Guia Microbiología - Practica 3

FACULTAD DE INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

SEDE LIMA CENTRO
Guía de práctica de laboratorio

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
LIMA, 2024
UPN - Lima Centro
Departamento de Ingeniería Versión: 01/2023
Guía de Prácticas Página 2 de 9
PRÁCTICA Nº 3 . COLORACIONES BACTERIANAS Y FÚNGICAS
1. OBJETIVOS.
− Identificar distintas formas y agrupaciones bacteriana y fúngicas utilizando

técnicas de tinción.
− Clasificar a las bacterias según características morfológicas y estructurales de la
pared celular.
2. FUNDAMENTO TEÓRICO
Debido a que las bacterias y otros microorganismos tienen un tamaño muy pequeño, se
requiere de tinciones biológicas para visualizarlos, demostrar detalles de su estructura
interna, o algunas funciones fisiológicas.
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al

microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio del
uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación.
La tinción es una de las técnicas más utilizadas en los laboratorios de microbiología para
clasificar microorganismos. Se emplean tres clases de técnicas de tinción: simple,
diferencial y especial.
Tinciones simples
Una tinción simple usa un solo colorante básico. Aunque los diferentes colorantes se
unen de forma específica a las distintas partes de las células, el propósito principal
de una tinción simple es destacar el microorganismo completo para que se vean las
formas y las estructuras celulares básicas. Los colorantes básicos más empleados
son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, carbofucsina y verde de malaquita.
Tinciones diferenciales
Se usan para diferenciar de manera más explícita los microorganismos. Usan más
de un colorante y reaccionan de modo diferente con las distintas clases de bacterias
y por lo tanto pueden ser usadas para establecer una distinción entre ellas. Las tinciones
diferenciales más usadas son la tinción Gram y la tinción de ácido –alcohol resistencia.
Ambas tinciones se utilizan para obtener información acerca de la composición de las
capas de la pared celular de las células bacterianas.
Tinción de Gram: La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen

UPN - Lima Centro
microscópico de las bacterias. En 1884, Christian Gram, un bacteriólogo danés,
desarrolló una técnica de tinción que permite separar a las bacterias en dos grandes
grupos: gram positivas y gram negativas, basados en si retienen o no, el colorante
primario (cristal violeta o violeta de genciana) luego del proceso de decoloración. Los
organismos que retienen el cristal violeta luego de la adición del agente decolorante
(alcohol-acetona), aparecen de color azul oscuro o violeta, y se designan como gram
positivos; aquellos que pierden el cristal violeta y se tiñen con el colorante secundario,
safranina, aparecen de color rojo y se designan como gram negativos.
UPN - Lima Centro
Fig. 1. Técnica de coloración gram
Fig. 2. Observación microscópica de bacterias
Tinción Especial
Utilizada para colorear y aislar varias estructuras, como cápsulas, endosporas y

flagelos, a veces se la utiliza como herramienta diagnóstica.
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Características Morfológicas
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse carios varios morfotipos distintos:
• Los cocos, son de forma esférica

• Los bacilos poseen forma alargada
• Los cocobacilos
• Los vibriones que son bacilos en forma de coma o curvados
• Los espirilos, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o
espiroquetas si son blandas y onduladas.
Pueden aparecer agrupados de diferente forma:
• Aislados después de la división celular (Micrococos)

• Aparecer por pares (Diplococos)
• Formar cadenas (Estreptococos)
• Agruparse de manera irregular (Estafilococos)
• Los bacilos en general suelen agruparse en forma de cadena
(Estreptobacilos) o en empalizada.
Fig.3. Forma y disposición de bacterias
3. EQUIPOS, MATERIALES y REACTIVOS.
• Microscopios
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• Láminas portaobjetos y cubreobjetos

• Mango y asa de siembra
• Solución de colorante azul de lactofenol
• Solución salina
• Mecheros
• Palitos mondadientes
• Aceite de inmersión
• Picetas con agua destilada
• Pinzas
• Pipeta Pasteur
• Kit de coloración GRAM: Violeta de genciana al 1%, solución de yodo,
decolorante: alcohol-acetona al 50%, fucsina básica al 0.1%.
• Cepa de E. coli
Muestra brindada por los estudiantes: palitos mondadientes, pan o fruta con moho.
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Entre al siguiente enlace:
Coloración de Gram (youtube.com)
Ver el material multimedia y analizar el papel que cumplen cada uno de los reactivos
que componen la coloración Gram.
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En el laboratorio:
1. Extraer sarro dental con un palito 7. Lavar con agua destilada inclinando la
mondadientes, extender una capa fina sobre lámina.
una lámina portaobjeto que presente 1 gota
de solución salina y dejar secar. Hacer lo
mismo con cepa de E. coli
8. Cubrir la superficie de la lámina con

2. Cubrir la superficie con solución de cristal safranina o fucsina, dejar 1 minuto.
violeta y dejar por 1 minuto.
9. Lavar con agua destilada.

3. Lavar con agua destilada inclinando
ligeramente la lámina.
10. Dejar la lámina en posición

4. Cubrir la lámina con lugol, dejar 1 minuto. vertical, dejando que escurra el
exceso de agua y que se seque el
extendido.
11. Examinar la lámina al microscopio con

5. Lavar nuevamente con agua destilada el objetivo de inmersión (100X)
inclinando ligeramente la lámina. utilizando aceite de inmersión.
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6. Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el 12. Reconocer los diferentes tipos

índice, inclinar la lámina y bañar la superficie morfológicos de bacterias y
con unas gotas del decolorante alcohol clasificarlos, según la tinción, en Gram
acetona por 10 segundos. positivos y Gram negativos.
13. Represente gráficamente lo

observado. Nomine sus esquemas.
Entre al siguiente enlace
https://www.youtube.com/watch?v=5hQSreyd--I
Observamos la metodología a utilizar para identificar a los hongos microscópicos.

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Examen directo-Montaje en azul de lactofenol

1. Deposite en el centro del portaobjetos 1 a 2 gotas de azul de lactofenol y extienda
en él un trozo de micelio (con ayuda de las pinzas). Mezclar la muestra con el
azul de lactofenol.
2. Coloque el cubreobjetos después, procurando que no quede ninguna burbuja de
aire.
3. Observe la muestra al microscopio con diferentes aumentos y recorriéndola
en toda su extensión. Observarás las hifas a modo de pequeños tubos. En el
extremo de algunas hifas aparece un engrosamiento (columnilla) rodeado del
esporangio, en cuyo interior se hallan las esporas.
5. RESULTADOS Y OBSERVACIONES
-Indique los resultados encontrados en la práctica evidenciado con fotografías para

cada muestra.
6. CUESTIONARIO
− ¿Cuáles son los errores que usted identificó que pueden influir en una
buena tinción de Gram?
− ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram en bacterias? ¿A qué se debe
la desigual capacidad de las células bacterianas para teñirse?
− Describa lo observado en las muestras de hongos.
7. BIBLIOGRAFÍA
• DE ROBERTIS E, 2004. Fundamentos de Biología celular y Molecular de

De Robertis. 4 ed. Buenos Aires: El ateneo.
• KARP G. 2005. Biología Celular y Molecular: Conceptos y Experimentos. 4
ed. México: McGraw-Hill.

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PRÁCTICA Nº 3 . COLORACIONES BACTERIANAS Y FÚNGICAS

− Identificar distintas formas y agrupaciones bacteriana y fúngicas utilizando

Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al

Tinción de Gram: La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen

Fig. 1. Técnica de coloración gram

Fig. 2. Observación microscópica de bacterias

Utilizada para colorear y aislar varias estructuras, como cápsulas, endosporas y

A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse carios varios morfotipos distintos:

• Los cocos, son de forma esférica

Pueden aparecer agrupados de diferente forma:

• Aislados después de la división celular (Micrococos)

Fig.3. Forma y disposición de bacterias

3. EQUIPOS, MATERIALES y REACTIVOS.

• Láminas portaobjetos y cubreobjetos

Entre al siguiente enlace:

Coloración de Gram (youtube.com)

8. Cubrir la superficie de la lámina con

9. Lavar con agua destilada.

10. Dejar la lámina en posición

11. Examinar la lámina al microscopio con

6. Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el 12. Reconocer los diferentes tipos

13. Represente gráficamente lo

Entre al siguiente enlace

Observamos la metodología a utilizar para identificar a los hongos microscópicos.

Examen directo-Montaje en azul de lactofenol

-Indique los resultados encontrados en la práctica evidenciado con fotografías para

• DE ROBERTIS E, 2004. Fundamentos de Biología celular y Molecular de

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