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    Problemas de Cinética Enzimática

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    Jhojan Ugarte Chinchero
    Este documento presenta dos problemas de cinética enzimática relacionados con la inhibición. El primer problema involucra una fosfatasa alcalina bovina inhibida por bromolevamisol y determina que es un inhibidor competitivo con valores de Km de 0.417 mM y Vmax de 1.04 mmol min-1 mg prot-1. El segundo problema analiza los datos de una enzima inhibida y determina gráficamente que es un inhibidor no competitivo con valores de Km de 4 mM sin inhibidor y entre 7-9 mM con inhibidor, y un valor de Ki de 2.2 x 10

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    Problemas de Cinética Enzimática

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    Jhojan Ugarte Chinchero
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    Este documento presenta dos problemas de cinética enzimática relacionados con la inhibición. El primer problema involucra una fosfatasa alcalina bovina inhibida por bromolevamisol y determina que es un inhibidor competitivo con valores de Km de 0.417 mM y Vmax de 1.04 mmol min-1 mg prot-1. El segundo problema analiza los datos de una enzima inhibida y determina gráficamente que es un inhibidor no competitivo con valores de Km de 4 mM sin inhibidor y entre 7-9 mM con inhibidor, y un valor de Ki de 2.2 x 10

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    Este documento presenta dos problemas de cinética enzimática relacionados con la inhibición. El primer problema involucra una fosfatasa alcalina bovina inhibida por bromolevamisol y determina que es un inhibidor competitivo con valores de Km de 0.417 mM y Vmax de 1.04 mmol min-1 mg prot-1. El segundo problema analiza los datos de una enzima inhibida y determina gráficamente que es un inhibidor no competitivo con valores de Km de 4 mM sin inhibidor y entre 7-9 mM con inhibidor, y un valor de Ki de 2.2 x 10

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    Este documento presenta dos problemas de cinética enzimática relacionados con la inhibición. El primer problema involucra una fosfatasa alcalina bovina inhibida por bromolevamisol y determina que es un inhibidor competitivo con valores de Km de 0.417 mM y Vmax de 1.04 mmol min-1 mg prot-1. El segundo problema analiza los datos de una enzima inhibida y determina gráficamente que es un inhibidor no competitivo con valores de Km de 4 mM sin inhibidor y entre 7-9 mM con inhibidor, y un valor de Ki de 2.2 x 10

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    UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

    (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)


    FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
    ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
    DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOQUÍMICA

    Problemas de cinética enzimática

    ASIGNATURA: BIOQUIMICA I
    PROFESORA: GLORIA GORDILLO
    1-Problemas sobre inhibición: Se realizaron estudios de inhibición para
    dos enzimas diferentes presentes en el suero bovino. Se varió la
    concentración de sustrato a en ausencia y en presencia de tres
    concentraciones diferentes de inhibidores de cada enzima. En cada caso
    encontrar: a) El tipo de inhibición. b) El valor de Km y Vmax.
    c) El valor de Ki para el inhibidor.
    Enzima: Fosfatasa alcalina de suero bovino, inhibidor: Oxalato de
    Bromolevamisol [Bromolevam 0 8 16 40
    isol] (mM)
    [Sustrato]¯[F Velocida iniciales (mmol mgProt.-
    P](mM) des min-1 1)
    0.1 0.231 0.210 0.191 0.158
    0.3 0.431 0.369 0.309 0.239
    0.7 0.607 0.488 0.425 0.277
    1.3 0.751 0.599 0.467 0.304
    1.8 0.811 0.657 0.530 0.319
    2.6 0.912 0.657 0.546 0.328
    4.1 0.957 0.688 0.561 0.351
    5.8 0.981 0.741 0.558 0.344
    .- parte a. En este problema, podemos graficar los valores de
    velocidad frente a la concentración de sustrato para las series
    obtenidas sin y con las distintas concentraciones del inhibidor.
    Esto se muestra en la figura. Aunque es posible estimar los
    valores de Km y Vmax (en ausencia del inhibidor) y los valores
    de las constantes aparentes en presencia del inhbibidor en esta
    figura, el estimado será difícil de hacer, debido a que la Vmax es
    una valor límite que debe extrapolarse y el valor de Km debe
    estimarse una vez que se conoce la Vmax, lo que significa que
    un mal estimado de Vmax dará un mal estimado de Km. Una
    manera sencilla de resolver este problema es realizar la gráfica
    que se presenta en el lado izquierdo de la figura, la
    representación de 1/v vs. 1/s propuesta por Linewaver & Burk
    permite, uniéndo los puntos con una recta, determinar los
    valores de 1/Vmax a partir de la intercepción con el eje
    ordenado y -1/Km a partir de la intercepción de la recta
    extrapolada al eje de las abscisas.
    • a) A partir de la representación mostrada en la figura,
    puede también determinarse el tipo de inhibidor que
    se tiene, que en este caso
    es acompetitivo (tambiénllamado incompetitivo)
    dado que las rectas que unen cada una de las series
    de puntos son paralelas. En estos casos, una vez que
    se ha decidido que los puntos realmente representan
    rectas paralelas, lo mejor es tomar una regla y trazar
    todas las recta paralelas buscando que el conjunto de
    líneas realmente describan, tan cercanamente como
    sea posible, el conjunto de puntos experimentales
    • b) Aquí, el único valor de Vmax para la enzima es el determinado
    en ausencia del inhibidor (O). Es decir 1/Vmax = 0.965 (mmol-1 min
    mg prot) ó Vmax = 1.04 (mmol min-1 mg prot-1).
    • Los valores obtenidos con las otras rectas representan tan sólo
    parámetros cinéticos aparentes cuyo valor refleja las alteraciones
    impuestas sobre la actividad enzimática por la presencia del
    inhibidor. Km se determina por consiguiente del valor de la
    intercepción con las absisas de esta misma recta i.e. -1/Km = -2.4
    mM-1 ó Km = -1/-2.4 mM = 0.417 mM de p-nitrofenilfosfato. Esto
    significa que cuando la concentración de p-nitrofenilfosfato en el
    medio de reacción (al pH y temperatura empleados en este
    experimentos) alcanzan 0.417 mM, el 50% de los sitios activos de
    la enzima se encontrarán saturados y por tanto la actividad derá
    igual a la mitad de la máxima que puede observarse en dichas
    condiciones.
    2. Se hacen cinco mezcla de reacciòn que contiene concentraciones iguales de
    una enzima, a las concentraciones de S indicadas en la tabla, y se miden las V de
    reacción.El experimento se repite luego con un inhibidor enzimàtico presente a
    una concentraciòn de 2.2 x 10‾4M EN CADA MEZCLA DE REACCIÒN.Utilizando las
    gràficas de Lieneweaver-Burk de estos datos,determine gràficamente la KM para
    el S ,la Ki para el inhibidor y la Vmáx en ausencia y presencia del inhibidor. Es este
    un inhibidor competitivo o no competitivo.

    Inhibidor ausente Inhibidor presente


    S (moles/litro) V(umoles/min) (2.2 x 10‾4M)
    V(umoles/min)
    1.x10‾4 28 18
    1.5x10‾4 36 24
    2x10‾4 43 30
    5x10‾4 63 51
    7.5x10‾4 74 63
    • a) Sin CTP, K0,5 = 4 mM (es decir, la [S] para la cual Vo es ½ de la Vmáx)
    • Con CTP, K0,5 = entre 7 y 9 mM

    b) Sustituyendo en la ecuación de Michaelis-Menten, para una [S] = 3 mM:


    • Vo = 5,8 x 3/ 4 + 3 . Luego Vo = 2,48 u.a. (unidades arbitrarias).
    • Existe discrepancia porque a una [S] = 3 mM le corresponde, según los
    datos obtenidos experimentalmente, una velocidad de 1,7 u.a. Por lo
    tanto, no se ajusta a la ecuación de Michaelis-Menten (si se representa
    se comprueba que es una enzima alostérica).
    • c) Efecto inhibidor, ya que en presencia de CTP aumenta KM, por tanto,
    disminuye la afinidad de la enzima por el sustrato.

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