Leitao Celine 2011

Thèse
Thèse
Présentée par
Céline LEITAO
Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Strasbourg
Spécialité
Chimie analytique
Etude de composés à intérêts technologique et

fonctionnel dans la bière
Soutenue le 28 mars 2011 devant la commission d’examen
Pr. Eric MARCHIONI Directeur de thèse

Dr. Saïd ENNAHAR Directeur de thèse
Pr. Henri PORTUGAL Rapporteur externe
Pr. Miguel de la GUARDIA Rapporteur externe
Pr. Jean-Marc JELTSCH Examinateur
Dr. Luc DIDIERJEAN Examinateur
Institut Pluridisciplinaire
Hubert Curien
Département de Recherches
Subatomiques
UMR 7178
2
Remerciements
Ce travail a été réalisé au sein de l’Equipe de Chimie Analytique des Molécules Bioactives,
UMR 7178, Département des Sciences Analytiques de l’Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien
(IPHC) sous la direction du Pr. Eric Marchioni et du Dr. Saïd Ennahar, mes deux directeurs de thèse,
et en partenariat, par une Convention Industrielle de Formation par la Recherche (CIFRE), avec les
Brasseries Kronenbourg sous la direction du Dr. Luc Didierjean. Merci à vous trois pour m’avoir
guidée dans le monde de la chimie analytique et de la bière, pour votre encadrement scientifique,
votre soutien dans les coups durs et vos conseils toujours avisés.
Je remercie également les Pr. Henri Portugal, Miguel de la Guardia et Jean-Marc Jeltsch d’avoir
accepté de juger ce travail.
Je tiens à remercier tout particulièrement Martine Bergaentzlé et Françoise Bindler pour leurs
conseils et les longues discussions tant scientifiques que personnelles que nous avons pu avoir
ensembles… Merci aussi à Minjie pour sa disponibilité et pour tout ce qu’elle m’a appris. Merci à
Mimi de si bien s’occuper de nous, « qu’est-ce qu’on ferait sans toi ! ».
Merci à tous les doctorants ; les « docteurs » : Diane, Esther, Julie et Gildas, les « futurs » :
Etienne, Li et Remmelt ; merci pour ton aide et bonne chance pour la suite. Merci à Michel de nous
faire partager sa bonne humeur brésilienne et ses gâteaux pour le goûter. Merci à Carole et
Christophe pour votre amitié, nos petites discussions sur la vie, grâce à vous, ces trois années m’ont
paru un peu moins longues ; je vous souhaite beaucoup de bonheur. Merci à Omar, Eli et Erwan pour
nos longues conversations « philosophiques » dans le bureau, nos crises de rire et nos petits délires ;
Omar, le retour au Sénégal est proche… à très vite pour une petite visite ; Erwan, merci pour tes
« sujets » de discussion, tes petites expressions et merci à ta petite famille (Julie et Margot); Eli, ma
coloc’ de bureau, merci pour ta précieuse aide avec les calculs, les figures…, merci d’avoir été là
quand j’avais besoin de papoter et promis, tu pourras compter sur moi même à 500 km d’ici.
Je tiens à remercier sincèrement Jacques Gangloff et Jacques Gaucher pour toute leur aide au
cours de mon projet, leurs réponses rapides à mes appels au secours, merci à Carole, Marc, Thérèse
et toutes les autres personnes que j’oublis.
Je remercie tous mes copains de « l’Allier » pour m’avoir changé les idées quand je rentrais!
Merci à Yoann et Audrey et à Manou et Aurel d’être à mes côtés depuis tout ce temps.
Merci à toute ma famille, ma sœur, mon père, mon frère, mes grands-parents, mes beaux-
parents; ma Ju, bon courage pour la suite, promis je serais présente pour te changer les idées quand
cela sera nécessaire ;). Merci à maman de m’avoir soutenue et sans qui tout cela n’aurait pas été
possible.
Enfin, merci à Martin d’avoir traversé cette épreuve à mes côtés, pour tous les kilomètres que
nous avons fait, et pour tous les kilomètres que l’on fera encore ensemble :).
3
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE .............................................................................................................................. 7
CHAPITRE 1 : CONTEXTE DE L’ETUDE.............................................................................................................. 11
1 PROCEDE DE FABRICATION DE LA BIERE ................................................................................................ 12
1.1 MATIERES PREMIÈRES ............................................................................................................................... 12

1.1.1 L’orge .......................................................................................................................................... 12
1.1.2 Le houblon .................................................................................................................................. 12
1.1.3 L’eau ........................................................................................................................................... 14
1.1.4 Les levures .................................................................................................................................. 15
1.2 MALTAGE ............................................................................................................................................... 15
1.3 BRASSAGE : PRODUCTION DE MOUT ............................................................................................................. 16
1.4 FILTRATION ET CUISSON ............................................................................................................................. 16
1.5 FERMENTATION ....................................................................................................................................... 16
1.6 GARDE, FILTRATION ET CONDITIONNEMENT ................................................................................................... 17
2 COMPOSITION ET PROPRIETES DE LA BIERE .......................................................................................... 18
2.1 LES COMPOSES PHENOLIQUES DE LA BIERE ..................................................................................................... 18

2.1.1 Structures générales ................................................................................................................... 18
2.1.1.1 Les acides phénoliques .......................................................................................................................... 18
2.1.1.2 Les flavonoïdes ...................................................................................................................................... 19
2.1.2 Les composés phénoliques du houblon....................................................................................... 21
2.1.3 Les composés phénoliques de l’orge ........................................................................................... 22
2.2 LES PROPRIETES DES COMPOSES PHENOLIQUES DE LA BIERE ............................................................................... 23
2.2.1 Propriétés dans la bière .............................................................................................................. 24
2.2.1.1 Propriétés organoleptiques ................................................................................................................... 24
2.2.1.2 Propriétés colorantes ............................................................................................................................ 24
2.2.1.3 Propriétés antioxydantes ....................................................................................................................... 28
2.2.2 Propriétés biologiques / santé pour l’homme ............................................................................ 31
3 EFFETS DES PROCEDES SUR LES COMPOSES PHENOLIQUES DE LA BIERE................................................ 32
3.1 CHAUFFAGE ............................................................................................................................................ 32

3.2 FERMENTATION ....................................................................................................................................... 33
3.3 FILTRATION ............................................................................................................................................. 34
4 METHODES D’ANALYSES DES COMPOSES PHENOLIQUES....................................................................... 35
4.1 EXTRACTION............................................................................................................................................ 35
4.1.1 Extraction liquide-liquide ............................................................................................................ 35
4.1.2 Extraction sur phase solide ......................................................................................................... 35
4.2 ANALYSES ............................................................................................................................................... 36
4.2.1 Analyses spectrophotométriques ............................................................................................... 36
4.2.2 Analyses chromatographiques ................................................................................................... 36
4.2.2.1 Chromatographie liquide ....................................................................................................................... 36
4.2.2.2 Chromatographie liquide couplée à l’analyse de l’activité antioxydante .............................................. 37
4.2.2.2.1 Détection par chimiluminescence ................................................................................................... 37
4.2.2.2.2 Détection par électrochimie ............................................................................................................ 38
4.2.2.2.3 Détection impliquant un radical stable ............................................................................................ 38
CHAPITRE 2 : DECOLORATION DE LA BIERE .................................................................................................... 41
4
1 INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 42
2 MATERIEL ET METHODES ....................................................................................................................... 44
2.1 REACTIFS, PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIELS VEGETAUX ............................................................................... 44

2.2 BRASSAGE A L’ECHELLE DU LABORATOIRE ...................................................................................................... 44
2.3 DECOLORATION DU MOUT ......................................................................................................................... 45
2.3.1 Choix de l’adsorbant ................................................................................................................... 45
2.3.2 Décoloration du moût au charbon actif...................................................................................... 45
2.3.3 Fermentation du moût décoloré ................................................................................................. 45
2.4 DECOLORATION DE LA BIERE ....................................................................................................................... 46
2.5 EFFET DE LA DECOLORATION SUR LES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DU MOUT ET DE LA BIERE ............................. 46
2.5.1 Analyse des composés phénoliques ............................................................................................ 46
2.5.1.1 Dosage colorimétrique des composés phénoliques totaux ................................................................... 46
2.5.1.2 Extraction et analyse chromatographique des composés phénoliques ................................................ 47
2.5.2 Analyses de routine selon les protocoles Analytica EBC ............................................................. 48
2.5.2.1 Acides aminés libres .............................................................................................................................. 48
2.5.2.2 Sucres fermentescibles .......................................................................................................................... 48
2.5.2.3 Minéraux ............................................................................................................................................... 49
2.5.2.4 Couleur .................................................................................................................................................. 49
2.5.2.5 Composés phénoliques totaux .............................................................................................................. 49
2.5.2.6 Azote aminé libre................................................................................................................................... 50
2.5.2.7 Sucres totaux ......................................................................................................................................... 50
2.5.2.8 Atténuation limite ................................................................................................................................. 50
2.5.2.9 β-glucanes solubles ............................................................................................................................... 51
2.5.2.10 Volatils ................................................................................................................................................... 51
2.5.2.11 Diacétyle et 2,3-pentanedione .............................................................................................................. 51
2.5.2.12 Populations de levures .......................................................................................................................... 52
3 RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................................................... 53
3.1 DECOLORATION DU MOUT ......................................................................................................................... 53

3.1.1 Effet du temps de contact des adsorbants ................................................................................. 53
3.1.2 Effet de la concentration en adsorbants .................................................................................... 54
3.1.3 Effet de la décoloration du moût sur la quantité de composés phénoliques totaux .................. 56
3.1.4 Extraction des composés phénoliques par le charbon actif ........................................................ 57
3.2 FERMENTATION DU MOUT DECOLORE........................................................................................................... 59
3.3 DECOLORATION DE LA BIERE ....................................................................................................................... 62
3.4 EFFET DE LA DECOLORATION SUR LES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DU MOUT ET DE LA BIERE ............................. 62
4 CONCLUSION ......................................................................................................................................... 67
CHAPITRE 3 : MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE ......................... 69
1 INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 70
2.1 REACTIFS ET PRODUITS CHIMIQUES .............................................................................................................. 72

2.2 SOLUTIONS STOCK .................................................................................................................................... 72
2.3 ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE ........................................................................ 73
2.3.1 Extraction des composés phénoliques ........................................................................................ 73
2.3.2 Séparation chromatographique et identification des composés antioxydants .......................... 73
2.3.3 Limites de quantification ............................................................................................................ 73
2.4 ANALYSE BIOLOGIQUE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE ....................................................................................... 74
2.4.1 Lignée cellulaire .......................................................................................................................... 74
5
2.4.2 Effet des antioxydants sur la viabilité des cellules bêta pancréatiques ...................................... 74
2.5 ANALYSES STATISTIQUES ............................................................................................................................ 75
3.1 ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE ........................................................................ 76

3.1.2 Séparation chromatographique et identification des composés antioxydants .......................... 77
3.2 COMPOSES PHENOLIQUES ET STRESS OXYDANT ............................................................................................... 80
3.3 COMPARAISON DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUE ET BIOLOGIQUE.............................................................. 84
4 CONCLUSION ......................................................................................................................................... 88
CHAPITRE 4 : COMPOSES ANTIOXYDANTS DE LA BIERE .................................................................................. 89
1 INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 90
2.1 REACTIFS, PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIEL VEGETAL ................................................................................... 92

2.2 SOLUTIONS STOCK .................................................................................................................................... 92
2.3 ETUDE DES COMPOSES ANTIOXYDANTS A DIFFERENTES ETAPES DU PROCEDE DE FABRICATION DE LA BIERE .................. 93
2.3.1 Procédé de brassage................................................................................................................... 93
2.3.3 Analyse chromatographique ...................................................................................................... 94
2.3.4 Identification de composés phénoliques .................................................................................... 95
2.3.5 Courbes de calibrage .................................................................................................................. 95
2.4 ETUDE DES BIERES DECOLOREES................................................................................................................... 95
2.4.1 Décoloration de la bière ............................................................................................................. 95
2.4.2 Coloration de la bière ................................................................................................................. 96
2.5 ANALYSES STATISTIQUES ............................................................................................................................ 96
3.1 ETUDE DES COMPOSES ANTIOXYDANTS A DIFFERENTES ETAPES DU PROCEDE DE FABRICATION DE LA BIERE .................. 97
3.1.1 Composés antioxydants au cours du maltage ............................................................................ 98
3.1.2 Composés antioxydants au cours du brassage et de la fermentation ...................................... 102
3.1.3 Impact du procédé de brassage sur l’activité antioxydante totale........................................... 107
3.2 ETUDE DES BIERES DECOLOREES................................................................................................................. 110
3.2.1 Composés antioxydants ............................................................................................................ 110
3.2.2 Coloration des bières ................................................................................................................ 113
4 CONCLUSION ....................................................................................................................................... 120
PUBLICATION ............................................................................................................................................... 121
CONCLUSION GENERALE .............................................................................................................................. 129
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................................ 135
ANNEXES ..................................................................................................................................................... 145
6
Introduction
générale
7
La bière est un breuvage universel et probablement le plus ancien jamais fabriqué par
l'homme. Elle est si populaire qu'elle est la boisson alcoolisée la plus vendue au monde. L'histoire de
la bière est intimement liée à celle de ses ingrédients, ainsi qu'aux avancées technologiques qui
firent de cette boisson le breuvage que l'on connaît aujourd'hui. Les premières cultures de céréales,
notamment de l'orge et de l'épeautre (une céréale proche du blé), ont été attestées en 8000 avant
J.-C. en Mésopotamie, berceau de la bière. Les premières traces concrètes de la bière remontent à
4000 ans avant J.-C. Consommée en famille et utilisée comme moyen de paiement à Babylone, puis
boisson des dieux en Égypte, la bière devint dans la Grèce antique et dans l’Empire romain celle du
pauvre, et le vin celle des dieux. Elle resta cependant la boisson de choix des peuples du Nord, celtes
et germains. L'utilisation de houblon ne se répandit qu'à partir du XVème siècle et devança très vite
les autres plantes amères qui aromatisaient à l'époque la bière (gentiane, coriandre, absinthe, sauge
ou lavande). Au niveau de la fabrication, il faudra attendre le milieu du XIXe siècle pour assister à
une évolution radicale des techniques grâces notamment au développement de la verrerie, des
appareils de filtration, du soutirage sous-pression, de l'embouteillage et de la réfrigération. À la
même époque, les recherches scientifiques sur les micro-organismes vont permettre de mieux
comprendre et maîtriser le processus de la fermentation alcoolique, d'améliorer les conditions
sanitaires des brasseries et de produire une boisson plus saine et plus claire. À cet effet, la
contribution de Louis Pasteur a été très importante. Si l'histoire de la bière continue d'évoluer, les
procédés de fabrication de la bière sont pérennisés, depuis l'ancienne Égypte, comprenant les
étapes successives de maltage, de brassage, de fermentation et de garde.
La bière traditionnelle est faite à partir d'orge, de houblon, d'eau et de levures. Cette boisson
possède un intérêt santé, notamment grâce à son contenu en minéraux et aux composés
phénoliques connus pour leur activité antioxydante. Le houblon et l’orge maltée constituent une
source importante de composés phénoliques dans la bière ; environ 20-30% proviennent du
houblon, tandis que 70-80% sont dérivés de l’orge maltée. Au cours des étapes de fabrication de la
bière, des co-produits, riches en composés phénoliques provenant soit des céréales, soit du
houblon, sont formés. La fermentation entraîne une production importante de levures, dont les
"levures brunes", dénomination liée à la présence de composés phénoliques fixés à leur surface. La
filtration de la bière permet d’éliminer un résidu de protéines et de composés phénoliques non
désirable dans le produit fini (entraînant l’apparition d’un trouble). Souvent, ces co-produits ne sont
pas valorisés, or, étant donné leur activité antioxydante, ils possèdent des potentialités importantes
pour lesquelles ils pourraient être utilisés, soit pour l’industrie cosmétique / pharmaceutique, soit
pour produire une boisson maltée avec des bénéfices fonctionnels supplémentaires.
8
Dans ce contexte, les Brasseries Kronenbourg se sont associées à l’équipe de Chimie
Analytique des Molécules Bioactives, afin de développer une boisson maltée originale qui se
différencierait des produits existants sur le marché par ses propriétés organoleptiques, par son
aspect incolore pour l’ajout de couleurs vives et/ou par la mise en évidence de ses propriétés
nutritionnelles et fonctionnelles. L’objectif de ce travail a été de mettre au point des techniques
performantes d’extraction, de concentration et de purification des composés phénoliques dès la
première étape de fabrication (brassage), afin d’isoler et de concentrer les substances d’intérêts
fonctionnels, qui sont généralement diluées et/ou perdues au cours du procédé, de faciliter
certaines étapes délicates du procédé en limitant les quantités de ces substances et d’éliminer tous
les composés colorés, ce qui permettraient de développer de nouvelles boissons maltées incolores.
En effet, obtenir des colorations particulières semble être un objectif extrêmement difficile à
atteindre en partant d'un liquide naturel (moût ou bière) dont la gamme de couleurs, provenant
principalement des composés phénoliques du malt ou du houblon, varie du jaune paille, dans le
meilleur des cas, au marron foncé. C’est pour cela qu’il sera tout d’abord procédé à une décoloration
préalable de la boisson, à un stade de fabrication à déterminer, et le produit clarifié obtenu pourra
être coloré de façon originale et attrayante en utilisant des colorants alimentaires appropriés.
Par ailleurs, la concentration des substances d’intérêts fonctionnels va dans le sens du

développement d’une boisson à allégation santé en tirant profit des vertus du malt et du houblon. A
cet égard, la récupération et/ou la valorisation des composés phénoliques de la bière pour la santé
des consommateurs constitue un aspect essentiel et le produit à développer répond au marché
grandissant des produits alimentaires de types fonctionnels. La présence des composés phénoliques
dans les matrices alimentaires et les boissons telles que la bière, est généralement mise en évidence
par des méthodes chromatographiques de chimie analytique, toutefois, l'intérêt fonctionnel des
composés identifiés, à savoir leur activité antioxydante, n’est pas souvent rapportée. Des méthodes
analytiques ont été développées dans l’objectif de pouvoir identifier et quantifier les composés
d’intérêt fonctionnel de la bière et de déterminer leur potentiel d'activité fonctionnelle.
Le manuscrit est divisé en quatre chapitres. Le premier chapitre présente le contexte de

l’étude sur la bière, sa composition en composés phénoliques et les propriétés associées, l’effet des
procédés sur les composés phénoliques et les différentes méthodes d’analyse des composés
phénoliques. Le deuxième chapitre décrit les travaux de décoloration de la bière. Le troisième
chapitre présente la mise au point d’une méthode d’analyse de l’activité antioxydante. Enfin, le
quatrième chapitre décrit l’application de la méthode d’analyse de l’activité antioxydante à la bière
et à ses différentes étapes de fabrication et également les différents essais de coloration de la bière.
9
10
Chapitre 1 :
Contexte de l’étude
11
1 Procédé de fabrication de la bière
La fabrication de la bière nécessite quatre ingrédients essentiels : les céréales, le houblon,

l’eau et les levures. Les étapes de maltage et de brassage préparent les constituants des grains
céréaliers (amidon et protéines essentiellement) pour qu’ils puissent être métabolisés lors de la
fermentation par les levures qui produiront de l’alcool, du dioxyde de carbone ainsi que des arômes.
L’ensemble de ce processus aboutit à une bière qui, après maturation et filtration, peut être
pasteurisée et conditionnée. Le houblon est généralement ajouté au moment du brassage, il confère
à la bière son amertume et son arôme. Ainsi pour fabriquer 1 L de bière, il faut 6 L d’eau, 140 g
d’orge malté, 2 g de cônes de houblon et 10 g de levures. Les étapes de ce procédé sont présentées
sur la Figure 1.1.
1.1 Matières premières
1.1.1 L’orge
L’orge appartient à la famille des graminées et au genre Hordeum qui comprend 31 espèces,
mais seule Hordeum vulgare est couramment cultivée. Il a été l’une des premières cultures
domestiquées, il y a 10 000 ans dans le croissant fertile du Moyen-Orient. L’orge est classée selon les
types printemps ou hiver (sensible au gel ou au contraire résistant au froid environ jusqu’à -15°C),
deux-rangs ou six-rangs (nombre de rangs de grains sur les épis d’orge), à grains nus ou à coque
(absence ou présence de l’enveloppe extérieure du grain), et est utilisée principalement pour
l’alimentation animale ou pour la brasserie1.
1.1.2 Le houblon
Le houblon (humulus lupulus), appartennant à la famille des cannabinacées, est une espèce
dioïque pérenne. Seules les plantes femelles sont cultivées pour la récolte de leurs fleurs appelées
cônes qui sont les seuls constituants de la plante utilisés en brasserie. A l’intérieur, une fine poudre
jaune appelée lupuline est produite, elle contient les substances actives de la fleur de houblon
recherchées pour la bière. Le houblon peut être utilisé sous différentes formes : cônes, pellets et
extraits de houblon. Il existe deux principales sortes de houblon : les houblons aromatiques et les
houblons amérisants. Aujourd’hui, les brasseries utilisent essentiellement des extraits de houblon
12
dépourvus de composés phénoliques. En effet la biosynthèse des composés phénoliques tels que les
proanthocyanidines dans le houblon semble inversement liée à celle des acides α, principaux
responsables de l’amertume de la bière, ce qui explique que des variétés sans composés
phénoliques aient été sélectionnées.
Figure 1.1 : Procédé de fabrication de la bière
13
La composition approximative du houblon séché est la suivante : humidité (10-11%), acides α
(2-12%), acides β (2-10%), huiles essentielles (0,5-2%), composés phénoliques (2-5%), lipides et cires
(2-4%), protéines (12-18%) et cellulose (40-50%). Les acides α, sesquiterpènes, en particulier
l’humulone (35-70% des acides α totaux), la cohumulone (20-65%), et l’adhumulone (10-15%) sont
considérés comme étant les constituants les plus importants dans la détermination de la qualité du
houblon2. Au cours de l’ébullition du moût, les acides α sont isomérisés pour former les acides iso-α,
plus solubles et amers que les premiers (Figure 1.2). Chaque acide iso-α a deux isomères, cis et
trans, avec différentes orientations de la chaîne latérale2. Les acides β sont principalement
constitués de lupulone et colupulone.
Figure 1.2 : Réaction d’isomérisation des acides α
1.1.3 L’eau
L’eau constitue 90 à 95% de la bière. Ses qualités sont donc très importantes. Elle doit être
potable et non polluée. La composition ionique de l’eau, telle que sa composition en calcium, est
également importante, car il a un effet acidifiant par réaction avec les phosphates, protège les α-
amylases des destructions thermiques, permet la précipitation de l’acide oxalique, dérivé du malt, et
évite ainsi des problèmes de trouble et de faux goût dans la bière. Par ailleurs le calcium est
indispensable à la floculation de la levure en fin de fermentation2.
14
1.1.4 Les levures
Les levures jouent un rôle primordial dans la préparation des boissons fermentées, elles
interviennent dans la conversion du sucre en alcool, découverte faite par Pasteur en 1861. En
principe, chaque brasseur possède ses propres souches de levures avec lesquelles il ensemence le
moût. Les levures de brasseries sont de l’espèce Saccharomyces cerevisiae et englobent aussi bien
les levures de fermentation haute (14 à 28°C, quelques jours) qui sont utilisées pour fabriquer des
bières de type « ale » et les levures de fermentation basse (0 à 15°C, 1 à 2 semaines) qui servent à la
production de bières dite « lager », les plus répandues dans le monde3.
1.2 Maltage
Le maltage consiste à transformer l’orge en malt par une étape de germination du grain
(Figure 1.1). Cette transformation permet d’accumuler des groupes d’enzymes hydrolytiques qui
dégraderont l’amidon et les protéines à l’étape suivante (le brassage), de donner sa friabilité au
grain pour faciliter cette dégradation et de développer les arômes de l’orge. Avant le maltage, les
grains d’orge sont séchés et ensilés ; ils sont ensuite calibrés et nettoyés de manière à éliminer tous
contaminants (herbe, paille, cailloux, fragments de grains, etc.). Le procédé de maltage débute par
des cycles de trempe et d’aération de plusieurs heures pour aérer les grains et amener leur humidité
d’environ 12% à 45%. Cette étape induit la levée de la dormance et le démarrage de la germination
des grains. Des conditions adaptées à ce processus (température de 15°C, humidité élevée de près
de 100%) sont appliquées aux grains durant les 4 à 6 jours suivants. Les enzymes hydrolytiques
nécessaires à la dégradation de l’amidon sont alors synthétisées. Ce processus est finalement stoppé
par le touraillage : durant plusieurs heures, les grains sont chauffés par palier entre 45°C et 105°C.
Cette étape finale du maltage permet de détruire le pouvoir germinatif, de sécher les grains qui
perdent 25% de leur masse et 40% de leur humidité, de donner une couleur aux grains et aura un
impact très fort sur la qualité organoleptique de la bière. Selon le type de bières, les brasseurs
sélectionneront des malts pâles pour la fabrication de bières blanches ou blondes, des malts
caramels pour les bières rousses ou ambrées et des malts bruns pour les bières brunes.
15
1.3 Brassage : production de moût
Le brassage permet la préparation du moût à partir de grains de malt d’orge (Figure 1.1). Des
succédanés (regroupant les sirops de glucose et de saccharose) et d’autres céréales sous forme de
grains crus (maïs, riz, blé, orge) pouvant être ajoutés, l’apport de malt doit être de 50% minimum, en
France, pour avoir l’appélation bière. Les grains sont concassés et moulus, puis mélangés à de l’eau.
Ce mélange, appelé maïsche, va subir des chauffages à différents paliers de températures
correspondant aux températures optimales d’action des enzymes d’hydrolyse (protéases, glucanases
et α/β amylases) et de gélatinisation en vue de transformer l’amidon en sucres fermentescibles et
non fermentescibles.
1.4 Filtration et cuisson
La maïsche obtenue est filtrée pour éliminer les drêches (Figure 1.1). Ces drêches, résidu de
grains de céréales, sont la plupart du temps destinées à l’alimentation animale. Le moût clair,
obtenu après filtration, est additionné de houblon et porté à ébullition. Cette étape permet de
donner à la bière son goût amer par isomérisation des acides α du houblon et ses arômes. Après
ébullition, le moût houblonné stérile est refroidi à 5-6°C afin d’être préparé pour la fermentation.
1.5 Fermentation
La fermentation se déroule généralement dans des cuves verticales cylindro-coniques (Tank

Out Door, TOD) de 1 000 à 10 000 hL et en deux phases successives. La première phase, qui dure
environ sept jours, est la fermentation principale au cours de laquelle la levure consomme 90% des
sucres fermentescibles et produit ainsi de l’éthanol et du dioxyde de carbone. Les hexoses et le
saccharose sont assimilés en premier, puis les levures utilisent le maltose, sucre majoritaire dans le
moût, et enfin le maltotriose. Durant la seconde phase de fermentation (2 à 3 jours), il y a
accumulation d’esters et d’alcools supérieurs ainsi que réduction des faux-goûts dus à des composés
qui se sont accumulés (dicétones, aldéhydes et composés soufrés). A la fin la température est
diminuée jusqu’à 4°C ce qui induit la floculation des levures et leur précipitation au fond de la cuve
(Figure 1.1).
Le taux d’ensemencement (nombre de cellules par mL) à la fin de l’entonnement (remplissage

des fermenteurs par le moût) a un impact important sur la vitesse de fermentation. Une cible
16
d’ensemencement exprimée en millions de cellules par mL de moût est ainsi définie et est variable
suivant la densité du moût. Un moût de 14°Plato est, par exemple, ensemencé à 1,4.107 cellules
vivantes par mL. En fonction de la cible et du volume à ensemencer, il est possible de calculer le
nombre total de cellules à inoculer dans le fermenteur. Il faut ensuite mesurer la concentration
cellulaire de la levure grâce à un compteur automatique de cellules ainsi que la viabilité cellulaire qui
se mesure par comptage des cellules mortes colorées au bleu de méthylène4. Il est ensuite possible
de calculer la masse de levure correspondant au nombre de cellules vivantes à inoculer dans le
fermenteur.
1.6 Garde, filtration et conditionnement
La bière subit encore une étape de stabilisation au cours de laquelle les arômes se
développent, les sucres résiduels sont transformés en alcool et la saturation en gaz carbonique
augmente (Figure 1.1). La stabilisation se déroule entre 0,5 et -1°C, sur une durée de sept jours. Elle
provoque la floculation des protéines et des levures encore présentes qui seront finalement
éliminées par filtration sur des filtres de Kieselguhr, fossiles de diatomées broyées. La bière clarifiée
est conditionnée en bouteilles, en fûts ou en boîtes puis, généralement, pasteurisée à 60°C.
17
2 Composition et propriétés de la bière
Les matières premières telles que le malt, le houblon, l’eau de brassage et les levures
fournissent à la bière des composants nutritionnels comprenant les sucres (maltose, glucose,
fructose…), les acides aminés, les minéraux (potassium, calcium, magnésium…), les vitamines
(thiamine, riboflavine…), les acides organiques (citrate, pyruvate…), les composés phénoliques
(catéchine, épicatéchine…), les composés amers (humulone, isohumulone…), les amines (tyramine,
histamine…) et les acides nucléiques3.
Dans cette étude, l’intérêt s’est principalement porté sur les composés phénoliques de la
bière.
2.1 Les composés phénoliques de la bière
Les composés phénoliques constituent une grande famille de molécules très largement
répandues dans le monde végétal. Ce sont des métabolites secondaires synthétisés par la plante, de
façon ubiquitaire, au cours du développement normal ou en réponse à des conditions de stress tels
que les infections, les blessures et les radiations UV.
2.1.1 Structures générales
Les composés phénoliques sont constitués d’un noyau aromatique comportant une ou
plusieurs fonctions hydroxyles ainsi que des groupes fonctionnels (ester, méthyl ester, glycoside,
etc.). Il en existe quatre grandes classes : les acides phénoliques, les flavonoïdes, les stilbènes et les
lignanes. Les stilbènes et les lignanes ne sont pas présents dans la bière, ils ne seront donc pas
développés ici.
2.1.1.1 Les acides phénoliques
Les acides phénoliques se distinguent en deux classes : les acides hydroxybenzoïques, dérivés
d’acide benzoïque et les acides hydroxycinnamiques, dérivés d’acide cinnamique (Figure 1.3).
18
La teneur en acides hydroxybenzoïques dans les plantes est très faible, sauf exception de
certains fruits rouges, radis noirs et oignons qui peuvent contenir jusqu’à plusieurs dizaines de
milligrammes par kilogrammes de poids frais5. Les acides hydroxybenzoïques sont souvent des
composants de structures complexes comme les tannins.
Les acides hydroxycinnamiques sont plus communs que les acides hydroxybenzoïques et sont
constitués principalement des acides p-coumarique, caféique, férulique et sinapique. L’acide
férulique est l’acide phénolique le plus abondant dans les céréales, notamment dans l’orge où il est
présent sous forme trans et liée6.
Figure 1.3 : Structures chimiques des acides phénoliques
2.1.1.2 Les flavonoïdes
Les flavonoïdes peuvent être divisés en six grands groupes7 (Figure 1.4). Les flavonols sont les
flavonoïdes les plus présents dans l’alimentation et les principaux représentants sont la quercétine
et le kaempférol. Les flavones sont beaucoup moins communs que les flavonols dans l’alimentation.
Ils consistent principalement en glycosides de lutéoline et apigénine. Les flavanones sont présents
dans les tomates, certaines plantes aromatiques telles que la menthe, et en fortes concentrations
dans le citron. Les isoflavones sont présents exclusivement dans les légumineuses telles que le soja.
19
Figure 1.4 : Structures chimiques des flavonoïdes
20
Les flavanols sont présents sous formes de monomères (catéchines) et de polymères
(proanthocyanidines). Le thé vert et le chocolat sont les aliments les plus riches en catéchine8. Les
proanthocyanidines, aussi connus sous le nom de tannins condensés, sont des dimères, oligomères
et polymères de catéchine. A travers la formation de complexe avec les protéines de la salive, les
tannins condensés sont responsables du caractère astringent des fruits (raisins, pêches, pommes,
poires, etc.) et des boissons (vin, cidre, thé, bière, etc.) et de l’amertume du chocolat9. Les
anthocyanes sont des pigments de fleurs et de fruits, auxquels ils donnent des couleurs allant du
bleu-violet au rouge en passant par l’orange et le jaune10. Ils existent sous différentes formes
chimiques, colorées ou incolores, en fonction du pH. Ils sont présents dans le vin rouge, certaines
variétés de céréales et certains légumes, mais ce sont dans les fruits qu’ils sont les plus abondants.
L’intensité de la couleur de l’aliment est souvent proportionnelle à la teneur en anthocyanes
présents.
2.1.2 Les composés phénoliques du houblon
La fleur de houblon possède 3 à 6% de composés phénoliques, principalement les acides

phénoliques et les flavonoïdes. Les flavonoïdes du houblon sont constitués de flavonols aglycones
(kaempférol, quercétine…), de quinones (sesquiterpènes : humulones, lupulones…), de
proanthocyanidines (catéchine, épicatéchine, proanthocyanidines B2, B3, B4, prodelphinidine…) et
de prénylflavonoïdes11.
Les prénylflavonoïdes du houblon les plus abondants sont le xanthohumol, l’isoxanthohumol,

le 6-prénynaringénine et 8-prénylnaringénine (Figure 1.5). Le 8-prénylnaringénine est connu comme
étant le plus puissant des phytoestrogènes isolés à ce jour12.
Le xanthohumol est le principal flavonoïde contenu dans la bière13. Il a été isolé, partiellement
caractérisé et nommé la première fois par Power et al. en 1913. Le xanthohumol et d’autres
prénylflavonoïdes ont reçu beaucoup d’attention au cours de ces dernières années en tant qu’agent
de chimio-prévention du cancer13. Il peut inhiber la synthèse de l'ADN et la prolifération de cellules
cancéreuses in vitro, inactiver les radicaux d’oxygène et induire l’apoptose cellulaire. Il protège
également contre les dommages causés à l’ADN et contre le cancer induit par la mutagénèse des
aliments cuits11.
21
Figure 1.5 : Structures chimiques des composés du houblon
L’apport journalier de prénylflavonoïdes (0,14 mg) est relativement faible comparé aux
composés phénoliques totaux de la bière (42 mg équivalents catéchine par jour)14. Ils
contribueraient donc faiblement aux propriétés antioxydantes de la bière.
L’activité biologique potentielle des acides α et iso-α (Figure 1.2) a été largement caractérisée.
En plus de leurs actions antibactériennes (activité bactériostatique)15, ils présentent des propriétés
anticancéreuses, incluant l’inhibition de la prolifération des cellules leucémiques, l’induction de la
différentiation et de l’apoptose cellulaire15-18, l’inhibition de l’oxydation19, l’inhibition de l’expression
de la cyclo-oxygénase-2 et la réduction de la sécrétion de prostaglandine E220,21. Les lupulones
induisent l’apoptose des cellules du cancer du côlon et contrent ainsi le développement de tumeurs
dans un modèle préclinique du cancer du côlon22.
2.1.3 Les composés phénoliques de l’orge
Les flavanols constituent la classe majoritaire des composés phénoliques de l’orge, suivi des
flavonols et des acides phénoliques23, présents sous formes libres et/ou glycosylées24. Ils
apparaissent sous formes de monomères, (+)-catéchine et (-)-épicatéchine, et sous formes de
22
polymères, ou proanthocyanidines, constitués principalement par des unités (+)-catéchine et (+)-
gallocatéchine. Les dimères les plus abondants dans l’orge sont la prodelphinidine B3
(gallocatéchine-catéchine) et la procyanidine B3 (catéchine-catéchine)25. Le principal trimère est la
procyanidine C2 (trimère de catéchine). Les monomères, dimères et trimères de flavanols
représentent 58 à 68% de la teneur totale en composés phénoliques de l’orge26. Le composé qui
présente la plus forte activité antioxydante de l’orge, quelle que soit la méthode testée, est la
prodelphinidine B323,27.
Les flavonoïdes, notamment les proanthocyanidines, sont bien connus en raison de leur
contribution au goût et à la couleur et de leur rôle dans la formation du trouble de la bière du à leur
affinité pour les protéines.
Les acides phénoliques de l’orge sont principalement constitués de l’acide férulique, le plus
abondant8, suivi des acides p-coumarique27 et vanillique23. Les acides hydroxycinnamiques et
hydroxybenzoïques sont connus pour contribuer au potentiel antioxydant des grains de céréales28.
L’orge et le malt contiennent également des caroténoïdes (lutéine et zéaxanthine) et des

tocophérols23. Le tocophérol, en particulier le ɣ-tocophérol, combiné à la lutéine inhibent la
formation des groupements peroxyl et par conséquent, participent à l’activité antioxydante des
composés dont ils sont extraits. Dans les études de modèle d’oxydation, l’inhibition de la formation
d’hydroperoxyde de triglycérides la plus forte est obtenue par combinaison de la lutéine et du ɣ-
tocophérol29.
Les composés phénoliques de l’orge sont moins bien caractérisés que les composés
phénoliques de houblon. Et pourtant, il est reconnu que, dans la bière, 20-30% seulement des
composés phénoliques proviennent du houblon alors que 70-80% proviennent de l’orge maltée30,31.
2.2 Les propriétés des composés phénoliques de la bière
Dans la plante, les composés phénoliques peuvent agir en tant que attractants pour les
pollinisateurs, contributeurs de la pigmentation de la plante, agent protecteur contre les radiations
UV, phytoaléxines, antioxydants, antimutagènes, anticarcinogènes, antimicrobiens et anti-
inflammatoires8.
Dans les aliments, ils peuvent contribuer à l’amertume, l’astringence, la couleur, la flaveur,
l’odeur et la stabilité de l’oxydation de l’aliment.
23
Dans le corps humain, les composés phénoliques jouent un rôle important dans la prévention
de nombreuses maladies associées au stress oxydatif, telles que les cancers et les maladies
cardiovasculaires et neurodégénératives32.
2.2.1 Propriétés dans la bière
2.2.1.1 Propriétés organoleptiques
Avec beaucoup d’autres composés de structures différentes (acides aminés et peptides,

composés terpéniques…), les composés phénoliques peuvent être responsables de la sensation
d’amertume présente dans la bière. Nombre de composés phénoliques présentent un goût amer.
Cependant, il semble que seuls quelques uns, comme les flavanols contribuent de façon significative
à ce caractère dans les produits alimentaires10. Le tyrosol et les flavonols pourraient, comme les
acides phénoliques, contribuer à l’amertume des boissons.
Toutes ces molécules sont présentes dans la bière, mais leur incidence sur le plan gustatif y
est probablement mineure, du fait de la concentration importante en acides iso-α, constituants
fortement amers du houblon.
2.2.1.2 Propriétés colorantes
A côté des flavonoïdes et des pigments bruns découlant des phénomènes de brunissement,
les pigments végétaux appartiennent à des groupes chimiques divers dont les chlorophylles (vertes),
les caroténoïdes (jaunes, orangées ou rouges) et les bétalaïnes (la betterave rouge).
L’orge est une céréale colorée et il existe des variétés noires, bleues, rouges et pourpres en
raison de la présence de mélanines et d’anthocyanes (Figure 1.6). Mais la couleur de la bière
provient principalement des mélanoïdines, des caramels et de l'oxydation des composés
phénoliques de l'orge et du houblon.
24
Figure 1.6 : Exemples de variétés d’orges rouges (en haut) et noires (en bas).
Les mélanoïdines, polymères de hauts poids moléculaires, bruns, sont produites par la
réaction de Maillard33,34. La plupart des mélanoïdines sont produites au cours du maltage et
certaines au cours de l’ébullition du moût. La température, le temps de réaction, le pH, l’humidité, la
concentration et la nature des précurseurs ainsi que la présence d’oxygène, de métaux et
d’inhibiteurs influencent la réaction de Maillard35. Elle est impliquée dans le développement des
flaveurs, la formation de couleurs, d’antioxydants et d’agents cancérigènes31,36.
On peut subdiviser la réaction de Maillard en trois étapes principales (Figure 1.7). La première
étape est bien documentée, il s'agit de réactions carbonyles-amines conduisant à la production de 1-
amino-1-désoxy-2-cétose à partir d'un aldose à travers le réarrangement d'Amadori et à la formation
de 2-amino-2-désoxy-aldose à partir d'une cétose via le réarrangement de Heyns. La seconde étape
correspond à la dégradation des produits des réarrangements d'Amadori et de Heyns. Elle conduit,
notamment, à la formation de composés hétérocycliques responsables des odeurs. Cette étape est
moins connue étant donné la complexité et le nombre de combinaisons possible entre
intermédiaires. La troisième étape correspond à la polymérisation d'intermédiaires réactionnels
produits lors de la deuxième étape et conduit à la production de pigments, les mélanoïdines36.
25
Figure 1.7 : Principales étapes de la réaction de Maillard
Les composés phénoliques oxydés sont produits au cours de la cuisson du moût par réaction
avec l’O2 pour former des polymères. Il y alors apparition de pigments bruns, dont la formation
résulte de deux types de réactions successives dans le temps10 (Figure 1.8).
26
Figure 1.8 : Principales étapes du brunissement depuis l’oxydation enzymatique initiale des
composés phénoliques jusqu’à la formation des pigments bruns37. PPO: polyphénol oxydases; POD:
peroxydases; aa-NH2: acides aminés; Pr-SH: protéines; R’-SH: thiols.
La première réaction consiste en l’oxydation enzymatique des composés phénoliques natifs et

se traduit par la formation de quinones dont la couleur dépend des substrats oxydés. Cette réaction
se déclenche très rapidement dès que les conditions sont favorables et est réversible par exemple en
présence d’antioxydants tels que l’acide ascorbique. Les composés les plus efficaces vis-à-vis du
brunissement appartiennent à deux classes différentes : les acides hydroxycinnamiques, en
particulier les dérivés de l’acide caféique, et certains flavonoïdes, essentiellement les flavanols
catéchine, épicatéchine10. Cette première réaction aboutit à la formation de quinones, espèces très
instables et très réactives en milieux aqueux. La seconde réaction concerne leur polymérisation
et/ou leur combinaison avec d’autres molécules présentes in situ telles que les acides aminés, les
27
peptides, les protéines ou d’autres composés phénoliques tels que les proanthocyandines. Cela
conduit alors à la formation de complexes relativement stables, de couleurs plus ou moins brunes.
Ce deuxième groupe de réaction n’est ni enzymatique, ni réversible.
La couleur de la bière est déterminée par le comparateur d’échelle de couleur EBC (European
Brewing Convention), développé pour classer les bières, les moûts et les malts en unités visuelles de
2 à 27.
Figure 1.9 : Comparateur d’échelle de couleur EBC pour les bières, les moûts et les malts.
2.2.1.3 Propriétés antioxydantes
L’oxydation est l’une des plus importantes manifestations à l’origine du vieillissement des
produits alimentaires. Les dégradations oxydatives affectent les qualités nutritionnelles et
sensorielles des aliments et peuvent avoir des répercussions sur la santé du consommateur10.
Un bon antioxydant doit présenter plusieurs propriétés : efficacité à faible concentration,

compatibilité physique et chimique avec le substrat qu’il est censé protéger, absence de toxicité. A
côté de diverses autres molécules (caroténoïdes, acide ascorbique, glutathion, etc.), de nombreux
composés phénoliques répondent à ces exigences37,38. En effet, les composés phénoliques ont de
fortes propriétés antioxydantes ; des études sur les relations structure-activité ont été publiées
concernant l'inhibition de la peroxydation lipidique et le piégeage des radicaux libres39. Dans la
bière, l’oxydation des lipides, au cours du maltage et du brassage, induit la production de composé
trans-2-nonenal, responsable d’un faux-goût « papier-carton ». Les composés phénoliques ont un
effet bénéfique sur la qualité gustative de la bière en limitant les effets de l'enzyme responsable de
la production de ce composé40.
Rappelons que les cellules vivantes produisent naturellement des composés oxydants,
accepteurs d’électrons et réducteurs, donneurs d’électrons. L’oxygène, accepteur d’électrons, est
transformé en eau afin de générer des molécules énergétiques (ATP, adénosine triphosphate), dans
28
le cas contraire, il est dévié pour former des radicaux libres ou espèces activées de l’oxygène très
réactives (Figure 1.10).
Figure 1.10 : Formation des espèces activées de l’oxygène
L’activité antioxydante des composés phénoliques réside dans leur capacité à donner un
hydrogène ou électron et à délocaliser l’électron non apparié au sein de la structure aromatique
(Figure 1.11). Cela confère aux composés phénoliques la capacité de complexer les métaux, de se
combiner à des molécules nucléophiles et de faire des réactions d’oxydoréduction41. Le fort
caractère réducteur et donneur d’atome H des composés phénoliques se manifeste par des
réactions rapides avec les radicaux libres dont la production excessive (stress oxydant) est impliquée
dans le développement de certaines pathologies dégénératives (maladies cardiovasculaires,
cancers). Ils piègent et convertissent les radicaux libres en espèces non-toxiques.
Figure 1.11 : Mécanisme antioxydant d’un composé phénolique
29
Les antioxydants phénoliques peuvent également protéger diverses molécules biologiques
contre l'oxydation, telles que l’ADN, les protéines, les sucres et les lipides37. L’auto-oxydation des
lipides insaturés implique toute une chaîne de réactions (Figure 1.12) qui commence sous l’action de
différents facteurs (lumière, chaleur, radiations ionisantes, espèces toxiques de l’oxygène, ions
métalliques, etc.) avec la production de radicaux libres de natures lipidique. Elle s’amplifie ensuite
par autoformation de nouveaux radicaux libres puis se terminent avec la formation de produits non
radicalaires stables. Le caractère antioxydant des composés phénoliques se manifeste à différents
niveaux de cette chaîne par leur action réductrice, leur capacité à piéger et neutraliser les formes
toxiques d’oxygène et les formes radicalaires des lipides et par la chélation possible des ions
métalliques37. De nombreux composés phénoliques tels que les flavonoïdes et les acides
phénoliques présentent une activité antioxydante marquée, basée sur leur capacité à bloquer
l’accumulation des radicaux lipidiques libres qui sont réduits dès leur formation pour redonner le
lipide initial alors que le composé phénolique oxydé est en partie régénéré.
Figure 1.12 : Principaux points d’intervention des antioxydants phénoliques dans la protection des
lipides contre la dégradation oxydative37
De nombreux composés phénoliques fonctionnant comme antioxydants, peuvent également

exercer des effets pro-oxydants tels que les procyanidines ou les mélanoïdines42,43.
30
2.2.2 Propriétés biologiques / santé pour l’homme
L’alimentation apporte une grande variété d’antioxydants jouant un rôle important comme
facteur protecteur de la santé. Des preuves scientifiques suggèrent que les antioxydants réduisent
les risques de maladies chroniques, telles que les maladies cardiovasculaires, certains cancers ou les
diabètes de type 232. Ainsi l’apport de composés à activité antioxydante dans les aliments n’a plus
pour seul objet de préserver les qualités sensorielles du produit, mais également de renforcer sa
valeur nutritionnelle.
La plupart des composés phénoliques présentent des propriétés antioxydantes responsables,

pour une grande part, de leurs propriétés biologiques et de leur utilisation dans les industries
alimentaires, cosmétiques et pharmacologiques37. Les composés phénoliques, par leur activité
antioxydante, sont capables de neutraliser les formes activées de l’oxygène ou les radicaux libres à
caractère toxique issus de la peroxydation lipidique, des mutations de l’ADN, de la dégénérescence
des neurones ou de l’hyperglycémie due au diabète. Les formes activées de l’oxygène sont pour la
plupart des radicaux chimiques dérivés de l’oxygène, capables d'attaquer l'ADN, les enzymes, les
protéines, les membranes cellulaires, etc. Ces attaques peuvent être responsables de problèmes lors
de la réplication de l'ADN entraînant mutations et cancers, de perturbations au sein des cellules qui
peuvent conduire à leur mort, de la destruction des membranes cellulaires ; ceci peut mener au
durcissement et à l'épaississement des artères mais aussi à des crises cardiaques, de la détérioration
du collagène et donc à la rigidité des tissus. Dans les cellules, ces espèces activées de l’oxygène se
présentent, par exemple, sous la forme de radical hydroxyle OH• et de peroxyde d’hydrogène H2O2
(Figure 1.11).
Les radicaux libres dérivés de l’oxygène ou de l’azote sont en partie responsables de la

destruction des cellules β dans le diabète de type 1 et de leur dysfonction dans le diabète de type 2.
Les polyphénols du vin, le resvératrol cis et trans et l’épigallocatéchine gallate ont un effet
protecteur antioxydant vis-à-vis d’un stress oxydant induit sur les cellules β pancréatiques de rat44,45.
La biodisponibilité des composés phénoliques, c'est-à-dire leur faculté à s’incorporer dans

l’organisme, dépend de leur structure : les composés phénoliques hautement polymérisés traversent
difficilement la paroi intestinale. Les petits polymères ont donc une action plus grande dans
l’organisme.
31
3 Effets des procédés sur les composés phénoliques de la bière
Les composés phénoliques sont des espèces hautement instables qui subissent de
nombreuses réactions dans le cadre de la transformation et du stockage des aliments. Les produits
néoformés comptent pour une part importante de la composition en composés phénoliques dans
certains aliments et certaines boissons, mais ils sont négligés dans la plupart des études portant sur
la composition des aliments46. Cependant, certains des nouveaux composés formés dans ces
procédés peuvent présenter des propriétés particulières différentes de celles de leurs précurseurs.
Au cours des étapes de production de la bière, divers co-produits sont formés. Durant le
brassage, on produit des drèches et un résidu d’ébullition, encore appelé trouble whirlpool, formé
lorsque le moût est additionné de houblon et bouilli. Il est constitué principalement de protéines
coagulées et de résidus du houblon47. La fermentation entraîne une production importante de
levures, dont les "levures brunes", dénomination liée à la présence de composés phénoliques fixés à
leur surface. Enfin, la filtration de la bière permet d’éliminer un résidu de protéines et de composés
phénoliques non désirable dans le produit fini (entraînant l’apparition d’un trouble). Il est important
de noter que ces co-produits sont généralement riches en composés phénoliques provenant soit des
céréales, soit du houblon.
3.1 Chauffage
Les méthodes thermiques et de préparation des aliments appliqués aux céréales améliorent
leur texture, leur saveur et leur valeur nutritive par gélatinisation de l'amidon, dénaturation des
protéines, augmentation de la disponibilité des nutriments, inactivation des composés toxiques
thermolabiles et d'autres inhibiteurs d'enzymes. Toutefois, les informations concernant les effets du
chauffage sur les composés phénoliques et l’activité antioxydante de l'orge sont encore limitées48 .
Des recherches antérieures dans les céréales ont indiqué qu'une partie importante des
composés phénoliques est présente sous forme conjuguée, soluble ou sous forme liée, insoluble49-51.
Le traitement thermique induit l'hydrolyse des composés phénoliques conjugués, entraînant la
libération des acides phénoliques libres et augmente ainsi la quantité de composés phénoliques bio-
disponibles. Les acides cinnamiques tels que les acides caféique, férulique et p-coumarique se
trouvent généralement dans une forme conjuguée et ils sont libérés après un processus d'hydrolyse
tel que celui produit pendant le traitement thermique52.
32
Les réactions de brunissement non-enzymatique ou réaction de Maillard font parties des
phénomènes les plus importants se produisant pendant la transformation des aliments, lors de leur
traitement par des processus thermiques33. La formation des produits colorés de la réaction de
Maillard, lors des étapes de touraillage du malt et d’ébullition du moût31,42,53,54, est fréquemment
associée à la formation de composés antioxydants36,55 tels que les réductones et les mélanoïdines.
Une étude a corrélé la teneur en prodelphinidine B3, procyanidine B3 et catéchine avec le

degré de brunissement dans 42 variétés de pâtes d'orge56. Les proanthocyanidines, la catéchine et
l’acide caféique provoquent le brunissement par chauffage des pâtes d'orge et des solutions
aqueuses d’extraits d’orge, mais l'acide férulique réduit le brunissement des pâtes d'orge. La
catéchine et les proanthocyanidines, qui sont facilement auto-oxydé pendant le chauffage, sont les
acteurs principaux du brunissement des produits de l’orge chauffés56.
La concentration des proanthocyanidines diminue d’environ 70% au cours des étapes

successives du procédé. Des pertes importantes de proanthocyanidines se produisent lors des
étapes d’ébullition et de refroidissement du moût, du fait de leur coprécipitation avec les protéines
et les polysaccharides mais aussi du fait de réactions de dégradation telles que des réactions de
dépolymérisations puisque la concentration de monomères de flavanols augmente légèrement10.
3.2 Fermentation
Les composés phénoliques montrent divers degrés de tolérance aux procédés de fermentation
dans les industries de la brasserie et sont capables de résister partiellement à ces procédés57. La
teneur des différents composés phénoliques change au cours de la fermentation avec une réduction
constante de la teneur en tannins dans la bière58. Cela est dû à un phénomène d’adsorption des
composés phénoliques sur les levures au cours de la fermentation alcoolique. Bien que le
mécanisme des interactions soit inconnu, il a été démontré que certaines levures reteniennent les
anthocyanes dans le vin59,60, on parle de levures dites brunes. Mazauric et Salmon ont montré que
très peu de composés phénoliques monomères restent adsorbés sur les levures et qu'il n'y a pas
d'adsorption préférentielle entre les tanins de haut poids ou de faible poids moléculaire61. Les tanins
condensés restés dans le vin contiennent moins d’unités épigallocatéchine que les tanins initiaux, ce
qui indique que les tannins condensés polaires sont préférentiellement adsorbés sur les levures.
33
3.3 Filtration
La filtration finale de la bière, pour éliminer les levures, se fait par filtration au kieselguhr. Le
kieselguhr est une roche d’origine sédimentaire, constituée par l’agglomération des enveloppes
siliceuses de diatomées, micro-organismes marins ou lacustres unicellulaires.
Pendant le stockage de la bière, un trouble peut être formé par l'interaction de protéines et
de composés phénoliques. Afin de prévenir la formation du trouble et d'étendre ainsi la durée de
conservation de la bière, les composés phénoliques sont partiellement éliminés de la bière par un
traitement avec la résine polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)62. La suppression des composés
phénoliques par le traitement à la PVPP diminue le pouvoir réducteur de 9 à 38%, mais cela ne rend
pas la bière plus sensible à l’oxydation31.
34
4 Méthodes d’analyses des composés phénoliques
4.1 Extraction
La voie principale d’obtention des composés phénoliques est l’extraction des produits
végétaux : fruits, légumes, céréales et plantes (feuilles, branches, racines). Le simple fait de faire
macérer des végétaux dans de l’eau permet d’obtenir une solution contenant des composés
phénoliques. Cependant des techniques modernes permettent d’extraire une quantité plus
importante de composés phénoliques.
Avant extraction, les échantillons solides sont habituellement d'abord homogénéisés, ce qui
peut être précédé d'une étape de lyophilisation ou de congélation à l'azote liquide, pour une
meilleure conservation des composés à extraire et les échantillons liquides sont habituellement
filtrés et/ou centrifugés63.
4.1.1 Extraction liquide-liquide
Divers solvants comme le méthanol, l’éthanol, l’acétone, l’eau, l’acétate d’éthyle, l’éther
diéthylique, etc. peuvent être utilisés64. Mais l’extraction à l’acétate d’éthyle reste la méthode la plus
largement utilisée pour l'extraction des composés phénoliques54,65,66, même si la procédure
d'extraction est classique. Le plus souvent, la force ionique de la solution à extraire est modifiée par
ajout de chlorure de sodium et acidification à pH < 2 avant extraction. La plupart des composés
phénoliques se retrouvent alors dans l’acétate d’éthyle qu’il est ensuite aisé d’éliminer sous vide afin
de transférer la fraction phénolique correctement extraite dans le méthanol pour les analyses
qualitatives et quantitatives ultérieures.
4.1.2 Extraction sur phase solide
Les extraits phénoliques peuvent être partiellement purifiés en utilisant des résines
adsorbantes. Elles possédent une structure de résine échangeuse d’ions mais sans site chimique actif
greffé sur leur structure10. Leur squelette chimique poreux a la propriété d’adsorber certains types
de molécules de manière similaire au charbon actif. Les résines les plus utilisées et les plus connues
sont la PVPP67 ou encore des résines basées sur des structures polyméthacrylate (XAD)68. Les
composés phénoliques ainsi adsorbés sur la résine sont ensuite élués à l’éthanol légèrement acidifié.
35
L’extraction en phase solide (solid phase extraction, SPE) est utilisée pour l’isolation et la
concentration des composés phénoliques69. Les composés de l'échantillon d'intérêt sont séparés des
autres espèces par l'application de l’échantillon liquide sur un adsorbant solide approprié et par
l’élution sélective des composés désirés70. Dans la plupart des cas, l’adsorbant est de la silice sur
laquelle des groupements C18 ont été greffés. L’échantillon et le solvant d’élution sont légèrement
acidifiés.
4.2 Analyses
4.2.1 Analyses spectrophotométriques
De nombreuses méthodes spectrophotométriques ont été développées pour la quantification

des composés phénoliques. La méthode de Folin-Denis est la méthode la plus largement utilisée
pour la quantification des composés phénoliques totaux dans les plantes, mais la méthode de Folin-
Ciocalteu est aussi largement utilisée64. La méthode de la vanilline est utilisée pour la quantification
des proanthocyandines totales dans les plantes et les graines64,69. Les réactifs des méthodes de Folin
et de la vanilline ne sont pas spécifiques et peuvent interférer avec des substances absorbant dans
l’UV telles que des protéines, des acides nucléiques et des acides aminés69. Les méthodes
spectroscopiques traditionnelles peuvent conduire à une surestimation des composés phénoliques
présents dans les extraits en raison du chevauchement des réponses spectrales64.
4.2.2 Analyses chromatographiques
Des techniques classiques de séparation comme la chromatographie gazeuse et la

chromatographie sur couche mince peuvent être utilisées pour l’analyse des composés phénoliques.
Cependant, ces techniques de séparation sont beaucoup moins utilisées que la chromatographie
liquide pour la séparation des composés phénoliques et ne seront donc pas développées ici.
4.2.2.1 Chromatographie liquide
La présence des composés phénoliques dans les matrices alimentaires et les boissons telles
que la bière, est généralement mise en évidence par des méthodes chromatographiques de chimie
analytique telle que la Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC). Ces méthodes sont,
36
de loin, les plus performantes et les plus utilisées pour la séparation et le dosage des composés
phénoliques. Les séparations sont basées sur les polarités respectives des phases stationnaires
utilisées, du solvant d’élution et des composés phénoliques concernés et sont effectuées soit sur
phase normale, soit sur phase inverse. La phase normale implique une chromatographie de
composés phénoliques non polaires sur une phase stationnaire de silice avec élution par un solvant
apolaire. La phase inverse, qui est la plus couramment utilisées dans le monde des composés
phénoliques, consiste en une phase mobile plus polaire que la phase stationnaire64. L’échantillon
injecté sera séparé grâce à un mécanisme de partition entre la phase stationnaire et la phase mobile
et l’élution sera basée sur la différence de polarité entre les différents composés du mélange.
Les composés phénoliques sont communément détectés, en sortie de colonne, en utilisant

des détecteurs UV-visible, UV à barrette de diode (DAD) et de fluorescence UV69,71. Les
spectromètres de masse (MS) couplés à la HPLC sont couramment utilisés pour la caractérisation
structurale des composés phénoliques71. Des informations supplémentaires sur la structure des
composés peuvent également être obtenues par Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN)71.
4.2.2.2 Chromatographie liquide couplée à l’analyse de l’activité antioxydante
Les méthodes classiques d'identification de composés antioxydants dans des mélanges

complexes impliquent généralement de longues procédures de fractionnement bio-guidée, suivie de
l'identification des composés purifiés. De nouvelles méthodes d'analyses ont été conçues afin de
non seulement séparer les composés phénoliques, mais aussi de déterminer leur potentiel d'activité
fonctionnelle. Au cours des dix dernières années, plusieurs études sur l’analyse de l’activité
antioxydante couplée à la HPLC ont été publiées72,73.
4.2.2.2.1 Détection par chimiluminescence
Certaines études impliquent des interactions radicaux libres / substrats oxydables. L'activité
antioxydante mesurée dans le système est liée à la compétition entre le substrat et l'antioxydant
pour les radicaux libres. Des études de ce type ont été faites avec l'oxygène singulet, le peroxyde
d'hydrogène et/ou l’anion superoxyde74-78. Ces essais sont basés sur la chimiluminescence initiée par
les radicaux libres, mais utilisent des mécanismes d'initiation différents.
37
4.2.2.2.2 Détection par électrochimie
D’autres études impliquent la détection électrochimique comme méthode de détection de

composés contenant un ou plusieurs groupes électroactifs tels que les antioxydants. La détection par
électrochimie coulométrique implique l’utilisation d’un détecteur coulométrique multicanal pour
obtenir des informations voltamétrique sur les composés élués de la colonne chromatographique79.
Pour chaque composé une réponse maximale est obtenue à une tension spécifique appelée
potentiel dominant. La détection par électrochimie ampérométrique implique le fait que le potentiel
d'oxydation d'un composé fournit une estimation de l'énergie nécessaire pour donner un électron :
plus le potentiel d'oxydation est faible, plus le composé donne facilement un électron et plus
l’activité antioxydante est élevée80.
4.2.2.2.3 Détection impliquant un radical stable
Des études associent directement l'activité antioxydante à un potentiel d'oxydation et

indiquent la facilité avec laquelle un antioxydant peut être oxydé par des radicaux libres. Les études
les plus largement utilisées impliquent un radical coloré, relativement stable, comme le radical 1,1-
diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH•)81 ou le radical 2, 2-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonate)
(ABTS•+)82, qui est ajouté, en post-colonne, au débit de HPLC. Les composés antioxydants sont alors
détectés par une diminution de l'absorbance aux longueurs d’ondes visibles dues à la conversion des
radicaux sous leurs formes réduites, non-colorées.
Le système HPLC pour la détection de l’activité antioxydante (LC-AOx), utilisant l’ABTS•+, est
destiné à cribler des composés ayant une activité antioxydante dans des extraits naturels d'une
manière plus directe et plus rapide. Koleva et al. ont été les premiers à développer une méthode
HPLC utilisant l’ABTS•+ pour la détection des radicaux libres dans des mélanges complexes de
Sideritis syriaca82. Une comparaison de la sensibilité de cette méthode avec les méthodes du DPPH81
et de chimiluminescence77 couplée à la HPLC a démontré que la méthode LC-AOx est la plus sensible
et est moins analyte-dépendante que les deux autres. Le même système a été utilisé par Miliauskas
et al. pour détecter des antioxydants de trois plantes différentes (Geranium macrorrhizum, Potentilla
fruticosa, Rhaponticum carthamoides)83-85. Cano et al. ont décrit l’analyse de composés antioxydants
très polaires tels que l’acide ascorbique provenant de jus d’orange ou de composés antioxydants
non phénoliques, non polaires tels que le lycopène du jus de tomate86. Cette équipe a souligné
l'importance d'un temps de réaction d'au moins 1 minute pour obtenir une réaction complète de
tous les antioxydants. Les données peuvent également être utilisées de manière quantitative par
38
construction d’une courbe de calibration (équivalent Trolox). Beekwilder et al. ont étudié les
différentes étapes de maturation d’une variété de framboise et les fruits mûrs de 14 variétés de
framboisiers par la méthode LC-AOx et plusieurs anthocyanines, ellagitannins et proanthocyanidines
ont pu être identifiés87. Cette équipe a notamment utilisé une longueur d’onde de détection de
l’ABTS de 412 nm au lieu de 734 nm. La même méthode a été utilisée pour détecter les antioxydants
de tomates88 ou pour identifier, par combinaison de la capacité de réduction de l’ABTS avec les
spectres UV et les temps de rétentions des différents composés, et quantifier, en équivalent Trolox,
le potentiel antioxydant des thés vert et noir89. La méthode LC-AOx a également été utilisée pour
étudier les antioxydants des grains de café et identifier un grand nombre d’acides caffeoyl-, feruloyl-
et dicaffeoylquinique (acide chlorogénique)90. La sélectivité de la méthode a été bien illustrée par un
chromatogramme d’un extrait de bois d’olivier dans lequel l’hydroxytyrosol, parmi d’autres
composés, était difficilement observable par détection UV mais dont le pic dominait dans le profil
antioxydant91,92. Cassano et al. ont utilisé la méthode LC-AOx pour étudier l’influence du procédé de
torréfaction sur l’activité antioxydante des grains de café93. Le degré et la vitesse de torréfaction
influence les propriétés antioxydantes des grains de café. Li et al. ont présenté pour la première fois
la méthode LC-AOx couplée à la spectrométrie de masse pour l’identification de composés
antioxydants d’un extrait d’Angelica sinensis94. Les auteurs ont conclu que cette méthode était un
outil puissant pour la détermination et l’identification rapide de composés antioxydants dans des
extraits végétaux.
Concernant la bière, une étude de 2010 a permis de comparer les profils phénoliques et les
activités antioxydantes de bières commerciales95. Les auteurs ont analysé les corrélations entre les
composés phénoliques individuels et totaux, et ont quantifié la contribution des différents composés
phénoliques à l'activité antioxydante de la bière, mais n’ont pas utilisé de méthode de détection de
l’activité antioxydante couplée à la HPLC. La méthode LC-AOx a alors été utilisée pour détecter et
identifier les composés antioxydants à différentes étapes du procédé de la bière.
39
40
Chapitre 2 :
Décoloration de la
bière
41
1 Introduction
La couleur du moût, à l’origine de la couleur naturelle de la bière, est due principalement aux
mélanoïdines et aux composés phénoliques de l'orge et du houblon. Cette couleur est un frein
important au développement de produits innovants, comme par exemple des bières aux couleurs
vives. Obtenir des couleurs attrayantes semble par conséquent être un objectif extrêmement
difficile à atteindre en partant d'un liquide naturel (moût ou bière) dont la gamme de couleurs varie
du jaune paille, dans le meilleur des cas, au marron foncé. Plusieurs facteurs interviennent dans le
développement de la couleur de la bière dont le traitement subi par le malt et notamment le
touraillage, responsable de la production de mélanoïdines par des réactions de Maillard, de produits
de caramélisation, et de phlobaphènes colorés résultant de l'oxydation des composés phénoliques.
L’élément majeur de la couleur du moût reste toutefois les composés phénoliques natifs, qu’ils
proviennent du malt ou du houblon5. Le développement de techniques d’élimination des composés
colorés du moût, permettrait d’améliorer la qualité technologique du moût par suppression de
composés phénoliques, de glucanes et probablement aussi de certaines protéines qui, par
complexation impliquant des liaisons hydrogènes, sont à l’origine de la formation de précipités et de
troubles62, ce qui souvent complique certaines étapes délicates du procédé telles que la filtration.
Ceci ouvrirait la voie au développement de nouvelles boissons maltées incolores d’un grand intérêt
pour l’industrie brassicole.
La décoloration est une technique permettant d’éliminer la couleur, sans détériorer le produit,
et d’obtenir un nouveau produit pouvant être recoloré de façon innovante. Elle est influencée par de
nombreux facteurs physico-chimiques tels que, la nature de l'interaction composé coloré/adsorbant
(adsorption ou échanges d’ions96), la surface d’échange, la taille des particules adsorbantes, la
température, le pH et le temps de contact97. Le choix de l’adsorbant a donc toute son importance.
Parmi les adsorbants les plus notoires, il y a le charbon actif dont l’utilisation est très courante dans
la décoloration des eaux usées98, mais qui peut également être utilisé pour la préparation de
boissons maltées incolores et limpides. Word et al. ont ainsi réalisé la décoloration d’une boisson
maltée par mise en contact du moût bouilli non fermenté ou du produit fermenté avec le charbon
actif99. Dans les deux cas, 12 heures de contact au minimum ont été nécessaires à la décoloration.
Rivera, Macapugay et De Carlos ont utilisé le charbon actif au cours du brassage à partir de la
cuisson du moût ce qui a permis d’obtenir une période de contact supplémentaire et suffisamment
longue pour décolorer le moût100. Parmi les autres adsorbants les plus utilisés figure la PVPP qui est
un polymère synthétique utilisé dans les procédés de décoloration de boissons riches en composés
42
phénoliques. Dans le cas de la bière, ces composés sont éliminés afin de prévenir la formation de
complexes avec les protéines. Les mécanismes de formation de ces complexes sont similaires à ceux
des complexes formés entre la PVPP et les composés phénoliques101,102. Les résines échangeuses
d'ions sont également utilisées dans les procédés de décoloration de boissons, telles que le vinaigre
de vin103. Ces résines peuvent être utilisées sous la forme de réacteurs régénérables au
fonctionnement continu, ce qui permet d’automatiser le procédé de décoloration et de réduire la
production de déchets solides. D’autres adsorbants, à faible coût, proviennent de déchets et sous-
produits industriels et agricoles, il s’agit par exemple du chitosan, de la bentonite ou encore des
rafles de maïs104. La chitine et le chitosan, qui ont été utilisés comme adsorbants des composés
phénoliques du vin105, sont les deuxièmes polymères glucidiques naturels les plus abondants,
derrière la cellulose. Ils sont produits à partir d’exosquelettes de crustacés tels que les crabes, les
krills et les écrevisses, dont une grande quantité est disponible en tant que sous-produits de la
transformation des aliments. La bentonite, une fine poudre d’argile, possède une grande surface
spécifique ainsi qu’une grande capacité d'échange qui lui confère des propriétés adsorbantes
notamment pour l'élimination des composés phénoliques à partir des eaux usées106. Les rafles de
maïs sont des déchets agricoles obtenus par broyage de la ceinture ligneuse des épis de maïs. Elles
sont peu coûteuses, inertes, composées de grains homogènes et dépoussiérés, très riches en
celluloses et hémicelluloses107 (environ 80% de leur matière sèche), et sont utilisées comme
adsorbants de composés colorés, par exemple dans l’industrie textile108.
L’objectif de cette partie du travail est de mettre au point une technique d’élimination de la
couleur naturelle de la bière qui serait appliquée avant ou après l’étape de fermentation. Pour cela,
une large gamme d'adsorbants a été étudiée et leurs performances de décoloration ont été
comparées. Une étude comparative entre le moût et la bière, a ensuite été réalisée afin d’évaluer,
au niveau physico-chimique, l’influence de la décoloration sur la composition du moût et la qualité
de la fermentation.
43
2 Matériel et méthodes
2.1 Réactifs, produits chimiques et matériels végétaux
Le charbon actif en poudre (DARCO KB-G et DARCO KB-WJ) et en granules (GAC), la

bentonite, la chitine et le chitosan issus de carapaces de crabes, la PVPP, le kieselguhr, la
carboxyméthylcellulose, l’acide ethylènediaminetétraacétique (EDTA) et les acides 4-hydroxy-3-
méthoxycinnamique (acide férulique), 3,4-dihydroxycinnamique (acide caféique), 3,4,5-
trihydroxybenzoique (acide gallique), 4-hydroxy-3-méthoxybenzoique (acide vanillique), 3,4-
dihydroxybenzoique (acide protocatéchuique), p-hydroxybenzoique, chlorogénique, 4-
hydroxycinnamique (acide p-coumarique), sinapique, m-coumarique et o-coumarique, ainsi que la
catéchine et l’épicatéchine, de qualités HPLC, ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Steinheim,
Allemagne). Les résines échangeuses d’ions Amberlite FPA98, FPA90, FPA40 et FPX68 ont été
achetées chez Rhom and Haas (Paris, France). Les rafles d’épis de maïs EU GRITS 40/60, EU GRITS
100 et EU GRITS poudre ont été achetées chez EuroCob (Maubourguet, France). L’eau ultrapure est
produite au laboratoire par un système de purification Synergy UV (Millipore, Molsheim, France). Le
méthanol de qualité HPLC a été acheté chez VWR (Strasbourg, France). L’orge (Hordeum vulgare)
malté, de variété Sunshine, provient de la micromalterie des Brasseries Kronenbourg (Strasbourg,
France) où il a été brassé, puis fermenté pour former le moût et la bière de type Kronenbourg.
2.2 Brassage à l’échelle du laboratoire
Le malt (50 g) est moulu (Bühler Miag Disc Mill, DLFU, Etats-Unis), ajouté à 200 mL d’eau, puis
maintenu à 45°C pendant exactement 30 minutes. La température du bain est ensuite augmentée de
1°C par minute pendant 25 minutes jusqu’à atteindre 70°C, puis maintenue pendant 1 h. Le moût
obtenu est refroidi à température ambiante, puis filtré à travers un papier filtre Whatman n° 1
(Whatman, Paris, France).
44
2.3 Décoloration du moût
2.3.1 Choix de l’adsorbant
Les expériences de décoloration sont réalisées en utilisant 10 mL de moût (brassé à l’échelle

du laboratoire) et 50 mg de différents adsorbants pendant 10, 20, 30, 60 et 120 minutes pour la
détermination du temps de contact minimal et en utilisant 10 mL de moût et des adsorbants à
différents concentrations de 0 à 10 g/L pendant 30 minutes pour la détermination de la
concentration minimale en adsorbants, pour avoir le plus faible pourcentage d’adsorption. Les
expériences sont réalisées dans des tubes de centrifugation en polypropylène Corning® (New York,
USA) de 50 mL sur un agitateur giratoire (Fisher scientific, Illkirch, France) à 250 tr/min et à
température ambiante. Après centrifugation des mélanges moûts-adsorbants (2500 g, 10 min), les
surnageants obtenus sont filtrés (0,45 µm, Macherey-Nagel, Hoerdt, France) et l’absorbance du
moût décoloré est mesurée à 430 nm (spectrophotomètre, Shimadzu, Champs-sur-Marne, France).
Ces expériences sont répétées trois fois pour tous les adsorbants et les résultats sont exprimés en
unité EBC de couleur selon le calcul suivant109 :
Couleur (EBC) = Absorbance 430nm x 25.
2.3.2 Décoloration du moût au charbon actif
Dix litres de moût de type Kronenbourg sont mélangés à 50 g de Kieselguhr et 100 g de

charbon actif KB-WJ, puis agités pendant 30 min à 250 tr/min à température ambiante. Un filtre à
Kieselguhr avec une membrane (5 µm, Millipore) est d’abord alluvionné avec 50 g de Kieselguhr dans
5 L d’eau distillée, puis le mélange (moût, Kieselguhr et charbon actif KB-WJ) est filtré, afin d’obtenir
un moût décoloré.
2.3.3 Fermentation du moût décoloré
Les moûts non décoloré et décoloré au charbon actif KB-WJ sur le filtre à Kieselguhr, de
14°Plato de densité, sont fermentés, à 14°C, par des levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae,
ensemencées à 1,4.107 cellules par mL de moût. Cette cible d’ensemencement a été déterminée
comme nous avons pu le voir dans la partie 1.5 du chapitre 1. Le pH d’un moût décoloré (pH=4,29)
45
est ajusté à pH=5,04, pH du moût non décoloré, avec de la soude 1 M, préalablement à la
fermentation.
La fermentation a été réalisée en utilisant 2 L de moût, pré-aéré pendant 30 min à

température ambiante par saturation à l’air, soufflé dans le moût. Elle a également été réalisée avec
20 L de moût et une aération par saturation à l’oxygène dont l’utilisation cumule deux avantages :
une grande efficacité d’aération (rapidité) et un débit très faible, ce qui évite la formation de
mousse. Le débit d’oxygène est maintenu jusqu’à l’obtention de la cible d’aération qui correspond
aux 100% sur la sonde de pression d’oxygène, préalablement étalonnée à 11 ppm d’O2.
2.4 Décoloration de la bière
De la bière de type Kronenbourg est produite en fermentant 20 L de moût non décoloré. Une
décoloration est ensuite réalisée comme nous l’avons vu précédemment pour le moût : dix litres de
bière sont mélangés à 50 g de Kieselguhr et 100 g de charbon actif KB-WJ, puis agités pendant 30
min à 250 tr/min à température ambiante. Un filtre à Kieselguhr avec une membrane (5 µm,
Millipore) est d’abord alluvionné avec 50 g de Kieselguhr dans 5 L d’eau distillée, puis le mélange
(bière, Kieselguhr et charbon actif KB-WJ) est filtré, afin d’obtenir une bière décolorée.
2.5 Effet de la décoloration sur les propriétés physico-chimiques du moût

et de la bière
2.5.1 Analyse des composés phénoliques
2.5.1.1 Dosage colorimétrique des composés phénoliques totaux
Les composés phénoliques totaux sont dosés grâce à la méthode de la réaction colorée avec le
citrate de fer en milieu alcalin (protocole EBC n° 9.11)110,111. L'intensité de la coloration est lue à 600
nm et est proportionnelle à la concentration en composés phénoliques. Une solution est préparée
par mélange de 10 g de carboxyméthylcellulose pure et de 2 g d’EDTA dans un volume de 800 mL
d'eau distillée, puis agitation pendant une nuit jusqu'à dissolution complète. Le volume est ensuite
ajusté à 1 L avec de l’eau distillée (solution A). Une deuxième solution (solution B) est préparée avec
3,5 g de citrate de fer ammoniacal, dissous dans 100 mL d'eau distillée. La solution est conservée à
l'abri de la lumière et est renouvelée tous les jours. Une troisième solution (solution C) est préparée
46
avec 30 mL d'ammoniaque pur concentré mélangés à 60 mL d'eau distillée, puis conservée à 4°C à
l’abri de la lumière pendant 1 mois. Une solution essai (10 mL de solution d’échantillon, 8 mL de
solution A, 0.5 mL de solution B et 0.5 mL de solution C) et un blanc (10 mL de solution d’échantillon,
8 mL de solution A et 0.5 mL de solution C) sont préparés, puis ajustés à 25 mL avec de l'eau distillée.
Au bout de 10 minutes, l'absorbance est lue à 600 nm contre de l'eau distillée et les valeurs
obtenues converties en mg de composés phénoliques par litre de solution selon le calcul suivant 111:
Composés phénoliques (mg/L) = [AEssai - ABlanc] x 820
(AEssai : Absorbance de l’essai ; ABlanc : Absorbance du blanc).
2.5.1.2 Extraction et analyse chromatographique des composés phénoliques
Les expériences d’adsorption sont réalisées dans des tubes de centrifugation Corning® (New
York, USA) de 50 mL contenant 9 mL d’eau auxquels sont rajoutés 1 mL d’un mélange de composés
phénoliques à 150 µM chacun préparé dans un mélange méthanol/H2O (50/50 ; v/v) et 100 mg de
charbon actif KB-WJ. Le mélange est agité dans un agitateur giratoire à 250 tr/min pendant 30
minutes à température ambiante, puis centrifugé à 2500 g pendant 10 min. Le surnageant obtenu
est évaporé à sec dans un évaporateur sous vide à froid (Savant SPD121P SpeedVac® Concentrator,
ThermoScientific, Gometz le Châtel, France) et le résidu est dissous dans 1 mL de méthanol/eau
(50/50 ; v/v), filtré sur membrane (0,45 µm, Macherey-Nagel) et injecté (20 µL) dans un système
HPLC, constitué d’un contrôleur 600S, d’une pompe 616, d’un injecteur automatique 717 Plus et
d’un détecteur UV-visible à photodiode 2996 (Waters, Saint-Quentin-Fallavier, France). Les
séparations sont réalisées à température ambiante sur une colonne de chromatographie C18
Hypersil BDS (5 µm, 250 x 4,6 mm, ThermoScientific). La phase mobile, délivrée à 1 mL/min, consiste
en un mélange d’eau (0,1% [v/v] d'acide formique) (éluant A) et de méthanol (éluant B) selon le
gradient suivant: 0-25 min, 3-25% de B; 25-26 min, 25-18% de B; 26-29 min, 18% de B; 29-47 min,
18-30% de B; 47-57 min 30% de B; 57-67 min, 30-65% de B; 67-77 min, 65% de B, 77-78 min, 65-3%
de B, 78-90 min 3% de B. La détection UV est réalisée à 254 nm. Les expériences sont répétées trois
fois.
47
2.5.2 Analyses de routine selon les protocoles Analytica EBC
Les différentes méthodes d’analyses des moûts et des bières sont faites en routine au
Laboratoire Centrale des brasseries Kronenbourg selon les méthodes Analytica EBC112 : protocole n°
8.13.2, 9.2.1, 9.6, 9.7, 9.9.2, 9.10, 9.11, 9.12, 9.24.1, 9.26, 9.27, 9.35. Les méthodes correspondantes
aux composés décrits sont détaillées ci-après.
2.5.2.1 Acides aminés libres
Les échantillons de moût ou de bière, filtrés sur membrane (0,20 µm), sont injectés (0,5 µL)
dans un système HPLC (Waters). Les séparations sont réalisées sur une colonne de chromatographie
ODS hypersil (5µm, 100 x 2,1 mm, ThermoScientific) en phase inverse chauffée à 40°C. Les acides
aminés primaires, après traitement au fluoraldéhyde (20 µL, Merck), sont amenés en tête de
colonne par la phase mobile qui consiste en un mélange d’eau (acétate de sodium 0,1 M, pH=8,
Merck, Darmstadt, Allemagne) (éluant A) et de méthanol (éluant B) à un débit de 0,02 mL/min.
Après un temps de réaction d’une minute, le débit passe à 0,35 mL/min et la séparation commence
selon le gradient suivant : 0-5 min, 5-15% de B; 5-10 min, 15-25% de B; 10-13 min, 25-35% de B; 13-
18 min, 35-55% de B; 18-20 min, 55-75% de B, 20-21 min, 75-5% de B, 21-30 min 5% de B. La
détection UV est réalisée à 338 nm. Quinze acides aminés sont couramment étudiés dans la bière,
leur ordre d’élution est le suivant : acide aspartique ; acide glutamique ; sérine ; histidine ; glycine ;
thréonine ; arginine ; alanine ; tyrosine ; méthionine ; valine ; phénylalanine ; isoleucine ; leucine et
lysine. Les acides aminés sont identifiés et quantifiés sur la base des temps de rétention des surfaces
des pics des étalons. Vingt mesures sont réalisées par analyse. Le résultat est donné par le calcul
suivant :
R (µmol/L) = (Sp/Sx)*Mx
(Sp : surface du pic échantillon, Sx : surface du pic étalon, Mx : concentration en µmol/L du pic
étalon)
2.5.2.2 Sucres fermentescibles
Les échantillons de moût ou de bière, dégazés par agitation avec un barreau magnétique puis
filtrés (0.22 µm), sont injectés (10 µL) dans un système de HPLC (Waters). La séparation des sucres
48
est réalisée à 40°C sur une colonne de chromatographie Asahipak NH2 (5µm, 250mm x 4.6 mm,
Interchim, Montluçon, France) pendant 20 min. La phase mobile consiste en un mélange isocratique
d’eau (30%) et d’acétonitrile (70%, VWR) à 1 mL/min. La détection se fait par réfractométrie à 40°C.
Le fructose, le glucose, le saccharose, le maltose et le maltotriose sont identifiés par comparaison de
leur temps de rétention avec ceux des étalons. Vingt mesures sont réalisées par analyse.
2.5.2.3 Minéraux
La teneur en minéraux des échantillons de moûts ou de bières est déterminée par un système
de torche à plasma couplée à la Spectrométrie d’Emission Atomique (ICP-AES, inductively coupled
plasma by atomic emission spectrometry) ICAP 6000 (Thermo Fisher Scientific). Avant l’analyse, les
échantillons (2 mL), dégazés par agitation avec un barreau magnétique au moins 30 minutes à
température ambiante, sont dissous dans un mélange acide contenant 2 mL d’acide nitrique (65%,
Merck) et ajusté à 100 mL avec de l’eau distillée. L’analyse est réalisée entre 167 nm et 850 nm
(315.887 nm et 422.673 nm pour le calcium, 285.213 nm pour le magnésium, 589.592 nm pour le
sodium, 766.490 nm pour le potassium, 206.200 nm et 213.856 nm pour le zinc, 323.7 nm pour le
cuivre et 238.204 nm et 259.940 nm pour le fer) après nébulisation des composés qui sont ensuite
entraînés par un flux d’argon et injecté dans le plasma. Le solvant est évaporé et l’échantillon
résiduel est décomposé en atomes et ions qui sont excités par l’énergie du plasma. Les minéraux
(calcium, magnésium, sodium, potassium, fer, cuivre et zinc) ont été identifiés par comparaison de
leur longueur d’onde avec celles des étalons (SCP Sciences, Courtaboeuf, France).
2.5.2.4 Couleur
Les échantillons sont traités et analysés selon la méthode décrite dans la partie 2.5.1.1.
2.5.2.5 Composés phénoliques totaux
Les échantillons sont traités et analysés selon la méthode décrite dans la partie 2.5.1.2.
49
2.5.2.6 Azote aminé libre
Les échantillons de bières et de moûts filtrés sur Whatman n° 1 (Whatman) sont distribués sur
le plateau échantillonneur d’un analyseur à flux continu SKALAR SAN++ (Breda, Pays-Bas) et
décarboxylés par la ninhydrine (Merck) (10 g + 40 g d’acétate de sodium dans 500 mL d’eau
distillée), en relarguant de l’ammoniaque. La ninhydrine réduite réagit avec la ninhydrine non
réduite et l’ammoniac pour former un complexe coloré bleu jaune. L’addition d’iodate de potassium
(2 g/L) stoppe la réaction et évite les réactions parasites. L’intensité de la coloration, mesurée à 570
nm, est proportionnelle à la teneur en azote aminé libre des échantillons et les résultats sont
exprimés en mg/L.
2.5.2.7 Sucres totaux
La teneur en sucres totaux dans la bière ou le moût est déterminée par une méthode
colorimétrique, grâce à un analyseur à flux continu SKALAR SAN++ (Breda, Pays-Bas). Les échantillons
de bières et de moûts filtrés sur Whatman n° 1 (Whatman) sont distribués sur le plateau
échantillonneur et dilués dans l’acide chlorhydrique (400 ml de HCl à 37% dans 1 L d’eau distillée).
Les sucres, hydrolysés à 95°C, sont mélangés à une solution de chlorure de sodium (36 g/L, Merck),
puis dialysés contre une solution de carbonate de sodium (26,5 g/L, Merck). Les échantillons sont
alors additionnés d’un réactif formé d’un mélange de néocuproïne et de cuivre (200 mg de
chlorhydrate de néocuproïne, 100 mg de sulfate de cuivre, ajusté à 500 mL avec de l’eau distillée)
(Merck) et à 97°C, les sucres réducteurs présents réduisent le complexe cuivre-néocuproïne pour
former un complexe coloré jaune. L’intensité de la coloration, mesurée à 460 nm, est
proportionnelle à la teneur en sucres des échantillons et les résultats sont exprimés en g/L.
2.5.2.8 Atténuation limite
L’atténuation limite, obtenue lorsque tous les sucres fermentescibles sont fermentés, permet
de connaître la capacité maximum de fermentation d’un moût. Elle est calculée grâce à l’extrait
limite qui correspond à la densité de la bière après mesurée après une fermentation avec agitation
pour transformer rapidement les sucres fermentescibles en l’alcool. On mesure une densité
apparente à 20°C (densité 20/20) au densimètre électronique qui déterminera l’extrait du moût ou
de la bière après fermentation en g pour 100 g de moût et convertie en atténuation limite selon le
calcul suivant :
50
Extrait Pr imitif  ExtraitLim ite
A . L .en %  * 100
Extrait Pr imitif
A.L. : Atténuation Limite ; Extrait primitif : densité du moût de départ ; extrait limite : densité du
moût mesurée après fermentation)
2.5.2.9 β-glucanes solubles
La teneur en β–glucanes solubles dans les moûts et les bières est déterminée sur une chaîne à
flux continu SKALAR SAN++ (Breda, Pays-Bas). Les moûts et les bières sont dilués avec de l'eau
distillée puis mélangés à un réactif au Calcofluor (Sigma) qui se lie aux β-glucanes. L'intensité de
fluorescence de ce complexe calcofluor-β-glucanes, mesurée à 425 nm, est proportionnelle à la
teneur en β-glucanes des échantillons pour une longueur d'onde d'excitation à 365 nm et les
résultats sont exprimés en mg/L.
2.5.2.10 Volatils
Les composés volatils du moût et de la bière (l’acétaldéhyde, l’ethylacétate, le propanol,

l’isobutanol, l’isoamylacétate et l’alcool isoamylique) sont analysés par chromatographie en phase
gazeuse avec un système d’injection à espace de tête (headspace HS 40, Perkin Elmer Courtaboeuf,
France) chauffé à 50°C. Les échantillons sont séparés sur une colonne CP-WAX 52 CB (25 m x 0,53
mm, 2 µm, Varian) soumise à un gradient de température comme décrit ci-après : 2,5 min à 55°C,
puis une augmentation de la température jusqu’à 90°C (8°C/min). Le gaz vecteur utilisé est l’hélium
avec un débit fixé à 11 mL/min. La flamme du détecteur nécessite de l’air et de l’hydrogène. Les
températures de l’injecteur et du détecteur par ionisation de flamme FID sont de 150°C et 250°C,
respectivement. Les composés volatils ont été identifiés et quantifiés à l’aide d’un étalonnage réalisé
avec des solutions étalons (Merck) contenant des concentrations connues de chacun des composés
analysés.
2.5.2.11 Diacétyle et 2,3-pentanedione
L’analyse de ces deux composés se fait par chromatographie en phase gazeuse avec système
d’injection à espace de tête et détection par capture d’électrons. Les échantillons de bière sont
séparés sur une colonne de type Carbowax 20M à 10% sur Chromosorb PAW 80-100 mesh de
51
dimensions 4 m x 0,125 mm (Varian). La température initiale du four est fixée à 90°C isotherme. Le
mélange argon/méthane (90/10) est utilisé comme gaz vecteur avec un débit fixé à 15 mL/min et
comme gaz détecteur dans le détecteur à capture d’électrons (Ni 63) (Varian). La température de
l’injecteur et du détecteur est de 150°C. Les composés volatils ont été identifiés et quantifiés à l’aide
d’un étalonnage réalisé avec des solutions étalons (Sigma) contenant des concentrations connues de
chacun des composés analysés.
2.5.2.12 Populations de levures
La détermination du nombre total de cellules dans un échantillon se fait au microscope grâce

à une cellule de Malassez. L’échantillon de bière contenant les levures est agité afin d’homogénéiser
les levures et de les séparer les unes des autres, puis une suspension de levure est déposée entre la
cellule de Malassez et une lamelle. Après avoir placée la cellule sous le microscope (la combinaison
oculaire-objectif doit réaliser un grossissement d’environ 500 fois), toutes les levures des cinq
rectangles de la diagonale de la cellule sont comptées. Après avoir fait la moyenne du nombre de
levures dans les rectangles comptés, on obtient le nombre de levures dans un volume de 1/100
mm3, exprimé en nombre de cellules/mL.
52
3 Résultats et discussion
3.1 Décoloration du moût
3.1.1 Effet du temps de contact des adsorbants
La couleur du moût en EBC a été mesurée après sa mise en contact avec différents adsorbants
(KB-G, FPA40, PVPP, Chitosan, EU GRITS 40/60) à 5 g/L pendant des temps variables. La Figure 2.1,
représente la couleur résiduelle du moût après différentes durées de traitement décolorant
exprimée en pourcentage par rapport à la couleur initiale (100%). Comme on peut le voir, l’intensité
de la couleur du moût diminue pour atteindre une valeur constante au bout d’un temps
relativement court au-delà duquel la couleur n’est plus éliminée. L’intensité de couleur du moût
obtenue à l'équilibre reflète la capacité maximale de décoloration des adsorbants dans ces
conditions.
Figure 2.1 : Effet du temps de contact de différents adsorbants sur la couleur du moût (%)
53
Il apparaît ainsi qu’après 10 min de temps de contact entre le moût et le charbon actif (KB-G),
la résine (FPA40), la PVPP et le chitosan, la couleur résiduelle du moût correspond, respectivement,
à 27±8%, 49±8%, 72±7% et 80±0% de la couleur initiale. Pour ces adsorbants, l’équilibre semble avoir
été atteint après 10 min de contact, voire bien avant, puisque des essais réalisés entre 0 et 10 min
ont montré que l’adsorption des composés colorés pourrait être instantanée. Dans le cas du
chitosan, une légère diminution de la couleur du moût a toutefois été observée au-delà de 30 min.
Concernant l’EU GRITS 40/60, un temps de contact de 30 min est nécessaire pour atteindre une
couleur relativement stable à 88±13%. Ces deux adsorbants semblent adsorber plus lentement les
composés colorés du moût. En effet, ce sont des polymères de grandes tailles qui ont une faible
affinité pour ces composés113. Cela pourrait expliquer une adsorption plus lente, dans les conditions
utilisées (concentration de l’adsorbant, temps de contact, température) par rapport aux autres
adsorbants testés. En tenant compte de tous ces résultats, 30 min de temps de contact ont été
choisis pour la suite des expériences.
3.1.2 Effet de la concentration en adsorbants
La Figure 2.2 montre l'effet, sur la couleur du moût, d’adsorbants à différentes concentrations
(0, 0,5, 2 et 10 g/L) et après un temps de contact de 30 min. Les adsorbants testés sont : le charbon
actif (Figure 2.2a) ; la chitine, le chitosan et la bentonite (Figure 2.2b) ; les résines (Figure 2.2c) et les
rafles de maïs (Figure 2.2d).
Les résultats montrent qu’avec l’augmentation de la concentration en adsorbant, l’intensité

de la couleur résiduelle du moût diminue jusqu’à atteindre une valeur minimale à 10 g/L. En
augmentant la quantité d'adsorbant, le nombre de sites d’adsorption disponibles augmente et, avec
cela, l’efficacité de la décoloration113,114. La capacité décolorante du GAC, du chitosan, de la chitine,
de la bentonite et de l’EU GRITS poudre est visiblement très faible, puisqu’à 10 g/L, la couleur
résiduelle du moût est encore, respectivement, de 92±3%, 93±6%, 94±4%, 90±4% et 96±3% (Figure
2.2a, b et d). Les résultats sont à peine meilleurs avec le FPX68 et l’EU GRITS 40/60, avec une couleur
résiduelle du moût de 87±2 % et 88±1 %, respectivement, à 10 g/L (Figure 2.2c et d). Pour le FPA40,
le FPA98, l’EU GRITS 100 et le FPA90, l’intensité de la couleur du moût diminue jusqu'à 71±2%,
72±2%, 74±6% et 75±1%, respectivement, à 10 g/L (Figure 2.2c et d). La PVPP, le KB-G et le KB-WJ
semblent être les adsorbants les plus efficaces avec des valeurs respectives de couleur résiduelle de
47±3%, 25±1% et 8±1% à 10 g/L (Figure 2.2a).
54
Figure 2.2 : Effet de la concentration de différents adsorbants sur la couleur du moût (%) : (a), le
charbon actif KB-WJ, KB-G et GAC; (b), la chitine, le chitosan et la bentonite; (c), les résines PVPP,
FPA98, FPA90, FPA40 et FPX68; (d), les rafles de maïs EU GRITS 100, 40/60 et poudre.
Un classement des différents adsorbants suivant leur capacité de décoloration est donné dans
le Tableau 2.1. Ceux-ci peuvent ainsi être classés de la façon suivante, du plus fort pouvoir
décolorant au plus faible : KB-WJ > KB-G > PVPP > FPA40 > FPA98 > FPA90 > EU GRITS 100 > FPX68 >
EU GRITS 40/60 > bentonite > GAC > chitosan > chitine > EU GRITS poudre.
55
Tableau 2.1 : Capacité de décoloration du moût de différents adsorbants à 10 g/L
Capacité de décoloration (%)

Adsorbant
(10 g/L)
KB-WJ 92 ± 1
KB-G 75 ± 1
PVPP 53 ± 3
FPA40 29 ± 2
FPA98 28 ± 2
FPA90 26 ± 6
EU GRITS 100 25 ± 1
FPX68 13 ± 2
EU GRITS 40/60 12 ± 1
Bentonite 10 ± 4
GAC 8±3
Chitosan 7±6
Chitine 6±4
EU GRITS poudre 4±3
3.1.3 Effet de la décoloration du moût sur la quantité de composés phénoliques totaux
L'effet d’un traitement décolorant de 30 min avec chacun des différents adsorbants (0, 0,5, 2
et 10 g/L) sur la teneur en composés phénoliques totaux a été étudié. Le pourcentage en composés
phénoliques résiduels a été calculé en comparant les quantités de composés phénoliques avant et
après traitement décolorant. Il apparaît que, pour toutes les phases testées, lorsque la
concentration en adsorbant augmente, la teneur en composés phénoliques totaux diminue (Figure
2.3). Cette diminution se fait de manière parallèle à celle de la couleur du moût, ce qui confirme que
l’intensité de la couleur du moût est étroitement liée à la présence des composés phénoliques5. D’un
autre côté, les adsorbants dont la capacité de décoloration du moût est la plus élevée sont aussi
ceux qui ont le plus fort impact sur la teneur des composés phénoliques totaux. Ainsi, le FPX68
(Figure 2.3h), l’EU GRITS 40/60 (Figure 2.3i), la bentonite (Figure 2.3j), le GAC (Figure 2.3k), le
chitosan (Figure 2.3l), la chitine (Figure 2.3m) et l’EU GRITS poudre (Figure 2.3n) sont très peu
efficaces pour l'adsorption des composés phénoliques totaux. Le FPA40 (Figure 2.3d), le FPA98
(Figure 2.3e), le FPA90 (Figure 2.3f) et l’EU GRITS 100 (Figure 2.3g) sont moyennement efficaces. Et,
comme pour la décoloration, le KB-WJ (Figure 2.3a) est l’adsorbant le plus efficace lorsqu’il s’agit de
fixer les composés phénoliques totaux, suivi par le KB-G (Figure 2.3b) et la PVPP (Figure 2.3c).
56
Figure 2.3 : Evolution de la couleur du moût et de la quantité de composés phénoliques en fonction
de la concentration en adsorbant : (a), KB-WJ; (b), KB-G; (c), PVPP; (d), FPA40; (e), FPA98; (f), FPA90;
(g), EU GRITS 100; (h), FPX68; (i), EU GRITS 40/60; (j), bentonite; (k), GAC; (l), chitosan; (m), chitine et
(n), EU GRITS poudre.
____: Couleur du moût (%)
-------: Quantité de composes phénoliques (%)
3.1.4 Extraction des composés phénoliques par le charbon actif
Les résultats précédents ont montré que le charbon actif KB-WJ était l’adsorbant le plus
efficace pour fixer les composés phénoliques. Afin de savoir quels sont les composés phénoliques
ayant le plus d’affinité pour cette phase, un mélange d’étalons phénoliques représentatif des
composés présents dans la bière a été utilisé (Chapitre 1 2.1). Il s’agit de treize composés
phénoliques, à concentrations équimolaires, qui ont été mis en contact avec 10 g/L de KB-WJ
pendant 30 min. Le mélange a ensuite été centrifugé afin de déterminer la quantité résiduelle de
composés phénoliques dans le surnageant, permettant ainsi d’évaluer la quantité de composés
adsorbés par le KB-WJ. La capacité d’adsorption des composés phénoliques, exprimée en
pourcentage, a été obtenue par le rapport entre la teneur en composés phénoliques retrouvée dans
le surnageant et la teneur de départ. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2.2.
57
Tableau 2.2 : Capacité d’adsorption des composés phénoliques par le charbon actif KB-WJ.
Adsorbant Capacité d’adsorption (%)

Acide gallique 100,0 ± 0,0
Acide protocatéchuique 99,3 ± 0,1
Acide p-hydroxybenzoique 99,2 ± 0,1
Catéchine 100,0 ± 0,0
Acide chlorogénique 100,0 ± 0,0
Acide vanillique 99,6 ± 0,0
Acide caféique 100,0 ± 0,0
Epicatéchine 100,0 ± 0,0
Acide p-coumarique 100,0 ± 0,0
Acide férulique 99,8 ± 0,2
Acide sinapique 100,0 ± 0,0
Acide m-coumarique 99,9 ± 0,1
Acide o-coumarique 100,0 ± 0,0
Parmi les composés phénoliques testés, les acides gallique, chlorogénique, caféique, p-
coumarique, sinapique, o-coumarique, la catéchine et l’épicatéchine sont adsorbés à 100% sur le
charbon actif KB-WJ. Les résultats sont légèrement inférieurs avec les acides protocatéchuique, p-
hydroxybenzoique, vanillique, férulique et m-coumarique avec une capacité d’adsorption sur le KB-
WJ, respectivement, de 99,3%, 99,2%, 99,6%, 99,8% et 99,9%. Des facteurs comme la structure
chimique, la solubilité et la taille des molécules jouent un rôle important dans la capacité
d’adsorption des composés phénoliques par le charbon actif115. En particulier, il a été montré que le
rôle de la solubilité était prépondérante dans l’adsorption des acides gallique, syringique et p-
hydroxybenzoïque sur un charbon actif, les composés les plus solubles dans l’eau étant, moins
adsorbés116. Par ailleurs, le mélange et l’adsorption combinée de différents composés semblent
améliorer l’adsorption de certains d’entre eux, par rapport aux adsorptions séparées116. Ceci
pourrait avoir contribué à l’excellente performance du charbon actif KB-WJ qui apparaît donc être un
très bon adsorbant pour les composés phénoliques de la bière. Finalement, le KB-WJ a montré la
plus grande efficacité d’adsorption des composants du moût responsables de sa couleur
caractéristique, et qui sont essentiellement constitués de composés phénoliques. La décoloration
de la bière par le KB-WJ aura donc nécessairement un impact sur ces derniers qu’il va falloir
déterminer. Par ailleurs, le KB-WJ pourrait être très efficace pour l’extraction des composés
phénoliques d’un point de vue analytique.
58
3.2 Fermentation du moût décoloré
Afin d’évaluer l’impact éventuel du procédé de décoloration sur la fermentescibilité du moût,

des essais de fermentation ont été conduits sur un moût décoloré à environ 90% au charbon actif
KB-WJ (Figure 2.4). Le pH du moût décoloré (pH=4,29) étant plus faible que celui d’un moût non
décoloré (pH=5,04), un essai a également été réalisé avec un moût décoloré dont le pH a été ajusté à
5,04.
Figure 2.4 : Moûts décoloré (10%) et non décoloré (100%) avant et après fermentation.
Les premiers essais de fermentation dans un volume de 2 litres ont montré qu’il était possible
de fermenter un moût décoloré, mais des essais de dégustation effectués aux Brasseries
Kronenbourg, notant principalement l’intensité globale de la bière, le sucré, l’amer ou les faux goûts,
ont révélé que le produit final n’avait pas toutes les propriétés sensorielles caractéristiques de la
bière (Figure 2.4). La bière issue du moût décoloré au pH ajusté avait toutefois un goût moins acide.
Une fermentation à une échelle de production plus grande (un volume de 20 litres) a permis
de confirmer ces résultats. Par ailleurs, pendant cette fermentation, divers paramètres ont été suivis
59
dont la densité (Figure 2.5a), la population de levures (Figure 2.5b), le pourcentage (v/v) d’alcool
produit (Figure 2.5c) et les deux précurseurs d’arômes diacétyle (2,3-butanedione)117 et 2,3-
pentanedione, responsables du faux-goût «beurre rance» de la bière et donc non désirables (Figure
2.5d). La fermentation est considérée comme terminée, une fois que la diminution de la densité ne
dépasse plus 0,1°Plato par 24 h, toutefois la température de fermentation est maintenue tant que
les taux du diacétyle et du 2,3-pentanedione sont supérieurs à 200 ppb, seuil de détection par
l’homme.
Figure 2.5 : Paramètres suivis au cours de la fermentation de moûts décoloré, décoloré au pH ajusté
et témoin non décoloré : (a), densité du moût ; (b), population de levures « non déposées » ; (c),
pourcentage d’alcool ; (d), quantité de diacétyle et de 2,3-pentanedione.
Au cours de la fermentation, la densité des trois moûts étudiés diminue à la même vitesse
pour atteindre une valeur d’environ 13% à 65 heures et une valeur finale (densité limite) de 8,26%
pour les moûts décolorés et de 11,19% pour le moût non décoloré (Figure 2.5a). Cette densité
limite, ou limite de fermentation, correspond au pourcentage de sucres non-fermentescibles et donc
encore présents dans le moût à la fin de la fermentation. Le pourcentage (v/v) d’alcool, dont
l’évolution est inversement proportionnelle à la densité du moût, atteint 4,5% pour le moût non
60
décoloré et environ 4,25% d’alcool pour les moûts décolorés à 65 h de fermentation, puis 4,5% pour
les trois moûts à la fin de la fermentation (Figure 2.5c).
Les populations de levures « non déposées » correspondent aux cellules en suspension,

prélevées à mi-hauteur du fermenteur, celui-ci n’étant pas sous agitation, celles qui floculent et
sédimentent dans le fond ne sont pas comptabilisés. Les populations se développent et évoluent de
façon identique au cours de la fermentation des différents moûts (Figure 2.5b). Au cours des
quarante premières heures de la fermentation, les levures entrent en période de croissance
exponentielle pour atteindre, à 40 h, un pic d’environ 38 millions de cellules/mL pour les moûts
décolorés et de 47 millions de cellules/mL pour le moût non décoloré. Puis, les levures entrent en
phase stationnaire, mais les populations de levures diminuent aussitôt pour les trois moûts jusqu’à
atteindre, en fin de fermentation, 2 à 4 millions de cellules/mL, en raison de la tendance des cellules
de levure à floculer et sédimenter en absence d’agitation.
Les courbes correspondant au diacétyle et au 2,3-pentanedione représentent la somme des

concentrations de ces deux composés qui évoluent de façon identique au cours de la fermentation
des différents moûts (Figure 2.5d). Toutefois, la concentration de diacétyle et de 2,3-pentanedione à
40 h est plus faible pour le moût décoloré (1 132 ppb) que pour le moût non décoloré (2 898 ppb). Le
pH semble jouer un rôle important dans cette différence, puisque quand celui du moût décoloré
(pH=4,29) est ajusté au pH du moût avant décoloration (pH=5,04), la quantité de diacétyle et de 2,3-
pentanedione produite est nettement plus élevée (2 263 ppb). La production de ces deux composés
est donc plus faible lorsque le pH du moût est bas et le seuil de détection de 200 ppb est franchi plus
rapidement (dès 70 h par rapport à 90 h). Pour les trois moûts étudiés néanmoins, les taux
continuent de diminuer au delà de 96 h, pour atteindre 20 ppb après 200 h de fermentation.
Finalement, l’impact de la décoloration du moût sur le déroulement de la fermentation

semble être très faible, dans la mesure où le léger ralentissement de la croissance de la population
de levures ne se ressent pas sur la densité finale et le taux d’alcool de la bière. D’un autre côté,
l’effet positif consistant en une plus faible production des précurseurs de diacétyle et 2,3-
pentanedione se résorbe assez rapidement. Si l’on considère le fait, que la fermentation est
typiquement arrêtée au bout d’une dizaine de jours (plus de 200 h), les effets observés n’auraient
pas de réel impact sur la qualité du produit final.
61
3.3 Décoloration de la bière
Les paramètres optimaux de la décoloration, déterminés en utilisant le moût, à savoir le

charbon actif KB-WJ à 10 g/L pendant 30 min, ont été appliqués à la bière (moût fermenté et filtré).
La décoloration appliquée à la bière permet de ne pas influencer le déroulement de la fermentation
et de ne pas avoir d’impact sur les métabolites de la bière au cours de la fermentation. Une étude
comparative entre le moût et la bière, permettrait d’évaluer l’effet de l’étape de fermentation sur
l’efficacité de la décoloration, mais aussi sur ses répercussions sur les constituants du moût. Les
changements de la composition du moût suite aux activités métaboliques de la levure, pourront par
ailleurs aider à expliquer les éventuelles différences.
3.4 Effet de la décoloration sur les propriétés physico-chimiques du moût

et de la bière
Après avoir décrit les changements de paramètres grossiers caractéristiques du moût ou de la

bière (couleur, alcool, densité, levures, …) suite à la décoloration, nous pouvons maintenant
examiner ces changements de manière plus détaillée au niveau physico-chimique.
En ce qui concerne les acides aminés, les résultats de l’analyse quantitative des acides aminés
après la décoloration montrent très peu de changements sauf pour la méthionine, la tyrosine et la
phénylalanine dont les concentrations respectives ne sont plus que de 81%, 64% et 64% suite à la
décoloration du moût (Tableau 2.3). L’analyse des acides aminés de la bière avant et après
décoloration montre des différences similaires à celle du moût, notamment pour la méthionine
(35%), la tyrosine (80%) et la phénylalanine (78%) (Tableau 2.3).
La méthionine a comme particularité la présence d’une chaine latérale avec un groupement

sulfhydrile, la tyrosine et la phénylalanine sont des acides aminés aromatiques (la tyrosine est de
nature phénolique)118, ces différences pourraient expliquer la forte adsorption des ces trois
composés sur le charbon actif contrairement aux autres acides aminés.
Il apparaît toutefois que l’impact de la décoloration sur la composition en acides aminés de la

bière est moins important lorsque ce procédé est appliqué au produit fini que lorsqu’il est appliqué
au moût. En effet, la teneur totale en acides aminés est plus élevée pour la bière décolorée (95%)
que pour la bière issue du moût décoloré (58%) proportionnellement à leurs témoins respectifs.
62
Tableau 2.3 : Effet de la décoloration du moût et de la bière sur la teneur pour 15 acides aminés
exprimée en pourcentage de la teneur initiale dans le produit avant décoloration. Les résultats pour
le moût décoloré puis fermenté sont également montrés.
Moût décoloré
Acides aminés Groupe Moût décoloré Bière décolorée
fermenté
Acide Aspartique I 92 64 96
Acide Glutamique I 99 56 97
Sérine I 100 93 105
Histidine II 100 15 94
Glycine III 98 43 104
Thréonine I 107 70 114
Arginine I 93 82 104
Alanine III 98 80 105
Tyrosine III 64 130 80
Méthionine II 81 11 35
Valine II 100 44 104
Phénylalanine III 64 48 78
Isoleucine II 95 79 103
Leucine II 98 27 105
Lysine I 102 31 103
Gras, changements suite à la décoloration.
les acides aminés peuvent être classés en trois groupes selon leur ordre d’assimilation dans le
moût119 (Tableaux 2.3) : l’assimilation des acides aminés du groupe I est immédiate et complète au
bout 20 heures de fermentation, celle des acides aminés du groupe II est plus graduelle, alors que
dans le groupe III, les acides aminés commencent à être assimilés à la fin de l’ assimilation de ceux
du groupe I.
Après la fermentation, il y a une diminution globale de la teneur en acides aminés liée à leur
consommation par la levure. Cependant cette diminution est encore plus importante pour l’histidine
(85%), la glycine (57%), la méthionine (89%), la valine (56%), la phénylalanine (52%), la leucine (73%)
et la lysine (69%) dont les teneurs dans le moût décoloré fermenté sont inférieures à 50% de celle de
la bière témoin (Tableau 2.3). Saccharomyces cerevisiae est capable de synthétiser des acides
aminés nécessaires à sa croissance, à partir des sources d’azote présentes dans le milieu et, en
absence de ces composés, elle puise directement les acides aminés disponibles dans le moût33, ce
qui pourrait expliquer la diminution des teneurs de certains acides aminés suite à la fermentation du
moût décoloré.
Plusieurs autres paramètres ont également été suivis afin d’évaluer les répercussions de
l’étape de la décoloration sur les constituants du moût et de la bière. Comme nous avons pu le voir
précédemment, la couleur, les composés phénoliques totaux, le pH et la densité limite sont à des
63
niveaux faibles dans le moût décoloré. La bière qui en est issue et la bière décolorée présente des
résultats similaires (Tableau 2.4).
Tableau 2.4 : Effet de la décoloration du moût et de la bière sur les teneurs en différents
constituants exprimées en pourcentage des teneurs initiales dans le produit avant décoloration. Les
résultats pour le moût décoloré puis fermenté sont également montrés.
Moût décoloré
Composés Moût décoloré Bière décolorée
fermenté
Somme Sucres Fermentescibles 107 93 100
Fer 814 200 1600
Cuivre 82 100 43
Calcium 115 115 102
Magnésium 100 102 101
Potassium 102 105 101
Sodium 107 107 107
Zinc 150 100 250
Couleur 7 6 5
Composés Phénoliques Totaux 12 18 7
Azote Aminé libre 90 68 87
Ph 85 90 93
Densité limite 57 - -
-Glucanes Solubles 30 - -
Diacétyle - 48 102
2,3-pentanedione - 67 80
Acétaldéhyde - 46 126
Somme Alcools Totaux - 116 87
Volume d’alcool - 98 100
Gras, changements suite à la décoloration; -, non analysé.
La concentration en fer est élevée dans les trois produits décolorés (le moût, le moût
fermenté et la bière), ce qui est sans doute dû à un relargage du fer contenu dans le charbon actif
(Tableau 2.4). Des teneurs élevées en fer ne sont toutefois pas souhaitées dans la production de la
bière car ceci risque de favoriser des réactions d’oxydations. La teneur en azote aminé libre est
affectée à la fois par la décoloration, que ce soit du moût ou de la bière, et par la fermentation,
puisqu’elle diminue dans le moût décoloré suite à sa fermentation (Tableau 2.4). Ces diminutions
seraient dues à la perte de sources azotées, essentiellement des acides aminés, suite à leur
adsorption par le charbon actif, ainsi qu’à leur utilisation par les levures (Tableau 2.3). En ce qui
concerne les β-glucanes, fibres solubles présentes dans l’orge, leur concentration est plus faible dans
le moût décoloré (30%) que dans le moût témoin (Tableau 2.4). Ces molécules de structure
64
(1,3)(1,4)-β-D-glucanes sont connues pour provoquer, à des concentrations élevées, un trouble et
des problèmes de filtration120. A ce titre, la décoloration au charbon actif aurait un effet bénéfique
sur le moût en améliorant sa qualité technologique.
Les quantités de diacétyle et de 2,3-pentanedione, composés responsables du faux-goût

«beurre rance» de la bière et donc non désirables, sont, comme nous avons pu le voir
précédemment, faibles dans le moût décoloré fermenté (48% et 67%) (Tableau 2.4). La production
et l’utilisation du diacétyle et du 2,3-pentanedione sont étroitement liées à l’évolution du
métabolisme des acides aminés au cours de la fermentation. Ainsi, la production de diacétyle est-
elle par exemple liée à celle de la valine. Au début de la fermentation, la levure utilise les acides
aminés du groupe I et synthétise de la valine, acide aminé du groupe II, ainsi qu’un intermédiaire de
sa voie de synthèse, l’α-acétolactate qui est alors excrété de la cellule et décarboxylé pour former le
diacétyle121,122 (Figure 2.6). Quand la levure débute l’assimilation des acides aminés du groupe II, la
valine inhibe sa propre synthèse et la production de l’α-acétolactate cesse118. En fin de fermentation,
le diacétyle est réabsorbé par la levure et réduit en acétoine, composé sans propriétés
organoleptiques. Une voie similaire est impliquée dans la production de 2,3-pentanedione ; le
précurseur est l’ α-acétohydroxybutyrate, et l'acide aminé en concurrence est la leucine.
Figure 2.6 : Voie de formation du diacétyle dans une cellule de levure122.
65
L’utilisation importante de la valine par la levure au cours de la fermentation du moût
décoloré (Tableau 2.3) permettrait d’inhiber les voies de synthèse de la valine et de l’α-acétolactate
et donc de limiter la synthèse du diacétyle. Cela aurait comme conséquence de réduire l’apparition
du faux-goût liée à cette synthèse. Le processus de décoloration ne semble pas avoir d’effet sur la
teneur en diacétyle une fois celui-ci produit, comme cela est montré par la valeur inchangée dans la
bière décolorée par rapport à une bière témoin. Toutefois, il semble avoir un effet sur la teneur en
pentanedione, puisque sa concentration diminue de 20% après la décoloration de la bière.
Cependant cet effet ne semble pas être dû à l’adsorption de la leucine par le charbon actif (Tableau
2.3).
Visiblement, la décoloration du moût au charbon actif résulte en une bière avec une teneur en
acétaldéhyde 54% plus faible (Tableau 2.4). L’acétaldéhyde est en effet un intermédiaire de la
fermentation alcoolique produit par décarboxylation enzymatique du pyruvate et qui est, à son tour,
réduit en éthanol via l’alcool déshydrogénase (Figure 2.6). La faible teneur en acétaldéhyde dans la
bière issue du moût décoloré ne peut pas s’expliquer par une fermentation plus efficace qui
résulterait en une stabilisation plus rapide, car comme nous avons pu le voir dans la Figure 2.5a, la
fermentation des moûts, décoloré et non décoloré, évolue à la même vitesse et aboutit à des taux
d’alcool équivalents. Par conséquent, une quantité suffisante d’acétaldéhyde, nécessaire à la
production d’alcool, doit être générée au cours de la fermentation. En revanche, comme l’autre voie
de synthèse nécessitant l’acétaldéhyde, celle de la valine et du diacétyle, est plus ou moins inhibée
par une utilisation plus importante de la valine par la levure dans la bière issue du moût décoloré, la
quantité finale d’acétaldéhyde en serait réduite. Le processus de décoloration ne semble pas avoir
d’effet sur la teneur en acétaldéhyde une fois celui-ci produit, comme cela est montré par la valeur
inchangée dans la bière décolorée par rapport à une bière témoin.
Tous les autres composés analysés dans le moût et les bières ne semblent pas être affecté par
la décoloration (Annexe 1 et 2).
Finalement, il apparaît que, si l’on excepte l’augmentation importante de la quantité de fer

due à l’utilisation du charbon actif, l’effet de la décoloration sur la composition de la bière est
relativement modéré. Il l’est d’autant plus lorsque cette décoloration est appliquée après l’étape de
fermentation du moût. Ainsi, dans le cas des acides aminés, les pertes en teneur totale ne dépassent
pas 5% lors de la décoloration de la bière, comparativement à 42% lors de la décoloration du moût.
66
4 Conclusion
L’objectif de cette partie du travail était de développer une méthode d’extraction des
composés colorés du moût afin de produire une bière incolore par élimination des composés
phénoliques et autres molécules colorées, pouvant servir au développement d’un produit malté
clarifié. Une telle transformation sensorielle devait avoir une conséquence technologique
importante, celle de faciliter l’étape de filtration du moût en réduisant la quantité de composés
phénoliques et de glucanes qui ont une tendance à former des précipités et des troubles, seuls ou en
combinaison. Pour ce faire, divers adsorbants de qualité alimentaire ont été expérimentés. La
décoloration avec du charbon actif KB-WJ à une concentration de 10 g/L avec un temps de contact
de 30 minutes a permis de réaliser une décoloration du moût de près de 90% par rapport au moût
de départ. Les essais de décoloration ont ensuite été réalisés à des échelles plus grandes. Des
volumes de 2 et de 20 L de moût ont été traités et des essais de fermentation ont été menés. Une
étude comparative entre le moût et la bière, a ensuite été réalisée afin d’évaluer, au niveau physico-
chimique, l’influence de la décoloration sur la composition du moût et sur la qualité de la
fermentation. La décoloration du moût a permis d’obtenir une concentration en composés
phénoliques de 12% et en β-glucanes de 30% par rapport au moût de départ et une concentration
en diacétyle et 2,3-pentanedione, dans le produit fermenté, de 48% et 67%, respectivement. La
décoloration du moût permet donc d’obtenir un produit toujours fermentescible, mais amélioré
technologiquement dans la mesure où il présente moins de trouble et donc moins de problèmes liés
à la filtration, et sensoriellement dans la mesure où il est clarifié et où la production des composés
responsables du faux-goût «beurre rance» de la bière y est nettement réduite. Toutefois, cette
décoloration semble avoir plus d’impact sur la composition chimique du produit final, notamment sa
composition totale en acides aminés, en comparaison avec une décoloration qui serait appliquée
après la fermentation, c'est-à-dire à la bière. Dans les deux, l’obtention d’une bière clarifiée et
décolorée offre à l’industriel une plus grande marge d’innovation, notamment lorsqu’il s’agit de
développer des produits ayant des couleurs originales. Il faut noter finalement, qu’au début de
l’année 2009, alors que les résultats de cette étude venaient d’être validés, le charbon actif a été
autorisé en France comme agent de décoloration dans le procédé de fabrication de la bière123.
67
68
Chapitre 3 : Mise au
point d’une
méthode d’analyse
de l’activité
antioxydante
69
1 Introduction
Des études épidémiologiques récentes ont montré une association inverse entre la
consommation de certaines boissons riches en composés phénoliques et le risque de maladies
chroniques, telles que les maladies coronariennes et certains cancers124-127. Ces composés qui font
l'objet d'un intérêt croissant sont présents dans les aliments végétaux tels que les fruits et légumes,
mais aussi dans les céréales, comme l'orge et ses dérivés. Il s’agit notamment des acides phénoliques
(dérivés de l'acide benzoïque et cinnamique), des proanthocyanidines, des tanins, des flavonols, des
chalcones, des flavones et des flavanones23. Les effets observés sont attribués à l’activité
antioxydante de ces molécules qui agissent en piégeant des radicaux libres et en complexant des
pro-oxydants128-130. Ceci confère une protection contre les dommages causés à l’ADN, la
carbonylation des protéines et la peroxydation lipidique qui conduisent à une variété de problèmes
de santé, comme le cancer, le vieillissement, la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer131.
La présence de ces composés phénoliques dans les matrices alimentaires est généralement
mise en évidence en chimie analytique par des méthodes HPLC utilisant une détection par
photométrie d'absorption basée sur la présence de chromophores dans leurs structures. Cette
méthode permet une assez bonne quantification de ces molécules lorsque les étalons analytiques
sont disponibles, toutefois, l’activité antioxydante des composés séparés, et donc leur intérêt
fonctionnel, sont souvent négligés. Or, les études montrent que tous les composés phénoliques ne
présentent pas une activité antioxydante, que certains sont plus actifs que d'autres132. Par ailleurs,
parmi les antioxydants que l’on peut retrouver dans un extrait naturel, seule une fraction
correspond à ces composés connus, le reste des composés biologiquement actifs et responsables
d’une grande partie de l'activité totale n’étant pas encore identifiés133. Cela montre la nécessité
d'une alternative plus pragmatique qui mettrait l'accent sur la détection et la quantification de
l'activité biologique, plutôt que sur celles de la molécule elle-même.
Au cours des dix dernières années, plusieurs études portant sur le développement de
méthodes de chromatographie liquide combinant la détection des molécules séparées et celle de
leur activité antioxydante suite à une réaction post-colonne ont été publiées72,82,134. Plusieurs de ces
méthodes sont basées, pour l’évaluation de l’activité antioxydante, sur la mesure de la réduction
d’un radical libre stable. Un exemple est le radical cation 2,2'-azinobis (acide 3-éthylbenzothiazoline-
6-sulfonique) (ABTS•+), dont l'absorbance à 734 nm diminue en présence d’un agent réducteur82,135.
Ceci est associé à la capacité de la molécule d'intérêt à piéger les radicaux et donc à son activité
biologique. L'activité de piégeage de radicaux est généralement évaluée contre un antioxydant
70
standard, tel que le dérivé synthétique de la vitamine E, soluble dans l'eau, l’acide 6-hydroxy-2,5,7,8-
tétraméthylchroman-2-carboxylique (Trolox)87,89. Cette évaluation en ligne de l'activité antioxydante
permet de séparer des mélanges complexes par HPLC et d’évaluer séparément la contribution
antioxydante de chaque composé89. Elle permet également la mise en évidence de nouvelles
molécules ayant des activités antioxydantes mais dont les étalons ne sont pas disponibles ou qui ne
répondraient aux longueurs d’ondes de détection photométrique utilisées.
L’objectif de ce travail est d’évaluer directement l’activité antioxydante des différents

composés phénoliques, éléments majeurs de la couleur de la bière. Pour cela un système HPLC
couplé à un système post-colonne de détection de l’activité antioxydante (LC-AOx) a été mis au
point. Une étude comparative avec une analyse biologique de l‘activité antioxydante a ensuite été
réalisée afin d’évaluer la méthode LC-AOx.
71
2.1 Réactifs et produits chimiques
L’acide 2,2’-azinobis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS•+), l’acide 6-hydroxy-2,5,7,8-

tétraméthylchroman-2-carboxylique (Trolox), l’acide 4-hydroxy-3-méthoxycinnamique (acide
férulique), l’acide 3,4-dihydroxycinnamique (acide caféique), l’acide 3,4,5-trihydroxybenzoique
(acide gallique), l’acide 4-hydroxy-3-méthoxybenzoique (acide vanillique), l’acide 3,4-
dihydroxybenzoique (acide protocatéchuique), l’acide p-hydroxybenzoique, l’acide chlorogénique,
l’acide 4-hydroxycinnamique (acide p-coumarique), l’acide sinapique, l’acide m-coumarique, l’acide
o-coumarique, la catéchine, l’épicatéchine, l’épigallocatéchine gallate (EGCG) et l’acide ascorbique
(vitamine C) sont de qualité HPLC et ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne). La
procyanidine B2 a été acheté chez Extrasynthèse (Genay, France). L’éthanol, le méthanol et l’acétate
d’éthyle, de qualité HPLC, le chlorure de sodium, l’acide chlorhydrique (HCl 37%) et le persulfate de
potassium ont été achetés chez VWR (Strasbourg, France). L’eau ultrapure est produite au
laboratoire par un système de purification Synergy UV (Millipore, Molsheim, France).
2.2 Solutions stock
Une solution stock d’ABTS•+ stable est préparée en mélangeant une solution aqueuse d’ABTS
et une solution de persulfate de potassium de concentration finale respective de 7 mmol/L et 2,5
mmol/L (une nuit, à l’obscurité et à 4°C)82,134. Avant son utilisation, la solution stock d’ABTS•+ est
diluée dans l’éthanol ou le tampon PBS (Phosphate-buffered saline, 8mM à pH 7,4)136 pour atteindre
une absorbance de 0,70 (± 0,02) AU à 734 nm. Les solutions stock d’étalons de composés
phénoliques sont préparées par dissolution des composés dans le méthanol (1 mg/mL) et sont
ensuite stockées à l’obscurité à -20°C. Avant utilisation, les solutions stock sont diluées dans un
mélange méthanol/eau (50/50, v/v).
72
2.3 Analyse chromatographique de l’activité antioxydante
2.3.1 Extraction des composés phénoliques
Les échantillons (10 mL) sont d’abord acidifiés à pH 2,0 par ajout de HCl (37%), puis 0,5 g de
chlorure de sodium sont ajoutés. Trois extractions successives sont ensuite réalisées dans des tubes
de centrifugation en polypropylène Corning® (New York, USA) de 50 mL avec 10 mL d'acétate
d'éthyle sur un agitateur giratoire à 200 tr/min66,86 pendant 15 min. Après centrifugation des
mélanges (2500 g, 10 min), les surnageants sont groupés et évaporés à sec sous vide (30°C, 80
mbar). Le résidu obtenu est dissous dans 1 mL de méthanol/eau (50/50, v/v), filtré sur membrane
(0,45 µm, Macherey-Nagel, Hoerdt, France) et injecté (20 µL) dans le système chromatographique.
2.3.2 Séparation chromatographique et identification des composés antioxydants
L’analyse utilisant l’ABTS a été effectuée en utilisant la méthode développée par Koleva al.82,
Dapkevicius et al.134 et Re et al.136. Le système HPLC (Waters, Saint-Quentin-Fallavier, France) utilisé
est constitué d’un contrôleur 600S, d’une pompe 616, d’un injecteur automatique 717 Plus, d’un
détecteur UV-visible à photodiode 2996, d’un détecteur UV-visible 486 pour la détection de l'ABTS•+,
et d’une pompe HPLC supplémentaire utilisée pour la distribution de la solution d'ABTS•+. Après
mélange de cette dernière avec la phase mobile sortant de la colonne, la réaction a lieu pendant 1
min, le temps nécessaire pour parcourir un tube en PEEK de 7 m de long et 0,5 mm de diamètre. Les
séparations sont réalisées à température ambiante sur une colonne de chromatographie C18
hypersil BDS (5 µm, 250 x 4,6 mm, ThermoScientific, Gometz le Châtel, France). La phase mobile,
délivrée à 1 mL/min, consiste en un mélange d’eau à 0,1% (v/v) d'acide formique (éluant A) et de
méthanol (éluant B) selon le gradient suivant : 0-25 min, 3-25% de B; 25-26 min, 25-18% de B; 26-29
min, 18% de B; 29-47 min, 18-30% de B; 47-57 min 30% de B; 57-67 min, 30-65% de B; 67-77 min,
65% de B. La solution d’ABTS•+ est délivrée à 0,5 mL/min. La détection des composés séparés est
réalisée à 254 nm, alors que celle de l'ABTS•+ réduit l’est à 412 nm.
2.3.3 Limites de quantification
Les limites de quantification sont estimées par dilutions successives des étalons, et en
considérant un rapport signal/bruit de 10. La précision et la justesse de la méthode sont
déterminées sur la base du coefficient de variation et du recouvrement (concentration trouvée /
73
concentration attendue) calculés à partir de trois injections successives. Les limites de quantification
sont acceptables si le coefficient de variation est inférieur à 10% et si le recouvrement est d'environ
100±5%.
2.4 Analyse biologique de l’activité antioxydante
2.4.1 Lignée cellulaire
Les cellules cancéreuses de l’insulinôme de rat, RINm5F (ATCC, American Type Culture
Collection, Manassas, USA) sont issues d’un clone de cellules β RIN-m qui produisent et sécrètent de
l’insuline. Les cellules sont cultivées en milieu RPMI-1640 (Sigma, St Louis, USA) supplémenté de 10%
de sérum de veau fœtal (Sigma) et de 1% de solution antibiotique-antimycotique (ABAM, Gibco®,
Invitrogen, Grand Island, USA) comprenant 10 000 U/mL de pénicilline G associée à 10 mg/mL de
streptomycine et 25 µg/mL d’amphotéricine B. Les cellules sont incubées à 37°C sous atmosphère
enrichie à 5% en CO2. Lorsque les cellules sont en phase de pré-confluence (80% de confluence),
elles sont trypsinées à l’aide de trypsine EDTA à 0,05% (Sigma). Le milieu est changé toutes les 48
heures.
2.4.2 Effet des antioxydants sur la viabilité des cellules bêta pancréatiques
Le screening des composés antioxydants a été réalisé par l’équipe du Centre Européen
d’Etude du Diabète (CEED), à l’aide d’un test de cytotoxicité mesurant la viabilité cellulaire (CellTiter
96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega Corporation, Madison, USA). Il s’agit
d’une méthode colorimétrique basée sur la réduction du composé tétrazolium [3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium], appelé MTS,
en un produit coloré, le formazan. La réaction est permise grâce à des enzymes de la famille des
déshydrogénases présentes dans les cellules métaboliquement actives. La quantité de formazan
produite est proportionnelle à l’activité cellulaire et peut être extrapolée à la prolifération cellulaire.
Des cellules RINm5F sont pour cela ensemencées dans des micro-plaques 96 puits traitées (BD
Falcon™, Franklin Lakes, USA) à raison de 30 000 cellules par puits dans un volume de 200 µL de
milieu de culture supplémenté et incubées pendant 48 heures avant le test.
Dans un premier temps, les composés antioxydants sont testés seuls pendant une heure à
différentes concentrations (1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 et 500 µg/mL). Dans un second
74
temps, les tests sont réalisés avec une pré-incubation des cellules RINm5F en présence des
composés antioxydants à ces mêmes concentrations pendant une heure, puis une molécule
générant un stress oxydant, le peroxyde d’hydrogène (H2O2), est ajoutée à une concentration de 40
µmol/L. La durée d’incubation est de 30 minutes. Le H2O2 est préparé extemporanément à partir
d’une solution commerciale à 33% (Sigma) diluée dans du milieu de culture.
Après le traitement, les puits sont rincés à l’aide de PBS (Gibco®, Invitrogen), puis 100 µL de
milieu de culture supplémenté et 20 µL de MTS sont ajoutés. Les plaques de culture sont incubées 2
heures à 37°C en atmosphère enrichie à 5% en CO2, et l’absorbance est mesurée à 490 nm sur un
lecteur de micro-plaque 96 puits Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwan). Les résultats sont
exprimés en pourcentage de viabilité par rapport au témoin négatif qui correspond à des cellules
sans traitement.
2.5 Analyses statistiques

Les données sont analysées par le test ANOVA (au seuil de signification de 95%) à l'aide du
logiciel Statgraphics Plus. Trois analyses sont effectuées par échantillon.
75
3.1 Analyse chromatographique de l’activité antioxydante
Etant donnée la richesse du moût et de la bière en composés phénoliques, la méthode

d’extraction liquide-liquide à l’acétate d’éthyle a été mise au point sur un ensemble de composés
sélectionnés afin de se rapprocher au plus près des conditions réelles. La précision de cette méthode
a été déterminée d’après les quantités de composés phénoliques issues de trois extractions
consécutives. Le Tableau 3.1 donne les valeurs moyennes et les déviations standards des quantités
extraites de composés phénoliques suite à plusieurs répétitions (n ≥ 3). Trois extractions successives
aboutissent à un taux de recouvrement d’au moins 73±5% des composés phénoliques, sauf pour les
acides protocatéchuique, chlorogénique et l’épicatéchine qui ne sont pas extraits à plus de 64±9%,
51±6% et 49±10%, respectivement (Tableau 3.1).
Tableau 3.1 : Taux de recouvrement moyen des composés phénoliques étudiés dans le moût (trois
déterminations de trois extractions à l’acétate d’éthyle).
Composés phénoliques Taux de recouvrement (%)

Acide gallique 93 ± 16
Acide protocatéchuique 64 ± 9
Acide p-hydroxybenzoïque 83 ± 10
Catéchine 75 ± 5
Acide chlorogénique 51 ± 6
Acide vanillique 94 ± 7
Acide caféique 73 ± 5
Epicatéchine 49 ± 10
Acide p-coumarique 73 ± 10
Acide férulique 87 ± 5
Acide sinapique 79 ± 16
Acide m-coumarique 125 ± 6
Acide o-coumarique 88 ± 9
Si l’on exclut ces derniers, l'extraction liquide-liquide à l'acétate d'éthyle donne de bons
résultats pour un procédé d'extraction multi-composés. Aujourd'hui, cette méthode, bien que
classique, reste la méthode la plus largement utilisée pour l'extraction des composés
phénoliques54,65,66,137, alors que d’autres composés pourraient être extraits par cette méthode. Il a
été admis que les composés extraits à l’acétate d’éthyle représentaient principalement les composés
76
phénoliques d’une matrice. D’autres méthodes, telles que l’extraction en phase solide, sont utilisées
pour l’extraction des composés phénoliques. Ainsi, Del Alamo et al. ont démontré que l’utilisation de
cartouches C18 greffées avec des groupements hydroxyles permettait d’obtenir un taux de
recouvrement d’au moins 88% d’un mélange concentré d’étalons de composés phénoliques, alors
que dans le vin rouge les mêmes composés ne sont que partiellement retenus138. Bien que nous
ayons appliqué cette méthode à nos composés, dans les concentrations proches de celle que l’on
retrouverait dans le moût, les résultats ont été moins satisfaisants que ceux obtenus avec
l’extraction liquide-liquide lorsque l'on considère l'ensemble des composés. Par ailleurs, nous avons
vu dans le chapitre précédent que le charbon actif était un très bon adsorbant pour les composés
phénoliques. Cependant, Soto et al. ont démontré que la désorption sélective de ces composés du
charbon actif était difficile et que l’utilisation de l’éthanol n'était pas appropriée139. Nous avons
également mené des essais de désorption de ces composés du charbon actif avec des solvants tels
que le méthanol et l’acétate d’éthyle, mais les résultats n’ont pas été satisfaisants.
3.1.2 Séparation chromatographique et identification des composés antioxydants
Les méthodes classiques pour identifier des composés antioxydants dans des mélanges
complexes impliquent généralement de longues étapes de fractionnement bio-guidé, suivies de
l'identification des composés purifiés. Le système utilisé ici est destiné à détecter les composés
ayant une activité antioxydante dans les extraits naturels d'une façon plus directe et plus rapide.
Après séparation par HPLC en phase inverse avec un gradient linéaire eau/méthanol, les composés
passent par un détecteur UV-visible pour l’identification à 254 nm (détection UV), puis sont dirigés
vers un détecteur UV-visible supplémentaire, après avoir réagi en ligne avec une solution du radical
ABTS•+ (détection AOx) (Figure 3.1a). Ce détecteur supplémentaire permet de détecter la forme
réduite de ce radical à 412 nm et donc la présence de composés ayant une activité antioxydante. La
longueur d’onde choisie correspond au maximum d’absorption du radical ABTS•+, toutefois certains
auteurs préfèrent détecter le radical ABTS•+ à 734 nm à cause d’interférences chromatographiques87,
problème que nous n’avons pas rencontré. La combinaison d'une boucle de réaction de 7 m de long
et de 0,5 mm de diamètre interne avec un débit de 0,5 mL/min donne un temps de réaction
d'environ 1 min ce qui explique les temps de rétention plus longs et l’obtention de pics plus larges
dans le chromatogramme inférieur. Cependant, ce temps de réaction de 1 min est nécessaire, dans
ces conditions, pour obtenir une réaction complète de tous les antioxydants86.
77
Figure 3.1 : Séparation et détection chromatographique des composés phénoliques : (a) schéma
expérimental ; (b) étalons de composés phénoliques à 30 µg/mL dans un mélange eau/méthanol
(50/50, v/v) et (c) leur activité antioxydante correspondante. Les pics sont comme suit : 1, acide
gallique ; 2, acide protocatéchuique ; 3, acide p-hydroxybenzoïque ; 4, catéchine ; 5, acide
chlorogénique ; 6, acide vanillique ; 7, acide caféique ; 8, épicatéchine ; 9, acide p-coumarique ; 10,
acide férulique ; 11, acide sinapique ; 12, acide m-coumarique ; 13, acide o-coumarique.
La séparation chromatographique des composés phénoliques présents dans des mélanges

naturels complexes nécessite habituellement un gradient linéaire d'élution. Dans cette étude, la
proportion de méthanol a été diminuée à 25 min, puis augmentée à nouveau à 29 min, afin de
permettre une meilleure séparation des acides vanillique et caféique sans trop allonger le temps
78
d’élution. La méthode a été testée sur un mélange d’étalons de composés phénoliques (30 µg/mL
chacun) (Figure 3.1b).
La limite de quantification déterminée avec la détection UV des composés phénoliques varie

de 2 pmol pour l'acide chlorogénique à 216 pmol pour la catéchine et l’épicatéchine (Tableau 3.2).
Cette valeur élevée pour la catéchine et l’épicatéchine, comparativement à d'autres composés,
pourrait s’expliquer par le fait que 254 nm n'est pas leur longueur d'onde de détection optimale (280
nm), leur coefficient d’extinction est donc plus petit à cette longueur d’onde. La limite de
quantification correspondant à la détection de l’activité antioxydante (AOx) varie de 54 pmol pour
l’épicatéchine à 2575 pmol pour l'acide férulique (Tableau 3.2). Ceci indique que la détection UV est
globalement plus sensible que la détection AOx, à l’exception de l'acide gallique et de l'épicatéchine,
mais la comparaison entre les deux méthodes de détection est difficile puisque les molécules
absorbant le plus à la longueur d'onde sélectionnée ne sont pas les plus antioxydantes et
inversement. Toutefois, lorsque l’intérêt est d’isoler des molécules antioxydantes, la détection AOx
permet de faire abstraction du coefficient d’extinction de la molécule, et de pouvoir ainsi détecter
des molécules antioxydantes absorbants peu ou pas à la longueur d'onde sélectionnée. De telles
molécules pourraient passer inaperçues dans les méthodes classiques de fractionnement bio-guidé.
Tableau 3.2 : Limites de quantification de composés phénoliques dans un mélange eau/méthanol

(50/50, v/v) pour les méthodes de détection UV et AOx.
Limite de quantification (pmol)

Composés phénoliques
Détection UV Détection AOx
Acide gallique 94 59
Acide protocatéchuique 10 779
Acide p-hydroxybenzoïque 29 nAOx
Catéchine 216 103
Acide chlorogénique 2 141
Acide vanillique 15 nAOx
Acide caféique 4 167
Epicatéchine 216 54
Acide p-coumarique 190 nAOx
Acide férulique 7 2575
Acide sinapique 14 268
Acide m-coumarique 98 nAOx
Acide o-coumarique 39 nAOx
nAOx, non antioxydant.
Avec cette méthode, certains composés tels que les acides p-hydroxybenzoïque, vanillique, p-
coumarique, m-coumarique, et o-coumarique n'ont montré aucune activité antioxydante ou cette
79
dernière était trop faible pour être détectée (Figure 3.1b, c). L’activité antioxydante est calculée par
rapport à la concentration de Trolox nécessaire pour produire une activité antioxydante équivalente
et est exprimée en équivalent Trolox (µM). A concentrations équimolaires, les composés
phénoliques testés ont présenté des activités antioxydantes variables, l'acide gallique (340 µM) est
le plus actif. Un classement des composés phénoliques, à concentrations équimolaires (150 µM), en
fonction de leur activité antioxydante a donc été établi (Tableau 3.3). Ce classement est en accord
avec celui de Kim et al. qui, en utilisant également l’ABTS•+, ont montré que l'acide gallique était le
composé testé le plus antioxydant140.
Tableau 3.3 : Classement par la méthode LC-AOx des composés antioxydants à concentrations
équimolaires (150 µM). L’activité antioxydante est exprimée en équivalent Trolox (µM).
Composés phénoliques équivalent Trolox (µM)

Acide gallique 340
Acide caféique 239
Acide chlorogénique 217
Epicatéchine 212
Acide sinapique 199
Catéchine 179
Acide protocatéchuique 67
Acide férulique 11
3.2 Composés phénoliques et stress oxydant
Afin de confirmer les résultats de la méthode chromatographique, le travail s’est poursuivi par
l’application, à l’étude de l’activité antioxydante des composés phénoliques, d’une méthode
biologique basée sur la mesure de l’influence d’un stress oxydant sur la croissance des cellules β du
pancréas, impliquées dans le diabète de type 2. L’effet des composés antioxydants a été testé sur la
viabilité de ces cellules à des concentrations de 1 à 500 µg/mL pendant une heure (Annexe 3). A titre
d’exemple, nous détaillons ici le cas de la catéchine. Malgré des pertes de viabilité entre 0,6 et 23,3%
aux différentes concentrations, aucun des résultats obtenus n’est significatif (p > 0,05) (Tableau 3.4 /
Figure 3.2a). On ne peut donc pas conclure que la catéchine ait un quelconque effet toxique sur les
cellules β.
80
Tableau 3.4 : Effet de la catéchine sur la viabilité des cellules β du pancréas (n=3) en absence et en
présence de H2O2 à 40 µM (n=3).
Concentrations en Viabilité cellulaire (%)

catéchine (µg/mL) Sans H2O2 Avec H2O2
CTL 100 ± 0 100 ± 0
H2O2 - 33,5 ± 6,5
1 99,4 ± 26,8 72,0 ± 21,8
5 114,1 ± 34,5 64,1 ± 8,9
10 90,8 ± 33,4 72,2 ± 11,4
20 78,0 ± 26,2 55,9 ± 10,2
50 81,0 ± 37,5 59,2 ± 10,1
100 79,2 ± 26,0 56,0 ± 9,5
200 76,7 ± 34,3 51,6 ± 10,9
300 81,6 ± 15,9 50,7 ± 10,9
400 80,7 ± 19,2 60,3 ± 13,9
500 82,5 ± 40,8 65,5 ± 7,4
Figure 3.2 : Effet de la catéchine sur la viabilité des cellules β du pancréas (n=3) en absence (a) et en
présence de H2O2 à 40 µM (n=3) (b).
L’effet d’une pré-incubation en présence des composés phénoliques a ensuite été testé sur
des cellules β du pancréas soumises ensuite à un stress oxydant de 30 min provoqué par le peroxyde
d’hydrogène (H2O2) à 40 µM. Ainsi, lorsque les cellules ne sont pas pré-incubées en présence des
composés phénoliques, leur viabilité diminue significativement à 33,5±6,5% lorsqu’elles sont
soumises au H2O2 par rapport au témoin sans traitement (100%) (Tableau 3.4 / Figure 3.2b). En
présence de composés phénoliques, la viabilité cellulaire est nettement améliorée pour tous les
composés par rapport au témoin H2O2 seul (Annexe 3). Dans le cas de la catéchine, la viabilité
81
cellulaire est augmentée à 50,7±10,9% (300 µg/mL) jusqu’à 72,2±11,4% (10 µg/mL). La catéchine a
bien un pouvoir antioxydant limitant la perte de viabilité des cellules β en conditions de stress par
H2O2, cependant, la viabilité cellulaire ne semble pas être dépendante de la concentration de la
molécule.
Douze composés ont ainsi été étudiés séparément afin de déterminer leur impact sur la
viabilité cellulaire en présence et en absence de H2O2 (Annexe 3). Ils ont été classés en fonction de
leur plus faible concentration, limitant significativement, la perte de viabilité cellulaire et traduisant
donc le plus fort pouvoir antioxydant de la molécule (Tableau 3.5). A chaque concentration est
associée la viabilité cellulaire, ainsi que la toxicité de la molécule vis-à-vis des cellules β,
correspondant à la concentration la plus faible induisant une perte de viabilité cellulaire significative.
Tableau 3.5 : Classement des composés antioxydants, du plus fort antioxydant au plus faible, selon
la méthode biologique (n = 3). A chaque concentration est associée la viabilité cellulaire ainsi que la
toxicité de la molécule vis-à-vis des cellules β du pancréas.
Viabilité cellulaire (%)

Concentration Concentration
Composés Témoin H2O2 H2O2 +
antioxydante (µM) toxique (µM)
seul composé
Catéchine 4 33,5 ± 6,5 72,0 ± 21,8 nt
Acide sinapique 5 35,9 ± 2,8 57,8 ± 2,8 892
Procyanidine B2 9 48,3 ± 8,2 61,9 ± 8,9 nt
Vitamine C 28 43,9 ± 6,2 53,9 ± 5,4 568
Epicatéchine 34 35,1 ± 2,9 55,9 ± 8,6 nt
Acide férulique 51 35,4 ± 9,0 51,2 ± 5,1 nt
Acide caféique 56 24,1 ± 16,5 54,5 ± 14,3 555
Trolox 400 12,5 ± 5,7 25,5 ± 2,6 nt
Acide protocatéchuique 649 36,0 ± 10,8 55,5 ± 6,0 nt
EGCG 654 20,1 ± 4,9 35,2 ± 10,6 109
Acide gallique nAOx 29
Acide chlorogénique nAOx nt
nAOx, non antioxydant. nt, non toxique.
En ce qui concerne l’activité antioxydante, les résultats montrent que la catéchine est le
composé présentant la plus forte activité puisqu’elle permet, à 4 µM, d’augmenter la viabilité
cellulaire à 72,0±21,8% alors que l’EGCG présente l’activité antioxydante la plus faible avec une
augmentation de la viabilité cellulaire à partir de 654 µM seulement (Tableau 3.5). Parmi les douze
82
composés testés, deux composés, les acides gallique et chlorogénique, ne sont pas antioxydants vis-
à-vis des cellules β. En ce qui concerne la toxicité, il apparaît que cinq composés induisent une perte
de viabilité cellulaire (Tableau 3.5). Les acides sinapique, caféique et la vitamine C sont toxiques
pour les cellules à partir de 892 µM, 555 µM et 568 µM, respectivement, ce qui ne les empêche pas
d’augmenter la viabilité cellulaire à 57,8±2,8% à 5 µM, à 54,5±14,3% à 56 µM et à 53,9±5,4% à 28
µM, respectivement. Deux autres composés, l’acide gallique et l’EGCG, sont toxiques dès 29 µM et
109 µM, respectivement ; l’acide gallique n’est pas antioxydant alors que l’EGCG montre un effet à
partir de 654 µM (Tableau 3.5). L’acide chlorogénique est le seul composé testé à n’être ni toxique
pour les cellules, ni antioxydant, puisqu’il ne permet pas d’augmenter significativement (p > 0,05) la
viabilité cellulaire (51,9±20,3% à 282 µM) en présence de H2O2 par rapport au témoin H2O2 seul
(34,6±12,5%).
Des études récentes ont montré que des aliments riches en composés phénoliques produisent
des concentrations considérables d’H2O2, responsables des effets pro-oxydants des molécules, au
cours de leur préparation et de leur stockage à température ambiante141. Chedea et al. ont souligné
l’effet pro-oxydant d’un extrait de pépin de raisin en fonction de la concentration et de la durée de
l’étude142. Frankel et al. ont démontré que de fortes concentrations en extrait de thé vert induisaient
une oxydation143. Parmi les principaux composés phénoliques, il y a l’acide caféique dans le café et
l’EGCG dans le thé, qui à des concentrations élevées et sous certaines conditions, sont capables de
produire du peroxyde d’hydrogène144,145.
Les effets pro-oxydants impliquent souvent des réductions de métaux, tels que Fe3+ et Cu2+ en
Fe2+ et Cu+, respectivement146. Zheng et al. ont démontré que les acides hydroxycinnamiques tels
que les acides caféique, chlorogénique et sinapique ont une forte activité pro-oxydante due à la
chélation entre leurs groupements hydroxyle et le Cu2+ 147. La production de H2O2, responsable de
l'activité pro-oxydante et donc de la toxicité de la molécule, pourrait être directement
proportionnelle au nombre total de groupements hydroxyles dans la structure chimique de la
molécule. Ces groupements sont impliqués dans les phénomènes d’oxydation des composés
phénoliques en quinones correspondantes, en présence de dioxygène et d’ions métalliques de
transition148.
Les résultats de notre étude montrent qu’à faibles concentrations, les composés antioxydants
ont un effet positif sur la viabilité des cellules β. Cependant, à fortes concentrations, une perte de
viabilité significative peut être observée pour certaines molécules, telles que les acides sinapique et
caféique et la vitamine C. Ceci va dans le sens des résultats des études précédentes citées et suggère
que tout antioxydant peut devenir pro-oxydant si les doses utilisées sont élevées.
83
Toutefois, d’autres études impliquant l’acide gallique et l’EGCG notamment ont souligné que
de faibles concentrations en antioxydant pouvaient induire un effet pro-oxydant. Ainsi, des
concentrations en EGCG comprises entre 5 et 100 µM peuvent induire une perte de viabilité
cellulaire149,150 et générer la formation de H2O2 dans un milieu de culture RPMI en absence de
cellules151. Yen et al. ont montré que l’acide gallique et la vitamine C, à 4,0 mM, montrent un effet
protecteur vis-à-vis du peroxyde d’hydrogène et à des concentrations de 4 à 240 µM, montrent, au
contraire, une induction de peroxyde d’hydrogène ce qui suggère qu’à faibles concentrations, l’acide
gallique augmente le niveau de peroxyde d’hydrogène dans les cellules induisant ainsi un stress
oxydant152. Nous avons obtenu des résultats similaires avec l’EGCG qui, dès 109 µM, est toxique vis-
à-vis des cellules, alors qu’il montre un effet antioxydant à partir de 654 µM (Tableau 3.5).
Il semblerait donc que de nombreux composés phénoliques possèdent à la fois des propriétés
antioxydantes et pro-oxydantes. Bien que ces propriétés dépendent de la concentration de ces
composés, il est difficile de déterminer dans quel sens évoluent l’un ou l’autre des deux effets, et des
résultats contradictoires sont souvent rapportés. D’autres paramètres interviennent sûrement, tels
que la structure chimique, le test et le substrat utilisés pour déterminer leur activité146. Cette
différence de comportement en fonction du test utilisé est particulièrement visible avec l’acide
chlorogénique, par exemple, qui ne présente ni activité antioxydante, ni activité pro-oxydante avec
notre méthode. Alors que Roche et al. ont démontré des activités antioxydantes pour l’acide
chlorogénique153 et Zheng et al., des activité pro-oxydantes147.
3.3 Comparaison des méthodes chromatographique et biologique
La méthode chromatographique et la méthode biologique de mesure de l’activité

antioxydante ont été appliquées à l’analyse de composés antioxydants à des concentrations
équimolaires (150 µM). L’étude a portée sur douze composés différents qui ont présenté des
activités antioxydantes variables. Les résultats sont exprimés en équivalent Trolox pour la méthode
LC-AOx et pour la méthode biologique, ils sont exprimés en pourcentage de viabilité par rapport au
témoin H2O2 seul (sans traitement) (Tableau 3.6).
84
Tableau 3.6 : Evaluation et comparaison des activités antioxydantes des composés à 150 µM avec les
méthodes chromatographique et biologique (n = 3).
Méthode
Méthode biologique
chromatographique
viabilité cellulaire (%)
Composés antioxydants Equivalent Trolox (µM)
Témoin H2O2 seul H2O2 + composé
Acide gallique 322 ± 46 36,8 ± 2,3 19,4 ± 9,1
Procyanidine B2 279 ± 40 48,3 ± 8,2 67,8 ± 11,7
EGCG 255 ± 36 20,1 ± 4,9 7,6 ± 5,4
Acide caféique 226 ± 32 24,1 ± 16,5 41,0 ± 17,6
Acide chlorogénique 205 ± 29 34,6 ± 12,5 45,7 ± 23,9
Epicatéchine 201 ± 29 35,1 ± 2,9 63,3 ± 5,9
Vitamine C 190 ± 27 43,9 ± 6,2 57,4 ± 4,2
Acide sinapique 188 ± 27 35,9 ± 2,8 72,5 ± 12,5
Catéchine 169 ± 24 33,5 ± 6,5 59,2 ± 10,1
Trolox* 141 ± 20 12,5 ± 5,7 12,7 ± 5,8
Acide protocatéchuique 62 ± 9 36,0 ± 10,8 38,0 ± 7,2
Acide férulique 9±4 35,4 ± 9,0 49,6 ± 6,0
*Test biologique non concluant
A 150 µM, l’acide gallique et l’EGCG sont parmi les composés les plus antioxydants avec la
méthode chromatographique, mais ne présentent aucune activité antioxydante avec la méthode
biologique, au contraire, ils diminuent la viabilité cellulaire par rapport au témoin H2O2 seul (Tableau
3.6). La procyanidine B2 est le deuxième composé le plus antioxydant avec la méthode LC-AOx, mais
ne permet d’augmenter la viabilité cellulaire qu’à 67,8±11,7% par rapport au témoin H2O2 seul
(48,3±8,2%). Les acides caféique et chlorogénique, à 150 µM, présente une activité antioxydante de,
respectivement, 226±32 µM et 205±29 µM équivalent Trolox, mais ne permettent pas d’augmenter
significativement la viabilité cellulaire. L’épicatéchine et la vitamine C ont des activités
significativement équivalentes de respectivement 201±29 µM et 190±27 µM équivalent Trolox (p >
0,05) avec la méthode chromatographique (Tableau 3.6). Ces deux composés permettent une
augmentation importante de la viabilité cellulaire en présence de H2O2 par rapport au témoin H2O2
seul. Les résultats des deux méthodes concernant ces molécules semblent donc relativement
cohérents. Les activités antioxydantes de l’acide sinapique et de la catéchine sont relativement
équivalentes avec chacune des deux méthodes. Les effets de ces deux molécules sont toutefois
faibles avec la méthode chromatographique et parmi les plus fortes avec la méthode biologique. En
ce qui concerne l’acide férulique l’activité antioxydante avec la méthode LC-AOx (9±4 µM équivalent
Trolox) est la plus faible. Une étude précédente a reporté l’utilisation d’un tampon PBS à pH 7,4
comme solvant de dilution du radical ABTS, au lieu de l’éthanol72. Il est apparu que l’utilisation du
85
PBS, avec la méthode LC-AOx, augmentait la réponse antioxydante de l’acide férulique à 148±25 µM
équivalent Trolox. On peut donc estimer que l’acide férulique, qui est parmi les cinq composés les
plus antioxydants avec la méthode biologique, aurait un comportement antioxydant équivalent avec
les deux méthodes. L’acide protocatéchuique est le composé qui répond le moins bien aux deux
méthodes, puisqu’il est le moins antioxydant avec la méthode LC-AOx (exclusion faite de l’acide
férulique) et avec la méthode biologique puisqu’il ne permet pas d’augmenter la viabilité cellulaire
par rapport au témoin H2O2 seul.
La comparaison des activités antioxydantes des différents composés testés montre que les
acides férulique et protocatéchuique, l’épicatéchine et la vitamine C ont une capacité antioxydante
équivalente avec les méthodes chromatographique et biologique. Ces résultats semblent mettre en
évidence une corrélation entre la capacité antioxydante des composés et le niveau de stress oxydatif
des cellules en présence des mêmes composés. Toutefois, d’autres composés tels que l’acide
sinapique et la catéchine montrent des degrés d’activité antioxydante différents et les acides
gallique, caféique et chlorogénique, la procyanidine B2 et l’EGCG réagissent de façons très
différentes avec les méthodes testées. Nous ne pouvons donc pas conclure qu’il existe une
corrélation entre les deux méthodes pour ces composés.
Au vu de ces résultats, l’utilisation d’une méthode chromatographique sur des composés

isolés ne semble pas pouvoir refléter la réalité des activités des composés naturels. D’après Frankel
et al., chaque évaluation de composé antioxydant devrait être menée dans différentes conditions
d'oxydation, en utilisant plusieurs méthodes154. Cependant, l’utilisation de la méthode
chromatographique combinée à la méthode biologique nous a permis de mettre en évidence des
activités antioxydante et pro-oxydante pour un même composé, tel que pour l’acide gallique ou
l’EGCG. Un antioxydant peut être défini comme une substance qui, lorsqu'elle est présente à des
concentrations faibles comparées à celle d'un substrat oxydable, empêche ou retarde de manière
significative une oxydation du substrat ; un pro-oxydant est une substance toxique qui peut causer
des dommages oxydatifs des lipides, des protéines et des acides nucléiques155,156. Toutefois, dans la
pratique des effets pro-oxydants peuvent également être bénéfiques, car, en imposant un faible
degré de stress oxydatif, les niveaux de défenses antioxydants pourraient être élevés, conduisant à
une protection globale157. Dans l’organisme humain, ni les activités antioxydantes, ni les activités
pro-oxydantes des composés phénoliques n’ont encore été clairement établies, probablement en
raison des faibles teneurs retrouvées in vivo après la consommation d’aliments riches en ces
composés156, mais aussi en raison de la complexité du milieu biologique qui ne peut être représenté
par une cellule, et encore moins par une seule réaction. D’un autre côté, il y a la complexité du
86
milieu alimentaire dont les effets et les multiples interactions ne peuvent, eux, être réduits aux
propriétés d’un seul composé. Plutôt que de s’intéresser aux composés purs, la priorité devrait être
portée sur l’ensemble de la matrice alimentaire avec ses composés phénoliques et ses autres
composants qui pourraient moduler le stress oxydatif158,159.
87
4 Conclusion
L’objectif de ce travail était de détecter dans un mélange les composés ayant une activité
antioxydante d'une façon directe et rapide. L’utilisation de la méthode LC-AOx a permis, après
séparation en chromatographie liquide classique, d’identifier les composés grâce à un détecteur UV-
visible, puis un détecteur UV-visible supplémentaire a été utilisé pour mettre en évidence leur
activité antioxydante après réaction avec le radical ABTS•+. Cette méthode de dosage de l’activité
antioxydante permet donc d’identifier les molécules par détection UV et de détecter, en même
temps et directement, leur activité antioxydante afin de pouvoir associer une activité antioxydante à
un composé. Toutefois, la comparaison de cette méthode à une méthode de mesure de l’activité
antioxydante à travers le suivi de la survie de cellules β du pancréas soumises à un stress oxydant a
permis de révéler des effets antioxydants et pro-oxydants pour une même molécule. En effet, à
concentrations équimolaires, certains composés pouvaient montrer une activité antioxydante
importante avec la méthode chromatographique, et peu d’activité, voire des effets toxiques, comme
pour l’acide gallique avec la méthode biologique. Globalement, il semblerait que tout composé
possède à la fois des propriétés antioxydantes et pro-oxydantes qui dépendent de sa concentration
et de sa structure et l’une ou l’autre des propriétés sera révélée en fonction des tests et substrats
utilisés pour déterminer son activité.
Il est évident que la méthode chromatographique de détection de l’activité antioxydante ne

reflète pas la totalité des activités des composés naturels. Cependant, elle permet de détecter et
d’identifier rapidement des composés antioxydants dans des mélanges complexes sans étapes
préalables de purification ou de fractionnement bio-guidé. L’application de cette méthode aux
aliments permettrait d’identifier les composés antioxydants, connus ou non, en une seule
chromatographie. Dans le cas de la bière, cela permettrait non seulement de déterminer ses
composés antioxydants, mais également d’évaluer l’effet du procédé de décoloration sur ces mêmes
composés.
88
Chapitre 4 :
Composés
antioxydants de la
bière
89
1 Introduction
L’orge est l'une des céréales les plus anciennes et les plus cultivées, principalement (80-90%)
destinée à l'alimentation animale et à la production de malt160. L’intérêt santé de l’orge et du malt
est principalement dû à l’activité antioxydante de leurs composés phénoliques, en particulier les
flavonoïdes et les acides hydroxycinnamiques161. Cette activité semble être plus importante dans le
malt que dans l'orge non maltée correspondante54, ce qui suggère que le procédé de maltage, en
particulier les derniers stades de la germination et du touraillage, pourrait avoir une influence sur
l’augmentation de l’activité antioxydante et de la teneur des composés phénoliques disponibles162.
Par ailleurs, les étapes suivantes de fabrication de la bière qui sont de natures thermique et
biochimique telles que le brassage, la cuisson et la fermentation, sont également susceptibles de
transformer les composés phénoliques, espèces hautement instables. Il est donc important de
pouvoir suivre l’évolution des composés phénoliques au cours du procédé de fabrication de la bière
afin de déterminer l’impact du chauffage et de la fermentation sur ces composés et l’activité
antioxydante qui leur est associée.
Les études qui ont été réalisées sur l’orge et le malt tendent toutes à montrer une
augmentation de la teneur en composés phénoliques et de l’activité antioxydante au cours du
maltage, particulièrement durant l’étape de touraillage162. Lorsqu’il s’agit de malt pale, l’activité
antioxydante provient principalement des composés phénoliques de l’orge131,163. Toutefois, dans du
malt brun, une bonne partie de cette activité est issue des produits de la réaction de Maillard163.
D’autres étapes de nature thermique, telles que le procédé de brassage, peuvent aussi augmenter
l’activité antioxydante, comme cela a été montré pour le café164. En plus de l’activité antioxydante
totale, une augmentation de la teneur en composés phénoliques libres par décomplexation
thermique n’est pas à exclure.
L’activité antioxydante est en général étudiée globalement, sans séparation des composés
individuels, et parfois dans des mélanges complexes constitués de composés naturels dans leur
matrice environnante. Comme cela a été dit au chapitre précédent, cette approche présente
l’avantage de prendre en considération la complexité de cette matrice et les interactions qui
peuvent y avoir lieu, et donc de se rapprocher de ce que peut être l’activité antioxydante d’un
aliment. Cependant, d’un point de vue analytique, une telle approche rend l’identification des
composés responsables de l’activité et l’étude d’éventuels changements dûs aux procédés des
tâches particulièrement difficiles.
90
Le recours à la séparation des composés individuels ou encore à une simple réduction de
l’effet de la matrice peut donc s’avérer très utile et permettre des déterminations plus aisées et
parfois plus précises. Ainsi, l’utilisation de la méthode LC-AOx permet de séparer des mélanges
complexes par HPLC et d’évaluer individuellement la contribution des différents antioxydants72,82,134.
Cette méthode qui a déjà été appliquée à l’évaluation de l’activité antioxydante de la bière132,
pourrait être utilisée pour l’étude de l’effet du procédé de fabrication sur cette activité. Par ailleurs,
une simplification de la matrice telle que l’utilisation d’extraits polyphénoliques, et non du moût,
comme support de brassage permettrait une évaluation plus aisée de l'impact du procédé sur
l'activité antioxydante de certains composés phénoliques.
L’objectif de cette partie du travail est donc de déterminer l'effet des diverses étapes du
procédé de fabrication de la bière sur la teneur et l'activité antioxydante des composés phénoliques.
Des extraits à l’acétate d’éthyle d’orge, de malt et de bière à différentes étapes de sa fabrication,
(brassage, cuisson et fermentation) sont analysés par la méthode LC-AOx pour la teneur et l’activité
antioxydante des composés phénoliques qu’ils contiennent. Des extraits de malt ont aussi été
soumis au traitement thermique du brassage afin d'évaluer de manière précise l'effet de celui-ci sur
l'activité antioxydante des composés phénoliques. De la même manière, l’effet sur le profil
antioxydant de la bière du procédé de décoloration développé au cours de ce travail a également été
étudié en comparant des extraits de bière témoin et de bière décolorée au charbon actif KB-WJ.
Pour finir, la bière décolorée a été recolorée en utilisant des colorants naturels dans l’objectif de
valoriser le produit pour l’industrie brassicole.
91
2.1 Réactifs, produits chimiques et matériel végétal
L’acide 2,2’-azinobis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS•+), l’acide 6-hydroxy-

2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique (Trolox), l’acide 4-hydroxy-3-méthoxycinnamique (acide
férulique), l’acide 3,4-dihydroxycinnamique (acide caféique), l’acide 4-hydroxy-3-méthoxybenzoique
(acide vanillique), l’acide 3,4-dihydroxybenzoique (acide protocatéchuique), l’acide p-
hydroxybenzoique, l’acide chlorogénique, l’acide 4-hydroxycinnamique (acide p-coumarique), l’acide
sinapique, la catéchine et l’épicatéchine, de qualités HPLC, le kieselguhr et le charbon actif DARCO
KB-WJ ont été acheté chez Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne). L’acide carminique (E120), le
rouge de betterave (E162), les anthocyanes de chou rouge (E163), la chlorophylle (E140) et le
lycopène (E160) on été achetés chez Nactis-Sofral (Strasbourg, France). Le méthanol, l’éthanol,
l’acétonitrile de qualités HPLC, le persulfate de potassium, l’acétate d’ammonium, le chlorure de
potassium (KCl), le chlorure de sodium (NaCl) et l’acide chlorhydrique (HCl) ont été achetés chez
VWR (Strasbourg, France). L’eau ultrapure est produite au laboratoire par un système de purification
Synergy UV (Millipore, Molsheim, France). L’orge (Hordeum vulgare) malté, de variété Sunshine,
provient de la micromalterie des Brasseries Kronenbourg (Strasbourg, France) où il a été brassé, puis
fermenté. Le houblon a été acheté chez Yakima Chief, Inc (Suunyside WA, Etats-Unis) sous la forme
d’une résine riche en acides α et β et huiles, produite par extraction supercritique au CO2.
2.2 Solutions stock
Les solutions stock d’ABTS•+ et des différents étalons de composés phénoliques sont préparées
selon la méthode décrite dans le chapitre 3. Une solution stock d’ABTS•+ stable est préparée en
mélangeant une solution aqueuse d’ABTS et une solution de persulfate de potassium de
concentration finale respective de 7 mmol/L et 2,5 mmol/L (une nuit, à l’obscurité et à 4°C)82,134.
Avant son utilisation, la solution stock d’ABTS•+ est diluée dans l’éthanol pour atteindre une
absorbance de 0,70 (± 0,02) AU à 734 nm. Les solutions stocks d’étalons de composés phénoliques
sont préparées par dissolution des composés dans le méthanol (1 mg/mL) et sont ensuite stockées à
l’obscurité à -20°C. Avant utilisation, les solutions stocks sont diluées dans un mélange
méthanol/eau (50/50, v/v).
92
2.3 Etude des composés antioxydants à différentes étapes du procédé de
fabrication de la bière
2.3.1 Procédé de brassage
Le malt est brassé avec de l’eau pour obtenir le moût (13°Plato) selon le digramme de
brassage suivant : 0-20 min, 37°C; 20-34 min, 37-50°C; 34-44 min, 50°C; 44-59 min, 50-65°C; 59-69
min, 65°C; 69-82 min, 65-76°C; 82-92 min, 76°C. Le moût est bouilli sans houblon (1 h, 100°C) pour
obtenir le moût bouilli, puis fermenté pour obtenir le moût bouilli fermenté. Le moût est également
bouilli avec du houblon (1 h, 100°C) pour obtenir le moût bouilli houblonné, puis fermenté pour
obtenir la bière. Le houblon utilisé est sous la forme d’une résine produite par extraction
supercritique au CO2 ne contenant pas de polyphénols, mais il est l’ingrédient le plus couramment
ajouté dans le moût des brasseries industrielles. La procédure d’extraction est appliquée après
chacune des étapes précédentes.
Le procédé de brassage a également été appliqué à l’extrait de malt obtenu par extraction des
composés du malt à l’acétate d’éthyle. L’extrait de malt brassé (EMB) est obtenu par mélange de
l'extrait de malt (EM) avec de l'eau (mélange correspondant à 10 mL de moût à une densité finale de
13°Plato) et brassé selon le diagramme de brassage décrit ci-dessus. L’extrait de malt brassé et
bouilli (EMBB) est obtenu en faisant bouillir l’extrait de malt brassé (EMB) (1 h, 100°C). L’extrait de
malt brassé bouilli et houblonné (EMBBH) est obtenu en faisant bouillir l’extrait de malt brassé
(EMB) avec l’extrait de houblon (EH) (1 h, 100°C). La même expérience est réalisée sur l'extrait de
houblon (EH) avec de l'eau pour obtenir un extrait de houblon bouilli (EHB) (Figure 4.1, page 95). Les
échantillons sont évaporés à sec dans un évaporateur sous vide à froid (Savant SPD121P SpeedVac®
Concentrator, ThermoScientific, Gometz le Châtel, France) et les résidus, dissous dans 1 mL de
méthanol/eau (50/50, v/v), sont filtrés sur membrane (0,45 µm, Macherey-Nagel) et injectés (20 µL)
dans le système chromatographique.
La procédure d'extraction des composés phénoliques utilisée est adaptée de celle de l’équipe
de Samaras et al. avec de légères modifications163. Les échantillons d’orge et de malt sont finement
broyés dans un broyeur cryogénique (6870 Freezer/Mill, Spex CertiPrep, Stanmore, Royaume-Uni)
pendant 9 minutes (3 x 3 minutes) à une fréquence de 20 impactes/seconde. Les échantillons broyés
(1,63 g) sont mis en suspension dans un tampon acétate (acétate d’ammonium, 50 mM, pH 5,4,
93
10,72 mL) et homogénéisés pendant 2 min à l'aide d'un pilon et d’un mortier (conservé dans la
glace). Après centrifugation (920 g, 10 min), le surnageant est filtré à travers un papier filtre
Whatman n° 1 (Whatman, Paris, France), pour enlever les éventuelles particules et obtenir ainsi
l’extrait au tampon acétate. La proportion d'orge moulue dans le tampon acétate (1,63 g dans 10,72
mL) est équivalente à 10 mL de moût à une densité finale de 13°Plato. Les composés phénoliques
sont extraits à l'acétate d'éthyle, à partir des extraits au tampon acétate d’orge et de malt, des
différents échantillons de bière et de la résine de houblon, selon la méthode décrite dans le chapitre
3. Les échantillons (10 mL) sont d’abord acidifiés à pH 2,0 par ajout de HCl (37 %), puis 0,5 g de
chlorure de sodium sont ajoutés. Trois extractions successives sont ensuite réalisées dans des tubes
de centrifugation en polypropylène Corning® (New York, USA) de 50 mL avec 10 mL d'acétate
d'éthyle sur un agitateur giratoire à 200 tr/min66,86 pendant 15 min. Après centrifugation des
mélanges (2500 g, 10 min), les surnageants sont groupés et évaporés à sec sous vide (30°C, 80
mbar). Le résidu obtenu est dissous dans 1 mL de méthanol/eau (50/50, v/v), filtré sur membrane
(0,45 µm, Macherey-Nagel, Hoerdt, France) et injecté (20 µL) dans le système chromatographique.
Dans le cas de l’extrait de malt, utilisé pour appliquer le procédé de brassage, le résidu est dissous
dans 1 mL d’eau.
2.3.3 Analyse chromatographique
L’analyse chromatographique a été effectuée selon la méthode décrite dans le chapitre 3. Le

système HPLC (Waters, Saint-Quentin-Fallavier, France) utilisé est constitué d’un contrôleur 600S,
d’une pompe 616, d’un injecteur automatique 717 Plus, d’un détecteur UV-visible à photodiode
2996, d’un détecteur UV-visible 486 pour la détection de l'ABTS•+, et d’une pompe HPLC
supplémentaire utilisée pour la distribution de la solution d'ABTS•+. Après mélange de cette dernière
avec la phase mobile sortant de la colonne, la réaction a lieu pendant 1 min, le temps nécessaire
pour parcourir un tube en PEEK de 7 m de long et 0,5 mm de diamètre. Les séparations sont
réalisées à température ambiante sur une colonne de chromatographie C18 hypersil BDS (5 µm, 250
x 4,6 mm, ThermoScientific, Gometz le Châtel, France). La phase mobile, délivrée à 1 mL/min,
consiste en un mélange d’eau à 0,1% (v/v) d'acide formique (éluant A) et de méthanol (éluant B)
selon le gradient suivant : 0-25 min, 3-25% de B; 25-26 min, 25-18% de B; 26-29 min, 18% de B; 29-
47 min, 18-30% de B; 47-57 min 30% de B; 57-67 min, 30-65% de B; 67-77 min, 65% de B. La solution
d’ABTS•+ est délivrée à 0,5 mL/min. La détection des composés séparés est réalisée à 254 nm, alors
que celle de l'ABTS•+ réduit l’est à 412 nm.
94
2.3.4 Identification de composés phénoliques
L'étude qualitative des composés phénoliques est réalisée par HPLC couplée à la
spectrométrie de masse équipée d’une source d’ionisation (ESI). Les spectres de masse à haute
résolution (HRMS) sont réalisés par le Service Commun d'Analyses de la Faculté de Pharmacie de
Strasbourg en utilisant un spectromètre de masse de type Q-TOF 6520 (Agilent, Massy, France). Les
composés analysés sont préalablement séparés à l’aide d’un système HPLC constitué d'un module
de distribution de solvants 1200 (Agilent) et d’une colonne de chromatographie en phase inverse
C18 (1,9 µm, 100 x 1 mm). La phase mobile est constituée d’un mélange isocratique eau/acétonitrile
additionné de 0,01% (v/v) d'acide formique.
2.3.5 Courbes de calibrage
Les courbes de calibrage de chaque composé phénolique, sont établies à partir des données
de trois injections (20 µL) de mélanges étalons obtenus par dilutions des solutions mères
(méthanol/eau (50/50, v/v)). Les courbes (six points de données, n=3) sont linéaires avec des valeurs
R2 supérieures à 0,99. La concentration de chaque composé phénolique connu est déterminée par
référence à l’absorbance de son étalon, alors que le potentiel antioxydant est calculé par rapport à la
concentration de Trolox nécessaire pour produire une activité antioxydante équivalente et est
exprimé en équivalent Trolox (µM).
2.4 Etude des bières décolorées
2.4.1 Décoloration de la bière
La bière est décolorée selon la méthode décrite dans le chapitre 2. Dix litres de bière sont
mélangés à 50 g de Kieselguhr et 100 g de charbon actif KB-WJ, puis agités pendant 30 min à 250
tr/min à température ambiante. Un filtre à Kieselguhr avec une membrane (5 µm, Millipore) est
d’abord alluvionné avec 50 g de Kieselguhr dans 5 L d’eau distillée, puis le mélange (bière, Kieselguhr
et charbon actif KB-WJ) est filtré, afin d’obtenir une bière décolorée.
95
2.4.2 Coloration de la bière
Des bières avant et après décoloration sont additionnées de différents colorants : la

chlorophylle (500 mg/L) ; le lycopène (100 mg/L) ; la poudre de betterave (500 mg/L) ; l’acide
carminique (10 mg/L) et les anthocyanes de chou rouge (125, 250 et 500 mg/L). Ces deux derniers
colorants ont été testés aux pH 4,4 et 6,4. Ces deux pH permettant d’obtenir différentes couleurs,
ont été déterminés grâce à une solution de KCl 0,25M ajustée à différents pH (avec NaOH ou HCl) et
additionnée d’acide carminique ou d’anthocyanes à 10 mg/L. La couleur de chaque solution est
analysée par spectrophotométrie UV-visible (UV-2401 PC, Shimadzu, Champs-sur-Marne, France) et
les différences de couleur entre les deux bières ont été analysées par le système des couleurs
L*a*b*.
2.5 Analyses statistiques

Les données sont analysées par le test ANOVA (au seuil de signification de 95%) à l'aide du
logiciel Statgraphics Plus. Tous les échantillons sont analysés en triple exemplaire.
96
3.1 Etude des composés antioxydants à différentes étapes du procédé de

fabrication de la bière
La méthode LC-AOx a été appliquée à la séparation des composés phénoliques extraits à

différentes étapes du procédé de fabrication de la bière et à l'évaluation de leur activité
antioxydante. Cela a permis de suivre les profils des composés phénoliques et des molécules
antioxydantes à chaque étape du procédé, de l’orge à la bière, en passant par le malt et le moût
(Figure 4.1).
Figure 4.1 : Les différentes étapes du procédé de fabrication de la bière : maltage, brassage, cuisson
et fermentation avec ou sans houblon ; brassage et cuisson appliqué aux extraits de malt et de
houblon obtenus après extraction à l’acétate d’éthyle (EM, extrait de malt ; EH, extrait de houblon ;
EMB, extrait de malt brassé ; EMBB, extrait de malt brassé et bouilli ; EMBBH, extrait de malt brassé,
bouilli et houblonné ; EHB, extrait de houblon bouilli).
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’étape du maltage afin de comparer
les teneurs en composés phénoliques et les activités antioxydantes de l’orge et du malt. Puis, afin de
97
différencier les apports en composés phénoliques et antioxydants des deux matières premières de la
bière (le malt et le houblon), nous avons suivi les étapes de brassage, de cuisson et de fermentation.
Le moût, le moût bouilli et houblonné et la bière représentent le procédé normal de fabrication de la
bière, tandis que le moût bouilli et le moût bouilli et fermenté représentent un procédé excluant
l'étape de houblonnage. Enfin, dans l’objectif d’étudier l’influence des températures appliquées lors
des procédés de brassage et de cuisson, ces derniers ont été appliqués, non aux matières premières
(malt et houblon), mais à leurs extraits respectifs à l’acétate d’éthyle (Figure 4.1). L’EMB, l’EMBB et
l’EMBBH servent à évaluer l’impact du brassage, de la cuisson et du houblonnage sur l’EM. De
même, l’EHB a été utilisé pour évaluer l'impact du procédé de cuisson sur l’EH.
3.1.1 Composés antioxydants au cours du maltage
La Figure 4.2 montre les chromatogrammes LC-AOx correspondant aux extraits à l’acétate
d'éthyle d'orge et de malt et leurs activités antioxydantes. La partie supérieure de chaque
chromatogramme représente principalement les composés phénoliques de l’orge (Figure 4.2a) et du
malt (Figure 4.2c), détectés à 254 nm, tandis que la partie inférieure est obtenue par détection UV à
412 nm, après réaction post-colonne et représente l'activité antioxydante des composés extraits de
l'orge (Figure 4.2b) et du malt (Figure 4.2d).
A partir des profils de l’orge et du malt, dix composés phénoliques ont pu être identifiés en
utilisant des standards de chromatographie : l’acide protocatéchuique (3) ; l’acide p-
hydroxybenzoïque (5) ; la catéchine (6) ; l'acide chlorogénique (7) ; l’acide vanillique (8) ; l’acide
caféique (9) ; l'épicatéchine (10) ; l’acide p-coumarique (11) ; l’acide férulique (12) et l'acide
sinapique (13). Parmi ces composés, seuls les acides p-hydroxybenzoïque, vanillique et p-
coumarique ne sont pas antioxydants (Figure 4.2). Cinq autres composés (1, 2, 4, 14 et 15), non
identifiés en utilisant des standards de chromatographie, présentent également des activités
antioxydantes.
Les composés 2 et 4 ont pu être identifiés par analyse LC-ESI-MS, en mode positif, et par
HRMS comme dimères de procyanidine et prodelphinidine25. Le composé 2 montre une [M+H]+ à
595 m/z et une masse exacte de 595,14534 et correspond à la prodelphinidine B3, un dimère
(gallocatéchine-catéchine). Le composé 4 montre une [M+H]+ à 579 m/z et une masse exacte de
579,15039 et correspond à la procyanidine B3, un dimère (catéchine-catéchine)23,25,165. Les composés
1, 14 et 15 n’ont quant à eux pas été identifiés, bien que des tentatives d’identification aient été
30
faites, notamment du (2R,3S)-catéchine-7-O-β-D-glucopyranoside, retrouvé par Friedrich et al.
98
dans l’orge et le malt. Cependant l’utilisation de l’analyse LC-ESI-MS ne nous a pas permis
d’identifier ce glucoside.
Figure 4.2 : Détermination chromatographique des composés phénoliques et de leurs activités

antioxydantes correspondantes dans l'orge (a, b) et le malt (c, d). Les pics sont comme suit: 1,
composé non identifié; 2, prodelphinidine B3; 3, acide protocatéchuique; 4, procyanidine B3; 5,
acide p-hydroxybenzoïque ; 6, catéchine ; 7, acide chlorogénique ; 8, acide vanillique ; 9, acide
caféique ; 10, épicatéchine ; 11, acide p-coumarique ; 12, acide férulique ; 13, acide sinapique ; 14 et
15, composés non identifiés.
99
L’activité antioxydante dans l'orge provient en grande partie de la prodelphinidine B3, de la
procyanidine B3 et de la catéchine qui ensemble correspondent à 53% de l'activité totale (Tableau
4.1). D’après Zhao et al., les composés de structure catéchine sont plus antioxydants que les autres
composés phénoliques95. Cependant, nous avons vu dans le chapitre 3 qu’avec la méthode LC-AOx
les acides caféique, chlorogénique et sinapique sont plus antioxydants que la catéchine. La
contribution de la prodelphinidine B3, de la procyanidine B3 et de la catéchine à l’activité
antioxydante totale de l’orge semble plutôt due à leurs teneurs élevées. Ceci est en accord avec les
études montrant que la catéchine et les composés de structure flavonoïde sont généralement les
plus abondants dans l’orge23.
Tableau 4.1 : Teneur et activité antioxydante des composés de l’orge et du malt (n=9)
Orge Malt
UV AOx UV AOx
Composés phénoliques
Conc. éq. Trolox Conc. éq. Trolox
(µM) (µM) (µM) (µM)
1 nq 2 ± 1 nq 10 ± 3
Prodelphinidine B3 nq 5 ± 2 nq 2 ± 1
Acide protocatéchuique 12 ± 1 3 ± 1 3 ± 1 2 ± 1
Procyanidine B3 nq 10 ± 6 nd nd
Acide p-hydroxybenzoique 7 ± 0 nAOx 5 ± 1 nAOx
Catéchine 15 ± 8 7 ± 3 nd nd
Acide chlorogénique 5 ± 0 2 ± 0 nd nd
Acide vanillique 17 ± 1 nAOx 10 ± 1 nAOx
Acide caféique 3 ± 0 2 ± 1 1 ± 0 3 ± 1
Epicatéchine 24 ± 7 2 ± 0 15 ± 3 3 ± 1
Acide p-coumarique 3 ± 1 nAOx 30 ± 8 nAOx
Acide férulique 20 ± 2 2 ± 1 73 ± 7 6 ± 2
Acide sinapique 1 ± 0 2 ± 1 8 ± 2 6 ± 1
14 nq 2 ± 0 nq 5 ± 1
15 nq 2 ± 0 nq 5 ± 2
nAOx, non antioxydant ; nq, non quantifié (pas d’étalons) ; nd, non détecté.
A l’inverse de l’orge, l’acide chlorogénique, la catéchine et la procyanidine B3 ne sont pas

détectées dans le malt, et l’activité liée à la prodelphinidine B3 y est plus faible (Tableau 4.1). La
diminution de la teneur en catéchine suite au maltage est conforme aux résultats d’études
précédentes. Goupy et al. ont montré que la teneur en composés de type catéchine diminuait après
le maltage et plus encore pour les monomères que pour les dimères23. La même observation a été
faite par Friedrich et al. avec en plus une augmentation de la teneur en catéchine glucoside30. Une
100
glycosylation de la catéchine au cours du maltage pourrait expliquer le fait qu’elle ne soit plus
détectée par la méthode LC-AOx.
Ce sont les acides férulique et sinapique, ainsi que le composé 1, non identifié, qui contribuent
le plus (52%) à l’activité antioxydante du malt. L’activité liée au composé 1 et aux acides férulique et
sinapique est, respectivement, cinq et trois fois plus importante dans le malt que dans l’orge. En
réalité, ce sont les teneurs en ses composés qui ont considérablement augmenté suite au maltage,
ce qui a également été observé pour l’acide p-coumarique. Les acides férulique et p-coumarique
sont présents sous forme liée dans les grains d'orge6. Une libération de ces composés durant le
touraillage, rendrait leur extraction plus facile et serait responsable de l’augmentation observée42.
Globalement, les mêmes tendances que celle observée avec l’activité antioxydante sont
observées avec les teneurs totales en composés phénoliques. Toutefois, on observe quelques
problèmes de linéarité entre les résultats des composés phénoliques et de l’activité antioxydante,
pour l’acide caféique et l’épicatéchine. Ceci pourrait être dû à l’effet de la matrice qui affecterait la
réponse antioxydante.
En considérant les différents extraits, les aires des pics de chaque chromatogramme ont été
additionnées et les moyennes ± écart-types ont été déterminées à partir de trois déterminations
répétées trois fois. La Figure 4.3 montre la teneur totale en composés phénoliques (Figure 4.3a) et
l’activité antioxydante totale (Figure 4.3b) de l'orge et du malt.
Figure 4.3 : Teneur en composés phénoliques (a) et activité antioxydante (b) totales de l’orge et du
malt.
101
La teneur totale en composés phénoliques est trois fois plus élevée dans le malt que dans
l’orge (Figure 4.3a), ce qui est conforme aux résultats obtenus par Maillard et al. (1996)54. Cette
différence est due, en grande partie, à l’augmentation importante des quantités des acides p-
coumarique, férulique et sinapique (Tableau 4.1). Ces trois composés correspondent en effet à 22%
de la teneur totale en composés phénoliques de l'orge et à 77% de celle du malt.
L'activité antioxydante totale, exprimée en équivalent Trolox (µM), ne suit pas la même
tendance que la teneur totale en composés phénoliques, car aucune différence significative (p >
0,05) n’est observée entre l'orge et le malt (Figure 4.3b). Cependant, les deux profils
chromatographiques d'activité antioxydante ne sont pas similaires dans la mesure où la disparition
de certains pics a été compensée par l’apparition d’autres (Figure 4.2b, d). Cette compensation est
en grande partie due à l’activité des acides férulique et sinapique et des composés 1, 14 et 15 dont
les teneurs ont augmenté.
3.1.2 Composés antioxydants au cours du brassage et de la fermentation
La Figure 4.4 montre les chromatogrammes LC-AOx obtenus avec des extraits à l’acétate
d'éthyle de moût (Figure 4.4a), de moût bouilli (Figure 4.4b), de moût bouilli et houblonné (Figure
4.4c), de moût bouilli et fermenté (Figure 4.4d) et de bière (Figure 4.4e) et leurs activités
antioxydantes. Les composés suivants ont été détectés : la prodelphinidine B3 (2), l’acide
protocatéchuique (3), la procyanidine B3 (4), l’acide p-hydroxybenzoïque (5), la catéchine (6), l'acide
chlorogénique (7), l’acide vanillique (8), l’acide caféique (9), l'épicatéchine (10), l’acide p-coumarique
(11), l’acide férulique (12), l'acide sinapique (13) et le composé 1 non identifié. Quatre nouveaux
composés non identifiés ont été détectés au cours de la transformation de la bière et ont été
nommés a, b, c et x. Seuls les composés 14 et 15 de l’orge et du malt ne semblent pas présents ou
sont présents en quantités trop faibles pour être détectés.
102
Figure 4.4 : Détermination chromatographique des composés phénoliques et de leurs activités
antioxydantes correspondantes dans : le moût (a); le moût bouilli (b); le moût bouilli et houblonné
(c); le moût bouilli et fermenté (d) et la bière (e). Les pics sont comme suit: 1, composé non identifié;
2, prodelphinidine B3; 3, l'acide protocatéchuique; 4, procyanidine B3; 5, l'acide p-
hydroxybenzoïque ; 6, catéchine ; 7, acide chlorogénique ; 8, acide vanillique ; 9, l'acide caféique ;
10, épicatéchine ; 11, l'acide p-coumarique ; 12, acide férulique ; 13, acide sinapique ; a, b, c, et x,
composés non identifiés.
103
Les chromatogrammes de la teneur en composés phénoliques du moût (Figure 4.4a) et du
moût bouilli (Figure 4.4b) sont similaires. Avec le moût bouilli et houblonné (Figure 4.4c), les
concentrations de quatre composés semblent être plus élevées que dans les autres profils : a (12,5
min), b (13,8 min), 2 (14,2 min) et c (15,5 min). Avec le moût bouilli et fermenté (Figure 4.4d), la
concentration du composé a diminue et celle du composé x (46,1 min) augmente. Avec la bière
(Figure 4.4e), on retrouve les pics correspondant aux composés a, b, c et x, mais le pic b (13,8 min)
est trois fois plus important que celui du moût bouilli et houblonné. Cette augmentation peut être
liée à une meilleure extraction des composés grâce à la présence de l'éthanol produit lors de la
fermentation.
Les profils de l'activité antioxydante sont assez similaires pour tous les chromatogrammes.
Pour le moût bouilli et houblonné (Figure 4.4c) et la bière (Figure 4.4e), le composé antioxydant 1
(11 min) a une concentration un peu plus élevée et un pic émerge à 14,9 min (deuxième flèche),
correspondant au composé b à 13,8 min dans les profils de détection UV. Ces différences entre les
chromatogrammes peuvent être dues à la présence de composés, autres que phénoliques, formés
au cours de la cuisson avec houblon et qui absorbent dans l’UV, mais ne semblent pas être dues à
l'apparition de nouveaux composés phénoliques qui serait due à l'addition de houblon ou de la
fermentation. En effet, l'extrait de houblon a été produit par extraction supercritique au CO2 et le
CO2, non-polaire, n'est pas un bon solvant d’extraction des composés phénoliques polaires166.
L’acide férulique est le composé phénolique dont la teneur est la plus importante tout au long
du procédé de fabrication de la bière (Tableau 4.2). Cependant, la contribution antioxydante la plus
importante provient de la prodelphinidine B3, de la procyanidine B3 et de la catéchine, qui ensemble
correspondent à 54% de l'activité antioxydante totale du moût, 59% de celle du moût bouilli, 37% de
celle du moût bouilli et houblonné, 45% de celle du moût bouilli et fermenté et 25% de celle de la
bière. Ces trois composés sont donc présents dans les étapes de brassage, de cuisson et de
fermentation alors qu’ils ne l’étaient pas ou peu dans le malt. Ces composés ne semblent donc pas
être dégradés dans le malt. D’après Friedrich et al., ces composés ont pu être glycosylés dans le
malt30. La glycosylation de ces composés augmente leur solubilité dans l’eau et cette solubilité
augmente avec l’augmentation de la température167. Leur présence dans le moût peut être due à
l’étape de brassage qui correspond à une extraction des composés du malt à l’eau à 37°C et plus. Les
différents paliers de températures du brassage correspondent aux températures optimales d’action
des hydrolases telles que les amylases ; ces enzymes vont permettre la déglycosylation des
composés qui pourront alors être détectés dans le moût par la méthode LC-AOx.
104
Au cours du procédé, on observe que la teneur des acides p-hydroxybenzoïque, chlorogénique
et vanillique est multipliée, respectivement par trois et par deux au cours de la fermentation avec et
sans houblon (Tableau 4.2). L’activité antioxydante des composés 1 et b est multipliée par deux au
cours de l’étape de cuisson avec houblon.
L’activité antioxydante de la prodelphinidine B3 et de la procyanidine B3 augmente au cours

de la cuisson car la solubilité des composés est augmentée dans l’eau à température élevée.
Cependant leur activité antioxydante diminue respectivement de 43% et 62% au cours de l’étape de
fermentation avec houblon. Cette diminution de l’activité antioxydante peut être liée à une
diminution de la teneur de ces composés suite à leur adsorption par les levures utilisées lors de la
fermentation. En effet, Razmkhab et al. ont démontré que les composés de type catéchine était
significativement retenus par les levures au cours de la fermentation168.
Tableau 4.2 : Teneur et activité antioxydante des composés antioxydants dans les différentes étapes
du procédé de fabrication de la bière (n=9)
Moût bouilli et Moût bouilli et

Moût Moût bouilli Bière
houblonné fermenté
UV AOx UV AOx UV AOx UV AOx UV AOx
Conc. éq.Trolox Conc. éq.Trolox Conc. éq.Trolox Conc. éq.Trolox Conc. éq.Trolox
(µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM)
1 nq 24±10 nq 32±8 nq 53±10 nq 45±12 nq 60±12
a nq 8±4 nq 1±0 nq 4±0 nq 8±4 nq 8±1
b nq 5±0 nq 7±5 nq 12±3 nq 8±1 nq 15±7
Prodelphinidine B3 nq 49±34 nq 73±46 nq 35±18 nq 58±30 nq 20±13
c nq 8±5 nq 8±3 nq 10±4 nq 8±4 nq 10±3
Acide protocatéchuique 21±10 6±2 7±3 3±1 17±7 11±5 9±4 11±3 27±13 10±5
d nq 8±3 nq 8±8 nq 9±0 nq 6±1 nq 11±8
Procyanidine B3 nq 74±51 nq 113±76 nq 58±40 nq 74±38 nq 22±17
e nq 5±3 nd nd nq 7±0 nq 4±0 nd nd
Acide p-hydroxybenzoïque 8±2 nAOx 11±3 nAOx 7±3 nAOx 38±15 nAOx 18±2 nAOx
f nq 5±3 nd nd nd nd nd nd nd nd
Catéchine 35±18 38±19 37±18 47±23 33±10 44±31 29±12 43±13 38±21 32±19
Acide chlorogénique 4±2 5±3 5±1 nd 6±3 9±1 13±12 10±0 11±2 nd
Acide vanillique 16±10 nAOx 19±3 nAOx 17±7 nAOx 34±13 nAOx 33±5 nAOx
Acide caféique 13±5 15±1 13±3 17±6 12±4 15±2 13±5 14±8 10±6 11±7
g nq 8±2 nq 13±2 nq 10±2 nq 14±6 nq 11±5
Epicatéchine 35±19 2±1 nd nd 14±9 13±1 49±0 11±0 19±7 23±3
h nd nd nd nd nq 13±7 nq 17±2 nd nd
i nd nd nd nd nq 16±0 nd nd nd nd
Acide p-coumarique 70±31 nAOx 84±26 nAOx 64±16 nAOx 45±23 nAOx 60±12 nAOx
j nq 3±1 nq 9±0 nq 9±2 nq 5±1 nq 17±9
Acide férulique 129±52 8±5 133±23 11±5 118±49 9±2 115±49 12±1 114±11 11±6
Acide sinapique 18±7 15±8 22±3 21±6 28±10 20±4 10±4 21±7 11±2 16±9
105
Pour chaque extrait, les aires des pics de chaque chromatogramme ont été additionnées et la
moyenne ± écart-type a été déterminée à partir de trois déterminations répétées trois fois. La Figure
4.5 montre la teneur totale en composés phénoliques (Figure 4.5a) et l’activité antioxydante totale
(Figure 4.5b) des extraits de moût, de moûts bouilli, bouilli et houblonné, bouilli et fermenté et de
bière.
Figure 4.5 : Teneurs en composés phénoliques (a) et activité antioxydante (b) totales à différentes
étapes du procédé de fabrication de la bière.
La teneur totale en composés phénoliques ne semble pas être affectée par l’étape de
brassage (Figure 4.3a et 4.5a), ni par l’étape de la cuisson sans houblon, mais elle est multipliée par
deux suite à l’étape de houblonnage (Figure 4.5a). Cette augmentation ne peut être due ni à
l'apparition de nouveaux composés phénoliques qui serait due à l'addition de houblon, puisque la
résine de houblon utilisée est dépourvue de composés phénoliques, ni à l’augmentation de la teneur
en composés naturels connus, d’après le Tableau 4.2. Cependant, la teneur des composés
phénoliques non identifiés 1, a, b et c semble augmenter à l’étape du houblonnage (Figure 4.4c).
Cette augmentation pourrait être due à la présence de composés absorbant dans l’UV. L’étape de
fermentation augmente également la teneur totale en composés phénoliques (Figure 4.5a),
probablement à cause de l’augmentation des quantités des composés 1 et b (Figure 4.4e) et des
acides p-hydroxybenzoïque, chlorogénique et vanillique (Tableau 4.2).
L'activité antioxydante totale ne suit pas la même tendance que la teneur totale en composés
phénoliques. Elle est multipliée par six entre le malt et le moût (Figure 4.3b et 4.5b). Cette
augmentation est principalement due à la présence de la prodelphinidine B3, de la procyanidine B3
et de la catéchine qui contribuent à 54% de l’activité antioxydante totale du moût, alors qu’elles sont
absentes du malt. Cependant, aucune des étapes de transformation de la bière n’a d’effet significatif
106
(p > 0,05) sur l’activité antioxydante totale (Figure 4.5b). La variation de l’activité antioxydante
individuelle des composés au cours du procédé ne semble pas affecter l’activité totale de chaque
étape. Toutefois, on constate une grande variation dans la répétabilité des résultats de l’activité
antioxydante, contrairement à la teneur en composés phénoliques, ce qui suggère que la matrice
affecte la réponse antioxydante des composés.
3.1.3 Impact du procédé de brassage sur l’activité antioxydante totale
Les procédés de brassage et de cuisson ont été appliqués aux extraits à l’acétate d’éthyle de
malt et de houblon, dans l’objectif d’étudier l’influence des températures appliquées lors du
brassage sur les teneurs totales en composés phénoliques et les activités antioxydantes
correspondantes. Ainsi, la méthode LC-AOx a été appliquée à l’évaluation de l’activité antioxydante
des extraits de malt (EM), de malt brassé (EMB), de malt brassé et bouilli (EMBB), de malt brassé,
bouilli et houblonné (EMBBH), de houblon (EH) et de houblon bouilli (EHB).
Au cours du procédé de brassage, la teneur totale en composés phénoliques de l’EM diminue

de 62% (Figure 4.6a). Elle ne varie pas pendant l’étape de cuisson sans houblon, mais diminue de
20% durant l’étape de cuisson avec houblon (Figure 4.6a). Il n'y a pas de composés phénoliques dans
l’EH, la résine de houblon ayant été produite par extraction supercritique au CO2, alors que la teneur
en composés phénoliques de l’EHB n’est pas nulle, ce qui confirme la présence de composés, autres
que phénoliques, formés au cours de la cuisson et qui absorbent dans l’UV.
Figure 4.6 : Teneurs en composés phénoliques (a) et activités antioxydantes (b) totales de : EM,
extrait de malt ; EMB, extrait de malt brassé ; EMBB, extrait de malt brassé et bouilli ; EMBBH,
extrait de malt brassé bouilli et houblonné ; EHB, extrait de houblon bouilli ; EH, extrait de houblon.
107
L'activité antioxydante totale suit la même tendance que la teneur totale en composés
phénoliques. Lors de l'étape de brassage, l'activité antioxydante totale diminue de 60% (Figure
4.6b). Mais contrairement à la teneur totale en composés phénoliques qui reste constante, l'activité
antioxydante totale diminue de 30% durant l’étape de cuisson sans houblon. Toutefois, elle n’est pas
affectée par l’ajout du houblon. Les composés de l’EHB ne présentent pas d’activité antioxydante.
Au cours de l’étape de brassage, les teneurs des composés phénoliques individuels connus
diminuent, ce qui pourrait expliquer la diminution de 60% de la teneur en composés phénoliques et
de l’activité antioxydante totales entre l’EM et l’EMB (Tableau 4.3). Toutefois, la teneur de l’acide p-
hydroxybenzoique est constante et celle de l’acide sinapique est quatre fois plus élevée. Au cours
des étapes de cuisson avec ou sans houblon, on n’observe pas de changement par rapport à l’EMB.
En ce qui concerne l’activité antioxydante, on observe la même diminution que pour la teneur
en composés phénoliques sauf pour l’acide sinapique dont l’activité reste constante tout au long du
procédé (Tableau 4.3).
Tableau 4.3 : Teneur et activité antioxydante des composés antioxydants de l’EM à différentes
étapes du procédé de brassage (n=9)
EM EMB EMBB EMBBH

UV AOx UV AOx UV AOx UV AOx
Conc. éq. Trolox Conc. éq. Trolox Conc. éq. Trolox Conc. éq. Trolox
(µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM)
1 nq 10 ± 3 nq 6 ± 2 nd nd nd nd
Prodelphinidine B3 nq 2 ± 1 nd nd nd nd nd nd
Acide protocatéchuique 3 ± 1 2 ± 1 nd nd nd nd nd nd
Procyanidine B3 nd nd nd nd nd nd nd nd
Acide p-hydroxybenzoique 5 ± 1 nAOx 5 ± 1 nAOx 4 ± 1 nAOx 4 ± 0 nAOx
Catéchine nd nd nd 3 ± 0 nd nd nd nd
Acide chlorogénique nd nd nd nd nd nd nd nd
Acide vanillique 10 ± 1 nAOx 5 ± 0 nAOx 5 ± 1 nAOx 5 ± 1 nAOx
Acide caféique 1 ± 0 3 ± 1 nd 1 ± 0 nd nd nd nd
Epicatéchine 15 ± 3 3 ± 1 nd nd nd nd nd nd
Acide p-coumarique 30 ± 8 nAOx 21 ± 2 nAOx 19 ± 2 nAOx 22 ± 4 nAOx
Acide férulique 73 ± 7 6 ± 2 37 ± 3 1 ± 1 40 ± 2 2 ± 1 40 ± 5 2 ± 0
Acide sinapique 8 ± 2 6 ± 1 31 ± 5 6 ± 1 20 ± 4 5 ± 1 24 ± 5 4 ± 2
14 nq 5 ± 1 nq 2 ± 1 nq 1 ± 0 nq 3 ± 1
15 nq 5 ± 2 nd nd nd nd nd nd
108
D’après les résultats de l’étude des extraits de malt et de houblon, seuls l’acide p-
hydroxybenzoïque, composé de l’EM, ne semblent pas être affectés par le brassage. Toutefois, la
prodelphinidine B3, la procyanidine B3 et la catéchine qui ne sont pas détectés dans l’EM (ou
faiblement), le sont dans le moût, comme nous l’avons vu précédemment (partie 3.1.2 p.102), mais
pas dans l’EMB, l’EMBB et l’EMBBH. Il semble donc difficile de transposer cette étude à ce qui se
passe dans la matrice.
Dans cette étude la méthode LC-AOx a été utilisée pour la détermination des composés
phénoliques au cours de la fabrication de la bière. Cette méthode est plus complète que l’HPLC
classique, car elle est destinée non seulement à séparer les composés phénoliques, mais aussi à
déterminer leur intérêt fonctionnel potentiel, à travers la mesure de leur activité antioxydante. En
utilisant cette méthode, il a été possible de mettre en lumière deux composés représentant la plus
grande partie de l'activité antioxydante de l’orge, du moût et de la bière et pour lesquels aucun
standard de chromatographie n’était disponible. Il s’agit de la prodelphinidine B3 et la procyanidine
B3. Cette étude a également permis de montrer qu’au cours du procédé de fabrication de la bière, la
teneur totale en composés phénoliques augmentait alors que l'activité antioxydante totale restait
constante.
109
3.2 Etude des bières décolorées
Le traitement décolorant développé et décrit dans le chapitre 2 et consistant en une mise en

contact avec le charbon actif KB-WJ à 10 g/L de bière pendant 30 min, a permis d’obtenir un produit
fonctionnel d’un point de vue technologique et clarifié. Dans cette partie de l’étude, l’extraction des
composés phénoliques et la méthode LC-AOx ont été appliquées à la séparation et l’évaluation de
l’activité antioxydante des composés phénoliques de la bière avant et après la décoloration. Puis,
différents colorants de qualité alimentaire ont été testés sur la bière décolorée afin d’obtenir un
produit aux couleurs originales.
3.2.1 Composés antioxydants
La Figure 4.7 montre les chromatogrammes obtenus avec des extraits à l’acétate d'éthyle de
la bière avant (Figure 4.7a) et après décoloration (Figure 4.7c), ainsi que les activités antioxydantes
correspondantes (Figure 4.7b et d). En comparant les deux profils, on constate que la décoloration
provoque la diminution de la teneur des composés phénoliques (Figure 4.7a, c), seuls la
prodelphinidine B3, l’acide p-hydroxybenzoïque et les composés 1, a, b et c sont détectés. En ce qui
concerne l’activité antioxydante, seul le composé 1 montre encore une activité détectable et sa
teneur est diminuée de moitié (Figure 4.7b, d). Ces résultats sont conformes à ceux du chapitre 2
démontrant que les composés phénoliques connus dans la bière sont adsorbés par le charbon actif
KB-WJ.
110
Figure 4.7 : Détermination chromatographique des composés antioxydants et de leurs activités
antioxydantes correspondantes dans la bière (a, b) et la bière décolorée (c, d). Les pics sont comme
suit: 1, composé non identifié; 2, prodelphinidine B3; 3, acide protocatéchuique; 4, procyanidine B3;
5, acide p-hydroxybenzoïque ; 6, catéchine ; 7, acide chlorogénique ; 8, acide vanillique ; 9, acide
caféique ; 10, épicatéchine ; 11, acide p-coumarique ; 12, acide férulique ; 13, acide sinapique ; a, b
et c, composé non identifiés.
111
Les aires des pics de chaque chromatogramme ont été additionnées et les moyennes ± écart-
types ont été déterminées à partir de trois déterminations répétées trois fois. La Figure 4.8 montre
la teneur totale en composés phénoliques (Figure 4.8a) et l’activité antioxydante totale (Figure 4.8b)
des extraits de bière avant et après décoloration.
Figure 4.8 : Teneur en composés phénoliques (a) et activité antioxydante (b) totales de la bière avant
et après décoloration.
La teneur en composés phénoliques diminue de 60% suite à l’étape de décoloration de la

bière (Figure 4.8a). L'activité antioxydante totale suit la même tendance, puisqu’elle diminue de 67%
(Figure 4.8b). La décoloration de la bière par le charbon actif KB-WJ entraîne donc une perte des
composés phénoliques de la bière et de l’activité antioxydante correspondante. Il s’agit à notre
connaissance de la première étude rapportant l’effet de la décoloration au charbon actif sur
l’activité antioxydante de la bière. En effet, bien que des études (brevets) aient été publiées
concernant d’une part la décoloration de la bière, et d’autre part l’adsorption des polyphénols par le
charbon actif, il n’y a pas eu d’études préalables sur l’effet de la décoloration par le charbon actif sur
les composés phénoliques et l’activité antioxydante de la bière.
112
3.2.2 Coloration des bières
Après l’étude de l’effet de la décoloration sur les composés polyphénoliques de la bière, les
travaux se sont poursuivis par le développement de bières aux couleurs vives. Des expériences de
coloration ont donc été réalisées sur des moûts fermentés, puis clarifiés (décoloré au charbon actif)
en utilisant des colorants issus d’extraits alimentaires, tels que le rouge de betterave, la
chlorophylle, le lycopène et les anthocyanes de chou rouge (Figure 4.9).
Figure 4.9 : Gamme de couleurs obtenues pour la bière et la bière décolorée.
La comparaison de la couleur de la bière avant et après décoloration montre que celle-ci passe
du jaune foncé avant décoloration au transparent après décoloration (Figure 4.10a). L’ajout de
chlorophylle donne une couleur verte aux deux bières, mais la bière décolorée est beaucoup plus
claire que la bière témoin qui est vert foncé (Figure 4.10b). L’ajout de lycopène, à une concentration
plus faible (100 mg/L) que celle de la chlorophylle afin de pouvoir dissoudre correctement ce
colorant, donne une couleur légèrement rosée à la bière décolorée alors que la bière non décolorée
n’est pas différente du témoin sans colorant (Figure 4.10c). L’ajout de poudre de betterave donne
113
une couleur rose à la bière décolorée par rapport à la bière non décolorée qui est rouge (Figure
4.10d).
Figure 4.10 : Couleur de la bière (1) et de la bière décolorée (2) en absence de colorant (a), en
présence de chlorophylle à 500 mg/L (b), de lycopène à 100 mg/L (c) et de poudre de betterave à
500 mg/L (d).
Pour valider la différence de couleur entre deux bières, le système des couleurs L*a*b* (aussi
appelé CIELAB) a été utilisé. Ce système, l’un des plus employés actuellement, permet de corréler la
distance entre deux points (deux couleurs) à la différence de couleur telle qu’elle est perçue. La
composante chromatique L* y représente la clarté (indice de luminosité relatif allant de 0 pour le
noir à 100 pour le blanc absolu), a* représente la composante chromatique rouge-vert (rouge, valeur
positive ; vert, valeur négative ; gris, 0) et b* représente la composante chromatique jaune-bleu
(jaune, valeur positive ; bleu, valeur négative ; gris, 0). Le point situé au centre du diagramme est
achromatique (c'est à dire de couleur blanche) et quand les valeurs a* et b* augmentent, le point
considéré s'éloigne du centre du disque et la saturation de la couleur correspondante augmente.
La différence de l’indice de luminosité ΔL* entre la bière et la bière décolorée est négative (-
4), ce qui indique que la bière est plus foncée que la bière décolorée (Tableau 4.4). La différence de
composante chromatique rouge-vert Δa* est négative (-4), celle de la composante chromatique
jaune-bleu Δb* est positive (19) et permet de confirmer la couleur jaune de la bière par rapport à la
bière décolorée.
114
Tableau 4.4 : Coordonnées L*a*b* de la bière avant et après décoloration en fonction des différents
colorants ajoutés.
Bière Différence entre la bière et la

Colorant Bière
décolorée bière décolorée
L* 96 100 Δ L* -4
Sans colorant a* -4 0 Δ a* -4
b* 21 2 Δ b* 19
L* 96 98 Δ L* -2
Chlorophylle (500 mg/L) a* -15 -15 Δ a* 0
b* 14 13 Δ b* 2
L* 94 94 Δ L* 0
Lycopène (100mg/L) a* 2 1 Δ a* 0
b* 4 3 Δ b* 0
L* 93 100 Δ L* -7
Betterave (500 mg/L) a* 18 19 Δ a* -1
b* -6 -6 Δ b* 0
La différence de luminosité des bières colorées à la chlorophylle, déjà bien visible à l’œil nu est
confirmée par le ΔL* négatif (-2) (Tableau 4.4). L’indice de luminosité L* de la bière est égal à celui
de la bière décolorée en présence de lycopène (Tableau 4.4) et les composantes chromatiques
rouge-vert a* et jaune-bleu b* sont positives pour les deux bières et supérieures pour la bière par
rapport à la bière décolorée. Ces résultats indiquent que la bière est plus rouge et plus jaune que la
bière décolorée. La différence de luminosité des bières colorées à la poudre de betterave est
confirmée par le ΔL* négatif (-7), la couleur rouge de la bière par rapport à la bière décolorée est
confirmée par le Δa* négatif (Tableau 4.4). La décoloration de la bière avant l’ajout de différents
colorants permet donc d’obtenir un produit généralement plus clair avec des couleurs plus vives.
Des expériences de coloration ont également été menées sur de la bière, décolorée ou non,
en utilisant des colorants naturels pouvant présenter un virage de coloration dans les plages de pH
de la bière. En effet, l’acidification de la bière par addition d’acide citrique (jus de citron) pourrait
entraîner une modification immédiate de la couleur à l’ajout d’une rondelle de citron dans la bière
colorée. Afin de mesurer l’impact réel de l’acide citrique sur le pH de la bière, des volumes de 1 à 5
mL de jus de citron (on estime le volume du jus d’un citron à 35 mL et celui d’une rondelle à 5 mL)
ont été ajoutés à 25 cL de bière à température ambiante. Le pH mesuré du jus est de 2,3 et la
variation de pH n’est que de 0,7 unité pour 5 mL de jus de citron ajouté (Tableau 4.5).
115
Tableau 4.5 : pH de 25 cL de bière en fonction du volume de jus de citron ajouté.
Volume du jus de citron (pH=2,3) (mL) 0 1 2 3 4 5
pH de la bière 4,32 4,15 3,99 3,88 3,69 3,63
En considérant les valeurs de pH de la bière après acidification, on peut estimer que la zone de
virage des colorants qui seront testés doit être comprise entre 4,5 et 3,5. Parmi les colorants
alimentaires naturels, l’acide carminique (E120) et la poudre de chou rouge (mélanges non purifiés
d’anthocyanes) (E163) sont des cibles intéressantes pour essayer d’obtenir un changement de
couleur en fonction du pH. Les résultats obtenus avec ces deux colorants indiquent que le virage de
couleur de l’acide carminique est plus visible que celui des anthocyanes (Figure 4.11). Toutefois,
pour les deux colorants, la zone de virage se situe entre les pH 6,4 et 4,4, c'est-à-dire dans une plage
trop élevée pour être exploitée facilement dans la bière.
Figure 4.11 : Coloration en fonction du pH de l’acide carminique (a) et d’anthocyanes issus de la

poudre de chou rouge (b).
Des expériences de coloration ont néanmoins été faites sur de la bière, décolorée ou non, en
utilisant l’acide carminique et la poudre de chou rouge dont la couleur peut varier en fonction du
pH. L’acide carminique a été ajouté à la bière et à la bière décolorée à une concentration de 10 mg/L
afin de pouvoir corréler les résultats aux expériences précédentes (Figure 4.11). En présence d’acide
116
carminique, la couleur de la bière préalablement décolorée est plus claire que celle de la bière qui
est jaune-orangée foncée (Figure 4.12). Le changement de pH à pH=6,4 modifie la couleur des deux
bières en présence d’acide carminique. La couleur de la bière passe du jaune-orangé foncé (pH 4,4)
au rouge foncé (pH 6,4) (Figure 4.12), mais dans ce cas le virage de coloration est peu visible, les
pigments de la bière atténuant fortement la coloration apportée par l’acide carminique. La bière
décolorée passe du jaune-orangé (pH 4,4) au rose (pH 6,4) (Figure 4.12), le virage de couleur obtenu
est donc plus visible grâce à la décoloration de la bière.
Figure 4.12 : Coloration, en fonction du pH, de la bière (1) et de la bière décolorée (2) en présence
d’acide carminique à 10 mg/L et en présence de poudre de chou rouge à 500, 250 et 125 mg/L à pH
4,4 et 6,4.
L’ajout de poudre de chou rouge à 500, 250 et 125 mg/L a permis d’obtenir un dégradé de
couleurs qui varie du rose foncé au rose clair pour la bière décolorée et du rouge foncé au rouge
clair pour la bière (Figure 4.12). Le changement de pH à pH=6,4 modifie la couleur des deux bières
en présence de poudre de chou rouge. La bière décolorée passe du rose (pH 4,4) au bleu-violet (pH
6,4) et la bière passe du rouge (pH 4,4) au marron (pH 6,4). Le virage de couleur est beaucoup plus
visible dans le cas de la bière décolorée, car les pigments de la bière atténuent fortement la
117
coloration apportée par la poudre de chou rouge (Figure 4.12). Ainsi, l’ajout de poudre de chou
rouge à pH 6,4 permet d’obtenir un dégradé de couleurs qui varient, du bleu-violet foncé au violet
clair pour la bière décolorée et du marron foncé au marron clair pour la bière (Figure 4.12).
La différence de luminosité des bières en présence d’acide carminique à pH 4,4 est confirmée
par le ΔL* négatif (-1) (Tableau 4.6). La composante chromatique rouge-vert a* est positive pour les
deux bières, mais supérieure pour la bière par rapport à la bière décolorée (9 > 8) ; et la composante
chromatique jaune-bleu b* est positive pour les deux bières, mais inférieure pour la bière par
rapport à la bière décolorée (10 < 12). La bière décolorée est donc plus claire que la bière en
présence d’acide carminique, moins rouge et plus jaune. La composante b* est négative pour les
deux bières, mais elle est légèrement supérieure pour la bière par rapport à la bière décolorée (-6 > -
7) en présence d’acide carminique à pH 6,4 (Tableau 4.6). La bière décolorée est donc moins jaune
que la bière non décolorée.
A pH 4,4, pour les trois concentrations de poudre de chou rouge testées, le ΔL* est nul ou
négatif (0, -6, -6), le Δa* est négatif (-13, -6, -6) et le Δb* est positif (1, 0, 1) (Tableau 4.6), ce qui
confirme que la bière décolorée en présence de poudre de chou rouge est plus claire, plus rouge et
moins jaune que la bière. A pH 6,4, le ΔL* est négatif (-5, -8, -8), le Δa* est en moyenne nul et le Δb*
est positif (7, 3, 4), ce qui confirme que la bière décolorée en présence de poudre de chou rouge est
plus claire et plus bleue que la bière (Tableau 4.6).
118
Tableau 4.6 : Coordonnées L*a*b* de la bière avant et après décoloration en fonction des différents
colorants ajoutés et du pH.
Bière Différence entre la bière et

Colorant Bière
décolorée la bière décolorée
L* 94 96 Δ L* -1
Acide carminique (10 mg/L + pH 4,4) a* 9 8 Δ a* 1
b* 10 12 Δ b* -2
L* 86 87 Δ L* 0
Acide carminique (10 mg/L + pH 6,4) a* 17 17 Δ a* 0
b* -6 -7 Δ b* 1
L* 81 80 Δ L* 0
Chou rouge (500 mg/L + pH 4,4) a* 31 44 Δ a* -13
b* -18 -20 Δ b* 1
L* 75 79 Δ L* -5
Chou rouge (500 mg/L + pH 6,4) a* -9 -8 Δ a* -2
b* -17 -24 Δ b* 7
L* 91 98 Δ L* -6
b* -11 -11 Δ b* 0
L* 88 96 Δ L* -8
Chou rouge (250 mg/L + pH 6,4) a* 3 1 Δ a* 2
b* -10 -13 Δ b* 3
L* 98 104 Δ L* -6
b* -5 -6 Δ b* 1
L* 96 104 Δ L* -8
Chou rouge (125 mg/L + pH 6,4) a* 1 1 Δ a* 0
b* -3 -7 Δ b* 4
119
4 Conclusion
Le premier objectif de cette partie du travail était d’appliquer l’extraction et la méthode LC-
AOx à l’étude des composés antioxydants au cours du procédé de fabrication de la bière. Cette
méthode, plus spécifique que l’HPLC classique, est destinée non seulement à séparer les composés
phénoliques, mais aussi à déterminer leur activité antioxydante. En mettant l’accent sur cette
dernière plutôt que sur la réponse des molécules au détecteur utilisé, il est ainsi possible de révéler
plus facilement et plus rapidement des composés ayant un intérêt antioxydant.
En comparant les différents extraits d’orge, de malt, de moût et de bière, on a pu constater

que les profils chromatographiques de l'activité antioxydante sont assez similaires à toutes les
étapes, sauf à la suite du maltage. La contribution antioxydante la plus importante provient de la
prodelphinidine B3, de la procyanidine B3, de la catéchine, des acides férulique et sinapique, et d’un
composé non identifié (composé 1). Ces six composés représentent en moyenne 69±8% de l'activité
antioxydante totale sur l’ensemble des étapes de fabrication de la bière. Exception faite du malt, où
elles ne sont pas détectées, la catéchine, la prodelphinidine B3 et la procyanidine B3 représentent
quant à elles 45±13% de l'activité antioxydante totale.
Le second objectif était d’appliquer la même méthode à l’étude de la bière décolorée. Nous
avons montré que l’utilisation du charbon actif KB-WJ permettait d’adsorber les composés
phénoliques de la bière, ce qui, bien sûr, a une incidence sur l’intérêt santé de la bière puisque
l’activité antioxydante de ces composés est perdue. Cependant, cette utilisation, dont le but premier
est de décolorer, permet d’éliminer les pigments de la bière qui atténuant l’effet d’une coloration
apportée par l’ajout de colorants, réduisent fortement les possibilités d’innovation par les brasseurs.
Les résultats obtenus ont montré que, contrairement aux bières non décolorées, les bières
préalablement décolorées ont permis d’obtenir par recoloration des produits aux couleurs vives et
variées telles que le rose, le vert ou le bleu. Un nouveau panel de couleurs est donc envisageable
pour l’industrie de la bière et des boissons maltées.
120
Publication
121
ARTICLE
pubs.acs.org/JAFC
Effects of Processing Steps on the Phenolic Content and

Antioxidant Activity of Beer
Celine Leitao,†,§ Eric Marchioni,*,† Martine Bergaentzle,† Minjie Zhao,† Luc Didierjean,§
Behnam Taidi,§ and Saïd Ennahar†
†
Equipe de Chimie Analytique des Molecules BioActives, UMR 7178 - Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien
Universite de Strasbourg - Faculte de Pharmacie, 74 route du Rhin, 67400 Illkirch, France
§
Carlsberg Group, Brasseries Kronenbourg, 68 route d’Oberhausbergen, B.P. 13, 67037 Strasbourg Cedex 2, France
ABSTRACT: A new analytical method (liquid chromatography-antioxidant, LC-AOx) was used that is intended to separate beer
polyphenols and to determine the potential antioxidant activity of these constituents after they were allowed to react online with a
buffered solution of the radical cation 2,20 -azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•þ). Using the LC-AOx method,
it was possible to demonstrate that the extent of the antioxidant activity was very much dependent on the phenolic compound
considered. The method was also applied to the analysis of beer extracts and allowed the evaluation of their antioxidant activity at
different steps of beer processing: brewing, boiling, and fermentation. This study showed that the total antioxidant activity remained
unchanged throughout beer processing, as opposed to the polyphenolic content, which showed a 3-fold increase. Hopping and
fermentation steps were the main causes of this increase. However, the increase measured after fermentation was attributed to a
better extraction of polyphenols due to the presence of ethanol, rather than to a real increase in their content. Moreover, this method
allowed the detection of three unknown antioxidant compounds, which accounted for 64 ( 4% of the total antioxidant activity of
beer and were individually more efficient than caffeic acid and epicatechin.
KEYWORDS: Beer, polyphenol, liquid chromatography, antioxidant activity, ABTS
’ INTRODUCTION available, the antioxidant activity of the analyzed compounds,

Plant-based diets rich in fruits and vegetables are associated with a which varies as a function of their chemical structures, is often
reduced risk of chronic diseases including coronary heart disease and overlooked. Given that not all polyphenols present an anti-
some cancers.1 Plant foods contain numerous molecules that, by oxidant activity and that some are more active than others,6
acting through various mechanisms, provide protection against such inconsistencies regarding the actual interest of many polyphenols
diseases. Among these molecules, attention is particularly directed and their nutritional allegations are widespread in scientific docu-
toward phenolic compounds with antioxidant activity. Polyphenols ments. Furthermore, studies of the antioxidant activity of natural
are present not only in fruits and vegetables but also in cereal crops, extracts show that known antioxidants account for only a fraction of
such as barley and its products, which are the focus of increasing the total activity and that a large part of biologically important
interest due to their high content in phenolic acids (e.g. benzoic and compounds is still unknown.7 This shows the need for a more
cinnamic acid derivatives), proanthocyanidins, tannins, flavonols, pragmatic alternative that would focus on detecting and quantitating
chalcones, flavones, flavanones, and amino phenolic compounds.2 the biological activity, rather than the molecule itself.
Barley is among the most ancient and most widely consumed cereal In the past 10 years, several sensitive postcolumn HPLC
crops, mainly (80-90%) destined to animal feed and malt produc- methods (liquid chromatography-antioxidant, LC-AOx) for
tion.3 Even after malting, barley seems to retain high amounts of the analysis of the antioxidant activity have been published.8-10
phenolic compounds and an associated antioxidant potential.4,5 One of these methods requires a stable model free radical system,
Phenolic compounds constitute the main class of natural anti- such as the 2,20 -azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
oxidants present in plant foods and may function as reducing agents, radical cation (ABTS•þ), the absorbance of which at 734 nm
free radical scavengers, singlet oxygen quenchers, and potential com- decreases upon reaction with a reducing agent.8,11 This reaction
plexers of prooxidants. They also confer protection against biologi- is associated with the ability of the molecule of interest to trap
cal macromolecular damage, significantly prevent the decrease of radicals and in turn with its biological activity. The radical scavenging
antioxidant enzyme activity in the aging brain and liver, decrease activity is generally assessed against a standard antioxidant, such as
brain and liver malondialdehyde level and carbonyl content, and the water-soluble synthetic vitamin E derivative 6-hydroxy-2,5,7,8-
improve the total antioxidant capability in the organism.4 tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox).12,13 This online
Phenolic and polyphenolic compounds are usually investi-
gated by liquid chromatography coupled with detection by Received: October 19, 2010
absorption photometry, due to the presence of chromophores Accepted: December 23, 2010
in their structures. Although this allows a fairly good quantitative Revised: December 19, 2010
assessment of the compounds, when chemical standards are Published: January 24, 2011
r 2011 American Chemical Society 1249 dx.doi.org/10.1021/jf104094c | J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 1249–1255
Journal of Agricultural and Food Chemistry ARTICLE
Figure 1. Chromatographic separation and detection of phenolic compounds: (a) experimental chart; (b) polyphenol standards at 30 μg/mL in
methanol/water (50:50, v/v); (c) their corresponding antioxidant activity. Peaks: 1, gallic acid; 2, protocatechuic acid; 3, p-hydroxybenzoic acid;
4, catechin; 5, chlorogenic acid; 6, vanillic acid; 7, caffeic acid; 8, epicatechin; 9, p-coumaric acid; 10, ferulic acid; 11, sinapic acid; 12, m-coumaric acid; 13,
o-coumaric acid.
assessment of antioxidant activity allows complex mixtures to be p-hydroxybenzoic acid, chlorogenic acid, 4-hydroxycinnamic acid (p-cou-
separated by HPLC and the antioxidant contribution of indivi- maric acid), sinapic acid, m-coumaric acid, o-coumaric acid, catechin, and
dual components to be separately evaluated.12 In addition, the epicatechin were purchased from Sigma-Aldrich (Seelze, Germany). All
detection of unknown molecules with antioxidant activities in chemicals and solvents used were of HPLC grade and were purchased from
such mixtures will be made much easier. VWR (Strasbourg, France). Ultrapure water was produced by a Synergy UV
In the present study, ethyl acetate extracts of beer at different purification system (Millipore, Molsheim, France). Barley was of the
stages of its processing were analyzed for their content in antioxidant Sunshine variety and was malted, brewed, and fermented by Brasseries
compounds using an HPLC system linked to an ABTS•þ-based Kronenbourg (Strasbourg, France). Hop was purchased from Yakima
postcolumn antioxidant detection system (LC-AOx). Zhao et al. Chief, Inc. (Sunnyside, WA) in the form of a resinous phase of R-acids,
showed that the brewing process might have a considerable impact β-acids, oils, and uncharacterized resins produced by CO2 supercritical
on the ABTS radical cation scavenging activity of beer. 14 The extraction and used as a bittering extract added at the final brewing step.
purpose was to directly investigate the effect of the various Stock and Working Solutions. A stable stock solution of
processing steps on both the content and the antioxidant activity ABTS•þ was produced by mixing a 7 mmol L-1 aqueous solution of
of beer phenolic compounds. ABTS with a 2.5 mmol L-1 solution of potassium persulfate (final
concentration) and allowing the mixture to stand in the dark at 4 °C
’ MATERIALS AND METHODS overnight.8,9 Before use, an ABTS•þ working solution was obtained by
diluting the stock solution in ethanol to reach an absorbance of 0.70
Chemicals and Products. ABTS•þ, Trolox, 4-hydroxy-3-methox- ((0.02) AU at 734 nm. Stock solutions of phenolic standards were
ycinnamic acid (ferulic acid), 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid), prepared by dissolving the compounds in methanol (1 mg/mL) and
3,4,5-trihydroxybenzoic acid (gallic acid), 4-hydroxy-3-methoxybenzoic were then stored in the dark at -20 °C. Before use, working solutions
acid (vanillic acid), 3,4-dihydroxybenzoic acid (protocatechuic acid), were prepared by diluting the stock solutions in methanol/water (50:50, v/v).
1250 dx.doi.org/10.1021/jf104094c |J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 1249–1255

Table 1. Quantification Limits of Some Phenolic Table 2. Average Recovery Rates of the Studied Compounds
Compounds in Methanol/Water (50:50, v/v) for the in Wort (Recovery Rates from Six Ethyl Acetate Extractions
LC-UV and the LC-AOx Detection Methods in LC-UV)
quantification limit (pmol) phenolic compound recovery rate (%)
phenolic compound LC-UV LC-AOx gallic acid 93 ( 16

protocatechuic acid 64 ( 9
gallic acid 94 59 p-hydroxybenzoic acid 83 ( 10
protocatechuic acid 10 779 catechin 75 ( 5
p-hydroxybenzoic acid 29 -a chlorogenic acid 51 ( 6
catechin 54 103 vanillic acid 94 ( 7
chlorogenic acid 2 141 caffeic acid 73 ( 5
vanillic acid 15 - epicatechin 49 ( 10
caffeic acid 4 167 p-coumaric acid 73 ( 10
epicatechin 541 54 ferulic acid 87 ( 5
p-coumaric acid 190 - sinapic acid 79 ( 16
ferulic acid 7 2575 m-coumaric acid 125 ( 6
sinapic acid 14 268 o-coumaric acid 88 ( 9
m-coumaric acid 98 -
o-coumaric acid 39 - ABTS•þ reduction was carried out at 412 nm. Separations were carried
a
-, no antioxidant activity. out at room temperature on a Hypersil BDS C18 HPLC column (5 μm
particle size, 250 4.6 mm i.d., Fisher Scientific, Illkirch, France). The
Sampling and Extraction at Different Stages of Beer mobile phase, delivered at 1 mL/min, consisted of a gradient mixture of
Processing. Malt was brewed with water to obtain wort (13 °Plato) water containing 0.1% formic acid (eluent A) and methanol (eluent B).
under the following brewing diagram: 0-20 min, 37 °C; 20-34 min, The following gradient was used: 0-25 min, 3-25% B; 25-26 min,
37-50 °C; 34-44 min, 50 °C; 44-59 min, 50-65 °C; 59-69 min, 25-18% B; 26-29 min, 18% B; 29-47 min, 18-30% B; 47-57 min,
65 °C; 69-82 min, 65-76 °C; 82-92 min, 76 °C. Wort was boiled 30% B; 57-67 min, 30-65% B; 67-77 min, 65% B. The ABTS•þ
without hop (1 h, 100 °C) to obtain boiled wort and then was fermented solution was delivered at 0.5 mL/min.
to obtain fermented boiled wort. Wort was boiled with hop (1 h, 100 °C) Calibration Graphs. Calibration graphs for each phenolic com-
to obtain boiled hopped wort and then was fermented to obtain beer. pound were drawn from data of three replicate injections of 20 μL of
Hop used was resinous extracts obtained by CO2 supercritical extraction, standard mixtures obtained by dilution (methanol/water (50:50, v/v))
and even if it contains no polyphenols, it is the most commonly used at various levels of the stock standard solutions. The curves (six data
ingredient added in wort by industrial brewers. points, n = 3) were linear with R2 values of >0.99. Each phenolic
Extraction of Phenolic Compounds. Phenolic compounds compound was quantified by reference to its appropriate authentic
were extracted after each previous production step. Sample solutions standard for UV detection, whereas the antioxidant potential was
(10 mL) were first set at pH 2.0 by the addition of HCl (37%), and then calculated as the concentration of Trolox required to produce an
0.5 g of sodium chloride was added. Extraction was carried out in 50 mL equivalent peak area and expressed as Trolox equivalent (μM).
Corning centrifuge tubes with 10 mL of ethyl acetate (three times, for Quantification Limits. The quantification limits were estimated
periods of 15 min) on a gyratory shaker at 200 rpm.5,15 The obtained following successive dilutions of standards and considering a signal-to-
phenolic extract was centrifuged (5000 rpm, 10 min), and supernatant noise ratio of 10 (Table 1). The precision and trueness of the method
was evaporated to dryness under vacuum (30 °C, 80 mbar). The residue were determined on the basis of the coefficient of variation and the
was dissolved in 1 mL of methanol/water (50:50, v/v), membrane- recovery (found concentration/expected concentration) calculated from
filtered (0.45 μm, Macherey-Nagel, Hoerdt, France), and injected three successive injections. Quantification limits were acceptable only if the
(20 μL) in the chromatographic system. coefficient of variation was <10% and the recovery about 100 ( 5%.
Recovery Rates. The recovery rates of the extraction method were Statistical Analysis. Data were analyzed by ANOVA (at a sig-
determined by comparison of data obtained from wort extract and data nificance level of 95%) using Statgraphics Plus software. All samples
obtained from the same extract with preliminary addition of phenolic were analyzed in triplicate.
standard compounds. These compounds were added to wort at two
different concentrations for each compound. The range of values was ’ RESULTS AND DISCUSSION
from 7 to 200 μM. These concentrations were representative of values of
each compound obtained in extracts at different processing steps. The
Separation and Identification of Antioxidant Products.
average recovery rates were calculated. HPLC separation of phenolic compounds from complex natural
HPLC Analysis. HPLC coupled with ABTS (LC-AOx) assay was mixtures usually requires a long linear elution gradient. Because
performed by using the method developed by Koleva et al.8 and beer extracts are rich in phenolic compounds, the separation was
Dapkevicius et al.9 with slight modifications. The block scheme of the first performed on standards to try to separate them with the
instrumental setup is presented in Figure 1a. The HPLC system highest resolution possible. The used gradient, which started
(Waters, Saint-Quentin-Fallavier, France) consisted of the following: from 3% with an increase of 0.88%/min of methanol, did not
a 616 controller; a 2996 photodiode array detector to UV detection; a allow a good separation of vanillic and caffeic acids. The
486 tunable absorbance detector to ABTS•þ detection; a 717 plus methanol content was then decreased before being increased
autosampler; and an additional HPLC pump used for the delivery of the again toward the end of the separation, which allowed a much
ABTS•þ solution. The reaction coil used was made of PEEK tubing of better separation of the two compounds at 30 μg/mL each
7 m 0.5 mm i.d. UV detection was carried out at 254 nm. Detection of (Figure 1b).
Figure 2. Chromatographic determination of antioxidant compounds (upper chromatogram) and their corresponding antioxidant activity (lower
chromatogram) in extracts of (a) wort, (b) boiled wort, (c) boiled hopped wort, (d) fermented boiled wort, and (e) beer. Peaks: a-e and g, unknown
compounds; 2, protocatechuic acid; 3, p-hydroxybenzoic acid; 4, catechin; 5, chlorogenic acid; 6, vanillic acid; 7, caffeic acid; 8, epicatechin; 9, p-coumaric
acid; 10, ferulic acid; 11, sinapic acid; 12, m-coumaric acid.
Conventional methods for identifying antioxidant com- extract were mixed online with a stabilized solution of the
pounds in complex mixtures typically involve time-consuming ABTS•þ radical, which was directed to a UV-vis detector.
assay-guided fractionation procedures, followed by identifica- Beekwilder et al.13 detected ABTS•þ at 734 nm because of
tion of the purified compounds. The system described here chromatographic interferences. In this work the detector was
(LC-AOx) is meant to screen for compounds with antioxidant set at 412 nm because it is the wavelength of maximum
activity in natural extracts in a more direct and rapid fashion. absorption of the ABTS cation. The presence of antioxidants,
Following chromatographic separation, compounds of an acting as radical scavengers, results in a reaction with ABTS•þ
and a subsequent decrease in absorption detected as a negative

peak at 412 nm.
Antioxidant compounds, even at low concentrations, could
be quantified. The quantification limits with LC-UV detection
varied from 2 pmol for chlorogenic acid to 541 pmol for
epicatechin (Table 1). This high limit of quantification for
epicatechin, compared with other compounds, was due to a high
coefficient of variation at lower concentrations probably because
it was monitored at 254 nm, which is not its optimal detection
wavelength (280 nm). The quantification limits with LC-AOx
detection varied from 54 pmol for epicatechin to 2575 pmol
for ferulic acid (Table 1). The LC-UV detection was generally
more sensitive than this of LC-AOx except for gallic acid and
epicatechin. Figure 3. Total antioxidant activity at different steps of beer processing:
Panels b and c of Figure 1 show chromatograms obtained with wort extract, boiled hopped wort extract, and beer extract correspond to
a standard mixture of phenolic compounds (30 μg/mL each) and normal process; boiled wort extract and fermented boiled wort extract
their corresponding antioxidant activity. The upper part was correspond to process excluding the hopping steps.
obtained with direct UV detection at 254 nm, whereas the lower
part was obtained with visible detection at 412 nm after post- Analysis of Beer Processing Compounds. The LC-AOx
column reaction. The combination of a delay coil of 7 m length, method was applied to the separation and the evaluation of the
0.5 mm internal diameter, with a flow rate of 0.5 mL/min gave a antioxidant activity of compounds from extracts at different steps
reaction time of about 1 min. This delay along with the passage of beer processing: brewing, boiling, and fermentation. This
through the coil explains the shift in retention time and the wider allowed the direct monitoring of the antioxidant activity of
peaks obtained in the bottom chromatogram; however, it was polyphenolic fractions separated from extracts of wort, boiled
necessary, in these conditions, to achieve a complete reaction wort, boiled hopped wort, fermented boiled wort, and beer.
with all antioxidants.15 Using this method, standard phenolic Wort, boiled hopped wort, and beer represented the normal
compounds tested did not show equal antioxidant activities; in processing of beer, whereas boiled wort and fermented boiled
particular, p-hydroxybenzoic, vanillic, p-coumaric, m-coumaric, wort represented a process that would exclude the hopping step.
and o-coumaric acids showed no antioxidant activity at all or had Figure 2 shows chromatograms obtained with ethyl acetate
an antioxidant activity too small to be detected with the LC-AOx. extracts of wort (a), boiled wort (b), boiled hopped wort
Among the active compounds, the relative antioxidant activity of (c), fermented boiled wort (d), and beer (e). The UV absorption
these compounds was as follows: gallic acid > epicatechin > chromatograms between wort (Figure 2a), boiled wort (Figure 2b),
caffeic acid > catechin > sinapic acid > chlorogenic acid > and fermented boiled wort (Figure 2d) were quite similar. With
protocatechuic acid > ferulic acid. This is in agreement with boiled hopped wort (Figure 2c) four peaks seemed in higher
results obtained by Kim et al., who, using the same radical, concentration than in the other profiles: b (12.5 min), c (13.8
showed the following antioxidant activity order: gallic acid > min), d (14.2 min), and e (15.5 min). With beer (Figure 2e), the
epicatechin > catechin > chlorogenic acid.16 Gallic acid, with the same peaks were present, but peak c (13.8 min) was 3 times higher
best antioxidant response, was approximately 75 times more than the boiled hopped wort one. This increase may be linked to a
potent than ferulic acid, the least active compound. better extraction of compounds due to the presence of ethanol.
Extraction. The extraction method accuracy was validated by For each step, peak areas of chromatograms for the LC-AOx
monitoring the amount of phenolic compounds extracted over detection system were summed and represented as average ( SD
three consecutive extractions of wort. Concentrations of ex- from triplicates of three determinations (Figure 3). The total
tracted phenolic compounds were given as mean ( standard antioxidant activity results were expressed as Trolox equivalent
deviation (SD) from at least three determinations (n g 3). (μM). It was affected neither by the brewing process nor by the
Except with protocatechuic acid, chlorogenic acid, and epicate- fermentation process, because there was no significant difference
chin, for which recovery rates did not exceed 64 ( 9, 51 ( 6, and (p > 0.05) between the different steps (Figure 3). The anti-
49 ( 10%, respectively, three successive extractions were enough oxidant activity profiles were quite similar for all chromatograms.
to obtain recovery rates above 75% (Table 2). Even if the With boiled hopped wort (Figure 2c) and beer (Figure 2e), the
liquid-liquid extraction with ethyl acetate did not allow a good first antioxidant activity peak at 11 min (first arrow) was in a little
extraction of each individual compound, 75% seems to be quite a bit higher concentration and a peak emerged at 14.9 min (second
good result for a multicompound extraction process. Today, this arrow). This peak corresponds to the one at 13.8 min in LC-UV
method remains the most widely used method for the extraction profiles. These differences between chromatograms may be due to
of polyphenols,5,17-19 even if the extraction procedure is the increased content of natural compounds due to the depoly-
classical. Although we tested other methods, such as solid- merization of antioxidant compounds during the process. It might
phase extraction on wort, the results were less satisfactory when not be due to the appearance of new polyphenols due to hop
the whole range of compounds was considered (data not addition or fermentation. Indeed, hop extract was produced by CO2
shown).20 In view of the various compounds in the different supercritical extraction. Because CO2 is nonpolar, it is not a good
extracts of beer, there were a lot of unknown compounds solvent for polar polyphenols.21 Moreover, hop extract did not show
without data of recovery rate. Therefore, the recovery rate polyphenol content with LC-AOx method (data not shown).
correction was not applied to the extraction method data. The Among the polyphenols with antioxidant activity, seven
recovery rate measurement was used to highlight the extraction compounds could be identified using chromatographic standards:
method efficiency. protocatechuic acid (2), catechin (4), chlorogenic acid (5),
Table 3. Content and Antioxidant Activity of Antioxidant Compounds in Extracts at Different Stages of Beer Processing (n = 9)
fermented boiled wort

wort extract boiled wort extract boiled hopped wort extract extract beer extract
LC-UV LC-AOx LC-UV LC-AOx LC-UV LC-AOx LC-UV LC-AOx LC-UV LC-AOx
concn Trolox equiv concn Trolox equiv concn Trolox equiv concn Trolox equiv concn Trolox equiv
(μM) (μM) (μM) (μM) (μM) (μM) (μM) (μM) (μM) (μM)
a, unknown nq a
24 ( 10 nq 32 ( 8 nq 53 ( 10 nq 45 ( 12 nq 60 ( 12
b, unknown nq 8(4 nq 1(0 nq 4(0 nq 8(4 nq 8(1
c, unknown nq 5(0 nq 7(5 nq 12 ( 3 nq 8(1 nq 5(0
d, unknown nq 49 ( 34 nq 73 ( 46 nq 35 ( 18 nq 58 ( 30 nq 15 ( 7
e, unknown nq 8(5 nq 22 ( 3 nq 10 ( 4 nq 10 ( 4 nq 20 ( 13
protocatechuic acid 21 ( 10 6(2 7(3 3(1 17 ( 7 11 ( 5 9(4 11 ( 3 27 ( 13 10 ( 5
f, unknown nq 8(3 nq 8(8 nq 9(0 nq 6(1 nq 11 ( 8
g, unknown nq 74 ( 51 nq 113 ( 76 nq 58 ( 40 nq 74 ( 38 nq 22 ( 17
h, unknown nq 5(3 ndb nd nq 7(0 nq 4(0 nd nd
p-hydroxybenzoic acid 8(2 -c 11 ( 3 - 7(3 - 38 ( 15 - 18 ( 2 -
i, unknown nq 5(3 nd nd nd nd nd nd nd nd
catechin 35 ( 18 38 ( 19 37 ( 18 47 ( 23 33 ( 10 44 ( 31 29 ( 12 43 ( 13 38 ( 21 32 ( 19
chlorogenic acid 4(2 5(3 5(1 nd 6(3 9(1 13 ( 12 10 ( 0 11 ( 2 nd
vanillic acid 16 ( 10 - 19 ( 3 - 17 ( 7 - 34 ( 13 - 33 ( 5 -
caffeic acid 13 ( 5 15 ( 1 13 ( 3 17 ( 6 12 ( 4 15 ( 2 13 ( 5 14 ( 8 10 ( 6 11 ( 7
j, unknown nq 8 nq 13 ( 2 nq 10 ( 2 nq 14 ( 6 nq 11 ( 5
epicatechin 35 ( 19 2(1 nd nd 14 ( 9 13 ( 1 49 ( 0 11 ( 0 19 ( 7 23 ( 3
k, unknown nd nd nd nd nq 13 ( 7 nq 17 ( 2 nd nd
l, unknown nd nd nd nd nq 16 ( 0 nd nd nd nd
p-coumaric acid 70 ( 31 - 84 ( 26 - 322 ( 86 - 45 ( 23 - 60 ( 12 -
m, unknown nq 3(1 nq 9(0 nq 9(2 nq 5(1 nq 17 ( 9
ferulic acid 129 ( 52 8(5 133 ( 23 11 ( 5 118 ( 49 9(2 115 ( 49 12 ( 1 114 ( 11 11 ( 6
sinapic acid 18 ( 7 15 ( 8 22 ( 3 21 ( 6 28 ( 10 20 ( 4 10 ( 4 21 ( 7 11 ( 2 16 ( 9
m-coumaric acid 7(5 - 12 ( 5 - 6(2 - 11 ( 5 - 14 ( 9 -
n, unknown nq 5(1 nq 10 ( 6 nq 7(3 nq 10 ( 4 nq 10 ( 8
o, unknown nq 7(2 nq 10 ( 6 nq 8(4 nq 9(4 nq 12 ( 4
a
nq, not quantified (no standards). b nd, not detected. c -, no antioxidant activity.
caffeic acid (7), epicatechin (8), ferulic acid (10), and sinapic to determine their potential functional interest, namely, their
acid (11). The largest antioxidant contribution came from antioxidant activity. Unknown antioxidant compounds could
catechin, caffeic acid, ferulic acid, sinapic acid, and three other be detected, which accounted for the larger part of the anti-
compounds (a, d, and g), which could not be identified using oxidant activity of the extracts. Work is underway to identify
chromatographic standards (Table 3). The total antioxidant these unknown compounds.
activity of each extract was measured, and these three com-
pounds, present in all extracts, accounted for 64 ( 4% of the ’ AUTHOR INFORMATION
total. Catechin was important to beer antioxidant activity because
it made considerable contributions to the antioxidant activity of Corresponding Author
beer. Compounds with flavonoid structure such as catechin *Phone: þ33 368 854 326. Fax: þ33 368 854 325. E-mail: eric.
generally showed higher antioxidant activity than nonflavo- marchioni@unistra.fr.
noid compounds.14 Whittle et al. reported the general ob-
servation that the higher the content of gallocatechin in ’ REFERENCES
gallocatechin polymers is, the earlier the compounds elute.22 (1) Duthie, G. G.; Duthie, S. J.; Kyle, J. A. M. Plant polyphenols in
Due to the high antioxidant activity of compounds a, d, and g, cancer and heart disease: implications as nutritional antioxidants. Nutr.
and on the basis of their retention times, they are probably Res. Rev. 2000, 13, 79–106.
compounds with flavanoid structure such as polymers of (2) Goupy, P.; Hugues, M.; Boivin, P.; Amiot, M. J. Antioxidant
composition and activity of barley (Hordeum vulgare) and malt extracts
gallocatechin. and of isolated phenolic compounds. J. Sci. Food Agric. 1999, 79, 1625–
The LC-AOx method was used for the determination of 1634.
phenolic compounds during beer processing. For reactive anti- (3) Liu, Q.; Yao, H. Antioxidant activities of barley seeds extracts.
oxidants, this method may prove to be more sensitive than the Food Chem. 2007, 102, 732–737.
classical HPLC with UV detection. It is also more specific because (4) Qingming, Y.; Xianhui, P.; Weibao, K.; Hong, Y.; Yidan, S.; Li, Z.;
it is intended not only to separate and detect polyphenols, but also Yanan, Z.; Yuling, Y.; Lan, D.; Guoan, L. Antioxidant activities of malt

extract from barley (Hordeum vulgare L.) toward various oxidative stress
in vitro and in vivo. Food Chem. 2010, 118, 84–89.
(5) Madhujith, T.; Shahidi, F. Antioxidative and antiproliferative
properties of selected barley (Hordeum vulgare L.) cultivars and their
potential for inhibition of low-density lipoprotein (LDL) cholesterol
oxidation. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 5018–5024.
(6) Pellegrini, N.; Del Rio, D.; Colombi, B.; Bianchi, M.; Brighenti,
F. Application of the 2,20 -azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic
acid) radical cation assay to a flow injection system for the evaluation
of antioxidant activity of some pure compounds and beverages. J. Agric.
Food Chem. 2003, 51, 260–264.
(7) Cao, G.; Booth, S. L.; Sadowski, J. A.; Prior, R. L. Increases in
human plasma antioxidant capacity after consumption of controlled
diets high in fruit and vegetables. Am. J. Clin. Nutr. 1998, 68, 1081–1087.
(8) Koleva, I. I.; Niederl€ander, H. A. G.; van Beek, T. A. Application
of ABTS radical cation for selective on-line detection of radical
scavengers in HPLC Eluates. Anal. Chem. 2001, 73, 3373–3381.
(9) Dapkevicius, A.; van Beek, T. A.; Niederl€ander, H. A. G. Evalua-
tion and comparison of two improved techniques for the on-line
detection of antioxidants in liquid chromatography eluates. J. Chro-
matogr., A 2001, 912, 73–82.
(10) Niederl€ander, H. A.; van Beek, T. A.; Bartasiute, A.; Koleva,
I. I. Antioxidant activity assays on-line with liquid chromatography.
J. Chromatogr., A 2008, 1210, 121–134.
(11) Cano, A.; Hernandez-Ruíz, J.; García-Canovas, F.; Acosta, M.;
Arnao, M. B. An end-point method for estimation of the total antioxidant
activity in plant material. Phytochem. Anal. 1998, 9, 196–202.
(12) Stewart, A. J.; Mullen, W.; Crozier, A. On-line high-perfor-
mance liquid chromatography analysis of the antioxidant activity of
phenolic compounds in green and black tea. Mol. Nutr. Food Res. 2005,
49, 52–60.
(13) Beekwilder, J.; Jonker, H.; Meesters, P.; Hall, R. D.; van der Meer,
I. M.; Ric de Vos, C. H. Antioxidants in raspberry: on-line analysis links
antioxidant activity to a diversity of individual metabolites. J. Agric. Food
Chem. 2005, 53, 3313–3320.
(14) Zhao, H.; Chen, W.; Lu, J.; Zhao, M. Phenolic profiles and
antioxidant activities of commercial beers. Food Chem. 2010, 119, 1150–
1158.
(15) Cano, A.; Alcaraz, O.; Acosta, M.; Arnao, M. B. On-line
antioxidant activity determination: comparison of hydrophilic and
lipophilic antioxidant activity using the ABTS.þ assay. Redox Rep.
2002, 7, 103–109.
(16) Kim, D.; Lee, K. W.; Lee, H. J.; Lee, C. Y. Vitamin C equivalent
antioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals. J. Agric.
Food Chem. 2002, 50, 3713–3717.
(17) Bravo, M.; Silva, S.; Coelho, A.; Vilas Boas, L.; Bronze, M.
Analysis of phenolic compounds in Muscatel wines produced in
Portugal. Anal. Chim. Acta 2006, 563, 84–92.
(18) Maillard, M.; Soum, M.; Boivin, P.; Berset, C. Antioxidant activity
of barley and malt: relationship with phenolic content. Lebensm.-Wiss.
Technol. 1996, 29, 238–244.
(19) Wang, Y.; Catana, F.; Yang, Y.; Roderick, R.; van Breemen, R. B.
An LC-MS method for analyzing total resveratrol in grape juice,
cranberry juice, and in wine. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 431–435.
(20) del A lamo, M.; Casado, L.; Hernandez, V.; Jimenez, J. J.
Determination of free molecular phenolics and catechins in wine by
solid phase extraction on polymeric cartridges and liquid chromatogra-
phy with diode array detection. J. Chromatogr., A 2004, 1049, 97–105.
(21) Adil, I. H.; C-etin, H.; Yener, M.; Bayındırlı, A. Subcritical
(carbon dioxide þ ethanol) extraction of polyphenols from apple and
peach pomaces, and determination of the antioxidant activities of the
extracts. J. Supercrit. Fluids 2007, 43, 55–63.
(22) Whittle, N.; Eldridge, H.; Bartley, J. Identification of the
polyphenols in barley and beer by HPLC/MS and HPLC/electrochemical
detection. J. Inst. Brew. 1999, 105, 89–99.

Conclusion générale
129
La bière est une boisson riche en composants nutritionnels divers comprenant sucres, acides
aminés, minéraux, vitamines et composés phénoliques. Ces derniers participent à la coloration de la
bière, mais également à ses propriétés santé, notamment à travers leur activité antioxydante.
L’étude présentée dans le cadre de cette thèse de doctorat s’est attachée à traiter ces deux aspects
de la présence des composés phénoliques dans bière.
En ce qui concerne le premier aspect, l’objectif, qui est de nature technologique, consistait à
explorer les moyens et les modalités d’application d’une élimination des composés colorés,
essentiellement constitués de composés phénoliques, de la bière. La couleur de la bière est en effet
un frein important au développement de produits innovants par les brasseurs. La réduction ou
l’élimination des composés phénoliques devait servir un autre objectif technologique qui est de
réduire la formation de précipités et de troubles dus à des complexations entre ces composés et les
protéines et qui souvent complique les étapes délicates de filtration.
Une quinzaine d’adsorbants de qualité alimentaire ont alors été expérimentés et leurs
performances de décoloration ont été comparées. Le charbon actif en poudre à une concentration
de 10 g/L avec un temps de contact de 30 minutes a permis d’obtenir une décoloration du moût de
près de 90%. L’étude a montré que les composés phénoliques ont une affinité particulière pour cet
adsorbant. Les essais de décoloration ont ensuite été réalisés à des échelles plus grandes avec des
volumes de 2 et de 20 L de moût et des essais de fermentation ont pu être menés. Ce procédé de
décoloration a également été appliqué avec succès à la bière. Les résultats des analyses physico-
chimiques ont montré qu’en comparaison avec une décoloration du moût, la décoloration de la
bière a moins d’impact sur la composition du produit final.
Ce produit a ensuite été utilisé afin de développer une boisson maltée aux couleurs originales.
Des colorants alimentaires tels que la chlorophylline et le lycopène, ont été ajoutés, ainsi que
d’autres colorants issus d’extraits alimentaires, tels que le rouge de betterave ou le jus de chou
rouge (mélanges non purifiés d’anthocyanes) dont la couleur peut varier en fonction du pH. Cela
nous a permis d’obtenir une gamme de nouvelles boissons maltées aux couleurs vives et variées
allant du rose au bleu.
Concernant le deuxième aspect de la présence des composés phénoliques dans la bière, celui
de leur intérêt santé, notre objectif consistait à mettre au point une méthode analytique afin
d’identifier et de quantifier ces composés, mais qui serait également capable de déterminer leur
activité antioxydante. Les méthodes classiques d’indentification des composés antioxydants dans
des mélanges complexes impliquent en effet de longues procédures de fractionnement bio-guidé,
130
suivie de l'identification des composés purifiés. Une étape d’extraction liquide-liquide a été
appliquée à un mélange de composés phénoliques représentatif de la bière. La séparation des
composés extraits a été faite par HPLC en phase inverse couplée à un détecteur UV-visible pour
l’identification et à un détecteur UV-visible supplémentaire utilisé pour surveiller l'activité
antioxydante de ces composés, après avoir réagi en ligne avec une solution du radical ABTS•+. A des
concentrations équimolaires, l’acide gallique a été identifié comme le composé le plus antioxydant,
les acides p-hydroxybenzoïque, vanillique, p-coumarique, m-coumarique, et o-coumarique quant à
eux n'ont montré aucune activité antioxydante détectable.
Cette méthode chromatographique a ensuite été testée en comparaison avec une méthode
biologique de mesure de l’activité antioxydante consistant à mesurer la modulation d’un stress
oxydant sur la croissance des cellules β du pancréas, impliquées dans le diabète de type 2. Ceci
permis de révéler qu’en plus de son effet antioxydant, une même molécule pouvait montrer un effet
toxique, sans doute pro-oxydant. En effet, à concentrations équimolaires, certains composés
pouvaient montrer une activité antioxydante importante avec la méthode chromatographique, et
peu d’activité, voire des effets toxiques, comme pour l’acide gallique, avec la méthode biologique. La
concentration semble jouer un rôle dans l’expression de l’un ou l’autre des deux effets, et sans
doute d’autres paramètres tels que la structure chimique et le substrat utilisé pour déterminer
l’activité. Néanmoins, des résultats concordant entre les deux méthodes ont été obtenus pour
certains composés tels que l’acide férulique, l’acide protocatéchuique et l’épicatéchine.
La méthode chromatographique d’analyse de l’activité antioxydante a ensuite été appliquée à

la séparation et à la détection des composés d’intérêt extraits à différentes étapes du procédé de
fabrication de la bière: le maltage, le brassage, la cuisson et la fermentation. Cela nous a permis
d’étudier l’effet des procédés sur la composition phénolique et les profils antioxydants de la bière.
Globalement, il est apparu, que la teneur totale en composés phénoliques augmentait suite aux
étapes de maltage, de houblonnage et de fermentation, alors que l’activité antioxydante totale
restait constante. Parmi les composés phénoliques à activité antioxydante, neufs composés ont pu
être identifiés, avec une contribution antioxydante importante (69±8% en moyenne) provenant de la
prodelphinidine B3, de la procyanidine B3, de la catéchine, des acides férulique et sinapique, et d’un
composé non identifié (composé 1). Mis à part le malt, la prodelphinidine B3, la procyanidine B3 et
la catéchine sont présentes à chaque étape de fabrication de la bière et contribuent en moyenne de
45±13% à l’activité antioxydante. L’impact du procédé de décoloration sur l’activité antioxydante de
la bière a également été évalué par la méthode chromatographique de détection de l’activité
antioxydante. Cela nous a permis de confirmer que l’utilisation du charbon actif permet d’éliminer la
131
majeure partie des composés phénoliques de la bière, ainsi que l’activité antioxydante qui leur est
associée.
Dans l’organisme humain, le devenir des composés phénoliques, ainsi que leurs activités
antioxydantes et sans doute pro-oxydantes n’ont encore été clairement établis, et ceci
principalement en raison de la complexité du milieu biologique. Il est donc évident que cette
complexité ne peut être représentée par une seule réaction, telle que la réduction du radical ABTS•+,
ni même par une cellule β pancréatique. Un autre élément de complexité est le milieu alimentaire
dont les effets et les multiples interactions ne peuvent quant à eux, être réduits aux propriétés d’un
seul composé. Il y a donc un intérêt à considérer, pour les études des effets sur la santé « le milieu
réel », et donc à s’intéresser, plutôt qu’aux composés purs, à l’ensemble de la matrice alimentaire
avec ses polyphénols et ses autres composants qui pourraient moduler le stress oxydatif, et plutôt
qu’aux essais in vitro et aux réactions isolées, aux essais in vivo.
De telles approches présentent l’avantage de prendre en considération la complexité des

milieux biologiques et alimentaires, et les interactions qui peuvent y avoir lieu, et donc de se
rapprocher de la réalité des effets biologiques. Cependant, d’un point de vue analytique, cela rend
l’identification des composés responsables des activités et l’étude d’éventuels changements dus aux
procédés des tâches particulièrement difficiles. Il est évident que la méthode chromatographique de
détection de l’activité antioxydante ne reflète pas la totalité des activités des composés naturels.
Cependant, elle permet de détecter et d’identifier rapidement des composés antioxydants dans des
mélanges complexes sans étapes préalables de purification ou de fractionnement bio-guidé.
Ce travail est une première étape dans la mise en place de techniques rapides d’analyses de
l’activité antioxydante dans des mélanges complexes, tels que la bière, et l’application au procédé de
fabrication pour le suivi de l’activité antioxydante. Toutefois de nombreux aspects restent à étudier,
aussi bien au niveau de la chimie que de la biologie. Le choix du radical semble primordial, car l’ABTS
(ou le DPPH) n’est pas un radical naturel que l’on retrouve dans l’organisme humain. D’autres
auteurs ont proposé l’utilisation de radicaux plus physiologiques tels que le peroxyde d’hydrogène
ou l’ion superoxyde169,170. Les conditions chromatographiques peuvent également être améliorées
par la modification de la forme, de la température et de la position de la boucle de réaction, ou
encore de la composition de la phase mobile. L’étude des composés bioactifs doit également tenir
compte de la biodisponibilité du composé : fixation à la matrice alimentaire et non libération dans le
tractus digestif, résistance du produit vis-à-vis de l’acidité gastrique, transformations métaboliques
induites par le transit digestif. Pour cela, ce modèle pourra également être appliqué comme
méthode de détection de composés actifs présents dans le plasma d’animaux de laboratoire après
132
qu’ils aient été nourris de produits d’intérêt. Il est bien connu que certains extraits présentent à la
fois des effets toxiques et protecteurs en fonction de la concentration à laquelle ils sont employés.
Selon nos derniers résultats, il est clairement apparu que l’EGCG présente une forte activité dès la
dose de 30 µg/mL avec la méthode chromatographique, alors qu’il ne se montre actif qu’au-delà de
200 µg/mL avec la méthode biologique, dose bien supérieure aux concentrations plasmatiques
retrouvées pour ce composé. Il apparaît donc important de travailler à des concentrations proches
de ce que l’on retrouve dans l’organisme humain.
Grâce aux méthodes de screening et d’analyses de molécules antioxydantes mises en place au

laboratoire, nous savons quels composés sont responsables de l’activité antioxydante, il serait
intéressant de savoir de la même manière quels composés sont responsables de la couleur. Une des
perspectives est également de rechercher d’autres composés ou molécules issus de l’alimentation,
qui pourraient avoir des effets antioxydants, tels que des composés d’intérêt hydrophiles (ex :
polyphénols) mais également lipophiles (ex : acides gras polyinsaturés, vitamines liposolubles,
lycopène, …). Ainsi, il a récemment été mis en place un projet collaboratif avec entre autre, l’équipe
du Dr. Séverine Sigrist du CEED de Strasbourg. Ce projet a pour but d’évaluer le pouvoir antioxydant
des fruits et légumes cultivés en Alsace et d’en valider l’activité biologique par la méthode LC-AOx
comparée avec les analyses de survie des cellules  pancréatiques soumises à un stress oxydatif
(H2O2) en prenant une attention toute particulière à réaliser les études dans des conditions
physiologiques de concentrations. Enfin, il est aujourd’hui bien admis que ces composés peuvent
avoir une action synergique ou antagoniste. A ce propos, une intéressante étude clinique à été
publiée dans la revue Nature171 et fait état d’interactions fortes entre les composés phénoliques du
chocolat (épicatéchine) et les protéines du lait démontrant de façon assez simple que le lait
éventuellement présent dans le chocolat ou consommé avec lui était responsable de l’inhibition de
la (bio)activité des composés en question. Comme cela a été rappelé, il est donc fondamental que
l’étape ultime de toute étude analytique des effets biologiques considère d’une part l’aliment dans
son ensemble, principe actif et matrice environnante, promotrice ou inhibitrice de ces effet, et
d’autre part le milieu biologique et donc les tests in vivo.
133
134
Références
bibliographiques
135
1. Baik, B.-K. & Ullrich, S.E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest.
Journal of Cereal Science 48, 233-242 (2008).
2. Bamforth, C.W. Beers – Chemistry of Brewing. Encyclopedia of Food Sciences & Nutrition 440-
447 (2003).
3. Moll, M. Bières et coolers : Définition, fabrication, composition. (Tech.& Doc./Lavoisier: 1991).
4. Fachverlag, H.C. Analytica-Microbiologica-EBC. European Brewery Convention, Section 3,
Method 3.2.1.1. (2001).
5. Shahidi, F. & Naczk, M. Food Phenolics: Sources, Chemistry, Effects, Applications, 2nd Edition.
(CRC - Press: ).à <http://www.informaworld.com/978-1-58716-138-4>
6. Nordkvist, E., Salomonsson, A.C. & Aman, P. Distribution of insoluble bound phenolic acids in
barley grain. Journal of the Science of Food and Agriculture 35, 657-661 (1984).
7. Havsteen, B.H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology &
Therapeutics 96, 67-202 (2002).
8. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C. & Jimenez, L. Polyphenols: food sources and
bioavailability. Am J Clin Nutr 79, 727-747 (2004).
9. Xie, D.-Y. & Dixon, R.A. Proanthocyanidin biosynthesis - still more questions than answers?
Phytochemistry 66, 2127-2144 (2005).
10. Sarni-Manchado, P. & Cheynier, V., Collectif Les polyphénols en agroalimentaire. (Tec & Doc
Lavoisier: 2005).
11. Ferk, F. et al. Xanthohumol, a prenylated flavonoid contained in beer, prevents the induction of
preneoplastic lesions and DNA damage in liver and colon induced by the heterocyclic aromatic
amine amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinoline (IQ). Mutation Research/Fundamental and
Molecular Mechanisms of Mutagenesis 691, 17-22 (2010).
12. Milligan, S.R. et al. Identification of a potent phytoestrogen in hops (Humulus lupulus L.) and
beer. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 84, 2249-2252 (1999).
13. Stevens, J.F. & Page, J.E. Xanthohumol and related prenylflavonoids from hops and beer: to
your good health! Phytochemistry 65, 1317-1330 (2004).
14. Vinson, J.A., Mandarano, M., Hirst, M., Trevithick, J.R. & Bose, P. Phenol Antioxidant Quantity
and Quality in Foods: Beers and the Effect of Two Types of Beer on an Animal Model of
Atherosclerosis. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 5528-5533 (2003).
15. Gerhäuser, C. Beer constituents as potential cancer chemopreventive agents. Eur. J. Cancer 41,
1941-1954 (2005).
16. Honma, Y., Tobe, H., Makishima, M., Yokoyama, A. & Okabe-Kado, J. Induction of
differentiation of myelogenous leukemia cells by humulone, a bitter in the hop. Leukemia
Research 22, 605-610 (1998).
17. Tobe, H., Kubota, M., Yamaguchi, M., Kocha, T. & Aoyagi, T. Apoptosis to HL-60 by humulone.
Biosci. Biotechnol. Biochem 61, 1027-1029 (1997).
18. Chen, W.-J. & Lin, J.-K. Mechanisms of Cancer Chemoprevention by Hop Bitter Acids (Beer
Aroma) through Induction of Apoptosis Mediated by Fas and Caspase Cascades. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 52, 55-64 (2004).
19. Zhao, F., Nozawa, H., Daikonnya, A., Kondo, K. & Kitanaka, S. Inhibitors of nitric oxide
production from hops (Humulus lupulus L.). Biol. Pharm. Bull 26, 61-65 (2003).
20. Yamamoto, K., Wang, J., Yamamoto, S. & Tobe, H. Suppression of cyclooxygenase-2 gene
transcription by humulon. Adv. Exp. Med. Biol 507, 73-77 (2002).
21. Nozawa, H., Nakao, W., Zhao, F. & Kondo, K. Dietary supplement of isohumulones inhibits the
formation of aberrant crypt foci with a concomitant decrease in prostaglandin E2 level in rat
colon. Mol. Nutr. Food Res. 49, 772-778 (2005).
22. Lamy, V. et al. Chemopreventive effects of lupulone, a hop β-acid, on human colon cancer-
derived metastatic SW620 cells and in a rat model of colon carcinogenesis. Carcinogenesis 28,
1575 -1581 (2007).
136
23. Goupy, P., Hugues, M., Boivin, P. & Amiot, M.J. Antioxidant composition and activity of barley
(Hordeum vulgare) and malt extracts and of isolated phenolic compounds. Journal of Science
and Food Agricultural 79, 1625-1634 (1999).
24. Kim, M.-J. et al. Relationship between Phenolic Compounds, Anthocyanins Content and
Antioxidant Activity in Colored Barley Germplasm. Journal of Agricultural and Food Chemistry
55, 4802-4809 (2007).
25. McMurrough, I., Madigan, D. & Smyth, M.R. Semipreparative Chromatographic Procedure for
the Isolation of Dimeric and Trimeric Proanthocyanidins from Barley. Journal of Agricultural
and Food Chemistry 44, 1731-1735 (1996).
26. McMurrough, I., Loughrey, M.J. & Hennigan, G.P. Content of (+)-catechin and
proanthocyanidins in barley and malt grain. J. Sci. Food Agric. 34, 62-72 (1983).
27. Dvorakova, M. et al. Characterization of monomeric and oligomeric flavan-3-ols from barley
and malt by liquid chromatography–ultraviolet detection–electrospray ionization mass
spectrometry. Journal of Chromatography A 1189, 398-405 (2008).
28. Adom, K.K., Sorrells, M.E. & Liu, R.H. Phytochemical Profiles and Antioxidant Activity of Wheat
Varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 7825-7834 (2003).
29. Haila, K.M., Lievonen, S.M. & Heinonen, M.I. Effects of Lutein, Lycopene, Annatto, and γ-
Tocopherol on Autoxidation of Triglycerides. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44,
2096-2100 (1996).
30. Friedrich, W. & Galensa, R. Identification of a new flavanol glucoside from barley (Hordeum
vulgare L.) and malt. European Food Research and Technology 214, 388-393 (2002).
31. Vanderhaegen, B., Neven, H., Verachtert, H. & Derdelinckx, G. The chemistry of beer aging - a
critical review. Food Chemistry 95, 357-381 (2006).
32. Scalbert, A., Manach, C., Morand, C., Rémésy, C. & Jiménez, L. Dietary Polyphenols and the
Prevention of Diseases. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 45, 287 (2005).
33. Maillard, L.C. Action des acides amines sur les sucres : formation des melanoidines par voie
methodique. Council of Royal Academy Science Series 2 154, 66-68 (1912).
34. Ames, J.M., Defaye, A.B., Bailey, R.G. & Bates, L. Analysis of the non-volatile Maillard reaction
products formed in an extrusion-cooked model food system. Food Chemistry 61, 521-524
(1998).
35. Ames, J.M. Applications of the Maillard reaction in the food industry. Food Chemistry 62, 431-
439 (1998).
36. Machiels, D. & Istasse, L. La réaction de Maillard : importance et applications en chimie des
aliments = Maillard reaction: importance and applications in food chemistry. Annales de
médecine vétérinaire 146, 347-352 (2002).
37. Macheix, J.-J., Fleuriet, A. & Jay-Allemand, C. Les composés phénoliques des végétaux : Un
exemple de métabolites secondaires d’importance économique. (PPUR: 2005).
38. Rice-Evans, C., Miller, N. & Paganga, G. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends
in Plant Science 2, 152-159 (1997).
39. Goupy, P., Dufour, C., Loonis, M. & Dangles, O. Quantitative Kinetic Analysis of Hydrogen
Transfer Reactions from Dietary Polyphenols to the DPPH Radical. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 51, 615-622 (2003).
40. Boivin, P. Relationship between polyphenols and beer flavour stability. (2009).à
<http://www.uclouvain.be/cps/ucl/doc/inbr/documents/Boivin.pdf>
41. Rice-Evans, C. Plant polyphenols: free radical scavengers or chain-breaking antioxidants?
Biochemical Society Symposia 61, 103-116 (1995).
42. Woffenden, H.M., Ames, J.M., Chandra, S., Anese, M. & Nicoli, M.C. Effect of Kilning on the
Antioxidant and Pro-oxidant Activities of Pale Malts. Journal of Agricultural and Food Chemistry
50, 4925-4933 (2002).
43. Yen, G.-C., Chen, H.-Y. & Peng, H.-H. Antioxidant and Pro-Oxidant Effects of Various Tea
Extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry 45, 30-34 (1997).
137
44. Auberval, N. et al. P153 Effet antioxydant des extraits de polyphénols et du resvératrol trans et
CIS sur des cellulesRINm5F après induction d’un stress oxydant. Diabetes & Metabolism 35,
A64 (2009).
45. Auberval, N., Dal-Ros, S., Schini-Kerth, V., Pinget, M. & Sigrist, S. P170 Effet antioxydant des
extraits de polyphénols de vin rouge et de thé vert sur des cellules RINm5F après induction
d’un stress oxydant. Diabetes & Metabolism 36, A79 (2010).
46. Cheynier, V. Polyphenols in foods are more complex than often thought. Am J Clin Nutr 81,
223S-229 (2005).
47. Mikyska, A., Hrabak, M., Haskova, D. & Srogl, J. The role of malt and hop polyphenols in beer
quality, flavour and haze stability. Journal of the Institute of Brewing 108, 78-85 (2002).
48. Gallegos-Infante, J.A., Rocha-Guzman, N.E., Gonzalez-Laredo, R.F. & Pulido-Alonso, J. Effect of
processing on the antioxidant properties of extracts from Mexican barley (Hordeum vulgare)
cultivar. Food Chemistry 119, 903-906 (2010).
49. Dewanto, V., Wu, X., Adom, K.K. & Liu, R.H. Thermal Processing Enhances the Nutritional Value
of Tomatoes by Increasing Total Antioxidant Activity. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 50, 3010-3014 (2002).
50. Randhir, R., Kwon, Y.-I. & Shetty, K. Effect of thermal processing on phenolics, antioxidant
activity and health-relevant functionality of select grain sprouts and seedlings. Innovative Food
Science & Emerging Technologies 9, 355-364 (2008).
51. Ranilla, L.G., Genovese, M.I. & Lajolo, F.M. Effect of Different Cooking Conditions on Phenolic
Compounds and Antioxidant Capacity of Some Selected Brazilian Bean (Phaseolus vulgaris L.)
Cultivars. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57, 5734-5742 (2009).
52. Clifford, M.N. Chlorogenic acids and other cinnamates - nature, occurrence, dietary burden,
absorption and metabolism. J. Sci. Food Agric. 80, 1033-1043 (2000).
53. Maillard, M.-N. & Berset, C. Evolution of Antioxidant Activity during Kilning: Role of Insoluble
Bound Phenolic Acids of Barley and Malt. Journal of Agricultural and Food Chemistry 43, 1789-
1793 (1995).
54. Maillard, M.-N., Soum, M.-H., Boivin, P. & Berset, C. Antioxidant Activity of Barley and Malt:
Relationship with Phenolic Content. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie 29, 238-244
(1996).
55. Manzocco, L., Calligaris, S., Mastrocola, D., Nicoli, M.C. & Lerici, C.R. Review of non-enzymatic
browning and antioxidant capacity in processed foods. Trends in Food Science & Technology
11, 340-346 (2000).
56. Kohyama, N. et al. Effects of phenolic compounds on the browning of cooked barley. Journal of
57. Giriwono, P.E. et al. Extract of fermented barley attenuates chronic alcohol induced liver
damage by increasing antioxidative activities. Food Research International 43, 118-124 (2010).
58. Fantozzi, P. et al. In vitroantioxidant capacity from wort to beer. Lebensmittel-Wissenschaft
und-Technologie 31, 221-227 (1998).
59. Lopez-Toledano, A., Mayen, M., Merida, J. & Medina, M. Yeasts used to delay browning in
white wines. Food Chemistry 97, 498-504 (2006).
60. Salmon, J.-M. Interactions between yeast, oxygen and polyphenols during alcoholic
fermentations: Practical implications. LWT - Food Science and Technology 39, 959-965 (2006).
61. Mazauric, J.-P. & Salmon, J.-M. Interactions between Yeast Lees and Wine Polyphenols during
Simulation of Wine Aging: I. Analysis of Remnant Polyphenolic Compounds in the Resulting
Wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 5647-5653 (2005).
62. McMurrough, I., Madigan, D. & Smyth, M.R. Adsorption by Polyvinylpolypyrrolidone of
Catechins and Proanthocyanidins from Beer. Journal of Agricultural and Food Chemistry 43,
2687-2691 (1995).
63. de Rijke, E. et al. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of
Chromatography A 1112, 31-63 (2006).
138
64. Naczk, M. & Shahidi, F. Phenolics in cereals, fruits and vegetables: Occurrence, extraction and
analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41, 1523-1542 (2006).
65. Bravo, M.N., Silva, S., Coelho, A.V., Vilas Boas, L. & Bronze, M.R. Analysis of phenolic
compounds in Muscatel wines produced in Portugal. Analytica Chimica Acta 563, 84-92 (2006).
66. Madhujith, T. & Shahidi, F. Antioxidative and Antiproliferative Properties of Selected Barley
(Hordeum vulgarae L.) Cultivars and Their Potential for Inhibition of Low-Density Lipoprotein
(LDL) Cholesterol Oxidation. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 5018-5024 (2007).
67. Magalhães, P.J. et al. Isolation of phenolic compounds from hop extracts using
polyvinylpolypyrrolidone: Characterization by high-performance liquid chromatography-diode
array detection-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1217,
3258-3268 (2010).
68. Llorach, R., Gil-Izquierdo, A., Ferreres, F. & Tomás-Barberán, F.A. HPLC-DAD-MS/MS ESI
Characterization of Unusual Highly Glycosylated Acylated Flavonoids from Cauliflower (Brassica
oleracea L. var. botrytis) Agroindustrial Byproducts. Journal of Agricultural and Food Chemistry
51, 3895-3899 (2003).
69. Naczk, M. & Shahidi, F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography
A 1054, 95-111 (2004).
70. Michalkiewicz, A., Biesaga, M. & Pyrzynska, K. Solid-phase extraction procedure for
determination of phenolic acids and some flavonols in honey. Journal of Chromatography A
1187, 18-24 (2008).
71. Schoefs, B. Determination of pigments in vegetables. Journal of Chromatography A 1054, 217-
226 (2004).
72. Niederländer, H.A.G., van Beek, T.A., Bartasiute, A. & Koleva, I.I. Antioxidant activity assays on-
line with liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1210, 121-134 (2008).
73. Shi, S.-Y. et al. Coupling HPLC to on-line, post-column (bio)chemical assays for high-resolution
screening of bioactive compounds from complex mixtures. TrAC Trends in Analytical Chemistry
28, 865-877 (2009).
74. Niederländer, H.A.G., de Jong, M.M., Gooijer, C. & Velthorst, N.H. Flow injection system for
determination of singlet oxygen quenching efficiencies utilizing on-line dioxetane
chemiluminescence detection. Analytica Chimica Acta 290, 201-214 (1994).
75. Ogawa, A., Arai, H., Tanizawa, H., Miyahara, T. & Toyo’oka, T. On-line screening method for
antioxidants by liquid chromatography with chemiluminescence detection. Analytica Chimica
Acta 383, 221-230 (1999).
76. Toyo’oka, T., Kashiwazaki, T. & Kato, M. On-line screening methods for antioxidants scavenging
superoxide anion radical and hydrogen peroxide by liquid chromatography with indirect
chemiluminescence detection. Talanta 60, 467-475 (2003).
77. Dapkevicius, A., van Beek, T.A., Niederländer, H.A.G. & de Groot, A. On-Line Detection of
Antioxidative Activity in High-Performance Liquid Chromatography Eluates by
Chemiluminescence. Analytical Chemistry 71, 736-740 (1999).
78. Kool, J. et al. An on-line post-column detection system for the detection of reactive-oxygen-
species-producing compounds and antioxidants in mixtures. Analytical and bioanalytical
chemistry 388, 871-879 (2007).
79. Guo, C., Cao, G., Sofic, E. & Prior, R.L. High-Performance Liquid Chromatography Coupled with
Coulometric Array Detection of Electroactive Components in Fruits and Vegetables:
Relationship to Oxygen Radical Absorbance Capacity. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 45, 1787-1796 (1997).
80. Mannino, S., Brenna, O., Buratti, S. & Cosio, M.S. A new method for the evaluation of the
antioxidant power of wines. Electroanalysis 10, 908-912 (1998).
81. Koleva, I.I., Niederländer, H.A.G. & van Beek, T.A. An On-Line HPLC Method for Detection of
Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Analytical Chemistry 72, 2323-2328
(2000).
139
82. Koleva, I.I., Niederländer, H.A.G. & van Beek, T.A. Application of ABTS Radical Cation for
Selective On-Line Detection of Radical Scavengers in HPLC Eluates. Analytical Chemistry 73,
3373-3381 (2001).
83. Miliauskas, G., van Beek, T.A., Venskutonis, P.R., Linssen, J.P.H. & de Waard, P. Antioxidative
activity of Geranium macrorrhizum. European Food Research and Technology 218, 253-261
(2004).
84. Miliauskas, G. et al. Antioxidant activity of Potentilla fruticosa. J. Sci. Food Agric. 84, 1997-2009
(2004).
85. Miliauskas, G., van Beek, T.A., de Waard, P., Venskutonis, R.P. & Sudhölter, E.J.R. Identification
of Radical Scavenging Compounds in Rhaponticum carthamoides by Means of LC-DAD-SPE-
NMR. Journal of Natural Products 68, 168-172 (2005).
86. Cano, A., Alcaraz, O., Acosta, M. & Arnao, M.B. On-line antioxidant activity determination:
comparison of hydrophilic and lipophilic antioxidant activity using the ABTS.+ assay. Redox
Report 7, 103-109 (2002).
87. Beekwilder, J. et al. Antioxidants in Raspberry: On-Line Analysis Links Antioxidant Activity to a
Diversity of Individual Metabolites. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 3313-3320
(2005).
88. Schijlen, E. et al. Pathway engineering for healthy phytochemicals leading to the production of
novel flavonoids in tomato fruit. Plant Biotechnology J 4, 433-444 (2006).
89. Stewart, A.J., Mullen, W. & Crozier, A. On-line high-performance liquid chromatography
analysis of the antioxidant activity of phenolic compounds in green and black tea. Molecular
Nutrition Food Research 49, 52-60 (2005).
90. Stalmach, A., Mullen, W., Nagai, C. & Crozier, A. On-line HPLC analysis of the antioxidant
activity of phenoliccompounds in brewed, paper-filtered coffee. Brazilian Journal of Plant
Physiology 18, 253-262 (2006).
91. Pérez-Bonilla, M. et al. Isolation and identification of radical scavengers in olive tree (Olea
europaea) wood. Journal of Chromatography A 1112, 311-318 (2006).
92. Pérez-Bonilla, M. et al. Isolation of antioxidative secoiridoids from olive wood (Olea europaea
L.) guided by on-line HPLC-DAD-radical scavenging detection. Food Chemistry 124, 36-41
(2011).
93. Cassano, M., Doualé, G.A. & Zapp, J. Determination of Radical Scavenging Capacities in
Differently Roasted Coffees by On-line Combination of High-performance Liquid
Chromatography with ABTS Decolorization. Colloquium of Coffee Chelistry and Quality 21st 264
(2006).
94. Li, S.-Y., Yu, Y. & Li, S.-P. Identification of Antioxidants in Essential Oil of Radix Angelicae
Sinensis Using HPLC Coupled with DAD-MS and ABTS-Based Assay. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 55, 3358-3362 (2007).
95. Zhao, H., Chen, W., Lu, J. & Zhao, M. Phenolic profiles and antioxidant activities of commercial
beers. Food Chemistry 119, 1150-1158 (2010).
96. Slokar, Y.M. & Majcen Le Marechal, A. Methods of decoloration of textile wastewaters. Dyes
and Pigments 37, 335-356 (1998).
97. Robinson, T., McMullan, G., Marchant, R. & Nigam, P. Remediation of dyes in textile effluent: a
critical review on current treatment technologies with a proposed alternative. Bioresource
Technology 77, 247-255 (2001).
98. Allen, S.J. & Koumanova, B. Decolourisation of water/wastwater using adsorption. Journal of
the university of chemical technology and metallurgy 40, 175-192 (2005).
99. Word, K.M., Pflugfelder, R.L., Neu, J.A., Head, G.P. & Patino, H. WO9418304 Colorless flavored
malt beverage and method for making the same. (1994).
100. Rivera, A.D., Macapugay, E.S. & De Carlos, J.Y. WO2006046879 Method of making colorless and
artificially colored clear beer. (2006).
140
101. Siebert, K.J. & Lynn, P.Y. Comparison of Polyphenol Interactions with Polyvinylpyrrolidone and
Haze-Active Protein. Journal of the American Society of brewing Chemists 56, 24-31 (1998).
102. Laborde, B. et al. PVPP−Polyphenol Complexes: A Molecular Approach. Journal of Agricultural
103. Achaerandio, I., Güell, C. & López, F. New approach to continuous vinegar decolourisation with
exchange resins. Journal of Food Engineering 78, 991-994 (2007).
104. Bailey, S.E., Olin, T.J., Bricka, R.M. & Adrian, D.D. A review of potentially low-cost sorbents for
heavy metals. Water Research 33, 2469-2479 (1999).
105. Spagna, G. et al. The stabilization of white wines by adsorption of phenolic compounds on
chitin and chitosan. Food Research International 29, 241-248 (1996).
106. Marsal, A., Bautista, E., Ribosa, I., Pons, R. & García, M.T. Adsorption of polyphenols in
wastewater by organo-bentonites. Applied Clay Science 44, 151-155 (2009).
107. Garg, U.K., Kaur, M.P., Garg, V.K. & Sud, D. Removal of hexavalent chromium from aqueous
solution by agricultural waste biomass. Journal of Hazardous Materials 140, 60-68 (2007).
108. Nigam, P., Armour, G., Banat, I.M., Singh, D. & Marchant, R. Physical removal of textile dyes
from effluents and solid-state fermentation of dye-adsorbed agricultural residues. Bioresource
Technology 72, 219-226 (2000).
109. Seaton, J.C. & Cantrell, I.C. The determination of beer colour. Journal of the Institute of
Brewing 99, 21-23 (1993).
110. Bernard, M. Determination of repeatability and reproducibility of EBC accepted methods : V -
Beer. Journal of the Institute of Brewing 106, 135-138 (2000).
111. Bishop, L.R. Analysis commitee of the European Brewery Convention: the measurement of
total polyphenols in worts and beers. Journal of the Institute of Brewing 78, 37-38 (1972).
112. Analytica-EBC. (2006).
113. Ahmaruzzaman, M. Adsorption of phenolic compounds on low-cost adsorbents: A review.
Advances in Colloid and Interface Science 143, 48-67 (2008).
114. Garg, V.K., Gupta, R., Kumar, R. & Gupta, R.K. Adsorption of chromium from aqueous solution
on treated sawdust. Bioresource Technology 92, 79-81 (2004).
115. Richard, D., Delgado Núñez, M. de L. & Schweich, D. Adsorption of complex phenolic
compounds on active charcoal: Adsorption capacity and isotherms. Chemical Engineering
Journal 148, 1-7 (2009).
116. Garcia-Araya J. F, Beltran F. J & Alvarez P, , et , Masa F. J Activated Carbon Adsorption of Some
Phenolic Compounds Present in Agroindustrial Wastewater. Adsorption 9, 107-115 (2003).
117. Wainwright, T. A review part I - analyticaland biochemical considerations; part II - brewing
experience. Journal of the Institute of Brewing 79, 451-470 (1973).
118. European Brewery Convention Manual of good practice : Fermentation and Maturation. 7,
(2000).
119. Jones, M. & Pierce, J.S. Absorption of amino acids from wort by yeasts. Journal of the Institute
of Brewing 307-315 (1964).
120. Vis, R.B. & Lorenz, K. [beta]-Glucans: Importance in Brewing and Methods of Analysis.
Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie 30, 331-336 (1997).
121. Yamauchi, Y. et al. Rapid maturation of beer using an immobilized yeast bioreactor. 1. Heat
conversion of [alpha]-acetolactate. Journal of Biotechnology 38, 101-108 (1995).
122. Yamauchi, Y. et al. Rapid maturation of beer using an immobilized yeast bioreactor. 2. Balance
of total diacetyl reduction and regeneration. Journal of Biotechnology 38, 109-116 (1995).
123. Afssa Saisine n°2008-SA-0385 Avis de l’Agence de sécurité sanitaire des aliments relatif à la
demande d'autorisation d'emploi de charbon actif en tant qu'auxiliaire technologique en
brasserie. (2009).
124. Duthie, G.G., Duthie, S.J. & Kyle, J.A.M. Plant Polyphenols in Cancer and Heart Disease:
Implications as Nutritional Antioxidants. Nutrition Research Reviews 13, 79-106 (2000).
141
125. Manach, C. et al. Bioavailability, metabolism and physiological impact of 4-oxo-flavonoids.
Nutrition Research 16, 517-544 (1996).
126. Bravo, L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance.
Nutr. Rev 56, 317-333 (1998).
127. Scalbert, A. & Williamson, G. Dietary Intake and Bioavailability of Polyphenols. The Journal of
Nutrition 130, 2073S -2085S (2000).
128. Hanasaki, Y., Ogawa, S. & Fukui, S. The correlation between active oxygens scavenging and
antioxidative effects of flavonoids. Free Radical Biology and Medicine 16, 845-850 (1994).
129. Rice-Evans, C.A., Miller, N.J. & Paganga, G. Structure-antioxidant activity relationships of
flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and Medicine 20, 933-956 (1996).
130. Cao, G., Sofic, E. & Prior, R.L. Antioxidant and Prooxidant Behavior of Flavonoids: Structure-
Activity Relationships. Free Radical Biology and Medicine 22, 749-760 (1997).
131. Qingming, Y. et al. Antioxidant activities of malt extract from barley (Hordeum vulgare L.)
toward various oxidative stress in vitro and in vivo. Food Chemistry 118, 84-89 (2010).
132. Pellegrini, N., Del Rio, D., Colombi, B., Bianchi, M. & Brighenti, F. Application of the 2,2‘-
Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) Radical Cation Assay to a Flow Injection
System for the Evaluation of Antioxidant Activity of Some Pure Compounds and Beverages.
Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 260-264 (2003).
133. Cao, G., Booth, S.L., Sadowski, J.A. & Prior, R.L. Increases in human plasma antioxidant capacity
after consumption of controlled diets high in fruit and vegetables. Am. J. Clin. Nutr 68, 1081-
1087 (1998).
134. Dapkevicius, A., van Beek, T.A. & Niederländer, H.A.G. Evaluation and comparison of two
improved techniques for the on-line detection of antioxidants in liquid chromatography
eluates. Journal of Chromatography A 912, 73-82 (2001).
135. Cano, A., Hernández-Ruíz, J., García-Cánovas, F., Acosta, M. & Arnao, M.B. An end-point
method for estimation of the total antioxidant activity in plant material. Phytochem. Anal. 9,
196-202 (1998).
136. Re, R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay.
Free Radic. Biol. Med 26, 1231-1237 (1999).
137. Wang, Y., Catana, F., Yang, Y., Roderick, R. & van Breemen, R.B. An LC-MS Method for
Analyzing Total Resveratrol in Grape Juice, Cranberry Juice, and in Wine. Journal of Agricultural
138. del Álamo, M., Casado, L., Hernández, V. & Jiménez, J.J. Determination of free molecular
phenolics and catechins in wine by solid phase extraction on polymeric cartridges and liquid
chromatography with diode array detection. Journal of Chromatography A 1049, 97-105
(2004).
139. Soto, M.L., Moure, A., Domínguez, H. & Parajó, J.C. Charcoal adsorption of phenolic
compounds present in distilled grape pomace. Journal of Food Engineering 84, 156-163 (2008).
140. Kim, D.-O., Lee, K.W., Lee, H.J. & Lee, C.Y. Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity (VCEAC) of
Phenolic Phytochemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, 3713-3717 (2002).
141. Long, L.H., Lan, A.N., Hsuan, F.T. & Halliwell, B. Generation of hydrogen peroxide by
« antioxidant » beverages and the effect of milk addition. Is cocoa the best beverage? Free
Radic. Res 31, 67-71 (1999).
142. Chedea, V.S., Braicu, C. & Socaciu, C. Antioxidant/prooxidant activity of a polyphenolic grape
seed extract. Food Chemistry 121, 132-139 (2010).
143. Frankel, E.N., Huang, S.-W. & Aeschbach, R. Antioxidant activity of green teas in different lipid
systems. JAOCS, Journal of the American Oil Chemists’ Society 74, 1309-1315 (1997).
144. Park, S. et al. -Ascorbic acid induces apoptosis in acute myeloid leukemia cells via hydrogen
peroxide-mediated mechanisms. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36,
2180-2195 (2004).
142
145. Long, L.H., Clement, M.V. & Halliwell, B. Artifacts in Cell Culture: Rapid Generation of Hydrogen
Peroxide on Addition of (-)-Epigallocatechin, (-)-Epigallocatechin Gallate, (+)-Catechin, and
Quercetin to Commonly Used Cell Culture Media. Biochemical and Biophysical Research
Communications 273, 50-53 (2000).
146. Maurya, D.K. & Devasagayam, T.P.A. Antioxidant and prooxidant nature of hydroxycinnamic
acid derivatives ferulic and caffeic acids. Food and Chemical Toxicology 48, 3369-3373 (2010).
147. Zheng, L.-F., Dai, F., Zhou, B., Yang, L. & Liu, Z.-L. Prooxidant activity of hydroxycinnamic acids
on DNA damage in the presence of Cu(II) ions: Mechanism and structure-activity relationship.
Food and Chemical Toxicology 46, 149-156 (2008).
148. Akagawa, M., Shigemitsu, T. & Suyama, K. Production of hydrogen peroxide by polyphenols
and polyphenol-rich beverages under quasi-physiological conditions. Biosci. Biotechnol.
Biochem 67, 2632-2640 (2003).
149. Suh, K.S. et al. Prooxidative effects of green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate on
the HIT-T15 pancreatic beta cell line. Cell Biol. Toxicol 26, 189-199 (2010).
150. Yin, S.-T. et al. Epigallocatechin-3-gallate induced primary cultures of rat hippocampal neurons
death linked to calcium overload and oxidative stress. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol
379, 551-564 (2009).
151. Isbrucker, R.A., Bausch, J., Edwards, J.A. & Wolz, E. Safety studies on epigallocatechin gallate
(EGCG) preparations. Part 1: Genotoxicity. Food and Chemical Toxicology 44, 626-635 (2006).
152. Yen, G.-C., Duh, P.-D. & Tsai, H.-L. Antioxidant and pro-oxidant properties of ascorbic acid and
gallic acid. Food Chemistry 79, 307-313 (2002).
153. Roche, M., Dufour, C., Mora, N. & Dangles, O. Antioxidant activity of olive phenols: mechanistic
investigation and characterization of oxidation products by mass spectrometry. Org. Biomol.
Chem. 3, 423 (2005).
154. Frankel, E.N. & Finley, J.W. How To Standardize the Multiplicity of Methods To Evaluate
Natural Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56, 4901-4908 (2008).
155. Prior, R.L. & Cao, G. In vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical
methods1. Free Radical Biology and Medicine 27, 1173-1181 (1999).
156. Halliwell, B. Are polyphenols antioxidants or pro-oxidants? What do we learn from cell culture
and in vivo studies? Archives of Biochemistry and Biophysics 476, 107-112 (2008).
157. Fahey, J.W. & Kensler, T.W. Role of Dietary Supplements/Nutraceuticals in Chemoprevention
through Induction of Cytoprotective Enzymes. Chemical Research in Toxicology 20, 572-576
(2007).
158. Adhami, V.M. & Mukhtar, H. Polyphenols from green tea and pomegranate for prevention of
prostate cancer. Free Radic Res 40, 1095-1104 (2006).
159. Vinson, J.A. et al. Chocolate Is a Powerful ex Vivo and in Vivo Antioxidant, an
Antiatherosclerotic Agent in an Animal Model, and a Significant Contributor to Antioxidants in
the European and American Diets. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 8071-8076
(2006).
160. Liu, Q. & Yao, H. Antioxidant activities of barley seeds extracts. Food Chemistry 102, 732-737
(2007).
161. Hernanz, D. et al. Hydroxycinnamic Acids and Ferulic Acid Dehydrodimers in Barley and
Processed Barley. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49, 4884-4888 (2001).
162. Lu, J. et al. Evolution of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity during Malting. Journal
of Agricultural and Food Chemistry 55, 10994-11001 (2007).
163. Samaras, T.S., Camburn, P.A., Chandra, S.X., Gordon, M.H. & Ames, J.M. Antioxidant Properties
of Kilned and Roasted Malts. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 8068-8074 (2005).
164. Parras, P., Martínez-Tomé, M., Jiménez, A.M. & Murcia, M.A. Antioxidant capacity of coffees of
several origins brewed following three different procedures. Food Chemistry 102, 582-592
(2007).
143
165. McMurrough, I. & Baert, T. Identification of proanthocyanidins in beer and their direct
measurement with a dual electrode electrochemical detector. Journal of the Institute of
Brewing 100, 409-416 (1994).
166. Adil, I.H., Çetin, H.I., Yener, M.E. & BayIndIrlI, A. Subcritical (carbon dioxide + ethanol)
extraction of polyphenols from apple and peach pomaces, and determination of the
antioxidant activities of the extracts. The Journal of Supercritical Fluids 43, 55-63 (2007).
167. Srinivas, K., King, J.W., Howard, L.R. & Monrad, J.K. Solubility of Gallic Acid, Catechin, and
Protocatechuic Acid in Subcritical Water from (298.75 to 415.85) K. Journal of Chemical &
Engineering Data 55, 3101-3108 (2010).
168. Razmkhab, S. et al. Adsorption of Phenolic Compounds and Browning Products in White Wines
by Yeasts and Their Cell Walls. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, 7432-7437
(2002).
169. Huang, D., Ou, B. & Prior, R.L. The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays. Journal of
170. Quick, K.L., Hardt, J.I. & Dugan, L.L. Rapid microplate assay for superoxide scavenging
efficiency. Journal of Neuroscience Methods 97, 139-144 (2000).
171. Serafini, M. et al. Plasma antioxidants from chocolate. Nature 424, 1013 (2003).
144
Annexes
145
Annexe 1
Composition Unités Moût témoin Moût décoloré Bière témoin Bière décolorée
Acide Aspartique µmol/l 279 258 14 9
Acide Glutamique µmol/l 329 326 18 10
Serine µmol/l 438 436 151 140
Histidine µmol/l 188 188 26 4
Glycine µmol/l 260 255 122 53
Threonine µmol/l 298 348 10 7
Arginine µmol/l 566 529 33 27
Alanine µmol/l 655 645 81 65
Tyrosine µmol/l 358 228 10 13
Methionine µmol/l 101 82 76 8
Valine µmol/l 509 511 34 15
Phenylalanine µmol/l 467 299 21 10
Isoleucine µmol/l 291 276 14 11
Leucine µmol/l 655 639 37 10
Lysine µmol/l 426 433 35 11
Somme AA Classe 1 µmol/l 1445 1450 269 174
Fructose (P/V) g/dl 0,09 0,1 0,04 0,03
Glucose (P/V) g/dl 0,67 0,72 0 0
Saccharose (P/V) g/dl 0,15 0,17 0 0
Maltose (P/V) g/dl 5,29 5,67 0 0
Maltotriose (P/V) g/dl 1,08 1,13 0,1 0
Somme Sucres Fermentescibles g/dl 7,28 7,79 0,14 0,03
Somme Sucres invertis (F+G+Sa) g/dl 0,76 0,83 0,05 0,04
Fer mg/l 0,064 0,521 0,005 0,01
Cuivre mg/l 0,022 0,018 0 0,008
Calcium mg/l 68,83 79,3 70,37 81,15
Magnesium mg/l 58,6 58,8 52,7 53,9
Potassium mg/l 312 319 258 270
Sodium mg/l 14,7 15,7 14,7 15,8
Zinc mg/l 0,1 0,15 0,02 0,02
Couleur EBC 3 0,2
Polyphénols Totaux mg/l 86 10 93 17
Flavonoïdes mg/l 20,4 0 26,8 0
Azote Total mg/dl 56,8 28,6 36,2 12,7
Azote Amine Libre mg/l 106,7 95,8 25,7 17,4
Ph 5,04 4,29 3,87 3,48
Sucres Totaux g/dl 9,65 9,14 - -
Extrait Limite °Pl 1,1 0,63 - -
Atténuation Limite % 88,8 93,24 - -
Extrait Mout °Pl 9,82 9,31 - -
B-Glucanes Solubles mg/l 23 7 - -
Densité 20/20 1,03933 1,03723 1,00445 1,00295
Acétaldéhyde ppm - - 90,4 41,5
Ethylacétate mg/l - - 14,8 18,6
Propanol mg/l - - 10,8 10,6
Isobutanol mg/l - - 13,5 17,4
Isoamylacétate mg/l - - 1,9 2,5
Alcool Iso Amylique mg/l - - 78,4 90,9
146
Caproate d'Ethyle mg/l - - 0,2 0,2
Caprylate d'Ethyle mg/l - - 0 0
Somme Alcools totaux mg/l - - 102,7 118,9
Somme Esters mg/l - - 16,9 21,3
Volume d’alcool EBC % - - 4,68 4,59
Viscosité A 20 °C c.p. 1,5 1,44 - -
Diacétyle + Précurseurs ppb - - 21 10
2,3 Pentanedione + Précurseurs ppb - - 6 4
147
Annexe 2
Composition unités Bière témoin Bière décolorée
Fructose g/dl 0,05 0,05
Glucose g/dl 0 0
Saccharose g/dl 0,02 0,02
Maltose g/dl 0 0
Maltotriose g/dl 0,04 0,04
Somme Sucres Fermentescibles g/dl 0,11 0,11
Somme Sucres invertis (F+G+Sa) g/dl 0,08 0,08
Fer mg/l 0,011 0,276
Cuivre mg/l 0,042 0,018
Calcium mg/l 70,67 71,88
Magnesium mg/l 90,5 91,4
Potassium mg/l 618 623
Sodium mg/l 15,7 16,8
Zinc mg/l 0,02 0,05
Couleur EBC 7,8 0,4
Composés Phénoliques Totaux mg/l 244 16
Flavonoïdes mg/l 43,7 0,3
Azote Total mg/dl 81,9 42,4
Azote Amine Libre mg/l 143,3 124,1
pH 4,64 4,32
Acétaldéhyde ppm 3,8 4,8
Ethylacétate mg/l 21,3 19,5
Propanol mg/l 11,1 10,8
Isobutanol mg/l 13,4 13,1
Isoamylacétate mg/l 2,5 0,3
Alcool Iso Amylique mg/l 65,2 54,3
Caproate d'Ethyle mg/l 0,2 0
Caprylate d'Ethyle mg/l 0 0
Somme Alcools totaux mg/l 89,7 78,2
Somme Esters mg/l 24 19,8
Volume d’alcool EBC % 5,58 5,56
Diacétyle ppb 51 52
2,3-Pentanedione ppb 82 66
148
Annexe 3 :
Effet des différents composés sur la viabilité des cellules β du pancréas (n = 3) en absence (a) et en
présence de H2O2 à 40 µM (n = 3).
149
150
151
Liste des abréviations
ABTS : radical 2, 2-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonate)
ADN : acide désoxyribonucléique
AOx : antioxydant
CEED : centre européen d’étude du diabète
CIFRE : convention industrielle de formation par la recherche
HPLC : chromatographie liquide à haute performance
DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EBC : european brewing convention
EDTA : acide ethylène-diamine-tétraacétique
EGCG : épigallocatéchine gallate
EH : extrait de houblon
EHB : extrait de houblon bouilli
EM : extrait de malt
EMB : extrait de malt brassé
EMBB : extrait de malt brassé et bouilli
EMBBH : extrait de malt brassé, bouilli et houblonné
ESI : source d’ionisation electrospray
MS : spectrométrie de masse
PBS : phosphate buffered saline
PVPP : polyvinylpolypyrrolidone
SPE : solid phase extraction
TOD : tank out door
152
Publications et communications scientifiques
Publications:
 Thomas Louveau, Celine Leitao, Sol Green, Cyril Hamiaux, Benoît van der Rest, Odile Dechy-
Cabaret, Ross G. Atkinson, Christian Chervin, Predicting the substrate specificity of a
glycosyltransferase implicated in the production of phenolic volatiles in tomato fruit. 2011,
FEBS Journal, 278, 390–400.
 Céline Leitao, Eric Marchioni, Martine Bergaentzlé, Minjie Zhao, Luc Didierjean, Behnam
Taidi, Saïd Ennahar, Effects of the processing steps on the polyphenolic content and the
antioxidant activity of beer. 2011, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59 (4), 1249-
1255.
 Céline Leitao, Eric Marchioni, Martine Bergaentzlé, Minjie Zhao, Luc Didierjean, Saïd
Ennahar, Comparison of the polyphenolic content and the antioxidant activity of barley
and malt and study of the impact of brewing process on the total antioxidant activity. En
rédaction.
Communication par oral:
 Céline Leitao, Study of polyphenolic profiles and antioxidant activity of beer. “Symposium
and Workshop on Polyphenols”, 26 mai 2010, Copenhague (Danemark).
Communications par affiche:
Taidi, Saïd Ennahar, Effects of process on the polyphenolic profiles and antioxidant activity
of beer. “5th International Conference on Polyphenols Applications”, 29-30 octobre 2009,
Saint Julian (Malte).
Taidi, Saïd Ennahar, Chromatographic detection of antioxidant compounds during beer
processing. “25th International Conference on Polyphenols”, 24-27 août 2010, Montpellier
(France).
153
Etude de composés à intérêts technologiques et fonctionnels dans la bière
Résumé : L’objectif de ce travail était de développer une boisson maltée originale qui se
différencierait des produits existants sur le marché par ses propriétés organoleptiques, notamment
par son aspect incolore ou l’ajout de couleurs vives et par la mise en évidence de ses propriétés
nutritionnelles et fonctionnelles. Une décoloration avec du charbon actif en poudre a permis
d’obtenir une bière décolorée qui pourra aboutir à un produit aux couleurs originales. Le travail s’est
poursuivi par l’étude des propriétés bénéfiques pour la santé des composés phénoliques de la bière,
représentées par leur activité antioxydante. Le radical ABTS•+ a été utilisé en post-colonne d’un
système CLHP afin d’identifier les composés phénoliques et de déterminer leur activité
antioxydante. Ceci a permis de comparer directement et simultanément l’activité de douze
composés phénoliques. Cette méthode a ensuite été appliquée à la bière afin de suivre l’évolution
des composés phénoliques et leur activité antioxydante correspondante au cours du procédé de
fabrication (maltage, brassage, ébullition, houblonnage et fermentation). Nous avons déterminé
que, contrairement à l’activité antioxydante, la teneur en composés phénoliques évolue au cours du
procédé de fabrication.
Mots-clés : bière, composés phénoliques, couleur, activité antioxydante, chromatographie liquide.
Study of technologic and functional interest compounds in beer
Abstract: The aim of this work was to develop an original malted beverage which was different by its
organoleptic properties, including its colorless appearance or brightly colors addition and its
nutritional and functional properties. Decoloration with active carbon powder produced a decolored
beer which could give a product with original colors. This work continued through the study of the
health benefits of beer phenolic compounds, i.e. their antioxidant activity. The radical ABTS•+ was
used post-column in an on-line HPLC method for the identification of phenolic compounds and the
determination of there antioxidant activity. This method allowed comparing directly and
simultaneously the antioxidant activity of twelve compounds. The method was then applied to beer
in order to follow the evolution of phenolic compounds and their corresponding antioxidant activity
during the process (malting, brewing, boiling, hopping and fermentation). Thus, contrary to the
antioxidant activity, variations were determined in the phenolic content during the process.
Keywords: beer, phenolic compounds, color, antioxidant activity, liquid chromatography.
154

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Thèse

Pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université de Strasbourg

Etude de composés à intérêts technologique et

Pr. Eric MARCHIONI Directeur de thèse

CHAPITRE 1 : CONTEXTE DE L’ETUDE.............................................................................................................. 11

1 PROCEDE DE FABRICATION DE LA BIERE ................................................................................................ 12

1.1 MATIERES PREMIÈRES ............................................................................................................................... 12

2 COMPOSITION ET PROPRIETES DE LA BIERE .......................................................................................... 18

2.1 LES COMPOSES PHENOLIQUES DE LA BIERE ..................................................................................................... 18

3 EFFETS DES PROCEDES SUR LES COMPOSES PHENOLIQUES DE LA BIERE................................................ 32

3.1 CHAUFFAGE ............................................................................................................................................ 32

4 METHODES D’ANALYSES DES COMPOSES PHENOLIQUES....................................................................... 35

CHAPITRE 2 : DECOLORATION DE LA BIERE .................................................................................................... 41

2 MATERIEL ET METHODES ....................................................................................................................... 44

2.1 REACTIFS, PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIELS VEGETAUX ............................................................................... 44

3 RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................................................... 53

3.1 DECOLORATION DU MOUT ......................................................................................................................... 53

CHAPITRE 3 : MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE ......................... 69

2 MATERIEL ET METHODES ....................................................................................................................... 72

2.1 REACTIFS ET PRODUITS CHIMIQUES .............................................................................................................. 72

3 RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................................................... 76

3.1 ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE ........................................................................ 76

CHAPITRE 4 : COMPOSES ANTIOXYDANTS DE LA BIERE .................................................................................. 89

2 MATERIEL ET METHODES ....................................................................................................................... 92

2.1 REACTIFS, PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIEL VEGETAL ................................................................................... 92

3 RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................................................... 97

4 CONCLUSION ....................................................................................................................................... 120

PUBLICATION ............................................................................................................................................... 121

CONCLUSION GENERALE .............................................................................................................................. 129

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................................ 135

ANNEXES ..................................................................................................................................................... 145

Par ailleurs, la concentration des substances d’intérêts fonctionnels va dans le sens du

Le manuscrit est divisé en quatre chapitres. Le premier chapitre présente le contexte de

La fabrication de la bière nécessite quatre ingrédients essentiels : les céréales, le houblon,

1.1 Matières premières

Figure 1.1 : Procédé de fabrication de la bière

Figure 1.2 : Réaction d’isomérisation des acides α

1.4 Filtration et cuisson

La fermentation se déroule généralement dans des cuves verticales cylindro-coniques (Tank

Le taux d’ensemencement (nombre de cellules par mL) à la fin de l’entonnement (remplissage

1.6 Garde, filtration et conditionnement

2.1 Les composés phénoliques de la bière

2.1.1 Structures générales

2.1.1.1 Les acides phénoliques

Figure 1.3 : Structures chimiques des acides phénoliques

2.1.1.2 Les flavonoïdes

2.1.2 Les composés phénoliques du houblon

La fleur de houblon possède 3 à 6% de composés phénoliques, principalement les acides

Les prénylflavonoïdes du houblon les plus abondants sont le xanthohumol, l’isoxanthohumol,

2.1.3 Les composés phénoliques de l’orge

L’orge et le malt contiennent également des caroténoïdes (lutéine et zéaxanthine) et des

2.2 Les propriétés des composés phénoliques de la bière

2.2.1 Propriétés dans la bière

2.2.1.1 Propriétés organoleptiques

Avec beaucoup d’autres composés de structures différentes (acides aminés et peptides,

2.2.1.2 Propriétés colorantes

La première réaction consiste en l’oxydation enzymatique des composés phénoliques natifs et

2.2.1.3 Propriétés antioxydantes

Un bon antioxydant doit présenter plusieurs propriétés : efficacité à faible concentration,