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    Les Proteines

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    Le document décrit plusieurs méthodes pour déterminer la structure primaire des protéines, notamment la composition en acides aminés et l'ordre des résidus. Il présente des techniques d'hydrolyse chimique et enzymatique, ainsi que la dégradation séquentielle d'Edman.

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    Description originale:

    Séquençage des protéines www.inessm.org

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    LES PROTEINES

    SEQUENAGE DES PROTEINES

    Dtermination de la structure d'un peptide


    La dtermination de la structure primaire d'un
    peptide est conduite en deux tapes :
    1) dtermination de la composition en aminoacides
    2) dtermination de l'ordre des enchanements des rsidus
    Ces deux tapes ont comme point commun l'hydrolyse
    de la liaison peptidique.

    Dtermination de la composition en Acides Amins


    Hydrolyse de la liaison peptidique
    La liaison peptidique est trs stable, son hydrolyse
    spontane est quasiment nulle.
    Hydrolyse chimique complte

    Hydrolyse chimique spcifique

    Hydrolyse enzymatique

    Dtermination de la composition en Acides Amins


    Hydrolyse chimique complte
    hydrolyse Acide totale
    HCl 6M 100c pendant au moins 24heures: rupture des
    liaisons peptidiques aboutissant un hydrolysat.
    l'aminoacide acide tryptophane est entirement dtruit, et les
    amides (Asn, Gln) sont hydrolyses en ammoniac et acides
    correspondants (Asp, Glu).
    Hydrolyse alcaline par chauffage.
    Destruction de tous les acides amins sauf le TRP.
    Analyse du mlange obtenu par chromatographie sur une
    rsine changeuse dions ( Qualitative et Quantitative) .

    dtermination de l'ordre des enchanements


    des rsidus
    Identification des aminoacides terminaux
    N terminaux
    Mthode de Sanger (FDNB)

    Le NDFB forme, avec la fonction N terminale, un driv( peptide


    dinitrophnyl) avec libration d'acide fluorhydrique.
    L'hydrolyse de la protine libre ensuite les AcA dont lAcA N
    terminal sous forme de dinitrophenyl aminoacide de couleur
    jaune :
    qui peut tre identifi par chromatographie ou lectrophorse, et
    dos par spectrophotomtrie 360nm.
    La prsence de lysine dans le peptide va perturber cette mthode
    puisque la chane latrale de ce rsidu porte un groupe -NH2 qui
    ragira avec le FDNB.

    dtermination de l'ordre des enchanements


    des rsidus
    Identification des aminoacides terminaux
    N terminaux
    Mthode de dansylation (chlorure de dansyl )

    Le chlorure de 1-dimthyl-amino-naphtalne-5-sulfonyle
    (DANS) ragit avec le NH2 terminal et donne un driv
    (dansyl-amino-acide) dcelable par sa fluorescence jaune.
    La raction est 100 fois plus sensible: compos sulfonamide
    trs fluorescent permettant une plus grande sensibilit dans
    la dtection.
    Utilise pour doser les acides amins par HPLC.

    La prsence de lysine dans le peptide va perturber cette


    mthode puisque la chane latrale de ce rsidu porte un
    groupe -NH2 qui ragira avec le DNS-Cl.

    dtermination de l'ordre des enchanements


    des rsidus
    Identification des aminoacides terminaux
    N terminaux
    Mthode enzymatique (Exopeptidases /Aminopeptidases)
    L'enzyme n'hydrolyse que la premire liaison peptidique.
    Cintique de libration : Ordre de lenchainement.

    Mthode non prcise: affinit enzyme-substrat:


    Ex : Leucine aminopeptidase hydrolyse les liaisons N.t de
    tous les AcA sauf Proline.

    dtermination de l'ordre des enchanements


    des rsidus
    Identification des aminoacides terminaux
    C terminaux
    Mthode enzymatique (Carboxy-peptidasepeptidases)
    L'enzyme n'hydrolyse que la dernire liaison peptidique.

    Carboxy-peptidase A ( la plus utilise): extraite du pancras :


    attaque les liaisons Ct sauf celle du glycocolle et AcA basique .
    Carboxy-peptidase B : extraite du pancras : attaque les liaisons
    Ct des AcA basiques .

    dtermination de l'ordre des enchanements


    des rsidus
    Identification des aminoacides terminaux
    C terminaux
    Mthode chimique (Hydrazinolyse)
    Un traitement l'hydrazine(H2N-NH2) 100C hydrolyse toutes
    les liaisons peptidiques, et libre des hydrazides de tous les AA
    sauf le C terminal, qui se prsente comme un AA libre normal.
    Il est alors facile isoler et identifier.
    Ncessite moins dune micromole de peptide mais ne permet de
    dterminer quun seul rsidu Ct .

    la dgradation rcurrente d'Edman


    formation d'un PTC-peptide pH 9. Par un changement de pH
    (lgrement acide), il y a cyclisation et libration d'un driv
    PTH-aminoacide et d'un peptide amput de son aminoacide
    N-terminal.
    En rptant ces cycles : action du PTC pH 9 pour donner un
    PTC-peptide puis libration du PTH-aminoacide par passage
    un pH acide, et du peptide (n-1) amput du ct N-terminal, on
    a, chaque cycle, la libration de l'aminoacide suivant dans la
    squence du peptide original. LAcA peut tre isol et identifi
    par chromatographie.
    Des appareils (squenceur) sont capables d'effecteur ces
    cycles automatiquement. Toutefois l'analyse est
    techniquement limite de squences dont le nombre
    d'aminoacides est infrieur 60.

    dtermination de l'ordre des enchanements


    des rsidus Dgradation des peptides en fragments
    Hydrolyse chimique spcifique
    - le bromure de cyanogne (BrCN) hydrolyse la liaison
    peptidique du ct carboxyle de la mthionine .
    - le 2-nitro-5-thiocyanobenzoate (NTCB) hydrolyse la liaison
    peptidique du ct amine de la cystine.

    - Hydroxylamine(NH2OH): coupe entre Asn-Gly.


    - N-Bromosuccinimide: hydrolyse la liaison peptidique du ct
    carboxyle de la Tyrosine et Tryptophane.

    dtermination de l'ordre des enchanements


    des rsidus Dgradation des peptides en fragments
    Hydrolyse enzymatique : endo-peptidases
    L'enzyme hydrolyse des liaisons peptidiques internes entre
    deux aminoacides i, (i+1).

    Il peut tre spcifique du rsidu en position i ou (i+1).

    L'hydrolyse d'un peptide par une endopeptidase donnera


    plusieurs fragments peptidiques : si on a m coupures (m
    liaisons peptidiques hydrolyses), le peptide sera dgrad en
    (m+1) fragments peptidiques.

    Exemples dendo-peptidases
    Enzyme

    Cot C-t

    Particularit

    Trypsine

    Lys et Arg

    Sauf si Pro en N-t

    Chymotrypsine

    Tyr, Try et Phe

    Protase stapylo

    Asp et Glu

    Pepsine

    Cot N-t

    Tyr, Try et Phe

    clostriparine
    Thermolysine

    Arg
    Leu, Ile et Val

    Squenage des Protines ayant Plusieurs


    Chaines Polypeptidiques
    Deux chaines ou plus
    - Agents dnaturants : Ure ou le chlorhydrate
    de guanidine .
    Chaines lies par des ponts disulfures
    Rduction par le B-mercapto-thanol
    Oxydation par lacide performique : transforme
    la Cystine et la cystine en acide Cystique.

    HO-COOH

    Acide performique

    SO3H

    Deux Acides cystique

    2[ HS-CH2-CH2OH ]

    B-mercapto-thanol

    S-CH2-CH2OH
    S-CH2-CH2OH

    Deux cystine

    Technique dlectrophorse diagonale


    Utilise pour dterminer la position des liaisons
    disulfures.
    Clivage spcifique de la protines : les disulfures
    restent intactes.
    Electrophorse puis exposition aux vapeurs dacide
    performique qui clive les disulfures et les convertis
    en rsidus dacide cystique.
    2me lectrophorse perpendiculaire .

    Electrophorse aprs exposition aux


    vapeurs de lacide performique

    R-CH2-COO-

    R-CH2-COO-

    1re direction avant exposition lacide performique

    techniques rcentes
    Technique du DNA recombinant
    La squence des quatre types de base du DNA (A, T, G, C)
    rvle directement la squence des AcA de la protine
    code par le gne ou la molcule de RNA messager
    correspondante
    spectromtrie de masse

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