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CROMATOGRAFIA

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Cromatografía

Ruth Leticia Valenzuela Arroyo


Paola Hayde Rodríguez Acosta

Facultad de Medicina, Universidad del Norte


Bioquímica - tercer semestre

Profesor: Alfredo Verón.


1 de junio de 2021
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Introducción

La cromatografía es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia que permite la
separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas.
Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general. Las cromatografías
son procesos que abarcan varias técnicas separativas, basadas en propiedades físicas de ciertos
materiales, que, en interacción con sustancias o mezclas de sustancias, las cuales guardan relación
con las propiedades químicas de éstas, permite descomponer una mezcla y analizar sus
constituyentes. Con el desarrollo de la tecnología, las técnicas cromatográficas se diversificaron y
mejoraron sensiblemente su capacidad para resolver mezclas de distinta naturaleza.

En este trabajo se presentan conceptos introductorios, un breve panorama de las diversas técnicas
cromatográficas disponibles y sus aplicaciones.
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Cromatografía

El término cromatografía fue introducido en 1906 por el botánico ruso Mikhalil Tswet, para hacer
referencia a la separación de los pigmentos contenidos en extractos vegetales, conforme estos se
filtraban a través de una columna rellena con un sólido.

La cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes que se van a separar
se distribuyen en dos fases, una fase estacionaria y la otra fase móvil. La fase estacionaria consta,
según el procedimiento, de un material solido o líquido, y la fase móvil de un líquido o gas.

La cromatografía se puede definir como un proceso de separación basado en la distribución selectiva


de compuestos diferentes entre dos fases inmiscibles. En una cromatografía las dos fases deben
estar en contacto, pero no mezcladas.

Los procesos cromatográficos están estrechamente vinculados a la extracción, es decir, a la


distribución de un compuesto orgánico, por ejemplo, la cafeína, en un sistema bifásico agua-
cloroformo. La cromatografía se puede considerar como la repetición continua del proceso de
extracción.

Los métodos cromatográficos pueden agruparse en dos tipos básicos:

a) De partición, donde se utilizan dos líquidos inmiscibles, uno de ellos generalmente


soportado en un sólido.
b) De adsorción, donde una de las fases es un sólido y la otra generalmente un líquido.
El sólido actúa adsorbiendo parte del líquido alterando su composición.

Técnicas cromatográficas

1. Cromatografía en columna

En esta técnica se verifican procesos de absorción (columnas de alúmina) o de partición


(columnas de silicagel impregnados en sistema bifásico) y es el más viejo y útil de los
procedimientos de separación de cantidades relativamente grandes de mezclas. Una solución de
la mezcla a separar se coloca en la parte superior de la columna y los componentes de la misma
migran a diferentes velocidades cuando son fluidos con un solvente o mezcla de solventes
adecuados.
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De este modo, las sustancias que migran a velocidades mayores se eluyen de la columna
disueltas en el solvente de desarrollo. Si uno o más componentes se mueven a velocidades muy
lentas, o permanecen fijas en la parte superior de la columna, el material solido se puede retirar
de la columna y separar las diferentes bandas en forma mecánica y luego cada una extraerla con
solvente

Los componentes no polares son usualmente eludíos con un solvente no polar, tales como
alcanos, benceno y los compuestos que son más polares pueden requerir solventes polares (éter,
acetona, ácidos orgánicos).

Como la elusión no permite recuperar los componentes de la mezcla a separar, se los puede
identificar en la columna con luz ultravioleta, que posibilita la detención de compuestos que
fluorecen cuando son expuestos a esa radiación. En otros casos se debe retirar (extrudar) la
columna de adsorbente cuidadosamente de modo que mantenga su forma, y aplicarle una
pequeña línea longitudinal con uno o más reactivos conocidos, que reaccionen con los materiales
que se sospecha contiene la mezcla, produciendo zonas de identificación intensamente
coloreadas.

El procedimiento total de la cromatografía en columna puede resultar tedioso, pero de suma


utilidad, especialmente cuando los otros métodos de separación y purificación, tales como la
recristalización, fallar por la similitud de solubilidades de los componentes de la mezcla.

2. Cromatografía en capa fina de (TLC)

Este proceso cromatográfico consiste en colocar una pequeña cantidad de muestra a analizar,
del orden de microgramos, sobre una capa fina de material absorbente. Dicho material se
encuentra sostenido sobre un soporte, y el conjunto se introduce en una cámara adecuada, de
modo que uno de sus extremos quede sumergido en el solvente de desarrollo (eluente).
Una fase móvil (eluente) pasa a través de una fase estacionaria (adsorbente) transportando
los diferentes componentes de la muestra a distintas velocidades en la dirección del flujo
(migración del solvente). Cada sustancia viaja independientemente de las otras durante la
migración. Concluido el desarrollo del cromatograma (cuando el solvente ha recorrido la
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mayor parte de la placa) se retira a ésta de la cámara, se marca la distancia recorrida por el
solvente y se la deja secar. La placa seca se observa bajo luz visible (para compuestos
coloreados), bajo la acción de luz ultravioleta (para compuestos que fluorescen) o usando
vapores de yodo o reactivos especiales.
Las sustancias se conocen por su relación de frente, que en determinadas condiciones de
trabajo es una constante para una sustancia y un solvente dado y contribuye a establecer
identidad.
Rf = Distancia del frene de avance de la sustancia
Distancias del frente de avance del solvente

A causa de las variaciones del valor de Rf producidas por distintas causas no siempre
controlables, es recomendable hacer desplazar en el mismo cromatograma, al lado de la
mezcla desconocida, una sustancia de comparación conocida. Así se evitan ciertas
interferencias, ya que las sustancias que se desplazan juntas están sujetas a las mismas
irregularidades.
El comportamiento cromatográfico depende tanto adsorbente como del medio de elución
(ambiente de absorción). Entre ciertos límites se puede predecir que absorbentes son
apropiados para la cromatografía de una determinada sustancia.
Mientras que el número de adsorbentes disponibles es relativamente limitado, existen
normalmente más medios de elusión apropiados. Es necesario usar el solvente desarrollado
adecuado para obtener manchas redondas y bien diferenciadas entre sí, y es por este motivo
que se han clasificado los eluyentes en series, según sus acciones eluyentes. Estas series se
llaman series eulótropas.

3. Cromatografía en papel
Es un típico sistema de partición en el cual el papel actúa como soporte de una fase
estacionaria que es el agua adsorbida. Por esto es posible una partición entre el agua de la
fase fija, y otro solvente inmiscible con ella que actúa como fase móvil. La fase móvil puede
subir el papel (cromatografía ascendente), bajar (cromatografía descendente) y en algunos
casos se extiende horizontal y radialmente (cromatografía circular).
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La mezcla a separar se deposita en el papel como una solución, mediante una pequeña
pipeta capilar, en un sitio cercano al solvente de desarrollo y se introduce el cromatograma en
la cámara de desarrollo.

A medida que la fase móvil va embebiendo el papel, cada componente moverá a velocidad
diferente en el papel. Estas velocidades dependen factores tales como: tipo de papel,
temperatura, sistema de solventes, etc.

Cuando el solvente se ha movido una cierta distancia en el papel, el cromatograma se retira de la


cámara cromatográfica y se miden las distancias que se desplazaron los componentes de la
mezcla y el frente del solvente. Con estos valores se determina la Rf de cada componente.

Como la fase móvil es un solvente orgánico saturado en agua, la polaridad de esta fase será
siempre menor que la fase fija (agua). Resultaran, por lo tanto, más retenidas las sustancias más
polares; y más desplazadas, de la zona de siembra, las sustancias menos polares.

Aplicaciones

Las distintas técnicas cromatográficas tienen aplicación en muestras que contengan compuestos
orgánicos. Algunos ejemplos de aplicación son:

 Determinación del porcentaje de formación de una molécula de síntesis, en una planta de


síntesis orgánica Determinación de porcentaje de solvente en un producto agroquímico
terminado.
 Determinación de concentración de producto activo en un producto agroquímico terminado.
 Control de calidad de pureza de solventes, como alcohol etílico anhidro, tolueno, xileno,
benceno, que entran como materias primas a una planta.
 Determinación del contenido de principio activo de un medicamento.
 Control de calidad de la pureza de materias primas entrantes a bodega de una fábrica de
productos medicinales, tales como: alcohol etílico al 95%, propilenglicol, glicerina, alcohol
isopropílico, o-toluidina, paracetamol, butanol, octanol, benzaldehído, acetato de etilo, éter di
etílico, alcanfor, y muchos otros.
 • En fábricas de adhesivos, pegamentos, pinturas, para controlar que el producto terminado
lleve las cantidades indicadas de solventes, humectantes, colorantes, gomas, resinas,
poliuretanos, secantes, rellenantes, esponjantes, suspensores, emulsificantes.
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 En investigaciones policiales o forenses resulta una herramienta muy útil para el análisis de
muestras.
 En fábricas de alimentos, para control de calidad de producto terminado y materias primas,
tales como proteínas, aromatizantes, determinación de colorantes.
 En la industria petrolera, es un método indispensable, para analizar las composiciones de
casi todos los productos que van saliendo, del cracking, los tipos de gasolinas, los
compuestos orgánicos destinados a síntesis.
 En el control de la producción vinícola, tiene infinidad de usos, desde usarse como una “nariz
electrónica”, para caracterización de vinos, de acuerdo a parámetros previamente
establecidos por expertos, concentración de componentes, análisis de aminas, como
etanolamina, metilamina, agmatina, triptamina. Determinación de ocratoxina-A.
 Su utilización es indispensable en análisis industriales, forenses bromatológicos,
toxicológicos, clínicos y de contaminación ambiental.
 Las muestras biológicas (ej.: sangre, exudados de diferentes orígenes, muestras de suelo,
etc.) deben recibir un tratamiento adecuado previo a su análisis, y luego son perfectamente
abordables por algunas o varias de las técnicas cromatográficas disponibles.

Revelado químico

Existen dos tipos de revelado químico, el destructivo y el no destructivo.

a. No destructivo: se revela con yodo, se sumerge la placa en una cuba que tienen cristales de
yodo en su fondo. Es un método muy sensible, al exponer la placa a la atmosfera de yodo,
este se absorbe en mayor proporción sobre las zonas que contienen sustancias orgánicas con
enlaces múltiples, produciendo manchas que en contacto con el aire se desvanecen con el
tiempo.
b. Destructivo: consiste en la pulverización con algún reactivo que reaccione con los
componentes de la muestra, dando productos coloreados, a veces, se prefiere sumergir las
placas en dichos reactivos (de la base alcohólica), luego se los deja secar o se secan con
calor. Estos reveladores son específicos para determinado grupo de sustancias
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Términos utilizados en cromatografía

 Absorción: es la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la
tendencia que tiene ésta a formar mezcla o a reaccionar químicamente con la misma.
 Adsorbente: fase estacionaria en la cromatografía de adsorción y de reparto.
 Adsorción: es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un
sólido, quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie
interfacial, esta retención superficial puede ser física o química.
 Disolvente o revelador: cualquier fase móvil.
 Elución: proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.
 Eluyente: la fase móvil una vez que se extrae de la columna.
 Fase estacionaria: material que permanece dentro de la columna cromatográfica durante la
cromatografía y que retiene algún componente de la muestra, posee una gran área superficial
y puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte.
 Fase móvil: es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa como
portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna cromatográfica y la fase
estacionaria.
 Origen: lugar físico donde se coloca la muestra al principio.
 Revelado: proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografía. Soporte:
el material sólido inerte que en la cromatografía de reparto sirve para sostener la fase
estacionaria líquida en su sitio.
 Sorbente: cualquier fase estacionaria.
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Conclusión

La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo


objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla por adsorción produciendo manchas.
Esta basada en las diferentes velocidades con la que se mueve cada fluido a través de una
sustancia y se fundamenta en la distribución de un compuesto.

La cromatografía es una técnica muy útil con un procedimiento relativamente corto que nos ayuda a
separar e identificar compuestos o mezclas.
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Anexo
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