Séquençage des

protéines
séquençage

Le séquençage des protéines est la

détermination de la séquence
polypeptidique. Elle est destinée à
connaître le nombre, la nature chimique
et l'ordre de tous les résidus d'acides
aminés dans un polypeptide. Pour cela, si
la protéine contient plus d'une chaîne
polypeptidique, les chaînes doivent être
d'abord séparées, puis purifiées.
Généralement, toutes les liaisons
disulfures seront réduites et les thiols
ainsi obtenus alkylés. Après isolement
d'une chaîne polypeptidique, la séquence
peut être étudiée :

en faisant appel à des méthodes

récurrentes chimiques ou
enzymatiques libérant les acides
aminés un à un à partir de l'extrémité C
ou N terminale;
ou plus récemment par des méthodes
de spectrométrie de masse
(séquençage de novo).

Le séquençage des protéines est plus

difficile que celui de l'ADN.
Historique

C'est dans les années 50 que Frederick

Sanger et les chercheurs de l'université
de Cambridge ont déterminé la séquence
des acides aminés qui composent
l'insuline. Pour cela, plutôt que
d'hydrolyser complètement l'hormone, ils
ont utilisé des enzymes catalysant la
coupure des polypeptides au niveau de
sites spécifiques. Les fragments
résultants ont été séparés par
chromatographie, puis partiellement
hydrolysés pour donner un nouveau
groupe de fragments. À ce stade, Sanger
utilisa des méthodes chimiques pour
déterminer la séquence des acides
aminés. À partir des séquences
obtenues il rechercha des
chevauchements afin de reproduire la
séquence initiale. Il fallut plusieurs
années à Sanger pour reconstituer la
structure primaire de l'insuline. Depuis, la
plupart des étapes du séquençage des
protéines ont été automatisées.
Actuellement le séquençage des
protéines a été largement délaissé au
profit de celui des acides nucléiques
(ADN principalement et ARN), plus rapide
et plus performant.
Structure des protéines

Article détaillé : Structure des protéines.

Chaque protéine est une macromolécule

constituée par l'enchaînement de
molécules de masse moléculaire plus
petite appelées monomères : les acides
aminés.

Structure primaire

Article détaillé : Structure primaire.

Les acides aminés (AA) s'assemblent

grâce à des liaisons peptidiques
(groupement acide carboxylique d'un AA
avec le groupement amine d'un AA voisin
→ C=O—NH), et forment ainsi la
structure primaire. La liaison peptidique
est plane dans l'espace et les radicaux
sont en opposition. La structure primaire
ne permettra d'avoir uniquement les
enchainements d'acides aminé. Celle-ci
n'a pas de propriété physiologique
particulière.

Structure secondaire

Article détaillé : Structure secondaire.

La structure secondaire peut se

manifester sous deux formes:

Élément A : L'hélice (en spirale –

exemple : la kératine alpha ). Ce sont
 les protéines fibreuses.
Élément B : Le feuillet plissé (en
escalier – exemple : la kératine beta ).
Ce sont les protéines globulaires.

Cette structure est due à l'existence de

liaisons hydrogène qui se forment entre
des liaisons peptidiques voisines.

Structure tertiaire

Article détaillé : Structure tertiaire.

Soit le feuillet plissé , soit l'hélice

s'assemblent en structure tertiaire[1] par
des liaisons secondaires qui se créent
entre les radicaux des acides aminés qui,
lors de la formation de la structure
secondaire, se sont retrouvés à l'extérieur
de la structure (exemples : liaison saline,
hydrogène, pont disulfure). Ces liaisons,
hormis le pont disulfure qui est une
liaison covalente forte, sont des liaisons
faibles.

Ce repliement de la chaîne peptidique

amène la création d'un site actif
responsable de l'activité biologique de la
protéine. (cf Enzymes)

Structure quaternaire

Article détaillé : Structure quaternaire.

Certaines protéines, dites oligomériques

(constituées par plusieurs chaînes de
polypeptides – chaque chaîne présente
une structure primaire, secondaire et
tertiaire), telle que l'hémoglobine par
exemple, atteignent une structure
quaternaire en adoptant une
construction symétrique et paire par
l'association de ces différents
protomères. Ces protéines ne voient la
création de leur site actif que lorsque
cette structure a été atteinte.

Dénaturation

Article détaillé : Dénaturation.

La dénaturation est une désorganisation

de la structure spatiale sans rupture des
liaisons peptidiques, car seules les
liaisons secondaires sont concernées.

Conséquences

Perte de l'activité biologique

Changement des propriétés optiques
Perte de la solubilité car précipitation

Agents dénaturants

Ils sont nombreux et peuvent être

physiques ou chimiques. On utilise
certains de ces agents dénaturants pour
obtenir une structure primaire, utile au
séquençage des protéines
(détermination de l'ordre des acides
aminés dans la chaine peptidique).
Agents dénaturants physiques

Température : toute augmentation de

la température provoque une rupture
des liaisons hydrogène.
Modification de pH : elle entraîne une
modification des charges portées par
les groupements ionisés, d'où une
rupture de ces liaisons.
Agents dénaturants chimiques

L'urée et le SDS (détergent) : rupture

des liaisons faibles, le SDS ajoute en
outre une charge négative à chaque
résidu.
Le mercaptoéthanol, le DTT et l'acide
performique : rupture des ponts
 disulfures.
Les bases et détergents provoquent
une forte dénaturation protéique.
Les défécants : précipitation des
protéines (défécation)
Le bromure de cyanogène (BrCN) :
clive la méthionine côté C-terminal.

Importance

In vitro : pour les extractions d'enzymes,

on évite les dénaturations. Mais pour une
stérilisation, on les provoque.

C'est également en faisant agir des

dénaturants sur des protéines que l'on va
pouvoir les séquencer.
Détermination de la
composition d'une protéine
en acides aminés

Rupture des ponts disulfure

La rupture des ponts disulfure entre les

cystéines est avant tout une dénaturation
chimique, qui est de plus essentielle pour
pouvoir séparer les différents groupes
d'acides aminés. On utilise à cet effet
des agents réducteurs porteurs de
fonctions thiol (–SH), comme le β-
mercaptoéthanol ou le dithiothréitol
(réactif de Cleland). Il existe également
des réducteurs non-thiolés comme le
TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine). Il
faut savoir également que deux
cystéines sont réunies par leur
groupement thiol (–SH), et forment alors
une molécule appelée cystine. La
cystéine est un acide aminé, elle peut
donc être dénaturée. Le pont disulfure
est responsable de la structure tertiaire
des protéines, apportant une grande
stabilité à cette dernière.

Hydrolyse des liaisons peptidiques

L'hydrolyse des liaisons peptidiques

permet de séparer les différents acides
aminés, car elles sont responsables de la
structure primaire, agissant entre le
groupement carboxyle d'un acide aminé
(C=O) et le groupement amine (NH2) d'un
AA (acide aminé) voisin.

Hydrolyse totale acide :

Utilisation d'acide chlorhydrique
(HCl) à 6 mol/L à chaud (110 °C)
et pendant 24h environ.
L'hydrolyse acide totale détruit le
tryptophane et transforme en
acide les fonctions amides de la
glutamine et de l'asparagine pour
donner du glutamate et de
l'aspartate.
Hydrolyse totale alcaline :
Utilisation d'hydroxyde de sodium
(NaOH) à 4 mol/L à chaud (110
 °C) pendant 24h environ.
L'hydrolyse totale alcaline détruit
la sérine, la thréonine, la cystéine.

L'hydrolyse totale acide détruisant moins

d'acides aminés, elle est en conséquence
la méthode d'hydrolyse la plus utilisée.

Analyse de l'hydrolysat

Après rupture des liaisons disulfures au

2-mercaptoéthanol et une hydrolyse,
l'hydrolysat est déposé sur une résine
échangeuse d'anions ou de cations. Une
fois les fractions récupérées on les
colore à la ninhydrine et on mesure
l'absorbance à 570nm. On obtient
finalement une estimation du
pourcentage de chaque acide aminé
contenu dans la chaîne (% de résidus
alanine...). La détermination de cette
composition n’est pas nécessaire pour
déterminer la séquence et est de fait de
moins en moins pratiquée.

Détermination de la
séquence

Marquage chimique de l'extrémité

N-terminal (NH2)

La première méthode utilise la réaction

de Sanger (cf. arylation). Les fonctions
2-amine des acides aminés et peptides
réagissent avec le 2,4-
dinitrofluorobenzène pour former des
dérivés jaunes, les 2,4-dinitrophényl-
peptides. Lorsque ces composés sont
soumis à une hydrolyse acide, toutes
les liaisons peptidiques sont
hydrolysées, mais la liaison entre la
fonction 2,4-dinitrophényl et la fonction
amine de l'acide aminé N-terminal
reste stable. On pourra par la suite
identifier cet acide aminé, par
chromatographie par exemple.
La deuxième méthode utilise le
chlorure de dansyle, qui, combiné à
une hydrolyse totale acide forme un
Dansyl-AcideAminé1 (DNS-aa) qui est
fluorescent et un hydrolysat.

Une troisième méthode est celle

d'Edman, dans laquelle le
phénylisothiocyanate (PITC) réagit
avec la fonction amine N-terminale
pour donner un complexe qui, après
action d'un acide dans des conditions
 douces libère une
phénylthiohydantoïne et le peptide
restant intact (cf. carbamylation). Les
deux premières méthodes utilisant une
hydrolyse totale acide, le reste de la
chaîne peptidique voit ses acides
aminés clivés. Le grand avantage de la
méthode d'Edman est que la chaîne
peptidique reste intacte et peut être
récupérée et soumise à nouveau au
traitement avec le PITC.

Identification des acides aminés C-

terminaux

On utilise l'hydrazinolyse, qui coupe les

liaisons à 100 °C et donne un acide
aminé libre. On peut également utiliser
des carboxypeptidases qui coupent
l'extrémité C-terminale, il en existe
plusieurs types:

la carboxypeptidase A, qui coupe, en C-

terminal tous les acides aminés sauf la
lysine, l'arginine, la glycine et la proline.
Elle est aussi, bloquée quand la proline
précède l'acide aminé C-terminal.
la carboxypeptidase B, ne libère que la
Lys, l'Arg et l'aminoéthyl Cystéine
quand la proline n'occupe pas la
position n-1.
Analyse enzymatique des
extrémités N et C-terminaux

Il existe également des méthodes

biochimiques utilisant des enzymes
capable de couper le premier ou le
dernier acide aminé de la chaîne
polypeptidique, on les appelle des
exopeptidases. Les aminopeptidases
clivent la liaison peptidique située juste
après le premier acide aminé et libèrent
celui-ci. De manière symétrique, les
carboxypeptidases clivent la liaison
peptidique située juste avant le dernier
acide aminé.
Il en existe plusieurs de ces enzymes de
spécificités variées, par exemple parmi
les carboxypeptidases, on trouve :

La carboxypeptidase A, clive l'acide

aminé C-terminal lorsque celui-ci est
aromatique ou aliphatique
La carboxypeptidase B, clive l'acide
aminé C-terminal lorsque celui-ci est
basique (Arginine ou Lysine)
La carboxypeptidase Y à spectre large

En analysant les acides aminés libérés

par ces enzymes, il est possible
d'analyser la séquence N ou C-terminale
de la protéine.
Fragmentation de la chaîne
polypeptidique

La chaîne polypeptidique est découpée

en une série de petits peptides par des
hydrolyses enzymatiques ou chimiques.

Méthode chimique

L'hydrolyse chimique la plus utilisée

implique une réaction avec le bromure de
cyanogène, qui scinde les liaisons
peptidiques dans lesquelles la fonction
carboxyle est fournie par des résidus de
méthionine.
Méthode enzymatique (utilisation
d'endopeptidases)

L'hydrolyse enzymatique utilise les

protéases, enzymes qui hydrolysent les
liaisons peptidiques. La trypsine catalyse
l'hydrolyse des liaisons peptidiques dans
lesquelles la fonction carboxyle est
fournie par la lysine ou l'arginine, la
chymotrypsine permet la coupure du
côté C-terminal des acides aminés
aromatiques (Phe, Trp et Tyr).

Trypsine (C) : LYS, ARG (sauf si PRO à

droite)
Chymotrypsine (C) : PHE, TRP, TYR,
(sauf si PRO à droite)
Thermolysine (N) : MET, PHE, TYR, TRP,
ILE, VAL (sauf si PRO à gauche)
Pepsine (N) : PHE, TRP, TYR, LEU (sauf
si PRO à gauche)
LysC
Papaïne : très utilisée dans l’industrie
agro-alimentaire et chimique, elle
permet notamment en boucherie
d’attendrir la viande. Elle est aussi
utilisée dans les produits de
nettoyages de verres de contact, ainsi
que dans les poudres à lessive, où son
action est de détruire les protéines
responsables des taches.
Clostripaïne [Arginine[ARG]
Subtilisine
 Elastase
etc.

Identification de la séquence

L'identification de la séquence se fait de

manière logique à partir des résultats
obtenus par l'utilisation des différentes
méthodes décrites précédemment.

Séquençage par spectrométrie de

masse

Article détaillé : Séquençage par

spectrométrie de masse.

La fragmentation par spectrométrie de

masse MS/MS permet de séquencer des
courtes séquences d'acides aminés (10 à
20). Couplée avec les techniques de
digestion des protéines précédemment
décrite, il est ainsi possible de connaitre
la séquence d'une protéine. Cependant,
cette approche nécessite d'utiliser
différents protocoles de digestion
différents pour espérer obtenir
l'ensemble de la séquence de la protéine.

Pour un organisme dont le génome est

entièrement connu, on utilisera un seul
type de digestion (par exemple une
digestion par la trypsine suivie d'une
analyse par HPLC couplée à un
spectromètre de masse de type ESI-
MS/MS), ce qui permet d'obtenir jusque
30 % de la séquence de la protéine (ce
qui est suffisant pour caractériser la
protéine).

Pour un organisme dont le génome n'est

pas entièrement connu, on utilise en
première intention un séquençage
automatisé (séquençage d'Edman par
exemple).

Classement par famille de

peptidases

Ce séquençage des protéines a conduit à

regrouper par familles des enzymes
faisant apparaître des séquences acido-
aminés similaires. La première lettre de
la classification correspond au type de
peptidase : A pour les protéases
aspartiques, S pour les protéases à
cystéine, etc[2].

Notes et références

Cours de première année de Biochimie

Références

1. Exemple : étude de la myoglobine (ht

tp://sti-bio.scola.ac-paris.fr/PEDAG
O/proteines/html/myoglobine.htm
l) [archive]
2. Families of Proteolytic Enzymes (htt
p://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/fami
ly_index?type=P) [archive] sur
Merops, 4 mars 2016
 Portail de la biochimie

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