Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

POSGRA
Optimización de la concentración de los azúcares reductores
totales de melaza de Saccharum officinarum L. “caña de
DO
azúcar” en la producción de proteína unicelular de Candida
utilis var. Major. Trujillo – Perú. 2018.
TESIS
PARA OBTAR EL GRADO ACADEMICO DE
MAESTRA EN CIENCIAS
MENCIÓN EN
BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL

Br. Casanova Guajardo, Marlin Deandra

ASESOR: DRA. Bardales Vásquez, Cecilia Betzabet

TRUJILLO – PERU
2018
Nº DE REGISTRO:…

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú.
Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
 PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado Dictaminador

En el cumplimiento con lo dispuesto en el reglamento de maestría de la

Escuela de Post Grado de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra
consideración y criterio el trabajo de Tesis para obtener el Grado Académico de
Maestro en Ciencias con mención en Biotecnología Agroindustrial y Ambiental
titulado: Optimización de la concentración de los azúcares reductores totales de
melaza de Saccharum officinarum L. ´´caña de azúcar´´ en la producción de
proteína unicelular de Candida utilis var. Major. Trujillo – Perú. 2018

El que dejo a su criterio para su evaluación, esperando cumplir los

requisitos para vuestra aprobación.

Trujillo, 12 de Noviembre del 2019.

Br. Marlin D. Casanova Guajardo

ii
 JURADO DICTAMINADOR

Dr. MAX HEBER ROBLES CASTILLO

PRESIDENTE

Dr. CARLOS LEÓN TORRES

SECRETARIO

Dra. CECILIA BETZABET BARDALES VASQUEZ

MIEMBRO

iii
 DEDICATORIA

A DIOS…

A mis padres Rosi y Marco

Por su gran apoyo constante e incondicional
en las metas que me propongo y por enseñarme
que todo sacrificio tiene una gran recompensa

A mi esposo Alexander
Por su comprensión e infinito
amor, por su gran apoyo el cual
me ayudó a lograr esta meta.

A mis hermanos Thyrza,

Mía y Mattías por su cariño
y apoyo moral.

A mi familia que directa o

indirectamente hicieron
posible este logro

iv
 AGRADECIMIENTOS

A mi Asesora Dra. Betzabet Bardales Vásquez por compartir sus conocimientos

y apoyarme de manera constante en el desarrollo de esta tesis.

A mi profesor y amigo Dr. Carlos León Torres quien me donó la cepa de

Candida utilis var. Major. C.E.C.T 1430 procedente de la Colección Española de
Cultivos Tipo y por su contribución en la ejecución de esta tesis.

v
 ÍNDICE

PRESENTACIÓN ii
JURADO DICTAMINADOR iii
DEDICATORIA iv
AGRADECIMIENTOS v
INDICE GENERAL vi
RESUMEN viii
ABSTRACT ix

I. INTRODUCCIÓN 1
II. MATERIAL Y MÉTODOS 6
1. Material 6
1.1 Material Biológico 6
2. Métodos 6
2.1 Reactivación de la cepa 6
2.2 Tratamiento de los sustratos 6
2.3 Preparación del inóculo 7
2.4 Acondicionamiento de los biorreactores 7
2.5 Proceso de producción de biomasa: Fermentación 7
2.6 Determinación de la optimización de la concentración de azúcares
reductores totales de melaza de caña de azúcar en la producción
de proteína unicelular de Candida utilis. var. major. 8
III. RESULTADOS 10
IV. DISCUSIÓN 17
V. CONCLUSIÓN 20
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 21
ANEXOS 25

vi
ANEXOS

Anexo 1: Melaza de Saccharum officinarum L. ´´caña de azúcar´´

Anexo 2: Composición físico – química de la melaza de
Saccharum
officinarum L. ´´caña de azúcar´´
Anexo 3: Tratamiento de la melaza de Saccharum officinarum L. ´´caña
de azúcar´´
Anexo 4: Observación microscópica y macroscópica de Candida utilis
var. Major. C.E.C.T. 1430
Anexo 5: Diseño del biorreactor tanque agitado y aireado
Anexo 6: Esterilización del sistema de fermentación en cámara UV
Anexo 7: Nomograma
Anexo 8: Valores de biomasa neta producida “X” (g/L) de Candida utilis
var. Major. Vs. La concentración de Azúcares Reductores
Totales (ART) suministrados “So” (g/L) de melaza de
Saccharum officinarum L. “caña de azúcar” y sus estimadores.
Anexo 9: Valores del rendimiento Y (%) de Candida utilis var. Major. Vs
la concentración de azúcares reductores totales (ART)
suministrados “So” (g/L) de melaza de Saccharum officinarum
L. “caña de azúcar” y sus estimadores.
Anexo 10: Valores de productividad del sistema “P” (g/L – h) de Biomasa
de Candida utilis var. Major. Vs la concentración de Azúcares
Reductores Totales (ART) suministrados ´´So´´ (g/L) de melaza
de Saccharum officinarum L. ´´caña de azúcar´´ y sus
estimadores.
Anexo 11: Valores promedio original y estimado de biomasa neta
producida (X), Rendimiento (Y) y Productividad (P) de
Candida utilis var. Major. a diferentes concentraciones de
Azúcares Reductores Totales (ART) suministrados, de melaza
de Saccharum officinarum L. “caña de azúcar”
Anexo 12: Secuencia fotográfica del proceso de producción de C. utilis
var. Major. de melaza de Saccharum officinarum L. ´´caña de
azúcar´´.
vii
 RESUMEN

La presente investigación tuvo como objetivo la optimización de la

concentración de los azúcares reductores totales de melaza de Saccharum
officinarum L. ´´caña de azúcar´´ en la producción de proteína unicelular Candida
utilis var. Major. Para ello se construyó un biorreactor de 16 cm de altura tipo
tanque agitado con turbina Rushton. La preparación del inoculo fue realizado a
partir de la cepa Candida utilis var. Major. C.E.C.T. 1430. El medio de cultivo
fue formulado a partir de diluciones de melaza desde 18 hasta 22 gr/L de azucares
reductores totales ´´ART´´. El bioproceso se llevó a cabo a 25ºC; a Ph DE 5.0 –
5.5 y durante un tiempo de 25 horas. Se encontró que la biomasa y productividad
aumentan progresivamente, desde 6.93 hasta 8.37 g/L y desde 0.277 hasta 0.3348
g/L-h respectivamente, tal como se aumenta la concentración de ´´ART´´ de
melaza. El rendimiento de Candida utilis. fue de 56.2% valor que fue tan cercano
al rendimiento teórico 56.7%

Finalmente, la concentración más óptima de azúcares reductores totales de

melaza de Saccharum officinarum L. fue de 18 g/L.

viii
 ABSTRACT

The present investigation had as objective decide the optimization of the

concentration of the sugar reductors total of molasses of Saccharum officinarum
L. ´´cane sugar´´ in the production of single cell protein Candida utilis var.
Major. For it a stirred tank reactor of 16 cm. Of heigth with turbine Rushton was
built. The preparation of the inoculo was carried out starting from Candida utilis
var. Major. C.E.C.T 1430. The médium of culture was formulated starting from
molasses dilutions from 15 to 22 g/L of ART (sugar reductors total). The
bioprocess was carried out at 25º C to pH 5.0 – 5.5 and during a time of 25 hours.
To be found that the biomass and productivy increase progressively (6.93 – 8.37
g/L and 0.277 – 0.3348g/L – h) respectively such as increase the molasses
concentration (ART). The yield of Candida utilis var. Major was 56.2% value so
closet he teorical yield 56.7%.

Finally, the most optimal concentration of ART of molasses of Saccharum

officinarum L. ´´cane sugar´´ was 18 g/L.

ix
 I. INTRODUCCIÓN

La tendencia mundial es el notable crecimiento en la generación de

residuos, derivado del incremento en la generación de productos
comercializables, se puede entonces decir que los residuos agroindustriales
son materiales en estado sólido o líquido que se generan a partir del
consumo directo de productos primarios o de su industrialización, y que ya
no son de utilidad para el proceso que los generó, pero que son
susceptibles de aprovechamiento o transformación para generar otro
producto con valor económico, de interés comercial y/o social (Saval,
2012).

El desarrollo de la industrialización trae consigo ventajas

indiscutibles como el aumento en la calidad de vida de las poblaciones,
pero a la vez la convierte en una sociedad de consumo para la cual la
industria debe ofrecer nuevos productos haciendo más complejos sus
procesos, generando cada vez mayores cantidades de residuos, que la
llevan a ser el blanco de muchas críticas y a adquirir una imagen de
contornos no muy positivos (Hanssen, 2000), aunque estos residuos no
representen el valor principal de la transformación pueden ser la materia
prima para otro producto (Saval, 2012). Para lo cual el diseño de las
plantas de transformación debe incorporar tecnologías que permitan su
utilización para darle un valor agregado (Galanakis, 2012).

La Libertad se constituye como una de las principales regiones

agrícolas de la costa peruana por las condiciones favorables que presenta
para su desarrollo. A las condiciones climáticas idóneas para un
importante número de productos, se adiciona el ser una de las regiones
líderes en la tecnificación de cultivos, fruto de las inversiones realizadas
durante la última década por el sector privado, así como por la

1
infraestructura generada por los grandes proyectos de irrigación (Región
La Libertad y Banco Central de Reserva del Perú, 2013).

La capacidad agrícola de la región se puede observar en la variedad

de productos en los que destaca a nivel nacional. La Libertad es el primer
productor de espárrago (cultivados principalmente en los valles de Virú y
Chao), caña de azúcar, palta, trigo, cebada, maíz amarillo duro y sandía, y
el segundo productor de alcachofa a nivel nacional y el cuarto productor
mundial (sembrándose en la Provincia de Virú, Pacasmayo, entre otros),
pimiento, col, arveja grano seco, coliflor, pepino, piña y fresa. Asimismo,
la región cuenta con 528,8 mil hectáreas de superficie agrícola, lo que la
convierte en la segunda región en extensión de superficie agrícola. Estos
factores, representan una base para consolidar una agricultura moderna,
basada en las ventajas comparativas de la región, destinada tanto al
mercado nacional como internacional (Región La Libertad y Banco
Central de Reserva del Perú, 2013).

Los desechos agrícolas son aquellos generados con el desarrollo de

un cultivo o tras el proceso de transformación producido en las industrias
agroalimentarias, la clasificación de estos desechos agrícolas son desecho
agrícola, residuo agrícola y subproducto agrícola. La biomasa
lignocelulósica se encuentra dentro de la clasificación, como subproducto
agrícola que es un residuo de la cual se puede obtener una segunda
utilidad. No es un desecho porque no se elimina y se utiliza para otro
proceso (Palazón, 2010).

Estos remanentes son producidos en millones de toneladas

alrededor del mundo y representan una abundante fuente de biomasa
lignocelulósica, barata y de fácil acceso. De estas enormes cantidades de

2
residuos agroindustriales, solamente una pequeña cantidad es empleada
como alimento animal, combustible para hogares y una mayor porción es
quemada en los campos creando un problema de contaminación ambiental.
(Arias y Meneses, 2016).

En la actualidad las agroindustrias no solo son valoradas por su

desempeño productivo y económico, sino también por su relación con el
medio ambiente, de manera que la protección de este ya no solo es una
exigencia sujeta a multas o sanciones sino que representa amenazas,
oportunidades y hasta condiciona su permanencia o salida del mercado, de
manera que la utilización eficaz, de bajo costo y ecológicamente racional
de estos materiales es cada vez más importante, sobre todo por las
restricciones legales que ya empiezan a surtir efecto en muchos países
incluyendo el nuestro (Wadhwa et al., 2013). Debido a la preocupación
ambiental de la sociedad, la agroindustria debe ser sensible a los temas
ambientales, procurando el desarrollo creciente de una conciencia social
que obliga a no producir a costa del planeta, sino de una manera
sostenible; considerando que los subproductos agroindustriales generados
desde el lugar de siembra y los que se derivan de su manejo y
comercialización constituyen un serio problema de residuos en gran parte
del mundo debido principalmente a que se han experimentado aumentos en
la producción (Yepes et al., 2008).

Las pocas alternativas, desde el punto de vista económico, social y

nutricional, que en la actualidad se presentan para el aprovechamiento de
los residuos agroindustriales, aunado a la falta de conciencia en la
protección del medio ambiente provocan que estos sean mal manejados y
se conviertan en fuentes de contaminación de los recursos naturales; suelo,
agua y aire. (Centro de Promoción Tecnología Sostenible, 2003). Por ello,
surge la necesidad de conversión de los mismos en un producto útil y de

3
mayor valor agregado, que además de solucionar un problema, generé
ingresos económicos adicionales; de ahí la importancia del estudio de
alternativas tecnológicas tendientes al aprovechamiento de los residuos
agroindustriales. (Yepes et al., 2008; Mirabella et al., 2014).

El primer avance en el cultivo de microorganismos para su

utilización como alimento se realizó al cultivar la levadura Candida utilis
en el licor de cocción al sulfito (subproducto de la industria del papel) y en
derivados de azúcares obtenidos por hidrólisis ácida de la madera y se la
empleó como suplemento alimentario para animales y personas en
Alemania durante la Segunda Guerra Mundial (Lee, 2000).

Como medio de cultivo para C. utilis se han usado Hidrocarburos:

petroquímicos como n-alcanos y combustibles como metano, metanol
parafina y etanol; desechos industriales como aguas residuales de las
industrias de la celulosa, del café, almidón, procesamiento de alimentos y
del papel, melaza de la industria azucarera, residuos de la industria
vinícola, desechos de la industria láctea, residuos de cáscara de cítricos,
entre muchos otros (Ferreira et al., 2010).

En una investigación de producción a nivel industrial de cultivo de

C. utilis, empleando melaza diluida al 2 %, se han obtenido rendimientos
de 45 % de levadura y 92 % de masa seca, teniendo en cuenta un
rendimiento teórico de 56,7 %, comparado con un 55 % en rendimiento
real que se obtuvo al trabajar con una concentración de 15 g/L de ART de
melaza; así también se obtuvo un rendimiento de 56.2 % a una
concentración de 20 g/L.de ART de cáscara de café. (Estévez, 1998; León,
2005; Rodríguez, 2011.).

4
 Teniendo en cuenta que la información sobre la relación
rendimiento- concentración del sustrato, posee una especial importancia,
ya que desde el punto de vista técnico- económico las ofertas de
instalaciones industriales a nuestra disposición nos sitúan ante la
alternativa de tecnologías de fermentación a altas y bajas concentraciones
y además que la oferta y demanda de proteína unicelular destinada al
consumo humano y animal en el periodo 1992 – 2001, estuvo liderada por
la levadura C. utilis tanto en Estados Unidos, La Unión Europea y Asia, es
necesario realizar trabajos de investigación orientados a determinar la
concentración óptima de los azúcares reductores totales de melaza de
Saccharum officinarum L. ¨caña de azúcar¨ en la producción de proteína
unicelular de C. utilis var. Major

5
 II. MATERIAL Y MÉTODOS

1. MATERIAL
1.1 Material Biológico:
 Cultivo de Candida utilis var. major proveniente de la
colección española de cultivos tipo CECT 1430. Donada por el
Dr. Carlos León Torres del Departamento de Química
Biológica y Fisiología Animal. Facultad de Ciencias Biológicas
– UNT.
 Melaza de caña de azúcar proveniente del Complejo
Agroindustrial Cartavio S.A.C. del Centro Poblado Menor
¨Cartavio¨. Distrito de Santiago de Cao- La Libertad. (Anexo 1
y 2)

2. MÉTODOS
2.1 Reactivación de la cepa:
La cepa se reactivó en medio agar y caldo sabouraud (Bailón,
2001).

2.2 Tratamiento de los sustratos:

2.2.1 Tratamiento de la melaza de caña de azúcar y
preparación del caldo fermentativo:
La melaza de caña de azúcar se sometió a
clarificación mediante el método ácido en caliente (Estévez,
1998) (Anexo 3).

Sse determinó la concentración de “ART” azúcares

reductores totales según el método de Folin-Wu (Folin, O. y
H. Wu. 1920) y dicha concentración fue diluida con agua
destilada estéril preparándose las concentraciones
siguientes: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22; las mismas que
constituyeron el caldo fermentativo. A este caldo

6
 fermentativo se le adicionó una concentración de 1% de
sulfato de amonio (Bailón, 2001).

2.3 Preparación del inóculo:

El cultivo de la cepa de Candida utilis. var. major fue
sembrada en el medio de mantenimiento (agar sabouraud) y se
incubó durante 24 horas a 30ºC (Marchand, 1997). Del desarrollo
de este cultivo se hizo un traspaso al medio de propagación
compuesto por 700 mL de caldo sabouraud – oxitetraciclina
(Manual Difco, 2005) el cual se incubó a temperatura ambiente
durante 48 horas. La pureza del cultivo se verificó por observación
microscópica (Anexo 4).
El inóculo tuvo una concentración celular de 1 x 10 5 cel/mL
(Gómez, 1999).

2.4 Acondicionamiento de los biorreactores:

Se emplearon 9 biorreactores de 1 L. de capacidad; con 16 cm.
de altura, 10 cm. de diámetro y 10 cm. de base y se le adaptó una tapa
a presión de Jebe Microporoso de 2 pulgadas (Anexo5).

Cada bioreactor fue equipado con un sistema de aireación y

agitación previamente desinfectados en la cámara UV durante tres
tiempos de 1 hora con un descanso de 5 minutos entre ellos (Anexo 6)
El aire insuflado a los biorreactores fue esterilizado a través de
una solución salina al 20% y suministrado a 20 mL/seg. Los
biorreactores fueron colocados en un ambiente cerrado a una
temperatura de 25 – 30ºC (Torres, 1995).

2.5 Proceso de producción de biomasa: Fermentación

En cada biorreactor se adicionó 630 mL. del caldo fermentativo
a las concentraciones de estudio (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 g/L
ART), la fuente nitrogenada (sulfato de amonio, al 1%) y 70 mL. del
inóculo previamente preparada.

7
 El proceso se realizó a un pH de 5.0 – 5.5. Se fermentó por un
lapso de 25 horas a una temperatura de 25ºC  3ºC.

Además, se realizó un ensayo blanco (630 mL de agua

destilada estéril y 70 mL de inóculo). Repitiéndose posteriormente 2
veces más (Torres, 1997).

2.6 Determinación de la optimización de la concentración de azúcares

reductores totales de melaza de caña de azúcar en la producción
de proteína unicelular de Candida utilis. var. major.
2.6.1 Determinación del peso seco de la biomasa:
La producción de proteína unicelular por Candida.
utilis. var. major. se realizó durante 25 horas (Bailón,
2001). Transcurrido dicho tiempo, se centrifugaron los
medios fermentativos a 15 000 g (Anexo 7) durante 20
minutos, eliminándose el sobrenadante y el sedimento se
lavó 3 veces con agua destilada estéril. Los sedimentos
fueron colocados en placas petri de peso conocido y
llevados a la estufa a 70ºC hasta peso constante, las cuales
luego fueron pesadas con la finalidad de obtener el peso
seco de la biomasa (Gómez, 1999); así mismo se harán
conteos de celdas en placa de Newbauer (León, 2005)

2.6.2 Cuantificación de los azúcares reductores totales

residuales:
Finalizado el proceso de fermentación, se centrifugó
100 mL del caldo fermentativo a 3 500 rpm por 20 minutos,
luego en el sobrenadante se determinó la concentración de
azúcares reductores totales residuales mediante el método
de Folin – Wu (Folin, O. y H. Wu. 1920).

8
 2.6.3 Determinación del rendimiento en base a azúcares
reductores totales suministrados (Y x/s)
Se determinó según (Herbert, 1999).

XF X O
Yx / s 
SO SF
Dónde: Xo = Biomasa inicial g/L
XF = Biomasa final g/L
So = Azúcares reductores total inicial g/L
SF = Azúcares reductores total final g/L

2.6.4 Cálculo de la Productividad (P g/L.h)

Se determinó según (Herbert, 1999)

XF  Xo X
P t t
Dónde: X = Biomasa neta producida
t = Tiempo de fermentación en horas
Xo = Biomasa inicial g/L
XF = Biomasa final g/L

2.7 Análisis estadístico:

Los resultados obtenidos de las variables biomasa, rendimiento
y productividad fueron evaluados mediante la estimación de medidas
de tendencia central y dispersión; comparación de medias según el
método “t”; correlación y regresión lineal (Freese, 1988).

9
 III. RESULTADOS

Los resultados del trabajo de investigación acerca de la optimización de la

concentración de azúcares reductores de melaza de Saccharum officinarum. L.
“caña de azúcar” en la producción de proteína unicelular de Candida utilis. var.
Major., se muestran en la siguiente tabla y figuras.

En la Tabla 1 se indica la relación de las variables (correlación y

regresión) de la concentración de azúcares reductores totales de melaza de caña de
azúcar con la biomasa, el rendimiento y la productividad de C. Utilis. var. major,
lo cual demuestra la dependencia de las variables biomasa y productividad y la no
dependencia del rendimiento con respecto a la concentración de azúcares
reductores totales de melaza de caña de azúcar.

En la tabla 2 se observa el análisis de la comparación de medias por el

método ´´t´´ al 1% de error, donde la biomasa neta producida sigue una relación
directa con la concentración de azucares suministrados So g/L; del mismo se
evidencia la productividad, sin embargo, en el rendimiento ´´y´´ no existe el
mismo patrón notándose claramente y la concentración óptima para el mayor
rendimiento fue de 18 gr/L de ART de melaza de Saccharum officinarum ´´caña
de azúcar´´

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Tabla 1: Relación de las variables (correlación y regresión) de la concentración de azúcares reductores totales de
melaza de Saccharum officinarum L. “caña de azúcar” y la biomasa neta producida “X”, el rendimiento “Y” y la
productividad “P” de Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430

VARIABLES BIOMASA RENDIMIENTO PRODUCTIVIDAD

“X” “Y” “P”
r 0.97613 0.66150 0.97230
a -1.0033041 -1.01737777 -1.0051602
b 3.0012132 0.42963977 4.3488893
g.L. 7 7 7
CONCENTRACIÓN /2 5% 5% 5%
tC 11.999* 2.786 11.785*
tt 2.365 2.365 2.365
FC 151.403** 5.499 128.785**
Ft 5.59 5.59 5.59

* Diferencias altamente significativas (5%) error

** Diferencias altamente significativas (5%) error

11

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Tabla 2: Resultados del análisis de la comparación de medias por el método “t” de la biomasa neta producida “X”, el
rendimiento “Y” y la productividad “P” de Candida utilis. var. major C.E.C.T. Vs la concentración de azúcares reductores
totales de melaza de Saccharum officinarum L. “caña de azúcar”
SO (g/L)
ART 15 16 17 18 19 20 21 22
COMPARACIÓN DE MEDIAS

1* 2 3 4 5 6 7 8 9*

X BLANCO 15 16 17 18 19 20 21 22
(g/L)

Y ----- 22 21 20 15 19 16 17 18*
(%)

P BLANCO 15 16 17 18 19 20 21 22
g/L-H

*Leyenda: diferencias altamente significativas (1%) error

12
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Figura 1: Relación entre la concentración de azúcares reductores totales (ART)

suministrados “So” (g/L) de melaza de Saccharum officinarun. L.
“caña de azúcar” y la biomasa neta producida “X” (g/L) de Candida
utilis. var. major C.E.C.T.1430.

La Figura 1 muestra la dependencia relación entre la concentración de

azúcares reductores totales suministrados de melaza de caña de azúcar y la
biomasa neta producida de C. utilis. var. major., observándose que existe
dependencia o regresión lineal en dichas variables. La biomasa aumenta
progresivamente desde 6.93 hasta 8.37 g/L (Anexo 8 y 11) tal como se aumenta la
concentración de azúcares reductores totales de melaza de caña de azúcar.

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Figura 2: Relación entre la concentración de azúcares reductores totales (ART)
suministrados “So” (g/L)” de melaza de Saccharum officinarun. L.
“caña de azúcar” y el rendimiento “Y” (%) de Candida utilis. var.
major. C.E.C.T.1430.

La Figura 2 muestra la relación entre la concentración de azúcares

reductores totales suministrados de melaza de caña de azúcar y el rendimiento de
C. utilis. var. major. notándose claramente que no existe dependencia o regresión
lineal de las variables. El rendimiento es óptimo a la concentración de 18 g/L de
ART (56.2%) (Anexo 9 y 11).

14
Figura 3: Relación entre la concentración de azúcares reductores totales (ART)
suministrados “So” (g/L) de melaza de Saccharum officinarun. L.
“caña de azúcar” y la productividad “P” (g/L – h) de Candida utilis.
var. major. C.E.C.T.1430.

La Figura 3 muestra la relación entre la concentración de azúcares

reductores totales suministrados de melaza de caña de azúcar y la productividad
de C. Utilis. var. major., observándose que existe dependencia o regresión lineal
entre las variables. La productividad aumenta progresivamente desde 0.277 hasta
0.3348 g/L.h (Anexo 9 y 11) tal como se incremente la concentración de azúcares
reductores totales de melaza de azúcar y la biomasa neta producida
respectivamente.

15
Figura 4: Comparación del Rendimiento “Y” (%) Teórico y Experimental de
Candida utilis. var. major. C.E.C.T.1430 a diferentes
concentraciones de azúcares reductores totales (ART)
suministrados “S” (g/L) de melaza de Saccharum. officinarun. L.
“Caña de azúcar”

La Figura 4 presenta la comparación del valor del rendimiento teórico y

experimental de C. utilis. var. major a diferentes concentraciones de azúcares
reductores totales suministrados de melaza de caña de azúcar, siendo el valor más
cercano, la concentración de 18 g/L ART y el valor más lejano 22 g/L ART.

16
 IV. DISCUSIÓN

Las características de los procesos microbianos a escala industrial presentan

grandes diferencias con los procesos a escala de laboratorio. Esto es
particularmente crítico en lo referente a sustratos: en laboratorio, están
perfectamente definidos en cuanto a composición, pureza, etc. mientras que a
escala industrial esto no es posible por no ser económicamente viable, por lo que
se utilizan generalmente residuos de otras industrias. Estos residuos han de
cumplir los siguientes requisitos para poder ser usados como sustrato: Contener
una fuente de carbono y nitrógeno suficientemente rica. Han de presentarse en
formas asequibles por las células, Cierto contenido en oligoelementos y sales
minerales, básicos para que los microorganismos efectúen sus funciones,
Tamponadores de pH. Debido a la actividad microbiana, el pH del medio puede
sufrir grandes variaciones, lo que puede llegar a inhibir el crecimiento microbiano.
Para minimizar estos efectos, se añaden tampones, Su composición ha de ser lo
suficientemente equilibrada; sin exceso ni limitación de ningún nutriente
necesario. Si no fuese así, el metabolismo del microorganismo puede
desequilibrarse hacia procesos que no son los habituales, lo que puede
interesarnos o no, en función de si los productos producidos son los que
buscamos. Cabe señalar que este proceso se llevó a cabo manteniendo el pH a 5.5,
la temperatura a 25° C y un flujo de aire de 20mL/seg. en un ambiente de
laboratorio.

Para el presente caso la melaza obtenida de la producción del azúcar de caña es

una alternativa viable para el desarrollo de esta tecnología, representando la
principal fuente de carbohidratos, vitaminas y minerales para el medio
fermentativo, según sus características composicionales (Fajardo y Sarmiento
2007). Así mismo la fuente nitrogenada es vital para el medio, ya que juega un
rol especial como elemento plástico en la formación de biomoléculas, Alrededor
del 70% del nitrógeno total de las levaduras esta en forma de proteínas, el 8 - 10%
como purina y el 4% como pirimidina. El resto está en forma de aminoácidos y
nucleótidos (Petrenko, 2005).

17
Para la producción de proteína unicelular de Candida. utilis. var. major. se
necesita agregar sustancias nitrogenadas y carbonadas del medio de cultivo que
puedan ser asimiladas y transformadas en nutrientes esenciales para el
crecimiento, en la presente investigación se usó sulfato de amonio 1 g/L (Bailón,
2001), porque si se cultiva en un medio con limitación de nitrógeno, la producción
de C. utilis. var. major. es baja (Israelidis y Evangelopoulos, 1980); así, también
la cantidad de azúcares presentes en el medio fermentativo un factor influyente en
el rendimiento de proteína unicelular de C. utilis. var. major (Estévez, 1998).

En la Tabla 1 se observa la relación de las variables (correlación y regresión) las

cuales demuestran la dependencia de la biomasa neta producida y la productividad
y la no dependencia del rendimiento de C. utilis. var. major con respecto a la
concentración de azúcares reductores totales de melaza de caña de azúcar.
Trabajos realizados han demostrado que la producción de proteína unicelular de
C. utilis. var. major. C.E.C.T. 1430 está en función de la composición del medio
de cultivo, de las condiciones ambientales y del tipo de microorganismo (Estévez,
1998); sin embargo, en la presente investigación los parámetros: condiciones
ambientales y tipo de microorganismo fueron mantenidos constantes durante el
proceso; por lo que la producción de proteína unicelular de C. utilis. var. major.,
dependió únicamente del medio del cultivo.

La biomasa neta producida, el rendimiento y la productividad de C. utilis. var.

major. a diferentes concentraciones de azúcares reductores totales de melaza de
caña de azúcar presentados en las figuras 1, 2 y 3 y (Anexo 8, 9 y 10), muestran
diferencias altamente significativas (5 % error) respectivamente según la
regresión. La biomasa neta producida de C. utilis. var. major. aumenta
progresivamente tal como se incrementa la concentración de azúcares reductores
totales de melaza de caña de azúcar. Similar comportamiento ocurre con la
productividad, debido a que existe una buena homogenización y disponibilidad
del sustrato en el medio (Estévez, 1998), En la tabla 2 se aprecia los resultados de
la comparación de medias por el método “t” (1% error) (Freese, 1988). Con

18
respecto al rendimiento éste es máximo a la concentración de 18 g/L de azúcares
reductores totales, decayendo progresivamente conforme aumenta la
concentración de azúcares reductores. Este comportamiento se explica mediante el
metabolismo endógeno del microorganismo, ya que los sitios reactivos de una
enzima (llamados sitios activos) pueden catalizar una reacción química
convirtiendo una molécula en otra; útiles para desarrollo y mantenimiento propio
de la célula (Herbert, D. 1999).

Son varias las causas del comportamiento antes mencionado, ya que la efectividad
del metabolismo de un cultivo está profundamente influenciado por las
condiciones físico-químicas a que se encuentra sometida la población celular, por
ejemplo: La presencia de sustratos coloidales capaces de inhibir la actividad
celular, los efectos de los productos metabólicos secundarios sobre el crecimiento
del microorganismo, el efecto de la densidad poblacional en el rendimiento de los
microorganismos sobre el sustrato, la limitación parcial del crecimiento por
ausencia o insuficiencia de otros constituyentes no azúcares en el sustrato, la
inhibición de la actividad enzimática por sobre saturación de sustrato y, por
la existencia de gradientes de concentración en el seno del cultivo provocado
por mezclado insuficiente o deficiente. (Leandro, 1981; Quintero, 1981; Torres,
1995 y Estévez, 1998).

Utilizando a nivel industrial el cultivo de C. utilis. var. major. empleando melaza

diluida de caña de azúcar al 2% (20 g/L) se obtuvieron rendimientos del 45%; aún
un tanto lejos del rendimiento teórico 56.7% Estévez (1998), León, 2005 encontró
que el rendimiento de C. utilis. var. major. obtenido (55%) es superior a (45%).

La concentración más óptima de azucares reductores totales de melaza de

Saccharum officinarum L. fue de 18g/L logrando un mayor rendimiento, dando un
valor de 56.2%, el cual, al comparar con los resultados antes mencionados, está,
mucho más cerca del valor teórico

19
 V. CONCLUSIÓN

De los resultados obtenidos de la optimización de la concentración

de azúcares reductores totales de melaza de Saccharum officinarum L.
´´caña de azúcar´´ en la producción de proteína unicelular de Candida
utilis. var. major., a temperatura de 25ºC; pH de 5.0 – 5.5 y a un flujo de
aire de 20 mL/sg. se concluye lo siguiente:

La optima concentración de azucares reductores totales de melaza de

“caña de azucar” para el máximo rendimiento de proteína unicelular de C.
utilis. var. major. fue 18gr/L.

A 18gr/L de azúcares reductores totales de melaza de Saccharum

officinarum L. ´´caña de azucar´´se produjo un rendimiento de 56.2 % de
proteínas unicelulares C. utilis. var. major. con una productividad de 0.3348
g/L

20
 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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24
ANEXOS

25
Anexo 1 : Melaza de Saccharum officinarum. L. “caña de azúcar”

POSGRA
DO

26
Anexo 2 : Composición físico – química de la melaza de
Saccharum officinarum. L. “caña de azúcar”

Composición aproximada de la melaza de caña (% peso)

Límites
Constituyentes normales de
Componentes
principales los
porcentajes
Agua 17 – 25
Sacarosa 30 – 40
Glucosa (dextrosa) 4–9
Azúcares Fructosa (levulosa) 5 – 12
Otras sustancias reductoras (como
invertidos) 1–4
Gomas, almidón, pentosanas,
Otros también trazas de hexitoles,
2–5
carbohidratos mioinositol, D-manitol y ac.
Urónicos
Ceniza Como carbonatos 7 – 15
(100%) de ceniza
K2O 30 – 50
CaO 7 – 15
MgO 2 – 14
Na2O 0.3 – 9
R2O2 (Fe) 0.4 – 2.7
SO3 7 – 27
Cl 12 – 20
P2O5 0.5 – 2.5
SiO2 e insolubles 1–7
Proteína cruda (N x 6.25) 2.5 – 4.5
Proteína verdadera 0.5 – 15
Aminoácidos, ac. Aspártico, ac.
Compuestos
glutámico, incluso pirrolidina del 0.3 – 0.5
Nitrogenados
ac. carboxílico
compuestos nitrogenados sin
identificar 1.5 – 3.0
Ac. Aconítico (1 a 5%), cítrico, 1.5 – 6.0
Ácidos no málico, oxálico, glicólico
nitrogenados Mesacónico, succínico, fumárico,
Tartárico 0.5 – 1.5
Ceras, esteroles y
0.1 – 1.0
fosfátidos
Vit. A, biotina, niacina, ac. Cantidades
Vitaminas
pantoténico, riboflavina, tiamina variables

Fuente: CHEN, J. 1997. Manual del azúcar de caña.

27
Anexo 3 : Tratamiento de la melaza de Saccharum officinarum. L.
“caña de azúcar”

CLARIFICACIÓN DE LA MELAZA MEDIANTE

EL MÉTODO ÁCIDO EN CALIENTE
(Estévez, 1998)

Diluir la miel 1:1 en peso, calentar durante 30 minutos a 80ºC,

ajustar el pH mediante ácido sulfúrico a 3.2, calentar a 80ºC
nuevamente durante 60 minutos. Se deja sedimentar y enfriar
durante 12 horas y luego se centrífuga.

DE

OTECA

28
Anexo 4 : Observación microscópica y macroscópica de
Candida utilis var. major C.E.C.T. 1430
FOTO A : Se observa células de C. utilis
FOTO B : Se observan las colonias de C. utilis. En agar sabouraud.

POSGRA
DO
FOTO A: Observación microscópica

LIOTE
CA

FOTO B: Observación macroscópica

29
Anexo 5 : Diseño del biorreactor tanque agitado y aireado

POSGRA
DO DE

BIBLIOTECA

Escala : ½

30
Anexo 6 : Esterilización del sistema de fermentación en cámara UV

POSGRA
DO

31
ANEXO 7 : Nomograma

32
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

ANEXO 8: Valores de biomasa neta producida “X” (g/L) de Candida utilis var. Major. Vs. La concentración de Azúcares Reductores
Totales (ART) suministrados “So” (g/L) de melaza de Saccharum officinarum L. “caña de azúcar” y sus estimadores.

X So (g/L.)
Blanco 15 16 17 18 19 20 21 22
Ni
1 0.0028 6.92 6.99 7.18 7.69 7.89 7.99 8.21 8.39
2 0.0031 6.87 7.11 7.32 7.56 7.92 8.01 8.15 8.42
3 0.0031 7.01 7.15 7.49 7.81 7.85 8.15 8.13 8.30

ΣXi 0.0090 20.8 21.25 21.99 23.06 23.66 24.15 24.49 25.11

X 0.0030 6.93 7.08 7.33 7.68 7.89 8.05 8.16 8.37

E.S 0.0001 0.040961 0.048074 0.048074 0.072188 0.020276 0.050332 0.024037 0.036056

S 0.000173
0.070946 0.083267 0.155242 0.125033 0.035119 0.087178 0.041633 0.06245
S2 0.00000003
0.005033 0.006933 0.0241 0.015633 0.001233 0.0076 0.001733 0.0039

Diagrama I: Comparación de medias método “t”

Concentración*: B 15 16 17 18 19 20 21 22
*Leyenda: diferencias altamente significativas (1%) error

33

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú.
Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
ANEXO 9: Valores del rendimiento Y (%) de Candida utilis var. Major. Vs la concentración de azúcares reductores totales (ART)
suministrados “So” (g/L) de melaza de Saccharum officinarum L. “caña de azúcar” y sus estimadores.

Y So
Blanco 15 16 17 18 19 20 21 22
ni
1 --- 54.1 54.7 55.5 56.1 55.3 53.1 50.2 48.7
2 --- 54.5 54.9 55.8 56.2 54.2 52.0 49.8 49.2
3 --- 54.7 54.8 55.9 56.3 54.4 51.0 49.8 48.6
ΣXi --- 163.3 164.4 167.2 168.6 163.9 156.1 149.3 146.5
X --- 54.43 54.80 55.73 56.2 54.63 52.03 49.76 48.83
E.S --- 0.17638342 0.05773503 0.12018504 0.05773503 0.33829639 0.60644685 0.13333333 0.18559215
S ---
0.30550505 0.10000000 0.2081666 0.10000000 0.58594653 1.05039675 0.23094011 0.32145503
S 2 ---
0.09333333 0.01000000 0.04333333 0.01000000 0.34333333 1.10333333 0.05333333 0.10333333

Diagrama II: Comparación de medias método “t”

Concentración*: B 22 21 20 15 19 16 17 18
*Leyenda: diferencias altamente significativas (1%) error

34
ANEXO 10: Valores de productividad del sistema “P” (g/L – h) de Biomasa de Candida utilis var. Major. Vs la concentración de
Azúcares Reductores Totales (ART) suministrados ´´So´´ (g/L) de melaza de Saccharum officinarum L. ´´caña de azúcar´´
y sus estimadores.

P So
BLANCO 15 16 17 18 19 20 21 22
ni
1 0.000112 0.2768 0.2796 0.2872 0.3076 0.3156 0.3196 0.3284 0.3356
2 0.000124 0.2748 0.2844 0.2928 0.3024 0.3168 0.3204 0.3260 0.3368
3 0.000124 0.2854 0.286 0.2996 0.3124 0.3140 0.326 0.3252 0.332
ΣXi 0.00036 0.832 0.850 0.8796 0.9224 0.9464 0.966 0.9796 1.004
X 0.00012 0.277 0.283 0.8796 0.3074 0.3155 0.322 0.3265 0.3348
E.S 0.00004
0.00325167 0.00192296 0.00358515 0.00288752 0.00081104 0.00201329 0.00096148 0.00144222
S 0.0000093
0.00563205 0.00333067 0.00620967 0.00500133 0.00140475 0.00348712 0.00166533 0.002498
11
S2 4.8X10
0.00003172 1.1093E-05 3.856E-05 2.5013E-05 1.9733E-06 0.00001216 2.7733E-06 6.24E-06

Diagrama III: Comparación de medias método “t”

Concentración*: B 15 16 17 18 19 20 21 22
*Leyenda: diferencias altamente significativas (1%) error

35
ANEXO 11: Valores promedio original y estimado de biomasa neta producida (X), Rendimiento (Y) y Productividad (P) de
Candida utilis var. Major. a diferentes concentraciones de Azúcares Reductores Totales (ART) suministrados, de
melaza de Saccharum officinarum L. “caña de azúcar”

So X(g/L) Y(%) P(g/L-h)

original estimado original estimado original estimado
BLANCO 0.003 -1.0544039 0.00 -1.0285777 0.00012 -1.0080803
15 6.93 44.189961 54.43 5.599888 0.277 65.1854985
16 7.08 44.259837 54.80 6.198955 0.283 69.584522
17 7.33 48.589252 55.73 6.895574 0.2932 74.895452
18 7.68 52.855255 56.20 7.295527 0.3074 79.854522
19 7.89 56.565658 54.63 7.795562 0.3155 84.875495
20 8.05 59.258878 52.03 7.993667 0.3220 88.998871
21 8.16 63.457858 49.76 8.688542 0.3265 93.789562
22 8.37 66.989894 48.83 8.999887 0.3348 99.5896501

36
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Anexo 12: Secuencia fotográfica del proceso de producción de C. utilis

var. Major. de melaza de Saccharum officinarum ´´caña de
azúcar´´.

POS
Foto 1: Autoclave para la esterilización del agua destilada en la
preparación del medio fermentativo.

TEC
A

Foto2: Tindalización del medio fermentativo

37

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú.
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 Foto 3: Biorreactor de 1L de capacidad, con el
de agitación, turbina tipo rushton

DE
Foto 4: Sistema completo de los biorreactores para el bioproceso de la producción
de proteína unicelular de Candida utitlis var. Major.

Foto 5: Solución de Nacl al 20% para esterilización del aire del sistema de
fermentación

38
 Foto 6: Secuencia de la producción de inoculo de Candida utilis var. Major. de
melaza de ´´caña de azúcar´´

PO
DE
Foto 7: Incubación del inoculo de Candida utilis a 25º C

TEC
A

Foto8: Colecta del medio fermentativo después de 25 horas del bioproceso para la
producción de biomasa de Candida utilis var. Major.

39