UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA

CLUB DE REVISTA 18 Y 19 DE ABRIL - TALLER SECUENCIACIÓN DE PROTEINAS

La función de una proteína depende de su secuencia de primaria sin afectar a la función biológica, las proteínas
aminoácidos. La bacteria Escherichia coli produce más de contienen a menudo regiones cruciales que son esenciales
3.000 proteínas diferentes; un ser humano tiene unos 25.000 para su función y cuya secuencia se encuentra, por tanto,
genes que codifican un número muy superior de proteínas conservada. La fracción de secuencia que es crítica varía de
diferentes. En ambos casos cada tipo de proteína tiene una proteína a proteína, lo que complica la tarea de relacionar
estructura tridimensional única que le confiere una función ú secuencia con estructura tridimensional y estructura con
nica. Cada tipo de proteína también tiene una secuencia de función. No obstante, antes de poder profundizar en este
aminoácidos única. La intuición sugiere que la secuencia de problema, hemos de examinar de qué forma se obtiene la
aminoácidos debe desempeñar un papel fundamental en la información sobre la secuencia.
determinación de la estructura tridimensional de la proteína y
en último término su función, pero ¿es correcta esta Se ha determinado la secuencia de amínoácidos de millones
suposición? Una observación general sobre las proteínas y de proteínas. Dos importantes descubrimientos que tuvieron
sobre sus variaciones en la secuencia de aminoácidos lugar en 1953 fueron de importancia crucial en la historia de
proporciona una serie de pistas empíricas que ayudan a la bioquímica. En aquel año James D. Watson y Francis Crick
sustanciar la importante relación entre secuencia de aminoá dedujeron la estructura en doble hélice del DNA y
cidos y función biológica. propusieron una base estructural que explicaba su precisa
replicación. Su propuesta aclaró la realidad molecular que
Primero cabe decir que, proteínas con funciones diferentes estaba detrás de la idea de gen. En aquel mismo año,
siempre tienen secuencias de aminoácidos diferentes. En Frederick Sanger resolvió la secuencia de aminoácidos de las
segundo lugar, se han correlacionado miles de enfermedades cadenas peptídicas de la hor mona insulina (Fig. 1),
genéticas humanas con la producción de proteínas sorprendiendo a muchos investigadores que habían creído
defectuosas. El defecto puede ir desde un único cambio en la durante mucho tiempo que la elucidación de la secuencia de
secuencia de aminoácidos (como en la anemia falciforme) a la aminoácidos de un polipéptido sería una tarea
eliminación de una parte mayor de la cadena polipeptídica descorazonadoramente difícil. Rápidamente se hizo evidente
(como en la mayoría de casos de distrofia muscular de que la secuencia de nucleótidos del DNA y la secuencia de
Duchenne: una eliminación de una gran porción del gen que aminoácidos de las proteínas estaban relacionadas de algún
codifica la proteína distrofina da lugar a la producción de una modo. Tan sólo una década después de estos
proteína más corta e inactiva). Sabemos por tanto que, si se descubrimientos se había determinado el código genético
altera la estructura primaria, la función de la proteína tambié que relaciona la secuencia nucleotídica del DNA con la
n puede cambiar. Finalmente, al comparar proteínas con secuencia de amino ácidos de las moléculas proteicas. Gracias
funciones similares de diferentes especies encontramos que al rápido incremento de las bases de datos genómicos es
estas proteínas tienen a menudo secuencias de aminoácidos posible derivar las secuencias de un enorme número de
similares. Un caso extremo es la ubiquitina, una proteína de proteínas de forma indirecta a partir de las secuencias de
76 residuos aminoácidos implicada en la regulación de la DNA. Sin embargo, la moderna química de proteínas sigue
degradación de otras proteínas. La secuencia de aminoácidos utilizando con frecuencia los métodos tradicionales de
de la ubiquitina es idéntica en especies tan dispares como la secuenciación de polipéptidos, capaces de revelar detalles no
mosca del vinagre y el ser humano.
 deducibles de la secuencia de nucleótidos, como por ejemplo
La secuencia de aminoácidos de una proteína ¿está fijada las modificaciones que tienen lugar después de la síntesis del
absolutamente, es decir, es invariable para una proteína polipéptido. Actualmente la secuenciación química de proteí
concreta? No; es posible cierta flexibilidad. Se calcula que nas complementa las metodologías más novedosas y
entre el 20 y el 30% de las proteínas humanas son polimórfí proporciona múltiples vías para obtener datos de secuencia
cas, habiendo secuencias de aminoácidos que varían dentro de aminoácidos. Estos datos son de importancia crítica para
de la población humana. Muchas de estas variaciones de cualquier área de la investigación bioquímica.
secuencia no tienen ningún efecto, o muy poco, sobre la Los polipéptidos cortos se secuencian utilizando
función de la proteína. Además, proteínas que llevan a cabo procedimientos automáticos. Para analizar la estructura
una función similar en especies distantes pueden diferir de primaria de una proteína se utilizan diversos procedimientos.
manera importante en el tamaño global y en la secuencia de Para empezar, se dispone de diversos protocolos para marcar
aminoácidos. e identificar el residuo amino-terminal (Fig. 2a). Sanger
A pesar de que la secuencia de aminoácidos puede variar desarrolló el reactivo 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (FDNB) con
considerablemente en algunas regiones de la estructura este fin; otros reactivos utilizados son el cloruro de dansilo y

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el cloruro de dabsilo, que generan derivados más fácilmente anhidro, que conlleva la eliminación del aminoácido amino-
detectables que los derivados dinitrofenilados Una vez que se terminal en forma de anilinotiazolinona. El aminoácido
ha marcado el residuo amino-terminal con uno de estos modificado se extrae con disolventes orgánicos, se convierte
reactivos, se hidroliza el polipéptido (en HCl 6M) para obtener en un derivado más estable, feniltiohidantoína, mediante
sus aminoácidos constituyentes y se identifica el aminoácido tratamiento con ácido en disolución acuosa y finalmente se
marcado. Dado que la etapa de hidrólisis destruye el polipé identifica. El uso de reacciones secuenciales llevadas a cabo
ptido, este procedimiento no puede utilizarse para secuenciar primero en condiciones básicas y a continuación en con
un polipéptido más allá de su residuo amino-terminal. Sin disoluciones acídicas proporciona un control adecuado sobre
embargo, puede ayudar a determinar el número de polipé todo el proceso. Cada una de las reacciones del aminoácido
ptidos químicamente diferentes en una proteína, siempre amino-terminal puede completarse prácticamente en su
que cada uno tenga un residuo amino-terminal diferente. Por totalidad sin afectar a ninguno de los demás enlaces del pé
ejemplo, si la insulina se somete a este procedimiento se ptido. Después de la eliminación e identificación del residuo
marcarían dos residuos, Phe y Gly (Fig 1) amino-terminal, el nuevo residuo amino-terminal puede ser
marcado, eliminado e identificado a través de la misma serie
Para secuenciar un polipéptido completo se utiliza de reacciones. Este procedimiento se repite hasta que se ha
normalmente un método químico diseñado por Pehr Edman. determinado toda la secuencia. La degradación de Edman se
El procedimiento de la degradación de Edman, marca y realiza en un instrumento, denominado secuenciador, que
elimina sólo el residuo amino-terminal de un péptido, mezcla los reactivos en las proporciones adecuadas, separa
dejando el resto de enlaces peptídicos intactos (Fig. 2b). Se los productos, los identifica y registra los resultados. Estos mé
hace reaccionar el péptido con fenilisotiocianato en todos son extraordinariamente sensibles. A menudo puede
condiciones alcalinas suaves, lo que convierte el aminoácido determinarse la secuencia aminoácida completa a partir de
amino-terminal en un aducto feniltiocarbamilo (PTC). El unos pocos microgramos de proteína.

enlace peptídico contiguo al aducto de PTC se rompe a
continuación mediante reacción en ácido trifluoroacético

Figura 1: Secuencia de aminoáddos de la insulina bovina. Las dos cadenas polipeptídicas están unidas por enlaces disulfuro cruzados.
La cadena A es idéntica en las insulinas humana, de cerdo, perro, conejo y cachalote. Las cadenas B de vaca, cerdo, perro, cabra y
caballo son idénticas.

La longitud de polipéptido que puede secuenciarse con precisión mediante la degradación de Edman depende de la eficiencia de los
pasos químicos individuales. Consideremos un péptido que empiece con la secuencia Gly-Pro-Lys- en su extremo amino. Si la glicina
se eliminara con una eficiencia del 97%, el 3% de las moléculas del polipéptido en la solución mantendrían un residuo de Gly en su
extremo amino. En el segundo ciclo de Edman, el 94% de los aminoácidos liberados sería prolina (se eliminaría el 97% de residuos de
Pro del 97% de moléculas terminadas en Pro) y el 2,9% glicina (se eliminaría el 97% de los residuos de Gly del 3% de moléculas que
mantendrían su extremo terminal de Gly), mientras que un 3% de moléculas del polipéptido mantendrían residuos de Gly (0,1%) o
Pro (2,9%) en su extremo amino. En cada ciclo, los péptidos que no han reaccionado en los ciclos anteriores aportarán aminoácidos a
un fondo que crece continuamente, haciendo finalmente imposible determinar cuál es el siguiente aminoácido en la secuencia peptí
dica original. Los secuenciadores modernos alcanzan eficiencias superiores al 99% por ciclo, permitiendo secuenciar más de 50
residuos aminoácidos contiguos de un polipéptido. La estructura primaria de la insulina, resuelta por Sanger y colaboradores a lo
largo de un período de 10 años, podría ser ahora determinada por completo en un día o dos mediante secuenciación directa en un
secuenciador.

Las proteínas grandes deben secuenciarse a partir de fragmentos más pequeños

La precisión global en la determinación de una secuencia de aminoácidos disminuye generalmente a medida que aumenta la
longitud del polipéptido. Los largos polipéptidos de las proteínas han de romperse en trozos más pequeños para poder secuenciarlos
de manera eficiente. Este proceso consta de varios pasos. En primer lugar, se rompe la proteína en un conjunto de fragmentos
específicos mediante métodos químicos o enzimá- ticos. Si existen puentes disulfuro, es necesario romperlos. A continuación, se

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purifica cada fragmento y se secuencia mediante el procedimiento de Edman. Finalmente, se determina el orden en que los
fragmentos aparecen en la proteína original y se determina dónde están localizados, si es que los hay, los enlaces disulfuro.

Figura 2: Pasos en la secuenciación de un polipéptido. (a)La identificación del residuo amino-terminal puede ser el primer paso de la secuenciación
de un polipéptido. Aquí se muestra el método de Sanger para identificar el residuo amino-terminal. (b) El procedimiento de la degradación de
Edman permite obtener la secuencia completa de un péptido. En el caso de péptidos cortos este método por sí solo da la secuencia completa, por
lo que frecuentemente se omite el paso (a). El paso (a) resulta útil en el caso de polipéptidos de gran tamaño que a menudo se fragmentan en pé
ptidos más pequeños para su secuenciación.
de los enlaces peptídicos. Algunas proteasas cortan
Rotura de los enlaces disulfuro solamente los enlaces peptídicos adyacentes a residuos
Los puentes disulfuro interfieren en el procedimiento de aminoácidos específicos (Tabla 1) y por tanto fragmentan una
secuenciación. Un residuo de cistina al que se cortara uno de cadena polipeptídica de forma predecible y reproducible.
sus enlaces peptídicos mediante el procedimiento de Edman, Varios reactivos químicos cortan también los enlaces peptí
podría permanecer unido a otra cadena polipeptídica a través dicos adyacentes a residuos específicos. Entre las proteasas,
de su puente disulfuro. Los puentes disulfuro también la enzima digestiva tripsina sólo cataliza la hidrólisis de
interfieren en la rotura enzimática o química del polipéptido. aquellos enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo está
En la Figura 3 se esquematizan dos métodos utilizados para proporcionado por un residuo de Lys o Arg,
romper enlaces disulfuro de manera irreversible. independientemente de la longitud o secuencia de aminoá
cidos de la cadena De este modo puede predecirse el número
Rotura de la cadena polipeptídica. Pueden utilizarse varios de péptidos de menor tamaño producidos por rotura con
métodos para fragmentar la cadena polipeptídica. Las tripsina a partir del número total de residuos de Lys o Arg en
enzimas denominadas proteasas catalizan la rotura hidrolítica el polipéptido original, determinado a partir de la hidrólisis de

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una muestra intacta (Fig. 4) Un polipéptido con tres residuos cadena polipeptídica original. Se corta otra muestra del
de Lys y/o Arg dará lugar normalmente a cuatro péptidos más polipéptido intacto en fragmentos utilizando una enzima o
pequeños al ser cortado por la tripsina. Además, todos reactivo diferente, que corte enlaces peptídicos en puntos
excepto uno tendrán una Lys o Arg como carboxilo-terminal. diferentes a los cortados por la tripsina. Por ejemplo, el
Los fragmentos producidos por acción de la tripsina (u otra bromuro de cianógeno sólo rompe aquellos enlaces peptí
enzima o reactivo químico) se separan a continuación dicos en los que el grupo carbonilo es aportado por Met. Los
mediante métodos cromatográficos o electroforéticos. fragmentos resultantes de este segundo procedimiento se
separan y secuencian igual que los anteriores.
TABLA 1. Especificidad de algunos métodos usuales de Se examinan las secuencias de aminoácidos de cada
fragmentación de cadenas polipeptídicas fragmento obtenido con los dos procedimientos de rotura
Tratamiento (Origen Biológico) Puntos de corte con el fin de encontrar péptidos producto del segundo
Tripsina (páncreas bovino) Lys, Arg ( C) procedimiento cuyas secuencias establezcan una continuidad,
Proteasa de submaxillarus (Glá Arg (C) debido al solapamiento, entre los fragmentos obtenidos por
ndula submaxilar de ratón) el primer procedimiento de rotura. Los péptidos solapantes
Quimotripsina (páncreas bovino) Phe, Trp, Tyr ( C) obtenidos a partir de la segunda fragmentación dan el orden
Proteasa V8 de Staphylococcus Asp, Glu ( C) correcto de los fragmentos peptídicos obtenidos en la
aureus primera. Si se ha identificado el aminoácido amino-terminal
Pepsina (estomago porcino) Leu, Phe, Trp, Tyr (N) previamente a la primera hidrólisis de la proteína, se puede
Proteasa Asp-N Asp, Glu ( N) utilizar esta información para establecer cuál es el fragmento
Endoproteinasa Lys C Lys ( C) que proviene del extremo amino. Se pueden comparar los
dos conjuntos de fragmentos para detectar posibles errores
Bromuro de cianógeno Met ( C)
al determinar la secuencia de aminoácidos de cada
fragmento. Si el segundo procedimiento de rotura no
Secuenciación de los péptídos Todos los fragmentos peptí
consigue establecer continuidad entre todos los péptidos de
dicos resultantes de la acción de la tripsina se secuencian
la primera rotura, deberá utilizarse un tercero o incluso un
separadamente por el procedimiento de Edman.
cuarto método de rotura para obtener un conjunto de pé
ptidos que pueda proporcionar los solapamientos necesarios.
Ordenación de los fragmentos peptídicos Ahora debe de
terminarse el orden de estos ͞fragmentos trípticos͟ en la

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Localización de los puentes disulfuro Si la estructura primaria electroforesis y se comparan con el conjunto original de pé
incluye puentes disulfuro, su localización se determina en un ptidos generados por la tripsina. Por cada puente disulfuro
paso adicional una vez completada la secuenciación. De faltarán dos de los péptidos originales, al tiempo que
nuevo se corta una muestra de la proteína con un reactivo tal aparecerá un nuevo péptido más grande. Los dos péptidos
como la tripsina, pero esta vez sin romper los puentes que han desaparecido representan las regiones del polipé
disulfuro. Los péptidos resultantes se separan por ptido intacto que están unidas por el puente disulfuro.

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Figura 4: Fragmentación de las proteínas, secuenciaón y ordenación de los fragmentos peptídicos. Se determina en primer lugar la composición de
aminoácidos y el residuo N-temninal de una muestra intacta. A continuación, se rompen los puentes disulfuro presentes antes de la fragmentación
de forma que la secuenciación pueda transcurrir con eficiencia. En el ejemplo aquí mostrado, sólo hay dos residuos Cys (C), por lo que sólo hay una
posibilidad de localización del puente disulfuro. En los polipéptidos con tres o más residuos Cys, la posición de los puentes disulfuro puede
determinarse tal como se describió anteriormente.

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