colesterol, M w = 11560 Da; es un polmero
con cadenas de colesterol que sirve para formar parte de la bicapa
lipdica que forma los liposomas, es sintetizado por el Dr. Alexander
Zelikin [13] . PMA SH o cido de polimetacrilato con 12-14%w grupos
tioles que es otro polmero que se sintetiza en el laboratorio, pero que
344 Anexos
debe obtenerse en el momento en que se va a utilizar ya que pierde

actividad con el tiempo. ................................................................ 140
Figura 3.5 Reactivos utilizados para la fabricacin del microgel donde (a) es el
co-monmero VI, (b) es el NIPAM, (c) es BIS que acta como
entrecruzador, (d) es el surfactante, CTAB, (e) es V50 que acta como
iniciador de la polimerizacin. ...................................................... 142
Figura 3.6 Sondas fluorescentes, de las cuales ITC acompaa al frmaco
encapsulado, odamina B (Sigma-Aldrich, contenido de sonda 95%)
a los microgeles y NBD-PC (Avanti Lipids) es una fosfocolina con la
sonda fluorescente verde NBD que facilita la observacin de l os
liposomas con el microscopio de confocal ..................................... 143
Figura 3.7 Estructura molecular de la doxorubicina y del dextrano ................. 144
Figura 3.8 Estructura molecular del sustrato, nitrocefina que reacciona con -
lactamasa. ..................................................................................... 144
Figura 3.9 Entrecruzadores ms utilizados en este trabajo. BM(PEG) 2 es un
reactivo homobifuncional no degradable y CAT, entrecruzador
biodegradable. Ambos utilizados para formar enlaces disulfuro a partir
de los enlaces SH. DTT rompe los enlaces disulfuro formados para
activar los enlaces -SH. ................................................................. 145
Figura 3.10 GSH o glutationa es un tripptido compuesto de glutamato, cistena y
glicina que sirve como cofactor para algunas reacciones enzimticas y
ayuda en la reconfiguracin de los enlaces disulfuro de las protenas.
..................................................................................................... 145
Figura 3.11 Disoluciones tampn utilizadas durante la tesis. ............................ 147
Figura 3.12 Esquema de la formacin de vesculas paso por paso: preparacin de
la disolucin, formacin de la pelcula, hidratacin y extrusin. .... 149
Figura 3.13 Partes de un mini-extrusor y detalle del ensamblaje de cada una de
ellas. Una vez ensambladas se coloca la pieza en el interior del
estabilizador de temperatura donde van perfectamente sujetas las dos
jeringuillas en cada uno de los extremos. Esto permitir tener una
temperatura constante durante todo el proceso de extrusin. .......... 151
Figura 3.14 Extrusor tipo thermo barrel extruder de Northern Lipids con capacidad
de 10 ml de muestra. ..................................................................... 152
Figura 3.15 Sntesis del microgel p-(NIPAM)-co-VI que comienza con la mezcla
de oligmeros para dar lugar a la partcula precursora y
posteriormente el crecimiento que de lugar al microgel [21] . ............ 155
Figura 3.16 Formacin de PMA con grupos tioles. Con la ayuda del EDC se activa
el grupo NH 2 para rpidamente formar un enlace con el grupo
carboxlico del PMA obteniendo una molcula con el nmero de
grupos tioles deseados. .................................................................. 156
Figura 3.17 Formacin de las cpsulas polimricas va la tcnica LbL por
interacciones electrostticas. Una vez disuelta la particular tras form ar
las capas, se obtiene una cpsula con coraza semipermeable que puede
albergar diferentes sustancias. ....................................................... 158
Figura 3.18 Recubrimiento de liposomas con una primera capa de polielectrolito
PSS y una segunda de PAH. .......................................................... 160
Figura 3.19 Esquema que muestra el proceso de ensamblaje para hbridos

invertidos. De esta forma, sobre la partcula de slice se aade la capa
precursora de PMA c seguido de la deposicin de los liposomas y la
siguiente adsorcin secuencial de capas separadoras PMA c y PLL. A
continuacin se aaden las cpsulas de 300 nm y se finaliza con el
ensamblaje electrosttico de los polmeros PVP/PMA SH . Con un
tratamiento de HF se consigue vaciar la partcula de slice. ............ 163
Figura 3.20 Transformacin estructural sufrida en la nitrocefina al ponerse en
contacto con la enzima en disolucin acuosa. ................................ 164
Figura 3.22 Reaccin de GSH con capsula polimricas de PMA SH /PVP. ........... 165
Figura 3.21 Ensayo enzimtico que consiste en la liberacin del frmaco que con
el contacto del sustrato se produce el cambio de color de amarillo a
rojo confirmando la encapsulacin del frmaco en el interior de los
liposomas. ..................................................................................... 165
Figura 4.1 Coloidosomas donde (a) representa la adsorcin de liposomas
unilamelares pequeos sobre la superficie de micropartculas de
polielestireno y (b) la adsorcin de nanopartculas de poliestireno
sobre liposomas unilamelares pequeos. ........................................ 169
Figura 4.2 (a) Variacin del contenido en fsforo con respecto al % m de DOPC
presente en los sistemas estudiados. Anlisis del contenido en fsforo
de liposomas de carcter catinico DOPC:DODAB con un tamao de
100 nm, obtenidos mediante extrusin en disolucin 10 mM de NaCl
frente al porcentaje de DOPC en vesculas formadas por mezclas de
DOPC:DODAB. La lnea continua representa los valores esperados sin
prdidas. (b) Variacin de las prdidas despus del proceso de
extrusin. La lnea discontinua representa el ajuste de los datos. ... 170
Figura 4.3 Variacin de la distribucin de tamaos en funcin de la intensidad a
medida que aumenta el nmero de extrusiones para liposomas de
= 100 nm. .................................................................................. 172
Figura 4.4 Funcin de correlacin frente al tiempo de decaimiento medidas en las
muestras obtenidas tras un nmero diferente de extrusiones. .......... 173
Figura 4.5 Radio hidrodinmico R H de las vesculas formadas por: (a)
DOPC:DODAB (3:1) y (b) DOPC. Las medidas de DLS han sido
realizadas a pH 7.4, a 25 C y a un ngulo de dispersin de 90
utilizdo membrans con diferente tamao de poro. La lnea azul para
100 nm, la lnea negra para 200 nm y la lnea roja para 400 nm. .... 174
Figura 4. 6 Variacin del potencial zeta para liposomas formados por
DOPC:DODAB con variacin de concentracin de DODAB. Medidas
realizadas a temperatura ambiente, 25C y en disolucin salina 10 mM
despus de ser extruidos con un tamao medio de 100 nm de dimetro.
..................................................................................................... 175
Figura 4.7 Radio hidrodinmico normalizado para liposomas formados por DPPC
extruidos en disolucin tampn a pH 7.4. La curva roja se corresponde
a liposomas de 100 nm de dimetro y la curva negra para liposomas de
1 m obtenidos tras la extrusin a travs de membranas de
policarbonato del tamao mostrado. .............................................. 176
346 Anexos
Figura 4.8 Potencial zeta obtenido mediante movilidad electrofortica en func in

del pH para determinar el punto isoelctrico en liposomas
zwiterinicos en disolucin acuosa con concentracin salina igual a
10 mM. El tamao de los liposomas es 100 nm de dimetro y las
medidas estn realizadas a 25C. Comparacin con el punto
isoelctrico observado para DPPC (), DOPC () y DOPC:DPPC
(30:70) (). El crculo indica la regin en la que se sita el IEP. .... 177
Figura 4.9 Calor liberado en liposomas de 1 m formados por DPPC () y
encapsulando DOX (). Los experimentos han sido relaizados en
disolucin tamponada HEPES a pH 7.4 con fuerza inica igual a
10 mM NaCl. ................................................................................ 178
Figura 4.10 Variacin de la anisotropa, r, para liposomas formados por DPPC ()
y liposomas formados por DPPC:DOPC() en disolucin tamponada a
pH 7.4 y con una concentracin de 10 mM NaCl. El tamao de los
liposomas es de 100 nm de dimetro. ............................................. 179
Figura 4.11 Variacin de la anisotropa, r, para liposomas formados por DPPC ().
Comparacin de la variacin de temperatura de transicin para
liposomas modificados por polmero y cargados de DOX (). Las
disoluciones son de disolucin tamponada HEPES a pH 7.4. .......... 180
Figura 4.12 Coeficientes de difusin para disoluciones de liposomas
DOPC:DODAB con un radio medio de 50 nm sin capas (), con una
capa () y con cuatro capas ().Las medidas han sido realizadas a
temperatura ambiente, en agua miliQ y en muestras diferentes para
cada dilucin. La lnea roja punteada indica el ajuste de los datos para
todos los casos. ............................................................................. 181
Figura 4.13 Obtencin del coeficiente de difusin: (a) representa las funciones de
correlacin de una muestra a diferentes ngulos; (b) representa la
funcin de correlacin para varias muestras a 90; (c) Tiempo d
decaimiento a 90 para diferentes muestras; (d) Variacin del tiempo
de la inversa del tiempo de decaimiento frente al cuadrado del vector
de onda para diferenctes muestras. Los errores representan las
anchuras de las distribuciones de tiempos de relajacin. ................ 183
Figura 4.14 Coeficiente de difusin para vesculas de 100 nm formadas por
DOPC:DODAB en una relacin 70:30 en disolucin salina con 10 mM
de NaCl a 25C a medida que se aade PSS. .................................. 184
Figura 4.15 (a) Potencial zeta o y (b) radio hidrodinmico de una suspensin de
concentracin del polielectrolito aninico, PSS. La barra horizontal en
(a) indica el error debido al equipo utilizado y que debe tenerse en
cuenta a la hora de considerar la densidad de carga positiva o
negativa. ....................................................................................... 185
Figura 4.16 Radio hidrodinmico frente al potencial zeta para vesculas formadas
por fosfolpidos recubiertas con polielectrolitos en disolucin salina
con una concentracin de 10 mM. Las lneas contnuas simtricas
indican el intervalo inestable de las disoluciones que encierran la zona
denominada Potencial de Velegol-Twar. ........................................ 186
Figura 4.17 Potencial zeta frente a la concentracin de PSS. Las vesculas estn
formadas por DOPC y DODAB: 10% DODAB (), 30% DODAB, (),
50% DODAB, (), 70% DODAB () y 80% DODAB, ().Todos los

datos corresponden a 25C y a un volumen total de 2 mL. .............. 187
Figura 4.18 Variacin de la concentracin de polielectrolito aninico PSS
necesaria para alcanzar el punto de neutralizacin en funcin del % m
de DODAB en la vescula. La concntracin de las vesculas es
constante y la temperatura de medida es 25C. La recta punteada
representa el ajuste lineal de los puntos pasando por cero. ............. 188
Figura 4.19 Variacin de la concentracin de polielectrolito catinico, PAH en
funcin de la carga del liposoma formado por DOPC y DODAB. Las
relaciones DODAB:DOPC representadas son: 30:70, ( ), 40:60, (),
50:50, (), 60:40, (), 80:20, (). Las medidas han sido realizadas en
disolucin salina 10 mM NaCl y tras centrifugar las muestras y
eliminar el complejo inter-polielectrolito. ...................................... 189
Figura 4.20 Variacin del potencial zeta en funcin del nmero de capas de
PSS/PAH adsorbidas sobre los liposomas formados por DOPC y
DODAB y medidos a 25C. Las relaciones DODAB:DOPC
representadas son: para 30:70, para 40:60, para 50:50, para
60:40, para 70:30 y para 80:20. ................................................. 190
Figura 4.21 Coeficiente de difusin para vesculas con diferente densidad de
carga. Medidas realizadas a 25C para vesculas de 100 nm de
dimetro en disolucin salina 10 mM NaCl. Las relaciones
DODAB:DOPC representadas son: para 30:70, para 40:60, para
50:50, para 60:40, para 70:30 y para 80:20. ........................... 191
Figura 4.22 Evolucin del radio hidrodinmico en func in del nmero de capas
para vesculas con 30% m de DODAB y 70% m de DOPC. ................ 192
Figura 4.24 Crio-TEM de (a) vescula sin recubrimiento y (b) vescula con cuatro
capas de PSS/PAH en disolucin acuosa con una concentracin de
10 mM NaCl a pH 7.4. La concentracin tanto de la vescula como de
los polielectrolitos es de 1 mgmL -1 . .............................................. 193
Figura 4.23 Crio-TEM de vesculas formadas por DODAB:DOPC (relacin 30:70)
sin recubrir con una concentracin de 1 mgmL -1 . .......................... 193
Figura 4.25 (a)Vista total de la muestra depositada sobre el portamuestras con
crio-SEM a pH 7.4 y de 100 nm de tamao. (b)Vista de la poblacin
total de liposomas en la muestra observada. ................................... 194
Figura 4.26 Crio-SEM para liposomas de 100 nm donde se observa la tendencia de
los liposomas a agregarse con el tiempo. Al mismo tiempo es fcil
deducir el tamao de los liposomas con una gran estadtica. (a) y (b)
representan la misma zona pero la figura (b) fue tomada con ms
resolucin. .................................................................................... 195
Figura 4.27 Crio-SEM para liposomas de 100 nm y de 1 m en disolucin tampn
HEPES regulando el pH a 7.4. Para proteger las muestras, durante el
proceso de preparacin se cubrieron con 5nm de platino en una cmara
en la que se controla que la temperatura se mantenga a la misma que
posteriormente se va a medir, que es -196C. ................................. 195
Figura 4.28 Focused Ion Beam (FIB) de liposomas de 100nm en disolucin tampn
HEPES a pH 7.4 y con una fuerza inica de 10mM. ....................... 196
348 Anexos
Figura 4.29 (a) Variacin de la intensidad normalizada en funcin del potencial

zeta, , en diferentes tiempos y (b) Variacin de la intensidad
normalizada con el radio hidrodinmico, R H , en diferentes tiempos
despus de la sntesis. Las vesculas estaban formadas por 40% m
DODAB con una capa de PSS en disolucin salina 10 mM NaCl. .. 198
Figura 4.30 (a) Variacin de la intensidad normalizada con el po tencial zeta, , en
diferentes tiempos y (b) Variacin de la intensidad normalizada con el
radio hidrodinmico, R H , en diferentes tiempos para vesculas
formadas por 40% m DODAB con cuatro capas del par de
polielectrolitos PSS/PAH en disolucin salina 10 mM NaCl. ......... 199
Figura 4.31 Variacin del coeficiente de difusin a medida que aumenta la
concentracin de partculas de ltex en la disolucin junto a los
liposomas sobre los que se adsorbe. ............................................... 200
Figura 4.32 (a) Radio hidrodinmico y (b) potencial zeta de una suspensin de
concentracin de partculas de ltex. Se observan claramente las zonas
de inversin de carga y de condensacin. La zona raya da indica la
zona de inestabilidad del sistema donde las medidas no son
reproducibles. ............................................................................... 201
Figura 4.33 Potencial zeta en funcin de la concentracin de PSS () y de ltex
() sobre liposomas catinicos formados por 30%m DODAB.
Dependencia del potencial zeta con la concentracin de partculas de
ltex. ............................................................................................. 202
Figura 4.34 Variacin del potencial zeta con la concentracin de partculas de
ltex para sistemas formados por liposomas catinicos con distinta
carga inica. Medidas realizadas en disolucin de HEPES 10 mM
pH 7.4 a 25C. Los resultados corresponden a vesculas de
DOPC:DODAB (20:80) (), DOPC:DODAB (70:30)(),
DOPC:DODAB (90:10) (), DOPC:DODAB (95:5) (). ................ 203
Figura 4.35 Variacin del potencial zeta en funcin del nmero de capas para
liposomas catinicos con distinta carga inica donde la primera capa
son partculas de ltex. La segunda, tercera y cuarta son capas
alternadas de PSS/PAH y finalmente de nuevo otra capa de ltex. Las
medidas son realizadas en tampn HEPES pH 7.4 a 25C y las grficas
representadas son para DOPC:DODAB 90:10 ( ), DOPC:DODAB
70:30 (), DOPC:DODAB 30:70 (), DOPC:DODAB 20:80 (). . 204
Figura 4.36 Variacin de la concentracin de ltex necesaria para obtener el punto
de neutralizacin con el % de DODAB que forma el sistema de
liposomas DOPC:DODAB. ............................................................ 205
Figura 4.37 Variacin de la intensidad dispersada por liposomas de 100 nm de
dimetro con diferentes capas en disolucin acuosa con una fuerza
inica de 10 mM NaCl medidos a 25C. (a) Liposomas catinicos
formados por DOPC:DODAB (50:50) () y por (90:10) recubiertos
con una capa de partculas de ltex de 20 m de dimetro ( ); (b)
DOPC:DODAB (6:4) recubiertos con una capa de poli -estiren
sulfonato (PSS) () y DOPC:DODAB (50:50) (). ........................ 206
Figura 4.38 Funcin de distribucin de densidad electrnica en funcin de la
distancia mxima, d max , calculada a partir de los resultados SAXS para
las muestras de liposomas de DOPC con DODAB en disolucin acuosa
y 10 mM NaCl donde se muestran: (a) DOPC:DODAB (50:50) () y

por (90:10) recubiertos con una capa de partculas de ltex de 20 m
de dimetro (); (b) DOPC:DODAB (6:4) recubiertos con una capa de
poli-estiren sulfonato (PSS) () y DOPC:DODAB (50:50) (). ...... 207
Figura 4.39 (a) Variacin experimental de la intensidad con respecto al vetor de
onda. (b) Representacin del cuadradado del vector de onda frente al
logaritmo de la intensidad por el vector de onda. Aplicacin de la ley
de Guinier para vesculas DOPC:DODAB (50:50). ........................ 208
Figura 4.40 (a) Densidad electrnica en funcin de la distancia, r para vesculas
DOPC:DODAB (50:50). (b) Representacin de Iq 2 frente a q........ 209
Figura 4.41 Fotografa del patrn de difraccin de neutrones para vesculas
obtenido con cmara del equipo de SANS en el LLB. Vesculas
30%DODAB-70%DOPC en disolucin acuosa con una concentracin
de 10 mM NaCl. ............................................................................ 211
Figura 4.42 Variacin de la intensidad dispersada con el vector de onda en escala
logartmica. Resultados de neutrones para vesculas sin recubrimiento
() y vesculas con dos bicapas (). .............................................. 213
Figura 4.43 (a) Variacin de la Intensidad dispersada por neutrones por el vector
de onda en funcin del cuadrado del vector de onda, ln I q q frente
a q 2 (b) Misma representacin pero en el intervalo seleccionado, en el
que se aplica la Ley de Guinier y obtener el radio de giro en vesculas
recubiertas con (Ltex/PAH). ........................................................ 214
Figura 4.44 (a) Imagen de FIB de partculas de poliestireno de 3m recubiertas
con liposomas de 100 nm. La adsorcin de los liposomas sobre estas
partculas se ha realizado mediante la tcnica capa a capa po r
interacciones electrostticas. (b) Corte del sistema obtenido con FIB.
..................................................................................................... 216
Figura 4.45 CLSM: Partculas de ltex recubiertas de liposomas de 1 m con
Quantum Dots en la bicapa lipdica. .............................................. 217
para vesculas catinicas DOPC:DODAB (70:30) en tampn HEPES
pH 7.4 medidas a 25C. ................................................................. 218
Figura 4.47 Variacin del potencial zeta para vesculas formadas por DODAB en
relacin a DOPC (3:1) recubiertas con el par de polielctrolitos
PGA/PLL en disolucin tampn a pH 7.4. ..................................... 219
para vesculas zwiterinicas formadas por DOPC en tampn HEPES
pH 7.4 medidas a 25C. ................................................................. 220
Figura 4.49 (a) Variacin del potencial con la concentracin de PLL aadido a la
disolucin tamponada a pH 7.4 de liposomas formados por DOPC y
(b) Variacin del potencial con la concentracin de PGA aadido a la
disolucin tamponada a pH 7.4 de liposomas formados por DOPC . 221
Figura 4.50 (a) Recubrimiento de DOPC con PEI en disolucin tamponada a
pH 7.4. (b) Recubrimiento con PGA tras PEI para DOPC en disolucin
tamponada a pH 7.4. ...................................................................... 222
350 Anexos
Figura 4.51 Evolucin del potencial zeta en funcin del nmero de capas para
liposomas zwiterinicos como el formado por DOPC para sistemas
con los pares polielectrolitos PLL/PGA () y PEI/PGA/PLL () .... 222
Figura 4.52 Variacin del radio hidrodinmico en funcin de la temperatura para
liposomas formados por DMPC y de tamao 100 nm. .................... 223
Figura 4.53 Variacin del radio hidrodinmico con la temperatura para todos los
sistemas liposomares formados por DMPC y DMPE -PEG medidos en
disolucin tamponada con una fuerza inica igual a 10mM y pH7.4
donde () son liposomas formados por DMPC puro, ( ) son los
formados por DMPC:DMPE_PEG 1000 (96:4), () son los formados por
DMPC:DMPE_PEG 1000 (92:8), () son los formados por
DMPC:DMPE_PEG 5000 (96:4), y finalmente () que son los formados
por DMPC:DMPE_PEG 5000 (92:8). ................................................ 224
Figura 4.54 Variacin del potencial zeta con el pH para liposomas zwiterinicos
formados por DMPC, y DMPC:DMPE_PEG. Las cadenas de PEG
estudiadas son dos, con distinto peso molecular, por lo que sen
estudiado dos ratios para cada uno de los PEG utilizados que permitan
ser separados. ................................................................................ 225
Figura 4.55 (a) Variacin del potencial zeta con el pH para liposomas formados
por DMPC:DMPE_PEG 1000 (98:2) en disolucin tamponada a pH 7.4 y
medido a temperatura ambiente, 25C. (b) Variacin del potencial zeta
() y del radio hidrodinmico () con la temperatura cuando el
liposoma formado por DMPC:DMPE-PEG 1000 (98:2) encapsula la
enzima en su interior. .................................................................... 227
Figura 4.56 (a) Absorbancia frente a longitud de onda para la nitrocefina. (b)
Absorbancia frente a longitud de onda para los liposomas obtenidos de
DMPC y un 1.7% de PEG 1000 con -lactamasa en su interior. ......... 227
Figura 4.57 (a) Variacin del espectro de absorcin a medida que transcurre la
reaccin. El subndice 0 indica el tiempo antes de aadir el sustrato y
cada una de las medidas posteriores se realizaron cada cinco minutos
una vez aadido el sustrato y agitado la mezcla.. (b) Espectro obtenido
despus de aadir TRITON-X100 medido a temperatura ambiente,
25C. En la disolucin est la enzima, el sustrato, el surfactante y la
disolucin de liposomas DMPC:DMPR_PEG................................. 228
Figura 4.58 Representacin de la variacin de la absorbancia frente al tiempo. 229
Figura 4.59 Variacin del punto isoelctrico para liposomas formados por DPPC
en funcin del tipo de compuesto aadido en la bicapa o en el interior
de los liposomas. Las medias han sido realizadas a temperatura
ambiente y en disolucin acuosa con una fuerza inica igual a 10mM
para todas las muestras. ................................................................. 231
Figura 4.60 Imagen de Crio-SEM para liposomas de 1 m a pH 7.4 en disolucin
tampn HEPES. La medida de los hueco que dejan las vesculas y
cambiar su posicin. El tamao estimado es de 917.592.5 nm. ..... 232
recubiertos con polmero mediante la tcnica capa a capa a pH 7.4 en
disolucin tampn HEPES. La medida de las vesculas es
917.592.5 nm. ............................................................................. 233

recubiertos con polmero en la bicapa lipdica extruidos con membrana
de tamao de poro idntico a pH 7.4 en tampn HEPES................. 234
Figura 4.63 Adsorcin de liposoma unilamelar sobre una superficie hidroflica [22] .
Se han observado tres pasos desde que se pone en contacto la
disolucin de liposomas con el sustrato hasta que se forma la bicapa
de lpidos y se comentan en el texto. ............................................. 235
Figura 4.64 Adsorcin de vesculas catinicas sobre diferentes sustratos antes del
lavado con disoucin salina con la misma fuerza inica. Ambas
disolucin tienen una fuerza inica de 10 mM NaCl y las medidas se
hicieron a 25C. ............................................................................ 236
Figura 4.65 Secuencia de adsorcin para (PSS+PAH) sobre una vescula de
DOPC+DODAB (70:30) adsorbida sobre un substrato plano. La lnea
continua representa la variacin de frecuencia, f, normalizada por el
nmero de armnico, , para el tercer armnico, ( f / ) 3rd , y la lnea
discontinua indica la variacin de disipacin para el mismo arm nico,
lavado. .......................................................................................... 238
del interior muestra la dependencia en N de la variacin del factor de
disipacin para el tercer armnico, D. ........................................ 239
respectivamente. ........................................................................... 240
formadas por DOPC:DODAB (70:30) sobre sustrato plano y con capas
sucesivas de partculas de ltex y el par de poielectrolitos PSS/PAH en
disolucin con 10 mM NaCl. ......................................................... 242
Figura 4.69 Dependencia con el nmero de capas, N, del las componentes del
formadas por DOPC:DODAB sobre sustrato plano y con capas de
polielectrolitos PSS/PAH con la penltima capa adsorbida sobr e los
liposomas de partculas de ltex en disolucin tamponada a pH 7.4
con 10 mM NaCl. .......................................................................... 243
Figura 4.70 Secuencia de adsorcin para PEI(PGA+PLL) sobre una vescula de
DOPC adsorbida sobre un substrato plano. La lnea continua
representa la variacin de frecuencia, f, normalizada por el nmero
de armnico, , para el tercer armnico, ( f / ) 3rd , y la lnea
352 Anexos

lavado. .......................................................................................... 244
insertada muestra la dependencia en N de la variacin del factor de
disipacin para el tercer armnico, D. ........................................ 245
respectivamente. ........................................................................... 246
formadas por DOPC sobre sustrato plano y con capas sucesivas del par
de polielectrolitos PGA/PLL con una capa inicial adsorbida sobre los
10 mM NaCl. ................................................................................ 247
Figura 4.74 Dependencia con el nmero de capas, N, de las componentes del
formadas por DOPC sobre sustrato plano y con capas de
polielectrolitos PGA/PLL con una capa inicial adsorbida sobre los
10 mM NaCl. ................................................................................ 248
Figura 4.75 Variacin del espesor con el nmero de capas mediante Dispersin de
luz(), Balanza de cuarzo, () y Elipsometra,(), para los sistemas
formados por (DOPC:DODAB)-(PSS/PAH)-Latex-PAH, (a), y DOPC-
PEI-(PGA/PLL) 2 , (b). .................................................................... 249
Figura 4.76 Comparativa de la liberacin de DEX marcado con FITC en liposomas
zwiterinicos de DPPC de 1 m a pH 7.4. Se observa la cantidad de
liposomas con una capa adicional de PEG ensamblado mediante la
tcnica denominada pegylation post-coating. ................................. 251
Figura 4.77 Comparativa de la liberacin de DOX marcado con FITC en liposomas
zwiterinicos DPPC de 1 m a pH 7.4. Se observa la cantidad de
liposomas con adems una capa de PEG ensamblado mediante la
tcnica denominada pegylation post-coating. ................................. 252
Figura 4.78 Aspecto del microgel sintetizado denominado p -(NIPAM)-co-VI. .. 254
Figura 4.79 Variacin del radio hidrodinmico del p -(NIPAM)-co-VI sin recubrir
en funcin de la temperatura en disolucin acuosa a diferen tes pH:
pH 3.3 (), pH 8.5 () y pH 9.2 (). Los smbolos rellenos
indican calentamiento y los smbolos huecos indican enfriamiento. 255
Figura 4.80 Variacin del radio hidrodinmico del microgel p -(NIPAM)-co-VI con
la temperatura a diferentes valores de fuerza inica: sin adiccin de
sal (), con 0.1 M NaCl (), con 0.25 M NaCl () y con disolucin
tampn y 0.15 M NaCl (). ........................................................... 256
Figura 4.81 Ilustracin de la respuesta que muestra un microgel rec ubierto con
diferentes polielectroitos al aumentar la temperatura [390] . ............... 257
Figura 4.82 Variacin del radio hidrodinmico con la temperatura para p -
(NIPAM)-co-VI Rodamina -(PSS/PDADMAC). El microgel en agua miliQ
y los polielectrolitos disueltos en 0.1M NaCl sin recubrimiento (),
con una capa de polielectrolito () y tres capas de polielectrolitos
(). Los smbolos rellenos indican calentamiento y los smbolos
huecos indican enfriamiento. Las flechas grises muestran la tenden cia
lineal, el crecimiento, de las multicapas. ........................................ 258
Figura 4.83 Variacin del radio hidrodinmico con la temperatura para el microgel
p-(NIPAM)-co-VI Rodamina -(PSS/PDADMAC). El microgel est en agua
miliQ y los polielectrolitos disueltos con una fuerza inica de 0.25 M
NaCl sin recubrimiento (), con la primera capa de polielectrolito
() y segunda capa de polielectrolitos (), cuarta capa (), quinta
capa (), seis capas ().Los smbolos rellenos indican calentamiento
y los smbolos huecos indican enfriamiento. Las flechas grises
muestran la tendencia lineal, el crecimiento, de las multicapas. ..... 259
Figura 4.84 Temperatura de transicin para p-(NIPAM)-co-VI Rodamina en H 2 O y
recubierto con los polielectrolitos (PSS/PDADMAC) en 0.25M NaCl y
a 20C. .......................................................................................... 260
Figura 4.85 Variacin del radio hidrodinmico con la temepratura del sistema p -
(NIPAM)-co-VI (Rodamina)- (PLL/PGA) n . El microgel est en agua y los
polielectrolitos en disolucin tampn a pH 7.4 y con 0.15M NaCl. Las
flechas azules muestran la tendencia lineal, el crecimiento, de las
multicapas. .................................................................................... 264
el microgel de carga positiva p-(NIPAM)-co-VI Rodamina en 0.1M NaCl
donde los smbolos () representan al microgel sin recubrimiento,
con la primera capa de polielectrolito (), segunda capa de
polielectrolitos (), cuarta capa (), quinta capa (). Los smbolos
rellenos indican calentamiento y los smbolos huecos indican
enfriamiento. (b) Variacin de la movilidad electrofortica en funcin
del nmero de capas que recubren el microgel donde () indica la
movilidad electrofortica medida a 25C y ( ) la movilidad
electrofortica medida a 44C despues de la temperatura de colapso.
..................................................................................................... 265
el microgel p-(NIPAM)-co-VI Rodamina en 0.25 M NaCl sin
recubrimiento y con diferente nmero de capas donde los sm bolos
() representan al microgel sin recubrimiento, con la primera capa de
polielectrolito (), segunda capa de polielectrolitos (), cuarta capa
(), quinta capa (). Los smbolos rellenos indican calentamiento y
los smbolos huecos indican enfriamiento. Variacin de la movilidad
electrofortica en funcin del nmero de capas que recubren el
microgel donde () indica la movilidad electrofortica medida a 25C
y () la movilidad electrofortica medida a 44C despues de la
temperatura de colapso. ................................................................. 266
polielectrolitos para el microgel de carga positiva p-(NIPAM)-co-
VI Rodamina en 0.1M NaCl, 0.25M NaCl. Temperatura medida 25C. . 267
354 Anexos

polielectrolitos para p-(NIPAM)-co-VI con el par de polielectrolitos
PGA/PLL en disolucin tamponada a pH 7.4 y medido a 25C,(), y a
44C,(), despues de la temperatura de colapso. ............................ 268
recubrimiento del microgel en disolucin con fuerza inica 0.1M
NaCl. Estabilidad temporal del microgel recubierto por la tcnica capa
a capa donde los smbolos rellenos indican calentamiento y los
smbolos huecos indican enfriamiento. .......................................... 269
recubrimiento del microgel en disolucin acuosa con fuerza inica
0.25M NaCl. Estabilidad temporal del microgel recubierto por la
tcnica capa a capa donde los smbolos rellenos indican calentamiento
y los smbolos huecos indican enfriamiento. .................................. 270
recubrimiento del microgel en disolucin con fuerza inica de 0.15M
NaCl y tamponado a pH 7.4. Estabilidad temporal del microgel
recubierto mediante la tcnica capa a capa donde los smbolos rellenos
indican calentamiento y los smbolos huecos indican enfriamiento. 271
Figura 4.93 Mtodo de obtencin de los hbridos donde (1) preparacin de
partcula de slice a pH 7, (2) adsorcin de nanocpsulas polimricas
por interacciones electrostticas, (3) capas de proteccin, se
distinguen tres casos: PLL, PLL/PMA c o PVP/PMA c (4) adsorcin de
liposomas (5) capa de proteccin, PMA c , (5.a) disposicin de los
polmeros si es el caso de dos capas de proteccin formadas por
cadenas laterales de colesterol, (5.a.1) vista de cerca de la estructura
que adoptan las cadenas de colesterol entre las cadenas de lp ido (6)
Adsorcin capa a capa de los pares de polielectrolitos PMA SH /PVP y
entrecruzamiento con BM(PEG) 2 (7) Vaciado de la partcula dando
lugar a los hbridos. ....................................................................... 273
Figura 4.94 Entrecruzamiento realizado para dar lugar a enlaces disulfuro que
proporciona al hbrido formado mayor estabilidad. ........................ 274
Figura 4.95 Resultados del citmetro de flujo tras introducir la muestra y fijar los
parmetros estudiados en estos sistemas previamente. ................... 275
Figura 4.96 (a) Intensidad de fluorescencia en lser rojo tras el ensamblamiento de
las cpsulas de 300 nm y (b) en lser verde, tras el ensamblamiento de
los liposomas DMPC:DPPC (40:10); Las medidas se realizaron a 25C
y un volumen de 2 mL. .................................................................. 276
Figura 4.97 (a) Intensidad de fluorescencia en rojo tras el ensamblamiento de las
cpsulas de 300 nm y (b) en lse verde, tras el ensamblamiento de los
liposomas DOPC:DODAB (30:70); Las medidas se realizaron a 25C y
un volumen de 2 mL. ..................................................................... 277
Figura 4.98 Intensidad de la fluorescencia con lser rojo, tras el ensamblamiento
de las capsulas de 300 nm; Las medidas se realizaron a 25C y con el
mismo volumen total medido igual a 2 mL. La primera columna de la
izquierda (ms oscura) corresponde a la medida despus de adsorberse
las cpsulas de 300 nm; la segunda columna al momento en que se
forma el core-shell a pH 4, la tercera columna es el hbrido tras el
tratamiento cido para disolver la partcula de slice a pH 4 y la ltima
columna (color blanco) corresponde al hbrido tras el tratamiento

cido pero a pH 7.4. ...................................................................... 278
Figura 4.99 Intensidad de la fluorescencia con lser verde, tras el ensamblamiento
de los liposomas. Medidas realizadas a 25C y en un volumen de
muestra igual a 2 mL. La primera columna de la izquierda (ms
oscura) corresponde a la medida despus de adsorberse los liposomas;
la segunda columna al momento en que se forma el core-shell a pH 4,
la tercera columna es el hbrido tras el tratamiento cido para disolver
la partcula de slice a pH 4 y la ltima columna (color blanco)
corresponde al hbrido tras el tratamiento cido pero a pH 7.4. ...... 279
Figura 4.100 Isotermas a T= 25C para distintas combinaciones medidas tras
realizar la adsorcin de los liposomas. Indica el tiempo necesario para
que se asegure la adsorcin completa de los liposomas sobre la
superficie. Se ha aadido la isoterma para liposomas insaturados
catinicos para mostrar todos los casos estudiados. ....................... 281
Figura 4.101 Imgenes obtenidas mediante microscopa de contraste en las que
inicialmente se observa la adsorcin de las cpsulas polimricas y tras
adsorber dos capas de polmeros, una de ellas con las cadenas de
colesterol se adsorben los liposomas de 50 nm de dimetro. Todo este
proceso se desarrolla a pH 4 en disolucin tamponada. .................. 282
Figura 4.103 Imagen de Confocal de los hbridos con la primera capa de
nanocpsulas polimricas de PVP/PMA SH (en rojo) y otra capa, tras
varios polmeros sin sonda, de liposomas con NBD en la bicapa de los
liposomas. Imgenes obtenidas a pH 7.4 en disolucin tampn de
HEPES 150 mM con una concentracin de 10 mM NaCl. La
temperatura de medida fue de 25C. .............................................. 283
Figura 4.102 Imagen obtenida mediante microscopa de contraste, campo claro que
muestra el paso de hbridos en forma de core-shell a cpsulas por el
tratamiento cido tamponado y tras el lavado con disolucin tampn a
pH 7. ............................................................................................. 283
Figura 4.104 Imagen obtenida mediante CLSM de los hbridos que contienen como
primera capa, adsorbida electrostticamente, las nanocpsulas
polimricas de PMA SH /PVP marcadas con Alexa-Fluor-633 y con otra
capa, posterior a esta y tras dos capas de sacrificio, los liposomas de
50 nm de dimetro marcados con el fluorforo NBD. Estas imgenes
de los hbridos fueron tomadas en disolucin tampn a pH 4. ........ 284
Figura 4.105 Imagen obtenida mediante Microscopa de contraste (DIC) de hbridos
invertidos, conteniendo en primer lugar los liposomas marcados con el
fluorforo NBD y como capa ms externa, las nanocpsulas
polimricas de PMA SH /PVP marcadas con Alexa-Fluor-633 y todo ello
en disolucin tampn a pH 7 en la etapa de core-shell. Se muestran
formas esfricas y partculas no agregadas. .................................... 285
Figura 4.106 Imgenes obtenidas por microscopa de transmisin electrnica (TEM)
de una cpsula polimrica con liposomas y nanocpsulas polimricas
alrededor a un pH 7.4. La escala es de 1 m. ................................. 286
Figura 4.107 Representacin de la absorbancia a 492 nm frente al tiempo que
corresponde a la longitud de onda a la que el product o de la reaccin
enzimtica absorbe. Un control negativo es aquel en el que los
liposomas estn en disolucin con el surfactante pero no poseen en el
356 Anexos
interior la enzima y otro control negativo que corresponde a liposomas

con la enzima pero sin la presencia del surfactante. En la centro de la
grfica se observa (a) que es la muestra control de liposomas con
enzima en presencia del sustrato sin Tritn X -100, (b) es la muestra
sin enzima, en presencia del sustrato al que se le aade Tritn X -100 y
(c)la muestra con liposomas con enzima encapsulada que lo liberan al
aadir Tritn X-100 dando lugar al cambio de color a rojo y al
aumento de absorbancia. ............................................................... 289
Figura 4.108 Intensidad de fluorescencia en funcin del tiempo para el proceso de
degradacin de las cpsulas de 300 nm formadas por PMA SH y PVP en
pH 7.4, donde se muestra el mximo de intensidad tras su degradacin
() y los datos de la muestra control que es la disolucin de hbridos
sin la presencia de GSH(). ........................................................... 290
Figura 4.109 Micrografas obtenidas con cmara en blanco y negro de los hbridos
antes y despus de la reaccin con GSH como prueba de la desorcin
de las nanocpsulas del complejo completo hbrido. Imgenes de
arriba fueron tomadas sin excitar la fluorescencia de las nanocpsulas
de 300 nm y las imgenes de abajo se tomaron excitando el
fluorocromo que poseen dichas nanocpsulas. ............................... 291
9.3 Listado de tablas 357
9.3 LISTADO DE TABLAS

Tabla 1.1 Geometra de los agregados frente al parmetro de empaquetamiento
P c . ................................................................................................... 26
Tabla 1.2 Nombres y estructuras de algunas cabezas polares ms utilizadas .... 48
Tabla 2.1 Posiciones posibles de los polarizadores. ....................................... 112
Tabla 3.1 Caractersticas principales de los lpidos usados. ........................... 137
Tabla 3.2 Polielectrolitos independientes del pH. .......................................... 139
Tabla 3.3 Polielectrolitos dependientes del pH. ............................................. 140
Tabla 3.5 Polmeros comerciales de Sigma-Aldrich derivado del p-(NIPAM) con
cadenas terminales de -COOH y derivado del polietilenglicol. ....... 141
Tabla 3.4 Reactivos necesarios para la fabricacin de PMA SH ....................... 141
Tabla 3.6 Descripcin detallada de los reactivos necesarios para la fabricacin
del microgel p-(NIPAM)-co-VI ..................................................... 142
Tabla 3.7 Otros materiales utilizados en los experimentos: ............................ 146
Tabla 3.8 Caracterticas de los tampones utilizados ....................................... 148
Tabla 3.9 Volmenes para la preparacin de la recta patrn .......................... 154
Tabla 4.1 Radio hidrodinmico obtenido al extruir la disolucin de vescu las y
utilizando una membrana de tamao de poro de 100 nm. ................ 171
Tabla 4.2 Coeficiente de difusin a dilucin infinita para el sistema de
liposomas DOPC:DODAB (30:70)................................................. 182
Tabla 4.3 Radio de giro, Dimetro mximo e Intensidad inicial para muestras de
liposomas en diolucin acuosa con fuerza inica de 10mM NaCl. .. 208
Tabla 4.4 Radios obtenidos experimentalmente mediante dispersin de rayos X
para liposomas con diferentes recubrimientos a 20C. .................... 210
Tabla 4.5 Datos principales de los compuestos utilizados en SANS ............... 212
Tabla 4.6 Radios obtenidos para liposomas con diferentes recubrimientos ..... 214
recubrimientos aplicando la Ley de Guinier ................................... 215
recubrimientos utilizando distintas tcnicas ................................... 215
Tabla 4.9 Valores del punto isoelctrico para liposomas de 100 nm en disolucin
salina de 10 mM formado por DMPC y DMPE modificado con cadenas
de PEG de distinto peso molecular ................................................ 226
358 Anexos
Tabla 4.10 Valores del PDI para liposomas de 100 nm en disolucin salina de
10 mM formado por DMPC y DMPE modificado con cadenas de PEG
de distinto peso molecular ............................................................. 230
Tabla 4.11 pH medido antes y despus del ciclo de centrifugacin medidos a
20C. ............................................................................................. 262
Tabla 4.12 pH medido antes y despus del ciclo de centrifugacin medidos a
temperatura ambiente, 20C y a la mayor fuerza inica. ................. 263

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Departamento de Qumica Fsica I

Fabricacin de liposomas y de cpsulas polimricas

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

Marta Ruano Aldea

Francisco Ortega Gmez

Marta Ruano Aldea, 2012

Marta Ruano Aldea

Directores de la Tesis Doctoral

Francisco Ortega Gmez Ramn Gonzlez Rubio

Equation Chapter (Next) Section 1

1.1 INTRODUCCIN GENERAL

Figura 1.1 Formacin de materiales core-shell y microcpsulas por ensamblaje

precursores de las partculas coloidales durante el proceso de sntesis. Para

1.2 LOS LPIDOS

Figura 1.2 Clasificacin estructural de los lpidos [3] . Se distinguen lpidos de

lugar a jabones o sales de los cidos grasos) y no saponificable. Ejemplos de

interacciones no covalentes que la refuerzan.

Figura 1.4 Fases del lpido en funcin de la temperatura. El cambio de fase se

1.3 LIPOSOMAS O VESCULAS

liposomas son aceptadas. Por ello en esta tesis, vescula y liposoma se

1.3.1 Fenmenos de Agregacin

En gran medida detrs de este fenmeno de autoasociacin estn las

de las molculas de soluto sea el mismo independientemente del entorno en

En esta expresin N es la energa libre asociada al paso de la molcula de

Podemos eliminar particularizando la expresin para N =1, de tal forma

De esta ecuacin se deduce que si N 1 la mayor parte de las molculas de

donde kBT 4 (3v / 4 N A ) . Utilizando esta expresin de N en 1.3

Tabla 1.1 Geometra de los agregados frente al parmetro de e mpaquetamiento P c .

Los argumentos geomtricos anteriormente citados se basan en tres

empaquetamiento cumple, v / lc a0 1/ 3 , N tendr un mnimo para un

Y utilizando la ecuacin 1.2 obtenemos una expresin que relaciona X N y

Sustituyendo la aproximacin parablica para N , la ecuacin1.8 se expresa

Esta ecuacin para M suficientemente grande conduce a una distribucin

Si el mnimo de la parbola es suficientemente profundo comparado con

donde = 1 - M y la fraccin en volumen total de tensioactivo es = X 1 +

Y sustituyendo de nuevo en la ecuacin 1.3 obtenemos

De donde podemos obtener la fraccin en volumen total, , sumando sobre

X N N [ X 1 exp( )]N exp( )

A partir de este resultado se puede encontrar un resultado para X 1 en funcin

y por tanto X N vendr dado por

Al contrario que con micelas esfricas esta distribucin es bastante ms

Figura 1.6 a) Representacin esquemtica de una bicapa de lpidos. b)

donde el primer sumando corresponde con la energa de una molcula

Es instructivo comparar este resultado con el obtenido para agregados

polidisperso dominado por agregados lamelares gigantes. Existe, por

micelares (tensioactivos monocatenarios, con CMC 10 -3 -10 -4 M) y bicapas

Curvaturas y fluctuaciones en una membrana

donde c 0 , es la curvatura espontnea de la membrana y tiene en cuenta la

Si se considera el movimiento Browniano en la membrana como una serie de

donde A es el rea de la membrana. La distorsin trmica (Browniana) de la

La integral en esta ecuacin diverge, y el significado fsico es que las ondas

1.3.2 Estabilidad coloidal segn la teora DLVO

La teora DLVO tambin supone que la partcula tiene una distribucin

regiones deben ser de un tamao suficiente tal que L , donde L es la

Figura 1.7 Variables que interviene en la aproximacin de Derjaguin para dos

(prcticamente significa que L 1 y L H donde 1 es la longitud de

opuesta) que en ese momento se encuentran cercanos. Definiendo como

donde es la funcin delta Krenecker y es la desviacin estndar del