CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

LIC. EN ANÁLISIS QUÍMICO BIOLÓGICOS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA II

QUINTO SEMESTRE

REPORTE #3
“Producción de piruvato durante la fermentación de glucosa por
levaduras”

 Marco Antonio Martínez Ramírez.

 Paola Montañez Devora
 Giovanni Bautista Gómez
 Daniel García Márquez

Profesor: Janeth Cecilia Sánchez Arana

Aguascalientes, Ags. A 13 de abril de 2016

OBJETIVOS
Objetivos Generales:

1. Cuantificar la producción de piruvato mediante la fermentación de la

glucosa por levaduras.
2. Determinar el efecto del pH del cultivo de las levaduras sobre la
acumulación de piruvato.
Objetivos particulares:

1. Preparar un sistema fermentativo de la glucosa para la producción de

piruvato.
2. Elaborar una curva patrón de piruvato de sodio por espectrofotometría a
una absorbancia de 505 nm.
3. Determinar cualitativamente la producción de piruvato mediante la
reacción con nitroprusiato de sodio.
4. Determinar cuantitativamente la producción de piruvato mediante 2,4-
dinitrofenilhidrazina.

INTRODUCCION

Para describir la palabra fermentación se refirió originalmente al metabolismo

anaeróbico de los compuestos orgánicos mediante microorganismos o sus
enzimas para dar lugar a productos más simples que la materia prima. La
definición actual es:

“Cualquier acción microbiana controlada por el hombre para obtener productos

útiles”.

Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y

segregan algunos compuestos bioquímicos de importancia para el hombre; estas
son las características en las que se ha basado el uso de los microorganismos
como productores de fermentación, la que de una manera esquemática se puede
representar así:

Microorganismos + Nutrientes + Condiciones Ambientales Adecuadas -------

Microorganismos + CO2(g) + Productos intracelulares y extracelulares.

El ácido pirúvico es un compuesto orgánico clave en el metabolismo (El anión

carboxilato del ácido pirúvico se conoce como piruvato). Es el producto final de
la glucólisis, una ruta metabólica universal en la que la glucosa se escinde en dos
moléculas de piruvato y se origina energía (2 moléculas de ATP). El ácido pirúvico
así formado puede seguir dos caminos:

1. Si hay suficiente suministro de oxígeno, el ácido pirúvico

es descarboxilado en la matriz de la mitocondria por el complejo
enzimático piruvato deshidrogenasa rindiendo CO2 y acetil coenzima
A que es el inicio de una serie de reacciones llamada ciclo de Krebs,
seguida de la fosforilación oxidativa.
2. Si no hay suficiente cantidad de oxígeno disponible o el organismo es
incapaz de continuar con el proceso oxidativo, el piruvato sigue una
ruta anaeróbica, la fermentación. En esta vía, el piruvato se reduce,
permitiendo regenerar las moléculas de NAD + consumidas en los procesos
anteriores. Los animales son capaces de realizar la fermentación láctica
cuyo producto es ácido láctico. Las bacterias y levaduras son más
versátiles, y pueden realizar otras fermentaciones, como la fermentación
alcohólica, cuyo producto es etanol. En la conversión en lactato, interviene
la enzima lactato deshidrogenasa y la coenzima NADH; en la fermentación
alcohólica el piruvato es convertido primero en acetaldehído y luego
en etanol y dióxido de carbono, interviniendo las enzimas piruvato
descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa, así como la coenzima NADH.

Cabe destacar la importante diferencia entre el ácido pirúvico y el anión piruvato,

que son similares pero no iguales, aunque sólo les diferencia perder o ganar un
catión hidrógeno.

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos
Micropipetas Fosfato de sodio dibasico
Tubos de ensaye Fosfato de potasio monobásico
Cronómetros Suspensión de levaduras
Pipetas de 1, 5 y 10 ml Glucosa
Centrifuga Nitroprusiato
Baño de agitación Hidróxido de amonio
Termómetro Clorhidrato de 2,4-dinitrofenilhidrazina
Balanza Ácido tricloroacetico
Gradillas Solución patrón de piruvato
Baño María Agua
 RESULTADOS

Tratamiento básico

Determinación cualitativa

Imagen 1: en estas imágenes se ve el anillo color rosa que esperábamos que se

formara el cual primero dio un tono rojizo hasta pasar a rosa

Observaciones

 Al agregar el amoniaco se formaron dos fases una donde se observa un

anillo rojizo
 En cambio con el piruvato puro la fase azul-verdosa se observa en la parte
superior

Determinación espectrofotométrica

Tubo extracto Absorbancia Imagen

(ml)

0.50 -0.036

0.75 0.052

Imagen 2. En esta imagen

se muestra ambos tubos el
cual uno es a una
 concentración de 0.50 y el
otro a 0.75

Tabla 1. En esta se muestran las absorbancias obtenidas para las diferentes

concentraciones con piruvato en un medio básico.

Observaciones

 No se considera la absorbancia el tubo con concentración 0.50, ya que su

valor es negativo, el cual se pudo ser debido a error experimental.
 el color café-rojiza del tubo dos nos dice que la glucosa se fermento en
piruvato.
 De acuerdo a la absorbancia obtenida del tobo 0.75 y comparando con la
curva patrón, podemos decir que la concentración de piruvato presente en
dicho tubo es aproximadamente.

 Tratamiento ácido
Determinación cualitativa

Observaciones

 Al agregar el amoniaco se formaron dos fases una donde se observa un

anillo rosado
 En cambio con el piruvato puro la fase azul-verdosa se observa en la parte
superior
Determinación espectrofotométrica

Tubo Absorbancia Imagen

1 (blanco) -0.009

2 0.169

Imagen 1. En esta se
muestra el blanco así
como la muestra
para verificar la
formación de
piruvato
Tabla 1. En esta se muestran las absorbancias obtenidas tanto para el blanco
como para la muestra con piruvato.

Observaciones

 No se considera la absorbancia del blanco, debido a que su valor es

negativo, el cual se pudo deber a error experimental.
 La coloración café-rojiza del tubo dos nos indica que la glucosa se fermento
en piruvato.
 De acuerdo a la absorbancia obtenida del tubo 2 y comparando con la
curva patrón, podemos decir que la concentración de piruvato presente en
dicho tubo es aproximadamente de 40 µg/ml; ya que se encuentra entre
los valores de 37.5 y 50 µg/ml.

CUESTIONARIO

1. Explique lo que ocurre a nivel molecular en la estructura de la enzima

piruvato descarboxilasa en condiciones alcalinas.
Este procedimiento se realiza por medio del bloqueo de la enzima que cataliza la
conversión del compuesto por medio de inhibidores como el pH. También se
pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a baja
velocidad con referencia a su actividad máxima usando un agente que atrape el
intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse. La enzima
piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas como la
de la levadura que se agregó en el tubo A de esta manera el piruvato se acumula
y su presencia se demuestra por la reacción de la 2,4dinitrofenilhidrazina.

2. Defina la reacción química que ocurre cuando el piruvato reacciona

con el nitroprusiato de sodio y con el 2,4-dinitrofenilhidrazina.
Se pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima piruvato
descarboxilasa funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad máxima,
o se puede usar un agente (nitroprusiato de sodio) que “atrape” el intermediario y
que forme un compuesto que no puede metabolizarse.

La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de

manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la
reacción con nitroprusiato de sodio, entonces se desactiva la enzima piruvato
descarboxilasa en solución alcalina débil, entonces el nitroprusiato de sodio
reacciona con el piruvato formando un anillo verde, el nitroprusiato de sodio
detecta grupos cetónicos como el presente en el piruvato H3C-CO-COO-.
 3. Proponga alguna técnica para caracterizar acetaldehídos.
Reacción de los aldehídos y la cetona con 2.4-dinitrofenilhidrazina, para el
acetaldehído: se observa un cambio de color, apareciendo un color marrón.

DISCUSIONES

En esta ocasión discutiremos sobre lo ocurrido en el experimento realizado en

esta práctica que trato sobre la determinación de piruvato.

Al crear la solución de glucosa y levadura ligeramente alcalina o acida en el tubo

A y B respectivamente, y al incubarlos durante una hora a 37ºC se observó que
las soluciones seguían siendo transparentes sin ningún otro cambio. Se llevaron
los tubos a la incubadora para proporcionarles el medio en el que se efectuaran
las reacciones referentes al proceso de la glucolisis. Posteriormente se agitaron
las sustancias contenidas en los tubos y se nivelo el volumen de sustancia para
que fuera igual en los dos sacando unos mililitros y depositándolos en otros
tubos de ensayo. El proceso que se lleva a cabo en esta práctica se llama
fermentación. Este se efectúa partiendo de la glucolisis que consiste en una serie
de reacciones en la que se involucran varios intermediarios. La reacción completa
de una molécula de glucosa produce dos moléculas de piruvato, dos moléculas de
ATP y dos moléculas de NADH. Este último es un cofactor que se encuentra en
cantidades catalíticas (es necesario reoxidarlo para que no se suspenda el
proceso), y es utilizado por la cadena respiratoria para la obtención del ATP
produciendo de esta forma NAD+. La glucolisis proporciona una cantidad de
piruvato que puede tomar dos rutas metabólicas anaerobias, eso depende del tipo
de células que intervengan. Para este caso de la práctica de laboratorio, se
utilizaron soluciones alcalinas y acidas de levadura respectivamente las cuales a
causa de su pH determinaron la cantidad de productos que se obtuvieron. En
este caso se presenta un proceso de fermentación el cual se caracteriza por ser
una reacción de obtención de energía en ausencia de oxígeno en el que el reactivo
inicial es la glucosa y se obtienen como productos una cantidad de piruvato y
otra cantidad de etanol que se deriva de la reacción del ácido pirúvico reducido a
acetaldehído y que finalmente produce este alcohol.

La fermentación alcohólica se caracteriza por que el ácido pirúvico formado por la

glucolisis se convierte de manera anaerobia en etanol. En este caso se libera
dióxido de carbono y se oxida el NADH reduciéndose a acetaldehído. La
fermentación láctica por su parte es un proceso al que recurren células como la
musculares la cuales presentan deficiencia en la obtención del oxígeno. Otras
células como los glóbulos rojos también recurren a la obtención de energía por
este medio ya que no poseen mitocondrias que realicen el proceso de respiración
y obtención de oxígeno. En esta reacción el NADH se oxida y el ácido pirúvico se
reduce transformándose en ácido láctico.

CONCLUSIONES

La fermentación alcohólica es un proceso necesario en la obtención del etanol

para la fabricación de vino y otras bebidas alcohólicas. El CO2 que se obtiene
como producto en es útil en la industria del pan ya que permite que la masa se
expanda.

Mientras mayores sean las condiciones anaerobias. Mayor será la calidad de la

fermentación.

La fermentación de los líquidos azucarados produce alcohol. El grano de la

cebada se fermenta en presencia de levadura y se crea cerveza.

La fermentación es propia solamente de los microorganismos y de algunas

levaduras.

Se produce la fermentación en la mayoría de las células de los animales, excepto

en las neuronas que mueren rápidamente si no pueden realizar la respiración
celular.

La fermentación son poco rentables si se compara con la respiración aerobia, ya

que a partir de una molécula de glucosa solo se obtienen 2moléculas de ATP,
mientras que en la respiración se producen 36.

BIBLIOGRAFIAS

1. Lehninger, A. Bioquímica. Editorial Pueblo y Educación. La Habana. 1985.

2. Caraway, T., Selected Methods for the Small Clinical Chemistry

Laboratory, (ed. by Faulkner, W.R., and Meites, S., Vol. 9, AACC,
Washington, 1982, p. 91.

3. José Félix Patiño Restrepo. 2006. Metabolismo, Nutrición y Shock. 4ª

edición. Editorial Panamericana. Colombia. Páginas 79-85.