Université de Jijel

Cours de Biologie Moléculaire et Génie Génétique

Pour les étudiants en Licence Microbiologie

Pr. Mohamed Sifour

Université de Jijel
2020-2021

Contenu de la matière

Partie I : Biologie moléculaire :

1. Expression de l’information génétique: synthèse protéique (Transcription, Traduction).

2. Régulation de l’expression génique : Régulation transcriptionnelle, Régulation

traductionnelle.

3. Techniques de base de la biologie moléculaire :

o préparation des acides nucléiques (extraction et purification)
o séparations des acides nucléiques (électrophorèse sur gel d’agarose, en champ pulsé,…...).
o détection, caractérisation et identification des acides nucléiques (transfert sur membrane,
marquage, hybridation…).
o Le séquençage de l'ADN.
o amplification in vitro des acides nucléiques (PCR, RT (reverse-transcriptase)-PCR …).

Partie II : génie génétique : 1. clonage in vivo : 1.1. Éléments nécessaires au clonage

: l’ADN à cloner, enzymes de restriction, enzymes de ligation, les vecteurs de clonage, leur
construction et leurs caractéristiques, les cellules hôte. 1.2. Les étapes du clonage :
construction du vecteur, insertion de l’ADN à cloner, transformation des bactéries, sélection des
recombinants, analyse des recombinants. 2. Technologie de l’ADN recombinant : Synthèse
de protéines recombinantes, ADNc et vecteurs d’expression. Exemple de production de protéines
par E. coli et par Saccharomyces cerevisiae.
Sommaire
Partie I : Biologie moléculaire :
1- Rappel
1-1 Structure et fonction des gènes
1-1-1 Structure des acides nucléiques (ADN et ARN)
1-1-2 Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques
1-1-3 L’organisation de l’ADN dans les cellules
1-1-4 Structure de gènes
1-2 La réplication de l’ADN
1-2-1 La réplication chez les procaryotes
1-2-2 La réplication chez les eucaryotes
1-3 Réparation de l’ADN

2. Expression de l’information génétique

2-1 Le code génétique
2-2- La transcription
2-2-1- La transcription chez les procaryotes
2-2-2- La transcription chez les eucaryotes
2-3- La traduction
2-3-1- ARN de transfert
2-3-2- Les ribosomes et ARN ribosomaux
2-3-3- Les étapes de la traduction
2-3-4- Les modifications post-traductionnelles

3. Régulation de l’expression des gènes

3-1 Régulation chez les procaryotes
3-2 Régulation chez les eucaryotes

4. Techniques de base de la biologie moléculaire :

3-1 Outils et techniques de la biologie moléculaire
3-2- Synthèse d'oligonucléotides, Les enzymes de la biologie moléculaire, vecteurs de clonage …
3-3- Electrophorèse, PCR, Hybridation et sondes nucléiques, Séquençage de l'ADN …

Partie II : génie génétique

1- Génie génétique (définition, historique…)
2- Les banques d'ADN
3- Clonage (transformation, criblage, clonage dans les cellules eucaryotes, expression des gènes dans les
cellules procaryotes et eucaryotes
4- les applications du génie génétique

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1- Structure et fonction des gènes
1-1- Structure des acides nucléiques (ADN et ARN)
Structure de l’ADN
L’acide désoxyribonucléique (ADN) est un polymère contenant des monomères appelés
nucléotides (un polynucléotides).
Un nucléotide se compose de :
- Un sucre : Un pentose (à cinq carbones) appelé 2’-désoxyribose car le groupement OH sur
le deuxième carbone du ribose est remplacé par un atome d’hydrogène.

Figure1 : Ribose et désoxyribose

- Une base azotée

Une base purique (l’adénine et la guanine) ou pyrimidique (la cytosine et la thymine)

Figure 2: Principales bases azotées. Les principales bases azotées entrant dans la composition des acides nucléiques
se répartissent en deux familles chimiques: bases puriques et pyrimidiques. L'uracile est une base pyrimidique
spécifiquement trouvée dans l'ARN.

- Un groupement phosphate (PO4)

-Les bases sont attachées au sucre par une liaison entre :

- Le carbone 1’ du sucre et l’azote 9 des bases puriques
- Le carbone 1’ du sucre et l’azote 1 des bases pyrimidiques
-L’association d’un sucre et d’une base est appelée nucléoside

Un nucléotide contient un nucléoside et une ou plusieurs molécules d’acide phosphorique. Les

groupements phosphate sont liés au carbone 5’ du sucre. Dans la cellule, on rencontre les nucléotides à
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l’état libre (ils jouent un rôle important de transporteurs de l’énergie pour les réactions enzymatiques) ou
polymérisés sous forme d’ADN ou d’ARN).
Les acides désoxyribonucléotides sont de très grandes molécules généralement composées de deux
chaines polynucléotidiques enroulées l’une autour de l’autre pour former une double hélice d’un diamètre
de 2 nm.
Le phosphate en 5’ d’un nucléotide forme une liaison avec le carbone en 3’ du nucléotide suivant ; la
réaction conduit à l’élimination d’un groupement OH au niveau du carbone en 3’. La liaison est appelée 3’-
5’ phosphodiester. La chaine polynucléotidique possède un 5’ phosphate libre à une extrémité et un
groupement 3’ hydroxyle libre à l’autre extrémité.

La partie sucre et phosphate de la molécule d’ADN constitue sa

colonne vertébrale et est située à l’extérieure de l’hélice. Les bases
azotées se font face au centre de l’hélice et sont empilées les unes
sur les autres.
La doble hélice effectue un tour toutes les 10paires de bases
environ. Le pas de l’hélice est de 34Å (3.4nm).

La double hélice a une structure antiparallèle : l’un des brins est

orienté dans le sens 5’→3’ et l’autre dans le sens 3’→5’.
- L’adénine (A) est toujours associée à la thymine (T) par
deux liaisons hydrogène
- La guanine (G) est toujours associée à la cytosine (C) par
trois liaisons hydrogène
Cette appariement de bases AT et GC implique que les deux brins
dans une double hélice d’ADN sont complémentaire.

Rapport de Chargaff (Chargaff’s rulles): égalité des concentrations de A et de B, d’un coté, de G

et de C, de l’autre, d’où A/T=G/C=1 et (A+G)/(T+C)=1.

Le pourcentage GC est caractéristique de l’espèce.

Il existe un grand nombre de formes d’ADN, A, B, Z… la forme présente de façon majoritaire dans
les cellules est appelée ADN B.

Structure de l’ARN
Il existe plusieurs différences importantes entre l’ADN et l’ARN :
- Dans l’ARN, du ribose remplace le 2’-désoxyribose de l’ADN (figure 1).
- La thymine est remplacée par l’uracil (U) (aussi complémentaire de l’adénine).
- L’ARN est monocaténaire (simple brin). Un brin d’ARN peut se replier sur lui-même par appariement des
bases complémentaires pour former une structure en forme d’épingle à cheveux.
- Il existe trois principaux types d’ARN : l’ARN messager, l’ARN ribosomial et l’ARN de transfert.

1-2- Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques (voir TD)

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1-3- L’organisation de l’ADN dans les cellules
L'ADN semble être beaucoup plus organisé dans la chromatine des eucaryotes et est associée avec
plusieurs protéines, les plus importantes étant les histones.
Les histones sont de petites protéines basiques riches en acides aminés, lysine et/ou arginine
(chargés positivement).Les charges positives leur permettent de s’associer fortement à l'ADN
chargé négativement (les charges négatives du phosphore de l'ADN).
Les cinq types d'histoires chez presque toutes les cellules eucaryotes: H1, H2A, H2B, H3 et H4. Le
nucléosome est composé de huit molécules d'histones (deux de H2A, de H2B, de H3, et de H4)
associés à environ 200 pb d'ADN.
L'association de l'ADN et de protéines qui constitue les chromosomes est appelée chromatine. La
molécule d'histone H1 participe à la compaction d'ADN.
Les protéines non histones (acides) sont mises en jeu dans plusieurs aspects du fonctionnement de
la chromatine, notamment la régulation de l'expression des gènes.

Bien que l'ADN existe en double hélice à la fois chez les procaryotes et les eucaryotes, son
organisation est différente dans les deux types cellulaires. L’ADN est organisé en en cercle fermé
chez presque tous les procaryotes (le chromosome du Borrelia est fait d’une molécule d’ADN
linéaire). Cette double hélice circulaire est de plus enroulée en superhélice et est associée à des
protéines basiques et non pas avec les histones complexées à presque tous les ADN eucaryotes.
Ces protéines qui ressemblent à des histones, ont apparemment pour fonction d’organiser l’ADN
bactérien en une structure enroulée de type chromatine.

1-4- Structure de gènes

L’information biologique est codée par la séquence des bases azotées de l’ADN, elle est organisée
en un grand nombre de gène dont chacun contient les informations nécessaires à la synthèse d’un
peptide.
Un gène est une unité d’information et il correspond à un segment d’ADN qui code la séquence
des acides aminés d’une protéine.
Un gène peut être aussi défini comme une séquence polynucléotidique codant pour un
polypeptide, un ARNt ou un ARNr.

Les gènes ont des tailles très variables : de 100 paires de bases à plusieurs millions de paires de
bases.

Introns et exons
Les gènes des procaryotes ont une structure très différente de celle des gènes des eucaryotes.
Dans les gènes bactériens et viraux, l’information codante est habituellement continue (il y a des
gènes bactériens qui contiennent des introns) alors que chez les eucaryotes, les gènes contiennent
des séquences codantes (exons) interrompues régulièrement par des séquences non codantes
(introns). [Une exception intéressante à cette règle concerne les gènes eucaryotes des histones
qui ne possèdent pas d’introns].

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Les promoteurs des gènes
L’expression des gènes est réglée par un fragment de la séquence d’ADN présent en amont de la
séquence codante: le promoteur
Des séquences conservées d’ADN du promoteur sont reconnus par l’ARN polymérase qui s’y fixe,
ainsi que des protéines associées appelées facteurs de transcription et qui permettent la
transcription du gène en ARN.

Expression des gènes

L’information biologique codée dans les gènes est rendue disponible lors de l’expression des
gènes. Au cours de ce processus, une copie ARN du gène est synthétisée et elle dirige ensuite la
synthèse d’un polypeptide.
L’utilisation de l’information est décrite par le « dogme central ». Il pose que le transfert
d’information est unidirectionnel : dans le sens ADN ARN Protéine
[Exception : les rétrovirus possèdent une enzyme appelée transcriptase inverse (reverse
transcriptase) capable de synthétiser une copie d’ADN d’un fragment d’ARN].
Le fonctionnement d’une cellule dépend de l’activité coordonnée de nombreuses protéines.
L’expression des gènes assure que les protéines sont synthétisées au bon endroit et au bon
moment.

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2. La réplication
2.1. La réplication est semi-conservative
La réplication est le processus par lequel une cellule copie son
ADN. La réplication est nécessaire pour que l’information
génétique présente dans les cellules puisse être transmise aux
cellules filles après la division cellulaire. L’ADN est copié dans le
sens 5’  3’ par l’ADN polymérase. Ces enzymes travaillent sur de
l’ADN monobrin en synthétisent un nouveau brin Molécule mère

complémentaire du brin original.

La réplication est dite semi-conservative car, dans chaque Brins

parentaux
molécule fille d’ADN, un brin provient de la molécule mère, et un
autre brin est nouvellement synthétisé. La réplication fournit deux
molécules d’ADN identiques entre elles est identique à la Brins fils

molécule mère.

Molécule d’ADN Filles

Figure 6 : la réplication semi-conservative de l’ADN

2.2. La topologie de l’ADN
Le super-enroulement de l’ADN est physiologiquement fondamental aussi bien sur le plan
structural que fonctionnel. Les enzymes responsables des super-enroulements sont appelées les
topoisomérases. Ces enzymes sont très conservées et sont présentes chez toutes les espèces avec
pour rôle principale celui de contrôler l’état topologique de la molécule d’ADN. Pour cela, ces
enzymes doivent pouvoir créer des superenroulements (appelés également supertours) pour
modifier le nombre d’enlacements de l’ADN, ce qui ne peut être rendu possible que si ces
enzymes coupent l’ADN sur un ou deux brins. On en connait ainsi deux types :
- Topoisomérase de type I: Ces enzymes se fixent au DNA, elle coupe l’un des 2 brins, elles
s’attachent ensuite par l’une de leur tyrosine au groupement 5’ phosphate libre de l’ADN coupé.
L’ADN peut alors se dérouler, l’enzyme répare ensuite la cassure en libérant l’ADN avec des
supertour en (-). Cette coupure, puis la régénération de la liaison initiale après le déroulement de
l’ADN, ne consomme pas d’ATP, puisque l’énergie de la liaison phosphodiester rompue est
conservée par la liaison avec le résidu de tyrosine de l’enzyme.
Topoisomérase de type II: elles coupent l’ADN sur les 2 brins puis le ressoudent après avoir crée
des superenroulement négatifs, ou après avoir supprimé les supertours positifs. Cette action
nécessite l’hydrolyse d’une molécule d’ATP
Donc le rôle de ces enzymes est de superenrouler négativement l’ADN pour permettre sa
compaction dans la cellule, et permettent des événements majeurs de la vie cellulaire comme la
transcription et la réplication (dérouler les deux brins).

Exemple : La gyrase bactérienne (inhibé par les antibiotiques).

2.3. Les polymérases
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Ces enzymes sont capables de synthétiser le brin d’ADN complémentaire d’un brin d’ADN parental
servant de matrice (template). Elles catalysent la formation des liaisons ester entre le groupement
5’ phosphate d’un dNTP libre et le groupement 3’ hydroxyle libre du brin d’ADN en formation. La
polymérisation nécessite en outre la présence d’une amorce (primer), séquence d’ARN (10 à 40 N)
hybridée au brin à copier et synthétisée par une ARN polymérase (primase).
La polymérisation doit être dirigée par une matrice, en l’occurrence le brin de DNA à copier, selon
les règles de l’appariement des bases de Watson-Crick (A = T, G = C). Les polymérases ajoutent des
nucléotides au brin en cours de formation en se déplaçant le long de la matrice, puis elles s’en
dissocient.

L’ADN polymérase, connue actuellement sous le nom de DNA polymérase I, a été isolée d’E. coli
par A. Kornberg en 1955. Par la suite, au moins quatre autres polymérases ont été décrites, les
polymérases II, III, IV et V. La polymérase III est l’enzyme essentiel pour la synthèse des chaînes
polynucléotidiques chez E. coli, tandis que la polymérase I joue un rôle dans la synthèse du brin
retardé et que les polymérases II, IV et V interviennent dans la réparation du DNA.

Les ADN polymérases possèdent une activité de polymérisation dans le sens 5’---> 3’et une activité
exonucléasique dans le sens 3’--> 5’. L’ADN polymérase I possède de plus une activité
exonucléasique dans le sens 5’--> 3’ (dégradation des amorces).

La DNA polymérase III est l’enzyme responsable de la synthèse de l’ADN chez E. coli ; d’une masse
d’environ 800 kDa, elle est constituée de 10 types différents de sous-unités.

La DNA polymérase I n’est pas l’enzyme responsable de la synthèse du DNA, mais elle effectue
diverse tâches lors de la réplication, de la réparation ou des recombinaisons du DNA. C’est une
chaîne polypeptidique unique de 103 kDa qui possède, outre une activité polymérase et une
activité exonucléase de relecture 3’-->5’, une activité exonucléase 5’-->3’ localisée dans un
domaine qui peut être séparé de l’enzyme par un traitement protéasique limité. Lorsque ce
domaine est éliminé, il demeure un fragment de 68 kDa, dit fragment de Klenow, qui retient les
activités polymérase et exonucléase de relecture.

Chez les eucaryotes supérieurs (mammifères), les ADN polymérases, au nombre minimum de cinq.
Alpha (α), bêta (β), delta (δ) et epsilon (ε) (polymérase nucléaires) assurent l’activité de
polymérisation 5’-->3’. Gamma (γ) (polymérase mitochondriale). (δ) et (ε) ont une activité
d’éxonucléase 3’-->5’.

La réplication démarre à l’intérieur de la molécule d’ADN en un point appelé origine de réplication.

Les origines de réplication contiennent généralement des séquences riches en appariements
faibles A-T. la région ou’ la double hélice est déroulée et du nouvel ADN synthétisé est appelée
fourche de réplication (replication fork)

2.4. Réplication chez les procaryotes

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La réplication du DNA se déroule en trois phases : initiation, élongation et terminaison. Chez E.
coli, l’origine de réplication est un site unique du DNA de 245 pb, dénommé locus Ori C. la protéine
dnaA induit la séparation des deux bri d’ADN et définit l’origine de réplication puis des protéines
dnaB et C (respectivement une hélicase et une primase) vont catalyser la formation d’une fourche
de réplication. La séparation des deux fourches s’effectue dans les deux sens (2 fourches de
réplication). Une topoisomérase, la DNA-gyrase, élimine les supertours formés par le déroulement
du DNA. Ensuite, des protéines SSB (Single-Stranded DNA-Binding Protein) se fixent sur les brins
séparés de DNA et maintenir les deux brins sous une forme monocaténaire indispensable à leur
fonction de matrices. Les protéines qui interviennent dans cette étape d’initiation forment le
complexe d’initiation, encore appelé primosome.

Réplicon : la portion du génome qui contient une origine et qui se réplique en une seule unité.

Figure 7: une seule origine de réplication chez les procaryotes. Les flèches indiquent le sens de déplacement de la
fourche de réplication (E. Passarge, Color Atlas of Genetics, 2007)

La formation d’un brin d’ADN complémentaire (élongation) s’opère par additions successives de
désoxyribonucléotides à un oligonucléotide en élongation. La polymérisation ne s’opère que dans
le sens 5--> 3’. Comme les deux brins d’ADN sont antiparallèles, un des brins en formation, le brin
avancé, s’allongera de façon continue dans le sens 5--> 3’, sens de déplacement de la fourche de
réplication. L’autre brin, dit retardé, se forme de façon discontinue par de petits fragments d’ADN
de 1000 à 2000 nucléotides (fragments d’Okazaki) dont la synthèse et à chaque fois amorcé dans
le sens 5--> 3’ (sens inverse du déplacement de la fourche).

L’ADN polymérase III va s’insérer dans la fourche au niveau de l’amorce d’ARN synthétisée par la
primase, puis elle ajoute les désoxynucléotides au fur et à mesure du déroulement du DNA par
l’hélicase et de l’élimination des supertours par l’ADN gyrase.

Chaque fragment d’Okazaki a une amorce, quand l’ADN polymérase III arrive à l’extrémité 5’ de
l’amorce précédente, elle est remplacée par la polymérase I qui agit d’abord comme une

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éxonucléase en dégradant l’ARN dans le sens 5--> 3’, puis comme une polymérase en remplaçant
l’amorce ARN par l’ADN.
Les différents fragments du brin retardataire sont ensuite réunis par l’enzyme ADN ligase (elle va
établir une liaison phosphodiester entre une extrémité 5’ monophosphate d’un fragment et
l’extrémité 3’ hydroxyle de l’autre fragment).

Sens de propagation de la réplication

Figure 8: réplication de l’ADN

Chez E. coli, la fourche de réplication de l’ADN circulaire s’arrête lorsque le complexe de

polymérisation atteint la région de terminaison (Ter).

Figure 9: réplication des molécules circulaires d’ADN

NB : un modèle différent de réplication de l’ADN est observé durant la conjugaison chez E. coli et
la multiplication des virus, tel le phage lambda : mécanisme du cercle roulant (rolling circle).

2.5. Réplication chez les eucaryotes

Les grands principes de la réplication sont les même chez les procaryotes et les eucaryotes. La
réplication est bidirectionnelle, complémentaire, antiparallèle, simultanée pour chaque brin mais
discontinue pour l’un des deux brins, elle s’effectue dans le sens 5’-3’, avec des amorces d’ARN.
Mais comme le génome est plus grand et réparti sur plusieurs chromosomes, il existe plusieurs
sites d’initiation sur chaque chromosome (plusieurs origines).
L’ADN des chromosomes des eucaryotes est emballé sous forme de complexes ADN-protéines
(nucléosome). Lorsque la fourche de réplication progresse l’ADN doit être déroulé du nucléosome

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pour que la réplication puisse avoir lieu. Ceci ralenti la fourche de réplication (et pourrait expliquer
la faible longueur des fragments d’Okasaki chez les eucaryotes (100 à 200 bases) en comparaison
avec ceux des procaryotes (1000-2000). Après le passage de la fourche de réplication, les
nucléosome se reformant.
Le brin avancé est synthétisé par le complexe ADN polymérase δ/protéine PCNA (proliférating cell
nuclear antigen). Le brin retardé, les amorces d’ARN et les fragments d’Okasaki serait l’œuvre
d’une primase et de l’ADN polymérase α. L’élimination des amorces ARN est assurée par une
Arase H (hybride), et leur remplacement par l’ADN résulte de l’activité des polymérases α et β.

Figure 8: une seule origine de réplication chez les eucaryotes. Les flèches indiquent le sens de déplacement de la
fourche de réplication (E. Passarge Color Atlas of Genetics, 2007)

La réplication des chromosomes linéaires des eucaryotes pose un problème qui n’existait pas pour
les chromosomes circulaires des procaryotes : les deux amorces se situent aux extrémités de
chaque brin fils néosynthétisés ne pourront être remplacées. Cela conduirait à un
raccourcissement des chromosomes à chaque cycle de réplication.

Le problème est résolu par l’intervention d’une télomérase. Afin de permettre la réplication de ces
extrémités, la télomérase leur ajoute des séquences non codantes.

3. Réparation de l’ADN
La polymérisation du DNA s’effectue avec une extrême fidélité, moins d’une erreur pour 109
nucléotides ajoutés (1 sur 1 milliard). Cette fidélité est due non seulement à la spécifité
d’appariement des Bases AT et GC mais aussi à la propriété de la correction d’épreuves de l’ADN
polymérase III (au moment de la réplication), cette activité 3’-->5’ exonucléase permet à l’enzyme
d’éliminer tout nouveau nucléotide qui présenterait un mésappariement de bases.

3.1. Les mutations (TD)

3.2. Les agents mutagènes (TD)
3.3. Réparation
Réparation directe
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Il existe des enzymes capables de reconnaître les bases modifiées, de retirer ces modifications et
de revenir à des bases normales. La guanine peut être transformée en O6-methylguanine (par des
agents alkylants) elle peut s’apparier par erreur avec la thymine. La réparation de cette
méthylation s’effectue de manière directe (sans coupure de l’ADN) par O 6-methylguanine
méthyltransférase, qui transfère le groupement en question de la base vers un de ces acides
aminés.
La photoréactivation: qui répare les dimères pyrimidiques produit par les radiations UV. ADN
photolyase induite par la lumière visible répare les dimères pyrimidiques en cassant les liens qui se
forment lors de la dimirisation.

Réparation par excision

La réparation des dimères pyrimidiques (dimères de thymines) peut s’effectuer par un système de
réparation spécifique (nucleotide excision repair). L’enzyme UvrABC (chez E. coli) peut reconnaitre
la déformation de l’ADN provoquée par le dimère de thymine et coupe l’ADN en amont ou en aval
de celui-ci. L’ADN polymérase comble l’espace manquant selon le modèle du brin parental. La
ligase relie le fragment réparé et le reste de l’ADN.

Réparation des mésappariement (Mismatch Repair)

Ce système corrige les erreurs introduit durant la réplication de l’ADN et n’ont pas été corrigés par
l’activité de l’ADN polymérase. La réparation de ce défaut nécessite la reconnaissance à la fois du
brin parental et du brin néoformé. Chez E. coli, le brin parental est facilement identifié puisqu’il est
marqué avec des adénines méthylées. Le brin naissant porteur de l’erreur est ainsi reconnu puis
coupé et le fragment d’ADN incorrect est ensuite éliminé. Il est ensuite remplacé grâce à l’action
combinée de plusieurs protéines (Mut H, Mut S, Mut L, SSB, exonuléase I, ADN polymérase III et
Ligase).

Réparation par recombinaison

Il arrive qu’au moment de la duplication de l’ADN la fourche de réplication rencontre sur un des
brins matrice une lésion ancienne qui n’a pas pu être réparée (dimère de thymine…). L’information
génétique est donc perdue puisque les deux brins parentaux sont déjà séparés. Chez E. coli, RecA
est la protéine qui assure la réparation par recombinaison. Elle va utiliser la deuxième hélice
d’ADN intacte pour reconstituer celle qui est lésée et combler la lacune sur le brin fils en face du
dimère de thymine. Ceci créé donc une lacune située cette fois sur le brin parental de l’autre
double hélice, mais qui possède un brin fils normal, à partir duquel une polymérase pourra
combler la lacune. Sur l’autre double hélice, les systèmes d’excision-resynthèse pourront enlever
le dimère de thymine et combler la lacune car le brin fils est redevenu normal.

Expression des gènes SOS (SOS repair)

L’arrêt de la réplication (quand les erreurs sont graves) provoque l’apparition d’ADN
monocaténaire reconnu par l’enzyme de réparation RecA. Celle-ci opère en assurant des
recombinaisons et en induisant l’autolyse du répresseur des gènes SOS, la protéine LexA. Cette
enzyme induit ainsi l’expression des gènes SOS (recA, lexA, uvrA, uvrB, et d’autres gènes).
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4. le code génétique
Les acides aminés sont codés par 64 triplets de bases appelés codons.
Codon = triplet de nucléotides (ex : AGC = Ser)
Chaque protéine est codée par un gène (ou plusieurs si la protéine est polymérique). L’unité de
base des protéines est l’acide aminé. Chaque acide aminé est codé par un codon.

Propriétés du code génétique

 Dégénéré : Un acide aminé est codé par plusieurs codons
La plupart des acides aminés sont désignés par plus d’un codon (à l’exception de la méthionine et
du tryptophane). La dégénérescence du code génétique aide à minimiser les effets des
mutations. Le code d’initiation, qui code la méthionine, est AUG. Il y a trois codons stop : UAG,
UGA et UAA.
Tableau 1 : le code génétique standard

 Universel : Identique chez tous les êtres vivants (exception : ADN mitochondrial et certains
organismes unicellulaires).
 Non chevauchant: Les codons sont lus en série depuis un point de départ jusqu’au codon stop

Phase de lecture
A partir d’une séquence quelconque, suivant la base choisie pour commencer un codon, il est possible de
lire trois ensembles de codons. Chaque ensemble de codons est appelé une phase de lecture. C’est le
codon d’initiation qui détermine la phase de lecture d’une séquence qui code une protéine. Les autres
phases de lecture ont tendance à comporter des codons stop et elles ne sont pas utilisées. Une phase
ouverte de lecture (Open Reading Frame : ORF) est une séquence de codons bornée par un codon start et
un codon stop.
NB : Les mitochondries sont dotées d’un petit génome d’ADN qui contient environ 20 gènes pour lesquels
ont peut observer des déviations par rapport au code génétique standard.

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5. La transcription
C’est la première étape de l’expression génétique et elle met en jeu la synthèse par RNA
polymérase un ARN à partir d’une matrice d’ADN. L’ARN est synthétisé à partir du brin matrice
(transcrit, antisens) et a donc la même séquence que le brin non matrice (codant, sens,
informatif). La polymérisation se fait dans le sens 5’-->3’, donc lecture du brin d’ADN dans le sens
3’-->5’.

5.1. La transcription chez les procaryotes

La transcription s’effectue chez les bactéries grâce à une seul enzyme, l’RNA polymérase. C’est une
enzyme de grande taille (PM 450000) contenant 5 sous-unités : 2 α, β, β’, et σ. Cette forme (α2 β
β’σ) est appelée holoenzyme. La sous-unité σ peut se dissocier des autres sous-unités pour laisser
une forme (α2 β β’) appelée enzyme centrale (le cœur) (core enzyme).
La transcription comporte trois étapes essentielles.

Initiation: Chez toutes les bactéries, le démarrage de la transcription est conditionné par la
reconnaissance de séquences spécifiques de l’ADN appelées sites promoteurs. La séquence
promoteur procaryote n’est pas transcrite. Dans les promoteurs d’E. coli, on trouve une séquence
de six bases (TTGACA), la séquences –35 (35 bases en amont du site d’initiation), et aussi une
séquence TATAAT boite de Pribnow (TATA Box) qui se situe environ 10 bases en amont du site
d’initiation (région -10). La sous-unité σ de l’ARN polymérase est responsable de la reconnaissance
des séquences -10 et -35 et de la liaison au promoteur. Une fois l’ARN polymérase fixées à la
région -35, les deux brins d’ADN se séparent temporairement autour de la région -10 autorisant le
début de la transcription. Le premier nucléotide utilisé par l’ARN polymérase est souvent une
purine.

L’élongation : Après l’allongement des 90 premiers nucléotides, le facteur σ se détache de l’ARN

polymérase pour aller assure un nouveau démarrage de la transcription. La polymérase poursuit
l’allongement de la chaine de l’ARN par l’addition des ribonucléotides. L’ARN en cours de
formation reste lié à l’ADN sur une longueur d’environ 12 nucléotides compris dans la bulle
formée par séparation des deux brins d’ADN. A mesure que l’ARN polymérase avance la partie
proximale de la molécule d’ARN se détache de l’ADN permettant ainsi à la double hélice d’ADN de
se reconstituer.

La terminaison : peut s’accomplir de deux manières :

a) par la reconnaissance d’une séquence de l’ADN appelée terminateur. Il s’agit d’une séquence
palindromique riche en base G-C suivie d’une région riche en adénine. Quand cette séquence est
transcrite, l’ARN forme un appariement intrabrin en épingle à cheveux qui contribue à détacher
l’ARN polymérase en libérant la molécule d’ARN appelée aussi transcrit primaire.
b) un autre mécanisme d’arrêt de la transcription complémentaire du premier est parfois assuré
par une protéine spécifique, le facteur ρ (rho) qui interagit avec l’hybride ADN/ARN et le dissocie
en consommant de l’ATP.

14
 Figure 9 : Séquences consensus des promoteurs et terminateurs chez les procaryotes

Les ARN procaryotes sont dits polycistroniques car ils codent généralement plus d’une chaine
polypeptidique. Une molécule d’ARNm polycistronique peut contenir des espaces
intercistroniques appelés espaceurs.
Exemple : l’opéron lactose

Figure 10 : ARNm polycistronique: dans un opéron bactérien, un promoteur contrôle la

transcription de plusieurs séquences codantes (cistrons)

5.2. La transcription chez les eucaryotes

Chez les eucaryotes, il existe trois ARN polymérases I, II et II, et une ARN polymérase
mitochondriale.
- ARN polymérase I : présente dans le nucléole, catalyse la synthèse des ARNr (sauf l’ARNr 5S)
- ARN polymérase II : présente dans le nucléoplasme, responsable de la synthèse des ARNm
- ARN polymérase III : présente dans le nucléoplasme, responsable de la synthèse des ARNt et
l’ARNr 5S
Les ARN polymérases eucaryote sont généralement d’une masse moléculaire supérieure à celle de
l’ARN polymérase eucaryote (supérieure de 500000 Daltons).
Bien que la transcription reste dan son principe identique chez les eucaryote et les procaryotes,
des différences, parfois importantes, existent. Elles tiennent à la structure de la matrice d’ADN,
aux polymérases, et aux modifications post-transcriptionnelles que subissent les transcrits
primaires de l’ARN.
15
 Chez les eucaryotes la transcription, qui s’opère dans le noyau, est beaucoup plus complexe car
elle nécessite une altération localisé et réversible de la structure de la chromatine. Le démarrage
s’effectue grâce aux séquences promotrices se trouvant autour des positions -25 et -75. Un facteur
TBP (TATA Binding Protein) est responsable de la reconnaissance du site d’initiation. L’arrêt de la
transcription est annoncé par une région du brin transcrit riche en base T (TTATT).

Figure 11: Promoteurs et terminateurs eucaryotes

ARN polymérase I
La synthèse de l’ARN ribosomal s’effectue dans un compartiment spécialisé du noyau, le nucléole.
Les ARN 5.8S, 18S et 28 S sont synthétisés en quantités équimolaires par l’ARN polymérase I sous
forme d’un ARN précurseur 45S (l’ADN contient un grand nombre de copies des gènes des ARNr).

ARN polymérase III

ARN polymérase III copie: - l’ARNr 5S - les ARNt
- certains ARN nucléaires appelés petits ARN nucléaires ou ARNsn
La transcription des ARNt nécessite les facteurs TFIIIB et TFIIIC. L’ARNt subit un processus
d’épissage (élimination de l’intron) avant de passer dans le cytoplasme. Le processus d’élimination
de l’intron est assez différent de celui utilisé pour l’ARNm.
Un troisième facteur TFIIIA est nécessaire pour la transcription des gènes de l’ARNr 5S (pas de
maturation pour l’ARN 5S et ARNsn).

ARN polymérase II
Les ARNm eucaryotes sont monocistroniques et possèdent une durée de vie assez longue. La
liaison de l’ARN polymérase à la boite TATA (-25) est assistée par une série de facteurs de
transcription: TFIIA, TFIIB, etc. Les ARNm sont protégés à leur extrémité 5’ par une coiffe (capping)
composée d’une guanosine méthylée liée par un groupe triphosphate au premier ribonucléotide.
Cette modification apportée à l’ARN en cours de transcription est reconnue par les ribosomes lors
de l’initiation de la traduction. Une fois le transcrit primaire est libéré, l’extrémité 3’ est modifiée
par addition de 100 à 200 résidus d’acide adénylique (polyadénylation) grâce à l’action d’une
polyA-polymérase, qui utilise des ATP comme donneurs d’adénine. La queue de poly A à pour rôle
de permettre l'exportation de l'ARNm dans le cytosol, ainsi que de l'y stabiliser. (Les ARN des
histones ne possèdent pas de queue poly A).

L’ARN transcrit connues sous le nom ARN nucléaires hétérogènes (ARNnh) ou ARN prémessagé.
L’épissage de l’ARNm nucléaire est une étape majeure de sa maturation. Ce processus est
l’élimination des séquences non codantes (introns) pour produire des ARNm matures. Plusieurs
rubonucléoprotéines (snRNP : Small nuclear ribonucleoproteins, ou snurps) interviennent dans le

16
processus d’épissage. Ce des complexes (splicéosome) contenant de petits ARN nucléaire (snARN),
U1 àU6.
L'excision-épissage est réalisée par réaction d'un nucléotide à adénine (A) situé dans l'intron avec
un nucléotide à guanine situé en 5' de l'intron. Cela entraîne la séparation de l'intron d'avec l'exon
1 (situé en amont) et la formation d'une structure en lasso interne à l'intron. Ensuite, l'extrémité 3'
de l'exon 1 réagit avec l'extrémité 5' de l'exon 2 permettant l'épissage des deux exons et la
libération du lasso qui sera dégradé par des ribonucléases.

http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/transcription/transcription.htm
La transcription chez les eucaryotes, Auteurs : Françoise Ibarrondo, Gilles Camus
Document publié le : 12 décembre 2006

6. La traduction
6.1. ARN de transfert
L’extrémité 3’OH est terminée par le triplet CCA ou’ ce produira une liaison ester entre l’ARNt et
l’AA. Une zone anticodon qui se lie par des liaisons faibles (hydrogène) au codon présent dans
l’ARNm. La boucle de l’anticodon porte une séquence de trois bases, qui reconnait et hybride un
codon complémentaire porté par l’ARNm.
Avant de participer à la traduction de l’ARNm, les ARNt fixent l’AA correspondant à leur anticodon.
Chaque AA est d'abord activé, en présence d’ATP, par une aminoacyl ARNt synthétase qui
catalyse en une première étape la formation d’un aminoacyl-AMP. L’enzyme reste liée au
complexe aminoacyl-AMP jusqu’à la rencontre d’un ARNt spécifique de l’AA. Dans une deuxième
étape, l’AA est transféré sur l’extrémité 3’OH de l’ARNt et forme un aminoacyl-ARNt. C’est à partir
de ces aminoacyl-ARNt que les AA seront assemblés pour former les protéines.

6.2. Les ribosomes et ARN ribosomaux

La comparaison des séquences de protéines ribosomales de plusieurs organismes révèle une très
grande conservation au cours de l’évolution. Les ARNr sont aussi très bien conserves.
Les deux sous unités sont souvent libres et ne s’associent qu’au moment de la traduction.
La fonction principale des ribosomes est d’orienter correctement les aminoacyl ARNt par rapport à
l’ARNm et de créer les liaisons peptidiques.

17
Plusieurs ribosomes peuvent successivement commencer la traduction de la même molécule
d’ARNm constituant un polysome ou polyribosome.

6.3. Les étapes de la traduction

 La traduction de l’ARN en protéines s’accomplit toujours dans le sens 5’….3’.
 Chez les procaryotes la traduction commence avant même la fin de la transcription.
 Chez les eucaryotes les ARMm sont transcrits puis maturés dans le noyau. Ils migrent
ensuite dans les cytoplasmes pour y être traduits en protéines.
L’initiation :
 « codon initiateur » : AUG situé à environ 100 pb de l’extrémité 5’ de l’ARNm, indiquant le
début de la traduction.
 AUG=Met (chez les bactéries: N-formyl-méthionine): toutes les protéines commencent par
une méthionine (qui sera clivée lors de la maturation de la protéine)
 Petite sous-unité s’associe avec l’ARNm au niveau du codon AUG avec l’ARNt portant la Met
 Grande sous-unité se fixe à ce complexe pour former le ribosome fonctionnel
 IF3 empêcherait l’association des sous-unités 30S et 50S
 IF2 lie le GTP au fMet-ARNt et dirige la liaison du fMet-ARNt à la sous-unité 30S
 La seconde étape est l’association de fMet-ARNt et de l’ARNm à l’ensemble IF-30S-GTP au
niveau d’une séquence de l’ARNm (AGGAGGU) appelée site de fixation du ribosome (RBS:
Ribosome Binding Site) ou séquence de Shine Dalgarno.
 Le codon AUG initiateur et défini par l’hybridation entre la séquence RBS et une séquence
proche de l’extrémité 3’ de l’ARN 16S.
 Chez les eucaryotes, les ribosomes reconnaissent la coiffe méthylée grâce à des facteurs
appelés protéines fixatrices de la coiffe (Cap binding protein).
 IF3 et ensuite libéré permettant l’association entre les deux sous-unités (50S et 30S).
 IF-1 empêche la fixation d'ARNt sur la partie de la petite sous-unité qui fera partie du site A.

L’élongation
- Chaque ribosome possède deux sites de fixation pour l’ARNt : P (peptidyl) et A (Aminoacyl).
- Le premier site P est occupé par le fMet-ARNtfMet apparié à l’AUG de l’ARNm.
- Le site A peut alors recevoir l’aminoacyl-ARNt dont l’anticodon cerrespond au second codon de l’ARNm.
Une liaison peptidique est établie entre le groupement COOH du premier acide aminé et le groupe NH2 du
second acide aminé grâce à l’enzyme peptidyl transférase, composante de la sous-unité 50S.
- A la suite de cette liaison, l’ARNtfMet déchargé quitte le site P. Le dipeptide se trouve alors lié à
l’ARNt portant le deuxième acide aminé et placé au site A.
- Ce peptidyl ARNt se déplace ensuite vers le site P par mouvement relatif de l’ARNm d’une
longueur de trois bases. Le site A peut alors recevoir un nouvel aminoacyl-ARNt. Une fois dans le
18
site A, une liaison peptidique associe l’acide aminé à celui qui le précédait dans le site P. La
répétition de ces mouvements engendre l’élongation du polypeptide. L’allongement de la chaine
polypeptidique nécessite l’hydrolyse du GTP.
- des facteurs d’élongation (EF : Elongation Factors) sont également indispensables.
- EF-Tu réagit avec le GTP et l’ARNt chargé pour former le complexe aniacylARNt-GTP-EF-Tu et
placer, grâce à l’hydrolyse du GTP en GDP, l’aminoacyl-ARNt au site A du ribosome.
- EF-Ts participe à la génération du complexe EF-Tu-GTP.
- la translocation (le déplacement du peptidyl-ARnt du site A au site P) se fait par l’intermédiaire
du facteur d’élongation EF-G qui se fixe au ribosome avec du GTP qui est ensuite hydrolysé ce qui
libère de l’énergie pour la translocation.
- Les mécanismes d’allongement (élongation) de la chaine peptidique chez les eucaryotes
s’avèrent similaires avec la participation des facteurs d’élongation eEF1et eEF2.

La terminaison :
S’effectue quand le ribosome rencontre un codon stop (Aucun ARNt ne se fixe en face de ce
codon).
L’intervention d’un facteur de terminaison (RF : Release Factors). Les RF entrent dans le site A et
provoquent la libération du polypeptide achevé. Chez E. coli, RF1 reconnait UAG et UAA et RF2
reconnait UGA et UAA. Che les eucaryotes, le facteur de terminaison appelé eRF.

N.B : un même ARNm peut servir de matrice à plusieurs ribosome en même temps = polysome

19
La régulation de l’expression des gènes
La quantité des protéines synthétisées par une cellule ne sont pas nécessairement fixes mais
varient en fonction des besoins de la cellule.
Afin de conserver l’énergie et de ressources, les cellules règlent l’activité de leurs gènes de façon
que seuls les produits génétiques nécessaires à leur fonctionnement soient fabriques.
Ex: La bactérie ne synthétise des métabolites (AA) que lorsqu’elle ne peut les prélever du milieu.
a- Enzymes constitutives : La synthèse et l'activité de ces enzymes ne subit pas de contrôle, car
elles sont nécessaires en quantités égales quelle que soit les conditions de croissance.
b- Enzymes inductibles (adaptatives): Ces enzymes sont produites uniquement en présence du
substrat (exemple: la bêta-galactosidase).

La régulation chez les procaryotes

L’organisation des gènes chez les bactéries se fait suivant des opérons.
C’est sur ce type que les premières études de la régulation ont été menées.
 L’opéron Lactose : regroupe trois gènes (lac Z, lac Y et lac A) codant pour enzymes nécessaires à
l’utilisation du lactose par la bactérie (E. coli)

 Les trois gènes de structure:

- lac Z code une -galactosidase qui hydrolyse le lactose en galactose et en glucose
-lac Y code une perméase permettant au lactose de pénétrer dans la cellule
-lac A code une acétylase
- Un promoteur P (unique pour les trois gènes)
- Un opérateur O (élément de contrôle de la transcription)
- Gène régulateur lac I (en amont du promoteur): codant pour le répresseur qui règle l’expression des gènes
lac Z, lac Y et lac A

- En l’absence de lactose:
Le promoteur de lac I permet la transcription du gène lac I, donc la synthèse du répresseur (lac) et
formation de tétramère lac.
Fixation du répresseur la région opératrice O lac et blocage de la transcription des gènes de structure
(empêcher la fixation de l’ARN Polymérase au site d’initiation de la transcription). Ainsi, il y a régulation

20
négative de la transcription des gènes de l’opéron lactose. Les enzymes nécessaires au métabolisme du
lactose ne sont pas synthétisées car inutiles en absence de lactose.

En présence de Lactose :
• Le gène régulateur continue de synthétiser la protéine répresseur,
• Le répresseur va s’associer au lactose présent dans le milieu
• Changement de conformation, donc le répresseur n’est plus capable de se fixer à l’opérateur.
• L’ARN polymérase peut alors se fixer sur le promoteur et transcription les trois gènes de structure
qui donneront les trois enzymes nécessaires à l’utilisation du lactose par les bactéries.
• On peut dire que le système de régulation de la voie de dégradation du lactose est inductible

Répression catabolique, régulation positive :

C’est un mécanisme supplémentaire de régulation du métabolisme qui permet à l’opéron lac de tenir
compte de la présence de glucose. S’il y a à la fois du lactose et du glucose, les cellules utilisent le glucose
en premier et ne dépensent ainsi pas d’énergie à découper le lactose en ces sources constitutifs. La
présence de glucose dans la cellule éteint l’opéron par un mécanisme appelé répression catabolique qui
met en jeu une protéine régulatrice appelée la protéine régulatrice du catabolisme (CAP).
La CAP augmente la transcription de l’opéron en présence de l’AMPc (adénosine monophosphate cyclique,
un dérivé de l’ATP). Quand la concentration du glucose est faible, l’AMPc devient abondant, se fixe à la CAP
et active ainsi l’opéron lactose. Le complexe AMPc-CAP se fixe sur le promoteur et active la transcription de
l’opéron en favorisant un meilleur attachement de l’ARN polymérase au promoteur.
21
Model de l’opéron tryptophane
L’opéron trp est précédé par une séquence leader (L) codant un peptide de 14 acides aminés dont
deux tryptophanes adjacents. Cette séquence présente des zones pouvant s’apparier deux à deux
(zones 1 à 4).
Lorsque la concentration en tryptophane dans le milieu est élevée, le segment 3 transcrit s’apparie
avec le segment 4, formant une épingle à cheveux qui provoque la dissociation de l’ARN
polymérase et la terminaison de la transcription.
Lorsque la concentration en tryptophane est faible, les ribosomes marquent une pause sur la
région 1. Le segment 2 peut alors s’apparier au segment 3, l’empêchant d’interagir avec le
segment 4. L’épingle à cheveux formée n’est plus suffisamment stable pour arrêter l’ARN
polymérase, et la transcription se poursuit.

Figure : Processus de l'atténuation de l'opéron tryptophane d’E. coli.

22
 Régulation par des facteurs sigma alternatifs
Les bactéries, dont E. coli, fabriquent différent facteurs sigma (de l'ARN polymérase responsable
de l'initiation de la transcription) alternatifs, qui reconnaissent des ensembles différents de
promoteurs et font que l'ARN polymérase transcrit différents ensembles de gènes. Ceci est utilisé
comme un moyen pour réguler l'expression des gènes lorsque les conditions environnementales
dictent des modifications majeures dans l'expression des gènes.

Dans les conditions normales, le facteur sigma σ70 dirige l'activité de l'ARN polymérase (chez E.
coli)

• Choc thermique: lorsqu' elle est exposée à une température élevée, E. coli transcrit un ensemble
de 17 protéines qui aident la cellule à s'adapter aux nouvelles conditions environnementales. Un
facteur sigma alternatif, 32, et produit et il reconnaît les promoteurs des gènes du choc thermique
(heat shock proteins). σH (σ32).

• Sporulation chez Bacillus subtilus: un des exemples les mieux étudiés de régulation par le facteur
sigma. Cette bactérie produit des spores en réponse à des conditions environnementales
défavorables. La sporulation requiert des changements drastiques dans l'expression des gènes qui
impliquent d'arrêter la plupart des synthèses protéique lorsque la spore germera. B. subtilus
réalise ces modifications en utilisant des facteurs alternatifs. Normalement, l'ARN polymérase de
B. subtilus emploie le facteur sigma σA (σ43) pour reconnaître les gènes. La sporulation commence
lorsque σF remplace partiellement σA dans la préspore. La sporulation est régulée par deux
cascades de facteurs sigma (pro- σE, σE, pro- σk, σK).

La régulation par l’ARN antisens :

L’activité de certains gènes est contrôlée par une éspèce de petites molécules régulatrices d’ARN
(ARN antisens). Ces ARN régulateurs ont une séquence en bases complémentaire à un segment
d’une autre molécule d’ARN et se lient spécifiquement à cet ARN cible. La liaison d’un ARN
antisens peut bloquer la réplication de l’ADN, la synthèse d’ARNm ou la traduction. Par exemple,
elle aide à contrôler le niveau des porines (protéines formant des canaux au travers de la
membrane externe de la paroi des bactéries. Ces canaux permettent le passage de petites
molécules).

La régulation chez les eucaryotes

Chez les eucaryotes, l’ARNm est toujours monocistronique est assure donc la biosynthèse d’une seul chaine
polypeptidique. Le profile d’expression des gènes eucaryotes détermine les caractéristiques d’une cellule et
son rôle dans l’organisme.

Régulation au niveau de la chromatine

La transcription ne peut pas avoir lieu lorsque la chromatine est sous forme d’hétérochromatine. Cette
structure compacte est maintenue par les histones des nucléosomes. Les histones sont des protéines
basiques dimériques qui sont presque inchangées au cours de l’évolution. Ils possèdent une queue, celle-ci

23
peut être acétylée par une transférase spécifique et désacétylée par une désacétylase. Quand les histones
sont désacétylés, les nucléosomes sont compactés en hétérochromatine, l’acétylation désagrège ces
structures et les rend perméables aux facteurs de transcription. C’est donc un préalable nécessaire à la
transcription chez les eucaryotes, pas chez les bactéries. L’un des schémas proposés inclut donc comme
étape première dans la transcription une liaison entre ces transférases et les facteurs de transcription.
L’inactivation d’un gène, d’un groupe de gènes ou d’un chromosome ou « silencing » est due à la
méthylation de cytosines sur des séquences CG. Le rôle physiologique de ce processus n’est connu qu’au
cours du développement ou dans le cas des deux chromosomes X, chez la femme.

Régulation de la transcription
Les régulateurs de la transcription les mieux connus chez les eucaryotes supérieurs sont les hormones. Les
hormones agissent en modulant la transcription, c’est le cas de nombreuses hormones sexuelles, de nature
hydrophobe, capable de traverser les membranes cellulaires et d’arriver au contact de l’ADN.

L'épissage alternatif
Les ARNm issue de la transcription des gènes sont d’abord maturés par excision-épissage avant d’être
traduits. Les étapes de la maturation de l’ARNm eucaryote sont des sites potentiels de régulation. Ainsi un
même transcrit primaire peut subir diverses maturations conduisant à des ARNm différents, chacun
correspondant à une combinaison particulière d’exons. Ce type de régulation est appelé épissage (« splicing
») alternatif.
Un phénomène très intéressant : selon les protéines réalisant l'épissage, on peut avoir différents épissages
de l'ARN en choisissant parmi plusieurs exons et obtenir une protéine dont une région peut être de
plusieurs sortes différentes. Un gène permet ainsi de coder pour un plus grand nombre de protéines
différentes.

Certains gènes eucaryotes peuvent être à l’origine de plusieurs protéines par épissage (« splicing »)
alternatif, ce processus est multiforme. Il est utilisé chez les eucaryotes et intervient au moment de la
maturation de l’ARNm soit par sélection du promoteur, soit par sélection de la queue, soit par sélection
alternative d’une cassette.

Fig : Épissage alternatif (B. Swynghedauw, J.-S. Silvestre, 2008)

24
Dans cet exemple, un même gène possède plusieurs promoteurs, P1 et P2. L’activation de P1 aboutit à la
transcription primaire de tout le gène, P2 compris. L’activation de P2 ne permet que la transcription des
séquences situées en 3’ par rapport à P2. Les résidus GU et AG situés, en haut, sur les introns indiquent les
points d’épissage. Le résidu A situé au milieu des introns indique le point de fermeture du lasso formé par
les introns après leur excision. Le splicéosome forme l’unité fonctionnelle d’épissage.

Régulation de la traduction
Chez les eucaryotes, existe une régulation traductionnelle qui intervient sur la durée de vie de la molécule
d’ARNm. L’exemple est l’œuf d’oursin. Quand il n’est pas fécondé, il y’a accumulation de grandes quantités
d’ARNm ayant une longue durée de vie. Dans un œuf fécondé, les molécules d’ARNM sont très rapidement
traduites pour assurer les synthèses protéiques nécessaires. Ces ARNm protégés avant la fécondation puis
activés au moment de la fécondation sont appelés ARN Masqués.

Régulation par réarrangement des gènes

Les eucaryotes possèdent des mécanismes qui permettent le réarrangement de segments d’ADN de
manière contrôlée et l’augmentation du nombre de gènes quand cela est nécessaire (phénomène rare chez
les procaryotes).

Exemple : la biosynthèse des immunoglobulines (anticorps)

Les calasses d’immunoglobulines : IgA , IgM, IgD, IgG et IgE. Ces classes diffèrent par les chaines constantes,
et au sein d’une même classe c’est la région variable qui est différente.
Les anticorps (106 types différents) ne sont pas codés par des gènes spécifiques. Ils correspondent à la
combinaison de trois sous unités, chacune étant codée par une famille de cent gènes différents. Chaque
cellule (lymphocyte) est spécialisée dans la production d’une sorte d’anticorps, ce qui démontre la
présence d’un système de régulation.
Les IgG sont des tétramères formés de deux chaines légères (L) et de deux chaines lourdes (H). Dans
chacune des chaines existent deux segments importants : une région constante (C) et une région variable
(V). Il existe en plus deux type de chaines L : κ et λ. Plusieurs gènes sont impliqués dans la synthèse de l’une
des deux chaines L. Ces gènes sont distribués en trois classes :
-Classe V composée de 300 gènes codant les 95 premiers acides aminés de la région variable ;
- Classe C comte un seul gène qui code la région constante ;
- Classe J composée de 5 gènes codant 12 acides aminés de la fin de la région variable et de la jonction
entres les parties V et C.
Dans les cellules lymphocytaires non différenciées, les gènes des trois classes sont regroupés situés sur le
même chromosome. Un réarrangement dans les gènes s’opère dans les cellules au cours de la
différenciation en fonction de l’immunoglobuline produit. Ce réarrangement repose la recombinaison entre
un gène V et un gène J et sur la délétion du fragment d’ADN entre ces deux gènes. Le processus s’opère au
niveau de l’ADN et non de l’ARN. Le nombre de gènes V et J ainsi que les différentes possibilités de
recombinaison aboutit à plus de 3000 régions variable L possibles.
Les gènes des chaines H sont organisés de la même manière avec la différence essentielle que quatre types
de segments différents sont impliqués dans leur assemblage (V, C, J et D). Potentiellement la
recombinaison peut aboutir à 5000 régions variables H possibles. Ceci donne 1.5 x 107 IgG différents et
explique la diversité des anticorps.

25
Extraction et purification des acides nucléique
Il existe de nombreuses méthodes pour extraire les acides nucléiques, qui suivent
approximativement le même schéma de principe.
- Lyse des cellules
- Elimination des protéines
- Extraction des protéines
- Précipitation de l’ADN

La méthode d’extraction se réalise en plusieurs étapes :

- Lyse des cellules

Le plus souvent à l’aide de détergent comme Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) qui permette la
dissolution des lipides membranaires et leur solubilisation. Les détergents peuvent aussi dénaturer
les protéines membranaires. Cette dénaturation contribue également à la lyse de la cellule.
L’enzyme lysozyme est utilisée pour fragilisation la paroi de cellules bactériennes
(Peptidoglycanne).
D’autres techniques existent (choc mécanique par exemple).

- Elimination des protéines et de l’ARN

Elle est réalisée par une digestion enzymatique (la protéinase K).
On peut réduire la concentration en ARN par digestion à la RNase.

- Extraction des protéines

Du phénol et du chloroforme sont ajoutés à la solution aqueuse afin de faire précipiter les
protéines. Le phénol est un déprotéinisant, il est utilisé pour débarrasser les acides nucléiques des
protéines. Après centrifugation on obtient deux phases : une phase aqueuse supérieure contenant
les acides nucléiques et une phase organique inférieure, avec les protéines précipitées à l’interface
entre les deux phases. Le chloroforme est utilisé pour éliminer toutes traces de phénol.

- Précipitation de l’ADN
La précipitation est réalisée par addition deux volumes d’éthanol absolu (100%) froid à un volume
de solution. On récupère les acides nucléiques sous forme solide après centrifugation. L’ADN
obtenu est lavé avec de l'éthanol à 70 %. Puis le précipité est séché pour éliminer l’éthanol. L’ADN
purifier est resolubilisé dans un tampon afin d’être conservé (souvent tampon TE = Tris-EDTA pH
8).

NB : Il existe aujourd'hui des kits commerciaux permettant de réaliser rapidement l’extraction et la

purification à l'aide de réactifs prêts à l'emploi.

26
Les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction sont des endonucléases capables de couper des séquences
nucléotidiques à des emplacements reproductibles et définis de façon spécifique en termes de
bases. Les plus utilisés des enzymes de restriction font des coupures sur des séquences dites
palindromiques, ce qui veut dire que la séquence est identique sur les deux brins lorsqu’elle est
lue de 5’ en 3’ dans les deux cas (EcoR I). Après ce type de coupure les extrémités de la séquence
se chevauchent (« sticky ends »). Il y a des enzymes qui font des coupures franches.

Nomenclature
Escherichia coli R y13
EcoR I : 1ère enzyme trouvée chez E. coli
EcoR V : 5ème enzyme trouvée chez E. coli

Types de coupure

Deux enzymes sont compatibles lorsqu’elles ont des sites de restriction différents mais donnent naissance
aux mêmes extrémités cohésives.
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bactériennes différentes et qui reconnaissent
les mêmes séquences sont appelées isoschizomères

Les ligases
(ADN ligase, T4 DNA ligase)
La ligase est capable de lier
de façon covalente deux
molécules d’ADN en une.
Formation de liaisons
phospho-diester entre 3’OH
et 5’P

27
Séparation des acides nucléiques
L’électrophorèse est une technique de séparation des molécules chargées sous l’action d’un champ
électrique.

L’ADN étant molécules chargée négativement, il est possible de la faire migrer sous l'effet d'un champ
électrique vers le pôle positif (anode).
La vitesse de migration d’une molécule d'ADN sera fonction :
- de sa taille donc du nombre de bases. Plus un fragment
d’ADN est petit, plus sa vitesse de migration est élevée.
- de la concentration du gel. Les gels les plus concentrés
permettre de mieux séparer les petits fragments alors que
les plus gros sont séparés sur des gels faiblement concentrés.
La migration se fait également avec un tampon de migration,
dont les rôles sont de maintenir le pH constant, assurer
la solubilité des molécules qui migrent et permettre une
bonne séparation.

Des marqueurs de masse moléculaires (fragment d’ADN

de tailles connues) sont utilisés pour déterminer, après Figure : détermination des masses moléculaires
migration électrophorétique, la taille des fragments des fragments d’ADN après l’électrophorèse
d’ADN isolés (exprimée en général en nombre de paires
de bases). Une corrélation linéaire négative existe entre la distance de migration et le logarithme de leur a
masse moléculaire.

Il existe plusieurs supports de l’électrophorèse :

- le gel d'agarose est le support le plus utilisé. Il permet de séparer les fragments de tailles comprises entre
0,1 et 30 kb en position horizontale.
- le gel de polyacrylamide est utilisé pour la séparation des petits fragments de moins de 0,1kb (100 pb) en
position verticale (On peut séparer les fragments d’ADN à une base près). L’électrophorèse sur gel de
polyacrylamide est utilisée dans la méthode de séquençage de l’ADN.

Révélation des bandes d'ADN :

Le bromure d'éthidium (BET) fluorescent aux UV s’est fixé sur l’ADN (cette molécule s’intercale entre les
plateaux de paires de bases de la molécule d’ADN) et va permettre de visualiser les fragments d’ADN dans
le gel placé sur la table UV (transilluminateur UV).
Le bromure d'éthidium (concentration d'utilisation finale : 0.5 µg/ml) est extrêmement dangereux et
nécessite de porter des gants pour manipuler les gels lors de la révélation et après. Les rayons UV sont
dangereux pour les yeux : il faut porter des lunettes, ou disposer d'une enceinte dans laquelle sont placés le
transilluminateur et une caméra.

NB : L'électrophorèse permet aussi de séparer des molécules d'acides nucléiques suivant leur structure, par
exemple les différentes formes d'un plasmide.

28
Le séquençage
Le séquençage consiste à déterminer la nature et l'ordre des nucléotides dans un acide nucléique.
Il existe deux méthodes de séquençage : la méthode de Maxam et Gilbert et la méthode de Sanger.

La méthode de Maxam et Gilbert : méthode de dégradation chimique

On prépare un tube par type de coupure (une après G, après A, après T, après C). En fonction des
concentrations d’enzyme et d’ADN, on obtient (statistiquement) une coupure par molécule avec tous les cas
différents présents.

La méthode de Sanger : méthode de terminaison des chaines par un didésoxy

Dans ce cas, on va réaliser la synthèse d’ADN avec des arrêts de synthèse, en utilisant des
didésoxynucléotides triphosphates. L’amorce pour démarrer la synthèse est connue (et vient du commerce).
On réalise ensuite la synthèse avec un ddNTP présent.

La technique consiste à effectuer la synthèse d’un brin complémentaire d’un fragment d’ADN monobrin que
l’on désire séquencer. On fournit donc à l’ADN polymérase une amorce et des ddNTP contenant du
phosphore radioactif (parfois l’amorce est marquée radioactivement). On prépare quatre milieux réactionnels
différents. Tout contiennent l’ADN matrice, l’ADN polymérase, des amorces et les quatre dNTP. On ajoute à
chaque tube un ddNTP différent (ils différent des dNTP par l’absence de groupe hydroxyle sur le carbone 3’
du sucre).

Lorsque l’ADN polymérase va intégrer un nucléotide modifié (ddNTP), la polymérisation va s’arrêter juste
après lui (pas de OH libre). Comme l’intégration de ces ddNTP est aléatoire pour les quatre bases, on
obtiendra un mélange de fragments d’ADN de tailles différentes en fonction du point d’arrêt de la
polymérisation.

29
Il suffit ensuite de faire migrer ces différents fragments d’ADN de quatre tubes dans
un gel de polyacrylamide, puis les analyser pour connaitre la séquence du fragment
d’ADN étudié. On peut lire la séquence du bas vers le haut dans le sens 5’3’ pour
le brin complémentaire. Il suffit d’en déduire la séquence du brin matriciel par
coplémentarité dans le sens 3’5’, puis de l’ecrire dans le sens conventionnel
5’3’.

La méthode de Sanger a aujourd’hui surpassé la méthode chimique car elle est à la fois efficace et plus facile
à mettre en œuvre. Cette méthode est valable pour séquencer des brins dont la taille n’excède pas 600
nucléotides.

L'automatisation du séquençage
La très grande majorité des séquences réalisées et publiées aujourd'hui sont réalisées sur des séquenceurs
automatiques. Ceux-ci sont capables de réaliser les réactions de séquence, puis de les lire. Le séquençage est
devenu facile à réaliser depuis que l’on sait marquer les fragments d'ADN par des molécules fluorescents
(fluorophores). On utilise un seul milieu réactionnel qui contient les 4 bases marquées. Le séquenceur détecte
la florescence sortant des colonnes de chromatographie (ou après migration sur un gel de polyacrylamide),
repérant ainsi les fragments d'ADN et leur taille précise. Un faisceau de laser excite les marqueurs attachés et
un système de détection identifie la base terminale en fonction de la longueur d’onde de la fluorescence
émise.

Le résultat est présenté par le séquenceur sous forme de courbes présentant la fluorescence détectée, et
l'interprétation qui en faite en terme de nucléotides.

30
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Cette technique développée en 1985 par Kary Mullis permet d’amplifier en un nombre très élevé de copies
une séquence particulière d’ADN, ce qui facilite grandement son étude et son exploitation. L’ADN
polymérase copiant jusqu'à un milliard de fois cette région cible (quantité suffisante pour être révélée).
Des séquences oligonucléotidiques (17-30 nucléotides) complémentaires des extrémités 3’ des deux brins du
fragment d’ADN à amplifier sont utilisées comme amorces (primers) pour l’ADN polymérase.

Etapes de la PCR
La technique se fait par une succession de cycles comportant les étapes suivantes :
1- Dénaturation de l’ADN à la chaleur (autour de 95°C) : pour séparer les deux brins (obtention des
matrices simple brin).
2- Hybridation des amorces (≈ 50-65°C): hybridation de chaque brin avec une amorce spécifique (les
amorces étant en excès, la plupart des brins d’ADN cibles se fixent à celles et non entre eux).
3- Extension: élongation des amorces grâce à une ADN polymérase (à 72°C) en utilisant les brins cibles
comme matrice.
Chaque molécule d’ADN produite par un cycle agit comme une matrice pour la synthèse d’un nouvel ADN
au cycle suivant. Lorsque les trois étapes du cycle sont répétées, les quatre chaines du premier cycle sont
copiées pour produire 8 copies. En théorie, 20 cycles produiront environ 1 million de copies de la séquence
désirée.

La dénaturation se déroule à une haute température autour de 95°C, donc l’enzyme utilisée doit être
résistante à cette température élevé. Une ADN polymérase thermiquement stable extraite de la bactérie
thermophile Thermus aquaticus, isolée d’une source chaude (ADN Taq polymérase) est utilisée dans la PCR.
72°C est la température optimale de fonctionnement de l’ADN Taq polymérase. L’utilisation de l’ADN Taq
polymérase augmente la spécificité de la PCR, car à une température élevée l’hybridation non spécifique
d’amorces à l’ADN non cible est rare.

La réaction s’effectuée dans un thermocycleur (un appareil

programmable permet d’exposer les tubes à des températures choisies et pour
des durées déterminées par l’utilisateur).

- Dans le cas ou l’on travaille avec de l’ARN, on utilise une technique

analogue appelée RT-PCR (pour Reverse Transcriptase). Un fragment
d’ADNc est donc synthétisé à partir d’un ARNm.

Les applications de la PCR

La PCR a de nombreuses applications en biologie et en médecine et a apporté des contributions importantes
à l’étude des maladies héréditaires et dans la recherche contre le cancer. Elle a aussi des applications pratique
dans d’autres domaines comme :
- les sciences médico-légales
- dans les biotechnologies (la mutagénèse dirigée…)
- les études paléontologiques (fossiles : momies, plantes, animaux, …etc.)
- le diagnostique microbiologique
- les produits de la PCR peuvent être utilisés pour le clonage et le séquençage, ou pour des études
comparatives ou phylogénétiques.

31
Hybridation des acides nucléiques
Le terme "hybridation" désigne la formation de duplex (un double brin) entre deux séquences nucléotidiques
simples brins, par appariement de bases. L'hybridation moléculaire ou l'hybridation des acides nucléiques est
une technique largement répandue et elle est à la base d'un grand nombre de méthodologies utilisées dans
tous les domaines de la biologie moléculaire moderne.

Les sondes
Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides monobrin (ADN ou ARN) identifié, utilisé pour
rechercher de manière spécifique un fragment d'acide nucléique que l'on désire étudier. Sa taille est très
variable : oligonucléotide de 20-30 nucléotides ou à l'opposé de plusieurs centaines de nucléotides. La
reconnaissance repose sur L’hybridation entre les molécules, rendue possible par la similitude des séquences.

Dans un mélange complexe où s'effectue l'hybridation moléculaire, la sonde doit être facilement repérable
grâce à un marquage avec un radio-isotope (marquage chaud), mais il existe également des sondes appelées
sondes froides (molécules fluorecentes).

Marquage d’une sonde

Marquage aux extrémités : L'ADN peut être marqué à son extrémité 5' à l'aide d'une kinase (la T4
polynucléotide kinase). En présence d'ATP avec du 32P, il est possible d'échanger le groupement 5'-
phosphate présent sur l'ADN avec le phosphate radio-actif sur l'ATP. Les extrémités 5'- sont préalablement
déphosphorylées par une phosphatase alcaline.
Marquage interne : les nucléotides marqués sont à l’intérieur de la molécule d’ADN. Par exemple la
technique de marquage par translation de coupure (Nick Translation)

Southern blot
Décrite par E. M. Southern en 1975. Elle consiste à détecter spécifiquement des fragments d'ADN transférés
sur filtre par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radio-isotope. Les étapes de
la technique :
1 - Extraction de l'ADN génomique

2-Digestion par des enzymes de restriction différentes du même ADN génomique : on obtient un très
grand nombre de fragments, mais seuls quelques fragments correspondent à une partie ou à la totalité du
gène étudié.

3-Séparation électrophorétique des fragments d'ADN par électrophorèse dans un gel d'agarose.

4-Dénaturation des fragments d'ADN : par un traitement alcalin du gel d'électrophorèse. Ce traitement
transforme les fragments d'ADN double brin en fragments d'ADN monobrin.

5-Transfert des fragments monocaténaires du gel d'agarose à un support souple : Une membrane en
nitrocellulose (ou nylon) est placée sur le gel. Une pression est appliquée au gel en plaçant une pile de
serviettes de papier et par un poids sur la membrane et le gel, par exemple. Ceci va permettre le déplacement
de l'ADN contenu dans le gel sur la membrane, où il va se fixer.

6-Fixation des fragments monocaténaires d'ADN sur la membrane et hybridation avec la sonde
marquée à un radioisotope.

7-Lavage et révélation (dans ce cas par autoradiographie)

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Northern blot
Northern est une technique employée pour étudier l'expression de gènes. Elle dérive du Southern blot, sauf
qu'au lieu d'étudier de l‘ADN, on étudie de l‘ARN. L'ARN va être analysé par électrophorèse et détecté par
une sonde. Une différence du procédé par rapport à la technique de Southern est l'utilisation de formaldéhyde
dans le gel d'électrophorèse comme dénaturant, parce que le traitement d'hydroxyde de sodium utilisé en
Southern dégraderait l'ARN. La procédure :
- Extraction d'ARN
-électrophorèse
-transfert
-hybridation, lavage, révélation

Dot blot
Dot blot est une technique semblable à la Northern et à la Southern blot, la différence est celle dans une dot
blot les nucléotides à détecter ne sont pas séparés par l'électrophorèse de gel. Au lieu de cela, un mélange
contenant probablement la molécule à détecter est appliqué directement sur une membrane comme point et
puis détecté par des sondes de nucléotide.

Cette méthode peut seulement confirmer la présence ou l'absence d'un biomolécule, parce que
l'électrophorèse de gel n'est pas employée pour séparer les molécules avant la détection. Elle ne peut pas
détecter le poids moléculaire relatif, ou la présence de plus d'une molécule d'intérêt.

33
Le clonage de l’ADN
Les vecteurs de clonage
Le vecteur de clonage est une molécule qui peut intégrer un ADN étranger pour permettre son transfert dans
une cellule hôte. Les vecteurs les plus utilisés sont :

Les plasmides : molécules d’ADN circulaires extra-chromosomiques, se multiplient de façon indépendante

au sein des cellules hôtes. Ils codent des caractères généralement importants (gènes de résistances aux
antibiotiques). Le plasmide pBR322 porte des gènes de résistance à l’ampicilline est à la tétracycline, ainsi
que de nombreux sites de restriction.
La structure typique d’un vecteur de clonage comprend :
- une origine de réplication pour assurer la multiplication autonome du vecteur
- une série de sites de restriction (région à sites multiples de clonage : MSC)
- une ou deux marqueurs de sélection (confèrent la résistance à des antibiotiques par exemple)

Les phages : les deux les plus utilisés sont des dérivés du phage λ et du phage M13, autorisent le clonage de
fragments d’ADN très grands (environ de 20kb). Aux extrémités du phage λ, existent des séquences appelées
site cos. L'association de ces extrémités cohésive donne une structure circulaire à l'ADN dans la cellule hôte.

Les cosmides : des molécules d’ADN circulaires, possèdent une origine de réplication plasmidique, un ou
plusieurs marqueurs de sélection, une région de sites multiples de clonage et un site cos (du phage). Ils
permettent le clonage de fragment d’ADN de grande taille (environ de 50Kb). Ils sont empaquetés dans des
capsides de lambda en vue d’une injection efficace dans les bactéries. Ensuite, ils se comporteront au sein de
la bactérie hôte comme des plasmides.

Les chromosomes artificiels : ils peuvent véhiculer de grandes quantités de matériel génétique. Les YAC
(yeast artificial chromosome) sont des segments d’ADN qui contient tous les éléments requis pour la
propagation d’un chromosome chez la levure : une origine de réplication le centromère (nécessaire à la
ségrégation des chromatides dans les cellules) et deux télomères (pour marquer les extrémités du
chromosome). Les BAC (bacterial rtificial chromosome) sont des dérivés d’un plasmide, le facteur F d’E.
coli.

34
 Les étapes du clonage

Isolement de l’ADN responsable d’un phénotype particulier (ADN d’intérêt)

Jonction de ce fragment d’ADN à un vecteur

Introduction dans une cellule hôte pour propagation (transformation)

Sélection de la séquence désirée

- L’ADN peut être coupé par des enzymes de restrictions. Les fragments qui en résultent sont soit séparés par
électrophorèse, soit d’abord insérés dans des vecteurs et clonés.
- Après isolement, les fragments sont insérés dans un vecteur approprié (plasmide…) pour former une
molécule recombinante qui peut se reproduire dans une cellule hôte.
- Le procédé le plus facile et le plus utilisé consiste à couper le plasmide et l’ADN avec la même enzyme de
restriction afin de produire des bouts cohésifs identiques.
- Après appariement d’un fragment avec le plasmide par les bases complémentaires, les coupures sont
fermées par l’ADN ligase.

* Pour les fragments et les vecteurs dépourvus des bouts collants (cohésifs) on peut ajouter des
séquences poly(dA) à l’extrémité 3’ de l’ADN plasmidique et du poly(dT) aux extrémités 3’ des
fragments à insérer en employant la terminal transférase.
* Les bouts francs peuvent être réunis par l’ADN ligase de T4.
- Les molécules recombinantes sont insérées dans les bactéries grâce à une transformation ou à une
infection par phage.
* la cellule hôte ne doit pas modifier ou détruire l’ADN recombiné qui y a été introduit. Comme la
plupart des bactéries possèdent des enzymes de restriction pour leur propre défense naturelle, il faut
utiliser des souches mutantes dépourvues de ces enzymes.

La transformation
Le transfert de l’ADN dans une cellule hôte désigne le processus de transformation. Cela n’est pas possible
que lorsque les cellules sont rendues compétentes, c’est-à-dire aptes et capables d’intégrer le vecteur portant
l’ADN étranger.

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La transformation peut s’opérer de plusieurs manières différentes. La technique la plus commune pour les
procaryotes est le choc thermique. Le vecteur est pour cela adsorbé sur la bactérie à la température de 4°C
puis capturé par la cellule grâce à un choc thermique de courte durée (42°C pendant 90 secondes).
Il est possible d’introduire l’ADN par la technique d’électroporation. Il s’agit de soumettre les cellules à une
charge électrique très brève en présence de l’ADN. La cellule devient alors transitoirement perméable et
intègre l’ADN dans sont cytoplasme.
D’autres techniques sont également pratiquées. Elles sont spécifiques pour les cellules eucaryotes.

La sélection
Après la transformation, les cellules sont ensuite étalées dans des
boites contenant le milieu nutritif et un antibiotique (marqueur de
sélection). Seules les bactéries ayant intégré le vecteur (seul ou
recombinant) pourront se multiplier. Le taux de transformation
des bactéries est généralement très faible. Trois populations de
cellules hôtes existent :
- celles qui n’ont pas été infectées par le vecteur
- celles qui ont été infectées par un vecteur ne possédant pas
d’ADN étranger.
- celles qui ont été infectées par un vecteur avec un ADN
étranger.

Criblage des cellules recombinantes

Un premier criblage s’opère à l’issue de la transformation. Toutes
les cellules n’ayant pas intégré le gène de sélection (le vecteur)
vont mourir. Il s’agit ensuite de distinguer les cellules comportant
le gène d’intérêt de cellules ayant intégrer le vecteur non
recombinant.

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On utilise pour cela une résistance à un second antibiotique. L’insertion du fragment d’ADN dans le vecteur
doit inactiver le gène de résistance au deuxième antibiotique. Les bactéries transformées par les vecteurs
recombinants sont donc résistantes au premier antibiotique et sensible au deuxième antibiotique.

Il suffit donc de placer un échantillonnage de la colonie bactérienne sur un milieu de culture possédant ce
second antibiotique pour détecter si cette colonie est transformée par des vecteur recombinants (auquel cas
ces bactéries ne se développeront pas).

Criblage à l’aide du gène lacZ

Le gène lacZ code l’extrémité NH2 (peptide α) de la β-galactosidase. Les cellules hôtes utilisées sont mutées
dans ce gène et ne possèdent donc pas de β-galactosidase active. Le site multiple de clonage se trouve à
l’intérieur du gène lacZ.

L’activité est restaurée quand la cellule est transformée avec un vecteur possédant lacZ intègre. Cependant
les cellules ayant intégré un vecteur recombinant perdront l’activité de la β-galactosidase et un test
colorimétrique sur colonies permet directement de les identifier.

Il suffit d’étaler sur l’agar le substrat X-Gal (produit incolore). Les cellules qui se développent sur l’agar et
qui possèdent une activité β-galactosidase libéreront le produit X de couleur bleu. Les colonies bleues
correspondent ainsi aux cellules possédant un vecteur non recombinant (lacZ intègre) alors que les colonies
blanches possèdent un plasmide recombinant (gène lacZ interrompu)

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Références
• Lehninger, Principles of Biochemistry, Fourth edition 2005
• Voet et al. Fundamental of Biochemestry 1999
• Prescott et al. Microbiologie 2003
• Meftah A. et Julien R., Biologie moléculaire, 2eme edition, Dunod, Paris, France, 2003
• WinterP.C., Hikey G.I. et Fletcher H.L., L’essentiel en génétique, Port royal Livres, Paris 2000
• Lewin B., Gene, 8ème édition, 2005
• Beaumont S., Biologie Moléculaire. Cours, exercices, annales et QCM corrigés, Dunod, Paris,
France, 2006
• E. Passarge, Color Atlas of Genetics, Third edition, 2007, Thieme, Germany
• Serge Weinman, Pierre Méhul. TOUTE LA BIOCHIMIE. Dunod, Paris, 200 ?
• B. Swynghedauw J-S Silvestre 2008, Biologie et Génétique Moléculaires Aide-Mémoire, 3e
Edition, Dunod, Paris,
• Site internent
• La transcription chez les eucaryotes, Auteurs : Françoise Ibarrondo, Gilles Camus
Document publié le : 12 décembre 2006.
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/transcription/transcription.htm
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