Chapitre 2 Etude Des Sequences

Support Cours Techniques d’études des Protéines. Master 1. Biochimie. Prof MERGHEM R.
Chapitre 2. Techniques d’études des séquences des protéines.
Rappels sur le catabolisme des protéines
1. Etude de la structure primaire des protéines

2. Fragmentation des chaînes peptidiques
3. Séparation de plusieurs chaînes peptidiques
4. Exercices
Rappels sur le catabolisme des protéines (protéolyse)
Les protéines sont catabolisées en acides aminés par des enzymes protéolytiques, appelés
protéases.
Ces enzymes ont une spécificité plus ou moins grande vis-à-vis de la position de la liaison
peptidique dans la chaine et / ou de la nature des acides aminés engagés dans cette liaison.
Les endopeptidases hydrolysent les liaisons peptidiques à l’intérieur de la chaine,
Les exopeptidases hydrolysent les liaisons peptidiques en bout de chaine,
Les protéines sont catabolisées en acides aminés et peptides. Les enzymes protéolytiques,
synthétisés par les cellules exocrines de l’appareil digestif, sous la forme de pro enzymes
inactifs sont :
- sécrétés par l’estomac : la pepsine ;
- sécrétés par le pancréas : la trypsine, la chymotrypsine, l’élastase et des

carboxypeptidases ;
-sécrétés par l’intestin grêle : des aminopeptidases.
1. Eude de la structure primaire d’une protéine :
La détermination de la structure des chaînes peptidiques met en jeu des agents chimiques et
des enzymes. Pour connaître la séquence des acides aminés il faut d’abord déterminer les
acides aminés N- et C- terminaux, puis l’ordre d’enchaînement des autres acides aminés.
Les tableaux 1 et 2 donnent les principales méthodes utilisées.
1
Tableau 1. Détermination de l’acide aminé en position N-terminale.
Méthodes chimiques Réactions

Sanger par le dinitro-
fluoro benzene puis hydrolyse
DNFB + aaDNP-aa
+ Les autres acides aminés
EDMAN ou méthodes par

récurrence par le phényl-
isothiocyanate cyclisation-libération
PTHo + aa -> PTH-aa
phénylthiodantoine Aa reste de la chaine
Dansyl ou chlorure de
diméthyl amino 1- sulfonyl
5-naphtalène
Tous les autres Aa non modifiés et un 1er Dansyl-amino acide fluorescent
Méthodes enzymatiques : -Enzyme spécifique qui hydrolyse la liaison peptidique impliquant l’acide aminé
N-terminale
Amino-peptidase N
terminal
2
Tableau 2. Détermination de l’acide aminé en position C-terminale.
Méthodes Réactions
Traitement par LiBH4
LiBH4 ou NaBH4 réduit la fonction carboxylique en fonction

alcool primaire
Méthodes
chimiques
Acide
aminé C-
terminale Hydrazinolyse
+ n (NH2 - NH2) formation d’hydrazides

n-1 (H2N-CH-CO-NH-NH2) + l’acide aminé C-terminale libre
La carboxypeptidase A : Elle coupe les liaisons C-terminales sauf
celles du glycine et des acides aminés basiques à condition que le
Méthodes (Rn-1) ne soit pas une proline.
enzymatiques
La carboxypeptidase B : Elle libère les acides aminés basiques à
condition que (Rn-1) ne soit pas une proline.
2. Fragmentation des chaînes peptidiques
Si la chaîne peptidique est trop longue, il faut au préalable la fragmenter en chaînes plus
courtes qui seront analysées séparément (tableau 3).
3
Tableau 3. Fragmentation des chaines peptidique.
Enzymes Spécificité
Chymotrypsine Elle attaque spécifiquement les liaisons peptidiques impliquant le

–CO– d’un acide aminé aromatique.
Coupe après Phe, Tyr,
Trp.
R1= Phe, Tyr, Trp
Pepsine Spécificité plus faible, elle coupe la liaison peptidique impliquant

le –NH– d’un acide aminé aromatique.
R2= Phe, Tyr, Trp
BrCN Coupe la liaison peptidique impliquant le–CO– d’une Met et

transforme le résidu Met en HSL (homosérine lactone).
3. Séparation de plusieurs chaînes peptidiques
Fréquemment les chaînes peptidiques sont unies entre elles par des points disulfures. Les
liaisons disulfures sont scindées par des agents oxydants.
On utilise aussi des agents réducteurs tels que le β mercaptoéthano
4
4. Exercices sur l’étude de la séquence des protéines
1/ On désire déterminer la séquence d’un décapeptide dont la composition est la

suivante : Asp ; Val ; Gly 2 ; Tyr ; Ile ; Cys ; Arg ; Leu ; Ala. La méthode d’Edman donne
Gly, puis Leu et ensuite un acide aminé soufré. La carboxypeptidase libere Ala.
L’hydrolyse trypsique donne un tétrapeptide basique et un héxapeptide. La
chymotrypsine hydrolyse de l’hexapeptide et donne un dipeptide qui possède un acide
aminé à 2 carbones assymétriques et un tétrapetide donnant un DNP-acide aminé acide
par la méthode de Sanger puis DNP-Val. Donner la séquence de ce peptide.
2/ L'analyse en acides aminés d'un oligopeptide formé de 7 acides aminés donne : Asp ;
Leu ; Lys ; Met2 ; Phe ; Tyr. Le traitement avec la trypsine n'a aucun effet apparent. La
dégradation Edman donne Phe. Un traitement avec la chymotrypsine donne un acide
aminé libre, un dipeptide et un tétrapeptide. La composition en acides aminés du
tétrapeptide est Leu, Lys et Met2. Le bromure de cyanogène donne un tétrapeptide, un
dipeptide, une lysine. Donner la séquence de l'oligopeptide.

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Chapitre 2. Techniques d’études des séquences des protéines.

Rappels sur le catabolisme des protéines

1. Etude de la structure primaire des protéines

Rappels sur le catabolisme des protéines (protéolyse)

Les endopeptidases hydrolysent les liaisons peptidiques à l’intérieur de la chaine,

Les exopeptidases hydrolysent les liaisons peptidiques en bout de chaine,

- sécrétés par l’estomac : la pepsine ;

- sécrétés par le pancréas : la trypsine, la chymotrypsine, l’élastase et des

-sécrétés par l’intestin grêle : des aminopeptidases.

1. Eude de la structure primaire d’une protéine :

Les tableaux 1 et 2 donnent les principales méthodes utilisées.

Tableau 1. Détermination de l’acide aminé en position N-terminale.

Méthodes chimiques Réactions

+ Les autres acides aminés

EDMAN ou méthodes par

PTHo + aa -> PTH-aa

phénylthiodantoine Aa reste de la chaine

Tous les autres Aa non modifiés et un 1er Dansyl-amino acide fluorescent

Tableau 2. Détermination de l’acide aminé en position C-terminale.

Traitement par LiBH4

LiBH4 ou NaBH4 réduit la fonction carboxylique en fonction

+ n (NH2 - NH2) formation d’hydrazides

2. Fragmentation des chaînes peptidiques

Tableau 3. Fragmentation des chaines peptidique.

Chymotrypsine Elle attaque spécifiquement les liaisons peptidiques impliquant le

R1= Phe, Tyr, Trp

Pepsine Spécificité plus faible, elle coupe la liaison peptidique impliquant

R2= Phe, Tyr, Trp

BrCN Coupe la liaison peptidique impliquant le–CO– d’une Met et

3. Séparation de plusieurs chaînes peptidiques

On utilise aussi des agents réducteurs tels que le β mercaptoéthano

4. Exercices sur l’étude de la séquence des protéines

1/ On désire déterminer la séquence d’un décapeptide dont la composition est la

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