Tesis Pardeamiento Enzim Nispero PDF

Pardeamiento enzimático del fruto de
níspero (Eriobotrya japonica cv. Algerie):

enzimología y fisiología de las polifenol
oxidasas.
Susana Sellés Marchat

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE AGROQUÍMICA Y BIOQUÍMICA
Pardeamiento enzimático del fruto de

níspero (Eriobotrya japonica cv. Algerie):
enzimología y fisiología de las polifenol oxidasas
Memoria presentada para aspirar al
grado de Doctor en Química
Susana Sellés Marchart
2007
El Dr. D. JUAN SANCHEZ ANDREU, Director del Departamento de Agroquímica y
Bioquímica de la Universidad de Alicante,
CERTIFICA
Que los trabajos experimentales conducentes a la elaboración de la presente memoria titulada

“Pardeamiento enzimático del fruto de níspero (Eriobotrya japonica cv. Algerie):
enzimología y fisiología de las polifenol oxidasas” presentada por Dª. SUSANA SELLES
MARCHART para aspirar al grado de Doctor han sido realizados en los laboratorios del
Departamento de Agroquímica y Bioquímica de la Universidad de Alicante bajo la dirección
del Dr. D. ROQUE BRU MARTINEZ.
Y para que conste a los efectos oportunos firmo el presente certificado en Alicante, a 24 abril
de 2007.
Fdo: Juan Sánchez Andreu

El Dr. D. ROQUE BRU MARTINEZ, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular del
Departamento de Agroquímica y Bioquímica de la Universidad de Alicante,
CERTIFICA
Que los trabajos conducentes a la elaboración de la presente memoria titulada Pardeamiento

enzimático del fruto de níspero (Eriobotrya japonica cv. Algerie): enzimología y fisiología
de las polifenol oxidasas” presentada por Dª. SUSANA SELLÉS MARCHART para aspirar
al grado de Doctor han sido realizados bajo mi dirección.
Y para que conste a los efectos oportunos firmo el presente certificado en Alicante, a 24 de
abril de 2007.
Fdo: Roque Bru Martinez

Agradecimientos
Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que han
contribuido directa o indirectamente para que este trabajo se lleve a cabo.
En primer lugar quiero agradecer a mi director de Tesis, El Dr. Roque Bru Martínez,
por darme la oportunidad de introducirme en el mundo de la investigación y por su
contribución a mi formación científica durante estos años. Su continua y constante
disponibilidad, junto con su espiritu investigador, ha sido para mí un gran estímulo en el
trabajo desarrollado día a día. Gracias por todo.
Al Doctor Juan Casado Vela por la ayuda que me ha brindado en todo momento
haciendo más fácil este trabajo. Por contar con su apoyo y amistad desde el primer día que
entré en el Departamento de Agroquímica y Bioquímica, por los buenos momentos y por no
permitir que la distancia merme nuestra amistad.
Al Dr. Ignacio Luque Romero, científico investigador del Instituto de Bioquímica

Vegetal y Fotosíntesis, por su contribución en una parte importante de esta tesis. Además
quiero agradecerle sus consejos, apoyo y amabilidad en todo momento que ha sido una
muestra de lo grato que puede ser una colaboración.
A mis primeros y antiguos compañeros del laboratorio- Juan, Diego, Nacho y Loli- y a
mis compañeros actuales -Maite, Mª José y Juan Carlos- que todos por igual y cada uno a su
manera, han contribuido con su amistad y ayuda a la realización de este trabajo. Gracias a
todos por hacer del laboratorio una segunda casa, donde he pasado tanto momentos divertidos
como inolvidables. A Diego, por la amistad que nos une y por sus ánimos constantes. A mis
compañeros actuales, por saber escuchar y animarme en los momentos más difíciles, fuera de
lo estrictamente profesional, que se han dado a lo largo de este trabajo.
A Maite Vilella, por su ayuda técnica en la realización del trabajo, por ayudarme
siempre que le he pedido consejo, por ser una buena compañera y sobre todo, una gran amiga.
A Maria José Martínez, por ayudarme en mis deficiencias sobre temas de Biología,
por su apoyo, consejos y amistad.
A Juan Carlos Vera, por tenderme una mano siempre que me ve estresada, por intentar
responder a todas mis preguntas y por su amistad.
A Alfonso, por ayudarme con la técnica de western-blot, por los buenos momentos
compartidos y porque siempre me hace reir.
Al Dr. Vicente Micol Molina y a Lorena Funes Gómez por su ayuda técnica en los
experimentos de fluorescencia.
Al Dr. Luis Vicente López-Llorca, a Jose, Javi y Sonia por la ayuda prestada en el uso
del lector de placas Tecan Genios.
A la Dra. Mª Ángeles Pedreño, por su constante ánimo en el tramo final de este

trabajo.
A Miriam, por su apoyo, ánimo y amistad. Por ser una gran persona y transmitirme
tranquilidad.
A mis mejores amigos, Héctor, Auro, Pecho, Frank, Maria, Lola, Victor, Juanra, Ali,
Gloria, Jose, Mª José, Mari Luz, Raquel, Longui, Lidia, Clara, Sento, Carmen, Miguel,
Alvaro..., por su ánimo en todo momento. Y por esas ganas locas de que termine, que sólo
muestran lo mucho que me echan de menos, tanto como yo a ellos.
A Pili, Mari Pepa y Nuria, compañeras de la carrera y grandes amigas, por animarme a
realizar esta etapa investigadora.
A la cooperativa de Callosa DÈnsarrià y en concreto a Esteban Soler, por haberme

proporcionado los nísperos para el trabajo.
En último lugar, y no por ello menos importante, a mi familia que me ha dado todo sin
pedir nada a cambio. Gracias por vuestro apoyo incondicional, y por el ánimo e ilusión que
me habeis transmitido. Y junto a ellos, mi mejor amigo y compañero, la persona que ha
estado siempre a mi lado, en los momentos buenos y sobre todo en los más duros, donde su
presencia, apoyo y ánimo han sido fundamentales. Gracias Héctor por reunir todo lo que he
necesitado.
El presente trabajo de investigación ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia y
Tecnología y los Fondos Europeos de Desarrollo Regional (FEDER). Proyectos: AGF99-
0396, BIO-2002-03100 y BIO-2005-00332.
El contenido de esta Tesis Doctoral ha sido parcialmente publicado en los siguientes
trabajos:
1. Sellés-Marchart, S., Casado-Vela, J. and Bru-Martínez, R. 2006. Isolation of a latent
polyphenol oxidase from loquat fruit (Eriobotrya japonica Lindl.): Kinetic characterization
and comparison with the active form. Archiv. Biochem. Biophys. 446: 175-185.
2. Sellés-Marchart, S., Casado-Vela, J. and Bru-Martínez, R. Effect of detergents,
trypsin and unsaturated fatty acids on latent loquat fruit polyphenol oxidase. Basis for the
enzyme’s activity regulation. Archiv. Biochem. Biophys. (en prensa).

A Héctor, a mi familia
Indice
Índice
Capítulo I. Introducción general y antecedentes
I.1 Introducción general.............................................................................................................. 1

I.1.1 Origen, clasificación taxonómica e importancia del cultivo del níspero.................... 1
I.1.2 Calidad del fruto del níspero ...................................................................................... 2
I.1.2.1 Tamaño del fruto ............................................................................................ 2
I.1.2.2 Magulladuras.................................................................................................. 3
I.1.2.3 La mancha púrpura......................................................................................... 4
I.1.3 Polifenol oxidasas en plantas...................................................................................... 6
I.1.3.1 Relevancia de PPO en frutos usados como alimentos ................................... 6
I.1.3.2 Distribución y localización .......................................................................... 10
I.1.3.3 Propiedades moleculares .............................................................................. 12
I.1.3.4 Estructura y mecanismo catalítico ............................................................... 14
I.1.3.5 Función biológica......................................................................................... 18
I.1.3.6 Latencia ........................................................................................................ 21
Objetivos.................................................................................................................................. 25
Capítulo II. Purificación y caracterización cinética de la polifenol oxidasa latente
II.1 Introducción ....................................................................................................................... 26

II.2 Materiales y métodos ......................................................................................................... 28
II.2.1 Material vegetal....................................................................................................... 28
II.2.2 Reactivos ................................................................................................................. 28
II.2.3 Métodos ................................................................................................................... 28
II.2.3.1 Purificación del Triton X-114..................................................................... 28
II.2.3.2 Método de extracción y purificación de la enzima polifenol oxidasa ........ 29
II.2.3.3 Ensayo de actividad de polifenol oxidasa................................................... 30
II.2.3.4 Cuantificación del contenido total de proteínas.......................................... 31
II.2.3.5 Cuantificación de compuestos fenólicos..................................................... 31
II.2.3.6 Especificidad de sustrato ............................................................................ 31
II.2.3.7 Estudios de inhibición................................................................................. 32
II.3 Resultados y discusión....................................................................................................... 33
II.3.1 Extracción y purificación enzimática ...................................................................... 33
i
Indice
II.3.2 Caracterización cinética de PPO ............................................................................. 39

II.3.2.1 Parámetros cinéticos de las isoenzimas de PPO ......................................... 39
II.3.2.2 pH óptimo ................................................................................................... 43
II.3.2.3 Temperatura óptima y termoestabilidad ..................................................... 45
II.3.2.4 Especificidad de sustrato ............................................................................ 48
II.3.2.5 Inhibidores .................................................................................................. 50
Capítulo III. Propiedades moleculares de la polifenol oxidasa latente
III.1 Introducción......................................................................................................................55
III.2 Materiales y métodos........................................................................................................55
III.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida..................................................................55
III.2.1.1 Reactivos y soluciones utilizadas ..............................................................55
III.2.1.2 Métodos .....................................................................................................56
- Preparación de las muestras ....................................................................56
- Preparación del gel de acrilamida ...........................................................56
- Condiciones de la electroforesis .............................................................57
- Tinción de los geles.................................................................................57
III.2.2 Cromatografía de filtración en gel .........................................................................58
III.2.3 Amino terminal ......................................................................................................58
III.3 Resultados y discusión .....................................................................................................60
III.3.1 Pureza de PPO latente y masa aparente de la proteína ..........................................60
III.3.2 Amino terminal y análisis de similitud de secuencia.............................................64
Capítulo IV. Regulación de la actividad enzimática de la polifenol oxidasa latente
IV.1 Introducción .....................................................................................................................66

IV.2 Materiales y métodos .......................................................................................................66
IV.2.1 Materiales ..............................................................................................................66
IV.2.2 Métodos .................................................................................................................66
- Ensayos enzimáticos .............................................................................................66
- Ensayos de activación de PPO ..............................................................................66
- Ensayos de inhibición de PPO ..............................................................................67
- Cromatografía de filtración en gel ........................................................................67
- Espectroscopia de fluorescencia ...........................................................................67
ii
Indice
- Determinación fluorimétrica de la concentración micelar crítica de detergentes .68

IV.2.3 Análisis de datos cinéticos.....................................................................................68
IV.3 Resultados ........................................................................................................................70
IV.3.1 Efecto del SDS y la tripsina sobre los perfiles de pH............................................70
IV.3.2 Efecto del SDS en la fluorescencia intrínseca de la PPO latente...........................72
IV.3.3 Efecto del pH, sustrato y tripsina en los parámetros cinéticos ..............................74
IV.3.4 Efecto de los detergentes en la actividad PPO.......................................................80
IV.3.5 Efecto de los detergentes sobre el tamaño aparente de la PPO latente..................84
IV.3.6 Efecto de los ácidos grasos ....................................................................................88
IV.4 Discusión ..........................................................................................................................90
Capítulo V. Identificación molecular de polifenol oxidasas de níspero mediante

cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS)
V.1 Introducción.......................................................................................................................95
V.2 Materiales y métodos.........................................................................................................97
V.2.1 Preparación de los extractos proteicos ....................................................................97
V.2.2 Separación y detección de péptidos con nanoflujo LC-MS/MS .............................98
V.2.2.1 Digestión tríptica de proteínas en gel .........................................................98
V.2.2.2 Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) 98
V.2.3 Identificación de péptidos y proteínas ....................................................................98
V.2.3.1 Identificaciones basadas en los espectros MS/MS .....................................99
V.2.3.2 Identificaciones basadas en la secuenciación de novo..............................100
V.2.4 Construcción de árboles filogenéticos. .................................................................101
V.3 Resultados........................................................................................................................102
V.3.1 Determinación de la diversidad de PPO en frutos de níspero...............................102
V.3.2 Determinación de la secuencia parcial de la PPO latente purificada de 59.2 kDa 103
V.3.3 Determinación de la secuencia parcial de las bandas inmunoreactivas de PPO. ..106
V.3.4 Relaciones filogenéticas entre las PPO de níspero. ..............................................112
V.4 Discusión .........................................................................................................................117
Capítulo VI. Estudio fisiológico de las polifenol oxidasas de frutos de níspero
VI.1 Introducción ...................................................................................................................120

VI.2 Materiales y métodos .....................................................................................................121
VI.2.1 Análisis de pH, azúcar y acidez en frutos de níspero. .........................................121
iii
Indice
VI.2.2 Niveles de actividad y fenoles en las diferentes fracciones de PPO....................121

VI.2.3 Western blot.........................................................................................................121
VI.2.3.1 Reactivos ....................................................................................................121
VI.2.3.2 Métodos:.....................................................................................................122
VI.2.3.2.1 Obtención del anticuerpo ..........................................................122
VI.2.3.2.2 Preparación de los extractos proteicos. .....................................125
- Precipitación con TCA y DXC ...............................................126
- Extracción y precipitación con fenol/acetato amónico /
metanol ......................................................................................126
VI.2.3.2.3 Electrotransferencia ..................................................................127
VI.2.3.2.4 Inmunodetección.......................................................................127
VI.2.3.2.5 Tinción de las membranas ........................................................128
VI.2.3.2.6 Titulación del antisuero.............................................................128
- Determinación de la cantidad mínima de proteína control
y de la dilución del anticuerpo. .................................................128
- Determinación de la dilución de anticuerpo primario para la
fracción particulada de PPO de níspero....................................131
VI.3 Resultados y discusión ...................................................................................................133
VI.3.1 Evolución de PPO durante el desarrollo y la maduración. ..................................133
VI.3.1.1 Caracterización del desarrollo y maduración mediante variables
físicoquímicas........................................................................................................133
VI.3.1.2 Evolución de los niveles de ácido clorogénico, actividad PPO y
bandas inmunoreactivas.........................................................................................136
- Fenoles totales y ácido clorogénico .........................................................136
- Actividad de PPO activa y latente en fracciones solubles y particuladas 137
- Análisis de Western-blot de bandas inmunoreactivas de PPO ................139
VI.3.2 Evolución de PPO durante la post-recolección....................................................145
- Aspecto visual de los frutos ................................................................................145
- Actividad PPO activa y latente de fracciones solubles y particuladas................146
- Análisis de western blot de bandas inmunoreactivas de PPO.............................147
VI.3.3 Evolución de PPO tras el magullado de los frutos ..............................................149
- Aspecto visual de los frutos ................................................................................149
iv
Indice
- Actividad PPO activa y latente de fracciones solubles y particuladas................151

-Análisis de western blot de bandas inmunoreactivas de PPO..............................152
Conclusiones.......................................................................................................................... 155
Bibliografía............................................................................................................................ 158
Anexo A . ............................................................................................................................... 177
Anexo B ................................................................................................................................. 184
v
Abreviaturas
Abreviaturas
A continuación se presenta una lista con las abreviaturas que aparecen durante la
redacción de este trabajo.
AA Aminoácido
AC Ácido clorogénico
ACN Acetonitrilo
BHA Butilhidroxianisol
BHT Butil hidroxitolueno
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
Cmc Concentración micelar crítica
CD(s) Ciclodextrina(s)
α-CD α-Ciclodextrina
β-CD β- Ciclodextrina
γ-CD γ- Ciclodextrina
CS Cobertura de secuencia
CTAB Bromuro de cetiltrimetilamonio
cv. Cultivar
DEAE Dietilaminoetil
DEDTC Ácido dietil ditiocarbámico
DPHT 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno
DTT Ditiotreitol
DXC Desoxicolato
EDTA Ácido etilen-diamino-tetraacético
ESI Ionización por electrospray
FAO Organización para la Agricultura y Alimentación de Naciones Unidas
Ha Hectáreas
H2O2 Peróxido de hidrógeno
HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento
IC50 Concentración para una inhibición del 50%
IPTG Isopropil-β-D-tio-galactósido
Kav Coeficiente de partición
kcat Constante catalítica
(k)Da (Kilo)Dalton
Km Constante de Michaelis-Menten
LC-MS/MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
L-dopa L- β-3,4-dihidroxifenilalanina
Li Ácido linoleico
α-Ln Ácido α-linolénico
γ-Ln Ácido γ-linolénico
MAPA Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación
MALDO Malus domestica (Acc.14194273)
4-MC 4-metil catechol
MeJA Metil-jasmonato
NaCl Cloruro de sodio
Na2CO3 Carbonato de sodio
vi
Abreviaturas
NaN3 Azida sódica

NCBI Centro Nacional de Información Biotecnológica
nm Nanómetros
O2 - Ion superóxido
Ol Ácido oleico
Pf Peso fresco
Pm Masa molecular
POD(s) Peroxidasa(s)
mPPO Polifenol oxidasa madura
pPPO Polifenol oxidasa precursor
PPO(s) Polifenol oxidasa(s)
PRUAR Prunus armeniaca (Acc. 3282505)
PVDF Difluoruro de polivinilideno
Rf Movilidad relativa
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
ROS Especies reactivas de oxígeno
Rpm Revoluciones por minuto
SDS Dodecil sulfato de sodio
SDSA Dodecano sulfonato de sodio
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio
SOS Octil sulfato de sodio
SOSA Octano sulfonato de sodio
STS Tetradecil sulfato de sodio
TBC 4-tert-butil catecol
TBS Tampón Tris salino
TCA Ácido tricloroacético
THF Tetrahidrofurano
Tm Toneladas métricas
TMV Virus del mosaico del tomate
Tris 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanodiol
Trp Triptófano
Tyr Tirosina
TX-100 Triton X-100, Poli-(9-10)-oxietilen p-t-octil-fenol
TX-114 Triton X-114, Poli-(7-8)-oxietilen p-t-octil-fenol
λ Longitud de onda
λmax Longitud de onda máxima
vii
Capítulo I.
Introducción general y antecedentes
I.1 INTRODUCCIÓN GENERAL
I.1.1 Origen, clasificación taxonómica e importancia del cultivo del níspero
El níspero japonés es originario del sudeste de China, donde se conoce desde hace
2000 años (Lin y col., 1999). De allí paso a Japón, país en el que se cultiva desde 1180
(Ichinose, 1995). En Europa se cultiva desde el S. XVIII, donde se introdujo como especie
ornamental. Después se introdujo en los países mediterráneos, Argelia, Chipre, Egipto,
Grecia, Italia, España, Túnez y Turquía (Morton, 1987).
Taxonómicamente pertenece a la familia de las Rosáceas, que también incluye

especies de gran importancia agronómica como manzano, peral, melocotonero, albaricoquero,
ciruelo y almendro y el nombre científico del níspero es Eriobotrya japonica. Se trata de uno
de los frutales menores de mayor interés comercial en las comarcas mediterráneas y
concretamente en la Comunidad Valenciana y, además constituye un patrimonio genético
importantísimo (Martínez-Calvo y col., 2000).
A nivel mundial China es el primer productor, seguido de España, Japón, Italia y

Brasil (FAO, 1999).
En el área del Mediterráneo, España es el primer país productor de níspero. Existen

3275 ha cultivadas en plantación regular, de las cuales están en producción 3.160,
obteniéndose una producción aproximada de 36.500 tm (MAPA, 1997).
Por Comunidades Autónomas, la Comunidad Valenciana, con más de 2.000 ha (el

63% del total español), es la principal productora. Solamente la provincia de Alicante
representa el 45% de la superficie cultivada en España, y el 52% de la producción total. Le
sigue en importancia Andalucía con 1.160 ha cultivadas (35%) y, a mucha distancia, Murcia,
Cataluña y Baleares (MAPA, 1997).
Las exportaciones en España representan algo más del 70% de la producción regular,
siendo los principales países importadores de la producción española, Italia, Portugal y
Francia, los cuales reciben el 95% del total de las exportaciones (Espinosa, 1996).
En la Comunidad Valenciana, la casi totalidad de la producción (98%), se dedica al

mercado fresco. De esta se exporta entre un 65% y un 70%, principalmente a Italia. Solo el
2% restante se destina a la industria, preferentemente a conserva de níspero en almíbar y
concentrados.
1
Las variedades más cultivadas en España son Algerie, Cardona, Golden Nugget,
Peluche y Moggie (Martínez-Calvo y col., 2000).
En este trabajo, hemos utilizado la variedad Algerie (figura 1.1) cuyas características
son las siguientes: variedad procedente de Argelia, pero multiplicada comercialmente en la
zona de Callosa dÉnsarrià. Variedad vigorosa y productiva, con el 60-85% de brotes laterales
y centrales fructíferos. Las hojas son grandes, con dientes espaciados. El fruto es redondeado-
alargado, con un peso medio de 65 g. Tanto la piel como la pulpa son de color amarillo-
anaranjado. Es la variedad cultivada por excelencia en la Comunidad Valenciana y tiene
buenas características vegetativas y excelentes características organolépticas.
Figura 1.1. Fruto de níspero de la variedad Algerie (Gariglio y col., 2002).
I.1.2 Calidad del fruto del níspero
Como para la mayoría de las especies frutales cuyo destino es el consumo en fresco, la
calidad del níspero japonés se basa en sus características intrínsecas, organolépticas y aspecto
externo, sobre todo la forma, tamaño, color y ausencia de lesiones. El tamaño final que
adquiere el fruto, la ausencia de magulladuras y de mancha púrpura, como desorden
fisiológico, son tres de los aspectos valorados por el consumidor y por tanto son problemas
importantes a los que se enfrentan los cultivadores en España.
I.1.2.1 Tamaño del fruto
El tamaño que alcanza el fruto en la madurez no es generalmente aceptable, de

acuerdo con la demanda del mercado. Esta falta de tamaño comercial es debida a la
competencia por carbohidratos que se establece entre los frutos que inician el desarrollo hasta
la maduración, por lo que el aclareo de frutos es una práctica habitual para incrementar su
2
tamaño (Lin y col., 1999). Esta práctica es efectiva pero supone entre un 25-30% de los costes
del cultivo. También puede mejorarse el tamaño del fruto mediante el rayado de ramas para
mejorar la disponibilidad de carbohidratos (Agustí y col., 1997) y mediante la aplicación de
reguladores de crecimiento como auxinas de síntesis que mejoran el tamaño por un efecto
directo sobre su desarrollo (Agustí y col., 1999).
I.1.2.2 Magulladuras
El níspero es un fruto no climatérico y por ello se recolecta una vez madurado en el

árbol. En este estadio de desarrollo la textura del fruto es frágil y susceptible de
deformaciones por causas mecánicas.
La consistencia coriácea de las hojas resulta perjudicial para el aspecto del fruto pues
la simple rozadura causada por el desplazamiento de las hojas por el viento produce manchas
marrones, típicas del pardeamiento enzimático. Para paliar este problema se recurre cada vez
más al cultivo bajo malla, reduciendo considerablemente el efecto del viento y produciendo,
además, mayor uniformidad en la floración y maduración de los frutos, con el consecuente
ahorro de mano de obra. Sin embargo, el cultivo bajo malla altera las condiciones ambientales
de temperatura y humedad, que provocan la falta de cuajado en algunas variedades.
El grado de manipulación del níspero desde su recolección hasta su presentación al

consumidor es bastante elevado, lo cual aumenta el riesgo de daños mecánicos. Su textura
frágil unida a una piel fina y poco pigmentada y una pertinaz actividad polifenol oxidasa son
la causa de la manifestación de magulladuras o zonas de decoloración parda y textura blanda a
las pocas horas de sufrir daños mecánicos.
Las magulladuras se originan por fuerzas de compresión, impacto y abrasión. La

magulladura por impactos es el resultado de caídas, rebotes o choques, la de compresión
ocurre cuando las cajas están demasiado llenas y los frutos son apretados unos contra otros y
la de abrasión resulta de la fricción de un fruto contra otro o contra las superficies del
contenedor (Day, 1992). Cualquiera de estos daños, cambian la textura o el color del tejido,
debido a la destrucción de los compartimentos celulares del fruto, que permiten que los
sustratos de naturaleza fenólica sean accesibles a la enzima polifenol oxidasa, dando lugar a
polímeros oscuros. En general, todos los tipos de magulladura resultan de una inapropiada
manipulación o inadecuado embalaje. En el caso específico de la magulladura de impacto la
incidencia de la severidad dependerá de la altura en que el fruto se deja caer y del tipo de
3
superficie de impacto (Crisoto y col., 1993; Crisoto y col., 1996). Cualquier daño mecánico
puede incrementar la tasa de respiración y producción de etileno lo que conlleva a una
aceleración en la maduración del fruto, ablandamiento, pérdida de agua y deterioro general de
los frutos (Crisoto y col., 1993). Además, el daño por impacto causa heridas superficiales en
el fruto lo que facilita la entrada de microorganismos y desarrollo de putrefacciones (Crisoto y
col., 1996).
I.1.2.3 La mancha púrpura
La mancha púrpura es el problema principal que presenta este cultivo de forma general
para todas las zonas cultivadas, y en particular en Alicante, (figura 1.2). La mancha púrpura
del níspero (o mancha morada) es una alteración fisiológica frecuente que afecta a la
epidermis del fruto, produciendo manchas pardo-violetas más notorias en la parte expuesta al
sol que desmerecen su calidad comercial sin que se observen síntomas en otros órganos de la
planta (Ojima y col., 1976). En España se considera que daña el 15% de la producción
afectando al precio del fruto en un 40-50%. La coloración morada que caracteriza esta
fisiopatía, es el resultado de una oxidación en el tejido subcuticular del fruto, con frecuencia
en la zona de elongación del fruto, en la que participa la enzima polifenol oxidasa (Tuset y
col., 1989).
Figura 1.2. Frutos de Níspero japonés, cv. Algerie, afectados de mancha púrpura
(Gariglio y col., 2002).
Los síntomas de la alteración aparecen en el momento del cambio de color del fruto,
cuando los frutos empiezan a virar de color verde al verde-amarillento (Tuset y col., 1989) y
se agrava cuando el crecimiento del fruto coincide con temperaturas diarias muy bajas
(Gariglio y col., 2003a). La aparición de la fisiopatía en un momento puntual hace pensar en
4
una fuerte influencia de los factores endógenos del fruto como la transpiración cuticular,
composición mineral, concentración de azúcar y relaciones hídricas. Sin embargo, estudios
recientes (Gariglio y col., 2002) han demostrado que no existen diferencias en la transpiración
cuticular entre frutos sanos y afectados y por ello la pérdida de agua no puede ser la causa del
desorden.
Cuando los frutos de níspero presentan sintomatología de mancha púrpura, las células
del tejido afectado aparecen deshidratadas con el citoplasma colapsado y su contenido celular
fuera del plasmalema (Gariglio y col., 2002). La lesión empieza en las células hipodérmicas
más profundas próximas a las células más externas de la pulpa y cuando los síntomas
aumentan, se incrementan el número de células epidérmicas implicadas, alcanzando en
estados severos toda la epidermis excepto la cutícula que permanece intacta (Gariglio y col.,
2002).
La alteración aparece durante todo el periodo de cosecha, pero es proporcionalmente

más intensa al inicio de la misma. Debido a esto los sistemas de cultivo tendentes a exaltar la
precocidad, de gran interés desde el punto de vista económico, son los que promueven una
afección mayor. Además esta comprobada la influencia del sol sobre la aparición de la lesión,
así como el exceso de abono nitrogenado y el uso de prácticas tendentes a aumentar el tamaño
del fruto, mediante técnicas de aclareo (Gariglio y col., 2003b). Hasta el presente, el origen
más aceptado de la mancha púrpura es una deficiencia localizada de calcio en el fruto
(Caballero, 1993; Tuset y col., 1989), sin embargo, la concentración de calcio en el fruto y
epidermis no muestra diferencias entre frutos sanos y dañados (Gariglio y col., 2002),
observándose diferencias en otros elementos como K, Fe y Cu, los cuales presentan mayor
concentración en frutos afectados por este desorden. Además de la carencia de este
macronutriente, la alteración puede deberse a una deficiencia de dos micronutrientes, Cu y Zn
o debido a una excesiva acidificación del fruto (Casado y col., 2003a).
Por otra parte, el contenido en azúcares se ha relacionado con este desorden (Gariglio
y col., 2003b), observándose una concentración de sacarosa superior al 25% en frutos
afectados (Gariglio y col., 2005). Además, se ha reforzado la hipótesis de que el desorden
aparece como consecuencia de un desequilibrio entre el contenido de agua presente en la
pulpa y la epidermis causado por la diferente habilidad de los tejidos para acumular azúcar.
Para mejorar la retención de agua en la epidermis y evitar la deshidratación celular se han
5
aplicado diferentes compuestos minerales (nitrato de calcio, cloruro de calcio, nitrato de

amonio, nitrato de potasio) durante las dos semanas anteriores al cambio de color
observándose una mayor retención de agua en la epidermis (Gariglio y col., 2005). Estos
resultados, refuerzan la hipótesis de un mejor control del desorden como consecuencia de un
efecto general de sales minerales sobre la relación de agua entre la epidermis y pulpa, más que
un efecto específico debido a un catión.
I.1.3 Polifenol oxidasas en plantas
I.1.3.1 Relevancia de PPO en frutos usados como alimentos
El fenómeno de pardeamiento de frutos y vegetales durante el crecimiento, recogida,

almacenamiento y procesado, es un problema de primera magnitud en la industria alimentaria
y se reconoce como una de las principales causas de pérdidas de calidad y valor comercial.
Este pardeamiento produce cambios importantes tanto en la apariencia (colores oscuros) como
en las propiedades organolépticas (sabor, textura) de vegetales comestibles (Mayer, 1987), y
además suele ir asociado al desprendimiento de olores y efectos negativos sobre el valor
nutricional (Amiot y col., 1992; Chen y col., 2000).
Las reacciones de oxidación que provocan el pardeamiento de frutos y vegetales son

de origen enzimático y están catalizadas principalmente por la enzima polifenol oxidasa
(PPO), siendo su actividad particularmente alta en aquellos frutos y vegetales que contienen
niveles altos de compuestos polifenólicos (Amiot y col., 1992).
En el procesamiento de alimentos suele ser una actividad perniciosa, pues en contacto

con el aire cataliza la oxidación de los compuestos fenólicos naturales a sus correspondientes
quinonas, y éstas evolucionan de forma espontánea hacia diferentes pigmentos que producen
el pardeamiento de los frutos, provocando un aspecto desagradable frente al consumidor y
considerables pérdidas económicas. Esta es la razón fundamental por la que el contenido de
fenoles y polifenol oxidasa se consideran determinantes para evaluar la calidad de frutos y
vegetales (Lee y Whitaker, 1995; Tomás-Barberán y Espín, 2001). El níspero no es una
excepción, y los fenómenos de pardeamiento asociados a magulladuras, mancha púrpura y
maduración están relacionados con la PPO.
En plantas existe una gran cantidad y diversidad estructural de compuestos fenólicos

pertenecientes a diversas familias como ácidos fenólicos, cumarinas, lignanos, ligninas y
flavonoides. Estos compuestos desempeñan funciones importantes en las plantas, siendo las
6
más relevantes las de protección frente a radiación ultravioleta y frente a condiciones de estrés
biótico gracias a las propiedades antimicrobianas de los propios compuestos fenólicos y
mediante sellado de heridas por lignificación (Hermann, 1976; Ke y Salveit, 1988; Macheix y
col., 1991).
La composición cualitativa y cuantitativa de fenoles en los tejidos vegetales varía

considerablemente según la especie de que se trate, grado de madurez de los frutos y manejo
post-cosecha de los mismos (Tomás-Barberán y Espín, 2001). Además, para una misma
especie el contenido de fenoles es dependiente de la variedad (Ding y col., 1998a; Ding y col.,
2001). Los niveles de fenoles para la variedad Algerie de níspero aumentan a lo largo del
desarrollo, alcanzándose los niveles más altos durante la recolección (Casado y col., 2003b),
mientras que para las variedades Mogi y Tanaka el contenido de fenoles decrece hasta
alcanzar el mínimo en el momento del cambio de color del fruto y después aumenta
progresivamente alcanzando el máximo en la recolección (Ding y col., 1998a; Ding y col.,
2001). Sin embargo, las fluctuaciones en los niveles de fenoles en el níspero suelen ser
pequeñas durante la maduración independientemente de la variedad (Ding y col., 1998a; Ding
y col., 2001) y para otras especies de la misma familia (Hobson, 1967; Amiot y col., 1995).
En la degradación oxidativa de estos compuestos fenólicos, participan dos enzimas

que son muy relevantes en términos de calidad de frutos y vegetales, por la formación de
melaninas que oscurecen los frutos. Estas enzimas son la polifenol oxidasa (PPO) y la
peroxidasa (POD). A pesar de que las PODs están ampliamente distribuidas en el reino
vegetal, su papel en el pardeamiento enzimático de frutos y vegetales esta todavía bajo
discusión, debido a que el nivel de H2O2 interno en las plantas limita la actividad peroxidasa.
Se ha propuesto que la PPO puede actuar como promotor de la POD puesto que en las
reacciones de oxidación de compuestos fenólicos se genera H2O2 (Richard-Forget y Gauillard,
1997; Subramanian y col., 1999). El estado antioxidante de diferentes frutos y vegetales
puede decrecer por la oxidación directa de estos en presencia de PPO y POD (Jiménez y col.,
1998; Jiménez y García-Carmona., 1999). Sin embargo, la principal enzima responsable del
pardeamiento enzimático es la PPO, aunque no debe ser excluido un posible efecto sinérgico
entre PPO y POD (Tomás-Barberán y Espín, 2001).
Uno de los objetivos principales de la industria alimentaria es prevenir el

pardeamiento enzimático antes o durante el procesamiento de frutos y vegetales. El control de
7
este fenómeno requiere un conocimiento químico del tipo de sustratos fenólicos presentes en
cada planta, del nivel de compuestos reductores, el nivel de accesibilidad del O2, la naturaleza
de los diferentes compuestos oxidables y la polimerización y degradación de las o-quinonas.
Además es necesario conocer el nivel de PPO y los sustratos disponibles a lo largo de los
diferentes estados de desarrollo de la planta y sobre todo, es importante distinguir entre el
pardeamiento enzimático y no enzimático (figura 1.3) (reacción de Maillard) (Lee y Witaker,
1995).
PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO
R cresolasa R OH catecolasa R O
OH O2 OH 1/2 O2 H2O O
incoloro incoloro coloreado
nucleófilos
pigmentos oscuros
PARDEAMIENTO NO ENZIMÁTICO
O OH OH
Proteína NH2 + H C C R Proteína N CH C R

glucosa base de Schiff
H H
O O O
NH2
Polímeros C C
R R´ Proteína NH CH2 C R
oscuros
productos con grupos carbonilo Producto de Amadori
Figura 1.3. Reacción de pardeamiento enzimático y no enzimático (reacción de

Maillard).
Este pardeamiento no enzimático consiste en la condensación de un grupo aldehído o

cetona de un azúcar con un grupo amino libre para formar una base de schiff, la cual se
reorganiza para formar una cetamina estable (producto de Amadori) y finalmente se degradan
a productos reactivos que contienen grupos carbonilo. Estos grupos pueden reaccionar con
grupos amino dando lugar a polímeros oscuros. Esta reacción que tiene lugar al calentar
mezclas de aminoácidos y carbohidratos (Walker y Mckersie, 1993) se ha descrito en uva
8
(Cheynier y Ricardo da Silva, 1991) y manzana (Oleszek y col., 1989; Richard-Forget y col.,
1992a).
Entre las diferentes técnicas para controlar el pardeamiento y mantener la calidad de

frutos y vegetales, una de las más usadas es la aplicación de inhibidores químicos, los cuales
consiguen inactivar los mecanismos no deseados. En principio, la actividad de esta clase de
inhibidores implica una interacción directa con la enzima o reaccionan preferiblemente con el
producto que conduce por reacción no enzimática a la formación de pigmentos oscuros.
Entre los diversos tipos de inhibidores vamos a destacar cuatro grupos: sulfitos,
agentes antioxidantes o reductores, acidulantes y compuestos quelantes. Los sulfitos son los
compuestos más efectivos en prevenir el pardeamiento enzimático (Sapers, 1993). Aunque el
mecanismo de actuación de los sulfitos para prevenir el pardeamiento no está claro, pueden
provocar una inhibición directa de la enzima, como se ha observado en la inhibición de PPO
de fresa por metabisulfito de sodio (Wesche-Ebeling y Montgomery, 1983), pueden
interaccionar con los intermedios evitando que estos participen en la formación de pigmentos
(Sayavedra-Soto y Montgomery, 1986) o pueden actuar como agentes reductores convirtiendo
a las quinonas en difenoles. A pesar de su efectividad en la prevención de la calidad de frutos
y vegetales, estos compuestos están sujetos a restricciones debido a que provocan efectos
adversos en la salud. Entre los antioxidantes, se han utilizado compuestos fenólicos sintéticos
como butilhidroxitolueno (BHT) y butilhidroxianisol (BHA), ampliamente utilizados en
alimentación para proteger el sabor y color de los alimentos y algunos compuestos fenólicos
naturales como tocoferol, derivados del ácido cinámico y flavonoides como la quercetina y el
kaemferol (Ashie y col., 1996).
Una de las mejores alternativas al uso de los sulfitos es el ácido ascórbico, este
compuesto es altamente efectivo en la inhibición del pardeamiento por su habilidad de reducir
las quinonas producidas por la PPO a los fenoles antes de que la reacción de formación de
pigmentos tenga lugar. Sin embargo, el ácido ascórbico es muy reactivo y se oxida
rápidamente a ácido dehidroascórbico (DHAA), pudiendo reaccionar con otros compuestos
que conllevan a cambios en la calidad de los frutos. A veces se utiliza en combinación con
acidulantes, siendo el más utilizado el ácido cítrico debido a su presencia natural en tejidos.
Otros inhibidores utilizados son los compuestos sulfhidrilos como mercaptoetanol, ditiotreitol
y tiourea por su habilidad como agentes reductores, sin embargo, las concentraciones
9
necesarias para prevenir el deterioro del fruto no son permitidas en alimentación. La cisteína
se ha mostrado como un inhibidor fuerte de PPO en banana y manzana, siendo incluso más
efectivo que el metabisulfito (Ashie y col., 1996; Richard-Forget y col., 1992b), sin embargo,
la concentración necesaria para alcanzar altos niveles de inhibición tiene efectos negativos en
el sabor de los frutos. Además se han utilizado agentes quelantes como ácidos
policarboxílicos, polifosfatos y ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA) para inactivar a la
PPO. A pesar de que muchos de estos compuestos son bastante efectivos en el control del
pardeamiento enzimático, a menudo su uso en alimentación está limitado por producir efectos
adversos en la salud, debido a un coste efectivo o porque su acción es sólo temporal como el
ácido ascórbico. Por este motivo, cada vez se recurre más a la utilización de productos
alternativos al metabisulfito como las ciclodextrinas, que tienen la capacidad de incluir una
amplia variedad de moléculas orgánicas e inorgánicas, incluyendo a los polifenoles (Cai y
col., 1990), dentro de su cavidad hidrofóbica, aunque el coste es elevado. Recientemente, se
han utilizado productos de la reacción de Maillard, sintetizados a partir de azucares (pentosa,
hexosa, o disacárido) y compuestos tiol como inhibidores del pardeamiento enzimático en
manzana, champiñón y berenjena (Billaud y col., 2005).
I.1.3.2 Distribución y localización
La polifenol oxidasa (PPO), es una metaloenzima ampliamente distribuida en la escala

filogenética, encontrándose tanto en organismos procariotas como en eucariotas. Se trata de
una enzima ampliamente distribuida en el reino vegetal, siendo detectada en algas, briófitos,
pteridófitos, gimnospermas y angiospermas (Mayer y Harel, 1979).
La polifenol oxidasa se ha descrito en diversos tejidos de plantas como raíces (Pérez-

Gilabert y col., 2001; Gandía-Herrero y col., 2004), semillas (Paul y Gowda, 2000), hojas
(Robinson y Dry, 1992; Sánchez-Ferrer y col., 1993; Chazarra y col., 1996; Mazzafera y
Robinson, 2000; Chazarra y col., 2001a; Shi y col., 2002) y frutos (Murata y col., 1992; Ding
y col., 1998b; Fraignier y col., 1995; Serradell y col., 2000; Casado y col., 2005a).
Estudios clásicos de PPO localizan a la enzima en la fracción soluble de las células o

fuertemente unida a membranas subcelulares (Mayer y Harel, 1979). Sin embargo, esta
asignación de localización se debe en algunos casos al método de extracción utilizado. A
pesar de los posibles artefactos la mayoría de las polifenol oxidasas vegetales se encuentran
asociadas a membranas, principalmente a las membranas tilacoidales del cloroplasto (Tolbert,
10
1973). El tipo de unión a la membrana depende del tejido y del estado de desarrollo de la
planta. Aunque las PPOs se han localizado en las membranas tilacoidales (Golbeck y
Cammarata, 1981; Chazarra y col., 1996), no son proteínas intrínsecas de membrana. A pesar
de que en el tabaco (Hofer, 1964) se libera simplemente por fuerza iónica débil, para la
mayoría de los tejidos hacen falta tratamientos más enérgicos para su solubilización:
detergentes como Triton X-100, (Harel y Mayer, 1971), enzimas proteolíticas (Mayer, 1966)
etc. Estos tratamientos pueden alterar la estructura y la conformación de la enzima
provocando el paso de su forma inactiva o latente a su forma activa (Kenten, 1958). Esta
solubilización también tiene lugar en condiciones naturales, como son la maduración de las
frutas y el envejecimiento de los tejidos (Harel y col., 1966; Kidron y col., 1978).
Diversas evidencias apuntan hacia la localización concreta de las PPOs de plantas

superiores en las membranas tilacoidales (Mayer, 1987; Vaughn y col., 1988; Kowalski y col.,
1992), aunque existen trabajos que describen la existencia de algunas PPOs vegetales en
forma soluble en el lumen de los tilacoides (Somer y col., 1994; Murata y col., 1997).
Varios trabajos en los que se utilizan frutos como fuente de PPO (Casado y col.,
2005a; Ding y col., 1998b; Gandía-Herrero y col., 2005a y b ), han descrito la presencia de
actividad PPO en fracciones particuladas y solubles del mismo tejido, mostrando propiedades
cinéticas diferentes, que comprometen la localización exclusiva de la proteína en los plastos.
Técnicas de inmunoprecipitación con oro coloidal han permitido demostrar la localización de
PPO en aquellos tejidos con escasa o nula presencia de cloroplastos en células del parénquima
denominadas idioblastos, que además acumulan cantidades elevadas de fenoles (Thipyapong
y Steffens, 1997).
Las PPOs vegetales son proteínas codificadas por el núcleo en forma de precursor
(Lax y col., 1984; Kowalski y col., 1990). El análisis de las secuencias de aminoácidos a
partir de cDNA de PPO de tomate (Newman y col., 1993; Hunt y col., 1993), haba (Cary y
col., 1992) y espinaca (Hind y col., 1995) muestran que la enzima PPO presenta un péptido
señal de transporte al cloroplasto y, en concreto, a tilacoides (Keegstra y Froeehlich, 1999,
Keegstra y Cline, 1999).
Estudios realizados por Sommer y col. (1994) con cloroplastos aislados, demuestran
que el proceso de translocación por transporte al cloroplasto de los polipéptidos de PPO de
tomate (67 kDa) resultantes de la traducción en el citosol se lleva a cabo en dos pasos. Un
11
primer paso implica la translocación por transporte hacia el estroma, produciéndose la

eliminación del amino terminal y proporcionando un intermediario de 62 kDa y
posteriormente un segundo paso de translocación por transporte a los tilacoides por un
proceso dependiente de ATP, que genera una proteína madura de 59 kDa. En este tránsito el
péptido señal se elimina por una peptidasa cloroplastídica (Koussevitzky y col., 1998). Así
mismo, Koussevitzky y col. (2004) han demostrado que el pretratamiento con MeJA de
plantas de tomate incrementa considerablemente la eficiencia de la translocación por
transporte de la polifenol oxidasa precursor (pPPO) del plástido al tilacoide. Estos autores
muestran un incremento en el nivel de la polifenol oxidasa madura (mPPO) en la fracción del
tilacoide después de las 8-16 h del tratamiento. Además este aumento en el nivel de mPPO
parece ser específico del tratamiento con MeJA para las plantas de tomate, debido a que otros
tratamientos, los cuales incrementan la expresión de genes de PPO como daños mecánicos o
exposición de las plantas a etileno durante 48 horas (Thipyapong y Steffens, 1997), no
muestran ningún efecto en la translocación por transporte del pPPO hacia el tilacoide. Esta
eficiencia observada en el transporte de pPPO para las plantas de tomate, se ha descrito para
otras plantas de la misma familia como el tabaco, mientras que el tratamiento con MeJA de
plantas leguminosas como el guisante, no afectó al transporte de los dos precursores de PPO
(Koussevitzky y col., 2004). La translocación de PPO está fuertemente inhibida por la
presencia de pequeñas concentraciones de Cu2+, lo que sugiere que la proteína ha de
transportarse en su forma desplegada y además, indica que el dominio de unión a cobre tiene
una fuerte avidez por este metal (Sommer y col., 1994). A pesar de esta fuerte unión del sitio
activo por el cobre, los procesos de homogenización y extracción de tejidos para realizar los
estudios de actividad de PPO en vegetales pueden provocar la pérdida de este metal de su
lugar correspondiente en la enzima, provocando la pérdida de actividad que a veces se puede
recuperar mediante incubación con sales de cobre (Mari y col., 1998; Casado y col., 2005a).
Nielsen y col. (1996) descubrieron que no hay péptido de tránsito amino terminal en
tirosinasas de hongos, lo cual es coherente con la ausencia de compartimentos plastídicos en
hongos. Así pues, las tirosinasas de hongos se encuentran localizadas en el citosol (Wickers y
col., 1995).
I.1.3.3 Propiedades moleculares
Las polifenol oxidasas vegetales se describen generalmente como metaloenzimas que

contienen dos átomos de cobre en el sitio activo (Mayer y Harel, 1979). El estado de
12
oxidación del cobre en el centro activo de la polifenol oxidasa ha sido motivo de controversia
desde el firme establecimiento de este metal como cofactor de la enzima.
La eliminación del péptido de tránsito amino terminal, responsable del paso del
cloroplasto al tilacoide, reduciría la masa molecular de las PPOs entre 5 y 10 kDa quedando
una proteína madura de unos 60 kDa (Robinson y Dry, 1992; Dry y Robinson, 1994; Cary y
col., 1992; Newman y col., 1993; Thygesen y col., 1995; Sahar y col., 1992; Hunt y col.,
1993; Anderson y Morris, 2003). El sitio de corte por una proteasa específica para eliminar el
tránsito amino terminal se ha identificado como alanina-alanina o alanina-serina en todas las
PPO de plantas examinadas hasta ahora (Lee y Whitaker, 1995). El análisis de la secuencia
madura indica que la proteína madura comprende un dominio largo de aproximadamente 40
kDa que contiene dos regiones de cobre altamente conservadas, las cuales son requeridas para
la actividad de la enzima (Newman y col., 1993; Hunt y col., 1993; Van Gelder y col., 1997),
y un dominio C-terminal de aproximadamente 16 kDa que no tiene una función asignada
claramente, aunque podría tener un papel en la activación de la enzima (Ratjhen y Robinson,
1992).
Haruta y col. (1999) compararon las secuencias de aminoácidos de PPO de diferentes

vegetales (pera, melocotón, níspero, manzana, judía, patata, haba y tomate), mediante el
alineamiento de 204 aminoácidos que comprenden el centro activo de la enzima con los dos
átomos de Cu. Estos autores muestran una gran similitud en la secuencia de aminoácidos para
especies de la misma familia (manzana, pera, níspero y melocotón), con valores
comprendidos entre 82.8 y 97.5%, mientras que el grado de homología es menor, entre un
55.1 y 68.6% entre especies de diferente familia. Esta gran similitud, observada para las
diferentes Rosáceas se ha descrito en plantas Solanáceas como el tomate (Newman y col.,
1993), patata (Hunt y col., 1993) y tabaco (Goldman y col., 1998). Asimismo, se ha mostrado
la antigenicidad común de PPO de diferentes familias como guisantes, lechuga, espinaca y
tabaco (Lanker y col., 1988) usando anticuerpos específicos de PPO de haba. Por el contrario,
Haruta y col. (1999) utilizaron un anticuerpo específico de PPO de manzana que reaccionó
con PPOs de la misma familia como níspero y pera, pero no mostró antigenicidad con
especies de diferente familia como el caqui.
La determinación del peso molecular y la estructura cuaternaria de la enzima PPO en

plantas superiores ha resultado problemática debido a la existencia de múltiples bandas
13
electroforéticas que se interpretaron como fenómenos de asociación-disociación ó

transformación de unas formas enzimáticas en otras durante la maduración (Harel y col.,
1973), pero que en realidad se debían a modificaciones sufridas durante los procesos de
extracción (Mayer y Harel, 1979). Por ello, el rango de pesos moleculares encontrados para
las PPOs de diferentes tejidos vegetales era bastante amplio, oscilando entre 10000-130000
Dalton. El control de la oxidación de fenoles y la proteolisis durante la extracción rinde un
polipéptido de 60 kDa, descrito por primera vez para haba (Robinson y Dry, 1992) y
posteriormente para níspero (Ding y col., 1998b). Aunque la proteína es monomérica, algunos
autores presentan evidencias de estructuras conformadas por la unión de varias subunidades
formando multímeros. En champiñón, la PPO forma asociaciones de diferentes tamaños
(diméricas hasta octaméricas) con pesos moleculares de hasta 128 kDa (Lee y Whitaker,
1995). En lechuga (Chazarra y col., 2001a) y judía (Kanade y col., 2006) se han descrito
formas tetraméricas.
I.1.3.4 Estructura y mecanismo catalítico
La única estructura de PPO determinada hasta la fecha es la de tubérculo de batata a

partir de cristales por difracción de Rayos X (Klabunde y col., 1998). Esto ha supuesto un
gran avance en la comprensión de la estructura y mecanismo de las polifenol oxidasas La
proteína purificada empleada para la determinación estructural carecía de la extensión C-
terminal, por tanto no existe ninguna estructura resuelta de la proteína madura completa.
Como se muestra en la figura 1.4, la PPO de batata es un monómero de 39 kDa, que

presenta forma elipsoidal, con dimensiones 55×45×45 Å.
Figura 1.4. Representación estructural de PPO de batata (Ipomoea batata) según

Klabunde y col. (1998).
14
Como se muestra en la figura 1.5, cada uno de los átomos de cobre del centro
catalítico (CuA y CuB) se encuentra complejado mediante tres residuos de histidina. CuA se
encuentra coordinado a los residuos de histidina 88, 109 y 118, mientras que CuB se
encuentra unido a los residuos de histidina en las posiciones 240, 244 y 274.
Figura 1.5. Estereografía de un detalle del centro activo de PPO de batata.
Para comprender el mecanismo de reacción complejo de esta enzima hay que tener en
cuenta la estructura de su centro activo (figuras 1.4 y 1.5) con dos átomos de cobre (Klabunde
y col., 1998), la existencia de dos actividades catalíticas y la posterior evolución química de
los compuestos formados.
Las polifenol oxidasas vegetales suelen presentar una doble actividad, monofenolasa
(monofenol monooxigenasa) y difenolasa (catecol oxidasa):
- monofenol monooxigenasa / EC 1.14.18.1:

L-tirosina + L-dopa + O2 = L-dopa + dopaquinona + H2O
La actividad monofenol monooxigenasa o cresolasa consiste en la hidroxilación en la

posición orto de monofenoles y oxidación del o-difenol intermedio hasta la o-quinona.
- catecol oxidasa / EC 1.10.3.1:

2 catecol + O2 = 2 (1,2-benzoquinona) + 2 H2O
La actividad catecol oxidasa o catecolasa consiste en la oxidación de dos moléculas de

un o-difenol a dos moléculas de o-quinona, y una reducción de oxígeno molecular,
formándose dos moléculas de agua.
15
A pesar de que Kablunde y col. (1998) han propuesto un mecanismo algo diferente
para la PPO de batata basado en datos de tipo bioquímico, espectroscópico y estructural para
esta enzima, nosotros mantenemos el modelo de Lee y Whitaker (1995) debido a que es un
modelo general, capaz de explicar ambas actividades, catecolasa y cresolasa de la PPO de
muchos vegetales y frutos. Este modelo, desarrollado recientemente, es capaz de explicar la
existencia de las tres formas enzimáticas (“met”, “oxi” y “desoxi”) y las particularidades de
cada una de las dos actividades de la enzima (figura 1.6).
Figura 1.6. Mecanismo propuesto para la oxidación enzimática de o-difenoles (A) y

monofenoles (B), mediante la participación de la enzima PPO. Adaptado de Lee y Whitaker
(1995).
Las tres formas enzimáticas participan en el ciclo catecolasa (A): la forma “desoxi”
une oxígeno, mientras que las formas “met” y “oxi” unen sendas moléculas de o-difenol. En
este ciclo un o-difenol reduce al Cu (II) de la forma “met” al Cu (I), en este paso están
implicados dos electrones. A continuación la forma “desoxi” reacciona con oxigeno
molecular, formándose la forma “oxi”. Cada uno de los dos átomos de Cu (II) de la forma
“oxi” se unen a un átomo de oxígeno de los grupos hidroxilo del o-difenol dando lugar al
complejo O2-difenol-PPO. En el último paso, el o-difenol es oxidado a o-benzoquinona y la
16
enzima es reducida a la forma “met”. Para completar el ciclo, otra molécula de o-difenol se
une a la forma “met” y se produce la oxidación del o-difenol a o-quinona y la correspondiente
reducción de la forma “met” a la forma “desoxi” PPO.
En el ciclo cresolasa (B) sólo participan las formas “desoxi” y “oxi”, debido a esto,
para introducir toda la enzima en el ciclo cresolasa son necesarias cantidades catalíticas de
difenol que lleva la forma “met”, la cual se encuentra entre un 98% y 70% según la fuente,
hasta “desoxi” (Lerch y Ettlinger, 1972). En este ciclo, la forma “oxi” reacciona con un
sustrato monofenólico para formar un complejo ternario, que se reorganiza dando lugar a un
intermedio de reacción. Este intermedio es de naturaleza muy reactiva y conduce a la
hidroxilación del sustrato, formándose o-difenol unido a la enzima.
La salida del producto implica la transferencia de 1 e- a cada Cu2+, pasando estos a

Cu1+ y formándose o-quinona, agua y la forma “desoxi”. La regeneración de la forma “oxi”
tiene lugar por la entrada de una nueva molécula de O2. Esta secuencia de reacciones coincide
con la primera mitad del ciclo de la actividad catecolasa, acentuando el íntimo acoplamiento
de las actividades cresolasa y catecolasa. El nivel de o-difenol requerido como catalizador se
alcanza mediante reacciones químicas lentas de reciclamiento de o-difenol a partir de formas
quinónicas (figura 1.7) (Cabanes y col., 1987). Por este motivo, la actividad cresolasa
presenta periodos de retardo en la acumulación de producto.
Figura 1.7. Mecanismo general que explica la ruta ente monofenoles y halocromos
que incluye una etapa de reciclamiento del o-difenol a partir de las formas quinónicas
(Cabanes y col., 1987). E = met-tirosinasa, E´ = oxi-tirosinasa, M = monofenol, D = o-
difenol, Q = o-quinona y DC = halocromo.
17
Como se ha comentado anteriormente, la oxidación de dos moléculas de o-difenol en

presencia de la actividad catecolasa conlleva a la obtención de dos moléculas de o-quinona.
Estas moléculas de color amarillento son muy reactivas e inestables y pueden reaccionar con
nucleófilos como grupos tiol y amino de proteínas mediante un mecanismo no enzimático
(García-Carmona y col., 1982; Valero y col., 1988). Además, las o-benzoquinonas pueden
reaccionar covalentemente con otros compuestos fenólicos mediante una reacción de adición
para formar compuestos poliméricos de colores intensos que varían entre amarillo, rojo, azul,
verde o negro (Wong y Staton, 1989) y que son responsables del aspecto final de un tejido
vegetal afectado de pardeamiento enzimático (figura 1.8).
Figura 1.8. Reacciones de evolución de las o-quinonas producidas por tirosinasa o

polifenol oxidasa. R = cadena lateral, Nu = grupo nucleofílico extra o intramolecular: -OH, -
SH ó –NH2.
I.1.3.5 Función biológica
La función de la polifenol oxidasa en numerosos vegetales es todavía un enigma sin

solucionar (Lee y Whitaker, 1995). A pesar de que las funciones biológicas no se conocen
todavía en detalle, la bibliografía sugiere como función más aceptada la participación de estas
enzimas en la defensa de las plantas frente a patógenos y herbívoros. Estos datos se basan en
los siguientes hechos (Dongfeng y col., 2004): (1) la costra de la melanina acumulada debido
a la formación de o-quinonas puede prevenir la infección por el patógeno. Es decir, una
lesión, corte o infección en un tejido vegetal produce la mezcla de la enzima con sus
18
substratos fenólicos, dando lugar a la formación de o-quinonas. Estas pueden unirse a

proteínas inactivándolas o pueden polimerizar dando lugar a melaninas, que oscurecen o
pardean la zona afectada haciéndola poco accesible para patógenos e invasiones bióticas; (2)
la unión de las o-quinonas y proteínas pueden reducir el valor nutritivo de los aminoácidos
nucleofílicos e inducir una defensa antinutritiva; (3) las o-quinonas pueden reprimir la
propagación bacteriana y (4) un incremento en la cantidad de PPO se ha observado como una
interacción incompatible huésped-patógeno.
Thipyapong y col. (2004) mostraron que la expresión antisentido de PPO en tomate

incrementaba dramáticamente la susceptibilidad a Pseudomonas syringae expresando el gen
avirulencia avrPto. Estos autores mostraron como hipótesis que al pH fisiológico, las
quinonas nucleofílicas son más propensas a sufrir desproporciones reversas con fenoles para
formar dos radicales semiquinona equivalentes (Guyot y col., 1995; Guyot y col., 1996). Estas
semiquinonas pueden interactuar con O2 para generar O2-. Algunos autores han descrito que la
PPO participa en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) como productos
secundarios de la oxidación de compuestos fenólicos en extractos de plantas (Richard Foret y
Gauillard, 1997; Subramanian y col., 1999). Estos autores muestran que la oxidación de
catequina en presencia de PPO de pera (Subramanian y col., 1999) o la oxidación de
epicatequina en presencia de PPO de te negro (Richard Foret y Gauillard, 1997) generan
cantidades µM de H2O2. El papel del H2O2 es importante en los alrededores del tejido afectado
por el patógeno ya que proporciona una toxicidad anti-microbiana, sirve como sustrato para el
entrecruzamiento oxidativo de las paredes celulares, como inductor de genes protectores y
como desencadenante de la muerte celular que da lugar a lesiones restringidas delimitadas por
tejidos sanos (Grant y Laoke, 2000; García-Olmedo y col., 2001). La sobreexpresión de PPO
en plantas transgénicas de tomate, produjo una mayor velocidad de la oxidación de los
sustratos fenólicos, además de mostrar una mayor resistencia frente a Pseudomonas syringae
(Li y Steffens, 2002) respecto de las plantas control; las líneas transgénicas mostraban
síntomas menos severos, con lesiones 15 veces inferiores, y una fuerte inhibición (alrededor
de 100 veces) del crecimiento bacteriano en las hojas infectadas. Aunque el mecanismo que
provoca una mejora en la resistencia frente a determinados microorganismos no está todavía
claro, los efectos biológicos de la PPO se basan en la naturaleza reactiva de las o-quinonas
producidas. Otro ejemplo es la sobreexpresión y los altos niveles de PPO en hojas
transgénicas de álamo, los cuales incrementan la resistencia frente a la oruga del álamo
19
(Malacosoma disstrica) (Wang y Constabel, 2004), insecto que merma el crecimiento y causa
mortalidad del álamo. Además recientemente, se ha mostrado la inducción de PPO en clavel
(Dianthus caryophyllus) a las 12 y 24 horas de la infección por Fusarium oxysporum,
indicando que la PPO puede desempeñar un papel en la defensa de la planta, en fenómenos
metabólicos probablemente relacionados con la lignificación y síntesis de compuestos
fenólicos (Ardila e Higuera, 2005).
Se han descrito familias multigénicas de PPO que codifican diferentes polipéptidos en

tomate (Newman y col., 1993), patata (Thygesen y col., 1995), banana (Gooding y col., 2001)
y álamo (Wang y Constabel, 2004), aunque no todas las PPOs pertenecen a familias
multigénicas, pues en uva se ha hallado un gen único para PPO (Dry y Robinson, 1994). La
expresión de parálogos de PPO esta sometida a una estricta regulación espacio-temporal y por
situaciones de estrés en un gran número de especies (Thipyapong y col., 1997; Thipyapong y
Steffens, 1997; Wang y Constabel, 2004; Gooding y col., 2001; Thygesen y col., 1995; Boss
y col., 1995; Kim y col., 2001), pero también se ha observado la expresión simultanea de dos
o más genes en el mismo tejido para el mismo estado de desarrollo (Kim y col., 2001;
Thipyapong y col., 1997). Aunque las secuencias que codifican las PPOs de tomate están
altamente conservadas, las regiones 5’ y 3’ no traducidas de algunas PPOs son altamente
divergentes, lo cual sugiere la existencia de diferentes mecanismos de regulación o la
existencia de funciones biológicas muy diferentes (Newman y col., 1993).
Determinados tejidos pueden experimentar aumentos localizados de PPO como

consecuencia de ataques de insectos y herbivoría, que provocan aumentos en los niveles de
hormonas como el metil-jasmonato y hormonas peptídicas como la sistemina que actúan
sobre los mecanismos de regulación de la expresión de PPO aumentando su concentración en
los tejidos afectados (Constabel y col., 2002; Czapski y Saniewski, 1988). También se ha
demostrado que en tomate, la expresión de la isoenzima F de PPO es la más inducida
cuantitativamente como respuesta a daños físicos y mecánicos (Thipyapong y Steffens, 1997).
En otras especies vegetales como manzana (Boss y col., 1995) y patata (Thipyapong y col.,
1995) se ha mostrado que la PPO puede ser inducida significativamente como respuesta a
daños mecánicos. Boss y col. (1995) mostraron la acumulación de mRNA en frutos de
manzana después de producir daños en el tejido y Stewart y col. (2001) han demostrado que la
PPO es inducida en hojas y frutos de piña después del daño. Sin embargo, no se observa
incrementos significativos de PPO en piel o frutos de plátano después de las 72 horas de dañar
20
el fruto. Este resultado sugiere que la respuesta de defensa, demostrada por un incremento de
PPO en otras especies (Boss y col., 1995; Stewart y col., 2001) no está presente en frutos de
plátano (Gooding y col., 2001). Además se ha demostrado que algunas especies vegetales
presentan una intensa actividad PPO en tricomas, con una función de defensa frente a
insectos, (Kowalski y col., 1990; Kowalski y col., 1992).
La participación de las PPOs en la biosíntesis de productos de bajo peso molecular se

ha probado en dos rutas diferentes de la biosíntesis de pigmentos de plantas. Se ha encontrado
en la flor de seda (Portulaca grandiflora) y remolacha roja (Beta vulgaris) (Steiner y col.,
1999) una tirosinasa implicada en la biosíntesis de betalainas, que son pigmentos naturales
nitrogenados, solubles en agua y se acumulan en flores y frutos (Steglich y Strack, 1990). Una
PPO específica de chalcona (flavonoide minoritario) participa en la biosíntesis de aurona
(pigmentos de color oro) y su participación se ha demostrado en flores de diente de dragón
(Antirrhinum majus) (Strack y Schliemann, 2001).
Existen otras muchas hipótesis alrededor del posible papel fisiológico de las PPOs en
plantas. Algunas funciones son; participación en la síntesis de componentes de la pared
celular y ligninas, papel en el ciclo de los fenilpropanoides (Vaughn y Duke, 1984), reacción
de Mehler (reducción del O2 a O2- en los cloroplastos), participación en el transporte de
electrones y regulación del oxígeno (Vaughn y col., 1988) y reguladora de la síntesis de
hormonas vegetales como el ácido indolacético.
I.1.3.6 Latencia
Muchas preparaciones de PPO de diferentes tejidos como hojas (Moore y flurkey,

1990; Chazarra y col., 1996; Chazarra y col., 2001a), frutos (Sánchez-Ferrer y col., 1989;
Fraignier y col., 1995; Gauillard y Richard Forget, 1997; Núñez-Delicado y col., 2003;
Núñez-Delicado y col., 2007) y raíces (Pérez-Gilalbert y col., 2001; Gandía-Herrero y col.,
2004) muestran latencia, fenómeno que se detecta por un incremento en la actividad
enzimática a pH 6.0 o mayor cuando se trata con agentes activantes. La activación de PPO se
puede alcanzar por una exposición prolongada a pH ácido (Kenten, 1957; Paul y Gowda,
2000) ó básico (Söderhäll, 1995) a concentraciones de SDS sub-cmc (Kenten, 1958; Moore y
Flurkey, 1990), en presencia de N-laurilsarcosina (Van Gelder y col., 1997), ácidos grasos
insaturados (Gauillard y Richard Forget, 1997), agentes caotrópicos como urea y cloruro de
guanidinio (Swain y col., 1966; Okot-Kotber y col., 2002), poliaminas (Jiménez-Atiénzar y
21
col., 1991) o incubándolas con proteasas (King y Flurkey 1987; Sugumaran y Nellaiappan,
1991, Pérez-Gilabert y col., 2001; Gandía-Herrero y col., 2005b). Aunque muchos estudios
muestran activación de PPO por los tratamientos comentados anteriormente, sólo unos pocos
(Kanade y col., 2006; Rathjen y Robinson, 1992) se han llevado a cabo usando preparaciones
homogéneas de PPO.
El fenómeno de activación por SDS se ha correlacionado con cambios

conformacionales en la proteína de acuerdo con cambios en la fluorescencia intrínseca
(Moore y Flurkey, 1990; Kanade y col., 2006) y en la elipticidad (Kanade y col., 2006) de la
proteína. Marquès y col. (1995) describieron el efecto del SDS como un cambio en el
comportamiento de la enzima con respecto al pH más que como una activación, ya que el
SDS induce un desplazamiento de entre 1.5-2 unidades del perfil de pH de la enzima hacia
pHs alcalinos. Por ello, Jiménez y García-Carmona (1996) sugirieron que el uso del término
“activación por SDS” se restringiera a un rango de valores de pH. Una posible relación entre
ambos factores, pH y SDS, se ha estudiado para diferentes PPOs como haba, uva, lechuga y
judía (Jiménez y García-Carmona, 1996; Valero y García-Carmona 1992, Chazarra y col.,
2001a, b), observándose que para algunos tejidos como la uva a pH ácido la actividad de PPO
es inhibida por SDS (Núñez Delicado y col., 2007). Además, Laveda y col. (2000) mostraron
la total reversibilidad de la activación por SDS de la PPO de melocotón, pues cuando el SDS
está secuestrado mediante la formación de complejos de inclusión en presencia de
ciclodextrinas, la enzima retorna a los niveles de activación sin SDS. Sin embargo, no existe
una dependencia del perfil de pH para la actividad de PPO en presencia de SDS después de
incubar la enzima con tripsina (Gandía-Herrero y col., 2005b).
Por otra parte, Gandía-Herrero y col. (2005a) obtuvieron cinéticas de activación de

PPO soluble de remolacha con SDS de dos tipos, hiperbólica y sigmoide, dependientes de la
naturaleza del sustrato. Con sustratos con sustituyentes hidrofóbicos como catecol, 4-metil
catecol y 4-tert-butil catecol la cinética de activación era hiperbólica mientras que con
sustratos con sustituyentes hidrofílicos como L-tirosina, dopa, dopamina y tiramina la cinética
era sigmoide. Además a bajas concentraciones de SDS, aproximadamente de 0.1 mM se
obtiene máxima activación con sustratos hidrofóbicos, siendo el grado de activación
inexistente para los sustratos hidrofílicos a estas concentraciones de detergente. En vista de
este comportamiento estos autores sugirieron que la diferente activación de PPO mostrada por
SDS puede ser relevante en el control de ésta enzima como consecuencia de su capacidad de
22
expresión de actividad específica hacia un sustrato, mientras permanece latente para otros
(Gandía-Herrero y col., 2005a).
Desde los primeros estudios de latencia de PPO, la proteolisis parcial se reconoció

como uno de los tratamientos típicos de activación (Kenten, 1958). La tripsina parece ser la
proteasa más efectiva en la activación de PPO de plantas como uva (Sánchez y col., 1989),
haba (King y Flurkey, 1987), espinaca (Golbeck y Camarata, 1981) y zanahoria (Söderhäll y
col., 1985). En el trabajo de Gandía-Herrero y col. (2005b) se describe que la PPO de raíz de
remolacha cuando se proteoliza con tripsina se convierte en una forma activa. Los ensayos
electroforéticos muestran que este tratamiento, altera el sitio de reconocimiento del anticuerpo
de PPO de hojas de haba, debido a que el anticuerpo no reconoce la forma activa. Estos
autores muestran que la digestión parcial afecta al sitio responsable de la activación del SDS,
debido a que la enzima pierde la capacidad de ser activada por el detergente. Las similitudes
descritas en el perfil de pH, parámetros cinéticos y grado de activación, llevan a estos autores
a postular la hipótesis de la existencia de una regulación común de la activación por SDS y
tripsina de la PPO de raíz de remolacha. Se ha mostrado que la PPO purificada de hojas de
haba de aproximadamente 60 kDa cuando se proteoliza con tripsina se convierte en una forma
activa catalíticamente de 40 kDa que conserva un resto de sensibilidad al tratamiento con SDS
(Robinson y Dry, 1992). En el mismo contexto, se ha sugerido que la extensión C-terminal de
la cadena del polipéptido puede enmascarar el centro activo, y que la eliminación de esta
extensión - bien por proteolisis o por inducción de cambios conformacionales en presencia de
SDS- puede ser la base de la activación de la enzima (Gerdemann y col., 2002). Este supuesto
se basa en la modelización de la extensión C-terminal de la cactecol oxidasa (CO) de boniato
(Ipomea batata) ausente en la estructura cristalina (Eicken y col., 1999), usando la estructura
de hemocianina (odgHC) de pulpo gigante (Octopus dofleini). Las hemocianinas son
proteínas que contienen dos átomos de cobre en el centro activo y que están implicadas en el
transporte de oxígeno de moluscos y artrópodos (Himmelwrigth y col., 1980; Solomon y col.,
1994). La superposición de la estructura de CO y odgHC muestra una estrecha relación con
una desviación de 1.27 Å para 704 átomos (Eicken y col., 1999), sin embargo, las
hemocianinas muestran ninguna ó sólo una débil actividad catecolasa debido a la oclusión del
centro activo por el dominio C-terminal, hecho que podría explicar una función inhibitoria de
ésta extensión en PPO. A pesar de que el efecto de la tripsina sobre la PPO latente está bien
23
documentado, no se ha mostrado hasta el momento ninguna actividad proteolítica endógena

que actúe de esta manera.
De todos los agentes activadores de PPO latentes descritos hasta el momento, sólo los
ácidos grasos pueden tener un significado biológico en plantas. Estos se describieron por
primera vez como activadores de preparaciones crudas de cloroplasto de PPO de hojas de
haba (Golbeck y Camarata, 1981). Recientemente, la exposición prolongada de una
preparación parcialmente purificada de frutos de pera con ácidos grasos ha mostrado un ligero
incremento en la actividad (Gauillard y Richard Forget, 1997).
24
Objetivos
Objetivos
El objetivo de esta tesis doctoral es estudiar la implicación de la enzima polifenol

oxidasa de níspero en el pardeamiento enzimático ocasionado de forma natural o por daños
mecánicos. Para ello, es necesario llevar a cabo una purificación a homogeneidad de la
polifenol oxidasa y realizar una caracterización biológica, molecular y fisiológica, con el fin
de lograr una mejor comprensión de las posibles relaciones entre su actividad y los problemas
característicos de pardeamiento enzimático que presentan los frutos de níspero de la
Comunidad Valenciana.
Los objetivos concretos son:
1. Purificar a homogeneidad la enzima polifenol oxidasa latente de frutos de

níspero mediante el uso de técnicas cromatográficas.
2. Realizar una caracterización cinética de la enzima
3. Determinar sus propiedades moleculares.
4. Estudiar el efecto de diferentes agentes activantes sobre las propiedades
estructurales y funcionales de la enzima pura con el fin de lograr una mejor
comprensión de los mecanismos de regulación de la actividad de polifenol
oxidasa.
5. Desarrollar y aplicar herramientas para obtener información molecular
específica de PPOs de níspero: anticuerpo anti-PPO, western-blot y análisis
de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas-masas.
6. Utilizar las herramientas anteriores para estudiar la relación de la enzima con
procesos fisiológicos en los que se manifiesta el pardeamiento enzimático
como el desarrollo y maduración de los frutos, el estrés post-recolección y
daños mecánicos.
25
Capítulo II.
Purificación y caracterización cinética
de la polifenol oxidasa latente
Introducción Purificación y caracterización cinética de la polifenol oxidasa latente
II.1 INTRODUCCIÓN
La extracción y purificación de PPO de tejidos vegetales continúa siendo un problema

debido a (i) fenómenos de pardeamiento y formación de quinonas que pueden interactuar e
inhibir a la propia enzima durante la extracción, (ii) a su interacción con las membranas
tilacoidales y (iii) la existencia de formas latentes.
Se han purificado PPOs funcionales de diferentes tejidos vegetales; hojas de espinaca

(Golbeck y Cammarata, 1981), hojas de haba (Flurkey, 1985; Robinson y Dry, 1992),
tricomas de tomate (Yu y col., 1992), tubérculos silvestres de patata (Kowalski y col., 1992),
bayas de vid (Dry y Robinson, 1992) y frutos de níspero (Ding y col., 1998b). La masa
molecular se ha determinado entre 40-45 kDa o 60 kDa, aunque se han obtenido isoformas
con pesos moleculares de hasta 72 kDa (Vaugh y col., 1988; Mayer, 1987). Estas variaciones
en la masa molecular pueden ser el resultado de modificaciones durante la purificación como
consecuencia de rupturas proteolíticas o bien modificaciones químicas con las quinonas. Por
esta razón, es muy importante seleccionar cuidadosamente los métodos de extracción de PPOs
vegetales. Estos métodos deben ser capaces de minimizar o eliminar cualquier cambio en la
estructura primaria y actividad de la proteína durante su purificación.
Se han utilizado diferentes métodos de extracción de PPO para minimizar la

interacción polifenol-proteína como homogenización en nitrógeno líquido (Benjamín y
Montgomery, 1973), precipitación con acetona (Duangmal y col., 1999; Wititsuwanakul y
col., 2002), o saturación con sulfato de amonio (Ding y col., 1998b; Gauillard Richard-Forget,
1997). Uno de los métodos más utilizados para solubilizar las proteínas de membrana (además
de eliminar los fenoles) es la separación de fases inducida por temperatura en presencia del
detergente Triton X-114 (Sánchez-Ferrer y col., 1994a y b). Este detergente se ha utilizado en
la extracción y purificación parcial de PPO de numerosos tejidos vegetales como uva (Núñez
Delicado y col., 2005; Núñez Delicado y col., 2007), palmera (Onsa y col., 2000) y melocotón
(Laveda y col., 2000). Sin embargo, este detergente no fue efectivo para extractos de salvado
(Okot Kober, 2002), los cuales se extrajeron con mayor efectividad con alcoholes como n-
butanol y detergentes como el SDS. Además de una adecuada extracción, la purificación de
PPOs homogéneas requiere algún paso cromatográfico como intercambio aniónico,
interacción hidrofóbica, adsorción, filtración en gel o combinación de estos métodos
(Wititsuwanakul y col., 2002; Gandía-Herrero y col., 2004; Paul y Gowda, 2000;
26
Introducción Purificación y caracterización cinética de la polifenol oxidasa latente
Muchas preparaciones de PPO de diferentes tejidos muestran latencia, este fenómeno

se observa por un incremento en la actividad enzimática a pH 6.0 o mayor cuando se trata con
agentes activantes. El grado de activación alcanzado se encuentra típicamente en un rango de
10 a 20, pero estas preparaciones exhiben niveles medibles de PPO en ausencia de agentes
activadores debido a que son preparaciones no homogéneas o preparaciones que presentan
diferentes niveles de impurezas. Estos estudios dejan abierta la cuestión sobre si el nivel de
actividad en ausencia de activadores es debido a una contaminación con formas activas de
PPO o es una propiedad de la PPO latente.
Aunque la latencia de PPO en vegetales está extensamente documentada, pocos

esfuerzos se han dedicado a conocer este fenómeno en profundidad con el fin de hallar una
explicación molecular para él. El conocimiento del fenómeno de latencia de PPO a nivel
molecular y fisiológico requiere la purificación y caracterización de PPO latentes homogéneas
libres de isoenzimas activas. En este sentido llama la atención el contraste entre el amplio
número de trabajos que describen características de PPO y el escasísimo número de PPO
vegetales purificadas a homogeneidad. La purificación a homogeneidad de la PPO latente con
un buen rendimiento, es decir, con un grado de activación por SDS prácticamente infinito, no
es un trabajo sencillo, pues trabajos previos de purificación han resultado en la obtención de
preparaciones contaminadas por bandas electroforéticas menores (Golbeck y Cammarata,
1981), preparaciones aparentemente puras pero con rendimientos bajos (Golbeck y
Cammarata, 1981; Robinson y Dry, 1992; Chazarra y col., 2001a) e incluso preparaciones que
no presentan cantidad suficiente de proteína para poderla cuantificar por métodos
colorimétricos (Gandía-Herrero y col., 2004). Además se han obtenido formas activas
hidrolizadas parcialmente de PPO latente (Dry y Robinson, 1994).
Nos encontramos pues con la necesidad de obtener una preparación homogénea de

PPO latente de fruto de níspero si queremos profundizar en el funcionamiento del enzima y su
fisiología. Para ello, en este capítulo se establece un protocolo reproducible de extracción y
purificación a homogeneidad de la fracción particulada de PPO de frutos de níspero,
utilizando la separación de fases con Triton X-114 y tres pasos cromatográficos; intercambio
iónico, interacción hidrofóbica y cromatografía de filtración en gel. Además, se caracteriza
cinéticamente en paralelo la PPO latente y la PPO activa presente en la fracción soluble y
purificada parcialmente con sulfato de amonio.
27
Materiales y métodos Purificación y caracterización cinética de la polifenol oxidasa latente
II.2 MATERIALES Y MÉTODOS
II.2.1 Material vegetal
Los frutos de níspero (Eriobotrya japonica Lindl.) de la variedad Algerie se

recolectaron de los huertos experimentales de la Cooperativa de Callosa d'En Sarriá entre los
meses de Marzo y Mayo. Los nísperos se seleccionaron de modo que estuviesen intactos, sin
golpes, y sin presentar ataque por insectos o cualquier otra plaga. Por último se lavaron y se
guardaron a -20ºC hasta su utilización.
II.2.2. Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron suministrados por Sigma Chemie. Gmbh,
Deseinhofen (Alemania). Los detergentes Triton X-114 y Triton X-100 fueron
suministrados por Fluka, AG Bucks (Suiza).
II.2.3 Métodos
II.2.3.1 Purificación del Triton X-114
El Triton X-114 comercial se condensa tres veces siguiendo el método Bordier (1981),
pero utilizando tampón fosfato 50 mM, pH 7.0. La condensación del TX-114 consiste en
disolver 20 gramos de este detergente con 16 miligramos de butil-hidroxitolueno en tampón
fosfato 50 mM, pH 7.0, a 4ºC hasta la completa disolución del detergente. A continuación, la
disolución se incuba a 37ºC durante 15 minutos. Este incremento de la temperatura hace que
el tamaño de las micelas formadas por el Triton X-114 aumente, agregándose unas con otras
hasta alcanzar un tamaño tal que ya no pueden mantenerse en disolución, provocando la
turbidez de la misma. La temperatura a la cual se produce este fenómeno se denomina "punto
de nube" y su valor depende del número de grupos polioxietileno del detergente no-iónico (n).
La ventaja de la utilización del Triton X-114 frente a otros detergentes no iónicos de la misma
familia es que la temperatura a la que alcanza el punto de nube es inferior, siendo de 64ºC
para el Triton X-100 (n = 9-10) y de 22ºC para el Triton X-114 (n = 7-8). A continuación, la
solución de aspecto blanquecino se introduce en un embudo de decantación durante toda la
noche a temperatura ambiente (20-25ºC aproximadamente). Transcurrido dicho tiempo
aparecen dos fases transparentes completamente separadas; una mayoritaria, en la parte
superior, pobre en detergente y otra minoritaria, en la parte inferior, rica en detergente. La
fase acuosa pobre en detergente se desecha y se reemplaza por un volumen igual de tampón
28
fosfato 50 mM, pH 7.0. La mezcla resultante se somete a condensación y separación de fases

dos veces más, bajo las mismas condiciones descritas anteriormente, pero sin la adición de
butil-hidroxitolueno. La fase rica en detergente resultante de la tercera condensación tiene una
riqueza aproximada del 24% (p/v) de Triton X-114. El detergente obtenido de esta forma se
utiliza como solución de partida para la purificación de la enzima polifenol oxidasa (PPO).
II.2.3.2 Método de extracción y purificación de la enzima polifenol oxidasa
Se homogeneizan en una relación (2/3) (p/v) frutos de nísperos maduros deshuesados

(peso fresco) con tampón fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.0 y 50 mM de ácido ascórbico durante
1 minuto utilizando una batidora. El homogenizado se filtra a través de ocho capas de gasa y
se suplementa con un cóctel de inhibidor de proteasas (4 ml/l). Al resultado de esta filtración
lo denominamos extracto crudo (EC). A continuación, el extracto crudo se centrifuga a 20000
× g durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante de esta centrifugación contiene actividad
polifenol oxidasa. El sobrenadante se somete a precipitación con sulfato de amonio en el
rango 40-85% (p/v). El precipitado tras centrifugar a 5000 × g durante 15 minutos se
resuspende en 5 ml de tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7.0 y lo hemos denominado PPO
soluble.
Por otra parte, el precipitado (pellet) obtenido en la centrifugación de 20000 × g se

resuspende en 40 ml de tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7.0 y 1.5% (p/v) de Triton X-114
y se somete a centrifugación a 5000 × g a temperatura ambiente tras incubar 15 minutos a
37ºC. El sobrenadante de la centrifugación anterior se recupera con ayuda de una pipeta
pasteur y se suplementa con Triton X-114 hasta alcanzar una concentración final del 4% (p/v).
Tras mezclar en frío durante 30 minutos, se incuba a 37ºC hasta observar una separación de
fases y posteriormente se centrifuga a 5000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente
para favorecer la separación de fases por efecto de la precipitación del detergente. El
sobrenadante resultante se suplementa de nuevo con Triton X-114 al 4% (p/v) y se repite el
proceso anterior. El sobrenadante resultante (fase superior pobre en detergente) contiene
actividad polifenol oxidasa y se denomina PPO particulada.
A continuación, el sobrenadante resultante de la segunda centrifugación al 4% de

Triton X-114 (40 ml), denominado fracción particulada, se concentra a través de una
membrana de corte de 30.000 Dalton mediante el sistema tangencial Viva flow 50 (Sartorius).
El retenido se introduce a través de una columna de intercambio aniónico, Hi prep.Tm 16/10
29
DEAE FF (GE Healthcare), se equilibra con tampón fosfato de sodio 15 mM pH 7.0 y 0.1%
de Triton X-100 (v/v). La columna se lava con el mismo tampón, y después se eluye con un
gradiente escalonado de NaCl (0 y 1M) en el mismo tampón. Las fracciones latentes se juntan
y se suplementan con sulfato de amonio hasta una concentración final de 2.5 M. A
continuación, estas fracciones se introducen en una columna de interacción hidrofóbica, Hi
Trap. Phenyl HP (1×1) (GE Healthcare), se equilibra con tampón fosfato de sodio 50 mM pH
7.0 y 2.5 M de (NH4)2SO4. La columna se lava con el mismo tampón, y después se eluye con
un gradiente escalonado de (NH4)2SO4 (2.5- 0 M) en el mismo tampón. Las fracciones
latentes se juntan y se introducen en una columna de filtración en gel Hi load 16/60 Superdex
prep. grad. (GE Healthcare), se equilibra con tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7.0 y se
eluye con el mismo tampón. Las fracciones latentes obtenidas se juntan y se utilizan como
PPO latente pura.
II.2.3.3 Ensayo de actividad de polifenol oxidasa
La determinación de la actividad polifenol oxidasa se lleva a cabo utilizando como

sustrato el 4-tert-butil catecol mediante el seguimiento espectrofotométrico a 390 nanómetros
(nm) de la acumulación del producto o-quinona, donde presenta un coeficiente de extinción
molar (ε) de 1225 M-1 × cm-1.
El medio de reacción consiste en 810 µl de tampón acetato 50 mM pH 4.5, 20 µl de

extracto enzimático y 170 µl de 4-tert-butil catecol 30 mM. Todos los reactivos se
termostatizan a 25ºC previamente a su utilización.
Para determinar y cuantificar la activación en cada uno de los diferentes pasos del
proceso de purificación se realizan medidas de actividad PPO utilizando tampón fosfato 50
mM pH 6.0, con y sin 2 mM de SDS en el medio de reacción. El grado de activación se
determina como el cociente entre la velocidad de reacción con SDS y sin SDS a pH 6.0.
Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima PPO que produce 1 µmol
de o-quinona por minuto a la temperatura de referencia (25ºC). Todas las medidas
espectrofotométricas se monitorizaron con un espectrofotómetro termostatizado JASCO V-
530.
30
II.2.3.4 Cuantificación del contenido total de proteínas
La concentración de proteínas en los distintos estadios del proceso de purificación se

determina utilizando el método Bradford (1976) utilizando albúmina de suero bovino (BSA)
como estándar. El complejo proteína-colorante tiene una gran absorción a 595 nm,
permitiendo así una gran sensibilidad en la detección de proteínas en el rango entre 10 y 100
µgramos de proteína total.
II.2.3.5 Cuantificación de compuestos fenólicos
El contenido de fenoles en los diferentes extractos proteicos se determina por el

método espectrofotométrico de Singleton y Rosi (1965), basado en la reacción de los fenoles
con el reactivo de Folin en presencia de Na2CO3. La cuantificación del contenido fenólico se
lleva a cabo en el extracto crudo y en los diferentes pasos del proceso de extracción y
purificación. Cada una de las muestras se prepara añadiendo 250 µl de extracto, 1.25 ml de
reactivo de Folin, 3.75 ml de Na2CO3 20% (p/v) y agua destilada hasta alcanzar un volumen
final de 25 ml. Tras incubar dos horas a 25ºC, se mide la absorbancia de las muestras a 765
nm, frente a un blanco que contiene los reactivos anteriores, pero sustituyendo el extracto
enzimático por etanol al 80% (v/v). Los valores de absorbancia se extrapolan a mg/l de ácido
gálico a partir de una recta de calibrado realizada con concentraciones de dicho ácido
comprendidas entre 50-500 mg/l.
II.2.3.6 Especificidad de sustrato
La especificidad de la enzima se estudió para una serie de sustratos; 4-tert-butil

catecol, 4-metil catecol, epicatequina, ácido cafeico, ácido clorogénico, ácido protocatechuico,
dopamina, L-dopa, pirocatecol e isoproterenol. Para cada uno de los sustratos se calcularon
los coeficientes de extinción molar (ε) de las respectivas quinonas. Para ello cantidades
conocidas de difenoles se oxidaron en presencia de IO4- en exceso a las correspondientes o-
quinonas. Si el producto de oxidación era estable, la longitud de onda (λ) seleccionada
corresponde al máximo de absorción del producto. En caso de evolución del producto, se
seleccionó la λ correspondiente al punto isosbéstico. Una vez determinada la λ para cada
sustrato, la reactividad de ambas fracciones de PPO, soluble y latente se determinó utilizando
3 mM de cada sustrato en tampón acetato a pH 4.5.
31
II.2.3.7 Estudios de inhibición
Para estudiar la inhibición de ambas fracciones se utilizaron compuestos tiol, agentes

reductores, análogos de sustrato, aniones inorgánicos y quelantes de cobre. La actividad de
PPO se mide en tampón acetato pH 4.5 con TBC como sustrato y utilizando tres
concentraciones diferentes (0.1, 1 y 10 mM) de cada uno de los inhibidores.
La inhibición de la reacción se estudió también en presencia de metil-β-ciclodextrina

(cds metilada) e hidroxipropil-β-ciclodextrina (cds hp). La actividad de PPO se mide en
tampón acetato pH 4.5 con 4 sustratos diferentes (TBC, AC, isoproterenol y L-dopa) y
utilizando concentraciones crecientes de CDs desde 0-16 mM.
32
Resultados y discusión Purificación y caracterización cinética de la polifenol oxidasa latente
II.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
II.3.1 Extracción y purificación enzimática
El protocolo que hemos propuesto para el procesamiento y homogeneización de frutos

de níspero ha revelado la presencia de actividad en dos fracciones diferenciadas que resultan
de una primera centrifugación de 20000 × g del extracto crudo (figura 2.1): la fracción soluble
(resultante del sobrenadante), y la fracción particulada (resultante del pellet). Para preservar la
actividad de estas fracciones ha sido necesario la inclusión de ácido ascórbico e inhibidores de
proteasas endógenas en el tampón de extracción.
Los resultados de la purificación parcial de PPO soluble se muestran en la tabla 2.1.

Mediante fraccionamiento por precipitación con sulfato de amonio (40-85% p/v) hemos
conseguido purificar parcialmente la fracción soluble y recuperar la mayor parte de la
actividad enzimática. El factor de purificación obtenido para la fracción soluble es de 3.3
veces con un rendimiento total de 16.7%. Estos resultados son comparables a los obtenidos en
la purificación parcial de PPO de níspero de la variedad Mogi (Ding y col., 1998b) y otros
frutos como caqui (Núñez Delicado y col., 2003). La PPO soluble se encuentra en estado
activo pues es insensible al tratamiento con SDS.
paso de volumen actividad proteína actividad factor rendimiento fenoles activación

purificación (ml) enzimática (mg) específica purificación (%) (%)
(Unidadesa) (U/mg)
extracto 400 478 84.3 5.68 1.0 100 100 n.d.b

crudo
sobrenadante 400 87.3 13.2 6.61 1.2 18.2 77.4 1

20000 ×g
soluble PPO 10 80.2 4.30 18.7 3.3 16.7 7.96 1
Tabla 2.1. Purificación parcial de la polifenol oxidasa soluble a partir de 1 kg fresco

de frutos de níspero. (a) Una unidad de enzima se define como la cantidad de PPO que
produce 1 µmol de quinona por minuto a 25ºC usando TBC como sustrato. (b) no detectado.
Como se observa en la tabla 2.1 el sobrenadante de 20000 × g contiene menos del 20%
de la actividad PPO del extracto crudo. Por su parte, en el extracto de la fracción particulada
solubilizado con 1.5% Triton X-114 se recupera un 73.6% de la actividad inicial, por lo que la
particulada es claramente la PPO más abundante en el fruto de níspero. En la bibliografía se
33
ha descrito actividad PPO en fracciones solubles y particuladas para diferentes tejidos de

plantas. En la raíz de remolacha de azúcar, la fracción soluble es mucho más abundante que la
fracción de membrana (Gandía-Herrero y col., 2004) y además la fracción soluble se puede
activar por SDS (Escribano y col., 1997).
La extracción de PPO de fracciones particuladas se han llevado a cabo por diferentes

métodos como sonicado (Golbeck y Cammarata, 1981), tratamiento con proteasas (Marqués y
col., 1995) y solubilización con detergentes (Casado y col., 2005a). Dry y Robinson (1994)
extrajeron una PPO de los cloroplastos de uva por tratamiento con CTAB obteniendo una
preparación que se encontraba en estado activo.
La actividad de PPO asociada a la fracción particulada (precipitado obtenido de la

centrifugación de 20000 x g) (figura 2.1) se extrajo y se solubilizó parcialmente con ayuda de
un tampón acuoso en presencia de Triton X-114 seguido de una separación de fases. El uso de
este detergente, se ha descrito como una herramienta muy útil para la solubilización y
purificación de proteínas de membrana de tejidos de animales, bacterias y plantas. (Bordier,
1981; Bricker y col., 2001; Bru y col., 1995; Sánchez Ferrer y col., 1994 a y b). Además, este
detergente permite su utilización en un rango compatible con la extracción de proteínas
debido a que presenta un punto de turbidez de 23ºC, temperatura por encima de la cual el
detergente coalesce y se separa en dos fases. Tras la separación de fases inducida a 37ºC, la
mayor parte del detergente, pigmentos plastídicos, fosfolípidos, algunos fenoles y proteínas
muy hidrofóbicas permanecen en la fase rica en detergente, mientras que los compuestos
fenólicos más polares y muchas proteínas de membrana quedan en la fase acuosa superior
pobre en detergente. Así, hemos conseguido recuperar prácticamente toda la actividad PPO
particulada de la fase pobre en detergente. No obstante, para la limpieza efectiva de la fase
pobre, el proceso de separación de fase se ha realizado dos veces.
Como se muestra en la tabla 2.2 para esta fracción, denominada PPO particulada,
hemos conseguido un factor de purificación de 1.05 con un rendimiento del 82.9%. Aunque el
factor de purificación es prácticamente nulo, la recuperación de la actividad PPO es bastante
alta, se elimina un 65% de fenoles y se incrementa la activación 6 veces respecto a la fracción
control (Pellet resuspendido en 1.5% Triton X-114).
34
Frutos de níspero
50 mM Na2HPO4
Homogenización 50 mM ácido ascórbico
cóctel inhibidor proteasas
Extracto crudo
Centrifugación 20000 x g
sobrenadante pellet
10 mM Na2HPO4
saturación 40-85% (p/v) agitación, sonicado 15 min 4ºC 1.5% (p/v) TX-114
(NH4)2SO4
centrifugación 5000 x g
centrifugación
5000 x g
1.5% (p/v) TX-114 pellet

PPO soluble
agitación, sonicado 15 min 4ºC 10 mM Na2HPO4

1.5% (p/v) TX-114
centrifugación 5000 x g
fase pobre en detergente fase rica en

PPO particulada detergente
Cromatografía DEAE gradiente escalonado

NaCl (0-1M)
PPO activa DEAE PPO latente DEAE
gradiente escalonado
Cromatografía HIC (NH4)2SO4 (2.5-0 M)
PPO latente Phenyl HP
Cromatografía FG 50 mM Na2HPO4
PPO latente purificada
Figura 2.1. Protocolo de extracción enzimática de las diferentes fracciones de PPO;

soluble, particulada activa y particulada latente purificada a homogeneidad de frutos de
níspero.
35
Como se muestra en la tabla 2.1 el 78% de los fenoles presentes en el extracto crudo
queda en el sobrenadante de 20000 × g. Del 20% restante, presente en el pellet resuspendido
en 1.5% Triton X-114, una buena parte se elimina con el método de separación de fases
mediante el uso del Triton X-114.
Una vez obtenida la fracción particulada se lleva a cabo la purificación de esta fracción
hasta homogeneidad mediante la utilización de tres pasos cromatográficos (figura 2.1). En
primer lugar, el sobrenadante de la segunda separación de fases con Triton X-114 (fracción
superior pobre en detergente, denominada PPO particulada) se fracciona por cromatografía de
intercambio aniónico, utilizando una columna Hi prep. 16/10 DEAE FF. Como se muestra en
la figura 2.2 este fraccionamiento revela la presencia de dos picos con actividad de PPO; el
más pequeño (B), eluye a una concentración de 0.21M de NaCl y el más grande (A) a 0.1 M
de NaCl, el cual representa el 89% de la enzima eluida.
1,2 60 1,2
1,0 50 1,0
Proteina (mg/mL)
[NaCl] (M)
0,8 40 0,8
0,6 30 v0 (µM/min) 0,6
0,4 20 0,4
0,2 10 0,2
0,0 0 0,0
0 50 100 150 200
Volumen de elución (mL)
Figura 2.2. Purificación de PPO de níspero por cromatografía de intercambio iónico

en una columna Hi prep. 16/10 DEAE FF. (A) DEAE latente y (B) DEAE activa,
Además de la diferencia cuantitativa, ambas fracciones se diferencian en cuanto al

estado en que se encuentra la PPO: las fracciones eluidas a mayor concentración de sal se
encuentran en estado activo, mientras que las fracciones eluidas a menor concentración salina
se encuentran en estado latente. Hemos conseguido para las fracciones latentes (A) una
actividad específica de 14.5 U mg-1 con un factor de purificación de 6.04 veces y una
activación por SDS de 80 veces (tabla 2.2).
36
paso de volumen actividad proteína actividad factor rendimiento fenoles activación

purificación (ml) enzimática (mg) específica purificación (%) (%)
(Unidadesa) (U/mg)
1.5% (w/v) 400 352 154 2.29 1.00 100 20.3 2.76
Triton X-114
particulada 400 292 122 2.40 1.05 82.9 6.95 16.2

PPO
DEAE 25 197 13.6 14.5 6.04 55.9 2.10 80.0
phenyl HP 4 130 6.67 19.5 8.53 37.0 1.60 102
filtración en 3 54.0 0.59 91.5 39.9 15.3 0.90 ∞

gel
Tabla 2.2. Purificación de la polifenol oxidasa latente a partir de 1 Kg fresco de frutos

de níspero. (a) Una unidad de enzima se define como la cantidad de PPO que produce 1 µmol
de quinona por minuto a 25ºC usando TBC como sustrato.
Las fracciones latentes (DEAE) se juntan y se suplementan con sulfato amónico hasta
una concentración final de 2.5 M y se purifican mediante interacción hidrofóbica en una
columna Phenyl HP. Como se observa en la figura 2.3, este fraccionamiento da lugar a un
solo pico con actividad PPO. Además se obtiene un factor de purificación de 8.53 veces y 102
veces de activación por SDS con un rendimiento total de 37%.
Finalmente, las fracciones latentes eluidas de la columna Phenyl HP (figura 2.3) se

purifican por exclusión molecular en una columna Hi Load 16/60 Superdex que resuelve un
solo pico de actividad PPO (figura 2.4).
El factor de purificación final de la PPO latente obtenido es de 39.9 veces con un

rendimiento total de 15.3%. La PPO obtenida se encuentra en estado latente con una
activación infinita por SDS, es decir, la actividad PPO a pH 6.0 es prácticamente cero a menos
que haya SDS en el medio, condiciones en las cuales la enzima es 100% activa. Esto indica
que la preparación está libre de contaminantes por otras PPO activas, que interfieren con la
latente cuando se estudian las propiedades cinéticas.
37
3,0 400 0,6
2,5 0,5
[(NH4)2SO4](M)
Proteina (mg/mL)
300
v0 (µM/min)
2,0 0,4
1,5 200 0,3
1,0 0,2
100
0,5 0,1
0,0 0 0,0
0 10 20 30 40
Figura 2.3. Purificación de PPO de níspero mediante cromatografía de interacción

hidrofóbica en una columna Hi Trap Phenyl Hp.
140 0,6
120 0,5
Proteina (mg/mL)
100
v0 (µM/min)
0,4
80
0,3
60
0,2
40
20 0,1
0 0,0
0 20 40 60 80 100 120 140
Figura 2.4. Purificación de PPO de níspero mediante cromatografía de exclusión

molecular en una columna Hi Load 16/60 Superdex.
La purificación a homogeneidad se ha mostrado anteriormente para otros frutos como

uva (Dry y Robinson, 1994) y manazana (Murata y col., 1992) pero en ambos casos la
preparación final fue una PPO activa de peso molecular alrededor de 40 kDa. En este trabajo
mostramos por primera vez la purificación de una PPO latente de frutos.
38
II.3.2 Caracterización cinética de PPO
La obtención de dos fracciones de PPO en frutos de níspero, soluble activa y

particulada latente, nos llevó a la determinación y análisis comparativo de las constantes
cinéticas y otras propiedades en ambas preparaciones para poder establecer si existe una
relación entre ambas fracciones de PPO.
II.3.2.1 Parámetros cinéticos de las isoenzimas de PPO
Para ambas fracciones, la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de

la enzima en un amplio rango; de 0.1 a 2 µg para la fracción latente pura y de 0.5 a 10 µg para
la fracción activa parcialmente pura en un ml de medio de reacción. Los parámetros cinéticos
se determinaron a partir de los gráficos de Lineweaver-Burk utilizando un sustrato natural,
ácido clorogénico (AC) y un sustrato artificial, 4-tert-butil catecol (TBC). Ambas fracciones
enzimáticas, soluble activa y particulada latente, mostraron una cinética micaeliana para
ambos sustratos, TBC y AC (figura 2.5). Los parámetros cinéticos determinados a partir de
los gráficos dobles inversos (figura 2.6) se muestran en la tabla 2.3.
PPO soluble PPO latente
pH 4.5 pH 4.5 pH 6.0

Parámetros cinéticos TBC AC TBC AC TBC + SDS
Km (mM) 1.20 1.00 1.23 5.70 2.40
Vmax (µM/min) 55.3 99.5 12.1 596 18.1
kcat (s-1) n.d. n.d. 0.61 29.8 0.91
kcat / Km (M-1 s-1) n.d. n.d. 496 5.230 379
VmaxAC/V maxTBC 1.80 49.3 n.d
n.d. no determinado
Tabla 2.3. Constantes cinéticas determinadas para las preparaciones de PPO de frutos
de níspero, soluble activa y particulada latente utilizando TBC y AC.
39
16
A
14
12
v0 (µM/min)
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7
[TBC] (mM)
180
B
160
140
120
v0 (µM/min)
100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7
[AC](mM)
100
C
80
v0 (µM /min)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7
[Substrato] (mM)
Figura 2.5. Cinéticas de ambas preparaciones enzimáticas; (A) fracción latente en

tampón acetato pH 4.5 con TBC (-●-) y en tampón fosfato pH 6.0 con 2 mM de SDS (-○-),
(B) fracción latente en tampón acetato pH 4.5 con AC (-●-) y (C) fracción soluble en tampón
acetato pH 4.5 con TBC (-●-) y AC (-○-).
40
0,30
1/ v0 (µM-1 min) pH 6.0 + SDS

A
1/ v (µM-1 min) pH 4.5

0,25
0,20
0,15
0 0,10
0,05
0,00
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
1/ [TBC] (mM-1)
0,12
B
1/ v0 (µM-1 min) pH 4.5
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0 1 2 3 4 5 6
1/ [AC] (mM-1)
0,14
1/ v0 (µM-1 min) TBC pH 4.5
C
1/ v0 (µM-1 min) AC pH 4.5
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0 1 2 3 4 5 6
1/ [sustrato] (mM-1)
Figura 2.6. Representaciones doble inversas para ambas preparaciones enzimáticas;

(A) fracción latente en tampón acetato pH 4.5 con TBC (-●-) y en tampón fosfato pH 6.0 con
2 mM de SDS (-○-), (B) fracción latente en tampón acetato pH 4.5 con AC (-●-) y (C)
fracción soluble en tampón acetato pH 4.5 con TBC (-●-) y AC (-○-).
41
Como se observa en la tabla 2.3, a pH 4.5, los valores de Km utilizando TBC fueron
muy similares para ambas preparaciones (Km= 1.2 mM para la soluble y Km= 1.23 mM para la
fracción latente pura). Sin embargo, para el AC, el valor de Km es de 5.7 veces superior para
la fracción latente respecto de la fracción soluble. Debido a que no es posible determinar la
kcat para la fracción soluble activa parcialmente purificada, se ha utilizado la ratio de
velocidad máxima para ambos sustratos (VmaxCA/V max
TBC
) como método indirecto que
permite comparar las propiedades catalíticas de ambas fracciones de PPO. Aunque ambas
fracciones catalizan mejor la oxidación del ácido clorogénico, la fracción soluble muestra sólo
un incremento de dos veces en la Vmax respecto del 4-tert-butil catecol, mientras que la
fracción latente pura oxida 50 veces más rápido el CA que el TBC. Estos resultados acentúan
la diferencia encontrada en los valores de Km obtenidos para la fracción soluble.
Por encima de pH 5.0 el ácido clorogénico es químicamente inestable (coloración

verdosa) y en presencia de SDS, los productos de oxidación del CA pierden su coloración
probablemente como consecuencia de reacciones de adición de Michael. Por ello, el efecto del
SDS en el estudio de los parámetros cinéticos se ha estudiado utilizando TBC como sustrato.
Los parámetros cinéticos de la oxidación de la PPO latente utilizando TBC a pH 6.0

con 2 mM de SDS no fueron muy diferentes a los obtenidos a pH 4.5 sin SDS. Como se
observa en la tabla 2.3, se produce un incremento en ambos Km y kcat lo que conlleva a una
reducción de un 20% en la eficiencia catalítica.
Ding y col. (1998b) determinaron una Km de 0.105 mM para la fracción soluble de

frutos de níspero de la variedad Mogi. Este valor es 10 veces más bajo que el determinado
para nuestra fracción soluble. Estos autores determinaron la velocidad de reacción en funcion
de la desaparición del producto a 325 nm. Debido a que la absortividad del CA a 325 nm es
muy alta, la mayor concentración de sustrato ensayable en estas condiciones es de 0.1 mM. La
utilización de concentraciones bajas de sustrato propicia condiciones de cinética de primer
orden y la linearización de los datos por transformación doble inversa conduce a errores en la
determinación de los parámetros cinéticos. Para evitar estos errores nosotros hemos
determinado la velocidad de reacción como la acumulación del producto de 0.2 a 6 mM de
ácido clorogénico.
42
II.3.2.2 pH óptimo
La figura 2.7 muestra los perfiles de pH para la fracción soluble parcialmente

purificada y la fracción latente pura ensayada en presencia y ausencia de 2 mM de SDS
usando TBC y AC como sustratos. La actividad PPO se determinó en un amplio rango de pH;
de 3.5-5.0 en presencia de 50 mM de tampón acetato y de 5.5-7.0 en presencia de 50 mM de
tampón fosfato. Los perfiles son muy diferentes para la fracción soluble (figura 2.7 A y C)
respecto de la fracción latente (figura 2.7 B y D) independientemente del sustrato usado. La
fracción soluble muestra un perfil no acampanado, con un incremento continuo en la actividad
a partir de pH 3.0 (para AC) o pH 4.0 (para TBC) y alcanzando un nivel máximo entre 4.5 y
5.0 (para AC) ó entre pH 6.0 y 7.5 (para TBC). Estos resultados difieren de los obtenidos para
la fracción soluble de PPO de la variedad Mogi (Ding y col., 1998b) la cual presenta un perfil
acampanado con un óptimo de pH a 4.5. Por su parte, la enzima particulada muestra un perfil
acampanado con un pH óptimo 4.0 y una caída rápida de la actividad entre pH 4.5-5.0.
La presencia de SDS no causa ningún efecto significativo sobre el perfil de pH para la

fracción soluble. Por el contrario, sobre la fracción particulada, el SDS causa un gran efecto
pues la curva de pH se desplaza dos unidades hacia la región alcalina mostrando el óptimo de
pH sobre 5.0 (figura 2.7 B y D). Este desplazamiento del perfil de pH en presencia de SDS se
ha observado para otras preparaciones parcialmente puras que contienen contaminantes de
fracciones activas de PPO (Chazarra y col., 1996; Jiménez y García-Carmona, 1996;
Gauillard y col., 1997; Perez-Gilabert y col., 2001). Sin embargo esta es la primera vez que el
efecto de SDS sobre el perfil de pH se ha determinado separando la fracción activa y la latente
de un mismo tejido. Como resultado se muestran dos tipos de perfil de pH claramente
diferentes; un perfil acampanado, desplazado por SDS, para la fracción particulada latente y
un perfil no acampanado, insensible a SDS, para la fracción soluble.
Los perfiles de pH para ambas fracciones, soluble activa y particulada latente,

utilizando ácido clorogénico en presencia y ausencia de 2 mM de SDS fueron similares a los
obtenidos con TBC como se observa en la figuras 2.7 C y D. Estos resultados difieren de los
perfiles de pH obtenidos para PPO de hojas de patata (Sánchez-Ferrer y col., 1993) en los que
cuando se utiliza AC como sustrato no se observa activación con el SDS en el medio de
reacción y se obtuvieron perfiles de pH similares en presencia y ausencia de SDS.
43
160 200
A 180 C
140
160
120
140
v0 (µM/min)
100
v0 (µM/min)
120
80 100
80
60
60
40
40
20 20
0 0
2 3 4 5 6 7 8 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
pH pH
140 3000
B D
120
2500
100
2000
v0 (µM/min)
v0 (µM/min)
80
1500
60
1000
40
20 500
0 0
2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6
pH
pH
Figura 2.7. Perfiles de pH de PPO de frutos de níspero en ausencia (-●-) y presencia (-

○-) de 2 mM de SDS. Los perfiles se determinaron para las dos fracciones; PPO soluble (A,
C) y PPO latente (B, D) usando TBC (A y B) y AC (C y D) como sustrato.
El pH del fruto de níspero, al igual que para otros frutos, es ácido y alcanza con
dificultad 4 unidades en la maduración, por lo que las propiedades cinéticas de PPO a pHs
ácidos podrían ser de gran relevancia fisiológica. La independencia de los perfiles respecto
del sustrato demuestra que las diferencias observadas entre soluble-particulada y con/sin SDS
se deben a propiedades enzimáticas y no a efectos de sustrato. Por ello, al pH del fruto, la
PPO latente podría modular su actividad oxidativa de los fenoles en presencia de un efector,
que actuara de la misma manera que el SDS, desplazando su perfil de pH. Dicha modulación
no sería posible sobre la PPO soluble.
44
II.3.2.3 Temperatura óptima y termoestabilidad
La figura 2.8 muestra los perfiles de temperatura para la fracción soluble y la fracción
latente utilizando TBC como sustrato. Los perfiles muestran grandes diferencias en cuanto a
la forma del perfil y la temperatura óptima. El perfil obtenido para la fracción latente es
bastante amplio, la actividad se mantiene prácticamente constante entre 30-60ºC, y presenta
su máximo de actividad a 70ºC. Estos resultados son similares a los obtenidos para la
polifenol oxidasa de lichi (Yue-Ming y col., 1997). El perfil para la fracción soluble es
también amplio con un máximo de actividad alrededor de 30-35ºC. Estos resultados son
similares a los obtenidos para los frutos de níspero de la variedad Mogi (Ding y col., 1998b) y
para la PPO de melocotón (Siddiq y col., 1992), cuya temperatura óptima se encuentra en
torno de 30ºC y 37ºC respectivamente.
100
80
v0 (µM/min)
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100
temperatura (ºC)
Figura 2.8. Perfiles de temperatura de PPO de frutos de níspero. Los perfiles fueron
determinados para ambas fracciones, PPO soluble (-○-) y PPO latente (-●-) en 50 mM de
tampón acetato pH 4.5 usando TBC como sustrato.
Con el fin de estudiar la termoestabilidad de ambas fracciones enzimáticas (figura

2.9; soluble (A) y latente (B)), éstas fueron incubadas en tampón acetato 50 mM pH 4.5 desde
5 hasta 150-200 minutos en un baño de agua a diferentes temperaturas (40ºC, 60ºC, 75ºC y
85ºC).
45
70
A
60
50
v0 (µM/min) 40
30
20
10
0
0 50 100 150 200 250
Tiempo (minutos)
35
B
30
25
v0(µM/min)
20
15
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo (minutos)
Figura 2.9. Termoestabilidad de las fracciones enzimáticas; PPO soluble (A) y PPO
latente (B), utilizando TBC como sustrato para diferentes temperaturas; 40ºC (-●-), 60ºC (-○-
), 75ºC (-▲-) y 85ºC.
El interior de la figura 2.10 muestra las gráficas semilogarítmicas de inactivación

térmica para ambas fracciones, soluble (A) y latente (B). Las constantes de velocidad de
primer orden para la inactivación térmica, ki, se determinaron de las gráficas semilogarítmicas
para cada temperatura y se muestran en la figura 2.10. La PPO latente muestra una estabilidad
térmica significativamente mayor que la fracción soluble en el rango estudiado, por ejemplo,
la incubación de la PPO soluble a 75ºC durante 25 minutos produce una pérdida del 98% de la
46
actividad PPO; mientras que para la fracción latente sólo se pierde un 33% de la actividad
bajo las mismas condiciones.
La alta estabilidad de la PPO latente es similar a la obtenida para la PPO de lichi,

enzima que en 10 minutos a 90ºC sólo pierde un 50% de su actividad (Yue-Ming y col.,
1997). La inactivación térmica de la PPO soluble es un fenómeno rápido a temperaturas
superiores a 60ºC, lo mismo que para frutos de tomate (Casado y col., 2005a) y para los frutos
de níspero de la variedad Mogi (Ding y col., 1998b).
0,5
5
A
4
Ln v0 (µM/min)
0,4 2
0,3 -1
0 50 100 150 200 250
ki (1/min)
Tiempo (min)
5
B
4
0,2 3
Ln v0 (µM/min)
0,1 -1
-2
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo (min)
0,0
30 40 50 60 70 80 90
temperatura de incubación (ºC)
Figura 2.10. Constantes de velocidad de primer orden para la inactivación térmica de

PPO de frutos de níspero. Las constantes de velocidad se determinaron para ambas fracciones;
PPO soluble (-○-) y PPO latente (-●-) a partir de las pendientes para cada temperatura.
Interior; gráficos semilogarítmicos de la velocidad de reacción frente al tiempo de incubación
para la fracción soluble (A) y latente (B). La velocidad de reacción se determinó usando TBC
como sustrato después de incubar la enzima a diferentes tiempos para las siguientes
temperaturas; 40ºC (-●-), 60ºC (-○-), 75ºC (-▲-) y 85ºC.
47
II.3.2.4 Especificidad de sustrato
La especificidad de sustrato para ambas formas, soluble y latente, se estudió utilizando

una batería de 10 o-difenoles que incluye sustratos naturales y sintéticos (tabla 2.4). Estos
sustratos se diferencian en el substituyente de la posición 4 del anillo o-difenólico.
La figura 2.11 muestra los resultados de la especificidad de sustratos para ambas

fracciones. Los perfiles son bastante similares, con algunas diferencias cuantitativas para
todos los sustratos. Para ambas fracciones, el ácido clorogénico es el mejor sustrato seguido
de 4-metil catecol (4–MC), 4-tert-butil catecol (TBC), epicatequina, pirocatecol e
isoproterenol. La actividad fue bastante débil con el ácido cafeico, el ácido protocatequico,
dopamina y L-dopa.
1200
1000
800
v0 (µM/min)
600
400
200
0
TBC
4-MC
dopamina
protocatechuico
epicatequina
ácido clorogénico
ácido cafeico
L-Dopa
isoproterenol
pirocatecol
Figura 2.11. Especificidad de sustrato de PPO de frutos de níspero. La velocidad de

reacción se determinó como µM de producto/minuto utilizando una concentración de 3 mM
de cada uno de los sustratos para ambas fracciones; PPO soluble ( ) y PPO latente ( ).
48
longitud de onda coeficiente de extinción

sustrato estructura
óptima (nm) molar (M-1×cm-1)
ácido caféico 400 1831
ácido
400 600
clorogénico
epicatequina 400 1553
ácido
400 1022
protocatequico
dopamina 408 2614
L-DOPA 475 3965
pirocatecol 400 1260
4-metil catecol 400 1298
4-tert-
390 1225
butilcatecol
OH
CH CH 2 NHPr-i
isoproterenol 490 740

HO
OH
Tabla 2.4. Estructura, longitud de onda óptima y coeficientes de extinción de los

diferentes sustratos ensayados para la medida de la actividad PPO de frutos de níspero.
49
De los resultados obtenidos se deduce que una carga, negativa o positiva, cerca del
anillo fenólico puede interferir en el proceso catalítico, dando lugar a una disminución de la
actividad. Además, resulta llamativo que la oxidación del ácido cafeico, el cual tiene una
estructura parcial del ácido clorogénico y es un precursor del mismo en la planta, sólo fue de
un 4% respecto del ácido clorogénico para la PPO latente y de un 2.5% para la PPO soluble
para la misma concentración de sustrato.
II.3.2.5 Inhibidores
El control del pardeamiento enzimático de frutos y vegetales se ha convertido en un

área de investigación independiente debido a su relevancia en la industria alimentaria. A
pesar de la gran cantidad de datos acumulados sobre inhibición de pardeamiento de alimentos
no existe en la actualidad una solución única y definitiva para este problema en la industria
alimentaria.
Un amplio abanico de compuestos y tratamientos químicos como acidulantes, haluros,

compuestos quelantes de cobre, compuestos reductores y antioxidantes se han estudiado por
su capacidad para prevenir el pardeamiento enzimático (Vámos-Vigyazó, 1981), pero su buen
funcionamiento como inhibidores enzimáticos es a menudo incompatible con la fabricación
de derivados, como zumos de frutos a nivel industrial ya que pueden presentar efectos
perniciosos para la salud y toxicidad (Taylor, 1986; Sayavedra-Soto y Montgomery, 1986).
Nosotros hemos estudiado el efecto de cuatro tipos de compuestos de actividad

inhibidora sobre PPO de frutos de níspero. Estos cuatro grupos de compuestos inhibidores
incluyen agentes reductores (ácido ascórbico, pirosulfito de sodio y compuestos que contienen
grupos tiol), sales de haluro (NaCl y NaF), un análogo estructural (tropolona) y, por último,
un compuesto quelante de cobre (dietil ditiocarbamato de sodio).
La Tabla 2.5 muestra el efecto de los diferentes inhibidores sobre ambas fracciones
enzimáticas, PPO soluble y PPO latente, utilizando TBC como sustrato y tres concentraciones
diferentes del compuesto inhibidor en el medio de reacción.
Los agentes reductores y el análogo estructural actúan como fuertes inhibidores

incluso a bajas concentraciones, mientras que las sales de compuestos halogenados inhiben
moderadamente.
50
actividad residual (%)

PPO soluble PPO latente
concentración de inhibidor
inhibidor 10 mM 1 mM 0.1 mM 10 mM 1 mM 0.1 mM
tiourea 17 78 86 28 88 95
2-mercaptoethanol n.d. n.d. 10 n.d. n.d. 21
L-glutatión n.d. 2 100 n.d. n.d. 7
L-cisteina n.d. n.d. 10 n.d. n.d. n.d.
DL-Ditiotreitol n.d. 17 65 n.d. n.d. n.d.
pirosulfito de sodio n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
ácido ascórbico n.d. n.d. 52 n.d. n.d. 25
NaCl 2 120 137 96 100 112
NaF 5 15 105 5 35 89
tropolona n.d. n.d. 1 n.d. 7 14
DEDTC n.d. n.d. 9 n.d. 18 36
n.d. no detectado
Tabla 2.5. Efecto de diferentes inhibidores sobre la actividad PPO de frutos de níspero.
La PPO latente se mostró mucho más sensible que la PPO soluble al glutatión, tiol que
se encuentra de forma natural en los tejidos vegetales, y al compuesto reductor sintético
ditiotreitol. El mecanismo de inhibición de los grupos tiol puede ser debido a su adición a las
quinonas para formar aductos incoloros o, alternativamente se puede unir al centro catalítico
de la enzima. La habilidad de los grupos tiol para inhibir PPO se ha descrito ampliamente
(Sanada y col., 1972; Sayavedra-Soto y Montgomery, 1986; Friedman, 1994, Negishi y
Ozawa, 2000), pero el efecto inhibitorio depende en gran medida de la estructura de la
molécula que contiene los grupos tiol y su posición dentro de la misma (Friedman, 1994).
Ambas fracciones, PPO soluble y latente, fueron inhibidas fuertemente por L-cisteina,
alcanzándose más de un 90% de inhibición a la concentración mas baja de inhibidor, es decir,
en presencia de 0.1 mM de L-cisteina. La cisteina es un aminoácido que contiene un grupo
sulfidrilo, estos grupos se han descrito como inhibidores de la actividad de PPO (Walker y
Redish, 1964; Dudley y Hotchkiss, 1989; Richard-Forget y col., 1992). El mecanismo de
inhibición del pardeamiento por L-cisteina ha sido discutido durante largo tiempo. Existen
dos opiniones principales: (1) las quinonas reaccionan con la cisteina mediante un mecanismo
51
no catalítico para formar aductos incoloros (Sanada y col., 1972; Negishi y Ozawa, 2000,
Ding y col., 2002), y (2) la cisteína puede inhibir a la enzima directamente por combinación
irreversible de esta con el cobre del sitio activo (Valero y col., 1991). Ambas fracciones
mostraron una inhibición similar por agentes reductores fuertes como el pirosulfito de sodio y
el ácido ascórbico. Ambos compuestos, pirosulfito y ácido ascórbico, actúan como
antioxidantes mediante la reducción de las quinonas a sus formas fenólicas originales,
evitando, por lo tanto, las reacciones secundarias que dan lugar a compuestos poliméricos de
colores oscuros (Harper y col., 1969; Hus y col., 1988). Además existen trabajos que sugieren
que el pirosulfito presenta un mecanismo de acción mixto, como antioxidante y como
inhibidor formando complejos enzima-inhibidor (Valero y col., 1992). Entre los haluros
utilizados, el fluoruro de sodio muestra claramente una inhibición más fuerte que el cloruro de
sodio mostrándose la fracción latente mucho más sensible frente ambos iones. A pesar de que
el cloruro de sodio para ambas fracciones mostró un efecto inhibidor, similar al obtenido para
la PPO de frutos de tomate (Casado y col., 2005), a veces se ha descrito a este haluro como
activador e inhibidor dependiendo del pH del medio de reacción; a pH inferior a 5.0 puede
actuar como inactivador inespecífico lo que concuerda con el mecanismo de inhibición
propuesto para los iones cloruro, capaces de unirse a las dos formas protonadas de la enzima,
a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato (Valero y García-Carmona, 1998). También
hemos cuantificado que la fracción soluble es más sensible que la fracción latente al agente
quelante de cobre (DEDTC), dato que sugiere que la unión del Cu2+ al centro catalítico podría
ser más fuerte para la PPO latente.
Para completar el estudio de inhibición de las diferentes fracciones de polifenol

oxidasa de frutos de níspero, hemos estudiado el efecto de las ciclodextrinas como
secuestrantes de los sustratos para prevenir el pardeamiento enzimático. Las ciclodextrinas
(CDs) son oligosacáridos cíclicos que contienen 6 (α-CD), 7 (βCD) u 8 (γ-CD) unidades de
glucosa unidas por enlaces α-1-4-glucosídicos (Saenger, 1980). La propiedad más importante
de las CDs es su capacidad para incluir una amplia variedad de moléculas orgánicas e
inorgánicas, incluyendo a los polifenoles (Cai y col., 1990), dentro de su cavidad hidrofóbica.
En este trabajo se ha estudiado el efecto inhibitorio de dos ciclodextrinas, metil-β-

ciclodextrina e hidroxipropil- β-ciclodextrina sobre la actividad de las dos fracciones de PPO.
Como se observa en la figura 2.12 el comportamiento es similar para las dos fracciones,
soluble activa (A y C) y latente (B y D), observándose un decrecimiento en la actividad de
52
ambas cuando se utilizan sustratos hidrofóbicos o polares neutros como el 4-tert-butil catecol
y el ácido clorogénico, mientras que en presencia de sustratos hidrofílicos cargados como el
isoproterenol y la L-dopa la actividad de PPO permanece inalterable al aumentar las
concentraciones de ambas ciclodextrinas.
200 200
A 180
C
160
150
140
v0 (µM/min)
v0 (µM/min)
120
100 100
80
60
50
40
20
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16
[cds metilada] (mM) [cds hp] (mM)
1000 1000
B D
800 800
v0 (µM/min)
600
v0 (µM/min)
600
400
400
200
200
0
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[cds metilada] (mM) [cds hp] (mM)
Figura 2.12. Efecto de diferentes concentraciones (0-16 mM) de la metil-β-

ciclodextrina (cds metilada) e hidroxipropil- β-ciclodextrina (cds hp) para la fracción soluble
(A y C) y para la fracción latente pura (B y D) respectivamente. La reacción se determinó a
pH 4.5 para cuatro sustratos diferentes; TBC (-●-), AC (-■-), isoproterenol (-○-) y L-dopa (-
□-).
53
Este efecto inhibitorio de la β-ciclodextrina sobre la actividad PPO con ciertos

sustratos ha sido atribuido anteriormente a la formación de compuestos de inclusión, que
disminuyen la concentración de sustrato libre que puede ser oxidado por la enzima (Fayad y
col., 1997, Sojo y col., 1999; Núñez Delicado y col., 2003). Sin embargo, en presencia de
sustratos hidrofílicos cargados, como dopamina, L-dopa e isoproterenol, las CDs no son
capaces de formar complejos de inclusión y por consiguiente, no inhiben la oxidación de los
sustratos (Casado y col., 2006a). Un ejemplo es la dopamina, principal polifenol de los frutos
de plátano, en los que la presencia de CDs promueve el pardeamiento en lugar de inhibición
de los extractos crudos (Sojo y col., 1999).
Entre las dos ciclodextrinas ensayadas, metil-β-ciclodextrina e hidroxipropil- β-

ciclodextrina, se observa un mayor efecto inhibitorio sobre la actividad PPO para la metil-β-
ciclodextrina. Con AC, sustrato mayoritario en frutos de níspero, y para una concentración de
CDs de 10 mM, se obtuvo un 91 y un 97% de inhibición de la actividad de PPO soluble y
latente respectivamente para la CDS metilada, mientras que en presencia de la misma
concentración de CDs hidroxipropilada, sólo se alcanzó entre un 42-44% de inhibición. Esta
diferencia de inhibición puede ser debida a la formación de un complejo más estable con la
CDS metilada que con la hidroxipropilada.
Durante la caracterización cinética en paralelo de ambas fracciones de PPO, latente

pura y soluble parcialmente pura, se han acumulado una serie de evidencias que sugieren que
ambas fracciones son diferentes formas de PPO que quizás pudieran estar implicadas en
diferentes funciones. La estabilidad térmica, perfiles de temperatura y perfiles de pH son
bastante diferentes para ambas fracciones. Además para un pH de 4.5, valor de pH más alto en
el fruto de níspero, los parámetros cinéticos muestran diferencias en la especificidad y
catálisis del ácido clorogénico, polifenol más abundante en el fruto del níspero. La PPO
soluble muestra una baja constante de Michaelis para el AC, mientras que se obtuvo una
mayor constante para la PPO latente. Por ello, para una baja concentración del sustrato, la
fracción soluble podría saturarse y no responder a fluctuaciones en la concentración de AC,
mientras que la fracción latente, ajustaría la velocidad de reacción a la disponibilidad de
sustrato. Además, si tenemos en cuenta la abundancia relativa de la fracción latente (80% del
total de PPO), podríamos considerar a ésta PPO como la principal en la ruta de la oxidación
del polifenol más abundante en los frutos de níspero.
54
Capítulo III.
Propiedades moleculares de la polifenol
oxidasa latente
Introducción Propiedades moleculares de la polifenol oxidasa latente
III.1. INTRODUCCIÓN
Tras la extracción y purificación a homogeneidad de la PPO latente, en este capítulo se

analizarán sus propiedades moleculares incluyendo la masa molecular aparente en
condiciones desnaturalizantes y nativas, y la secuencia de su extremo amino terminal.
III.2. MATERIALES Y MÉTODOS
III.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida
III.2.1.1. Reactivos y soluciones utilizadas
Solución de monómeros acrilamida/bisacrilamida: solución stock de acrilamida al

30% (p/v) y metileno-bisacrilamida al 0.8% (p/v) (37.5:1) desgasificada (Pronadisa).
Tampón de muestra: se prepara mezclando las siguientes cantidades:
Reactivo Volumen (ml)
Tris HCl 0.5 M pH 6.8 1.0

Glicerol 0.8
2 mercaptoetanol 0.4
SDS 10% 1.6
H2O 4.2
Azul de bromofenol 0.05% 0.01
Tampón de electroforesis: 25 mM de Tris base, 192 mM de glicina y 0.1% (p/v) de

SDS.
Marcadores de peso molecular: en los geles se ha introducido una mezcla de

proteínas de peso molecular conocido. (Fermentas).
Marcadores de peso molecular
Proteína Fuente Pm (kDa)
Β-Galactosidasa E.coli 116.0

Albúmina de suero bovino plasma bovino 66.2
Ovoalbúmina huevo blanco 45.0
Lactato deshidrogenasa músculo porcino 35.0
Endonucleasa de restricción Bsp981 E.coli 25.0
β-Galactoglobulina leche bovino 18.4
Lisozima huevo blanco 14.4
55
Materiales y métodos Propiedades moleculares de la polifenol oxidasa latente
III.2.1.2 Métodos
- Preparación de las muestras: una vez cuantificada la cantidad de proteína en cada

uno de los extractos enzimáticos, se toma de cada uno de ellos un volumen correspondiente a
100 µg de proteína total y se somete a precipitación con ácido tricloroacético (TCA) de
acuerdo al protocolo descrito por Granier y Van de Walle (1988) con alguna variación: el
volumen de proteína se lleva hasta un volumen final de 750 µl con agua destilada, a
continuación se adicionan 8.5 µl de dexosicolato de sodio 2% (p/v) (Bensadoun y Weinstein,
1975) y se incuban en hielo durante 15 minutos, pasado este tiempo se adicionan 250 µl de
TCA 24% (p/v) y se deja precipitar en frío durante 30 minutos. A continuación se centrifugan
a 11.000 rpm durante 10 minutos y se decanta el sobrenadante de la centrifugación. El
precipitado de cada una de las muestras se lava con acetona fría (-20ºC) y posteriormente se
incuba en hielo durante 10 minutos, se centrifuga a 11.000 rpm durante 10 minutos. El lavado
con acetona se repite dos veces más. La adición de ácido tricloroacético y acetona provoca la
inactivación y precipitación de la mayoría de las proteínas presentes en los tejidos vegetales.
Además, este método presenta la ventaja añadida de que mantiene solubles otros componentes
celulares que pueden interferir en el manejo de proteínas como sales y compuestos de
naturaleza fenólica. Para finalizar, el precipitado se deja secar a temperatura ambiente hasta
completa sequedad, se resuspende en 20 µl de tampón de muestra y se calienta a 100ºC
durante 3 minutos.
- Preparación del gel de acrilamida: el gel se prepara por acoplamiento de dos geles
con distinto pH: el gel separador situado en la parte inferior y el gel espaciador situado en la
parte superior. La presencia de tampones discontinuos en el gel resultante permite una mayor
resolución de las muestras proteicas, debido a que las proteínas se encuentran en una banda
pequeña antes de ser tamizadas según su tamaño y carga en el gel separador.
La polimerización de la acrilamida se consigue por la adición de persulfato amónico

(APS) y tetrametiletilendiamina TEMED. Las mezclas se desgasifican antes de adicionar el
persulfato amónico y el TEMED. Después de montar los soportes de vidrio para los geles, con
ayuda de pipeta pasteur de vidrio se rellenan ¾ partes con el gel separador, a continuación se
adiciona isopropanol saturado en agua con la finalidad de obtener un frente horizontal en la
parte superior y se deja polimerizar. La polimerización se lleva a cabo a 25ºC. Una vez
finalizada la misma, se elimina la capa de isopropanol y se adiciona el gel espaciador hasta
56
alcanzar el borde superior de los cristales. A continuación se introduce el peine, que da lugar a
la formación de las calles, que sirven para insertar las muestras. Una vez que el gel ha
polimerizado, se retira el peine y se introduce el molde con el gel en la cubeta de
electroforesis.
Los geles se preparan mezclando las cantidades siguientes:
gel separador (ml) 12.5% gel espaciador (ml) 4.5% reactivos
2.50 ------ Tris-base 1.5 M pH 8.8

------ 1.25 Tris-base 0.5 M pH 6.8
4.17 0.65 Solución acrilamida
3.17 3.02 Agua destilada
0.05 0.025 Persulfato amónico (APS)
0.01 0.005 TEMED
0.10 0.05 SDS
- Condiciones de la electroforesis: La electroforesis se realiza en gel de

poliacrilamida al 12.5% en condiciones desnaturalizantes según el método descrito por
Laemmli (1970). La SDS-PAGE se realiza a temperatura ambiente en una cubeta Hoefer
miniV de Amersham Pharmacia Biotech, conectada a una fuente de electroforesis Power
Suple- EPS 601. La cubeta se llena con 1 litro de tampón de electroforesis y la carrera se lleva
a cabo 200V con intensidad variable a temperatura ambiente. La duración bajo estas
condiciones es aproximadamente de 1 hora y 30 minutos.
- Tinción de los geles: terminada la electroforesis se procede a la tinción de los geles

utilizando una modificación del método de Coomassie Coloidal de Neuhoff y col. (1998). Los
geles se depositan en cubetas de tamaño apropiado y se cubren con una disolución de fijación
(40% (v/v) metanol y 10% (v/v) ácido acético). Se dejan en fijación en un periodo de tiempo
comprendido entre una hora y toda la noche. Finalizado el tiempo de fijación, se lavan con
agua ultra pura durante 10 minutos, el lavado se repite tres veces. Durante el tercer lavado con
agua se prepara la solución coloidal: 10 ml de Coomassie G-250 en agua (5% p/v) y se agita
durante 5 minutos. A continuación se prepara la solución de stock mezclando 50 g de sulfato
de amonio, 6 ml de ácido fosfórico 85% y 10 ml de la solución coloidal, para un volumen
final de 500 ml. Una vez finalizados los lavados con agua se mezclan 4 partes de solución
stock y una parte de metanol y se mantienen los geles durante toda la noche en agitación. Por
57
último se lavan con agua a una temperatura comprendida entre 45-55ºC repetidas veces hasta
la completa desaparición del color del fondo del gel.
Alternativamente, para una mejor comprobación de la purificación a homogeneidad de

la PPO latente, los geles se tiñen con nitrato de plata utilizando el protocolo descrito por
Shevchenko y col. (1996). Los geles se depositan en cubetas de tamaño apropiado y se cubren
con una disolución de fijación (50% (v/v) metanol y 10% (v/v) ácido acético). Se dejan en
fijación en un periodo de tiempo comprendido entre una hora y toda la noche. A continuación
se adiciona metanol al 5% durante 15 minutos. Finalizado este tiempo, se lavan con agua ultra
pura durante 10 minutos, el lavado se repite tres veces. Seguidamente se incuban con
tiosulfato sódico pentahidratado a la concentración de 0.2 g/l durante 2 minutos, se realizan
tres lavados con agua ultrapura y se dejan a temperatura ambiente durante 25 minutos con
solución de nitrato de plata a una concentración de 0.2 g/100 ml. Una vez transcurrido el
tiempo, se lavan con agua ultrapura y se prepara la disolución de revelado: 3 g/100 ml de
carbonato de sodio, 50 µl/100 ml de formaldehído al 37% y 2 ml/100 ml de solución de
tiosulfato, los geles se incuban a temperatura ambiente con esta disolución durante 10 minutos
como máximo. Por último el revelado de los geles se para adicionando una disolución de
EDTA disódico cuya concentración es de 14 g/l. Se espera entre 10 y 15 minutos y se lavan
con agua ultrapura.
Una vez teñidos los geles se escanean utilizando un densitómetro (ImageScanner) y se

guardan en una disolución de ácido acético al 5%.
III.2.2 Cromatografía de filtración en gel
El peso molecular de la fracción particulada latente nativa se determina por

TM
cromatografía de filtración en gel utilizando una columna Hi Load 16/60 SuperdexTM
prep.Grad. (GE Healthcare). La columna se calibra utilizando el kit de calibración de
filtración en gel (LMW, GE Healthcare). Cada una de las proteínas del kit se eluyen con 0.05
M de tampón fosfato pH 7.5 con 0.1 M de NaCl y 0.02% (p/v) de NaN3. La PPO purificada se
cromatografía en el mismo tampón pero sin utilizar azida sódica.
III.2.3 Amino terminal
La preparación de las muestras para obtener el amino terminal de la enzima requiere

una electroforesis en gel de acrilamida descrita en el punto anterior y a continuación una
transferencia del gel a una membrana de PVDF (ver materiales y métodos del capítulo VI).
58
Finalizada la transferencia la membrana se tiñe con azul de coomassie R250. En primer lugar
la membrana se sumerge en una de disolución de Coomassie que contiene 0.1% (p/v) de
Coomassie R250 y metanol al 50% (v/v) durante 5 minutos en continua agitación y después
se realizan varios cambios con una solución que contiene 50% metanol (v/v) y 10% de ácido
acético (v/v). Por último la membrana se lava con agua durante 5 minutos en agitación y se
recortan las bandas de la proteína. Estos puntos se mandaron al Servicio de Química de
proteínas del Centro de Investigaciones Biológicas (C.S.I.C.) donde determinaron la
secuencia del extremo amino terminal utilizando un secuenciador Procise 494 (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA).
59
Resultados y discusión Propiedades moleculares de la polifenol oxidasa latente
III.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.3.1 Pureza de PPO latente y masa aparente de la proteína
La pureza de PPO alcanzada en cada uno de los pasos del proceso de purificación se
ha analizado por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes
(SDS-PAGE). La figura 3.1A muestra la SDS-PAGE de todo el proceso de purificación de la
fracción de PPO latente asociada a membranas (PPO particulada) teñido con Coomassie
coloidal. El último paso de purificación (figura 3.1A y B) muestra una única banda de PPO
latente.
Figura 3.1. (A) SDS-PAGE del proceso completo de purificación de PPO latente
hasta homogeneidad. (0) 1.5% Triton X-114; (1) PPO particulada; (2) DEAE; (3) phenyl Hp y
(4) enzima purificada por filtración en gel (B) SDS-PAGE de la enzima purificada a
homogeneidad por filtración en gel revelado con plata. (5)-(9) diferentes fracciones de PPO
latente purificada. MW, marcadores de peso molecular.
Mediante representación semilogarítmica de los pesos moleculares de los patrones

(Pm) frente a la movilidad relativa (Rf) se determina que la banda tiene una masa molecular
aproximada de 59.2 kDa (figura 3.3B). El tamaño aparente de la PPO purificada latente se ha
estudiado asimismo en condiciones nativas por cromatografía en filtración en gel. La figura
3.2 muestra los resultados de la calibración de la columna donde se representa la absorbancia
a 280 nm de cada una de las proteínas control en función del volumen de elución y la elución
60
de la fracción particulada representada en función de la actividad de PPO latente (v0

(µM/min)). La PPO latente se eluye sobre unos 72.9 ml de tampón, comprendida entre la
albúmina y la ovoalbúmina (figura 3.2). Mediante representación semilogarítmica del
coeficiente de partición entre las fases cromatográficas (Kav) frente al log del peso molecular
(Pm) de los patrones se determina que el pico de PPO corresponde a 61.2 kDa (figura 3.3A).
Mediante representación semilogarítmica de los pesos moleculares de los patrones (Pm) frente
a la movilidad relativa (Rf) se determina que la banda tiene una masa molecular aproximada
de 59.2 kDa (figura 3.3B). Estos resultados demuestran que la PPO latente es un monómero.
Datos similares de peso molecular y estructura se han obtenido para la variedad Mogi del
níspero (Ding y col., 1998), pero hay que resaltar que nuestra isoenzima de polifenol oxidasa
se encuentra en estado latente, a diferencia de los resultados obtenidos para la variedad Mogi
donde la enzima se encuentra en su estado activo.
120 140
120
100
Absorbancia (280 nm) (mAU)
100
80
80
v0(µM/min)
60
60
40
40
20
20
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140
V(ml)
Figura 3.2. Cromatograma de filtración en gel en columna Hi Load 16/60 Superdex

(volumen de la columna 120-124 ml, velocidad de flujo 1ml/min). En el cromatograma se
muestra la absorbancia a 280 nm de las proteínas de calibración de la columna; ( ) azul
dextrano 2000; ( ) albúmina (67 kDa); ( ) ovalbúmina (43 kDa); ( )
quimotripsinógeno (25 kDa); ( ) ribonucleasa (18.7 kDa). La elución de la fracción de
PPO latente pura viene expresada en µM/min ( ).
61
0,70
4
A
0,65
0,60
3
0,55
KAV
0,50
2
0,45
0,40
PPO
0,35
1
0,30
4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9
log Pm
1,9
5
1,8
B
PPO
1,7 6
log Pm
1,6
7
1,5
1,4 8
1,3 9
1,2
0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Rf
Figura 3.3. Estimación del peso molecular de PPO latente de frutos de níspero por
filtración en gel en una columna Hi Load 16/60 Superdex (A) y SDS-PAGE (B). Marcadores
de peso molecular: (A) 1, albúmina de suero bovino (67.0 kDa); 2, ovoalbúmina (45.0 ); 3,
quimotripsinógeno (25.0 kDa); 4, ribonucleasa (18.7 kDa); (B) 5, albúmina de suero bovino
(67.0 kDa); 6, ovalbúmina (45.0 kDa); 7, lactato deshidrogenasa (35 kDa); 8, endonucleasa de
restricción Bsp 981 (25.0 kDa); 9, β-galactoglobulina (18.4 kDa); PPO, enzima latente
purificada.
Para descartar la posibilidad de que la PPO soluble parcialmente purificada a partir del
fruto de níspero sea una forma activa resultante de la proteolisis del precursor latente, hemos
determinado el tamaño aparente de la PPO soluble por filtración en gel en condiciones
nativas.
62
Como se observa en la figura 3.4A, la PPO soluble se eluye sobre unos 73.3 ml de
tampón, muy próximo al volumen de elución de la PPO latente pura. Mediante representación
semilogarítmica se determina que el pico de PPO corresponde a 60.0 kDa (figura 3.4B). Estos
datos confirman los resultados obtenidos por Ding y col. (1998) los cuales determinan una
PPO purificada de la fracción soluble tenía una masa de 58 kDa.
25
A
20
v0(µM/min)
15
10
0 20 40 60 80 100 120 140

volumen (mL)
0,70
4 B
0,65
0,60 3
0,55
kAV
0,50
2
0,45
0,40 PPO
1
0,35
0,30
4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9
log Pm
Figura 3.4. Cromatograma de filtración en gel en columna Hi Load 16/60 Superdex

(A). La elución de la fracción de PPO soluble viene expresada en µM/min. Estimación del
peso molecular de PPO soluble de frutos de níspero por filtración en gel (B); 1, albúmina de
suero bovino (67.0 kDa); 2, ovalbúmina (45.0 kDa); 3, quimotripsinógeno (25.0 kDa); 4,
ribonucleasa (18.7 kDa); PPO, enzima soluble activa parcialmente purificada.
63
III.3.2 Amino terminal y análisis de similitud de secuencia
La secuencia obtenida de la banda de 59.2 kDa de la PPO latente después de 13 ciclos

de microsecuenciación de Edman es APVAPDLTTXGP (Anexo A). Esta secuencia se analiza
mediante BLASTP contra las bases de datos de proteínas de NCBInr, Swiss prot y TrEMBL.
El resultado obtenido se muestra en la figura 3.5 y 3.6 que demuestra inequívocamente que la
banda es una PPO, cuyo extremo amino terminal es coincidente con el de PPO 2 de manzana
una vez eliminado el péptido de direccionamiento al tilacoide (residuos 1-93). La no
obtención de la cisteina puede ser debido a que este aminoácido en presencia de acrilamida se
encuentra modificado, pero la comparación con otras secuencias, que presentan homología
con la PPO 2 precursor, muestran una conservación de la cisteina en todas ellas.
Figura 3.5. Resultado del BLASTP frente a la base de datos NCBI.
64
NCBI BLAST program reference [PMID:9254694]:
Alignment
tr Q93XM8 Polyphenol oxidase 2 precursor [Malus domestica (Apple) (Malus 586 AA
Q93XM8_MALDO sylvestris)] align
Score = 35.0 bits (75), Expect = 0.36

Identities = 12/13 (92%), Positives = 12/13 (92%)
Query: 1 APVSAPDLTTXGP 13
APVSAPDLTT GP
Sbjct: 94 APVSAPDLTTCGP 106
Figura 3.6. Resultados del BLASTP frente a la bases de datos Swiss prot y TrEMBL
65
Capítulo IV.
Regulación de la actividad enzimática
de la polifenol oxidasa latente
Introducción Regulación de la actividad de la polifenol oxidasa latente
IV.1 INTRODUCCIÓN
Para lograr una mejor comprensión en los mecanismos de regulación de la actividad

de PPO latente, en este capítulo hemos estudiado el efecto de agentes activantes-detergentes,
tripsina y ácidos grasos- sobre las propiedades estructurales y funcionales de la PPO latente
purificada a homogeneidad.
IV.2 MATERIALES Y MÉTODOS
IV.2.1 Materiales
Todos los detergentes; tetradecil sulfato de sodio (STS), dodecil sulfato de sodio
(SDS), octil sulfato de sodio (SOS), dodecano sulfonato de sodio (SDSA), octano sulfonato
de sodio (SOSA), Triton X-100 y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y todos los ácidos
grasos insaturados; ácido oleico (Ol), ácido linoleico (Li), ácido α-linolénico (α-Ln) y ácido γ-
linolénico (γ-Ln) se obtuvieron de Sigma (Madrid, España).
La PPO latente homogénea se preparó de acuerdo al protocolo descrito en materiales y
métodos del capítulo II.
IV.2.2. Métodos
- Ensayos enzimáticos
La actividad PPO se ha determinado a 25ºC usando TBC o CA como sustrato,

monitorizando la aparición del producto a 390 nm y 400 nm respectivamente utilizando un
espectrofotómetro termostatizado Jasco V530. El medio de reacción estándar contiene 0.81 ml
de tampón 50 mM, 0.17 ml de 30 mM de TBC o 0.17 ml de 15 mM de CA y 0.02 ml de la
enzima.
Para determinar los perfiles de pH, la actividad se ensayó con tampón acetato sódico
en un rango de pH de 3.0 a 5.0 y con tampón fosfato en un rango de pH de 5.5 a 7.0.
En los ensayos de activación proteolítica, la muestra se incubó con 1000 unidades/ml

de tripsina durante 15 minutos a 37ºC.
- Ensayos de activación de PPO
Los ensayos de activación de la PPO latente se realizaron a pH 6.0 incluyendo

detergente en el medio de reacción. Los detergentes usados incluyen detergentes aniónicos
como alquil sulfatos (STS, SDS y SOS) y alquil sulfonatos (SDSA y SOSA), detergente no
66
Materiales y métodos Regulación de la actividad de la polifenol oxidasa latente
iónico como Triton X-100 o detergente catiónico como CTAB. El grado de activación se ha
determinado como actividad sin detergente/actividad con detergente.
- Ensayos de inhibición de PPO
Los ensayos de inhibición de PPO se realizaron en tampón acetato pH 4.5 incluyendo

en el medio de reacción detergentes o ácidos grasos insaturados. Para facilitar la
solubilización de los ácidos grasos, se incluye hasta un 46% de etanol (v/v). El grado de
inhibición determinado en cada caso se ha referido a un blanco sin inhibidor, que contiene la
misma concentración de etanol.
Para la inhibición de PPO en presencia de los detergentes, la reacción se monitoriza

con el espectrofotómetro descrito anteriormente. Para los ácidos grasos, el progreso de la
reacción se monitoriza por HPLC. Para ello se extrae periódicamente del medio de reacción
una alícuota y se le añade 100 µl de HCl 1 mM para parar la reacción. A continuación, se
centrifuga a 14000 rpm durante 5 minutos y 20 µl del sobrenadante se analiza
cuantitativamente por HPLC usando las condiciones isocráticas (90/10 (v/v) de agua
acidificada a pH 2.6 y acetonitrilo) descritas por Richard y col. (1991). La cantidad residual
de TBC y AC se determina a partir de la recta de calibrado realizada con diferentes
concentraciones de cada uno de los sustratos.
- Cromatografía de filtración en gel
Los experimentos de filtración en gel se realizaron en una columna Hi Load 16/60

Superdex prep. grad. (GE Healthcare, Uppsala Suecia), usando el sistema Akta Purifier LC
(GE Healthcare, Uppsala Suecia). Para cada experiencia, 2 ml de la fracción latente pura de
PPO se introdujeron en la columna, equilibrada previamente con 50 mM de tampón al pH
indicado y la concentración de detergente usada en cada caso, y después se eluyó con el
mismo tampón a una velocidad de 1 ml/min. Se recogieron fracciones de 1 ml y se mide la
actividad de PPO.
- Espectroscopia de fluorescencia
Las medidas de fluorescencia se registraron en un espectrofluorímetro SLM-8000C

(Instrumentos SLM, Urbana IL) usando una célula de cuarzo de 10 mm de paso óptico a
25ºC. Para realizar las medidas de fluorescencia intrínseca, se utilizó una preparación
homogénea de 0.3 mg/ml, se excitó a 275 nm, y el espectro de emisión se registró entre 300 y
67
400 nm. Para corregir la intensidad de fluorescencia de la línea base, se utilizaron los blancos
apropiados.
Para obtener la concentración necesaria de enzima, se juntaron varias fracciones de

enzima pura y se concentraron por ultrafiltración a través de una membrana de corte de 10 K
(MWCO, Ultrafree-0.5 PBGC Biomax membrane, 10K, Millipore) montada en un dispositivo
centrifugable (Ultrafree-0.5 PBGC Centrifugal Filter unit) hasta obtener una absorbancia de
0.5 a 280 nm. Para comprobar que la muestra concentrada no sufre ninguna modificación
estructural ni funcional, se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes, y se ensayó la actividad en ausencia y presencia de SDS.
- Determinación fluorimétrica de la concentración micelar crítica de detergentes
La concentración micelar crítica (cmc) de los detergentes se determinó mediante

espectroscopia de fluorescencia utilizando el método descrito por Chattopadhyay y London
(1984). Así, se preparó una placa con diferentes concentraciones de detergente para calcular
dichos valores de cmc. Cada muestra contenía un volumen total de 35 µl de solución acuosa:
0.88 µM de DPHT (disuelto en 2µl de THF) y las cantidades correspondientes de detergentes
y tampón (50 mM acetato pH 4.5 y pH 5.0 o 50 mM fosfato pH 6.0). A continuación estas
muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad, impidiendo
así cualquier posible fotoisomeización del fluoróforo (DPHT). Las medidas de intensidad de
fluorescencia se realizaron con un lector de placas termostatizado en modo fluorescencia
Tecan Genios a una λ de excitación de 360 nm y a una λ de emisión de 465 nm. Una vez
determinados los valores de fluorescencia relativa, se representaron gráficamente frente a la
concentración de cada uno de los detergentes. La cmc se define como el punto de intersección
entre las líneas que definen el comportamiento de fluorescencia en las regiones pre- y post-
micelares.
IV.2.3 Análisis de datos cinéticos
Los análisis cinéticos de los datos experimentales de PPO latente en presencia de AC a

pH 4.5, se procesaron de acuerdo a la ecuación
v0= vmax1.[S]n/(Km1n +[S]n) + vmax2.[S]m/(Km2m +[S]m) (ecuación 1)
debido a que la representación de velocidad frente a concentración de sustrato no es una

hipérbola y aparece como resultado de la adición de dos curvas tipo Hill con dos puntos de
68
inflexión. Además, se utilizó el método diferencial de Kurganov (1982) para calcular el índice
de cooperatividad nH con respecto a la saturación. Para ello se utilizó la siguiente ecuación:
n=log[(1/V´-1/V)/ (1/V-1/V´´)]/log χ (ecuación 2)
donde V, Vý V´´ son las velocidades obtenidas a la concentración de sustrato [S0], [S0]/ χ y
χ[S0] respectivamente y χ es una constante que es mayor que la unidad, en nuestro caso, el
valor es 2.
Por otra parte para calcular los datos cinéticos de la PPO latente en presencia de AC a
pH 3.5 y en presencia de ácido cafeico se utilizó la ecuación típica de inhibición por exceso
de sustrato (inhibición reversible):
v0=vmax.[S]/(Km+.[S]+([S]2/KI)) (ecuación 3)
Los datos cinéticos de la PPO latente digerida con tripsina a pH 4.5 usando AC como
sustrato se obtuvieron a partir de la ecuación:
v0= vmax1.[S]n/(Km1n +[S]n) (ecuación 4)
Para determinar los parámetros cinéticos se utilizó el programa de análisis estadístico

SPSS versión 12, y se utilizó una regresión no lineal de los datos experimentales.
69
Resultados Regulación de la actividad de la polifenol oxidasa latente
IV.3. RESULTADOS
IV.3.1 Efecto del SDS y la tripsina sobre los perfiles de pH
La figura 4.1 muestra los perfiles de pH de la fracción latente y de la fracción de PPO

digerida con tripsina, ensayadas ambas en presencia y ausencia de 2 mM de SDS, usando dos
sustratos: 4-tert-butil catecol (figura 4.1A) y ácido clorogénico (figura 4.1B).
Como se observa en la figura 4.1, la PPO latente muestra un perfil acampanado para
ambos sustratos, AC y TBC con un óptimo alrededor de pH 4.0 y 4.5 respectivamente. Estos
perfiles experimentan cambios dramáticos en presencia de tripsina y SDS. En el caso del
TBC, el efecto de estos tratamientos en el perfil de pH de PPO podría ser explorado en un
amplio rango de pH debido a que ambos, TBC y su quinona, son muy estables. Sin embargo,
para el AC la exploración del perfil de pH por encima de pH 5.0 se excluye por la
inestabilidad del sustrato.
Para el TBC, la preincubación de la PPO latente con tripsina cambia la forma del perfil
de pH, pasando de forma acampanada a forma de “S”. Este resultado es similar a los
obtenidos para los perfiles de pH de otras fuentes de plantas en presencia de tripsina (Marquès
y col., 1995; Gandia-Herrero y col., 2005b). Dicho cambio afecta principalmente a la parte
básica del perfil de pH, esto indica que el pK básico no tiene una gran influencia en el proceso
catalítico. Como resultado, el tratamiento con tripsina lleva a una activación de la PPO latente
por encima del pH óptimo mientras que la activación es cero o muy débil a valores de pH por
debajo del óptimo. Para el AC, el perfil se acerca a la forma de “S” aunque todavía conserva
la forma acampanada, observándose una reducción de la influencia del pK básico en la
actividad respecto del TBC. La activación puede ser detectada en todo el rango aunque es más
fuerte por encima de pH 4.5. Por otra parte, tal como discutimos en el capítulo anterior, la
inclusión de SDS en el medio de reacción causa un desplazamiento en el perfil acampanado
de pH hacia pH básico que es similar a los resultados obtenidos para los perfiles de pH de
otras fuentes de plantas en presencia de SDS (Moore y Flurkey, 1990; Jiménez y García-
Carmona, 1996; Marquès y col., 1995; Fraignier y col., 1995). La extensión de este
desplazamiento es más larga para el AC que el TBC, en el primer caso la actividad mostrada
para la curva de pH se desplaza de 2.5 a 4.3 mientras que en el segundo caso, se mueve de 3.0
a 4.0. Como resultado, el efecto observado es una activación por encima de pH 5.0 y una
inhibición por debajo de 4.5. Cuando la enzima activada por tripsina se ensaya con SDS se
70
produce un desplazamiento de pH causado por el detergente para ambos sustratos, TBC y AC.
Este resultado demuestra que el tratamiento con tripsina no desensibiliza a la PPO latente de
níspero frente al tratamiento con SDS. Sin embargo, los resultados encontrados en la literatura
son contrarios debido a que enzimas proteolizadas con tripsina de diferentes fuentes muestran
el mismo perfil de pH con y sin SDS (Marquès y col., 1995; Gandia-Herrero y col., 2005b).
500
A
400
v0(µM/min)
300
200
100
0
2 3 4 5 6 7 8
pH
600
B
500
400
v0(µM/min)
300
200
100
0
2 3 4 5 6 7 8
pH
Figura 4.1. Efecto del pH en la actividad del fruto de níspero de la PPO latente pura
(círculo) y la PPO activada con tripsina (cuadrado) con TBC (A) y AC (B). Los perfiles se
han determinado en ausencia (negro) y presencia de 2 mM SDS (blanco).
71
Por encima de pH 5.0, SDS, tripsina o ambos juntos activan la PPO latente como se ha
descrito extensamente en la literatura, pero por debajo de pH 4.5 la tripsina casi no tiene
efecto, para el TBC o muy débil, para el AC. Sin embargo, la presencia de SDS,
independientemente de la incubación con tripsina, causa el mismo grado de inhibición para
ambas, la PPO latente nativa y la PPO latente tratada con tripsina.
IV.3.2. Efecto del SDS en la fluorescencia intrínseca de la PPO latente
Los cambios significativos que se producen en la intensidad de fluorescencia y en la

longitud de onda máxima (λmax) del espectro de emisión pueden asignarse a cambios
conformacionales en la proteína y cambios en la polaridad del ambiente de los alrededores de
los residuos excitados. Como se observa en la figura 4.2, el espectro de emisión corregido de
la PPO excitada a 275 nm muestra un máximo en el entorno de 320 nm, que es consistente
con un contenido mayor en tirosina que en triptófano.
Exc 275 - PPO en presencia de concentraciones crecientes de SDS

40000
38000
36000 0mM
34000 0.25mM
32000 0.5mM
30000 0.75mM
28000 1mM
26000 1.5mM
24000 2mM
UAF 22000 2.5mM
20000 3mM
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
300 320 340 360 380 400
λ (nm)
Figura 4.2. Espectro de emisión de la PPO latente pura excitada a 275 nm para
diferentes concentraciones de SDS
Para la PPO de frutos de níspero no hay disponibles secuencias completas de

aminoácidos o nucleótidos en bases de datos, de modo que la ratio Tyr/Trp no se conoce.
72
Secuencias depositadas de otras PPO de Rosáceas (Chevalier y col., 1999; Haruta y col.,
1992; Nishimura y col., 2003) presentan una ratio de Tyr/Trp de 2-3 veces.
La figura 4.3 muestra el efecto de concentraciones crecientes de SDS en la intensidad

de fluorescencia integrada entre 300 y 400 nm (A) y sobre el máximo del espectro de emisión
excitado a 275 nm (B).
1,4e+6
A
1,2e+6
1,0e+6
Area - Area 0
8,0e+5
6,0e+5
4,0e+5
2,0e+5
0,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
[SDS](mM)
322
B
321
320
máximo de emisión
319
318
317
316
315
314
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
[SDS](mM)
Figura 4.3. Efecto de diferentes concentraciones de SDS en el medio de reacción en la

intensidad de fluorescencia integrada entre 300 y 400 nm (A) y el espectro del máximo de
emisión de PPO excitado a 275 nm (B)
La adición de pequeñas cantidades de SDS, por ejemplo 0.25 mM, muestran un gran
cambio sobre la intensidad de fluorescencia que posteriormente crece ligeramente al aumentar
la concentración de SDS. Del mismo modo, la adición de SDS causa cambios en la λ del
máximo de emisión. Después de un máximo de 320 nm a 0.5 mM SDS, este decrece
73
gradualmente hasta 315 nm a 1.5 mM y después aumenta de nuevo para 2 mM de SDS para
decrecer gradualmente a la mayor concentración utilizada, 3 mM de SDS. La tendencia de la
intensidad de fluorescencia y el perfil bifásico en el máximo de emisión se correlaciona con el
comportamiento de agregación del SDS cuya cmc a pH 6.0 es casi coincidente con el mínimo
del máximo de emisión, que indica un incremento en la hidrofobicidad de los residuos,
principalmente tirosinas.
En la primera fase, esta tendencia es consistente con la incorporación de monómeros a

la proteína que podrían inducir cambios conformacionales necesarios para la activación,
mientras que en la segunda fase, cuando se forman agregados de SDS, la tendencia es
consistente con la incorporación de la proteína al ambiente hidrofóbico de las micelas de SDS
formando, de este modo micelas mixtas proteína-detergente.
IV.3.3. Efecto del pH, sustrato y tripsina en los parámetros cinéticos
Como se ha comprobado en los experimentos anteriores, el pH es un factor

determinante en la expresión de la actividad de PPO, por ello la cinética de la enzima latente
pura se estudió a dos pHs diferentes, pH 4.5 y pH 3.5, con el sustrato natural ácido
clorogénico. Debido a que el AC modifica significativamente el pH del tampón utilizado al
aumentar la concentración, el sustrato se preparó en agua y se ajustó al pH requerido,
comprobando una vez terminada la reacción que el pH permanecía entre 4.47-4.53 ó entre
3.56-3.63 respectivamente. En tampón a pH 4.5, cuando el pH no se controla rigurosamente la
representación de la velocidad frente la concentración del AC se aproxima a una curva
hiperbólica hasta una concentración de 6 mM y su doble recíproca a una línea recta (ver
figura 2.5B Capítulo II), pero cuando se amplía el rango de concentración hasta 16 mM y se
realiza un control riguroso del pH la cinética se aproxima a la adición de dos curvas
sigmoides, como se muestra en la figura 4.4A. Para su análisis cinético los datos se ajustaron
a la ecuación 1 (materiales y métodos) que es la adición de dos ecuaciones tipo Hill
(Kurganov, 1982). Este procedimiento analítico se ha empleado con enzimas o
transportadores que exhiben comportamientos cinéticos complejos similares (Kagan and
Dorozhko, 1973; Gualix y col., 1996). Este ajuste arroja valores para los parámetros kcat, Km e
índice de cooperatividad de cada sigmoide, que se muestran en la tabla 4.1. Las sigmoides se
distinguen por sus valores de Km e índice de cooperatividad, pero el valor de kcat es muy
parecido por lo que a concentración saturante de AC la Vmax aparente sería la suma de vmax1 y
74
vmax2 que dan un valor próximo a 400 µM/min. La cooperatividad verdadera que viene dada
por la concentración del sustrato, depende del nivel de saturación, debido a que el nH es
variable. Para evaluar esta variación se utiliza el procedimiento diferencial de Kurganov
(1982) a partir del cual se calcula el índice de cooperatividad respecto de la saturación (figura
4.4A2) procesando los datos de acuerdo a la ecuación 2 (ver materiales y métodos).
Este comportamiento cinético complejo de cooperatividad se ha descrito para el

transporte de ε-nucleótidos en gránulos cromafines interpretándose como mecanismo
mnemónico de cooperatividad. La presencia de varios plateau intermedios en la
representación de la velocidad frente al sustrato en enzimas alostéricas, se ha explicado por la
presencia en el sistema de diferentes formas de la enzima que muestran diferentes grados de
cooperatividad cinética hacia el sustrato, debido a una isomerización lenta inducida por el
sustrato. Estas enzimas se conocen como histeréticas o mnemónicas (Kurganov, 1982; Valero
y García-Carmona, 1992).
Por el contrario, a pH 3.5 la cinética cambia radicalmente, mostrando una curva típica
de inhibición por exceso de sustrato (figura 4.4B). En este caso los datos se ajustaron a la
ecuación 3 (materiales y métodos). Como se observa en la tabla 4.1, la kcat para la oxidación
del AC a pH 3.5 es bastante mayor que a pH 4.5, sin embargo debido a la inhibición por
exceso de sustrato, la máxima velocidad alcanzada a igualdad de concentración de enzima se
situa alrededor de 400 µM/min, pero ésta se alcanza a 4 mM de sustrato en vez de a 16 mM.
A pH 4.5 se necesita cuadruplicar la concentración de AC para alcanzar la misma velocidad.
Así pues, el efecto del pH sobre la velocidad de reacción no es explicable por la

valoración de un pK sensible del centro activo, sino que se deben afectar otros grupos
ionizables que inducen cambios coordinados en la enzima que resultan en cambios del
comportamiento cinético. Resultados similares se han descrito para la polifenol oxidasa
latente extraída de las membranas del cloroplasto de uvas (Valero y García-Carmona, 1992),
en el cual, la cooperatividad expresada por esta enzima no está correlacionada con la
presencia de más de una isoenzima, ya que el análisis electroforético de la enzima latente y la
enzima activada con tripsina sólo mostraba una isoenzima de polifenol oxidasa en el extracto.
Estos autores explican la cooperatividad de la enzima en base a un modelo de isomerización
lenta de la enzima mediada por pH.
75
500 12
Curva de saturación A2
10 A
8
6
400
nH
4
300 -2
v0(µM/min)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

V/Vmax
20
15 A1
200 10
5
residual
0
-5
100 -10
-15
-20
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[AC](mM)
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
[AC](mM)
400
B
300
v0 (µM/min)
40
B1
30
200 20
10
residual
0
-10
100 -20
-30
-40
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[AC](mM)
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
[AC](mM)
Figura 4.4. Cinéticas de la fracción latente pura utilizando AC como sustrato; (A) a
pH 4.5, (B) a pH 3.5. Con una línea continua se muestra el ajuste por regresión no lineal de
los datos a las ecuaciones 1 y 3 respectivamente, y A1 y B1 muestran los residuales en
función de la concentración de ácido clorogénico. A2 muestra la curva de saturación de la
PPO latente; valores del índice de cooperatividad en función de V/Vmax calculado a partir de
la curva A, de acuerdo a Kurganov (1982).
76
La variación de la Km a diferentes pHs en el medio de reacción se ha mostrado para la

PPO de manzana (Janovitz-Klapp y col., 1989). Estos autores muestran un valor casi
constante de Km entre pH 3.5-5.0 pero su valor incrementa por encima de pH 5.0 en presencia
de tres sustratos diferentes; 4-metil catecol, ácido clorogénico y catequina.
La reactividad sobre ácido cafeico es mucho menor que sobre AC, siendo
estructuralmente idénticos en la parte o-difenólica (ver figura 2.11 y tabla 2.4 capítulo II). A
la vista de la compleja cinética exhibida sobre AC, nos hemos preguntado si la diferente
reactividad sobre cafeico puede estar asociada a una cinética diferente. Llevando un control
riguroso del pH del medio de reacción, el cual se mantuvo entre 4.56-4.59 en las diferentes
reacciones, la cinética mostró una curva típica de inhibición por exceso de sustrato (figura
4.5).
140 15
A 10
A1
120 5
residual
-5
100 -10
-15
-20
v0 (µM/min)
80 0 2 4 6 8 10 12 14
[cafeico](mM)
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
[ cafeico](mM)
Figura 4.5 Cinética de la PPO latente usando PPO latente pura a pH 4.5 usando ácido
cafeico como sustrato (A). Con una línea continua se muestra el ajuste por regresión no lineal
de los datos a la ecuacion 3, y A1 muestra el residual en función de la concentración de ácido
cafeico.
77
Como muestra la tabla 4.1, el análisis de los datos por ajuste a la ecuación 3 indica que
la kcat es muy próxima a la del AC y la Km es bastante más baja. Esto conduciría a una mayor
eficacia catalítica de no ser por el efecto de inhibición por sustrato, así, la máxima velocidad
alcanzada es una cuarta parte respecto de AC al mismo pH.
Parámetros PPO latente PPO latente

cinéticos digerida con tripsina
pH 4.5 pH 3.5 pH 4.5
AC Ácido cafeico AC AC
-1
kcat1 (s ) 10.5 7.72 31.31 55.43
kcat2 (s-1) 9.8 ----- ----- -----
Km1 (mM) 2.4 0.45 1.93 2.45
Km2 (mM) 9.3 ----- ----- -----
n 3.2 1 1 1
m 8.5 ----- ----- -----
Max V (µM/min) 400 110 360 839
([AC] mM) (16) (2) (4) (10)
KI (mM) ----- 8.50 13.58 -----
Tabla 4.1. Parámetros cinéticos de la PPO latente utilizando AC como sustrato a pH

3.5, y a pH 4.5 y usando ácido cafeico como sustrato a pH 4.5. Además se muestra el efecto
de la tripsina en la fracción latente pura a pH 4.5 en presencia de ácido clorogénico.
Este efecto cinético del sustrato que se solapa con el efecto cinético del pH sugiere que
el residuo quinoico del AC interacciona con el enzima de forma singular a pH 4.5 dando lugar
a una respuesta cinética diferente. Dicha interacción no sería posible para el ácido cafeico por
carecer del residuo quinoico o para el AC a pH 3.5, exhibiendo ambos casos el mismo
comportamiento cinético de inhibición por sustrato. La observación de que la PPO latente
pura es mucho menos reactiva sobre sustratos con carga en el grupo R del o-difenol que sobre
los no cargados, medidos a pH 4.5 (ver figura 2.11 capítulo II), concuerda con el
comportamiento cinético diferencial entre AC y ácido cafeico. Estos resultados difieren con
los obtenidos para otras preparaciones de PPO no homogéneas, PPO de taro y patata, que
muestran para ambos sustratos una cinética hiperbólica y que presentan mayor eficiencia
catalítica (expresada como la relación Vmax/Km ) del ácido cafeico con respecto al ácido
clorogénico (Duangmal y col., 1999).
78
Para investigar si la activación con tripsina induce variación en los parámetros

cinéticos, la actividad de la PPO digerida con tripsina se ensayó en presencia de ácido
clorogénico a pH 4.5 hasta 16 mM. La representación de la velocidad frente la concentración
del AC mostró una curva hiperbólica (figura 4.4). Como se muestra en la tabla 4.1, se produce
un incremento significativo de la kcat que es el responsable de una duplicación de la máxima
velocidad alcanzada respecto de la PPO nativa a concentraciones superiores a 10 mM de AC.
A concentraciones más bajas el incremento en actividad es incluso mayor debido a la
transición de cinética doble-sigmoide a hiperbólica. El incremento de la eficacia catalítica de
la enzima en presencia de tripsina se ha mostrado para la fracción soluble de PPO de
remolacha (Gandía-Herrero y col., 2005b). Estos resultados sugieren que la digestión de la
enzima con tripsina afecta a la interacción entre el residuo quinoico del AC y el centro activo,
además de destruir otro tipo de interacciones que regulan la capacidad catalítica del enzima.
Los resultados de este estudio del efecto del sustrato sobre la cinética de la PPO
latente pura ponen de manifiesto que la enzima está sometida a una regulación de su actividad
en la que la naturaleza del sustrato y el pH intervienen directamente.
1000
A
800
v0 (µM/min)
50
600 A1
40
30
residual
20
400 10
0
-10
200 -20
-30
0 2 4 6 8 10 12 14
[AC](mM)
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
[AC](mM)
Figura 4.6. Cinética de la PPO latente digerida con tripsina a pH 4.5 usando ácido
clorogénico como sustrato (A). Con una línea continua se muestra el ajuste por regresión no
lineal de los datos a la ecuación 4, y A1 muestra el residual en función de la concentración de
ácido clorogénico.
79
IV.3.4. Efecto de los detergentes en la actividad PPO
Para estudiar la influencia de la naturaleza química y las propiedades físicas de los

detergentes en la actividad de PPO, hemos ensayado detergentes con diferente longitud de
cadena, diferente grupo de cabeza y con diferente carga (negativa, positiva y neutra). La tabla
4.2 muestra la concentración micelar crítica (cmc) de los detergentes alquil sulfatos y alquil
sulfonatos usados en este estudio. Con respecto a la carga del detergente, sólo los detergentes
aniónicos tienen efecto en la actividad PPO, mientras que detergentes catiónicos (CTAB) y no
iónicos (TX-100) no producen casi efecto (figura 4.7). La activación de la PPO latente pura en
presencia de detergentes aniónicos se ha estudiado usando alquil sulfatos (STS, SDS, SOS) y
alquil sulfonatos (SDSA y SOSA).
El efecto de los detergentes aniónicos depende del pH, concentración de detergente,

longitud de la cadena de carbono y grupo de cabeza. Como se muestra en la figura 4.7 los
detergentes activan la PPO latente a pH 6.0. Por el contrario, como se muestra en la figura
4.8, estos detergentes inhiben a la PPO a pH 4.5. Los alquil sulfatos son más eficientes en la
activación de pH 6.0 e inhibición a pH 4.5 que sus homólogos alquil sulfonatos. Además entre
los detergentes con el mismo grupo de cabeza, existe una excelente correlación entre la
longitud de la cadena y el efecto causado en la PPO. Es decir, cuanto más larga es la cadena,
mayor es la activación máxima de PPO y menor es la concentración del detergente necesario
para activar la PPO. Del mismo modo, cuanto más larga es la cadena, menor concentración de
detergente es necesaria para inhibir la PPO. El STS es el mejor activador de la PPO latente
pura, seguido de SDS y SDSA (81.3% y 75.2% de activación con respecto al STS
respectivamente), siendo efectivos a baja concentración de detergente (figura 4.7). Los
detergentes de ocho carbonos, SOS y SOSA son también capaces de activar a la PPO, pero en
menor grado (23.5% y 14.6% con respecto al STS respectivamente) y a concentraciones
superiores a 30 mM.
Por otra parte, cuando los detergentes aniónicos se ensayan a pH 4.5 (figura 4.8), se
observa un efecto inhibitorio sobre la PPO, siendo el STS el inhibidor más fuerte, con un IC50
de aproximadamente 4 mM, seguido del SDS y SDSA con valores de IC50 de
aproximadamente 15 y 28 mM respectivamente. La actividad de la PPO se inhibe
completamente con 20, 40 y 60 mM de STS, SDS y SDSA respectivamente.
80
detergentes fórmula estructural cmca cmcb cmcc

(mM) (mM) (mM)
aniónicos
tetradecil sulfato de sodio 0.04 0.10-0.20

(TST)
dodecil sulfato de sodio 1.25 3.00 1.50

(SDS)
dodecanosulfonato de sodio 1.25 4.00

(SDSA)
octil sulfato de sodio >100 >100

(SOS)
octanosulfonato de sodio >100 >100

(SOSA)
catiónicos
bromuro de 0.05 ----- -----

cetiltrimetilamonio (CTAB)
no iónicos
triton X-100 (TX-100) 0.10 ----- -----
Tabla 4.2. Concentración micelar crítica (cmc) de detergentes aniónicos, catiónicos y

no iónicos determinados en tampón fosfato pH 6.0 (cmca), tampón acetato pH 4.5 (cmcb) y
tampón acetato pH 5.0 (cmcc). La cmc de cada uno de los detergentes se determina
gráficamente como la intersección de las líneas que definen el incremento de fluorescencia del
difenilhexatrieno en las regiones pre- y post-micelar.
81
Las cadenas más cortas de los detergentes, SOSA y SOS no producen o producen solo
una ligera inhibición a concentraciones muy altas (100 mM).
120
100
máxima actividad (%)
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12
[detergente] (mM)
30
25
máxima actividad (%)
20
15
10
0
0 10 20 30 40 50
[detergente] (mM)
Figura 4.7. Activación de la PPO por detergentes; tetradecil sulfato de sodio

(STS -▲-); dodecil sulfato de sodio (SDS -●-); octil sulfato de sodio (SOS -■-); dodecano
sulfonato de sodio (SDSA -○-); octano sulfonato de sodio (SOSA -□-); Triton X-100 (TX-100
-◊-) y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB -+-). El medio de reacción a 24ºC incluye 20 µl
de la enzima y 5 mM de TBC en 50 mM tampón fosfato pH 6.0.
82
120
100
actividad residual (%)
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100 120
[detergente](mM)
Figura 4.8. Inhibición de la PPO por detergentes aniónicos; tetradecil sulfato de sodio
(STS -▲-); dodecil sulfato de sodio (SDS -●-); octil sulfato de sodio (SOS -■-); dodecano
sulfonato de sodio (SDSA -○-) y octano sulfonato de sodio (SOSA -□-). El medio de reacción
a 24ºC incluye 20 µl de la enzima y 5 mM de TBC en 50 mM de tampón acetato pH 4.5
En todos los casos, la activación de la PPO ocurre por debajo de la cmc mientras la
inhibición ocurre a concentraciones muy por encima de la cmc. Este resultado sugiere que la
PPO latente interacciona con los monómeros de detergentes aniónicos, dando lugar a
activación a pH ligeramente ácido o neutro, pero también interacciona con las micelas de
detergentes aniónicos, dando lugar a inhibición a pH ácido. Además la PPO latente, podría
interaccionar con las micelas de detergentes aniónicos, de este modo, puede sufrir una fuerte
inhibición a pH ácido, pero no activación a pH ligeramente ácido o neutro. Como se ha
demostrado en la sección anterior, la activación e inhibición es consecuencia de un
desplazamiento en el perfil de pH por SDS, por ello los otros detergentes aniónicos usados
podrían causar desplazamientos similares del perfil de pH, aunque con diferencias
cuantitativas.
83
IV.3.5 Efecto de los detergentes sobre el tamaño aparente de la PPO latente
Con el fin de determinar el efecto de los detergentes en el tamaño aparente de la PPO

latente como medio para analizar la interacción física de la PPO latente pura con los
detergentes, se hicieron carreras cromatográficos en presencia de detergentes. La figura 4.9
muestra nueve pases cromatográficos en ausencia de detergente (A, H) y en presencia de
diferentes detergentes; detergente aniónico SDS a 2 mM (B, I) y 10 mM (C); detergente
catiónico CTAB a 1 mM (D) y 10 mM (E) y detergente no iónico Triton X-100 a 1 mM (F) y
10 mM (G). Dos valores de pH se ensayaron; pH 5.0 (H, I) y pH 7.0 (A, B, C, D, E, F, y G).
Como se describió anteriormente la fracción latente pura de peso molecular de 60 kDa
aproximadamente determinada por filtración en gel eluye como un solo pico a pH 7.0 (figura
4.9A) o a pH 5.0 (figura 4.9H) y con el mismo volumen de elución. La posición de elución de
la PPO latente a pH 7.0, no se desplaza en presencia de Triton X-100 para ninguna de las
concentraciones 1 y 10 mM, lo que indica que el tamaño aparente de la PPO latente no se
modifica por este detergente y consecuentemente no tiene lugar una interacción entre la PPO
latente y el Triton X-100. La PPO latente también eluye como un sólo pico en presencia de
CTAB a pH 7.0 para ambas concentraciones de detergente. A 1 mM de CTAB la enzima se
eluye en el mismo volumen que en ausencia de detergente. Sin embargo, a concentración de
10 mM de CTAB (figura 4.9E), el pico de PPO se ensancha hacia volúmenes de elución más
pequeños que indican un rango continuo de tamaños aparentes de la PPO, que puede ser
interpretado como una interacción débil entre la proteína y las micelas del detergente,
probablemente debido a efectos electrostáticos. Finalmente, en presencia de SDS a pH 7.0 a
ambas concentraciones, 2 mM (figura 4.9B) y 10 mM (figura 4.9C) el cromatograma muestra
dos picos muy bien definidos de actividad PPO. Un pico eluye con el mismo volumen que en
ausencia de detergente y otro pico que sale a volúmenes de elución menores. La proporción
de PPO entre ambos picos depende de la concentración de detergente, incrementando de 20 a
80% de la cantidad de PPO introducida en el pico obtenido en volúmenes de elución menores
al mismo tiempo que para la enzima eluida a volúmenes mayores, el pico decrece de un 80 a
un 20%. Teniendo en cuenta que la cmc del SDS es de 1.25 mM a pH 6.0 y probablemente
menor a pH 7.0, este resultado puede interpretarse como una distribución de PPO entre las
micelas de SDS y el medio acuoso. La unión de PPO a las micelas parece ser bastante
específica debido a la formación de micelas mixtas de detergente y proteína con una
composición definida. El peso molecular aparente del pico eluido a volúmenes menores es
84
104.4 kDa y la diferencia en tamaño respecto de la proteína desnuda es 43.2 kDa, lo que
corresponde a aproximadamente 150 moléculas de SDS. Como se observa en la figura 4.9, la
posición de elución de la PPO latente a pH 5.0 también se desplaza hacia pesos moleculares
mayores, pero no se observa un pico de actividad en la posición de elución de la proteína
control. De acuerdo a la posición del pico, la composición de la micela mixta PPO-SDS es
prácticamente la misma que observamos a pH 7.0. Estos resultados sugieren que el perfil de
interacción PPO-SDS es similar al observado a pH 7.0 pero cuantitativamente más fuerte;
debido a que prácticamente toda la enzima se encuentra formando parte de la micela mixta a
bajas concentraciones de SDS pero por encima de la cmc del detergente a pH 5.0 (ver tabla
4.2).
La figura 4.10 muestra tres pasos adicionales de cromatografía para investigar el

tamaño aparente de la PPO latente digerida con tripsina. Como se muestra en la figura 4.10A
el tratamiento con tripsina muestra la aparición de un hombro en el pico de PPO a volúmenes
altos de elución, que puede ser indicativo de la presencia de dos especies moleculares, una
con el mismo tamaño que la PPO latente pura sin digerir y otra con menor tamaño. Esto puede
ser interpretado como que sólo se ha cortado una fracción de PPO, lo cual es bastante
improbable ya que ensayos previos demostraron que la activación completa de la PPO se
alcanzaba después de 5 minutos de incubación, o que las cadenas resultantes del corte con
tripsina permanecen fuertemente unidas y su paso por la columna causa la separación de una
fracción de PPO digerida. Como se muestra en la figura 4.10B, cuando el paso cromatográfico
se lleva a cabo en presencia de 2 mM de SDS, el hombro desaparece y sólo se observa un pico
de actividad que presenta el mismo tamaño que la PPO no tratada con tripsina. Como se
observa en la figura 4.10C se observa un resultado similar para una concentración de 10 mM
de SDS. Este resultado indica que el detergente no impide la interacción entre las cadenas
cortadas, más bien la refuerza, y que el tratamiento con tripsina elimina la interacción de la
PPO latente con las micelas una vez cortada.
85
35 35
A
H
30 Figura 4.9. Filtración en gel analítica de la PPO latente en 30
25
ausencia (A, H) y presencia de diferentes detergentes; 25
aniónico como dodecil sulfato de sodio (SDS 2 mM; (B, I) y
v0(µM/min)
v0(µM/min)
20 20
SDS 10 mM (C)); catiónico como bromuro de
15 15
cetiltrilmetilamonio (CTAB 1 mM (D) y CTAB 10 mM (E)) y
10
no iónico como Triton X-100 (TX-100 1 mM (F) y TX-100 10
5 10 mM (G)). La PPO purificada se eluye usando tampón 5
0 fosfato pH 7.0 (A, B, C, D, E, F, G) y acetato pH 5.0 (H, I) 0

0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
volumen (mL)
volumen (mL)
30 50 35
40
B D F I
30
25
40
30 25
20
v0 (µM/min)
v0(µM/min)
v0(µM/min)
30
v0(µM/min)
20
20 15
15
20
10
10
10
10
5 5
0 0 0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
volumen (mL) volumen (mL) volumen (mL) volumen (mL)
40 25 60
C E G
50
20
30
40
v0(µM/min)
v0(µM/min)
v0(µM/min)
15
20 30
10
20
10
5
10
0 0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
volumen (mL) volumen (mL) volumen (mL)
86
70
A
60
50
v0(µM/min)
40
30
20
10
40
B
30
v0(µM/min)
20
10
40
C
30
v0(µM/min)
20
10
0 20 40 60 80 100 120 140

volumen elución (mL)
Figura 4.10. Filtración en gel analítica de la PPO pura tripsinizada en ausencia (A) y
presencia de 2 mM de SDS (B) y 10 mM de SDS (C). La medida de actividad se realiza a pH
4.5 en ausencia de detergente (A) y a pH 6.0 en presencia de detergente (B y C).
87
IV.3.6. Efecto de los ácidos grasos
Teniendo en cuenta la inestabilidad del sustrato natural de frutos de níspero, AC, a

pHs superiores a 5.0, no tiene sentido estudiar el efecto de los ácidos grasos a pH 6.0 o
superior de pH 6.0 usando el sustrato estable TBC. De esta forma, el efecto sobre la PPO
latente de diferentes ácidos grasos libres se ha estudiado a pH 4.5. Como se muestra en la
figura 4.11, la presencia de ácidos grasos libres en el medio de reacción causa una inhibición
de la PPO comparados con los blancos, los cuales contienen la misma concentración de etanol
usado para solubilizar los ácidos grasos.
Los ácidos grados evaluados tienen 18 carbonos y al menos una instauración en la
posición cis debido a que los ácidos saturados, incluso los de cadena más corta, no pudieron
ser dispersados en el medio de reacción a menos que se calentaran. Como en el caso de los
detergentes alquil sulfatos y sulfonatos, ha sido necesaria una alta concentración de anfifilo
para producir una inhibición significativa. Los ácidos grasos mono- y diinsaturados, oleico
(∆9) y linoleico (∆9,12) respectivamente, causan sólo una inhibición moderada incluso a altas
concentraciones, como 80 mM. En cambio, el ácido graso triinsaturado linolénico (∆9,12,15)
muestra una inhibición moderada (55-60%) a 20 mM y una fuerte inhibición (80-95% para
una concentración igual o superior a 40 mM. Sin embargo, el ácido γ-linolénico (∆6,9,12), tiene
prácticamente el mismo efecto que el ácido linoleico, esto sugiere la relevancia de la
insaturación del C15 en la inhibición de la PPO por ácidos grasos. La inhibición es similar
para ambos sustratos AC y TBC, aunque cuantitativamente la inhibición es más fuerte cuando
se utiliza el sustrato natural AC.
88
120
A
100
Actividad residual (%)

80
60
40
20
0
0 20 40 60 80
[ácido graso] (mM)

120
B
100
Actividad residual (%)
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80
[ácido graso](mM)
Figura 4.11. Inhibición de la PPO latente de frutos de níspero por varios ácidos grasos
insaturados usando CA (A) y TBC (B) como sustrato; ácido oleico ( ), ácido linoleico (
), ácido α-linolénico ( ) y ácido γ-linolénico ( ). La PPO digerida con tripsina
sólo se ensaya con ácido α-linolénico ( ) El porcentaje de inhibición (% inhibición) para
cada ácido graso se determina como la pendiente de la gráfica de actividad en función del
tiempo para cada concentración de ácido graso / la pendiente de etanol. La actividad residual
(%) se determina como el 100- % inhibición.
89
Discusión Regulación de la actividad de la polifenol oxidasa latente
IV.4. DISCUSIÓN
. La activación con SDS a pH mayor de 5 es un fenómeno mostrado anteriormente en

preparaciones crudas de polifenol oxidasas de plantas (Kenten, 1958), que se confirmó
posteriormente en preparaciones altamente purificadas de hojas de haba (Moore y Flurkey,
1990) y en bayas de uva (Rathjen y Robinson, 1992). El uso de una preparación de PPO
parcialmente purificada de manzana (Marques y col., 1995) mostró que el SDS modifica el
comportamiento de la enzima respecto del pH en lugar de causar una activación general y
además, especularon sobre la existencia de un dominio regulador de la proteína sensible a
SDS y proteasas. Jiménez y García-Carmona (1996) propusieron un equilibrio rápido entre la
PPO de hojas de haba y el complejo SDSn-PPO y determinaron una constante de disociación
de 0.52 mM, donde la unión de sólo una molécula de SDS al enzima era suficiente para
explicar la activación. Además, describieron un desplazamiento del perfil de pH en presencia
de SDS que se interpretó en base a que el SDS induce un cambio en el pK de los grupos
catalíticos. Además, cambios observados en la fluorescencia intrínseca de PPO de las hojas de
haba en presencia de SDS se interpretaron como cambios conformacionales relacionados con
la activación (Moore y Flurkey, 1990). Nuestro estudio sobre el efecto del SDS en el perfil de
pH y la fluorescencia intrínseca en la PPO latente pura de frutos de níspero, confirma las
observaciones anteriores y nos permite exponer una hipótesis sobre la regulación de la
actividad de PPO basada en la unión de un anfífilo aniónico que induce un cambio
conformacional de la proteína que lleva a un desplazamiento del perfil de pH. El
desplazamiento del perfil de pH en presencia de SDS se observa para ambos sustratos, TBC y
AC, fortaleciendo la hipótesis del efecto del detergente sobre el pK de la enzima. Por el
contrario, Gandía-Herrero y col., (2005a) describieron efectos de sustrato sobre la activación
de PPO por SDS, empleando preparaciones parcialmente puras de PPO de remolacha solubles
y de membrana. En estas preparaciones parcialmente puras de PPO, no se puede descartar la
presencia de isoenzimas o productos postrasduccionales de PPO ya que es muy probable, la
existencia de diferentes productos génicos de PPO (probablemente con diferentes propiedades
enzimáticas en el mismo tejido) (Kim y col., 2001; Thypiapong y col., 1997). Por esta razón,
los efectos de sustrato podrían reflejar la presencia de diferentes formas de PPO con diferente
especificidad de sustrato en vez de una activación diferencial de la PPO dependiente de la
naturaleza de sustrato explicada en base a un sofisticado mecanismo de cooperatividad
cinética (Gandía-herrero y col., 2005a).
90
En base a los resultados obtenidos se observa una interacción PPO-SDS por los
cambios inducidos en la fluorescencia intrínseca de la proteína. Tanto los cambios en la
fluorescencia intrínseca de la proteína como el incremento de actividad ocurren en el mismo
rango de concentración de SDS, lo que proporciona una evidencia de que la activación
inducida por SDS se debe a un cambio conformacional de la proteína producido por SDS. En
este sentido, el incremento en la intensidad de fluorescencia hasta una concentración de 1.75
mM de SDS se ha interpretado como un cambio conformacional durante la unión inicial y una
activación de la PPO de haba (Moore y Flurkey, 1990). Por otra parte, el patrón complejo del
máximo de emisión en función de la concentración de SDS puede ser interpretado como un
reflejo de la interacción de SDS con PPO y del estado de agregación antes y después de la
cmc. La tendencia del máximo de emisión indica un incremento en la hidrofobicidad de los
residuos excitados, principalmente Tyr. En el primera fase, esta tendencia es consistente con
la incorporación de los monómeros de SDS en la proteína que podrían incrementar localmente
la hidrofobicidad de los alrededores de varias Tyr/Trp, mientras que en la segunda fase,
cuando se forman agregados de SDS, la tendencia es consistente con la incorporación de la
proteína al ambiente hidrofóbico de las micelas de SDS, formando micelas mixtas proteína-
detergente. Estudios anteriores de fluorescencia (Moore y Flurkey, 1990) no mostraron
cambios en la fluorescencia a concentraciones de SDS por encima de la cmc.
El efecto de otros anfífilos en la actividad de PPO a pH 6.0, realzan la importancia de

la carga negativa en el grupo de cabeza, sin importar que sea sulfato o sulfonato y de la
longitud de la cadena para que tenga lugar la activación. De este modo, con respecto a la
topología del sitio hipotético de la unión de SDS, se podría especular que debería contener
una carga positiva al final del hueco hidrofóbico en el cual se podrían acomodar al menos 14
carbonos. Hasta el momento sólo se ha resuelto la estructura tridimensional de la catecol
oxidasa de boniato (Klabunde y col., 1998). Desafortunadamente la forma purificada y
cristalizada carece de la extensión del dominio C-terminal en la secuencia de cDNA que
podría hospedar el sitio de unión para activadores como el SDS (Genderman y col., 2002).
Para poder elucidar el mecanismo de la regulación de la actividad de PPO, es necesario
resolver la estructura tridimensional de la PPO madura completa.
El espectacular efecto del SDS como activador a pHs altos quizás tiene eclipsado su
efecto inhibitorio a bajo pH (Marquès y col., 1995). De acuerdo con los valores del pH ácido
del jugo, la inhibición de PPO podría ser más relevante desde el punto fisiológico que la
91
activación. Los experimentos de inhibición con detergentes aniónicos muestran una

correlación directa entre sus propiedades como activadores e inhibidores, indicando así un
efecto similar al desplazamiento producido por SDS, aunque la concentración necesaria para
la inhibición es siempre mayor que para la activación. Una característica interesante es que la
activación empieza a concentraciones por debajo de la cmc y se nivela cuando el detergente se
agrega mientras que la inhibición a concentraciones sub-cmc es débil, incrementándose
cuando la concentración del detergente agregado aumenta. Por esta razón, la activación de
PPO a pH ácido alto (pH 5.0-6.0) y la inhibición a pH ácido bajo (pH 3-4.5) están vinculadas
a diferentes estados de agregación; monómero y micela respectivamente. Los experimentos
posteriores de filtración en gel demostraron la incorporación de PPO a las micelas de
detergente, los cuales resultaron en micelas mixtas formadas por una proteína y
aproximadamente 150 moléculas de SDS. Trabajos anteriores han explorado los efectos del
SDS en el peso molecular aparente de la PPO por cromatografía de exclusión molecular. Para
la PPO de haba, monómero de peso estimado de 43 kDa, el efecto del SDS produjo un ligero
incremento de 5 kDa (Moore y Flurkey, 1990). Estos cambios se interpretaron como la unión
de unas pocas moléculas de SDS a la proteína o como un hinchamiento de la proteína
inducida por SDS. Recientemente, para la PPO de judía, tetrámero de 120 kDa, se ha descrito
un acortamiento similar en el tiempo de retención de la PPO activada por SDS y este
resultado se ha interpretado como un hinchamiento de la proteína o un desplegamiento parcial
puesto que un acortamiento similar del tiempo de retención se observó para la PPO activada
por choque ácido. (Kanade y col., 2006). El hecho de que nosotros observemos dos picos bien
resueltos, facilita la interpretación del resultado como un equilibrio entre la PPO libre y la
micela mixta PPO-SDS, que se desplaza a la formación de micela mixta cuando el pH baja.
Esta interpretación abre la posibilidad de que in vivo la PPO se una a membranas cargadas
negativamente de modo que la mantienen en un estado inactivo a pH ácido bajo. De hecho, la
enzima se localiza en los tilacoides y es necesaria la utilización de detergentes para una
óptima extracción de la proteína de las membrana (Sánchez-Ferrer, 1989).
El tratamiento con tripsina induce cambios en el perfil de pH que afectan

principalmente a la zona básica, pero no se observan desplazamientos en el perfil. Así, el
papel de la tripsina, o el de una proteasa endógena que actuara de la misma forma, sólo serían
significativos a un pH bastante alto. A un pH ácido bajo, ambas PPOs, completa y cortada
proteolíticamente con tripsina, podrían estar en óptimas condiciones para oxidar los
92
polifenoles de los frutos. Por el contrario, el efecto de SDS, o una molécula endógena
análoga, causarían una inhibición de la enzima en ambos casos. Para la PPO de remolacha
(Gandía-Herrero y col., 2005b) y de manzana, (Marques y col., 1995) el perfil de pH de PPO
no se afecta por SDS una vez que la enzima se ha tratado con tripsina o proteinasa K
respectivamente, pero como se muestra en la figura 4.10, el tratamiento con tripsina no
desensibiliza el tratamiento de SDS para la PPO de frutos de níspero. Estas evidencias
contradictorias podrían ser explicadas a través de la hipótesis de que una molécula de SDS en
el sitio de unión puede regular la actividad de la enzima por medio de un desplazamiento en el
perfil de pH. Este sitio de unión se podría haber eliminado por la tripsina para la PPO de
remolacha o por proteinasa K para la PPO de manzana, pero permanece todavía intacto en el
caso de la PPO digerida con tripsina para los frutos de níspero. El comportamiento de la PPO
digerida con tripsina en los experimentos de filtración en gel en presencia de SDS sugiere que
la proteolisis en presencia de tripsina interfiere en la habilidad de la PPO de unirse a las
micelas de SDS y supuestamente a las membranas cargadas negativamente. No se han llevado
a cabo experimentos similares con otras PPOs pero el comportamiento diferente con la
tripsina nos puede proporcionar una información valiosa. De este modo, el uso de la tripsina
podría ser un instrumento para elucidar la regulación de la actividad PPO, considerando que
su efecto en las propiedades de la PPO sería dependiente del sitio de corte para cada PPO en
particular.
Los resultados mostrados arrojan la primera evidencia de que los ácidos grasos
insaturados de 18 carbonos son inhibidores de la PPO de frutos de níspero a pH ácidos bajos,
con especial énfasis en el ácido linolénico triinsaturado frente a los ácidos grasos oleico y
linoleico. La presencia del tercer doble enlace en la posición 15 es esencial para aumentar la
capacidad de inhibición, ya que la localización de este doble enlace en la posición 6 para el
ácido graso γ-linolénico mantiene la capacidad de inhibición a los mismos niveles o inclusive
algo menores que los del ácido oleico. Debido a que el efecto del ácido graso sobre la PPO a
pH ácido es cuantitativamente comparable con el SDS u otros detergentes aniónicos, sería
razonable extrapolar ambos efectos para estos nuevos inhibidores; el mecanismo de
desplazamiento del perfil de pH y la hipótesis de la unión de una molécula de SDS en el sitio
de unión. El efecto diferencial de los ácidos grasos insaturados ofrece nuevas pistas
concernientes a los requerimientos del sitio de unión hipotético, es decir se podría acomodar
una cadena de 18 carbonos de longitud que presentara una forma curvada del hueco, impuesta
93
por el triple doble enlace cis. Golbeck y Cammarata (1981) mostraron activación a pH 7.0 de
una preparación cruda de hojas de haba con el ácido linolénico pero también en presencia de
otros ácidos grasos a niveles similares que incluían 1, 2 o 4 insaturaciones. Estos datos
apoyan que los ácidos grasos se inducen por un desplazamiento de pH y que su relevancia
fisiológica está relacionada con el pH local del fruto. En el caso del fruto de níspero, el efecto
específico del ácido linolénico frente a otros ácidos grasos, podría tener también una
relevancia como inhibidor de acuerdo al pH del fruto. No obstante, la alta concentración
requerida del ácido linolénico para una inhibición fuerte de la PPO compromete su papel
como regulador fisiológico de la actividad de PPO en el fruto. Sin embargo, no podemos
excluir a éste ácido graso como parte de un potente inhibidor que contiene un grupo aniónico
voluminoso como grupo de cabeza.
94
Capítulo V.
Identificación molecular de las
polifenol oxidasas de fruto de níspero
mediante cromatografía líquida
acoplada a espectrometría de masas
Introducción Identificación molecular de PPOs de frutos de níspero mediante LC-MS/MS
V.1 INTRODUCCIÓN
Para diversas especies de plantas que incluyen tomate (Newman y col., 1993), patata
(Thygesen y col., 1995), plátano (Gooding y col., 2001), un híbrido de álamo (Wang y
Constabel, 2004) y algunas Rosáceas (Haruta y col., 1999) se ha descrito la organización de
genes de PPO en familias multigénicas que codifican polipéptidos diferentes. Además, Kim y
col. (2001) y Thipyapong y col. (1997) han descrito la expresión de dos o más genes en el
mismo estadio de desarrollo y, utilizando un anticuerpo anti-PPO de manzana, Haruta y col.
(1999) han descrito la presencia de varias bandas de proteína entre peso molecular de 55 a 65
kDa de frutos y hojas de la familia de las Rosáceas, incluyendo manzana, pera, membrillo,
melocotón, caqui y níspero. Por lo tanto, hay bases genéticas y evidencias experimentales que
apoyan la existencia de diferentes isoformas de PPO en el mismo tejido en el mismo estadio
de desarrollo, aunque no hay datos sobre el origen mono- o multigénico de dichas isoformas.
Solo la información específica de isoformas (es decir, secuencias) aclararía de forma
incontestable este punto.
La diferenciación del origen génico de isoformas de proteínas es una tarea que, siendo
difícil, proporciona una información única y valiosa para los estudios fisiológicos. La
dificultad aumenta cuando se quiere diferenciar entre isoformas en el mismo tejido y las
proteínas pertenecen a familias multigénicas (Delalande y col., 2005). Los miembros de
familias multigénicas se definen como genes parálogos y son el resultado de duplicaciones
múltiples de genes seguidas de sucesos moleculares como supresiones, inserciones y
mutaciones puntuales. No todos los genes parálogos de una familia multigénica están
presentes en las bases de datos públicas de proteínas como Uni Prot Knowledgebase o
NCBInr. De este modo, las búsquedas clásicas de proteínas con datos de MS o MS/MS
conducen principalmente a la identificación de una función más que de una proteína en sí, ya
que difícilmente se podrá discriminar entre genes parálogos expresados específicamente si esa
información no esta en la base de datos. Para resolver este problema se puede optar entre
varias aproximaciones experimentales. El uso de anticuerpos específicos de isoformas
depende del conocimiento previo de las secuencias específicas de proteína para seleccionar
las regiones antigénicas específicas y requiere la validación del anticuerpo después de
producirlo. La secuenciación amino terminal es una técnica alternativa más económica, pero
requiere muestras de proteínas muy puras que habitualmente no pueden ser preparadas por
SDS-PAGE de los extractos crudos. La aplicación de la cromatografía liquida acoplada a
95
Introducción Identificación molecular de PPOs de frutos de níspero mediante LC-MS/MS
MS/MS en el marco de un flujo proteómico (separación electroforética 1D o 2D, digestión

tríptica, análisis de masas y búsqueda en bases de datos) proporciona una cantidad elevada de
secuencias de péptidos procedentes de mezclas de proteínas que después de un adecuado
ensamblaje (Nesvizhskii y Aebersold, 2005) puede permitir la identificación de proteínas
presentes en una mezcla incluso a nivel de parálogos. La identificación de genes parálogos
requiere alta resolución de la cromatografía líquida y alta sensibilidad en los datos de MS o
MS/MS para poder tener una amplia cobertura de secuencia que incluya péptidos
discriminantes, especialmente cuando varias proteínas codificadas por genes parálogos
diferentes se co-expresan y extraen de la misma banda del gel (Delalande y col., 2005). Así
pues, la información obtenida por LC-MS/MS es tan específica de proteínas que los datos de
MS de la proteína TMV se han usado para diferenciar diferentes estirpes de virus del mosaico
del tomate (Casado-Vela y col., 2006), es decir, variantes alélicas, o isoformas de fenil alanina
amonio liasa, chaperonina mitocondrial y fructosa bifosfato aldolasa (Delalande y col., 2005).
Cuando se conoce el genoma completo o cuando es una especie muy representada en las bases
de datos, la probabilidad de identificación de genes parálogos es muy alta. Sin embargo, el
níspero (Eriobotrya japonica) es una especie muy poco representada en las bases de datos
públicas, por lo que el uso de espectros de MS/MS para búsqueda en bases de datos es una
estrategia poco fructífera. En cambio, el uso de secuencias de péptidos, deducidas de la
interpretación por secuenciación de novo de los espectros de MS/MS para interrogar las bases
de datos, permite la identificación de proteínas basadas en homología, aumentando, de esta
forma, el grado de validación de los datos espectrales e incrementando notablemente la
cobertura de secuencias.
En este capítulo hemos usado la combinación de western-blot y análisis LC-MS/MS

que, junto con la secuenciación del amino terminal, nos han permitido determinar la presencia
de diferentes productos génicos de PPO en el fruto de níspero a nivel de proteína. Los
resultados se discuten por su relevancia fisiológica y su implicación filogenética.
96
Materiales y métodos Identificación molecular de PPOs de frutos de níspero mediante LC-MS/MS
V.2 MATERIALES Y MÉTODOS
V.2.1 Preparación de los extractos proteicos
Los extractos enzimáticos de PPO soluble (S), particulada (P), y latente purificada
(LP) se prepararon a partir de frutos en el momento óptimo de la recolección como se
describe en el capítulo II (figura 2.1. Protocolo de extracción enzimática de frutos de níspero).
En la figura 5.1 se presenta un esquema que resume las diferentes etapas para la extracción de
proteínas de las diferentes fracciones mediante la aplicación secuencial de las técnicas de
Granier y Van del Walle (1988) y Wang y col. (2003). Las muestras así preparadas se separan
por SDS-PAGE de acuerdo con el protocolo descrito por Laemmli (1970). Para algunas
fracciones se realizaron dos geles de poliacrilamida al 12.5%, a partir de los cuales se
visualizaron en uno de ellos las proteínas totales con Coomassie coloidal y, con el otro se
realizó un western-blot utilizando antisuero anti-PPO.
Extractos enzimáticos: PPO soluble (S)

PPO particulada (P) y PPO latente purificada (LP)
Precipitación con TCA/DXC y

lavado con acetona 80% Electroforesis y tinción
(Protocolo adaptado de Granier con Coomassie coloidal
y Van del Walle, 1988)
Lavado con acetato de etilo/etanol (1/2)

Lavado TCA 10% acetona
Lavado TCA 10% agua
Lavado Acetona 80%
Extracción y precipitación con

fenol/acetato amónico /metanol
(Protocolo adaptado Wang y col., 2003)
Electroforesis y Acetona 80% Electroforesis y tinción

western- blot con Coomassie coloidal
Figura 5.1. Esquema de la precipitación de proteínas para las tres fracciones (soluble
(S), particulada (P) y latente purificada (LP).
97
Las técnicas de precipitación de proteínas, la producción del antisuero anti-PPO y todo

el proceso de western-blot se detalla en el capitulo VI.
V.2.2 Separación y detección de péptidos con nanoflujo LC-MS/MS

V.2.2.1 Digestión tríptica de proteínas en gel.
Las proteínas recuperadas de los geles de acrilamida son digeridas de forma

automática mediante el empleo de proteasas, generalmente tripsina, con el equipo de digestión
ProGest (Genomic solutions, Cambridgeshire, UK) de acuerdo a las recomendaciones del
fabricante para muestras teñidas con Coomassie coloidal. Así, las bandas de gel se lavaron
con 25 mM de bicarbonato de amonio y agua para eliminar las impurezas del colorante y del
detergente SDS, antes de su reducción con DTT 10 mM y alquilación con yodoacetamida 100
mM en 50 mM de bicarbonato amónico. A continuación, estas bandas se digieren con tripsina
porcina modificada (Promega, Madison WI) a una concentración final de 0.15 µg en 25 mM
bicarbonato amónico durante 6-7 horas a 37ºC (Shevchenko y col., 1996). Finalmente los
péptidos resultantes de la digestión de proteínas se extraen con bicarbonato de amonio,
después se tratan con 70% de acetonitrilo (ACN) y finalmente con 1% de ácido fórmico. Los
péptidos extraídos se secan en una centrífuga de mesa a vacío y a continuación, se
resuspenden en 0.1% de ácido fórmico (10 µl). A partir de estos péptidos se procede al
análisis LC-MS/MS.
V.2.2.2 Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
Los análisis de LC-MS/MS se realizan usando un sistema de Agilent 1100 series

nano-HPLC en línea con un espectrómetro de trampa de iones XCT plus (Agilent) equipado
con una fuente nano-ESI. Después de desalar y concentrar la muestra en una columna de
enriquecimiento Zorbax 300SB-C18 (0.3 x 5 mm, 5 µm), la separación de los péptidos se
realiza en una columna de fase reversa Zorbax 300SB-C18 (75 mm ID x 15 cm, 3.5 µm)
usando un gradiente lineal de 5-40% ACN νs 0.1% (v/v) de ácido fórmico. Los espectros de
masas se adquieren en modo standard (26000 m/z por segundo), y los espectros MS/MS en
modo ultrascan (8100 m/z por segundo).
V.2.3. Identificación de péptidos y proteínas
Una vez obtenidos los espectros de masas se utiliza el programa informático Spectrum
Mill Proteomics Workbench para poder identificar las proteínas de nuestro interés. En la
98
figura 5.2 se muestra un esquema donde se resume todo el proceso de separación y detección
de péptidos con nanoflujo LC-MS/MS e identificación de las proteínas basadas en los
espectros de MS/MS y secuenciación de novo.
Separación de péptidos Digestión

mediante RP-HPLC con tripsina Gel 1D Extracto PPO
Péptidos Proteínas
MS validados validadas
Extracción de Búsquedas de
MS/MS los espectros MS/MS contra
procesados base de datos Blast P contra
bases de datos
Espectros sin
validar Espectros interpretados
Selección Secuenciación
espectros buenos de novo
Figura 5.2. Esquema completo de la separación y detección de péptidos con nanoflujo

LC-MS/MS e identificación de péptidos y proteínas basadas en los espectros de MS/MS y
secuenciación de novo con el programa informático Spectrum Mill.
V.2.3.1 Identificaciones basadas en los espectros MS/MS
Con la herramienta de extracción de Spectrum Mill Proteomics Workbench se

combinan los conjuntos de espectros MS/MS (~ 1200 espectros/carrera) que tienen el mismo
precursor para generar espectros de mayor calidad. La combinación de espectros se realiza
considerando los espectros donde la diferencia en m/z sea inferior a 1.4 y la diferencia en el
tiempo de elución sea inferior a 15 segundos. Cada uno de estos espectros, se busca en la
bases de datos de NCBInr en modo identidad utilizando la herramienta de búsqueda MS/MS
del Spectrum Mill y utilizando las siguientes condiciones: digestión con tripsina, se permiten
2 fallos como máximo en el corte con tripsina, modificación fija de carbamidometilación en
cisteina, masas monoisotópicas y una tolerancia de masa del precursor inferior a 2.5 Da. A
99
continuación los péptidos obtenidos se validan primero en modo proteína donde el score de la
proteína debe ser superior a 20 y después en modo péptido de acuerdo a las reglas que se
muestran en la tabla 5.1:
Validación en modo proteína Validación en modo péptido

Carga Carga
Regla Score SPI(%) Regla Score SPI(%)
precursor precursor
1 2 6 60 1 2 11 60
2 1 6 70 2 1 13 70
3 3 8 70 3 3 13 70
4 4 8 70 4 4 13 70
5 2 6 90 ----- ----- ----- -----
Tabla 5.1 Validación en modo proteína y modo péptido.
El score en MS/MS se calcula a partir de la suma de cada una de las masas

interpretadas del espectro experimental respecto del espectro teórico obtenido de las bases de
datos. El SPI (%) representa el porcentaje de intensidad del espectro interpretado. Por lo tanto,
una buena interpretación del espectro viene determinada por un score > 13 y SPI > 70%
(espectro muy bueno) o score > 10 y SPI > 70% (bueno). Los espectros de calidad media
pueden ser validados en modo proteína si esta acumula un score superior a 20.
V.2.3.2 Identificaciones basadas en la secuenciación de novo
La lista de espectros restantes con score medio o bajo no validados o no interpretados

por MS/MS, son inspeccionados visualmente y de ellos, los de alta calidad se someten a
secuenciación de novo mediante el uso de la herramienta del Spectrum Mill que usa el
algoritmo de la secuenciación de novo de Sherenga (Dancik y col., 1999). A las secuencias
interpretadas por Sherenga se les realiza un BlastP buscando frente a la base de datos NCBInr.
A continuación, se consideran las listas de péptidos que contengan hasta 4 sustituciones en la
secuencia buscada, siempre que con el mayor número de sustituciones la búsqueda sólo nos
proporcione nuestra proteína de interés. Las secuencias que coinciden con entradas
previamente identificadas por MS/MS se adicionan al conjunto de péptidos interpretados por
MS/MS incrementando de este modo la cobertura de la secuencia de una proteína ya
identificada.
100
V.2.4 Construcción de árboles filogenéticos
La construcción del árbol filogenético se realizó en colaboración con el Dr. Ignacio

Luque mediante el siguiente procedimiento: las secuencias de cada polifenol oxidasa se
alinearon con el programa CLUSTALX, versión 1.83 (Thompson y col., 1994). Las regiones
alineadas de forma ambigua fueron eliminadas utilizando el programa GBLOCKS
(Castresana, 2000). Para cada grupo de secuencias se construyó una matriz de distancias
utilizando el programa TREE-PUZZLE versión 5.2 (Schmidt y col., 2002), o el programa
PROTDIST del paquete PHYLIP, versión 3.6 (Felsenstein, 1989), o el programa PHYML
versión 2.4.4. (Guindon y Gascuel, 2003). En todos los casos el análisis se realizó por
duplicado utilizando matrices JTT y WAG. Los árboles se construyeron con los programas
TREE-PUZZLE o PHYML. Con el programa TREE-PUZZLE, se usaron los siguientes
parámetros: 1000 puzzling quartets, la matriz JTT o WAG y velocidad constante en todos los
sitios. Con el programa PHYML, los parámetros que se usaron fueron los siguientes: 1000
réplicas de bootstrap, la matriz JTT o WAG y la proporción de sitios invariables estimada de
la muestra. Los árboles obtenidos se visualizaron con el programa TREEVIEW (Page, 1996).
101
Resultados Identificación molecular de PPOs de frutos de níspero mediante LC-MS/MS
V.3 RESULTADOS
V.3.1 Determinación de la diversidad de PPO en frutos de níspero.
En un capítulo anterior hemos mostrado la purificación a homogeneidad de una PPO

latente de la fracción particulada de frutos de níspero y hemos demostrado que esta PPO es un
monómero de 59.2 kDa. La figura 5.3A muestra el análisis de SDS-PAGE de la proteína
purificada que denominamos PPO P1. Esta PPO mostró propiedades enzimáticas diferentes
comparadas con la actividad de la PPO de la fracción soluble, mostrando varias evidencias de
la existencia de una diversidad de PPOs en frutos de níspero. Esto coincide con la existencia
de varias isoformas de PPO en otras especies de la familia de las Rosáceas como Prunus o
Malus. En los western-blot, el antisuero anti-PPO reacciona frente a varias bandas del extracto
crudo de frutos de níspero (datos mostrados en el capítulo VI). Cuando este extracto crudo se
divide en la fracción particulada (figura 5.3B) y la fracción soluble (figura 5.3C), el antisuero
reacciona frente dos bandas, de 59.2 (P1) y 66.0 (P2) kDa, en la fracción particulada y tres
bandas, de 59.2 (S1), 62.0 (S2) y 66.0 (S3) kDa, en la fracción soluble. Aunque varias de
estas bandas pueden ser resultado de interacciones inespecíficas del antisuero con las
proteínas del extracto, estos resultados apoyan la existencia de varias isoformas en el fruto de
níspero.
Figura 5.3. (A) SDS-PAGE de la PPO latente homogénea; (B) SDS-PAGE

(izquierda) y western-blot de la fracción particulada y (C) SDS-PAGE (izquierda) y western-
blot de la fracción soluble en el momento óptimo de la recolección.
102
V.3.2 Determinación de la secuencia parcial de la PPO latente purificada de 59.2

kDa
Para obtener la secuencia parcial de la PPO latente de 59.2 kDa la banda se analiza por
cromatografía líquida unida a espectrometría de masas después de la digestión de la proteína
en gel con tripsina y la extracción de los péptidos. Los espectros de MS/MS se buscan en la
base de datos de NCBInr en modo identidad utilizando la herramienta de búsqueda MS/MS
del Spectrum Mill. A continuación, se muestra un ejemplo del listado de proteínas obtenidas
(tabla 5.2) y de los péptidos correspondientes a la proteína mayoritaria (tabla 5.3), donde para
cada péptido se obtiene el espectro de MS (anexo B), la carga del precursor (z), el score y el
porcentaje del espectro interpretado (SPI (%)).
Suma del %
Nº Intensidad
Grupo Péptidos score de Cobertura Nº acceso
Espectros del Especies Nombre proteína
distintos péptidos de AA en NCBI
espectro
distintos
Malus x Polifenol oxidasa 2

1 5 4 60.06 7 3.20e+008
domestica
14194273
precursor
Polifenol oxidasa
1 2 1 20.45 2 1.69e+008 Vicia faba 1172586 A1, cloroplasto
precursor (PPO)
Catechol oxidasa
1 2 1 20.45 2 1.69e+008 Vicia faba 418754
precursor
Tabla 5.2 Listado de las proteínas obtenidas para la PPO latente de 59.2 kDa.
Categoría SPI Intensidad

# Nombre archivo z Score Secuencia
Validación (%) Espectro
V R 1 19S.0534.0534.0 3 20.45 99.0 1.70e+007 (R)DPLFYSHHSNVDR(M)
V R 2 19S.0510.0513.0 3 18.87 96.9 1.52e+008 (R)DPLFYSHHSNVDR(M)
V R 3 19S.1281.1284.0 2 18.20 93.7 5.30e+006 (K)GPITIGGFSIELINTT(-)
V R 4 19S.0630.0645.0 3 12.63 93.7 1.35e+008 (K)SEFAGSFVHVPHK(H)
V R 5 19S.0612.0612.0 3 8.78 66.3 1.01e+007 (K)DKSEFAGSFVHVPHK(H)
Tabla 5.3. Listado de los péptidos correspondientes a la proteína mayoritaria, es decir,

a la polifenol oxidasa 2 precursor. En esta tabla se muestra la secuencia de un péptido -
(K)DKSEFAGSFVHVPHK(H)- con un score de 8.78 y cuyo SPI es menor del 70%, por lo
que se valida en modo proteína, pero no en modo péptido, por ello este péptido se descarta.
103
Para obtener más información, se llevó a cabo secuenciación de novo sobre los
espectros no validados y se volvió a interrogar la base de datos mediante BlastP. La tabla 5.4
muestra la lista de proteínas obtenidas para la PPO P1, indicando el número de péptidos
coincidentes encontrados por secuenciación del extremo amino terminal, búsqueda de
espectros de MS/MS, secuenciación de novo y, el porcentaje de la cobertura con respecto a la
proteína madura, siempre que el péptido señal al tilacoide se conozca.
Nº acceso Nombre Mw (Da) pI Especie Nº Nº %

NCBI/ (madura) (madura) péptidos péptidos cobertura
Swiss prot MS/MS “de novo” secuencia
(madura)
14194273/ Polifenol oxidasa 2 55425.60 5.38 Malus x 4c 10 37.3
Q93XM8 precursor domestica
1172586/ Polifenol oxidasa 58604.45 6.00 Vicia faba 1 1 4.86
Q06215 A1 cloroplasto
precursor
3282505/ Polifenol oxidasa 56189.53 5.64 Prunus 0 2 4.44
O81103 precursor armeniaca
7209776/ Polifenol oxidasa Ib 65655.50 6.27 Ipomoea batata 0 2 3.57

Q5ENY2
1172582/ Polifenol oxidasa E, 57124.55 5.88 Lycopersicon 0 1 2.20
Q08307 cloroplasto esculentum
precursor
1346774/ Polifenol oxidasa 61593.07 6.33 0 1 2.03
Q08303 A, cloroplasto Lycopersicon
precursor esculentum
1172580/ Polifenol oxidasa 61678.97 5.87 Lycopersicon 0 1 2.03
Q08305 C, cloroplasto esculentum
precursor
b
1741862/ Polifenol oxidasa 65310.79 6.74 Phytolacca 0 1 1.88
Q40775 americana
251895/ Polifenol oxidasa; 66303.40 6.61 Lycopersicon 0 1 1.87

--------a P2 b esculentum
b
27902361 Polifenol oxidasa 71297.83 8.44 Trifolium 0 1 1.77
/Q84YI0 pratense
20146265 Putativa polifenol 64838.12 6.26 Oryza sativa 0 1 1.74
/Q8RVE0 oxidasa b (japonica
cultivar-grupo)
b
/Q84YH9 pratense
b
30790423 Polifenol oxidasa 68492.31 6.90 Medicago sativa 0 1 1.65
/Q7Y249 subsp.sativa
b
/Q84YI1 pratense
Tabla 5.4. Lista de proteínas obtenidas para la PPO P1 de níspero. (a) Número de
acceso no anotado en la base de datos Swiss prot, (b) secuencias donde no está señalado el
péptido señal en Swiss prot y (c) péptidos obtenidos por MS/MS y secuenciación del amino
terminal. La determinación del amino terminal se detalla en el capítulo III.
104
La tabla 5.5 muestra las secuencias determinadas para la PPO P1 por los
procedimientos anteriores y las secuencias correspondientes a la proteína mayoritaria, es
decir, la PPO 2 precursor de manzana (Acc. 14194273).
∆M Coincidencias
Malus domestica (MALDO) PPO P1 Eriobotrya japonica (E.jap.) (MH+teórico - PPOP1/
+
MH PPO P1) Maldo
péptidos péptidos Score MH+
APVSAPDLTTCGP APVSAPDLTTXGP ---- N-terminal 12/13
(R)DPLFYSHHSNVDR DPLFYSHHSNVDR 20.45a 1587.1 -0.4 13/13
(K)SEFAGSFVHVPHK SEFAGSFVHVPHK 12.63a 1442.5 -0.8 13/13
(K)GPITIGGFSIELINTT GPITIGGFSIELINTT 18.86a 1633.2 -0.4 16/16
1
(K)LLDLNYGGTDDDVDDATR [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR]1 293b 1998.2 -0.3 17/18
1
(K)FDVYVNDDAESLAGK [FD]VYVNDDADSLA[GK]1 258b 1629.2 -0.4 14/15
2
….IFTDTSSSLYDQNR [IF]TDTSSSLYDQYR 238b 1696.1 -0.3 13/14
2
….TDWLDAEFLFYDEK [TD]WLDTEFLFYDEK 232b 1822.3 -0.5 13/14
3
….LLEELDAETDSSLVV…. [483.51]ELEMLGAETDSSLVV[538.65]3 248b 2615.4 -0.5 12/15
1
….PTQTNGEDMGTFYSAGR [PT]QTNGEDFGAFYSA[GR]1 244b 1817.1 0.7 15/17
(K)LPDRGPLR LPDSGPLR 117b 856.1 -1.6 7/8
1
(K)GIEFAGNEPVK [GI]EFAGNETVK 182b 1164.9 -0.0 10/11
(K)AHDEVLVIK AQDEVLVIK 158 1015.1 -0.5 8/9
1
(K)LGYVYDEKVPIPWLK [LGY]VYDENVSIP[331.16]3K 170b 1828.7 -0.6 10/12
Tabla 5.5. Secuencias determinadas mediante secuenciación de Edman, MS/MS y

secuenciación de novo para la PPO P1 de níspero y las secuencias correspondientes a la
proteína mayoritaria, es decir, la PPO 2 precursor de manzana (Malus domestica Acc.
14194273). (1) Fragmento no interpretado por Sherenga pero si interpretado por coincidencia
de masas de dipéptidos ó tripéptidos con secuencia adyacente en MALDO, (2) fragmento no
interpretado por Sherenga pero si interpretado por coincidencia de masas de dipéptidos ó
tripéptidos con secuencia adyacente en MALDO. La secuencia no presenta sitio de corte con
tripsina y (3) fragmento no interpretado. (a) Score de MS/MS y (b) score de Sherenga. Con un
* se indican los péptidos hallados al procesar la banda de 59.2 kDa de la fracción particulada
(figura 5.3B).
105
Cuando las secuencias de los péptidos del extremo amino terminal, MS/MS y
secuenciación de novo son consideradas individualmente o en conjunto, la polifenol oxidasa 2
precursor de manzana es la proteína con mayor homología. Estos resultados proporcionan una
magnífica evidencia de que la PPO latente de frutos de níspero de 59.2 kDa comparte un alto
grado de homología con ella. La banda PPO P1 de 59.2 kDa de la fracción particulada (figura
5.3B) se analizó de la misma manera con los procedimientos anteriores. En la tabla 5.5 se
indican los péptidos hallados con un asterisco (*). Los resultados, al igual que para la PPO P1
de la fracción purificada (figura 5.3A), muestran a la PPO 2 precursor de manzana como la
proteína con mayor homología.
V.3.3. Determinación de la secuencia parcial de las bandas inmunoreactivas de

PPO.
Las otras cuatro bandas inmunoreactivas (P2 de la fracción particulada y S1, S2 y S3

de la fracción soluble) se cortaron, procesaron por digestión tríptica en gel y analizaron por
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. El conjunto de espectros se
procesó como se ha descrito anteriormente y a continuación, se realizaron las búsquedas por
MS/MS y secuenciación de novo. La tabla 5.6 muestra la lista de proteínas para la banda P2 y
la tabla 5.8 para las bandas S1, S2 y S3, indicando el número de péptidos coincidentes
encontrados por MS/MS y secuenciación de novo y el porcentaje de la cobertura con respecto
a la proteína madura, siempre que el péptido señal al tilacoide se conozca.
La tabla 5.7 muestra las secuencias determinadas por los procedimientos comentados
anteriormente y las secuencias correspondientes a la proteína mayoritaria de la banda PPO P2,
es decir, PPO precursor de Prunus armeniaca (Acc. 3282505). Todos los péptidos buscados,
con excepción de [TD]WLDTEFLFYDEK (MH+=1822.113), muestran a PPO precursor de
Prunus armeniaca como la proteína candidata. Este péptido muestra a PPO 2 precursor de
manzana como la proteína candidata con una sustitución, mientras que PPO precursor de
Prunus armeniaca lo es con dos sustituciones. Como el ion precursor aparece en P2 y en P1,
los resultados sugieren que la PPO de níspero de la banda P2 es similar a PPO2 de manzana
sólo en esta secuencia pero comparte más identidad con la PPO de Prunus armeniaca si
observamos el conjunto de secuencias de PPO P2. No obstante, en ausencia de secuencias de
PPO de níspero en bases de datos no se puede descartar la presencia de otra isoforma que se
diferenciase en ese péptido.
106
Así pues, si observamos las secuencias de PPO P1 y PPO P2, podríamos deducir que
ambas son PPO, pero muy probablemente son productos génicos diferentes.
Nº acceso Nombre Mw (Da) pI Especie Nº Nº %

NCBI/ (madura) (madura) péptidos Péptidos cobertura
Swiss MS/MS “de novo” secuencia
prot (madura)
14194273/ Polifenol oxidasa 2 55425.60 5.38 Malus x 0 4 9.53

Q93XM8 precursor domestica
1172587/ Polifenol oxidasa 56718.23 5.65 Vitis vinifera 0 2 4.36

P43311 cloroplasto precursor
1172583/ Polifenol oxidasa F 66183.2 6.27 Lycopersicon 0 2 4.21

Q08296 cloroplasto precursor esculentum
1172580/ Polifenol oxidasa C, 61678.97 5.87 Lycopersicon 0 2 3.87

1346774/ Polifenol oxidasa A, 61593.07 6.33 Lycopersicon 0 2 3.87

15487290/ Polifenol oxidasa b 65774.87 8.22 Pyrus pyrofila 0 2 3.88

Q948S3
b
27902363/ Polifenol oxidasa 67737.78 7.60 Trifolium 0 2 3.67
Q84YH9 pratense
1785613/ Polifenol oxidasa b 67389.6 6.39 Vitis vinifera 0 2 3.62

P93622
27902361/ Polifenol oxidasa b 71297.83 8.44 Trifolium 0 2 3.53

Q84Y10 pratense
1172585/ Polifenol oxidasa 62243.0 5.60 Spinacia oleracea 0 1 2.23

P43310
cloroplasto precursor
b
27902359/ Polifenol oxidasa 68905.78 7.27 Trifolium 0 1 2.15
Q84YI1 pratense
13559508/ Polifenol oxidasa b 67008.7 8.30 Ananas comosus 0 1 1.99

Q9AU63
a
4519435/ Polifenol oxidasa 23387.26 5.95 Pyrus communis 0 2 ----- a
Q9ZQV
a
4519433/ Polifenol oxidasa 23374.99 5.37 Pyrus pyrofila 0 2 ----- a
Q9ZQV2
a
4519439/ Polifenol oxidasa 23455.25 5.76 Eryobotria 0 2 ----- a
Q9ZQU9 japonica
4519441/ Polifenol oxidasa a 23453.3 5.24 Pseudocydonia 0 2 ----- a

Q9ZQU8 sinensis
Tabla 5.6. Lista de proteínas obtenidas para la PPO P2 de níspero. (a) fragmento de
secuencia anotado en Swiss prot (b) secuencias donde no está señalado el péptido señal en
Swiss prot.
107
∆M Coincidencias
Prunus armeniaca (PRUAR) PPO P2 Eriobotrya japonica (E.jap.) (MH+teórico – PPOP2/
+
MH PPOP2) PRUAR
(R)MYLYFYER MYLYFYER 13.14 a 1182.9 1.6 8/8
(R)IDENLAIMYR IDENLAIMYR 16.23 a 1238.4 -0.8 10/10
(K)FDVFINDDAESLSR FDVFINDDAESLSR 22.00 a 1628.2 -0.4 14/14
a
(R)VSNSPITIGGFKIEYSS VSNSPITIGGFKIEYSS 13.74 1799.1 -0.2 17/17
2
.......EDMGNFYSAGR [ED]MGNFYSA[GR]1 149 b 1246.8 -0.3 11/11
(K)TPDLFFGHAYR TPDLFFGHE[YR]1 196 b 1381.9 -0.2 10/11
1
(K)TFKPDLSIPLR [TF]TPDLSI[PLR]1 140 b 1260.3 -1.2 10/11
1
….TDWLDAEFLFYEN [TD]WLDTEFLFYDEK 224 b 1822.1 -0.3 12/14
1
(K)SEFAGSFVHVPQG [SE]FAGSFVHVPHN[256.32]3 207 b 1683.9 0.1 11/13
(R)DPLFYAHHANVDR DPLFYAHHC[NV]1DR 165 b 1644.9 -1.2 12/13
3
….YEPVSLPWLFTK…. [264.34]YEPVSVPWLFTK 210 b 1730.0 1.1 11/12
(R)AGNLNTGKYPGTIENMPH.. A3[272.90]TTGTHPGTIENT[PH]2 227 b 1806.8 0.2 11/15
MWNIWK MWNIWK 100 b 877.9 -0.4 6/6
Tabla 5.7 Secuencias determinadas por MS/MS y secuenciación de novo para la PPO
P2 de níspero y las secuencias correspondientes a la proteína mayoritaria, es decir, la PPO
precursor de albaricoque (Prunus armeniaca Acc.3282505). (1) Fragmento no interpretado
por Sherenga pero si interpretado por coincidencia de masas de dipéptidos ó tripéptidos con
secuencia adyacente en PRUAR, (2) fragmento no interpretado por Sherenga pero si
interpretado por coincidencia de masas de dipéptidos ó tripéptidos con secuencia adyacente en
PRUAR. La secuencia no presenta sitio de corte con tripsina y (3) fragmento no interpretado.
(a) Score de MS/MS y (b) score de Sherenga.
Todas las bandas inmunoreactivas de la fracción soluble se analizaron de la misma

manera que la banda P2 y el recuento de los péptidos coincidentes con las proteínas de
NCBInr muestra como principal candidata la PPO2 precursor de manzana de nuevo (Acc.
14194273).
Como todas las secuencias deducidas de la banda S1 (tabla 5.9) se han encontrado en
P1 (tabla 5.5) y ambas bandas tienen la misma movilidad electroforética, podría considerarse
que ambas bandas son probablemente el mismo polipéptido, de modo que S1 podría obtenerse
por una liberación artefactual de P1 de la fracción particulada durante la homogeneización del
tejido. Las secuencias de los péptidos de S2 (que es una banda débil y con movilidad
108
electroforética menor que S1) y S3, (que es una banda más intensa y presenta la menor
movilidad electroforética), se encuentran también en la banda P1. Debido a que las PPOs son
proteínas que se traslocan al cloroplasto, eliminando el péptido señal por una peptidasa
cloroplastídica (Koussevitzky y col., 1998), los resultados sugieren que S2 y S3 son formas
inmaduras del polipéptido de P1. La menor movilidad electroforética con respecto a P1 es la
única evidencia que soporta esta hipótesis ya que no se han encontrado péptidos del extremo
amino terminal de la PPO inmadura. Una inspección detallada de las secuencias de los
péptidos señal de las PPOs revela la presencia de pocos residuos catiónicos y además
desigualmente distribuidos, que producirían péptidos trípticos muy cortos o muy largos que
son difíciles de detectar por ESI-MS.
Además hemos encontrado un ion precursor exclusivo de la banda S3 [MH+=1219.66]
(VSNSPITIGGFK) (tabla 5.9), cuya proteína candidata es la PPO de Prunus armeniaca
(Acc. 3282505). Una inspección minuciosa de las secuencias de péptidos de P2 (tabla 5.7)
revela la presencia de un ion precursor más largo [MH+=1798.92) (VSNSPITIGGFKIEYSS)
que contiene la secuencia anterior- subrayada - y que es el resultado de un fallo en el corte
con tripsina. Entre las secuencias de P1 y S1 (tablas 5.5 y 5.9), hay un ion precursor
[MH+=1632.88] (GPITIGGFSIELINTT) que se alinea pero no es coincidente con los otros
dos péptidos descritos anteriormente. Además el ion precursor [MH+=1821.86]
([TD]WLDTEFLFYD[EK]) hallado en S3 (tabla 5.9) es común a P1 (tabla 5.5) y P2 (tabla
5.7), por lo que podría proceder de alguna de estas proteínas o de ambas. La interpretación
más simple de estos resultados es que la banda S3 contiene dos poli-péptidos diferentes. Uno
es el polipéptido inmaduro altamente homólogo a PPO2 de manzana, precursor de la PPO
encontrada en P1. El otro es similar al encontrado en P2, altamente homólogo a PPO de
Prunus armeniaca, que procedería de la liberación artefactual de la fracción particulada
debido a la homogenización del tejido.
109
PPO S1
Nº acceso Nombre Mw (Da) pI Especie Nº Nº péptidos % cobertura

NCBI/ (madura) (madura) peptidos “de novo” secuencia
Swiss prot MS/MS (madura)
14194273/ Polifenol oxidasa 55425.60 5.38 Malus x 3 4 20.7

Q93XM8 2 precursor domestica

13559508/ Polifenol oxidasa a 67008.7 8.30 Ananas 0 1 1.99

Q9AU63 comosus
PPO S2


PPO S3



Tabla 5.8. Lista de proteínas obtenidas para la PPO S1, S2 y S3, indicando el
número de péptidos coincidentes encontrados por búsqueda de espectros de MS/MS,
secuenciación de novo, y el porcentaje de la cobertura con respecto a la proteína madura,
siempre que el péptido señal al tilacoide se conozca. (a) secuencias donde no está señalado el
péptido señal en Swiss prot.
110
∆M
PPO S1 Eriobotrya japonica (E.jap.) (MH+teórico – Coincidencias
Malus domestica (MALDO) PPOS1/Maldo
MH+ PPO S1
(R)DPLFYSHHSNVDR DPLFYSHHSNVDR 19.45 a 1587.7 -1.0 13/13
(K)SEFAGSFVHVPHK SEFAGSFVHVPHK 13.85 a 1442.2 -0.5 15/15
(K)GPITIGGFSIELINTT GPITIGGFSIELINTT 19.38 a 1633.4 -0.5 16/16
1 1 b
(K)LLDLNYGGTDDDVDDATR [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR] 296 1998.2 -0.3 17/18
1
(K)FDVYVNDDAESLAGK [FD]VYVNDDADSLA[GK]1 263 b 1628.9 -0.2 14/15
2
….TDWLDAEFLFYDEK [TD]WLDTEFLFYD[EK]1 211 b 1822.2 -0.4 13/14
1
(K)GIEFAGNEPVK [GI]EFAGNETVK 171 b 1164.9 0.7 10/11
∆M
(MH+teórico – Coincidencias
Malus domestica (MALDO) PPO S2 Eriobotrya japonica (E.jap.) + PPOS2/Maldo
MH PPO S2
1
(K)LLDLNYGGTDDDVDDATR [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR]1 288 b 1998.3 -0.4 17/18
(K)FDVYVNDDAESLAGK [FD]VYVNDDADSLAGK 251 b 1629.0 -0.3 14/15
1 b
(K)GIEFAGNEPVK [GI]EFAGNETVK 148 1164.9 0.7 10/11
∆M
(MH+teórico – Coincidencias
Malus domestica (MALDO) PPO S3 Eriobotrya japonica (E.jap.) + PPOS3/Maldo
MH PPO S3
Péptidos péptidos Score MH+
(R)VSNSPITIGGFK (R)VSNSPITIGGFK 13.96 a 1220.4 -0.7 12/12
1
(K)LLDLNYGGTDDDVDDATR [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR]1 304 b 1998.1 -0.2 17/18
1
(K)FDVYVNDDAESLAGK [FD]VYVNDDADSLA[GK]1 211 b 1628.8 -0.1 14/15
2 1 b
….TDWLDAEFLFYDEK [TD]WLDTEFLFYD[EK] 224 1823.0 -1.1 13/14
1
(K)GIEFAGNEPVK [GI]EFAGNETVK 164 b 1164.9 0.7 10/11
Tabla 5.9 Secuencias determinadas mediante MS/MS y secuenciación de novo para

PPO S1, S2 y S3 de níspero y las secuencias correspondientes a la proteína mayoritaria, es
decir, la PPO 2 precursor de manzana (Malus domestica Acc. 14194273). (1) Fragmento no
interpretado por Sherenga pero si interpretado por coincidencia de masas de dipéptidos ó
tripéptidos con secuencia adyacente en MALDO, (2) fragmento no interpretado por Sherenga
pero si interpretado por coincidencia de masas de dipéptidos ó tripéptidos con secuencia
adyacente en MALDO. La secuencia no presenta sitio de corte con tripsina y (3) fragmento no
interpretado. (a) Score de MS/MS y (b) score de Sherenga.
111
Con el fin de facilitar la interpretación de los resultados obtenidos, se han alineado los
péptidos de cada banda sobre un alineamiento de la PPO2 de manzana y la de Prunus
armeniaca. La figura 5.4 muestra la superposición de las secuencias de cada banda que
reacciona con antisuero anti-PPO.
Aunque se han hallado muchas secuencias exclusivas del conjunto de bandas P1, S1,
S2 o de la banda P2, podría ocurrir que en níspero haya una secuencia desconocida que
concilie los datos de estos dos conjuntos. Una prueba a favor de ello es que en S3 hay
péptidos comunes y exclusivos de ambos conjuntos. Sin embargo esta hipótesis la podemos
descartar porque algunos de los péptidos de estos conjuntos solapan pero muestran posiciones
divergentes (indicado con un símbolo * en la figura 5.4), lo cual es la mejor evidencia de que
estos conjuntos son productos de al menos dos genes diferentes.
V.3.4 Relaciones filogenéticas entre las PPO de níspero
Para poder estudiar las relaciones filogenéticas es necesario disponer de secuencias

completas. Dada la carencia de esta información para PPOs de níspero, hemos diseñado una
estrategia que consiste en hacer comparaciones filogenéticas entre las PPO de mayor
homología con secuencias de níspero y otras PPO completas existentes en bases de datos
públicas. En el níspero hemos demostrado la presencia de dos parálogos expresados en el
fruto. Además existe una secuencia parcial en base de datos (Acc. 4519439), que es la que
hemos usado para crear el anticuerpo. Dos análisis comparativos proporcionan evidencias
adicionales de la existencia de al menos tres genes parálogos de PPO en níspero: alineamiento
y matriz de homologías. Como se muestra en la figura 5.5, el alineamiento de esta secuencia
con los péptidos solapantes de P1 y P2, revela múltiples divergencias con ambos,
demostrando que esta secuencia es producto de un gen diferente de los que codifican para P1
y P2.
112
S3............................................................................................
S2............................................................................................
S1............................................................................................
P1..............................................................APVSAPDLTTXGP.................
AAK56323_Malus 59 DNLDQG--------LARLDRRNMLIGLG-TGGLYSAAGNSFAFAAPVSAPDLTTCGPADK-PDGS-TIDCCPPI
O81103_Prunus 58 SNNQNEQQEESSRLLGKLDRRNILIGLGGLYGATTLDRKPFAFADPIAPPDLTTCKPAEITPGGSETVPCCPPV
P2............................................................................................
S3............................................................................................
S3............................................................................................
S2............................................................................................
S1............................................................................................
P1..........................LPDSGPLR..........................................................
AAK56323_Malus 122 TTTIIDFKLPDRGPLRTRIAAQDVAKNPAYLAKYKKAIELMRALPDDDPRSLVQQAKVHCSYCDGGYPQVGYSD
O81103_Prunus 130 TTKIKTFKPDLSIPLRTSPAAHQVTD--EYLAKFKKAQAAMRALPDDDPRSMVQQAKVHCAYCNGAYPQVGFTD
P2.......................TFTPDLSIPLR..........................................................
S3............................................................................................
*** *
S3............................................................................................
S2............................................................................................
S1............................................................................................
P1......................................................................IFTDTSSSLYDQYR........
AAK56323_Malus 196 LEIQVHFCWLFFPFHRWYLYFYEKIMGELIGDPTFALPFWNRDAPAGMYIPEIFTDTSSSLYDQNRNTAHQPPK
O81103_Prunus 204 NDIQVHFSWLFFPFHRMYLYFYERILGKLIDDPTFALPYWNWDSPVGFPIPDIYTDTSSPLYDQYRNADHQPPV
P2..................................MYLYFYER..................................................
S3............................................................................................
S3..................LLDLNYSGTDDDVDDATR........................................................
P1..................LLDLNYSGTDDDVDDATR.......................................................P
AAK56323_Malus 270 LLDLNYGGTDDDVDDATRIKENLTTMYQQMVSKATSHRLFYGEPYSAGDE-PDPGAGNIETTPHNNIHLWVGDP
O81103_Prunus 278 LVDLSYGGKDDDVDEQTRIDENLAIMYRQMVSGAKTPDLFFGHAYRAGNLNTGKYPGTIENMPHNNIHIWVGDP
P2....................................IDENLAIMYR.......TPDLFFGHEYR....TTGTHPGTIENTPH..........
S3............................................................................................
S3..................................DPLFYSHHSNVDR.................TDWLDTEFLFYDEK..............
S2..................................DPLFYSHHSNVDR.............................................
S1..................................DPLFYSHHSNVDR.................TDWLDTEFLFYDEK..............
P1..................TQTNGEDFGAFYSAGRDPLFYSHHSNVDR.................TDWLDTEFLFYDEK..............
AAK56323_Malus 343 TQTNGEDMGTFYSAGRDPLFYSHHSNVDRMWSIYKDKLG-GTDIENTDWLDAEFLFYDEKKNLVRVKVRDSLDT
O81103_Prunus 352 SQTHQEDMGNFYSAGRDPLFYAHHANVDRMWNIWKTLGGKRKDITDTDWLDAEFLFYDENAELVRVKVRDSLEP
P2.......................EDMGNFYSAGRDPLFYAHHCNVDRMWNIWK...........TDWLDTEFLFYDEK..............
S3................................................................TDWLDTEFLFYDEK..............
* * * *
S3............................................................................................
S2............................................................................................
S1............................................................................................
P1....................LGYVYDENVSIP......................................................AQDEVL
AAK56323_Malus 416 KKLGYVYDEKVPIPWLKSKPTLVSRRIRERPQFIF-DLTTTFPATLSDTISVEVTRPSATKRTAAQKKAHDEVL
O81103_Prunus 426 EKQLRYNYEPVSLPWLFTKPTARKTKNKTKAKVAATQLTSKFPATLVEVTTVEVARPKPRKRSKKEKVDEEELL
P2.........................YEPVSVPWLFTK.......................................................
S3............................................................................................
* * *
S3.....................GIEFAGNETVKFDVYVNDDADSLAGK.............................................
S2.....................GIEFAGNETVKFDVYVNDDADSLAGK.............................................
S1.....................GIEFAGNETVKFDVYVNDDADSLAGK..SEFAGSFVHVPHK..............................
P1..................VIKGIEFAGNETVKFDVYVNDDADSLAGK..SEFAGSFVHVPHK.................ELEMLGAETDSSL
AAK56323_Malus 489 VIKGIEFAGNEPVKFDVYVNDDAESLAGKDKSEFAGSFVHVPHK--HKKNIKTNLRLSIMSLLEELDAETDSSL
O81103_Prunus 500 IIKDIEFEGTEAVKFDVFINDDAESLSRRDKSEFAGSFVHVPQGKTTKAKTKTNLKLGITDLLEDLGAEDDSSV
P2................................FDVFINDDAESLSR...SEFAGSFVHVPHN..............................
S3...........................................................................................
* * ** *
S3............................................
S2............................................
S1............................GPITIGGFSIELINTT
P1..................VV........GPITIGGFSIELINTT
AAK56323_Malus 561 VVTLVPKVGKGPITIGGFSIELINTT
O81103_Prunus 574 LVTLVPRVSNSPITIGGFKIEYSS--
P2.........................VSNSPITIGGFKIEYSS..
S3.........................VSNSPITIGGFK.......
* * ***
Figura 5.4. Alineamiento de las secuencias de PPO de M. domestica y P. armeniaca con los péptidos
obtenidos de las bandas P1, P2, S1, S2 y S3. En azul sustituciones en las posiciones de los péptidos de níspero
respecto de su secuencia homóloga y (*) posiciones divergentes entre péptidos de las bandas P1, S1, S2 y S3 y
las bandas P2 y S3. Los recuadros corresponden a los dominios de CuA, CuB y CuC.
113
4519439 DGAYDQAGFPELELQVHNSWFFFPFHRYYLYFFEKILGKLINDPTFAMPFWNWDSPAGMPLPAIYANPKS
P1 ...............................................................IFTDTSS
P2 ...........................MYLYFYER...................................
4519439 PLYDKFRSAKHQPPTLVDLDYNGTEDNVSKETTINANLKIMYRQMVSSSKNARLFFGNPYRAGDEPDPGG
P1 SLYDQYR........LLDLNYSGTDDDVDDATR.....................................
P2 ......................................................................
4519439 GSIEGTPHGPVHLWTGDNTQPNFEDMGNFYSAGRDPVFYAHHSNVDRMWNIWKTLGGKRTDLL
P1 .................PTQTNGEDFGAFYS...DPLFYSHHSNVDR................
P2 .......................EDMGNFYSAGRDPLFYAHHCNVDR
Figura 5.5. Secuencia de proteínas de PPO P1, PPO P2 y del fragmento de PPO
anotado en la base de datos de NCBInr para níspero (Acc. 4519439) alineados. En azul se
muestran las posiciones divergentes entre P1 o P2 con la secuencia de la base de datos.
La tabla 5.10 muestra los resultados del porcentaje de homología entre las secuencias
de PPOs de níspero y de proteínas homólogas extraidas de las bases de datos. La PPO2 de
manzana comparte sólo hasta un 63% de homología con otras PPOs, pero la homología
alcanza aproximadamente un 92% frente a los fragmentos de secuencia deducidos de P1. La
PPO de Prunus armeniaca comparte hasta un 58% de homología con secuencias completas de
PPOs y un 64% con el único fragmento de PPO de níspero anotado en la base de datos.
También en este caso, la homología alcanza casi un 92% cuando la comparamos con los
fragmentos de secuencias deducidas de la banda P2. Estos resultados sugieren que si los genes
de PPO de níspero codifican polipéptidos de estos productos, podrían compartir una
elevadísima homología con PPO2 de manzana y PPO de Prunus armeniaca respectivamente.
Por su parte, el polipéptido codificado por el único fragmento de PPO de níspero en las bases
de datos (Acc. 4519439), presenta un 96% de homología con PPO de Pyrus pyrifolia (Acc. N.
15487290) (figura 5.6). Al llevar a cabo un estudio filogenético, se comprueba que PPO de
Prunus armeniaca y PPO 2 de manzana se encuentran agrupadas (figura 5.7), indicando que
P1 y P2 probablemente son dos proteínas estrechamente relacionadas. Sin embargo, PPO de
Pyrus pyrifolia pertenece a otro grupo diferente en el análisis filogenético en el cual también
esta la PPO 1 de manzana (figura 5.7).
El árbol filogenético (figura 5.7) apoya la existencia de al menos tres genes, dos
expresados en frutos maduros y un tercer parálogo cuyo polipéptido no se encuentra en frutos,
al menos en estadio de recolección del fruto.
114
a b a
Nº acceso Nombre PPO 2 PPO P1 PPO PPO P2b 15487290a PPOc níspero
NCBInr Maldo níspero Pruar níspero PPO Pyrpy recombinante
14194273 PPO 2 Maldo 100% 91.8% 58% 66.2% 54% 63%
3282505 PPO Pruar 58% 67.9% 100% 91.9% 56% 63%
4519439 PPO Ejap 63% 16.8% 64% 32.4% 97% 99%
15487290 PPO Pyrpy 54% 56% 56% 60.1% 100% 96%
1172584 PPO 1 Maldo 55% 57% 56% 60.1% 95% 93%
7209776 PPO I Ipoba 48% 52.1% 48% 50.7% 51% 59%
1172586 PPO A1 Vicia 49% 54.9% 49% 49.3% 58% 66%
Tabla 5.10. Homología de las secuencias (%); (a) obtenidas por alineamiento
mediante Blast de las secuencias obtenidas de Swiss prot, (b) por comparación de los péptidos
obtenidos de las fracciones de níspero y la presencia de estos péptidos en las diferentes
especies y (c ) obtenidas mediante blast del fragmento de secuencia obtenido para la proteína
recombinante.
15487290 MTSLSPPVVTTPTVPNPATKPFSPFSQNNSQVSLLTKPKRSFARKVSCKATNNDQNDQAQSKLDRR
4519439 ..................................................................
15487290 NVLLGLGGLYGVAGMGTDPFAFAKPIAPPDVSKCGSADLPQGAEATNCCPPPATKIIDFKLPAPAK
4519439 ..................................................................
15487290 LRIRPPAHAVDKAYRDKFYKAMELMKALPDDDPRSFKQQAAVHCAYCDGAYDQAGFPELELQVHNS
4519439 ...............................................DGAYDQAGFPELELQVHNS
15487290 WLFFPFHRYYLYFFEKILGKLINDPTFAMPFWNWDSPAGMPLPAIYADPKSPLYDKFRSAKHQPPT
4519439 WFFFPFHRYYLYFFEKILGKLINDPTFAMPFWNWDSPAGMPLPAIYANPKSPLYDKFRSAKHQPPT
15487290 LIDLDYNGTEDNVSKETTINANLKIMYRQMVSNSKNAQLFFGNPYRAGDEPDPGGGSIEGTPHGPV
4519439 LVDLDYNGTEDNVSKETTINANLKIMYRQMVSSSKNARLFFGNPYRAGDEPDPGGGSIEGTPHGPV
15487290 HLWTGDNTQPNFEDMGNFYSAGRDPVFYAHHSNVDRMWSIWKTLGGKRTDLADKDWLDSGFLFYNE
4519439 HLWTGDNTQPNFEDMGNFYSAGRDPVFYAHHSNVDRMWNIWKTLGGKRTDLL..............
15487290 NAELVRVKVRDCLETKNLGYVYQDVDIPWLSSKPTPRRAKVALGKIAKKLGVAHAAVASSSKVVAG
4519439 ..................................................................
15487290 TEFPISLGSKISTVVKRPKQKKRSKKAKEDEEEILVIEGIEFDRDVAVKFDVFVNDVDDLPSGPDK
4519439 ..................................................................
15487290 TEFAGSFVSVPHRHKHKKKINTILRLGLTDLLEEIEAEDDDSVVVTLVPKYGAVNIGGIKIEFAS
4519439 .................................................................
Figura 5.6. Superposición de las secuencias de proteína PPO de Pyrus pyrifolia (Acc.
N. 15487290) y del fragmento de PPO de níspero en las bases de datos (Acc. 4519439). En
azul se muestran las sustituciones en las posiciones de los péptidos entre ambas secuencias.
115
BAB20048 Antirrhinum majus

P43311 Vitis vinifera
AAK29782 Ananas comosus
100 AAO16865 Ananas comosus
AAK13244 Trifolium pratense
94 AAP33165 Medicago sativa

89 S24758 Vicia faba
100
Q06215 Vicia faba
AAW65103 Prunus salicina
BAB64530 Pyrus pyrifolia mejor candidato para
100 PPO recombinante
100 P43309 Malus domestica (Apple 1)
93 BAA21676 Malus domestica (Apple 4)
96 BAA21677 Malus domestica (Apple 3)
AAU12257 Populus balsamifera.
ABF19601 Camelia ptilophyla
AAU12256 Populus balsamifera
99 AAK53414 Populus tremuloides
100 AAG21983 Populus balsamifera
AAK56323 Malus domestica (Apple 2) mejor candidato
para PPO P1
100 AAW58109 Prunus salicina
mejor candidato
100 O81103 Prunus armeniaca para PPO P2
100 AAC28935 Prunus armeniaca
Q08307 Lycopersicon esculentum
100 Q08296 Lycopersicon esculentum

74
Q06355 Solanum tuberosum
100 T07097 Solanum tuberosum
T07096 Solanum tuberosum
99
100
100 Q08303 Lycopersicon esculentum
100
Figura 5.7. Arbol filogenético de polifenol oxidasa.
116
Discusión Identificación molecular de PPOs de frutos de níspero mediante LC-MS/MS
V.4 DISCUSIÓN
Frente a otros abordajes experimentales, la LC-MS/MS empleada en el marco de un

flujo de análisis proteómico proporciona una información sobre la naturaleza química de las
proteínas, y en particular sobre las PPOs de níspero, absolutamente específica-fragmentos de
secuencia-, mucho menos costosa económicamente y rápida. Podemos decir por tanto que
para identificar la función de la proteína esta técnica supera a las técnicas inmunológicas o a
la secuenciación del extremo amino terminal. Además de la función, es capaz de proporcionar
una información que discrimine sin ambigüedad entre proteínas de genes parálogos (Delande
y col., 2005) e incluso de variantes alélicas (Casado-Vela y col., 2006).
La utilización de un anticuerpo para detectar bandas inmunoreactivas sirve de guía

para encontrar proteínas de interés en una mezcla compleja y dotar a la aproximación
experimental LC-MS/MS de una gran precisión y eficacia respecto de la selección de la
muestra a analizar. De hecho, los mejores espectros adquiridos y la mayor parte de ellos
correspondían a péptidos de PPO, si bien alguno correspondía a otra proteína que
supuestamente estaba en la misma banda. No obstante, ninguna otra proteína pudo ser
validada con los mismos criterios mínimos que para PPO.
Los genes parálogos que conforman una familia multigénica son el resultado de
duplicaciones múltiples las cuales sufren mutaciones de forma independiente, por ello, sus
productos proteicos comparten ampliamente su secuencia pero muestran diferencias en
posiciones concretas. Consecuentemente, los fragmentos trípticos de estas proteínas se pueden
asignar a un parálogo concreto si el péptido resultante es discriminante, es decir, su secuencia
es específica del parálogo, de lo contrario, la asignación es ambigua. Como no todos los
parálogos de una familia multigénica están presentes en bases de datos públicas de proteínas,
sus péptidos discriminantes quedarían huérfanos sin asignación a ninguna proteína, mientras
que los comunes a otros parálogos sólo servirían para identificar la función, pero no la
proteína en si. Una estrategia para acceder a esta información fue propuesta por Delande y
col. (2005), pero queda restringida a especies cuyo genoma está secuenciado, pues se basa en
hacer búsquedas contra la secuencia del genoma completo y extender al máximo la cobertura
de secuencia para aumentar la probabilidad de identificar péptidos discriminantes. Esta
estrategia deja fuera la mayoría de especies, de las cuales no hay secuencia completa de su
genoma.
117
Una estrategia complementaria con esta y no restrictiva es la que hemos empleado en

este estudio que sería aplicable a secuencias no presentes en las bases de datos siempre y
cuando las secuencias de genes o proteínas ortólogas si lo estén. De esta manera hemos
podido analizar la presencia de parálogos de PPO en frutos de níspero. Brevemente, se trata
de obtener la máxima cobertura posible de una proteína aislada mediante electroforesis,
combinando la búsqueda de MS/MS, secuenciación del extremo amino terminal y
secuenciación de novo. Con esta información se extrae el ortólogo de mayor homología de la
base de datos y finalmente se alinean sobre los péptidos encontrados sobre los ortólogos para
determinar los péptidos discriminantes, y así, el número mínimo de parálogos en la muestra.
La información obtenida por el uso combinado de western-blot y LC-MS/MS permite

asegurar la presencia de los productos de expresión de dos parálogos de PPO en el fruto de
níspero en el estadío de recolección. Uno de los productos, homólogo a PPO de P. armeniaca,
se muestra como una banda de 66.0 kDa en la fracción particulada (P2) y también en la
fracción soluble (S3). La presencia en la fracción soluble es quizás artefactual ya que de
existir precursores citosólicos cabe esperar que tenga un peso molecular mayor. El otro
producto, homólogo a PPO 2 de manzana, se muestra como una banda de 59.2 kDa en la
forma particulada (P1) igual que en la PPO latente purificada a homogeneidad en esta tesis, y
tres bandas de 59.2, 62.0 y 66.0 kDa en la fracción soluble (S1, S2 y S3 respectivamente).
Dos líneas de evidencia sugieren que estas formas corresponden al precursor (S3), a
una forma intermedia (S2) y a la proteína madura en su ubicación tilacoidal definitiva (P1) o
en su forma soluble artefactual (S1). Por una parte, no se han encontrado péptidos
discriminantes entre ellos, por tanto, la proteína candidata para las cuatro bandas es la misma
(PPO 2 de manzana). Por otra parte, las PPOs poseen un péptido señal que las dirige al
tilacoide en dos etapas, la primera consistente en la traslocación al cloroplasto perdiendo parte
del péptido señal y convirtiéndose en una forma intermedia, y la segunda es la traslocación al
tilacoide perdiendo el resto del péptido señal y convirtiéndose en la forma madura
(Koussevitzki y col., 1998). La presencia de precursores de P1 pero no de P2 sugiere que el
gen que codifica para P1 se expresa en este estadio del fruto, no así el que codifica para P2,
que se debió expresar en estadíos anteriores, permaneciendo el producto estable hasta la
recolección. El ortólogo de P1, PPO2, en manzana se expresa en frutos jóvenes, pero no en
frutos maduros (Kim y col., 2001). No hay datos publicados sobre la evolución de su producto
proteico a lo largo del desarrollo. Por su parte, el ortólogo de P2 en albaricoque, PA-PPO,
118
también se expresa sólo en estadíos muy tempranos del desarrollo del fruto, pero la proteína
se detecta en todos los estadíos (Chevalier y col., 1999). En el siguiente capítulo se abordará
el estudio sobre los patrones de expresión de proteínas durante el desarrollo y otros estados
fisiológicos.
La comparación de las secuencias obtenidas en fruto del fragmento de PPO de níspero

de la base de datos, permite asegurar que en níspero hay al menos tres genes parálogos para
PPO, pero sólo el producto proteico de dos de ellos se encuentra en el fruto en el estadío de
recolección.
119
Capítulo VI.
Estudio fisiológico de polifenol oxidasas
de fruto de níspero
Introducción Estudio fisiológico de las polifenol oxidasas de frutos de níspero
VI.1 INTRODUCCIÓN
El estudio bioquímico y molecular de la polifenol oxidasa en frutos de níspero

presentado en los capítulos anteriores aporta evidencias de que existe una diversidad compleja
de PPO en este órgano debido a la obtención de dos PPOs de productos génicos diferentes en
el momento óptimo de la recolección del fruto. La expresión simultanea de dos o más genes
en el mismo tejido y estado de desarrollo se ha descrito para otras especies (Kim y col., 2001;
Thipyapong y col., 1997). Además, en diversas especies se ha demostrado la expresión de
parálogos de PPO esta sometida a una estricta regulación espacio-temporal y por situaciones
de estrés (Thipyapong y col., 1997; Thipyapong y Steffens, 1997; Wang y Constabel, 2004;
Gooding y col., 2001; Thygesen y col., 1995; Boss y col., 1995; Kim y col., 2001). Para poder
establecer una relación que implique a la enzima en el proceso de pardeamiento enzimático es
necesario determinar el tipo de isoenzima expresada en frutos considerados óptimos para
consumo y frutos dañados durante la post-recolección, ya que esta información podría ayudar
a conocer el papel que desempeña la enzima. La utilización de técnicas de biología molecular
como el western-blot es una técnica contrastada que permite el análisis de las isoenzimas y
especies moleculares de PPO extractos crudos o fracciones parcialmente homogéneas.
En este estudio, nuestro objetivo es determinar las diferentes isoenzimas de PPO que
pueden estar directamente relacionadas con procesos fisiológicos que manifiestan el
pardeamiento enzimático. Para ello, se utilizaron extractos crudos y fracciones de PPO-
soluble y particulada- y se analizó su expresión a nivel de proteína mediante western blot en
diferentes etapas de desarrollo y maduración del fruto, así como después de someter al fruto a
situaciones de estrés, bien por un tratamiento largo de post-recolección o por daños
mecánicos. La inmunodetección de las diferentes isoenzimas, se realizó utilizando un
antisuero anti-PPO de conejo que se obtuvo a partir de un fragmento de la proteína purificada
de 27 kDa codificada por una secuencia amplificada de la PPO de níspero encontrada en bases
de datos públicas (Acc. 4519439) (Haruta y col., 1999).
120
Materiales y métodos Estudio fisiológico de las polifenol oxidasas de frutos de níspero
VI.2 MATERIALES Y MÉTODOS
VI.2.1 Análisis de pH, azúcar y acidez en frutos de níspero.
La determinación de las variables fisicoquímicas del jugo de frutos de níspero se

realizan a partir de los frutos que se conservaron a –20ºC inmediatamente después de la
recolección. Los nísperos se descongelan y se procede a la preparación de un jugo a partir
de la homogenización de 50 gramos de pulpa y 50 ml de agua fría durante 1 minuto. A
continuación el extracto se centrifuga a 4000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. En el
sobrenadante resultante de esta centrifugación se determina el pH, los sólidos solubles
mediante refractometría, la conductividad y la acidez valorable como tanto por ciento de
málico, obtenido mediante una valoración ácido-base en el que se utiliza un volumen de
muestra de 5 ml, NaOH 0.1N y fenoftaleína como indicador.
VI.2.2 Niveles de actividad y fenoles en las diferentes fracciones de PPO
Los frutos de níspero se homogenizaron en tampón fosfato 50 mM y en presencia de

ácido ascórbico 10 mM filtrando el homogenizado a través de ocho capas de gasa. El
filtrado se centrífuga a 5000 xg durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se utilizó para
medir la actividad de la fracción soluble de PPO a pH 4.5 y para la determinación de los
fenoles totales. El precipitado (pellet) se trató con Triton X-114 para extraer la PPO
particulada (ver capítulo II). La actividad PPO de ambas fracciones, soluble y particulada,
se determinó usando TBC como sustrato. La actividad PPO de la fracción soluble se medió
a pH 4.5, de la fracción particulada la PPO latente se midió como (actividad a pH 4.5-
actividad a pH 6.0) y la activa a pH 6.0. El contenido total de fenoles se determinó de
acuerdo con el método de Singleton y Rossi (1965), detallado en materiales y métodos del
capitulo II. La cantidad de ácido clorogénico presente en el fruto de níspero se determinó
de acuerdo con el método de Richard y col. (1991). Para ello, la fracción soluble se diluyó
en etanol en una relación 1/1(v/v) y se analizaron 40 µl por HPLC/MS con un gradiente
isocrático 90/10 (v/v) de agua acidificada con fórmico a pH 2.6 y ACN. La recta patrón se
realiza a partir de diferentes concentraciones (0.003 µmol-0.3 µmol) del ácido clorogénico.
VI.2.3. Western blot
VI.2.3.1 Reactivos
Para preparar el tampón 10X TBS, se adicionan 60.55 g de tris y 87.66 g de NaCl
121
y se ajusta el pH a 8.0. A partir de este tampón se prepara el TBS 1X que se utiliza para
preparar las disoluciones de anticuerpo primario y secundario.
Para montar el sandwich para la transferencia se utilizan las siguientes disoluciones:
soluciones tris (g) metanol (ml) SDS (g) agua (ml) pH disolución
ánodo 1 18.17 100 ----- hasta 500 10.4
ánodo 2 1.51 100 ----- hasta 500 10.4
cátodo 1.51 100 2.00 hasta 500 9.40
Tabla 6.1. Preparación del las disoluciones ánodo 1, ánodo2 y cátodo.
Para tratar la membrana después de la transferencia se utilizan las siguientes

disoluciones:
soluciones leche en Igepal Triton TBS 1X Anticuerpo Anticuerpo

polvo(g) 5%(µl) X-100(µl) (ml) primario(µl) secundario (µl)
Bloqueo 1.0 200 --- 20 --- ---
Anticuerpo
0.4 --- 50 20 8.0 ---
primario
Anticuerpo 0.4 --- 50 20 --- 4.0

secundario
Tabla 6.2. Preparación de 20 ml de las disoluciones de bloqueo, anticuerpo primario y

anticuerpo secundario.
VI.2.3.2 Métodos:
VI.2.3.2.1. Obtención del anticuerpo
La obtención del anticuerpo se llevo a cabo en colaboración con el Dr. Ignacio Luque
mediante el siguiente procedimiento: se amplificó por PCR un fragmento interno de polifenol
oxidasa de frutos de níspero utilizando como molde DNA total extraído de hojas de níspero
basado en el método de Zhang y Stewart, (2000) utilizando como cebadores PPO_Ejap_F \
(5´-AATGAATTCCCGACGGCGCGTACGACCAA-3´) y PPO_Ejap_R \
122
(5ĆGTCTAGAGTTAGTCAGTTCTCTTACCTCC-3´) (Invitrogen). A continuación el

producto de la PCR se clonó entre los sitios EcoRI y XbaI del sitio de clonación múltiple del
vector pPROExHtb (Promega, Madison, Wi, USA). La proteína codificada en el fragmento de
DNA de níspero se expresa en este vector como una proteína de fusión que incluye en su zona
amino terminal una cola de seis histidinas. A continuación, los cultivos de E.coli que
contienen el plásmido pPROEX: PPO se indujeron con IPTG a una concentración final de 1
mM durante 3 horas. La proteína recombinante de aproximadamente 27.0 kDa se acumulaba
principalmente en los cuerpos de inclusión, los cuales se aislaron por centrifugación a 8000 x
g, se lavaron con 2X TTBS (40 mM Tris pH 7.5, 1 M NaCl, 0.5% Triton X-100) y con 1X
TTBS (20 mM Tris pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.25% Triton X-100) y se resuspendieron en 50 mM
de Tris pH 7.5, 50 mM de NaCl, 8 M de urea. El fragmento se purificó utilizando una
columna de afinidad His Trap (GE Healthcare). La columna se equilibró con 50 mM Tris pH
7.5, 8M urea, 20 mM imidazol, 0.25% Triton X-100 y 0.2 M NaCl y después se eluyó con un
gradiente lineal de 0-100% del mismo tampón pero con 1 M de imidazol (tampón B) (Figura
6.1A y B). Las fracciones obtenidas se analizaron por SDS-PAGE (figura 6.2 A, B y C). Las
fracciones de proteína purificada (pico obtenido entre 66.0 y 70.5 mL) se juntan y se dializan
contra tampón TBS a 4ºC (figura 6.2C). A continuación la proteína dializada se liofilizó y se
envió a Genosphere Biotechnologies Antibodies services (Paris, Francia) para obtener
anticuerpos mediante inyección en conejos.
1,0
1800 120
B
1600
A
100 0,8
1400
Absorbancia 280 nm
% Imidazol 1M
1200 80
Proteína (mg)
0,6
1000
60
800
0,4
600 40
400
20 0,2
200
0 0
0,0
0 20 40 60 80 100
A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B10 B9
volumen (mL)
66 66,5 67 67,5 68,5 69 69,5 70 70,5
volumen (mL)
Figura 6.1. (A) Purificación de la proteína recombinante de 27 kDa por cromatografía

de afinidad en una columna His Trap. (B) determinación de la proteína de las fracciones
purificadas (desde A8-B9).
123
Figura 6.2. SDS-PAGE de la sobreexpresión de la proteína purificada en E. coli, inducción con IPTG, aislamiento de los cuerpos
de inclusión y purificación mediante cromatografía de afinidad. MW marcadores peso molecular, A; extracto de E .coli sin inducir con
IPTG, B; extracto de E.coli inducidas con IPTG, C cuerpos de inclusión solubilizados aplicados a la columna His Trap, A7, A8, A9, A10,
A11, A12, B12, B11, B10 y B9 fracciones obtenidas de la purificación. Estas fracciones se juntan (D) y se dializan (E). La proteína
dializada se envía para la producción de antisuero.
124
VI.2.3.2.2. Preparación de los extractos proteicos.
Para la extracción de proteínas de las experiencias- desarrollo, post-recolección y

daños mecánicos- se aplicaron dos técnicas secuencialmente: (1) precipitación de proteínas
con TCA/DXC (Granier y Van del Walle, 1988) y (2) aplicando el método basado en la
extracción con fenol, adaptando el protocolo descrito previamente por Wang y col. (2003) con
algunas modificaciones. En algún caso, con la primera técnica de extracción se obtenían
preparaciones aptas para la SDS-PAGE.
En la figura 6.3, se presenta un esquema que resume las diferentes etapas para la
preparación de las muestras de PPO, extracto crudo, fracción soluble y fracción particulada.
Para todas ellas se realiza el primer paso de precipitación con TCA y DXC.
Fracciones PPO: EC, soluble y particulada
Precipitación con TCA/DXC Estadios de

y lavado con acetona 80% Electroforesis
desarrollo
Lavado con acetato de etilo/etanol (1/2)
Lavado TCA 10% acetona
Lavado TCA 10% agua
Lavado Acetona 80%
Extracción y precipitación con

fenol/acetato amónico /metanol
(Protocolo adaptado Wang y col., 2003)
Acetona 80% Estadios de

Electroforesis Electroforesis
desarrollo
Post-recolección
y magullado
Figura 6.3. Esquema de los pasos seguidos para la precipitación de proteínas de cada
una de las fracciones (EC; extracto crudo, S; soluble, P; particulada) para cada uno de los
tratamientos a analizar (desarrollo, post-recolección y magullado).
125
- Precipitación con TCA y DXC (Granier y Van del Walle, 1988).
La muestra de proteína se lleva hasta un volumen final de 750 µl con agua destilada, a
continuación se adicionan 8.5 µl de dexosicolato de sodio 2% (p/v) (Bensadoun y Weinstein,
1975), y se incuban en hielo durante 15 minutos. Pasado este tiempo se adicionan 250 µl de
TCA 24% (p/v) y se deja precipitar en frío durante 30 minutos. A continuación se centrifugan
a 11.000 rpm durante 10 minutos y se decanta el sobrenadante. El precipitado de cada una de
las muestras se lava con acetona fría (-20ºC), se incuba en hielo durante 10 minutos y se
centrifuga a 11000 rpm durante 10 minutos. El lavado con acetona se repite dos veces más.
Para finalizar, el precipitado se deja secar a temperatura ambiente hasta completa sequedad, se
resuspende en 20 µl de tampón de muestra y se calienta a 100ºC durante 3 minutos.
- Extracción y precipitación con fenol/acetato amónico/metanol (Protocolo adaptado

Wang y col., 2003).
El precipitado obtenido después del protocolo anterior se lavó 2 veces de forma

secuencial con 1 ml de acetato de etilo/etanol (1/2) frío (o hasta que el precipitado no
presentara color), 2 veces con 1 ml TCA al 10% en acetona fría, seguidamente 2 veces con 1
ml de TCA 10% en agua, y finalmente 3 veces con 1 ml de acetona al 80%. Cada vez el
precipitado se resuspendió con agitación vigorosa y se centrifugó a 11.000 rpm durante 10
minutos a 4ºC. El precipitado final obtenido se resuspende por completo en 500 µl de tampón
denso (0.7 M sacarosa, 0.1 M KCl, 0.5 M Tris y 50 mM EDTA a pH 7.5) y se le adiciona 500
µl de fenol saturado en tris. La mezcla se agita vigorosamente durante 30 minutos en frío y a
continuación se centrifuga a 14000 rpm durante 15 minutos. La fase fenólica superior se
recoge y se precipita en frío durante toda la noche con 0.1 M de acetato de amonio en metanol
en una relación 1/5 (fenol/acetato). Las proteínas precipitadas se recogieron por
centrifugación a 11000 rpm durante 10 min y se lavaron dos veces con 1 ml de acetato de
amonio en metanol y 3 veces con 1 ml de acetona fría al 80%. El precipitado final se secó y
se resuspendió en el tampón de muestra de electroforesis para SDS-PAGE y se calienta a
100ºC durante 3 minutos.
La muestra dializada del fragmento recombinante que se usó como antígeno, se diluye
directamente con tampón 10 mM Tris pH 7.5, seguidamente se resuspende en el tampón de
muestra para electroforesis SDS-PAGE y se calienta a 100ºC durante 3 minutos.
126
Las muestras así preparadas se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al

12.5% en condiciones desnaturalizantes según el método descrito por Laemmli (1970).
VI.2.3.2.3. Electrotransferencia
Una vez finalizada la electroforesis, se realiza la transferencia de las proteínas del gel
a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) Hybond-P (GE Healthcare). Las
membranas se hidrataron en metanol durante 5-10 segundos, y tras lavar dos veces con H2O
durante 5 minutos, se equilibraron con el tampón ánodo 2. A continuación, se llevó a cabo la
electrotransferencia semi-seca utilizando el sistema Hoefer Semiphor (GE Healthcare),
colocándose secuencialmente sobre el electrodo inferior (ánodo) 2 hojas de papel whatman
impregnados en tampón ánodo 1, 1 hoja de papel whatman impregnado en tampón ánodo 2, la
membrana de PVDF, el gel y tres hojas de papel whatman en tampón cátodo. Se aplicó una
corriente de 0.8 mA por cm2 de membrana (4-8V) durante 1hora.
VI.2.3.2.4. Inmunodetección
Finalizada la transferencia, la membrana se incubó durante 1 hora a 37ºC (o toda la

noche a 4ºC) en agitación en solución de bloqueo. En este paso se neutralizan las áreas de la
membrana carentes de proteína para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos. A
continuación, se incubó durante 1 hora a 37ºC con la solución de anticuerpo primario diluido.
Una vez transcurrido el tiempo, la membrana se lavó tres veces con TBS 1X durante 5
minutos en agitación y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en la solución del
anticuerpo secundario que contiene una dilución 1/10000 de la enzima peroxidasa de rábano.
Finalmente, se lavó con TBS 1X (4 lavados de 5 min) y durante 15 minutos en agua.
Tras los lavados, la membrana se introduce entre dos láminas de plástico transparente
y se añade 512.5 µl de solución ECL Plus (Amersham Biosciences) obtenida de la mezcla de
500 µl de la solución A y 12.5 µl de la solución B y, tras incubar durante 5 minutos en
oscuridad, se retiró el exceso de reactivo y se expusieron las membranas en contacto con
películas de autorradiografía Hyperfilm ECL (Amershan Biosciencies) durante 5-10 min y 1
hora y 30 min. El revelado a través de las películas de autorradiografía se realizó
introduciendo la membrana en el revelador GBX developer/replenisher (Sigma-Aldrich)
durante 2 minutos, seguido de un lavado con agua y, finalmente, se introduce en el fijador
GBX fixer/replenisher (Sigma-Aldrich) durante otros dos minutos. Para una comprobación
del revelado a través de las películas de autorradiografía, las membranas se escanearon con el
127
Typhoon 9410 utilizando las siguientes condiciones: longitud de excitación 457 nm, longitud
de emisión 520 nm BP40, fotomultiplicador 450, 500V y sensibilidad normal.
VI.2.3.2.5. Tinción de las membranas
Para verificar la cantidad de la proteína en cada calle del gel y que la

electrotransferencia había tenido lugar correctamente, las membranas se tiñeron con azul de
Coomassie Brillant Blue R250. En primer lugar la membrana se sumerge en una de disolución
que contiene 0.1% (p/v) de Coomassie R250 y metanol al 50% (v/v) durante 5 minutos en
continua agitación y después se realizan varios cambios con una solución que contiene 50%
metanol (v/v) y 10% de ácido acético (v/v). Tras lavarla con agua durante 5 minutos en
agitación, se deja secar y se escanea.
VI.2.3.2.6. Titulación del antisuero
- Determinación de la cantidad mínima de proteína control y de la dilución del

anticuerpo.
A partir de una concentración 0.25 µg/µl de proteína dializada del fragmento

recombinante, se prepararon diferentes diluciones en tampón 10 mM Tris pH 7.5 para cargar
entre 0.1 pg y 250 ng de proteína por calle en el gel. Tras realizar la electroforesis se procede
a la transferencia e incubación en la solución de bloqueo. A continuación cada membrana se
incuba con una dilución de anticuerpo primario; dilución 1/1000, 1/5000, 1/10000 y 1/20000
y por último se incuban con una dilución 1/10000 de anticuerpo secundario.
La titulación se llevó a cabo con dos anticuerpos diferentes (antisuero 57 terminal y

antisuero 56 no terminal) obtenidos a partir de dos conejos diferentes. Como se muestra en la
figura 6.4, el antisuero 57 terminal es capaz de detectar la proteína control entre 10-50 ng con
una dilución 1/10000, mientras que el antisuero 56 es capaz de detectar la misma
concentración de proteína pero con una dilución 1/20000 (figura 6.5).
Sin embargo, antes de determinar el antisuero y la dilución que sería conveniente, es

necesario probar ambos antisueros con una fracción de PPO. Para ello se seleccionó la
fracción particulada debido a que a partir de esta fracción hemos obtenido una preparación
homogénea de PPO.
128
Exposición 1 hora y 30 minutos
Figura 6.4. Titulación antisuero 57 terminal con diferentes diluciones de antisuero

para diferentes concentraciones de proteína control; (a) 250 ng, (b) 50 ng, (c) 10 ng, (c) 1 ng,
(e) 500 pg, (f) 100 pg, (g) 50 pg, (h) 1 pg, (i) 0.1 pg. Detección en película durante 1 hora y
30 minutos.
129
Exposición 5 minutos Exposición 1 hora y 30 minutos
Figura 6.5. Titulación antisuero 56 terminal con diferentes diluciones de antisuero

para diferentes concentraciones de proteína control; (A) 250 ng, (B) 50 ng, (C) 10 ng, (D) 1
ng, (E) 500 pg, (F) 100 pg, (G) 50 pg, (H) 1pg , (I) 0.1 pg. Detección en película durante 5
minutos (izquierda) y 1 hora y 30 minutos (derecha).
130
- Determinación de la dilución de anticuerpo primario para la fracción particulada de

PPO de níspero.
1125 µl de PPO particulada de una concentración 0.80 µg/µl de proteína se precipitan

con TCA y acetona (Granier y Van del Valle 1988) y se resuspende en 180 µl de tampón de
muestra, obteniéndose una preparación que contiene 5 µg/µl de PPO. A continuación se
realizaron dos geles de acrilamida y en cada uno de ellos se dispusieron diferentes
concentraciones de PPO; 5, 25,50 y 100 µg de proteína. Se realizó por duplicado para obtener
4 geles que se someterán posteriormente a una dilución diferente de anticuerpo primario;
dilución 1/1000, 1/2500, 1/5000 y 1/10000 para el antisuero 57 y dilución 1/1000, 1/5000 y
1/10000 y 1/20000 para el antisuero 56 y por último se incubaron con una dilución 1/10000
de anticuerpo secundario
Exposición 1 horas y 30 minutos
Figura 6.6. Determinación de la cantidad mínima de proteína con diferentes

diluciones de antisuero para diferentes concentraciones de PPO particulada; (a) 5 µg, (b) 25
µg, (c) 50 µg y (d) 100 µg. Detección en película durante 1 hora y 30 minutos.
Como se observa en la figura 6.6 con una dilución de anticuerpo primario 1/10000 la
PPO sólo se detecta para concentraciones elevadas de 100 µg, por ello una dilución
131
aconsejable sería 1/5000 para antisuero 57 terminal, debido a que esta dilución es capaz de
detectar entre 5-100 µg de PPO particulada. Sin embargo el antisuero 56 no terminal parece
más inmunoreactivo con nuestra proteína debido a que es capaz de detectar entre 5-100 µg de
PPO particulada (figura 6.7) con una dilución 1/10000 de antisuero, pero también se observan
diferentes bandas inespecíficas cuando se utilizaron diluciones bajas de anticuerpo. Por esta
razón, la utilización de ambos antisueros sería adecuada en una dilución 1/5000.
Exposición 5 minutos Exposición 1 horas y 30 minutos
Figura 6.7. Determinación de la cantidad mínima de proteína con diferentes

diluciones de antisuero para diferentes concentraciones de PPO particulada; (1) 5 µg, (2) 25
µg, (3) 50 µg y (D) 100 µg. Detección en película durante 5 minutos (izquierda) y 1 hora y 30
minutos (derecha).
132
Resultados y discusión Estudio fisiológico de las polifenol oxidasas de frutos de níspero
VI.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudio de los niveles de PPOs en frutos de níspero
Una vez demostrada la presencia de al menos dos PPOs en el fruto del níspero en base
a sus propiedades moleculares y funcionales, hemos llevado a cabo estudios fisiológicos de la
PPO en extractos crudos y fracciones parcialmente purificadas en las siguientes situaciones:
- Desarrollo, maduración y sobremaduración del fruto
- Post-recolección durante 14 días a temperatura ambiente
- Magullado del fruto

En la figura 6.8 se muestra el esquema de fraccionamiento de los frutos de níspero
para determinar los niveles de PPO soluble y PPO particulada
Extracto crudo
Centrifugación 20000 x g
Sobrenadante 20000 x g Pellet
Saturación 40-85% Separación de fases

(NH4)2SO4 con Triton X-114
PPO soluble PPO particulada
Figura 6.8. Extracción de las diferentes fracciones de PPO; soluble y particulada.
VI.3.1. Evolución de PPO durante el desarrollo y la maduración.
VI.3.1.1. Caracterización del desarrollo y maduración mediante variables

físicoquímicas.
La determinación de las variables fisicoquímicas a lo largo del desarrollo, maduración

y senescencia del níspero en el árbol nos proporcionan una referencia en el momento óptimo
de la cosecha (día 0), en estadios anteriores (días con signo negativo) y posteriores de
133
sobremaduración (días con signo positivo). Como se muestra en la figura 6.9, los diferentes
estadios del fruto del níspero muestran cambios en los parámetros físico-químicos como pH,
conductividad eléctrica, acidez y azúcares totales.
El pH del jugo presenta un mínimo coincidente con el envero y sufre una variación
continua y bastante lineal desde ese momento (aproximadamente día –8) hasta la
sobremaduración (día +18). Consecuentemente el pH del jugo nos puede dar una buena
indicación del estado de la fruta. El pH es una variable de baja dispersión, es decir, su
desviación estándar es baja, en torno al 2-3%. El valor de esta variable en el estado óptimo
(día 0) es 3.18±0.12.
La conductividad también tiene una baja dispersión, pero sus valores en el estadio
óptimo no varían respecto de la sobremaduración, por ello no es una buena variable indicativa
del estado de maduración del níspero. La acidez valorable también tiene baja dispersión y una
variación continua desde el envero a la sobremaduración, aunque el comportamiento de la
variable es más complejo. Una situación similar se observa con los azúcares, donde la
dispersión es alta y el comportamiento complejo. El cociente entre estas dos variables, que
suele emplearse como un índice de madurez (figura 6.10), sigue una tendencia similar. En
conclusión, estas dos variables por separado o combinadas no mejoran las prestaciones del pH
a la hora de indicar el estado en que se encuentra la fruta.
Todos los parámetros, con excepción de la conductividad eléctrica, invierten su

tendencia en el momento del cambio de color, cuando el fruto cambia de verde a amarillo-
naranja, color típico del fruto maduro. El comienzo de la maduración está acompañado de un
incremento drástico de 0.4 unidades del pH y de 3.1% a 4% en el contenido total de azúcares
del jugo. Además, se observa un decrecimiento drástico, de 1.4% a 0.7%, de ácido málico. La
evolución de estos parámetros durante el desarrollo hasta la recogida del fruto es similar a los
obtenidos para la variedad Mogi (Ding y col., 1998a; Ding y col., 2001) y para la variedad
Tanaka (Ding y col., 2001). No hay estudios previos que caracterizan la evolución de estas
variables en periodo de sobremaduración en el árbol.
134
8
A B
7
CONDUCTIVIDAD (mS/cm)
4
6
pH
3
3
2
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30
6,0 1,6
DIA
C D
5,5 1,4
1,2
5,0
1,0
%AZUCAR
%MALICO
4,5
0,8
4,0
0,6
3,5
0,4
3,0
0,2
2,5 0,0
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30
DIA DIA
Figura 6.9. Evaluación de los parámetros físico-químicos del fruto de níspero durante
el desarrollo, maduración y sobremaduración del fruto en el árbol. (A) pH, (B) conductividad
eléctrica, (C) azucares totales y (D) acidez expresada en % de ácido málico.
18
SOLIDOS SOLUBLES/ACIDEZ VALORABLE
16
14
12
10
0
-40 -30 -20 -1 0 0 10 20 30
D ÍA
Figura 6.10. Índice de madurez expresado como el cociente entre los sólidos solubles
y la acidez durante el desarrollo, maduración y sobremaduración del fruto en el árbol.
135
VI.3.1.2 Evolución de los niveles de ácido clorogénico, actividad PPO y bandas

inmunoreactivas
- Fenoles totales y ácido clorogénico
El ácido clorogénico es el sustrato natural de PPO en frutos de Rosáceas (Haruta y

col., 1999) y se ha descrito como el o-difenol más abundante en frutos de níspero en extractos
solubles de siete variedades diferentes en la etapa de recolección (Ding y col., 1998b; Ding y
col., 2001). La presencia de ácido clorogénico también se ha mostrado en frutos de ciruela,
pera y manzanas (Macheix y Fleuriet, 1990). La figura 6.11 muestra el contenido total de
fenoles acumulados en la etapa de desarrollo, maduración y sobremaduración. El contenido de
fenoles crece uniformemente durante todo el periodo de desarrollo del fruto estudiado,
incrementándo 3 veces su concentración en el momento de la recolección. Además puede
observarse que el contenido de polifenoles se mantiene al mismo nivel en frutos
sobremadurados frente a sazón. En frutos de níspero en estadios jóvenes de la variedad Mogi
(Ding y col., 1998) y Tanaka (Ding y col., 2001) se ha descrito un alto contenido de fenoles,
que disminuye durante el desarrollo y aumenta de nuevo dos semanas antes de la recolección
del fruto. Este decrecimiento durante el desarrollo se ha descrito para otros frutos como
manzana (Burda y col., 1990), melocotón (Lee y col., 1990) y uva (Romeyer y col., 1993).
60 40 Ácido clorogénico y fenoles totales (mg/100g pf)

Ácido clorogénico/fenoles totales (%)
50
30
40
30 20
20
10
10
0 0
-40 -20 0 20
DIA
Figura 6.11. Evolución de los fenoles totales (-●-), contenido de ácido clorogénico (-
■-) y porcentaje de ácido clorogénico (-▲-) respecto de los fenoles totales en frutos de
níspero durante el desarrollo, maduración y sobremaduración del fruto en el árbol.
136
Los análisis de HPLC de los extractos solubles de níspero, muestran que el contenido
de ácido clorogénico aumenta significativamente durante la recolección y sobremaduración
del fruto. El porcentaje de ácido clorogénico respecto del contenido total de fenoles se
mantiene bajo y constante (entre un 5-7%) en la última parte del desarrollo del fruto, pero este
porcentaje se incrementa significativamente de 7% a 32% en el momento de la recolección y
se mantiene entre 42-50% durante la sobremaduración del fruto (figura 6.9), observándose
una relación directa del aumento del pH del fruto y la mayor concentración de ácido
clorogénico. Este incremento en el contenido de ácido clorogénico durante la maduración del
fruto es similar a los resultados obtenidos para las variedades Mogi (Ding y col., 2001) y
Tanaka (Ding y col., 2001) donde el porcentaje aumenta significativamente de 13.7% a 52%.
No obstante, otros frutos de la familia de las Rosáceas como la manzana, muestran un
decrecimiento en el contenido de fenoles totales y ácido clorogénico durante el desarrollo
hasta la recolección (CoSeteng y Lee, 1987).
- Actividad PPO activa y latente de fracciones solubles y particuladas
A pesar de que la presencia de actividad de polifenol oxidasa se ha estudiado

ampliamente en frutos y vegetales, son pocos los estudios que muestran la evolución de la
actividad de PPO durante el desarrollo y maduración de los frutos (Chevalier y col., 1999;
Gooding y col., 2001) y lo hacen mediante determinaciones en extractos crudos. En
concordancia con los estudios previos en esta tesis, nosotros hemos separado esta actividad en
dos fracciones; soluble y particulada y, para esta última se ha determinado el nivel de PPO
activa y latente. Como hemos demostrado anteriormente, la forma latente es inactiva a pH 6.0
en ausencia de SDS, por consiguiente los niveles determinados en ausencia de detergente se
deben a formas activas. El seguimiento de los niveles de PPO se ha extendido a frutos
sobremadurados en el árbol, que se recolectaron durante las tres semanas posteriores al
momento óptimo para la recolección, en base a los parámetros físicoquímicos estudiados. Los
resultados obtenidos se muestran en la figura 6.12. Antes de que se produzca el cambio de
color (paso del fruto verde al fruto amarillo-naranja) los niveles de PPO soluble son muy
bajos y a partir del envero aumentan rápidamente, alcanzando el nivel máximo a la recogida
del fruto (día 0), para descender paulatinamente hasta desaparecer a las dos semanas de
sobremaduración. Por su parte, el nivel de actividad de la PPO particulada latente es alto en
frutos verdes y decrece cuando el fruto se desarrolla, probablemente debido a la captación de
agua por el fruto. La etapa de desarrollo estudiada coincide con la fase descrita por Gariglio y
137
col. (2002) de incremento en el tamaño celular debido a la captación de agua por el fruto. En
dicha etapa el fruto triplica su peso, lo cual concuerda con una reducción en los niveles de
PPO particulada latente por peso fresco hasta aproximadamente 1/3. Así, se puede deducir
que los niveles de PPO particulada latente son estáticos en la etapa del aumento del tamaño
celular. Los mínimos niveles de actividad se dan en el cambio de color, produciéndose
después un incremento brusco de actividad, alcanzando los niveles iniciales cuando se recoge
el fruto. Dado que el crecimiento del fruto ya se ha detenido, este incremento en la actividad
debe ser achacado a síntesis de PPO latente. La actividad sigue aumentando hasta alcanzar el
máximo 8 días después del momento óptimo de recolección, para mantenerse estable hasta los
días avanzados de la sobremaduración.
120
100
Unidades/100 g peso fresco
80
60
40
20
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30

Día
Figura 6.12. Evolución de las isoenzimas de PPO durante el desarrollo, maduración y

sobremaduración del fruto. PPO soluble (○), latente (●) y particulada activa (■). La flecha
indica el momento de cambio de color en los frutos de níspero.
Como se ha comprobado en el capítulo anterior los datos comparativos de estas dos

PPOs a nivel molecular nos indican que es muy probable que sean productos del mismo gen,
siendo las formas solubles precursores de la particulada latente. Por tanto la elevación de los
niveles de PPO soluble podrían ser consecuencia de la síntesis de precursores de PPO que al
traslocarse al cloroplasto dan lugar a la forma madura, lo cual podría explicar el aumento de
los niveles de PPO particulada latente y el descenso de los niveles de la soluble.
138
Estos resultados difieren de los obtenidos para la variedad Mogi (Ding y col., 1998b),
en la que la actividad de PPO de una fracción soluble es alta en frutos verdes y decrece
cuando el fruto se desarrolla, alcanzando el mínimo nivel de actividad PPO en la recolección
del fruto. La PPO particulada activa mantiene bajos niveles durante todo el periodo estudiado,
si bien éstos son sensiblemente mayores en frutos verdes.
El incremento del pH del fruto y la acumulación coordinada de polifenoles -y en

particular de ácido clorogénico- y de PPO latente durante la maduración indican una mayor
susceptibilidad del fruto sobremadurado a sufrir procesos de pardeamiento enzimático, que
resultan perjudiciales para la calidad deseada del fruto, en cuanto a sus propiedades
organolépticas. Así pues podemos considerar la sobremaduración como un factor de riesgo
que va en contra de la calidad del producto para su distribución en fresco, y por tanto que ha
de ser controlado por parte de las empresas de manipulación, procesamiento y distribución.
- Análisis de western-blot de bandas inmunoreactivas de PPO
Para estudiar la expresión de proteína de PPO se seleccionaron tres estadios

representativos de los anteriores (figura 6.13); frutos verdes desarrollados (aproximadamente
día -13), frutos en el momento óptimo de la recolección (día 0) y frutos sobremadurados en el
árbol (entre día +8 y +13).
ESTADIOS DEL FRUTO
VERDE RECOLECCIÓN SOBREMADURACIÓN
Figura 6.13. Frutos de níspero en tres estadíos diferentes; frutos verdes desarrollados,
frutos en el momento óptimo de la recolección y frutos en las etapas intermedias de
sobremaduración.
Para cada uno de los estadios se prepararon entre 80-90 ml de extracto crudo
(materiales y métodos capítulo II), se guardaron unas alícuotas de cada estadio y se procedió a
la separación de los extractos crudos en las dos fracciones de PPO soluble y particulada. Para
139
cada estadio se determinó la actividad total medida a pH 4.5 de las tres fracciones (figura
6.14), observando que el perfil de actividad es similar al estudio anterior.
200

150
100
50
0
-20 -10 0 10 20
Día
Figura 6.14. Evolución de la actividad PPO para las diferentes fracciones; extracto
crudo ( ), PPO soluble ( ) y PPO particulada ( ) en tres estadios diferentes: frutos
verdes desarrollados (día -13), frutos en el momento óptimo de la recolección (día 0) y frutos
sobremadurados en el árbol (día 13).
Para una primera aproximación de la expresión a nivel de proteína de diferentes

isoenzimas de PPO durante el desarrollo y maduración de los frutos de níspero se precipitaron
50 y 100 µg de proteína de cada uno de los estadios. Se realizaron dos geles; uno de ellos se
tiñó con Coomassie coloidal (figura 6.15A) como control de las proteínas totales presentes en
los diferentes extractos y el otro se utilizó para realizar el western blot (figura 6.15B).
Como se muestra en la figura 6.15B, se detectaron diferentes bandas inmunoreactivas.

Por un lado, se observan dos bandas con masa molecular aparente de 66.0 y 59.2 kDa
presentes en todos los estadios y una banda de 72.0 kDa específica del fruto verde. Utilizando
un anticuerpo anti PPO de manzana Haruta y col. (1999) pudieron detectar de dos a tres
bandas de PPO mediante western-blot de peso molecular entre 65 kDa y 57 kDa en frutos y
hojas de níspero y otras Rosáceas como pera, melocotón, membrillo y manzana. Nuestros
resultados con un anticuerpo anti-PPO de níspero arroja por tanto resultados similares. La
persistencia de las bandas en todos los estadios del fruto no necesariamente se correlaciona
con la expresión de los genes. Se ha mostrado la expresión de genes de PPO en estadios
140
tempranos de desarrollo de los frutos de albaricoque (Chevalier y col., 1999), uva (Dry y
Robinson, 1994) y manzana (Boss y col., 1995), pero los transcritos no son detectados en
estadios posteriores.
Figura 6.15. SDS-PAGE (A) y western blot (B) de los extractos crudos de níspero en
diferentes estadíos del fruto; verde (V1 y V2), recolección (R1 y R2) y sobremaduración (S1
y S2) para dos concentraciones diferentes; 50 µg de proteína (V1, R1 y S1) y 100 µg de
proteína (V2, R2 y S2).
Otras Rosáceas como el caqui muestran la expresión de genes de PPO en frutos y

hojas en todos los estadios de desarrollo, observándose mayor nivel de expresión de los
transcritos en hojas y frutos maduros (Bahn y col., 1999). Por el contrario, Joy y col. (1995)
han mostrado la expresión de genes de PPO en frutos maduros de Phytolaca americana pero
los transcritos no son detectados en estadios tempranos de desarrollo.
Por otra parte, se observan dos bandas débilmente inmunoreactivas de menor peso
141
molecular: una banda de 40 kDa presente en todos los estadíos y otra menor de 38 kDa
aproximadamente y sólo observada para una concentración de 100 µg de proteína en los
frutos en el momento óptimo de la recolección y sobremadurados en el árbol (figura 6.15). La
detección de bandas de bajo peso molecular se han descrito en extractos de 5 especies
diferentes de Rosáceas, melocotón, almendro, ciruela, cereza y albaricoque mediante western
blot; en los cuales se muestra una banda intensa de 43 kDa, y otra más débil de 63 kDa en
todas las especies, y una banda de 36 kDa específica de la cereza (Fraignier y col., 1995).
Dada la débil inmunoreactividad con el anticuerpo, se procedió a identificar esas

bandas por LC-MS/MS. La banda de masa molecular aparente de 38 kDa, se cortó, procesó
por digestión tríptica en gel y se analizó mediante cromatografía líquida en tándem con
espectrometría de masas. La búsqueda de espectros por MS/MS y secuenciación de novo, se
muestra en la tabla 6.3 donde se observa que los péptidos obtenidos solapan exclusivamente
con la PPO2 de manzana y por lo tanto, esta PPO es un producto del mismo gen que codifica
para la PPO P1 de níspero. La presencia de intrones se ha descrito recientemente para la PPO
de frutos de banana (Gooding y col., 2001) y piña (Stewart y col., 2001). Sin embargo, las
PPOs de Rosáceas, las cuales presentan mayor homología de secuencia con la PPO1 de
níspero, como PPO 2 de manzana (Kim y col., 2001) y PPO de albaricoque (Chevalier y col.,
1999) carecen de intrones. Por lo tanto, se podría descartar la posibilidad de que sea una
variante de procesamiento alternativo.
Malus domestica (MALDO) PPO EC (38 kDa) Eriobotrya japonica
Péptidos MH+ Péptidos MH+ Score % CS
(R)DPLFYSHHSNVDR 1586.7 DPLFYSHHSNVDR 1586.7 19.2

(K)FDVYVNDDAESLAGK 1642.8 1
[FD]VYVNDDADSLA[GK]1 1628.8 186 8.3
(K)GIEFAGNEPVK 1
1160.6 [GI]EFAGNETVK 1164.7 173
Tabla 6.3. Péptidos obtenidos por MS/MS y secuenciación de novo para la banda de
38 kDa del extracto crudo.1Fragmento no interpretado por Sherenga pero si interpretado por
coincidencia de masas de dipéptidos ó tripéptidos con secuencia adyacente en MALDO.
Los resultados obtenidos, sugieren que la PPO P1 (banda de 59.2 kDa) en el extracto
crudo sufre degradación proteolítica parcial, produciendo la banda de 38 kDa en estadíos de
recolección y sobremaduración del fruto. Dado que nuestros experimentos de proteolisis
142
parcial con tripsina muestran una activación a pHs altos, es probable que la proteolisis en el
fruto sobremadurado contribuya a la mayor susceptibilidad del fruto a sufrir procesos de
pardeamiento enzimático en estos estadios.
Para correlacionar la actividad de PPO soluble, particulada latente y activa con bandas
inmunoreactivas, se realizó un fraccionamiento de los extractos en las fracciones soluble y
particulada. La preparación de las muestras se realizó con un protocolo más complejo
adaptado de Wang y col. (2003) con algunas modificaciones (figura 6.3). En estas
experiencias las bandas de aproximadamente 38-40 kDa no son detectadas en los extractos
crudos, probablemente por la limpieza exhaustiva de la muestra que da lugar a una
preparación con una concentración de proteína por debajo del umbral de detección con el
anticuerpo.
La figura 6.16 muestra el western-blot cargando las diferentes fracciones (extracto

crudo, soluble y particulada) en los diferentes estadios del fruto.
Figura 6.16.Western blot de las diferentes fracciones de PPO para el estadio verde,
recolección y sobremaduración de las diferentes fracciones: extracto crudo (EC), fracción
soluble (S) y fracción particulada (P).
143
Como puede observarse, el protocolo de extracción con fenol no altera la presencia de

las tres bandas en el estadio verde y las dos bandas en los estadios de recolección y
sobremaduración para el extracto crudo. Además la banda de masa molecular de
aproximadamente 66 kDa esta presente en todas las fracciones para los tres estadios. Esta
banda se analizó anteriormente en el estadio de recolección y resulta ser mezcla de dos
isoenzimas en la fracción soluble, una homóloga con la PPO de albaricoque y otra con PPO 2
de manzana, esta última como precursor de la banda de 59.2 kDa, mientras que en la fracción
particulada mostró alta homología con la PPO de albaricoque. Los ensayos inmunológicos en
extractos crudos de PPO de albaricoque muestran la expresión a nivel de proteína de una PPO
de 63 kDa a lo largo de seis estadios de desarrollo del fruto; desde fruto verde a fruto sobre
madurado (Chevalier y col., 1999). Estos autores mostraron que aunque los transcritos del gen
PA-PPO sólo se detectan en los frutos verdes la ratio de proteína PPO/proteína total
permanece constante a lo largo de la maduración del fruto indicando una elevada estabilidad
de la proteína in vivo. Nuestros resultados corroboran la estabilidad de esta banda también en
níspero. Por otra parte, la desaparición de la banda de 59.2 kDa en la fracción soluble del
fruto verde (probablemente acompañada por la desaparición del precursor de 66 kDa) es
coincidente con la escasa actividad de la fracción soluble en este estadio. Su reaparición en
los estadios de recolección y sobremaduración va acompañada del aumento de actividad en la
fracción soluble. Estos resultados sugieren que la PPO de níspero homóloga a PPO2 de
manzana se sintetiza de nuevo durante la etapa de maduración del fruto, sufriendo
acumulación transitoria en la fracción soluble y definitiva en la fracción particulada. Sin
embargo, la expresión de la banda de 72 kDa en el extracto crudo verde, y su completa
desaparición en la fracción soluble y particulada, se podría explicar por la limpieza exhaustiva
de la muestra que da lugar a una preparación con una concentración de proteína por debajo
del umbral de detección con el anticuerpo.
Las experiencias realizadas a lo largo del desarrollo muestran la presencia de tres

isoenzimas de PPO; PPO P1 de 59.2 kDa, que se acumula mayoritariamente durante la
maduración, PPO P2 de 66.0 kDa presente durante todas las etapas de desarrollo, maduración
y sobremaduración del fruto y otra isoenzima específica de los frutos verdes desarrollados de
72 kDa.
144
VI.3.2. Evolución de PPO durante la post-recolección
- Aspecto visual de los frutos
La figura 6.17 muestra el estado del fruto recolectado el día 0 (control) y tras ser
mantenido durante 7, 10 y 14 días a temperatura ambiente. Al final del tratamiento se apreció
una considerable deshidratación del fruto, por ello los datos referidos a peso de tejido se
corrigen con un factor de deshidratación, obtenido mediante la determinación de la pérdida de
peso del fruto por día transcurrido.
POST-RECOLECCIÓN
CONTROL 7 DÍAS 10 DÍAS 14 DÍAS
Figura 6.17. Frutos control y frutos mantenidos durante 7, 10 y 14 días a temperatura

ambiente.
La distribución de actividad total de PPO por fracciones en el fruto recién recolectado

se muestra en la figura 6.18, donde podemos apreciar que la fracción particulada latente es la
mayoritaria, representando alrededor de un 80%, seguida por la soluble con cerca de un 20%.
100
80
Actividad PPO (%)
60
40
20
0
A B C
Figura 6.18. Distribución de PPO de níspero por fracciones. (A) PPO particulada
latente, (B) PPO soluble y (C) PPO particulada activa.
Como se observa en la figura 6.19, en el extracto crudo la proteína total es

prácticamente constante a lo largo del tratamiento, sin embargo la actividad PPO sufre una
reducción de un 44% a los 7 días que se recupera al final del tratamiento.
145
250 250
Proteina (mg)/100g peso fresco

200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
control 7 días 10 días 14 días
Figura 6.19. Actividad PPO ( ) y proteína total ( ) en los extractos crudos en

frutos recién recolectados (control) y frutos mantenidos durante 14 días a temperatura
ambiente.
- Actividad PPO activa y latente de fracciones solubles y particuladas
En la figura 6.20, se muestra la evolución de cada fracción de PPO tras la recolección.

La actividad PPO soluble disminuye bruscamente a los 7 días de haberse recolectado los
frutos, quedando sólo un 10% de la actividad del fruto recién recolectado, para aumentar de
forma continua a partir de los 10 días, alcanzando al final del tratamiento una actividad 2.3
veces mayor respecto de la actividad inicial para esta fracción. De la misma forma, se observa
una disminución brusca para la PPO particulada latente a los siete días de haberse recolectado
el fruto, quedando a ese nivel de 27% de la actividad inicial hasta los 14 días. En la actividad
de PPO particulada activa se observa un leve aumento a los 7 días que continúa a los diez
días, llegando a alcanzar 50 veces más de actividad de esta fracción a los 14 días, siendo
entonces la más abundante de todas las PPOs. Esta evolución invertida de las formas
particulada latente y activa van acompañadas de una disminución paulatina de la activación de
la PPO latente (figura 6.21) hasta prácticamente una pérdida total de activación (sólo se activa
1.5 veces, 2% respecto al control) a los 14 días. Esta pérdida de activación en la PPO latente
va acompañada de una ligera activación en la PPO soluble a partir de los 7 días, que podría
deberse a la transferencia de PPO particulada latente a la fracción soluble. Como podemos
observar, las distintas fracciones de PPO evolucionan de manera muy distinta a como lo hacen
durante la sobremaduración en el árbol, de modo que al arrancar el fruto, dicha evolución
queda interrumpida, especialmente para la latente durante los primeros siete días, a partir de
los cuales las otras fracciones inician un nuevo patrón de evolución.
146
140
120
Unidades/100g peso fresco

100
80
60
40
20
Figura 6.20. Evolución de los niveles de actividad de PPO en frutos recién

recolectados (control) y después 7, 10 y 14 días de mantener los frutos de níspero a
temperatura ambiente. PPO soluble (○), latente (●) y particulada activa (■).
80 2,0
Activación PPO particulada latente
Activación PPO soluble

60 1,5
40 1,0
20 0,5
0 0,0
Figura 6.21. Activación de la PPO particulada latente ( ) y de la PPO soluble (

) en frutos recién recolectados (control) y después 7,10 y 14 días de mantener los frutos
de níspero a temperatura ambiente.
-Análisis de western blot de bandas inmunoreactivas de PPO
La PPO latente purificada muestra una banda única de 59.2 kDa en el momento
óptimo de la recolección. Como se muestra en la figura 6.22 (y también en la figura 5.3
capítulo V) el anticuerpo reconoce dos bandas en la fracción particulada (59.2 y 66.0 kDa) y
de dos a tres en la soluble (59.2, 62.0 y 66.0 kDa) siendo la banda de 62.0 kDa minoritaria.
147
Las bandas de mayor peso molecular pueden corresponder bien a otras isoenzimas de PPO o a
precursores de PPO latente madura.
Figura 6.22. Western blot de las fracciones soluble y particulada (100 µg de proteína)
usando anti-PPO (dilución 1/5000) en condiciones de post-recolección durante 14 días a
temperatura ambiente.
Por una parte, en la fracción soluble lo mas significativo es una paulatina desaparición
de las bandas de 66.0 kDa y especialmente de la de 59.2 kDa y, a partir de los 10 días, la
aparición de una banda de unos 38 kDa, muy patente a los 14 días, quizás resultante una
degradación proteolítica parcial de la fracción particulada o soluble. Para determinar su
origen, la banda de 38 kDa se cortó, procesó por digestión tríptica en gel y se analizó
mediante cromatografía líquida en tándem con espectroscopia de masas. Los resultados de la
búsqueda de espectros por MS/MS y secuenciación de novo, se muestra en la tabla 6.4 donde
se muestra que esta PPO es un producto del mismo gen que codifica para la PPO P1 de
níspero pues los péptidos encontrados son exclusivos respecto de los de PPO 2 de manzana.
148
Por lo tanto proceden de la proteolisis de la PPO latente de 59.2 kDa o de sus precursores, lo
cual es consistente con la casi total desaparición de esta banda a los 14 días.
Por su parte en la fracción particulada, se observa la aparición de una nueva banda de
72 kDa a los 14 días del tratamiento, donde los frutos muestran claramente síntomas de
pardeamiento enzimático. Boss y col. (1995) han descrito la expresión de transcritos de PPO
en piel de manzana a los 14 días de mantener los frutos a 20ºC, los cuales se habían expuesto
previamente 24 semanas a 0ºC y mostraban manchas marrones características del desorden de
post-recolección denominado escaldado superficial (Ingle y Dsonza, 1989). Por tanto hay
evidencias de síntesis de novo de formas de PPO tras largos periodos de post-recolección.
Aunque especulativa, es atractiva la hipótesis de que esa banda de alto Pm sea la responsable
de la PPO activa particulada, pues también aparece en frutos verdes donde la PPO particulada
activa está a niveles significativos (ver figura 6.12). Serían necesarios futuros estudios
moleculares para esclarecer este aspecto.
Malus domestica (MALDO) PPO SPH (38 kDa) Eriobotrya japonica
%
Péptidos MH+ Péptidos MH+ Score
CS

6.7
1 1
(K)LLDLNYGGTDDDVDDATR 1967.9 [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR] 1998.1 194
38 kDa de la fracción soluble a los 14 días después de la recolección (PPO SPH). 1Fragmento
no interpretado por Sherenga pero si interpretado por coincidencia de masas de dipéptidos ó
tripéptidos con secuencia adyacente en MALDO.
VI.3.3. Evolución de PPO tras el magullado de los frutos
- Aspecto visual de los frutos
Las experiencias anteriores nos han mostrado el potencial del fruto en distintos estados
fisiológicos para sufrir pardeamiento enzimático. En esta última experiencia vamos a estudiar
la evolución de la enzima cuando el fruto ha sufrido realmente un daño mecánico y se
manifiestan las magulladuras.
149
La magulladura se produce por golpeo del fruto intacto con una esfera de 50 g en caída
libre desde una altura de 20 cm. Cada fruto es golpeado en 4 puntos ecuatoriales para que la
magulladura afecte a la mayor parte de la pulpa. El estado de los frutos a diferentes tiempos
después del golpe, puede observarse en la siguiente figura 6.23.
MAGULLADO
MAGULLADO
CONTROL 24 HORAS HORAS

48 144 HORAS
CONTROL 24 HORAS 48 HORAS 144 HORAS
Figura 6.23. Frutos control y después de 24, 48 y 144 horas de magullar el fruto a
Para cada uno de los tratamientos se preparó el extracto crudo donde se midió la
actividad de PPO y proteína total. En la figura 6.24 se observa que el extracto crudo sufre una
disminución de un 50% de la actividad PPO en las primeras horas de producirse el daño,
recuperándose un nivel de actividad similar a los frutos recién recolectados transcurridas 144
horas. La proteína total permanece prácticamente constante durante todo el tratamiento.
250 300
Proteína (mg)/100 g peso fresco
250
200
Unidades/ 100 g peso fresco
200
150
150
100
100
50
50
0 0
control 24 horas 48 horas 144 horas
Figura 6.24. Actividad PPO ( ) y proteína total ( ) en los extractos crudos

en frutos recién recolectados (control) y después de 24, 48 y 144 horas de magullar el fruto a
150
- Actividad de PPO activa y latente en fracciones solubles y particuladas
La evolución de actividad PPO por fracciones se muestra en la figura 6.25, cuya

tendencia difiere para las tres fracciones de estudio. Se observa una clara disminución de la
actividad PPO latente en las primeras horas alcanzando una actividad residual del 22.3%
aproximadamente a partir de las 48 horas del daño mecánico. A la vez, la fracción soluble ve
incrementados ligeramente los niveles de actividad hasta las 48 horas de haber golpeado el
fruto y aumenta significativamente a las 144 horas del daño mecánico, obteniéndose unas 6.5
veces más de actividad que la fracción control. Por otra parte, no hay indicios de PPO
particulada activa en todo el periodo de magullado estudiado. La pérdida de actividad
particulada latente y el aumento de actividad en la PPO soluble podrían explicarse por la
transferencia de PPO de la fracción particulada a la soluble aunque no se detecta
significativamente PPO latente. La ausencia de latencia en la fracción soluble (figura 6.26)
puede explicarse por una previa activación de esta fracción como consecuencia del choque
ácido debido a la desintegración celular que ocurre a consecuencia del magullado. La
activación irreversible de PPO por la exposición a pHs ácidos es un fenómeno bien
establecido (Kenten, 1957; Kanade y col., 2006). Estos resultados sugieren que el grado de
pardeamiento del fruto se correlaciona con la actividad soluble, la cual puede incrementarse a
raíz de la solubilización de la particulada latente, que quedaría activada por choque ácido.
160
140
Unidades/100g peso fresco
120
100
80
60
40
20
-20
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo (horas)
Figura 6.25. Evolución de los niveles de actividad de PPO en frutos recién

recolectados (control) y después de 24, 48 y 144 horas de magullar el fruto a temperatura
ambiente. PPO soluble (○), latente (●) y particulada activa (■).
151
80 2,0
Activación PPO particulada latente
Activación PPO soluble

60 1,5
40 1,0
20 0,5
0 0,0
control 24 horas 48 horas 144 horas
Figura 6.26. Activación de la PPO particulada latente ( ) y de la PPO soluble (

) en frutos recién recolectados (control) y transcurridas 24, 48 y 144 horas del daño
mecánico.
- Análisis de western blot de bandas inmunoreactivas de PPO
En el experimento de magullado (figura 6.27) la banda de 66.0 kDa está presente

durante el tratamiento para la fracción particulada, mientras que respecto de ella, la banda de
59.2 kDa disminuye a partir de las 48 horas, observándose una pérdida casi completa a las
144 horas, consistente con la caída de actividad de la PPO particulada latente. Por el
contrario, en la fracción soluble la banda de 59.2 kDa aumenta en relación a la de 66.0 kDa
sugiriendo una transferencia de la banda de 59.2 kDa de la fracción particulada a la soluble. A
partir de las 48 horas aparece una banda de 44 kDa en la fracción soluble que se intensifica a
las 144 horas y que podría proceder de la degradación proteolítica de bandas de mayor peso
molecular. Estos resultados son consistentes con el aumento significativo de actividad en la
fracción soluble a tiempos largos (Figura 6.25). Para determinar su origen, la banda de 44 kDa
se procesó para el análisis parcial de su secuencia por MS. La tabla 6.5 muestra la secuencia
de los péptidos identificados y como en el caso de la banda de 38 kDa, esta PPO es un
producto del mismo gen que codifica para la PPO P1 de níspero pues los péptidos
encontrados son exclusivos respecto de los de PPO 2 de manzana. Por tanto podemos
asegurar que esta banda es un producto proteolítico de PPO P1.
152
Figura 6.27. Western blot de las fracciones soluble y particulada (100 µg de proteína)
usando anti-PPO (dilución 1/5000) en frutos magullados mantenidos hasta 144 horas.
La mayoría de los estudios de pardeamiento descritos en la bibliografía se han

realizado a nivel de transcritos (Thipyapong y col., 1997; Thipyapong y Steffens, 1997;
Thigesen y col., 1995) y muy pocos a nivel de proteína (Wang y Constabel, 2003). En frutos
se ha descrito la acumulación de mRNA de PPO inducida por daño mecánico en manzana,
piña y kiwi (Boss y col., 1995; Bahn y col., 1999; Stewart y col., 2001). Sin embargo la
expresión del mRNA del gen MD-PPO2 -que codifica la proteína que comparte la mayor
homología con la PPO de 59.2 kDa de frutos de níspero-, no se vio incrementada como
consecuencia del daño mecánico originado en el fruto. Estos resultados son coherentes con los
obtenidos en fruto de níspero para la PPO de 59.2 kDa que no ve incrementada su expresión
después de 144 horas de producir el daño mecánico. Nuestros resultados son explicables sin
considerar la síntesis de esta banda por causa del magullado, sino más bien por cambios en su
localización subcelular y su integridad molecular. Estos resultados sugieren que la respuesta
de defensa demostrada en otras especies por un incremento en la actividad de PPO no esta
153
presente en frutos de níspero. Otros frutos como la banana (Gooding y col., 2001) tampoco
exhiben una respuesta de defensa ya que la actividad de PPO en piel y pulpa no incrementa
significativamente después de 72 horas de producir el daño mecánico.
Malus domestica (MALDO) PPO SM (44 kDa) Eriobotrya japonica
%
Péptidos MH+ Péptidos MH+ Score
CS

6.7
1
(K)LLDLNYGGTDDDVDDATR 1967.9 [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR]1 1998.1 277
44 kDa de la fracción soluble en frutos magullados mantenidos hasta 144 horas (PPO SM).
1
Fragmento no interpretado por Sherenga pero si interpretado por coincidencia de masas de
dipéptidos ó tripéptidos con secuencia adyacente en MALDO.
154
.
Conclusiones
Conclusiones
Del trabajo que se ha realizado se han obtenido las siguientes conclusiones:
1. Nuestro protocolo de extracción ha permitido determinar la presencia de PPO en

dos extractos proteicos diferentes (soluble y particulada). La fracción soluble, que
representa un 20% de la actividad de PPO, se ha purificado parcialmente 3.3 veces
con una recuperación del 16.7%. La fracción particulada, que representa el 80%
restante de la actividad PPO, se ha purificado a homogeneidad 39.9 veces con una
recuperación del 15.3% después de ser extraída de la membrana con Triton X-114
y purificada mediante técnicas cromatográficas.
2. La caracterización cinética de ambas fracciones aportan evidencias de que ambas

fracciones pueden ser diferentes formas de PPO. La principal diferencia es que la
fracción soluble se encuentra en estado activo, pues es insensible al tratamiento
con SDS, mientras que la mayor parte de la fracción particulada se encuentra en
estado latente.
3. La PPO latente es un monómero de 59.2 kDa cuyo amino terminal (13 restos)
presenta una alta homología con el amino terminal de la polifenol oxidasa 2
madura de manzana (Acc. 14194273).
4. El estudio de los diferentes agentes activantes sobre las propiedades estructurales

y funcionales de la fracción latente pura nos llevan a las siguientes conclusiones:
- El efecto del SDS en el perfil de pH y la fluorescencia intrínseca de la

polifenol oxidasa latente pura nos ha permitido exponer una hipótesis que sugiere
que la regulación de la actividad de la enzima está basada en la unión de un
anfifilo aniónico que induce un cambio conformacional de la proteína que lleva a
un desplazamiento alcalino del perfil de pH.
- La PPO latente muestra un mecanismo cinético complejo de cooperatividad

en el que la naturaleza del sustrato y el pH influyen directamente. Además, la
eficacia catalítica de la enzima se incrementa considerable cuando se proteoliza
con tripsina.
- Los detergentes aniónicos activan la PPO a pH mayor de 4.5 a concentración

mayor de su cmc y la inhiben a pH menor de 4.5 a concentración menor de su cmc
Además, se ha demostrado que los ácidos grasos insaturados de 18 carbonos son
155
Conclusiones
inhibidores de PPO de frutos de níspero a pH ácido, con especial énfasis en el

ácido linolenico, triinsaturado, frente a los ácidos grasos oleico y linoleico, mono
y diinsaturados respectivamente.
- La PPO latente puede incorporarse a micelas de SDS formando una micela

mixta compuesta aproximadamente por 150 moléculas de detergente y una de
PPO. Sin embargo, la proteolisis de la enzima por tripsina elimina la capacidad de
la PPO de unirse a las micelas de SDS y supuestamente a las membranas cargadas
negativamente.
5. La combinación de western-blot y la cromatografía líquida acoplada a

espectrometría de masas/masas (LC-MS/MS) ha demostrado la presencia de dos
parálogos de PPO cuyos productos proteicos están en el fruto de níspero en el
estadío de recolección, uno homólogo a PPO 2 de Malus domestica (Acc.
14194273) y otro homólogo a PPO de Prunus armeniaca (Acc. 3282505).
Además, se ha obtenido otro parálogo de PPO, homólogo a PPO de Pyrus
Pyrifolia (Acc. 15487290), cuyo polipéptido no se encuentra en frutos en el
momento de la recolección. La PPO latente es el producto del gen homólogo al de
PPO 2 de manzana y la PPO soluble son formas inmaduras de la PPO latente.
6. El estudio fisiológico de la polifenol oxidasa en frutos de níspero nos llevan a las

siguientes conclusiones:
- La PPO latente (59.2 kDa) es una enzima persistente durante el desarrollo del
fruto con periodos de inducción de síntesis en la maduración, que dan lugar a una
acumulación transitoria en la fracción soluble y definitiva en la fracción
particulada. Por su parte, los niveles significativos de PPO particulada activa en
frutos verdes, se podrían explicar por la presencia de una banda de 72.0 kDa
específica de este estadío.
- El magullado y largos periodos de post-recolección de los frutos provocan

cambios en la localización subcelular de la PPO latente (59.2 kDa) y en su
integridad molecular, que coinciden con la transferencia de la PPO de la fracción
particulada a la soluble y la aparición en la fracción soluble de dos productos
proteolíticos procedentes de la banda de 59.2 kDa. Además, el tratamiento de post-
156
Conclusiones
recolección muestra la expresión de una banda de 72 kDa que podría explicar el

aumento de la PPO particulada activa.
- La degradación proteolítica de la PPO latente (59.2 kDa) observada en frutos

sobremadurados en el árbol, después de largos periodos de post-recolección o tras
someter al fruto a daños mecánicos, sugieren que la PPO latente puede estar
relacionada directamente con procesos fisiológicos que manifiestan el
pardeamiento enzimático en frutos de níspero.
157
Bibliografía
Bibliografía
Agustí, M., Almela, V., Andreu, I., Juan, M. and Zacarías, L. 1999. Synthetic
auxin 3,5,6-TPA promotes fruit development and climateric in Prunus persica L. Bastsch. J.
Hort. Sci. Biotechnol. 74:556-560.
Agustí, M., Juan, M., Almela, V., Andreu, I. and Speroni, C. 1997. Estímulo del
desarrollo de los frutos de hueso. Serie Divulgaciò Técnica Nº 38. Generalitat Valenciana.
Consellería de Agricultura, pesca y alimentación.
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang J., Zhang, Z., Miller, W. and
Lipman, D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
Amiot, M., Tacchini, M., Aubert, S. and Nicolas, J. 1992. Phenolic composition and
browning susceptibility of various apple cultivars at maturity. J. Food Sci. 57:958-962.
Amiot, M., Tacchini, M., Aubert, S. and Oleszek, W. 1995. Influence of cultivar,
maturity stage, and storage conditions on phenolic composition and enenzymatic browning in
pear fruits. J. Agric. Food Chem. 43:1132-1137.
Anderson, J.A. and Morris, C.F. 2003. Purification and analysis of wheat grain
polyphenol oxidase (PPO) protein. Cereal Chem. 80:135-143.
Applied Biosystems. Proteins electrotransferred onto polyvinylidene difluoride
(PVDF) membranes were subjected to N-terminal amino acid sequencing using standard
methods with an Applied Biosystems Procise 494 sequencer.
Ardila, H. and Higuera, B.L. 2005. Polyphenol oxidase and beta-1-3-glucanase
differential induction in carnation (Dianthus caryophyllus) infected by Fusarium oxysporum f.
sp. Dianthi race 2. Acta Biol. Colomb. 10:61-74.
Ashie, I.N.A., Simpson, B.K. and Smith, J.P. 1996. Mechanisms for controlling
enzymatic reactions in foods. Crit. Rev. Food Sci. Nut. 36:1-30.
Bachem, C.W.B., Speckmann, G.J., Verheggen, F.T.M., Hunt, M.D., Steffens,
J.C. and Zabeau, M. 1994. Antisense expression of polyphenol oxidase genes inhibits
enzymatic browning in potato tubers. Nat. Biotechnol. 12:1101-1105.
Bahn, S.C., Chung, Y.S., Shin, J.S., Lee, C.H. and Hyung, N.I. 1999.
Characterization of PPO (polyphenol oxidase) cDNA in sweet persimmon (Diospyros kaki). J.
Plant. Biol. 42:16-22.
Benjamin, N.O. and Montgomery, M. 1973. Polyphenol oxidase of Royal Ann
cherries: purificattion and characterization. J. Food Sci. 38:799-806.
158
Bibliografía
Bensadoun, A. and Weinstein, D. 1975. Assay of proteins in the presence of

interfering materials. Anal. Biochem. 70:241-250.
Billaud, C., Maraschin, C., Y. Chow, N., Chériot, S., Peyrat-Maillard, M.N. and
Nicolas, J. 2005. Maillard reaction products as natural antibrowning agents in fruit and
vegetable technology. Mol. Nutr. Food Res. 49:656-662.
Bordier, C. 1981. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114
solution. J. Bio. Chem. 256:1604-1607.
Boss, P.K., Gardner, R.C., Janssen, B.J. and Ross, G.S. 1995. An apple polyphenol
oxidase cDNA is up-regulated in wounded tissues. Plant Mol. Biol. 27:429-433.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem.
72:248-254.
Bricker, T.M., Prevost, M.V.V., Laborde, S., Womack, J. and Frankel, L.K. 2001.
Isolation of lumenal proteins from spinach thylakoid membranes by Triton X-114 phase
partitioning. Biochim. Biophys. Acta. 1503:350-356.
Bru, R., Sánchez-Ferrer, A. and García-Carmona, F. 1990. The effect of substrate
partitioning on the kinetics of enzymes acting in reverse micelles. Biochem. J. 268:679-684.
Bru, R., Sánchez-Ferrer, A., Pérez- Gilabert, M., López-Nicolás, J. and García-
Carmona, F. 1995. Plant protein purification using cloud point extraction (CPE). In:
Surfactants in solution, Chattopadhyay, A. and Mittal, K. (Eds). Marcel Dekker, Inc. New
York pp 367-377.
Burda, S., Oleszek, W. and Lee, C.Y. 1990. Phenolic compounds and their changes
in apple maturation and cold storage. J. Agric. Food Chem. 38: 945-948.
Caballero, P. 1993. El níspero y su expansión, posibilidades y limitaciones.
Fruticultura profesional 54:35-40.
Cabanes, J., García-Canovas, F. and García-Carmona, F. 1987. Chemical an
enzymatic oxidation of 4-methylcatechol in the presence and the absence of L-serine.
Spectrophotometric determination of intermediates. Biochim. Biophys. Acta. 912:190-197.
Cai, Y., Caffney, H.G., Lilley, T.H., Magnolato, D., Martin, R., Spencer, C.M.
and Haslam, E. 1990. Polyphenol interactions. Part 4. Model studies with caffeine and
cyclodextrins. J. Agric. Food Chem. 2:2197-2209.
159
Bibliografía
Cary, J.W., Lax, A.R. and Flurkey, W.H. 1992. Cloning and characterisation of
cDNAs coding for Vicia faba polyphenol oxidase. Plant Mol. Biol. 20:245-253.
Casado-Vela, J., Sellés, S., and Bru, R. 2005. Proteomic approach to blossom-end
rot in tomato fruits (Lycopersicon esculentum M.). Proteomics 5:2488-2496.
Casado-Vela, J., Sellés, S., Gómez-Lucas, I. and Bru, R. 2003a. A correlation study
of loquat (Eriobotrya japonica cv. Algerie) fruit quality parameters: Flesh firmness and
purple spotting. Options Mediterranees, Serie A: Seminaires Mediterranees 58:187-190.
Casado-Vela, J., Sellés, S., Gómez-Lucas, I. and Bru, R. 2003b. Evolution of
phenolics and polyphenol oxidase isoenzymes in relation to physical-chemical parameters
during loquat (Eriobotrya japonica cv. Algerie) fruit developement and ripening. Options
Mediterranees, Serie A: Seminaires Mediterranees. 58:161-164.
Casado-Vela, J., Sellés, S. and Bru, R. 2005. Purification and kinetic
characterization of polyphenol oxidase (PPO) from tomato fruits (Lycopersicon esculentum
cv. Muchamiel). J. Food Biochem. 29: 381-401.
Casado-Vela, J., Sellés, S. and Bru, R. 2006. Influence of developmental stage,
cultivar, and hexapeptide and cyclodextrin inhibitors on polyphenol oxidase activity from
tomato fruits. J. Food Biochem. 30:623-640.
Casado-Vela, J., Sellés, S. and Bru, R. 2006. Proteomic analysis of tobacco mosaic
virus-infected tomato (Lycopersicon esculentum M.) fruits and detection of viral coat protein.
Proteomics 6: S-196-S-206.
Castresana, J. 2000. Selection of conserved blocks from multiple alignements for
their use in phylogenetic analysis. Mol. Biol. Evol. 17:540-552.
Chattopadhyay, A. and London, E. 1984. Fluorimetric determination of critical
micelle concentration avoiding interference from detergent charge. Anal. Biochem. 139:408-
412.
Chazarra, S., Cabanes, J., Escribano, J. and García-Carmona, F. 1996. Partial
purification and characterization of latent polyphenol oxidase in iceberg lettuce (Latuca sativa
L.). J. Agric. Food Chem. 44:984-988.
Chazarra, S., García-Carmona, F., and Cabanes, J. 2001. Hysteresis and positive
cooperativity of iceberg lettuce polyphenol oxidase. Biochem Biophys. Res. Comun. 289:769-
775.
160
Bibliografía
Chazarra, S., García-Carmona, F. and Cabanes, J. 2001. Evidence for a tetrameric

form of iceberg lettuce (Latuca sativa) polyphenol oxidase: purification and characterization.
J. Agric. Food Chem. 49: 4870-4875
Chen, L., Berenbaum, M., Zangerl, A. and Engeseth, N. 2000. Honeys from
different floral sources as inhibitors of enzymatic browning in fruit and vegetable
homogenates. J. Agric. Food Chem. 48:4997-5000.
Chevalier, T., De Rigal, D., Mbeguié, D., Gauillard, F., Richard-Forget, F. and
Lycaon, F.R.B. 1999. Molecular cloning and characterization of apricot fruit polyphenol
oxidase. Plant Physiol. 119:1261-1269.
Cheynier, V. and Ricardo da Silva, J.M. 1991. Oxidation of grape procyanidins in
model solutions containing trans-caffeoyltartaric acid and polyphenol oxidase. J. Agric. Food
Chem. 39:1047-1049.
Constabel, C., Bergey, D. and Ryan, C. 2002. Systemin activates synthesis of
wound-inducible tomato leaf polyphenol oxidase via the octadecanoid defense signaling
pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 92:407-411.
CoSeteng, M.Y. and Lee, C.Y. 1987. Changes in apple polyphenol oxidase and
polyphenol concentrations in relation to degree of browning. J. Food Sci. 52: 985-989.
Crisoto, C., Andris, H. and Mitcham, B. 1993. Tips to reduce bruising during apple
harvesting. Central Valley Postharvest Newsletter 2:6-10.
Crisoto, C., Garner, D., Ritenour, M., Schap, J. and Rushing, J. 1996. Developing
critical bruising threshold for stone fruit. Central Valley Postharvest Newsletter 5:11-13.
Czapski, J. and Saniewski, M. 1988. The effect of methyl jasmonate on polyphenol
oxidase and peroxidase activities in tomato fruit. Bull. Pol. Acad. Sci. Biol. 36:127-132.
Dancick, V., Clauser, K.R., Addona, T.A., Vath, J.E. and Pevzner, P.A. 1999. De
novo peptide sequencing via tandem mass spectrometry. J. Comp. Biol. 6:327-342.
Das, J., Santhoor, G. and Gorda, L.R. 1997. Purification and characterization of a
polyphenol oxidase from Kew cultivar of Indian pineapple fruit. 89. J. Agric. Food Chem.
45:2031-2035.
Day, K. 1992. Management of stone fruit harvest and field operations. Central Valley
Postharvest Newsletter 1:4-7.
161
Bibliografía
Delandade, F., Carapito, C., Brizard, J.P., Brugidou, C. and Van Dorsselaer, A.
2005. Multigenic families and proteomics: extended protein characterization as a tool for
paralog gene identification. Proteomics 5:450-460.
Ding, C.K., Chachin, K., Ueda, Y. and Imahori, Y. 1998b. Purification and
properties of polyphenol oxidase from Loquat fruit. J. Agric. Food Chem. 46:4144-4149.
Ding, C.K., Chachin, K., Ueda, Y. and Mochioka, R. 1998a. Changes in polyphenol
concentrations and polyphenol oxidase activity of loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) fruits in
relation to browning. J. Jpn. Soc. Hortic. Sci 67:360-366.
Ding, C.K., Chachin, K., Ueda, Y., Imahori, Y. and Wang, C.Y. 2001. Metabolism
of phenolic compounds during loquat fruit developement. J. Agric. Food Chem. 49:2883-
2888.
Ding, C.K., Chachin, K., Ueda, Y. and Wang, C.Y. 2002. Inhibition of loquat
enzymatic browning by sulfhydryl compounds. Food Chem. 76:213-218.
Dongfeng, L., Feng, Y. and Jiang, D. 2004. Characterization of polypheol oxidase
from plants. Prog. Nat. Sci. 14:553-561.
Dry, I.B. and Robinson, S.P. 1994. Molecular cloning and characterisation of grape
berry polyphenol oxidase. Plant Mol. Biol. 26:495-502.
Duangmal, K., Richard, K. and Apenten, O. 1999. A comparative study of
polyphenol oxidases from taro (Colocasia esculenta) and potato (Solanum tuberosum var.
Romano). Food Chem. 64:351-359.
Dudley, E.D. and Hotchkiss, J.H. 1989. Cysteine as an inhibitor of polyphenol
oxidase. J. Food Biochem. 13:65-75.
Eicken, C., B. Krebs, and J. C. Sacchettini. 1999. Catechol oxidase-structure and
activity. Curr. Opin. Struct. Biol 9:677-683.
Escribano, J., Cabanes, J. and Gárcía-Carmona, F. 1997. Characterisation of latent
polyphenol oxidase in table beet: Effect of sodium dodecyl sulfate. J. Sci. Food Agric. 73:34-
38.
Espinosa, E. 1996. Fenología y caracterización pomológica de cultivares de níspero.
Escuela universitaria de ingeniería técnica agrícola de Valencia. 280 pp
FAO. 1999. FAO QBS. 12. Nº3/4.
162
Bibliografía
Fayad, N., Marchal, L., Billaud, C. and Nicolas, J. 1997. Comparison of β-

cyclodextrin effect on polyphenol oxidation catalyzed by purified polyphenol oxidase from
different sources. J. Agric. Food Chem. 45:2442-2446.
Felsenstein, J. 1989. PHYLIP-- Phylogeny interference package (Version 3.2).
Cladistics 5:164-166.
Flurkey, W.H. 1985. In vitro biosynthesis of Vicia faba polyphenol oxidase. Plant
Physiol. 79:547-564.
Fraignier, N., Marqués, L., Fleuriet, A. and Macheix, J.J. 1995. Biochemical and
inmunochemicals characteristics of polyfenol oxidases from differents fruits of Prunus. J.
Agric. Food Chem. 43:2375-2380.
Friedman, M. 1994. Improvement in the safety of food by SH-containing amino acids
and peptides. A review. J. Agric. Food Chem. 42:3-20.
Gandía-Herrero, F., García-Carmona, F. and Escribano, J. 2004. Purification and
characterization of a latent polyphenol oxidase from beet root (Beta vulgaris L.). J. Agric.
Food Chem. 52:606-615.
Gandía-Herrero, F., Jiménez-Atiénzar, M., Cabanes, J., García-Carmona, F. and
Escribano, J. 2005b. Differential activation of a latent polyphenol oxidase mediated by
sodium dodecyl sulfate. J. Agric. Food Chem. 53:6825-6830.
Gandía-Herrero, F., Jiménez-Atiénzar, M., Cabanes, J., García-Carmona, F. and
Escribano, J. 2005a. Evidence for a common regulation in the activation of a polyphenol
oxidase by trypsin and sodium dodecyl sulfate. Biol. Chem. 386:601-607.
García-Carmona, F., García-Canovas, F., Iborra, J.L. and Lozano, J.A. 1982.
Kinetic study of the pathway of melanization between L-dopa and dopachrome. Biochim.
Biophys. Acta 717:124-131.
García-Olmedo, F., Rodríguez-Palenzuela, P., Molina, A., Alamillo, J.M., López-
Solanilla, E., Berrocal-Lobo, M. and Poza-Carrión, C. 2001. Antibiotic activities of
peptides, hydrogen peroxide and peroxynitrite in plant defense. FEBS Lett. 498:219-222.
Gariglio, N., Juan, M., Almela, V. and Agustí, M. 2002. Histological and
physiological study of purple spot of loquat fruit. Sci. Hortic. 92:255-263.
Gariglio, N., Castillo, A., Alós, E., Juan, M., Almela, V., and Agustí, M. 2003a.
The influences of environmental factorson the development of purple spot of loquat fruit
(Eriobotrya japonica Lindl.). Sci. Hortic. 98:17-23.
163
Bibliografía
Gariglio, N., Castillo, A., Juan, M., Almela, V., and Agustí, M. 2003b. Effects of
fruit thinning on fruit growth, sugars and purple spot in loquat fruit (Eryobotria japonica
Lindl.). J. Hort. Sci. Biotechnol. 78:32-34.
Gariglio, N., Martínez-Fuentes, A., Mesejo, C. and Agustí, M. 2005. Control of
purple spot of loquat fruit (Eriobotrya japonica) by means of mineral compounds. Ann. Appl.
Biol. 146:415-420.
Gauillard, F. and Richard-Forget. F. 1997. Polyphenol oxidases from Williams pear
(Pyrus communis L, cv Williams): Activation, purification and some properties. J. Sci. Food
Agric. 74:49-56.
Gerdemann, C., Eicken, C., Galla, H. and Krebs, B. 2002. Comparative modeling
of the latent form of a plant catechol oxidase using a molluskan hemoyanin structure. J. Inorg.
Biochem. 89:155-158.
Golan-Goldhirsh, A. and Withaker, J.R. 1984. Effect of ascorbic acid, sodium
bisulfite, and thiol compounds on mushroom polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem.
32:1003-1009.
Golbeck, J.H. and Cammarata, K.V. 1981. Spinach thylakoid polyphenol oxidase.
Isolation, activation and properties of the native chloroplast enzyme. Plant Physiol. 67:977-
984.
Goldman, J., Seurink, M., Marins, G.H., Goldman, C. and Mariani, A. 1998. A
tobaco flower-specific gene encodes a polyphenol oxidase. Plant Mol. Biol. 36:479-485.
Gooding, S.P., Bird, C. and Robinson, P.S. 2001. Molecular cloning and
characterisation of banana fruit polyphenol oxidase. Planta 213:748-757.
Granier, F. and Van del Walle, C. 1988. Extraction of plant proteins for two-
dimensional electrophoresis. Electrophoresis 9:712-718.
Grant, J.J. and Loake, G.J. 2000. Role of reactive oxygen intermediates and cognate
redox signaling in disease resistence. Plant Physiol. 124:21-29.
Gualix, J., Abal, M., Pintor, J., García-Carmona, F. and Miras-Portugal, M.T.
1996. Nucleotide vesicular transporter of bovine chromaffin granules. Evidence for a
mnemonic regulation. J. Bio. Chem. 26:1957-1965.
Guindon, S. and Cascuel, O. 2003. A simple, fast and accurate algorithm to estimate
large phylogenics by maximum likelihood. Syst. Biol. 52:696-704.
164
Bibliografía
Guyot, S., Cheynier, V., Souquet, J.M. and Moutounet, M. 1995. Influence of pH
on the enzymatic oxidation of (+)-catechin in model systems. J. Agric. Food Chem. 43:2458-
2462.
Guyot, S., Vercauteren, J. and Cheynier, V. 1996. Structural determination of
colourless and yellow dimmers resulting from (+)-catechin coupling catalysed by grape
polyphenol oxidase. Phytochemistry 42:1279-1288.
Harel, E., Mayer, A.M. and Shain, Y. 1966. Catechol oxidases, endogenous
substrates and browning in developing apples. J. Sci. Food Agric. 17:389-392.
Harel, E. and Mayer, A.M. 1971. Partial purification and properties of catechol
oxiases in grapes. Phytochemistry 10:17-22.
Harel, E., Mayer, A.M. and Lehman, E. 1973. Multiple forms of Vitis vinifera
catechol oxidase. Phytochemistry 12:2649-2654.
Harper, K., Morton, A. and Rolfe, E. 1969. The phenolic compounds of black
currant juice and their protective effect on ascorbic acid. The mechanism of ascorbic acid
oxidation and its inhibition by flavonoids. J. Food Technol. 4:255-267.
Haruta, M., Murata, M., Hiraide, A., Kadokura, H., Yamasaki, M., Sakuta, M.,
Shimizu, S. and Homma, S. 1998. Cloning genomic DNA encoding apple polyphenol
oxidase and comparison of the gene product in Escherichia coli and in apple. Biosci. Biotech.
Biochem. 62:358-362.
Haruta, M., Murata, M., Kadokura, H. and Homma, S. 1999. Immunological and
molecular comparison of polyphenol oxidase in Rosaceae fruit trees. Phytochemistry
50:1021-1025.
Haruta, M., Pedersen, J.A. and Constabel, C.P. 2001. Polyphenol oxidase and
hervibore defense in trembling aspen (Populus tremuloides): cDNA cloning, expression, and
potential substrates. Physiol. Plantarum 112:552-558.
Hermann, K. 1976. Flavonols and flavones in food plants: a review. J. Food Technol.
11:433-448.
Himmelwright-Richard, S., Eickman, N.C., Lubien, C.D., Solomon, E.I. and
Lerch, K. 1980. Chemical and spectroscopic studies of binicular copper active site of
Neurospora tyrosinase: comparison to hemocyanins. J. Am. Chem. Soc. 102:7339-7344.
165
Bibliografía
Hind, G., Marsshak, D. and Coughlan, S. 1995. Spinach thylakoid polyphenol

oxidase: cloning, characterization, and relation to a putative protein kinase. Biochemistry
34:8157-8164.
Hobson, G.E. 1967. Phenolase activity in tomato fruit in relation to growth and to
various ripening disorders. J. Sci. Food Agric. 18:523-526.
Hofer, A. 1964. Intracellular localization of phenolases in tobacco leaves. Planta
62:137-159.
Hunt, M.D., Eannetta, N.T., Haifeng, Y., Newman, S.M. and Steffens, J.C. 1993.
cDNA cloning and expression of potato polyphenol oxidase. Plant Mol. Biol. 21:59-68.
Hus, A., Shieh, J.J., Bills, D. and White, K. 1988. Inhibition of mushroom
polyphenol oxidase by ascorbic acid and derivates. J. Food Sci. 53:765-767.
Ichinose, I. 1995. The origin and development of loquat. Serie Agronomical
Techniques y supl. 1-5.
Ingle, M. and D´Souza, M.C. 1989. Physiology and control of superficial scald and
apples: a review. Hortscience 24:28-31.
Janovitz-Klapp, A., Richard, F. and Nicolas, J. 1989. Polyphenol oxidase from
apple, partial purification and some properties. Phytochemistry 28:2903-2907.
Jiménez-Atiénzar, M., Pedreño, M.A. and García-Carmona, F. 1991. Activation of
polyphenol oxidase by polyamines. Biochem. Int. 25:861-868.
Jiménez, M. and García-Carmona, F. 1996. The effect of sodium dodecyl sulfate on
polyphenol oxidase. Phytochemistry 42:1503-1509.
Jiménez, M., Escribano-Cebrián, J. and García-Carmona, F. 1998. Oxidation of
the flavonol fisetin by polyphenol oxidase. Biochim. Biophys. Acta 1425:534-542.
Jiménez, M. and García-Carmona, F. 1999. Myricetin, an antioxidant flavonol, is a
substrate of polyphenol oxidase. J. Sci. Food Agric. 79:1993-2000.
Johnson, R.S., Martin, S.A., Biemann, K., Stults, J.T. and Watson, T. 1987. Novel
fragmentation process of peptides by collision-induced decomposition in a tandem mass
spectrometer: differentiation of leucine and isoleucine. Anal. Chem. 59:2621-2625.
Joy, R.W., Sugiyama, M., Fukuda, H. and Komamine, A. 1995. Cloning and
characterization of polyphenol oxidase cDNAs of Phytolacca americana. Plant. Physiol.
107:1083-1089.
166
Bibliografía
Jukanti, A.K., Bruckner, P.I., Habernicht, D.K., Foster, C.R., Martin, J.M. and
Fisher, A M. 2003. Extraction and activation of wheat polyphenol oxidase by detergents:
Biochemistry and applications. Cereal Chem. 80:712-716.
Kagan, Z.S. and Dorozhko, A.I. 1973. pH-dependent intermediate plateaux in the
kinetics of the reaction catalyzed by "biosynthetic" L-threonine dehydratase of Escherichia
coli K-12. Biochim. Biophys. Acta 302:110-128.
Kanade, S., Paul, B., Rao, A.G. and Gowda, L.R. 2006. The conformational state of
polyphenol oxidase from field bean (Dolichos lablab) upon sodium dodecyl sulfate and acid-
pH activation. Biochem. J. 395:551-562.
Ke, D. and Salveit, E. 1988. Plant hormone interaction and phenolic metabolism in
the regulation of russet spotting in iceberg lettuce. Plant Physiol. 88:1136-1140.
Keegstra, K. and Froehlich, J.E. 1999. Protein import to chloroplasts. Curr. Opin.
Plant Biol. 2:471-476.
Keegstra, K. and Cline, K. 1999. Protein import and routing systems of chloroplasts.
Plant Cell. 11:557-570.
Kenten, R.H. 1957. Latent phenolase in extracts of broad bean (Vicia faba L.) leaves.
Activation by acid and alkali. Biochem. J. 67:300-307.
Kenten, R.H. 1958. Latent phenolase in extracts of broad bean (Vicia faba L.) leaves.
Activation by anionic weyying agents. Biochem. J. 68:244-251.
Kidron, M., Harel, E. and Mayer, A.M. 1978. Catechol oxidase activity in grapes
and wine. Am. J. Enol. Vitic. 29:30-35.
Kim, J.Y., Seo, Y.S., Kim, J.E., Sung, S.K., Song, K.J., An, G. and Kim, W.T.
2001. Two polyphenol oxidases are differentially expressed during vegetative and
reproductive development and in response to wounding in the Fuji apple. Plant Science
161:1145-1152.
King, R.S. and Flurkey, W.H. 1987. Effects of limited proteolysis on broad bean
polyphenol oxidase. J. Sci. Food Agric. 41:231-240.
Klabunde, T., Eicken, C., Sacchettini, J.C. and Krebs, B. 1998. Crystal structure of
a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nat. Struc. Biol. 5:1084-1090.
Koussevitzky, S., Ne'eman, E., Sommer, A., Steffens, J. and Harel, E. 1998.
Purification and properties of a novel chloroplast stromal peptidase. J. Biol. Chem.
273:27064-27069.
167
Bibliografía
Koussevitzky, S., Ne'eman, E. and Harel, E. 2004. Import of polyphenol oxidase by

chloroplasts is enhanced by methyl jasmonate. Planta 219:412-419.
Kowalski, S., Banberg, J., Tingey, W. and Steffens, J. 1990. Insect resistance in the
wild potato Solanum berthaultii: Inheritance of granular trichome polyphenol oxidase. J.
Hered. 81:475-478.
Kowalski, S.P., Eannetta, N.T., Hirzal, A.T. and Steffens, J.C. 1992. Purification
and characterisation of polyphenol oxidase from glandular trichomes of Solanum berthaultii.
Plant Physiol. 100:677-684.
Kurganov, B.I. 1982. Kinetic behaviour, Yakovlev, V.A., Ed. John Wiley and sons,
New York.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.
Lanker, T., Flurkey, W.H. and Huges J.P. 1988. Cross-reactivity of polyclonal and
monoclonal antibodies to polyphenoloxidase in higher plants. Phytochemistry 27:3731-3734.
Laveda, F., Núñez-Delicado, E. and Sánchez-Ferrer, A. 2000. Reversible sodium
dodecyl sulfate activation of latent peach polyphenol oxidase by cyclodextrins. Archiv.
Biochem Biophys. 379:1-6.
Lax, A.R., Vaughn, K.C. and Templeton, G.E. 1984. Nuclear inheritance of
polyphenol oxidase in nicotiana. J. Hered 75:285-287.
Lee, C.Y., Kagan, V., Jaworski,W. and Brown, S.K. 1990. Enzymatic browning in
relation to phenolic compounds and polyphenol oxidase activity among various peach
cultivars. J. Agric. Food Chem. 38:99-101.
Lee, C.Y. and Whitaker, J. 1995. Enzymatic browning and its prevention, ACS
Symposum Series 600, Washington, D.C; American Chemical society Ed.
Lerch, K. and Ettinger, L. 1972. Purification and characterization of a tyrosinase
from Streptomyces glaucenses. Eur. J. Biochem. 31:427-437.
Li, L. and Steffens, J. 2002. Overexpression of polyphenol oxidase in transgenic
tomato plants resuts in enhanced bacterial disease resistance. Planta 215:239-247.
Lin, S., Sharpe, R.H. and Janick, J. 1999. Loquat botany and horticulture.
Horticultural Reviews 23:233-276.
168
Bibliografía
López-Nicolás, J.M., Bru, R., Sánchez-Ferrer, A. and García-Carmona, F. 1995.

Use of`"soluble lipids" for biochemical processes: linolenic acid-cyclodextrin inclusion
complexes in aqueous solutions. Biochem. J. 308:151-154.
Macheix, J.J., Fleuriet, A. and Billot, J. 1990. Fruit phenolics. CRC Press: Boca
Raton, FL.
Macheix, J.J., Sapis, J.C. and Fleuriet, A. 1991. Phenolic compounds and
polyphenol oxidase in relation to browning in grapes and wines. Crit. Rev. Food Sci. Nutr.
30:441-486.
MAPA. 1997. Anuario de estadística agraria. Ministerio de Agricultura, Pesca y
Alimentación. Madrid 320-322.
Mari, S., Marquès, L., Breton, F., Karamanos, Y. and Macheix, J.J. 1998.
Unfolding and refolding of active apple polyphenol oxidase. Phytochemistry 49:1213-1217.
Marquès, L., Fleuriet, A. and Macheix, J.J. 1995. Characterization of multiple
forms of polyphenol oxidase from apple fruit. Plant Physiol. Biochem. 33:193-200.
Marquès L., Fleuriet, A., Cleyet-Marel, J.C. and Macheix J.J. 1994. Purification of
an apple polyphenol oxidase isoform resistant to SDS-proteinase K digestion. Phytochemistry
36:1117-1121.
Martínez-Calvo, J., Badenes, M.L. and Yacer, G. 2000. El níspero del Japón.
Agrícola Vergel. 217:24-33.
Mayer, A.M. 1966. Catechol oxidase; enzymic liberation from sugar beet
chloroplasts. Phytochemistry 5:1297-1301.
Mayer, A.M. and Harel, E. 1979. Polyphenol oxidases in plants. Phytochemistry
18:193-215.
Mayer, A.M. 1987. Polyphenol oxidases in plants-recent progress. Phytochemistry
26:11-20.
Mayer, A.M. and Harel, E. 1991. Polyphenol oxidases and their significance in fruit
and vegetables. In: Fox PF (Ed) Food enzymology. Elsevier, New York 373-398.
Mazzafera, P. and Robinson, S.P. 2000. Characterization of polyphenol oxidase in
coffee. Phytochemistry 55:285-296.
Mdluli, K.M. 2005. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase
and peroxidase from marula fruit (Sclerocarya birrea subsp. Caffra). Food Chem. 92:311-
323.
169
Bibliografía
Moore, M.B. and Flurkey, H.W. 1990. Sodium dodecyl sulfate activation of a plant
polyphenol oxidase. Effect of sodium dodecyl sulfate on enzymatic and physical
characteristics of purified broad bean polyphenol oxidase. J. Biol. Chem. 265:4982-4988.
Morton, J.F. 1987. Fruits of warm climates. Creative Resources Systems Inc. Ed.
Dowling, F.C. U.S.A. 103-108.
Murata, M., Kurokami, C. and Homma, S. 1992. Purification and some properties
of chlorogenic acid oxidase from apple (Malus pumila). Biosci. Biotech. Biochem. 56:1705-
1710.
Murata, M., Tsurutani, M., Hagiwara, S. and Homma, S. 1997. Subcellular
location of polyphenol oxidase in apples. Biosci. Biotech. Biochem. 61:1495-1499.
Negishi, O. and Ozawa, T. 2000. Inhibition of enzymatic browning and protection of
sulfhydryl enzymes by thiol compounds. Phytochemistry 54:481-487.
Nesvizhskii, A. I. and R. Aebersold. 2005. Interpretation of shotgun proteomic data.
Mol. Cell. Proteomics 4:1419-1440.
Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D. and Ehrhardt, W. 1988. Improved staining of
proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at
nanogram sensivity using Coomasie Brilliant blue G-250 and R-250. Electrophoresis 9:255-
262.
Newman, S.M., Eannetta, N.T., Yu, H., Prince, J.P., de Vincente, M.C., Anksley,
S.D. and Steffens, J.C. 1993. Organisation of the tomato polyphenol oxidase gene family.
Plant Mol. Biol. 21:1035-1051.
Nielsen, H., Engelbrecht, J., Von Heijne, G. and Brunak, S. 1996. Defining a
similarity threshold for a functional protein sequence pattern: The signal peptide cleavage site.
Proteins-Structure, Function and Genetics 24:165-177.
Nishimura, M., Fukuda, C., Murata, M. and Homma, S. 2003. Cloning and some
properties of Japanese pear (Pyrus pyrifolia) polyphenol oxidase, and changes in browning
potential during fruit maduration. J. Sci. Food Agric. 83:1156-1162.
Nuñez-Delicado, E., Sojo, M.M., García-Carmona, F. and Sánchez-Ferrer, A.
2003. Partial purification of latent persimmon fruit polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem.
51:2058-2063.
Núñez-Delicado, E., Serrano-Megías, M., Pérez-López, A.J. and López-Nicolás, J.
2005. Polyphenol oxidase from Dominga table grape. J. Agric. Food Chem. 53:6087-6093.
170
Bibliografía
Núñez-Delicado, E., Serrano-Megías, M., Pérez, A.J. and López-Nicolás, J. 2006.

Characterization of polyphenol oxidase from Napoleon grape. Food Chem. 100:108-114.
Ojima, M., Rigitano, O., Simao, S. and Ique, T. 1976. The effect of the type of fruit
protection on the incidence of purple spot and fruit development in loquats. Bragantia 35: XI-
XLIV.
Okot-Kober, M., Liavoga, A., Yong, K.J. and Bagorogoza, K. 2002. Activation of
polyphenol oxidase in extracts of bran from several wheat (Triticum aestivum) cultivars using
organic solvents, detergents, and chaotropes. J. Agric. Food Chem. 50:2410-2417.
Oleszek, W., Chang, Y.L., Jaworski, A.W. and Price, K.R. 1989. Apple phenolics
and their contribution to enzymatic browning reactions. Acta Soc. Bot. Pol. 58:273-283.
Onsa, H.G., Saari, N., Selamat, J. and Bakar, J. 2000. Latent polyphenol oxidases
from Sago Log (Metroxylon sagu): Partial purification, activation and some properties. J.
Page, R.D.M. 1996. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on
personal computers. Computer applications in the Biosciencies 12:357-358.
Paul, B. and Gorda, L.R. 2000. Purification and characterization of a polyphenol
oxidase from the seeds of Field bean (Dolichos lablab). J. Agric. Food Chem. 48:3839-3846.
Perez-Gilalbert, M., Morte, A., Honrubia, M. and García-Carmona, F. 2001.
Partial purification, characterization, and histochemical localization of fully latent desert
truffle (Terfezia Claveryi Chatin) polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. 49:1922-1927.
Rathjen, A.H. and Robinson, S.P. 1992. Aberrant processing of polyphenol oxidase
in a variegated grapevine mutant. Plant Physiol. 99:1619-1625.
Richard-Forget, F.C., Goupy, P.M., Pascale, M., Nicolas, J.J., Lacombe, J.M. and
Pavia, A.A. 1991b. Cisteine as inhibitor of enzymic browning. Isolation and characterization
of adition compounds formed during oxidation of phenolics by aple polyphenol oxidase. J.
Richard-Forget, F.C., Goupy, P.M. and Nicolás, J.J. 1992a. Cysteine as an
inhibitor of enzymatic browning. Kinetic studies. J. Agric. Food Chem. 40:2108-2113.
Richard-Forget, F.C., Rouet-Mayer, M.D., Goupy, P.M., Philippon, J. and
Nicolas, J.J. 1992. Oxidation of chlorogenic acid, catechins and 4-methylcatechol in model
solutions by apple polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. 40:2114-2122.
171
Bibliografía
Richard-Forget, F.C. and Gauillard, F. 1997. Oxidation of chlorogenic acid,

catechins and 4-methylcatechol in model solutions by combination of pear (Pyrus communis
cv. Williams) polyphenol oxidase and peroxidase: a possible involvement of peroxidase in
enzymatic browning. J. Agric. Food Chem. 45:2472-2476.
Robinson, S.P. and Dry, I.B. 1992. Broad bean leaf polyphenol oxidase is a 60-
kilodalton protein susceptible to proteolytic cleavage. Plant Physiol. 99:317-323.
Romeyer, F.M., Macheix, J.J., Goiffon, J.P., Reminiac, C.C. and sapis, J. P. 1983.
The browning capacity of grapes. Changes and importance of hydroxycinamic acid-tartaric
acid esters during development and maturation of the fruit. J. Agric. Food Chem. 31:346-349.
Roepstorff, P. and Fohlman, J. 1984. Proposal for a common nomenclature for
sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed. Mass Spectrom. 601.
Saenger, W. 1980. Cyclodextrin inclusion compounds in research and industry.
Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 19: 344-362
Sanada, H., Suzue, R., Nakashima, Y. and Kawada, S. 1972. Effect of thiol
compounds on melanin formation. Biochim. Biophys. Acta 261:258-266.
Sánchez-Ferrer, A., Laveda, F. and García-Carmona, F. 1993. Substrate-
Dependent activation of latent potato leaf polyphenol oxidase by anionic surfactants. J. Agric.
Food Chem. 41:1583-1586.
Sánchez-Ferrer, A., Bru, R. and García-Carmona, F. 1994. Phase separation of
biomolecules in polyoxyethylene glycol non ionic detergents. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.
29:275-313.
Sánchez-Ferrer, A., Pérez- Gilabert, M., Núñez, E., Bru, R. and García-
Carmona, F. 1994. Triton X-114 phase partitioning in plant protein purification. J. Chromat.
668:75-83.
Sánchez-Ferrer, A., Bru, R. and García-Carmona, F. 1989. Novel procedure for
extraction of a latent grape polyphenol oxidase using temperature-induced phase separation in
Triton X-114. Plant Physiol. 91:1481-1487.
Sapers, G.M. 1993. Browning of foods: control by sulfites, antioxidants and other
means. Food Thecnol. 47:75-84.
Sayavedra-Soto, T. and Montgomery, M. 1986. Inhibition of polyphenol oxidase by
sulfite. J. Food Sci. 51:1531-1536.
172
Bibliografía
Schidt, H.A., Strimmer, K., Vingron, M. and Von Haeseler, A. 2002. TREE-
PUZZLE: maximal likelihood phylogenetic analysis using quartets and parallel computing.
Bioinformatics 18:502-504.
Segel, I.H. 1975. Enzyme Kinetics. Behaviour and analysis of rapid equilibrium and
steady-state enzyme system. John Wiley and Sons, New York.
Serradell, M.A., Rozenfeld, P.A., Martínez, G.A., Civello, P.M., Chaves, A.R. and
Añon, M.C. 2000. Polyphenol oxidase activity from strawberry fruit (Fragaria ananassa,
Duch., cv Selva): characterisation and partial purification. J. Sci. Food Agric. 80:1421-1427.
Shahar, T., Henning, N., Guttinger, T., Hareven, D. and Lifschitz, E. 1992. The
tomato 66.3-kDa polyphenol oxidase gene: molecular identification and developmental
expression. Plant Cell. 4:135-147.
Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. 1996. Mass spectrometric
sequencing of proteins from silver-stained polyacrilamide gels. Anal. Chem. 68:850-858.
Shi, C., Dai, Y., Xu, X., Xie, Y. and Liu, Q. 2002. The purification of polyphenol
oxidase from tobacco. Protein expression and purification 24:51-55.
Siddiq, M., Sinha, K. and Cash, J. 1992. Characterization of polyphenol oxidase
from Stanley plums. J. Food Sci. 57:1177-1179.
Singleton, V.L. and Rossi, J.A. 1965. Colorimetry of total phenolics with
phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Viticult. 16:144-158.
Sojo, M.M., Núñez, E., García-Carmona, F. and Sánchez-Ferrer, A. 1999.
Cyclodextrins as activator and inhibitor of latent banana pulp polyphenol oxidase. J. Agric.
Food Chem. 47:518-523.
Solomon, E.I., Tuczek, F., Root, D.E. and Brown, C.A. 1994. Spectroscopy of
binuclear dioxygen complexes. Chem. Rev. 94:827-856.
Sommer, A., Ne'eman, E., Steffens, J., Mayer, A.M. and Harel, E. 1994. Import,
targeting and processing of a plant polyphenol oxidase. Plant Physiol. 105:1301-1311.
Söderhäll, K., Calberg, I. and Erickson, T. 1985. Isolation and partial purification of
prophenol oxidase from Daucus carota L. cell cultures. Plant Physiol. 78:730-733.
Söderhäll, K. 1995. Properties of carrot polyphenol oxidase. Phytochemistry 39:33-
38.
Steglich, W. and Strack, D. 1990. In: The alkaloids. Chemistry and Pharmacology.
Ed: Brossi, A. Academic Press, London.
173
Bibliografía
Steiner, U., Schliemann, W., Böhm, H. and Strack, D. 1999. Tyrosinase involved in
betalain synthesis of higher plants. Planta 208:114-124.
Stewart, R.J., Sawyer, B.J.B., Bucheli, C.S. and Robinson, S.P. 2001. Polyphenol
oxidase is induced by chilling and wounding in pineapple. Australian J. Plant Physiol. 28:181-
191.
Strack, D. and Schliemann, W. 2001. Bifunctional polyphenol oxidases: Novel
functions in plant pigment biosynthesis.Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40: 3791-3794.
Subramanian, N., Venkatesh, P. Ganguli, S. and Sinkar, V.P. 1999. Role of
polyphenol oxidase and peroxidase in the generation of black tea theaflavins. J. Agric. Food
Chem. 47:2571-2578.
Sugumaran, M. and Nellaiappan, K. 1991. Lysolecithin-a potent acivator of
prophenol oxidase from the hemolymph of the lobster, Homarus americanas. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 176:1371-1376.
Swain, T., Mapson, L.W. and Robb, D.A. 1966. Activation of Vicia faba (L.)
tyrosinase as affected by denaturing agents. Phytochemistry 5:469-482.
Taylor, I.B. 1986. Biosystematics of the tomato. In the tomato crop. Atherton, J.G.
and Rudich, J.
Thipyapong, P., Hus, A. and Steffens, J. 1995. Systemic wound induction of potato
(Solanum tuberosum) polyphenol oxidase. Phytochemistry 40:673-676.
Thipyapong, P., Joel, D.M and Steffens, J.C. 1997. Differential expression and
turnover of the tomato polyphenol oxidase gene family during vegetative and reproductive
development. Plant Physiol. 113:707-718.
Thipyapong, P. and Steffens, J. 1997. Tomato polyphenol oxidase. Differential
response of the polyphenol oxidase F promoter to injuries and wound signal. Plant Physiol.
115:409-418.
Thipyapong, P., Hunt, M.D. and Steffens, J. 2004. Antisense downregulation of
polyphenol oxidase results in enhanced disease susceptibility. Planta 220:105-117.
Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. 1994. CLUSTAL W: improving
the sensitive of progressive multiple sequence alignement through sequence weighting,
position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic. Acids. Res. 22:4673-4680.
Thygesen, P.W., Dry, I.B. and Robinson, S.P. 1995. Polyphenol oxidase in potato.
Plant Physiol. 109:525-531.
174
Bibliografía
Tolbert, N. 1973. Activation of polyphenol oxidase of chloroplasts. Plant Physiol.

51:234-244.
Tomás-Barberán, F.A. and Espín, J.C. 2001. Phenolic compounds and related
enzymes of quality in fruits and vegetables. J. Sci. Food Agric. 81:853-876.
Tuset, J., Rodríguez, A., Boronad, S., García, J. and Monteagudo, E. 1989. La
mancha morada del níspero. Generalitat Valenciana. Conselleria d'Agricultura i Pesca. Fullets
Divulgació.
Valero, E., Escribano, J. and García-Carmona, F. 1988. Reactions of 4-methyl-o-
benzoquinone generated chemically or enzymically, in the presence of L-proline.
Phytochemistry 27:2055-2061.
Valero, E., Varón, R. and García-Carmona, F. 1991. A kinetic study of irreversible
enzyme inhibition by an inhibitor that is rendered unstable by enzymic catalysis. The
inhibition of polyphenol oxidase by L-cysteine. Biochem. J. 277:869-874.
Valero, E. and García-Carmona, F. 1992. pH-induced kinetic co-perativity of a
thylakoid-bound polyphenol oxidase. Biochem. J. 286:623-626.
Valero, E. and García-Carmona, F. 1998. pH-dependent effect of sodium chloride
on latent grape polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. 46:2447-2451.
Vamos-Vigyazo, L. 1981. Polyphenol oxidase and peroxidase in fruits and vegetables.
CRC Crit. Rev. Food Sci. 15:49-127.
Van Gelder, C.W.G., Flurkey, W.H. and Wichers, H.J. 1997. Sequence and
structural features of plant and fungal tyrosinases. Phytochemistry 45:1309-1323.
Vaughn, K.C., Lax, A.R and Duke, S.O. 1988. Polyphenol oxidase: the chloroplast
oxidase with no established function. Physiol Plant. 72:659-665.
Vaughn, K.R. and Duke, S.O. 1984. Function of polyphenol oxidase in higher plants.
Physiol Plant. 60:106-112.
Vaughn, P.F.T., Eason, R., Paton J.J., and. Ritchie, G.A. 1975. Molecular weight
and amino acid composition of purified spinach beet phenolase. Phytochemistry 14:2383-
2386.
Walker, J. and Reddish, C. 1964. Note on the use of cysteine to prevent browning in
apple products. J. Sci. Agr. 15:902-904.
Walker, J.R.L. and Ferrar, P.H. 1998. Diphenol oxidases, enzyme-cataysed
browing and plant disease resistance. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 15:457-498.
175
Bibliografía
Walker, M. and McKersie B. 1993. Role of the ascorbate-glutathione antioxidant

system in chilling resistance of tomato. J. Pant Physiol. 141:234-239.
Wang, J. and Constabel, C.P. 2004. Polyphenol oxidase overexpression in transgenic
Populus enhances resistance to herbivory by forest tent caterpillar (Malacosoma disstria).
Planta 220:87-96.
Wang, W., Scali, M.R., Vignani, A., Spadafora, E., Sensi, S., Mazzuca, and
Cresta, M. 2003. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf, a
plant tissue containing high levels of interfering compounds. Electrophoresis 24:2369-2375.
Wesche-Ebeling, P. and Montgomery, M.W. 1983. Extraction and partial
characterization of strawberry polyphenol oxidase. IFT Meet. , Abstr. , 43rd Annu 295.
Wickers, H.J., Van de Bosch, T., Gerritsen, Y.A.M., Oyevaar, J.I., Ebbelaar,
M.C.E. Recourt, K. and Kerrigan, R.W. 1995. Mushroom Science. XIV 720.
Wissing, J.S., Heim, L. Flohé, B.U., and Frank, R. 2000. Enrichment of
hydrophobic protein via Triton X-114 phase partitioning and hydroxyapatite column
chromatography for mass spectrometry. Electrophoresis 21:2589-2593.
Wititsuwannakul, D., Chareonthiphakorn, N., Pace, M. and Wititsuwannakul, R.
2002. Polyphenol oxidases from latex of Hevea brasilensis: purification and characterization.
Phytochemistry 115-121.
Wong, M. and. Stanton, D.W. 1989. Nonenzymic browning in Kiwi fruit juice
concentrate systems during storage. J. Food Sci. 54:669-673.
Yu, H., Kowalski, S.P. and Steffens, J.C. 1992. Comparison of polyphenol oxidase
expression in glandular trichomes of Solanum and Lycopersicon species. Plant Physiol.
100:1885-1890.
Yue-Ming, J., Zauberman, G. and Fuchs, Y. 1997. Partial purification and some
properties of polyphenol oxidase extracted from litchi fruit pericarp. Postharvest Biol.
Technol. 10:221-228.
Zhang, J. and Stewart, J. 2000. Economical and rapid method for extracting cotton
genomic DNA. The Journal of Cotton Science 4:193-201.
Zhou, P., Smith, N.L. and. Lee, C.Y. 1993. Potential purification and some
properties of Monroe apple peel polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. 41:532-536.
176
Anexo A
Anexo A
Para llevar a cabo la determinación de la secuencia del fragmento amino terminal cada
fragmento se secuencia mediante ciclos repetitivos de la degradación de Edman en un
secuenciador. En este método, el isotiocianato de fenilo (PITC), denominado reactivo de
Edman, reacciona con el residuo amino terminal de cada fragmento. El tratamiento del
producto de esta reacción con ácido rompe el residuo amino terminal en forma de derivado de
feniltiohidantoína. El derivado se identifica posteriormente con patrones conocidos utilizando
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Cada derivado de aminoácido se identifica
de acuerdo con su tiempo de retención en la columna. A continuación se muestran los
cromatogramas de los 13 residuos obtenidos mediante la degradación de Edman.
177
Anexo A
178
Anexo A
179
Anexo A
180
Anexo A
181
Anexo A
182
Anexo A
183
Anexo B
Anexo B
Fragmentación de los péptidos en MS/MS.
Los tipos de iones fragmentados que se observan en los espectros de MS/MS

dependen de varios factores incluyendo la estructura primaria, la cantidad de energía interna,
como se introduce la carga, etc. La figura a muestra la nomenclatura aceptada para la
fragmentación de iones propuesta por Roepstorff y Fohlman (1984), modificada
posteriormente por Johnson (1987).
Figura a. Fragmentación de iones en MS/MS.
Los fragmentos que se detectan contienen al menos una carga. Si la carga se retiene en
el fragmento amino terminal, los iones se denominan a, b y c, mientras que si la carga se
retiene en el C-Terminal los iones se denominan x, y ó z (figura b).
Figura b. Iones a, b, c, x, y y z. Estructuras monocargadas. Generalmente la

ionización genera péptidos con mayor carga, por lo que los iones pueden llevar más de un
protón.
184
Anexo B
Los espectros que se muestran a continuación, presentan iones del tipo y (color rojo),
b (color azul), y++ y b++. Los iones y++ y b++ son fragmentos con cargas inciertas donde la
carga del precursor es ≥ 2. En color negro se observan fragmentos no interpretados.
En los espectros obtenidos por Sherenga se muestran fragmentos no interpretados, los
cuales aparecen en valor numérico entre corchetes. Estos fragmentos pueden ser interpretados
por coincidencia de masas de dipéptidos o tripéptidos.
Espectros de MS/MS de PPO P1
A continuación se muestran los espectros de masas de los péptidos

DPLFYSHHNVDR, GPITIGGFSIELINTT y SEFAGSFVHVPHK.
185
Anexo B
Espectros interpretados mediante la secuenciación de novo de Sherenga de los

péptidos LPSGPLR, [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR] y [PT]QTNGEDFGAFYSA[GR].
186
Anexo B

péptidos AQDEVLVIK, [FD]VYVNDDADSLA[GK] y [IF]TDTSSSLYDQYR.
187
Anexo B

péptidos ELEMLGAETDSSLVV, [GI]EFAGNETVK, VYDENVSIP…K y
[TD]WLDTEFLFYDEK.
188
Anexo B
Espectros de MS/MS de PPO P2
Espectros de masas obtenidos para los péptidos FDVFINDDAESLSR,

IDENLAIMYR, VSNSPITIGGFKIEYSS Y MYLYFYER.
189
Anexo B

péptidos [ED]MGNFYSA[GR], [TF]TPDLSI[PLR], DPLFYAHHC[NV]DR y
[SE]FAGSFVHVPHN.
190
Anexo B

péptidos [TD]WLDTEFLFYDEK, A..TTGTHPGTIENT[PH], YEPVSVPWLFTK y
TPDLFFGHE[YR].
191
Anexo B
Espectro interpretado mediante la secuenciación de novo de Sherenga del péptido

MWNIWK
Espectros de MS/MS de PPO S1
Espectros de masas obtenidos para los péptidos DPLFYSHHSNVDR,

GPITIGGFSIELINTT y SEFAGSFVHVPHK.
192
Anexo B

péptidos [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR], [TD]WLDTEFLFYD[EK], [GI]EFAGNETVK y
[FD]VYVNDDADSLA[GK].
193
Anexo B
Espectro de masas obtenido para el péptido DPLFYSHHSNVDR.

péptidos [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR], [FD]VYVNDDADSLAGK y [GI]EFAGNETVK.
194
Anexo B
Espectros de masas obtenidos para los péptidos DPLFYSHHSNVDR y

VSNSPITIGGFK.
195
Anexo B

péptidos [LL]DLNYSGTDDDVDDA[TR], [GI]EFAGNETVK, [FD]VYVNDDADSLA[GK]
y [TD]WLDTEFLFYD[EK].
196

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II.1 Introducción ....................................................................................................................... 26

II.3.2 Caracterización cinética de PPO ............................................................................. 39

Capítulo III. Propiedades moleculares de la polifenol oxidasa latente

Capítulo IV. Regulación de la actividad enzimática de la polifenol oxidasa latente

IV.1 Introducción .....................................................................................................................66

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Capítulo V. Identificación molecular de polifenol oxidasas de níspero mediante

Capítulo VI. Estudio fisiológico de las polifenol oxidasas de frutos de níspero

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