Crispr Cas9

Gene editing
Sistema CRISPR – Cas9

CRISPR – Cas9
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Sistema de defensa de procariotas contra el ataque de virus
Función: destruir el genoma - ADN / ARN - viral
Existen 11 sistemas distintos
• Qué organismo provienen
• Tipo de proteína nucleasa Cas
• Target: RNA o DNA

CRISPR – Cas9
Science
2012
NUCLEASA (Cas)
RNA GUÍA
CRISPR – Cas9: Inmunización
CRISPR – Cas9: Inmunidad
CRISPR – Cas9
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
• Regiones Spacer repetitivas bacterianas

• Regiones Protospacer de origen viral
protospacers
variado repertorio
de inmunidad contra fagos
guideRNAs
CRISPR – Cas9
Destrucción del
genoma viral
Double Strand
Break!!
CRISPR – Cas9
scaffold
target
Sec guía propiamente dicha

In the acquisition phase, foreign DNA is incorporated into the bacterial genome at the CRISPR loci.
CRISPR loci is then transcribed and processed into crRNA during crRNA biogenesis. During
interference, Cas9 endonuclease complexed with a crRNA and separate tracrRNA cleaves foreign
DNA containing a 20-nucleotide crRNA complementary sequence adjacent to the PAM sequence.
(Figure not drawn to scale.)
Compuesto por…
La endonucleasa Cas9 5′-NGG
sgRNA
• Secuencia guia
• Secuencia “Scaffold”
¿Puedo “targetear” cualquier secuencia de un genoma?

Requerimiento: la secuencia target tiene que estar seguida inmediatamente río abajo
por una secuencia PAM:
5′-NGG
¿Cómo nos podría servir esto
para hacer Gene editing?
Gene editing
Capacidad de eliminar, reemplazar, modificar secuencias
de un genoma en forma altamente específica
No al azar!
bueno….trasladando CRISPR a eucariotas…

componentes Cas9 + sgRNA
creando un sistema que genera DSB en una secuencia
determinada
Una vez generado el DSB en el genoma…
Dos formas de “reparación” por la célula: Genera INDEL mutations
Cambio marco de lectura
Non homologous end joining (NHEJ) o aparición de STOP prematuro
Knock-out del alelo
Homologous Recombination (HR)
Si además agregamos un vector “de reparación” con secuencias homólogas
flanqueando la modificación que se quiere hacer… Knock-in del alelo
¿Cómo hacemos que se exprese la Cas9 y el sgRNA?
Vector básico:
O variantes…
Pero…
…todo es color de rosas?
¿Algo puede malir sal?
¿Cuán específico es?
Cuidado con los

Off-targets!
Lo bueno:
Software permite predecirlos en base a su secuencia y verificarlos
Entonces… Queremos generar una línea celular con un
alelo de un gen knockeado…
Diseñar secuencia guía teniendo en cuenta PAM (5’ – NGG)

Se hace con la ayuda de un software
Clonar secuencia guía en el vector sgRNA/Cas9
Transfectar células con el vector En células transfectadas (no todas)

se expresa Cas9 y sgRNA. En algunas, ocurre el DSB en algún alelo (o en ambos)
Si deseamos knock-in, también agregar vector con la otra versión del gen
Seleccionar células transfectadas (Puromicina, si usamos pspCas9)
Seleccionar clones recombinados (Ejemplo, expresión de GFP de HDR)

(o el knock-in lleva tmb gen de resistencia a otro ATB, ej, neomicina)
Validarlos (PCR genómica y secuenciación)
Validar no haber generado OFF-targets

PCR y y secuenciación
Knock-out para animales modelo de
enfermedades humanas
2013 un ejemplo:
directamente inyectan RNA de Cas9 y sgRNA en cigotos !!

evitan quimeras
Modifican 5 genes distintos en un solo paso!!!
Con uno de esos genes (Tet3), consiguieron:
de 8 blastocistos obtenidos: 3 homocig, 3 heterocig y 3 fallaron
¿También sirve para hacer transgénicos?
Claro! Y de manera sitio-dirigida
Por ejemplo, en ratones:
Una forma
• Modificar células madre embrionarias
• Inyectarlas en blastocistos
• Transferir a madre adoptiva y obtener animales quimera
Otra forma
Directamente en cigoto y transferir blastocisto resultante a madre adoptiva:

crías genéticamente homogéneas, es decir no-quimeras
Y la construcción?
Se agrega un vector “de reparación” con secuencias homólogas (“brazos” )
flanqueando la modificación que se quiere hacer…
ejemplo:
tagging de proteínas endógenas;
evita introducir proteína taggeada exógena
el reemplazo ocurre
mediante HR
¿Y terapia génica…?
(2014) 32: 551–553.
Ratones con una mutación puntual en el gen Fah daño hepático severo
Pero si les inyectan en la cola sgRNA + Cas9 + secuencia WT ssDNA de 180 b!!
es un knock-in Con “bracitos” de homología
reparación de la mutación
Ventajas del sistema CRISPR
Sólo hay que diseñar un sgRNA y no una proteína!
• Es mucho más barato, más rápido y más fácil
Más eficiente que Zinc finger nucleases y que TALEN
Se pueden hacer múltiples modificaciones en el genoma

al mismo tiempo.
• Ratones con muchos genes mutados al mismo tiempo

• Grandes deleciones usando 2 target sites
Ademas…
Se diseñaron variantes la proteína Cas9
nCas9: Proteína “nickasa” (le falta un dominio).

En vez de generar DSBs, genera nicks en una cadena.
• Reduce la frecuencia de NHEJ y favorece HDR
Cas9 sin actividad endonucleasa: se dirige al sitio, pero

no lo corta:
• Se la puede fusionar a GFP y mostrar la ubicación

de un locus en células vivas.
Desventajas y peligros
• Su rápida evolución deja poco tiempo al análisis ético y de bioseguridad
• Organismos editados por CRISPR podrían perturbar ecosistemas
• Se han modificado embriones humanos con CRISPR en el laboratorio.
• Creación de virus que distribuyen CRISPR para generar modelos de cáncer de pulmón
• El peligro de los Off-target en el uso biomédico
Conclusión…
CRISPR-Cas9 arrancó con todo!
Se pudo “editar” el genoma de líneas celulares humanas, ratones, zebra
fish, plantas, drosophila, C. elegans, levaduras y bacterias.
Y recién empieza!

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Sistema de defensa de procariotas contra el ataque de virus

Función: destruir el genoma - ADN / ARN - viral

Existen 11 sistemas distintos

• Qué organismo provienen

• Tipo de proteína nucleasa Cas

• Target: RNA o DNA

• Regiones Spacer repetitivas bacterianas

Sec guía propiamente dicha

La endonucleasa Cas9 5′-NGG

¿Puedo “targetear” cualquier secuencia de un genoma?

bueno….trasladando CRISPR a eucariotas…

Cuidado con los

Diseñar secuencia guía teniendo en cuenta PAM (5’ – NGG)

Clonar secuencia guía en el vector sgRNA/Cas9

Transfectar células con el vector En células transfectadas (no todas)

Seleccionar células transfectadas (Puromicina, si usamos pspCas9)

Seleccionar clones recombinados (Ejemplo, expresión de GFP de HDR)

Validarlos (PCR genómica y secuenciación)

Validar no haber generado OFF-targets

directamente inyectan RNA de Cas9 y sgRNA en cigotos !!

Directamente en cigoto y transferir blastocisto resultante a madre adoptiva:

Más eficiente que Zinc finger nucleases y que TALEN

Se pueden hacer múltiples modificaciones en el genoma

• Ratones con muchos genes mutados al mismo tiempo

nCas9: Proteína “nickasa” (le falta un dominio).

Cas9 sin actividad endonucleasa: se dirige al sitio, pero

• Se la puede fusionar a GFP y mostrar la ubicación

• Organismos editados por CRISPR podrían perturbar ecosistemas

• Se han modificado embriones humanos con CRISPR en el laboratorio.

• El peligro de los Off-target en el uso biomédico

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