Reporte de Practica Número 4

Aislamiento de procariontes
Marquez Labrada Cristofher Jeremy
Grupo: 5005

Introducción
Las bacterias se encuentran distribuidas ampliamente a lo largo del
planeta Tierra, e incluso en zonas donde el ser humano le es imposible
acceder. Las podemos encontrar en hábitats acuáticos, terrestres y algunas
crecen en ambientes de condiciones extremas de temperatura, pH, entre otras.
Las bacterias forman parte de los microorganismos, debido a su tamaño, y se
concentran en un ambienta local reducido denominado “microambiente”
(Ramírez et al. 2012).
El ser humano ha usado a las bacterias para su beneficio. En
aplicaciones biotecnológicas, industriales, farmacéuticas, alimenticias, entre
otras. Para poder estudiarlas y aplicarlas a las actividades humanas las
bacterias tienen que ser aisladas de su hábitat y estudiadas.
Para poder aislar a las bacterias debemos tomar en cuenta que la
comunidad microbiana esta controlada por condiciones fisicoquímicas, y que
su vez, estas están determinadas por la actividad metabólica de la comunidad
(Ramírez et al. 2012). Si se busca aislar una especie bacteriana hay que
replicar dichas condiciones en el laboratorio, de no ser as la especie que se
busca no se obtendrá.
Para el aislamiento e identificación de bacterias existen diferentes
estrategias: separación física de los microorganismos, utilización de medios de
cultivos selectivos y diferenciales, y el aprovechamiento de características
particulares de los microorganismos. Para facilitar y mejorar el proceso
generalmente se combinan estas estrategias (Ramírez et al. 2012).
Según Ramirez y colaboradores (2012) el proceso de aislamiento
consiste en disponer de la descendencia de un individuo (célula) inmovilizada
sobre la superficie de un medio sólido y separada del resto de individuos
presentes en el cultivo mixto. Esta célula, en las condiciones de crecimiento
adecuadas dará lugar a una descendencia (clon) que resultará
macroscópicamente visible y que se llama colonia. Cada colonia contiene
millones o miles de millones de células idénticas y con el mismo origen y
propiedades. Se puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de
una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo
forma agregados.
La separación física de los microorganismos consiste en una interacción
directa con la muestra y la obtención de un inoculo para poder sembrar un
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medio de cultivo a partir de una unidad formadora e colonia. Existen dos

técnicas utilizadas en laboratorio las cueles son:
1. Disoluciones seriadas: método cualitativo (porque evidencia
diferencias morfológicas de las colonias) y cuantitativo (permite conocer
la cantidad de microrganismos en una suspensión) que consiste en
realizar disoluciones sucesivas de la muestra en condiciones de
esterilidad de manera que se va reduciendo el número de
microorganismos de la suspensión inicial, con el objeto de sembrar
después cantidades conocidas de las diluciones en placas de Petri.
Evidentemente, el número de microorganismos en algunas de las
diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en una placa
originará colonias separadas en un número óptimo para su recuento.
2. Siembra por agotamiento en placa: método cualitativo que está
basado en arrastrar, mediante un asa de siembra, un número cada vez
más pequeño de individuos. Es un método rápido y simple de
agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido
contenido en una placa de Petri. De un elevado número de bacterias a
un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la
superficie de la placa.
La utilización de medios de cultivos es debido a que son un conjunto de
nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las
condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Para la
práctica destacamos dos tipos de medio de cultivos, los selectivos que son
cualquier medio de cultivo que favorece el crecimiento de un tipo o grupo de
microorganismo, e inhibe el crecimiento del resto de la flora microbiana
presente en el inóculo, y los diferenciales que son aquellos medios cuya
composición permite poner de relieve ciertas propiedades metabólicas de los
microorganismos, y por tanto diferenciarlos en base a estas propiedades
(Ramírez et al. 2012).
No podemos descartar las características particulares de los
microorganismos, como su metabolismo o habito. Tener en cuenta estas
características ayudara en e laboratorio para lograr cultivar a los
microorganismos.
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Objetivos
 Distinguir los diferentes ambientes donde las bacterias son capaces de
vivir.
 Reconocer el papel ecológico que desempeñan las bacterias dentro de
los ecosistemas naturales.

Metodología
Se machaco una hoja de árbol con manchas cafés en un mortero
usando un pistilo. Se agrego agua destilada para obtener una disolución de
color verde. La disolución se separo del mortero y se utilizo para obtener un
inoculo que se cultivo en cuatro cajas de Petri con agar Mac Conkey y nutritivo
(dos por agar).
Paso una semana. En los cultivos creció distintas colonias; obtuvimos
una muestra, se fijo y aplico tinción de Gram para seleccionar aquellas colonias
con las características similares a Pseudomonas spp. La profesora de clase
determino que especies cultivamos en el laboratorio, se cultivo
Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes faecalis, Pantoea agglomerans y
Enterobacter lwduigii.

Resultados
Medio de cultivo Características Porque se escogió

Contiene de sales biliares, cristal violeta, lactosa. Porque inhibe el

Mac Conkey crecimiento de bacterias
Medio selectivo y diferencial.
gram positivo.
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Contiene pluripeptona y extracto de carne que

Al ser enriquecido
constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y
permite el desarrollo de
Nutritivo aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano.
cualquier tipo de
Además de agregado de cloruro de sodio que
bacteria.
mantiene el balance osmótico.

Tabla 1. Medios de cultivo utilizados en la práctica.

Especie Características

Bacilo Gram negativa no fermentador cuyo hábitat

principal es el acuático, si bien se encuentra en el
Stenotrophomonas maltophilia
suelo, en las plantas y en los animales y actualmente
se considera un patógeno nosocomial emergente.

Bacteria gram negativa que no es nitrato-reductora, es

Alcaligenes faecalis oxidasa-positiva, catalasa-positiva y citrato-positiva
(aerobio estricto).

Pantoea agglomerans Bacilo gram negativa. Habita plantas, suelo, agua, piel
humana, heces animales y humanas.

Enterobacter lwduigii Bacilos Gram negativa, fermentativos y móviles con las

características generales del género Enterobacter

Tabla 2. Bacterias cultivadas y aisladas de la hoja de árbol.

Agar Colonia Características

Colonias enteras de color amarillo, bordes

1 completos regulares, superficies lisas cóncavas y
secas.
Nutritivo

2 Colonias enteras de color naranja, bordes

completos regulares, planas, húmedas traslucidas.
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Colonias enteras d color blanco, cóncavas, mucosa

3 y húmedas traslucidas. Bordes completos
regulares.

Colonias enteras de color amarillo traslucid de

4
bordes irregulares, planas y húmedas.

5 Colonas enteras de color verde, planas y húmedas

traslucidas. Bordes completos regulares.

Colonia entera de borde regular completo de

coloración naranjada con periferia blanca;
Mac Conkey 1
elevación ligeramente cóncava de textura
traslucida mucosa.

Tabla 3. Descripciones morfológicas de las colonias formadas en los medios de cultivo.

Imagen 1. Agar nutritivo con colonias

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Imagen 2. Agar Mac Conkey con colonias.

Imagen 3. Tinción de Gram.

Discusión
En la práctica se busco aislar Pseudomonas spp. de hojas de árboles
que presentaron como características manchas de color café. Pseudomonas
spp. es un género de bacterias en forma de bacilo y Gram negativas.
Interacciona con las plantas de dos maneras: fomentando el crecimiento
de las hojas porque sintetiza sideróforo, proteína que media la captación de
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hierro uniéndose al Fe3+, convierten la forma insoluble en soluble, lo que

facilita la absorción por parte de plantas y bacterias. (Carrillo y Ramírez, 2022).
E igual puede actuar como un patógeno hemibiótrofo porque coloniza,
principalmente, las partes aéreas de la planta, tales como las hojas y los frutos.
Su ciclo infectivo se divide en dos etapas: una primera fase biótrofa que se
produce cuando el patógeno alcanza la superficie de la planta sana; y una fase
necrótrofa en la cual la bacteria penetra en el interior de la planta a través de
heridas o aperturas naturales, como los estomas, en el espacio apoplástico;
provoca manchas de color café (Paya, 2017).
Por lo antes mencionado, se escogió aislar de hojas a Pseudomonas
spp, debido a su interacción con las plantas. Se uso cultivos nutritivos porque
esta especie puede crecer en cualquier medio y selectivos (agar Mac Conkey)
porque inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas (este genero es Gram
negativa) pero, esto fue un error porque aislamos géneros distintos a
Pseudomonas spp.
El Agar que se debió usar fue el Agar cetrimida porque, según los
laboratorios Britania, es el medio utilizado para el aislamiento selectivo de
Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del género. Su fundamento
consiste en que su constituyente peptona de gelatina aporta los nutrientes para
el desarrollo microbiano y el cloruro de magnesio y el sulfato de potasio
promueven la formación de piocianina, pioverdina, piomelanina y fluoresceína
de P. aeruginosa, además de que actúa como agente inhibidor porque libera el
nitrógeno y el fósforo de las células de casi toda la flora acompañante, aunque
inhibe también algunas especies de Pseudomonas spp.
Por lo antes mencionado no crecieron especies el genero Pseudomonas
spp y, debido al uso de los otros tipos de agares que fomento el crecimiento de
Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes faecalis, Pantoea agglomerans y
Enterobacter lwduigii porque son los agares que se usan principalmente para el
crecimiento de estas especies.
Los medios de cultivo para que proliferen las especies antes
mencionadas son: S. maltophilia en agar Mac Conkey y agar sangre (Santiago,
2006), A. faecalis en agar Mac Conkey y nutritivo (Bizet y Bizet, 1997), P.
agglomerans en agar nutritivo y agar dextrosa rojo fenol (Jiménez et al, 2017) y
E. lwduiggi en agar Mac conkey, agar sangre de cordero y agar CPS (Silva y
Martínez, 2018).
El crecimiento de las cuatro especies antes mencionadas tiene sentido
porque, las cuatro especies, se encuentran, comúnmente, en hábitats húmedos
y en el suelo (características de la zona donde se colectaron las hojas de los
arboles para la practica y, además, Pseudomonas spp se desarrolla en este
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tipo de condiciones) así que, probablemente iban en las hojas colectadas.

Además de ser todas bacilos Gram negativos.

Conclusiones
 El agar que se debe utilizar para el crecimiento de Pseudomonas spp es
el agar cetrimida.
 Las bacterias pueden desarrollarse en medios húmedos y el suelo, por
lo que, las hojas de arboles son un medio idóneo para su desarrollo.
 Pseudomonas spp. puede actuar como fitopatógeno y promotor de
crecimiento vegetativo.

Referencias
 Ramírez R, Luna B, Velásquez O, Vierna L, Mejía A, et al. (2012).
Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición. México:
Universidad Nacional Autónoma de México UNAM, Facultad de
Química; 2006
 Paya M. (2017). Estudio del papel defensivo y del mecanismo de acción
de los ésteres del (Z)-3-hexenol en plantas de tomate frente a
Pseudomonas syringae. UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA.
Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio
Natural. P.p. 57.
 Carrillo R y Ramírez P. (2022). Pseudomonas spp. benéficas en la
agricultura. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas volumen 13
número 4. P.p. 11
 Santiago. (2006). Stenotrophomonas maltophilia. Revista Chilena de
Infectología. Disponible en línea en: https://www.scielo.cl/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0716-10182006000300009 (consultado el 24 de
noviembre del 2023).
 Bizet j y Bizet C. (1997). Cepas de Alcaligenes faecalis a partir de
material clínico. Diario de infección. Volumen 35. Numero 2. P.p. 167-
169. Disponible en línea en:
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S01634453979171
02 (consultado el 24 de noviembre del 2023).
 Jimenez O, Contreras N, y Rodriguez C. (2007). Identificación y
caracterización de Pantoea agglomerans aislada en plantas
de gloxinia (Gloxinia alba). Biogro. Volumen 19. Numero 1. Disponible
en línea en https://ve.scielo.org/scielo.php?
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script=sci_arttext&pid=S1316-33612007000100007 (consultado el 24 de
noviembre del 2023).
 Silva F y Martínez P. (2018). Complejo Enterobacter cloacae. Revista
Chilena de Infectologia. Volumen 35. Numero 3. Disponible en linea en
https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-
10182018000300297 (consultado el 24 de noviembre del 2023).