Rapport Maria Lorna

RÉPUBLIQUE DU CAMEROUN
REPUBLIC OF CAMEROON
Paix-Travail-Patrie
Peace-Work-Fatherland
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MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT
SUPERIEUR MINISTRY OF HIGHER EDUCATION
********** **********
UNIVERSITÉ DE DOUALA UNIVERSITY OF DOUALA
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FACULTE DE MEDECINE ET DES
SCIENCES PHARMACEUTIQUES DE
FACULTY OF MEDECINE AND
DOUALA PHARMACEUTICAL SCIENCES OF
DOUALA
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Rapport de stage académique effectué au sein du

département de biologie clinique de l’hopital général
de Douala
Durée de stage : Du 12 Juillet au 08 décembre 2023

Spécialité : Biologie clinique
Rédigé par :
BIAMBAN Maria Lorna
Matricule : 21MBC010
Niveau : Master II
Option : Bactériologie-Virologie
Sous l’encadrement de :
Pr. OKALLA EBONGUE Cécile Pr. ASSOB NGUEDIA JULES

Chef du département de biologie clinique Vice doyen chargé de la recherche FMSP
(Encadreur professionnel) (Encadreur Académique)

Année académique : 2021-2022
i
REMERCIEMENTS
Nous rendons grâce à Dieu tout puissant pour son immense soutien à chaque moment de
notre vie, pour les maintes grâces et bénédictions qu’il nous accorde et pour avoir eu à veiller
sur nous durant cette période stage.
Nous tenons également à exprimer notre profonde gratitude à tous ceux qui de près ou
de loin ont contribué à l’élaboration de ce rapport de stage. Nous pensons donc :
- Au Doyen de la Faculté de Médecine et des Sciences pharmaceutiques pour les

moyens mises en œuvre dans le but de nous assurer une bonne formation ;
- Au Pr.ASSOB NGUEDIA Jules Clément, vice doyen chargé de la recherche
pour les précieux conseils promulgués avant et durant le stage ;
- Au Pr. Henry NAMME LUMA, directeur de l’Hôpital général de Douala qui a
bien voulu nous permettre d’effectuer un stage académique au sein de sa structure
hospitalière ;
- Au Pr. OKALLA EBONGUE Cécile médecin biologiste, chef service du
laboratoire de biologie clinique pour l’assistance et le suivi qu’elle nous a accordé
durant ce stage ;
- Au Pr. NDA MEFO’O Jean-Pierre médecin biologiste, chef service adjoint du
laboratoire de biologie clinique pour son assistance et sa surveillance ;
- Au Pr. NGOUADJEU Eveline médecin hématologue bioclinnicienne pour son
assistance et sa surveillance ;
- Aux médecins biologistes Dr. AKONO et Dr. OLEMBA, pour leurs assistances ;
- Au Dr. NGO MALABO Elodie, biologiste pour son assistance, ses conseils et sa
surveillance ;
- Au major Mme KINGUE DOMINIQUE, pour son assistance durant notre stage ;
- Aux vice majors Mr. KAYE LAYE Christian et Mr. FANGA BILLY pour leurs
multiples encouragements à notre égard et pour tous les conseils promulgués ;
- Aux différents chefs d'unités pour leurs disponibilités, leurs collaborations et le
partage de leurs connaissances avec nous ;
- Aux autres personnels du laboratoire pour avoir faciliter notre intégration et notre
adaptation dans leur équipe ;
ii
- A mes camarades stagiaires pour l’ambiance et le climat chaleureux de tous les
jours ;
- A ma famille pour son soutien moral et financier…
iii
SOMMAIRE
REMERCIEMENTS.........................................................................................................ii
LISTE DES ABREVIATION ET ANCRONYME...........................................................v
LISTE DES FIGURES.....................................................................................................vi
LISTE DES TABLEAUX...............................................................................................vii
INTRODUCTION.............................................................................................................2
CHAPITRE 1. Présentation de structure d’accueil.........................................................3
I.1. Situation géographique de l’hôpital général de Douala....................................3
I.2. Historique de l’HGD.........................................................................................3
I.3. Organisation de l’HGD.....................................................................................4
I.4. Organisation du laboratoire de l’HGD..............................................................7
CHAPITRE 2. Déroulement du stage.............................................................................9
II.1. Activités menées...............................................................................................9
II.1.1. L’unité d’accueil..........................................................................................9
II.1.2. L’unité de biologie moléculaire.................................................................10
II.1.3. L’unité d’immuno- Sérologie.....................................................................19
II.1.4. L’unité de parasitologie..............................................................................41
II.1.5. L’unité de bactériologie.............................................................................52
CHAPITRE 3. BILAN DE STAGE.............................................................................70
III.1. Apport du stage..............................................................................................70
III.2. Difficulté rencontrées....................................................................................70
III.3. Recommandations.........................................................................................71
CONCLUSION...............................................................................................................72
iv
LISTE DES ABREVIATION ET ANCRONYME
ADN : Acide Désoxyribonucléique
AcHCV : Anticorps Hépatite C
AgHbs : Antigène Hépatite B
ARN : Acide Ribonucléique
ATB : Antibiotique
BAAR : Bacille Acido Alcoolo Résistant
BGN : Bacille Gram Négatif
BGP : Bacille Gram Positif
CLED : Cystine Lactose Electrolyte Deficient
ECBU : Examen Cyto-Bactériologique des Urines
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMB : Eosine Methylene Blue
GE : Goutte Epaisse
HGD : Hopital Général de Douala
LCR : Liquide Céphalo-rachidien
MCP : Mycoplasme
Mh : Mycoplasma.hominis
PCV : Prélèvement Cervico-Vaginal
PU : Prélèvement Urétrale
PCT : Prolactine
RT-PCR :
Uu : Ureaplasma.urealyticum
VDRL : Veneral Disease Research Laboratory
VIH : Virus de l’Immunodéfience Humaine
v
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Ordre de prélèvement des tubes......................................................................10
Figure 2: Trophozoïte dans une lame de GE..................................................................44
Figure 3: Microfilaires à l'état coloré.............................................................................45
Figure 4: Les microfilaires sur dilution au formol.........................................................45
Figure 5: Forme végétative d'Entamoeba histolytica.....................................................47
Figure 6: Klebsiella sur CLED.......................................................................................63
Figure 7: Escherichia.coli sur EMB...............................................................................63
Figure 8: Salmonella sur HEKTOEN.............................................................................64
Figure 9: Pseudomonas sur EMB...................................................................................64
Figure 10: Kit de mycoplasma........................................................................................69
vi
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Les services médicaux de l'HGD...................................................................4
Tableau 2: Les marqueurs d'urgence..............................................................................33
Tableau 3: Les analyses hormonales..............................................................................35
Tableau 4: Les analyses tumorales.................................................................................39
Tableau 5: Les paramètres interprétés lors d'un spermogramme...................................50
Tableau 6: Les rôles des différents utilisés en parasitologie..........................................51
vii
INTRODUCTION
Pour une meilleure rentabilité de notre secteur de santé, le MINSANTE s’engage à

fournir à la population des établissements hospitaliers de qualité ayant à leurs dispositions un
personnel compétent. C’est ainsi que nous avons eu l’honneur d’effectuer notre stage
académique au sein de l’hôpital général de DOUALA situé dans en plein cœur du quartier
MALANGUE où nous avons été admis au service de laboratoire. Durant cette période, nous
avons orientés notre thème d’étude sur l’imprégnation aux pratiques microbiologiques au sein
d’un laboratoire de biologie clinique. De ce fait, nous avons pour objectif à la fin de ce stage
de participer au fonctionnement du laboratoire sous la supervision directe des médecins
biologistes et des techniciens du laboratoire ; maitriser les techniques de prélèvement, de
conditionnement, et de transport des spécimens biologiques et savoir évaluer la qualité de
l’échantillon. Maitriser le diagnostic parasitologique des selles, la composition des milieux de
culture, les critères de choix de ces derniers, les techniques d’identification des bactéries et
effectuer une validation technique des analyses de biologie médicales menées. Dans l’optique
de mener à bien notre analyse, nous allons tout d’abord vous présentez la structure d’accueil,
qui portera sur l’historique, la localisation etc. dans un deuxième temps nous vous parlerons
du déroulement de stage en décrivant les activités menées et ou observées ainsi que les
difficultés rencontrées, les apports de stage et les suggestions faites.
1
CHAPITRE 1. Présentation de structure d’accueil
Cette partie de notre document se propose de faire une description analytique de notre
lieu de stage à savoir, l’hôpital général de Douala. Cela suppose qu’on oriente notre étude sur
tout afin de mieux ressortir les mécanismes de fonctionnement de l’hôpital d’après sa
structure et son historique.
I.1. Situation géographique de l’hôpital général de Douala
L'Hôpital Général de Douala est situé dans la région du littoral, le département du

Wouri et l’arrondissement de Douala 5ème. Il est en plein cœur du quartier Malangue et
couvre une superficie d’environ 9 hectare pour une population d’environ 859988 habitants.
Il est délimité :
- Au Nord par le quartier Ndogbong ;
- Au Sud par le lycée de Maképé ;
- A l'Ouest par le complexe parcours VITA de Bonamoussadi ;
- A l'Est par le carrefour de la cité des Palmiers.
a.) Les missions de l’HGD
L’HGD est une structure sanitaire publique à but lucratif. Il s’est donc fixé pour mission
les directives de l’Etat camerounais, qui prône la santé en assurant la prise en charge Médicale
et médico- sanitaire. Cet à travers des soins promotionnels, préventifs et curatifs. Et avec un
personnel dévoué à sa tâche qui intègre dans sa pratique quotidienne :
 Intègrer dans sa pratique quotidienne des soins holistiques aux personnes malades.
 Assurer le diagnostic, le traitement des patients ;
 Assurer la prise en charge des cas référés et des urgences,
 Assurer la formation continue des professionnels de santé ainsi que des étudiant ;
 Conduire les travaux de recherche dans le domaine de la santé.
I.2. Historique de l’HGD
L’Hôpital Général de Douala fut fondé en 1896 par l’initiative du Dr.Albert PLEHN
avec l’aide de l’architecte allemand Henri DRESS, elle était réservé aux patients européens. Il
était initialement baptisé Hôpital NACHTIGAL en l’honneur du consul Gustav
2
NACHTIGAL. Au cours du décret présidentiel N°87-192 du 30 décembre 1987, l’Hôpital
général a ouvert ses portes en 1990.
Pour le mettre en conformité avec la loi 2017/010 du 12 juillet 2017 portant statut
général des établissements publics, le président de la république a signé le 20 septembre 2018
le décret N°2001/268 du 24 septembre 2001 portant réorganisation de l’Hôpital Général de
Douala qui fait passer cette formation sanitaire d’établissement publique administratif à un
établissement public à caractère hospitalier.
I.3. Organisation de l’HGD

I.3.1. Organisation technique
L’HGD est divisé en 2 grands secteurs dans lesquels reposent les différents services.
a.) Les services administratifs
 La direction ;
 Le bureau du Directeur Médical ;
 Le bureau du Surveillant Général ;
 La direction des ressources humaines ;
 Le standard ;
 Les différentes caisses (hospitalisation, consultation cantine) ;
 Salle de réunion ;
 Salle polyvalente ;
b.) Les services médicaux
Ils comprennent :
Tableau 1: Les services médicaux de l'HGD
 La consultation pédiatrique  Le service d’oncologie

 Le service de pédiatrique  Le service de rhumatologie
 Le service de Gynécologique  Le service de radiologie
 Le service de Néonatalogie  Le service d’odontostomatologie
 Le service des urgences  Le service de cobaltothérapie
 Le service de laboratoire et de  Le service de dermatologie
banque de sang  Le service de bloc opératoire
 Le service d’ORL
3
 Le service d’ophtalmologie  Le service d’anatomocytopathologie
 Le service d’hémodialyse  La pharmacie
 Le service de kinésithérapie  Les services de consultation
 Le service de réanimation  La morgue
 Le service de réanimation des brulés  Le magasin
 Le service de gastroentérologie  Le service de stérilisation
 Le service de dermatologie
 Le service de neurologie
 Le service de diabétologie
 Le service de pneumologie
 Le service d’hématologie
c.) Ressources financières
Les moyens financiers sont des moyens dont dispose une structure pour fonctionner et se
développer. En effet l’HGD tire ses ressources de :
- Des frais de consultation et autres facturations ;

- Des frais d’hospitalisation ;
- De la vente des médicaments ;
- Des frais d’examen et bilan biologique
De plus le service tire ses ressources financières des frais des prestations et examens
biologiques prescrit par le prestataire de soins.
d.) Ressources humaines
En effet cet hôpital possède un effectif de 644 personnels répartis dans les différentes
catégories comme suit :
❖ 90 médecins spécialisés;
❖16 médecins généralistes;
❖ 3 chirurgiens-dentistes;
4
❖ 4 pharmaciens;
❖ 298 paramédicaux;
❖ 39 techniciens médico sanitaires;
❖ 91 personnels administratifs;
❖ 76 agents de service généraux;
❖ 27 techniciens.
e.) Ressources matérielles
L'HGD a une capacité d'accueil de 320 lits qui sont repartis comme suit :
❖60 en médecine;
❖60 en chirurgie;
❖10 en réa-brulés;
❖10 en oncologie;
❖10 en réa médicaux chirurgicale;
❖ 40 en pédiatrie;
❖40 en néonatalogie;
❖30 en gynécologie.
I.4. Organisation du laboratoire de l’HGD
L’HGD est un hôpital de référence dans la ville de Douala grâce à son énorme plateau
technique comptant plusieurs services hospitaliers dans le but d’œuvrer massivement au bon
rétablissement de ces patients. Et parmi ces services, on a le laboratoire de biologie clinique
qui est une plaque tournante de l’HGD grâce aux multiples examens qu’il réalise, il est situé
au-dessus des urgences, en face du service d’ORL et à coté ophtalmologie.
Ce service est sous la responsabilité des biologistes médicaux qui interprètent les résultats
dans le but de participer au diagnostic et au suivi de certaines maladies, il est dont
d’importance capitale dans la prise en charge et le suivi des patients.
Le laboratoire de biologie médicale de l’HGD abrite environ 7 unités différentes et la
banque de sang avec laquelle, elle entretient une large collaboration.
5
- L’unité de prélèvement ;
- L’unité de bactériologie ;
- L’unité d’hématologie ;
- L’unité de parasitologie ;
- L’unité de sérologie ;
- L’unité de biochimie ;
- L’unité de biologie moléculaire.
Etant donné que le laboratoire travaille en étroite collaboration à la banque de sang qui est
subdivisée à son tour en deux dont :
- L’unité de prélèvement banque de sang ;
- L’unité de distribution banque de sang.
Toutes ces unités couplées à la banque de sang sont gérées par des IMS, des TMS, des
infirmières phlébotomiste, ceci sous la surveillance des médecins biologistes.
La responsabilité des médecins biologistes en fonction des unités
 Pr Cecile OKALLA médecin biologiste, responsable technique de Parasitologie,
Bactériologie, Biologie Moléculaire et de la gestion des stagiaires ;
 Pr Jean Pierre NDA MEFO’O médecin biologiste, responsable technique de
Biochimie, d’Immuno- Sérologie ;
 Pr Evéline NGOUADJEU hématologue bioclinicienne, responsable des techniques
de cytopathologie d’hématologie et de la banque de sang ;
 Dr Clémence OLEMBA médecin biologiste, co-responsable d’Immuno- Sérologie et
hématologie ;
 Dr Cathérine AKONO NDI médecin biologiste, responsable d’accueil, du suivi des
dossiers des malades hospitalisés, chargé de la mise en place de la qualité au
laboratoire et co-responsable de bactériologie.
 Dr. NGO MALABO Elodie biologiste, Co-responsable biologie moléculaire et
parasitologie.
6
CHAPITRE 2. Déroulement du stage
II.1. Activités menées
Etant étudiante en master professionnelle option biologie clinique ; nous avions été
appelés à effectuer un stage académique au sein d’une structure répondant aux besoins de
notre formation. Notre choix s’étant porté sur l’HGD au cours de ce stage, il nous a été donné
de travailler dans le service de laboratoire de biologie clinique. Nos activités qui ont été
réalisées dans ce service, seront répertoriées dans cette partie ainsi que les observations faites.
II.1.1. L’unité d’accueil
L’accueil est une unité tournante du laboratoire, car elle est la porte d’entrée des
patients dans le service. Alors dès son arrivée au laboratoire de l’HGD, le patient suit une
direction bien précise qui se déroule comme suite :
 Le premier box d’enregistrement, il est situé à la porte d’entrée du laboratoire.

Dans ce compartiment, on enregistre tous les patients qu’ils soient des externes
ou des hospitalisés, on prend toutes leurs informations pour leur répertorier dans
le registre comme information on a : leurs noms, leurs prénoms, leurs dates de
naissance, leurs sexes et aussi leurs numéros de téléphone. Et chaque patient, on
attribue des codes.
 Le deuxième box d’enregistrement se trouve à l’intérieur du laboratoire, il est
subdivisé en trois mini-box :
- Le box 1 où le patient externe dépose son reçu et son bulletin d’examen. Il faut
revérifier toutes les informations de ce dernier et le nom du médecin prescripteur. Le
personnel transportant les fiches de circulation et les échantillons des hospitalisés
passent directement au box 2.
- Le box 2, on enregistre les documents des différents patients dans la machine. Ce
logiciel donne un code au patient et donne une cotation aux examens qui leurs sont
prescrits.
NB : Après ce passage au box 2, les hospitalisés sont registrés dans le registre

correspondant où l’on répertorie le code du patient, les noms et prénoms du patient, son
âge et son sexe, le service d’hospitalisation, le nom du préleveur, les analyses demandées,
le nom du médecin et le nom du transporteur puis le numéro de la fiche de circulation.
7
Une fois l’enregistrement terminé, on fait des bulletins d’examen pour les différentes
unités du laboratoire et on passe à l’étiquetage des tubes, des pots d’urines, de selles et de
sperme.
 Les box de prélèvement où les échantillons pour la réalisation des examens sont
effectués. On compte au sein de l’unité, deux types de box dont :
- Le box de prélèvement sanguin où est recueilli tous les échantillons sanguins (GE,
NFS Urée, AcHCV, etc…).
- Le box de prélèvement gynécologiques où est recueilli les échantillons de PCV, de
PU, du mycoplasme et du PCR
Figure 1: Ordre de prélèvement des tubes
 Les box des différentes unités, ces bacs sont destinés à recevoir les échantillons
recueillis dans les différentes salles de prélèvement.
II.1.2. L’unité de biologie moléculaire
Le laboratoire de biologie moléculaire joue un rôle très important dans le diagnostic et

le suivi thérapeutique des pathologies bactériennes et virales. L’unité de biologie moléculaire
de l’HGD diagnostique l’infection au Chlamydiae trachomatis et l’infection au COVID 19,
elle permet également de la détection de la charge virale chez les sujets séropositifs.
Parmi les examens réalisés, deux sont sous la coordination du MINSANTE tels que le
COVID 19 et la charge virale du VIH. Le chlamydia quant à lui est un examen de routine
réalisé par le laboratoire.
8
L’unité est sous la responsabilité de quelques membres du personnel :
- Mr.WANGSO Daniel, chef d’unité ;

- Mr MANYIM Isaacar ;
- Mr MINYAKWE Ango ;
- Mme TEMB Abigael ;
- Mme NGOUNOU Céline ;
- Mme NJUMTA N.
▪ Les différents postes de l’unité de la biologie moléculaire
La biologie moléculaire de l’HGD se subdivise en 4 postes dont :
- La salle d’inactivation étant en même tant le poste de réception, le but de

l’inactivation est de détruire les membranes cellulaires qui sont autour de la
moléculaire nucléaire.
- La salle d’extraction comme son nom le dit, consiste à extraire l’acide
nucléique au travers de 4 étapes dont l’inactivation, la précipitation, le lavage et
l’élution.
- La salle de mix où la solution de mix nécessaire pour la phase d’amplification
est préparée.
- La salle d’amplification
▪ Les appareils utilisés
- Deux postes de sécurité microbiologique dont l’un de type I pour la salle de mix
et l’autre de type II pour la salle d’inactivation.
- Deux centrifugeuses réfrigérées ;
- Trois réfrigérateurs dont les températures de conservations varient entre 4 – 8°c,
-15 à -20°c et -60 à -80°c ;
- Le vortex ;
- Les micropipettes, les micro tubes, les embouts ;
- Les amplificateurs.
II.1.3.1. PCR-Chlamydia
Le Chlamydia est une infection sexuellement transmissible causée par une bactérie
intracellulaire obligatoire « Chlamydia trachomatis ».
a.) Mode de prélèvement
9
Le prélèvement varie en fonction des deux sexes dont :
- Chez la femme, le prélèvement se fait dans le col de l’utérus à l’aide d’un

écouvillon. L’échantillon est recueilli sur ce site car chez les infections génitales
hautes, la bactérie se fixe facilement sur les cellules épithéliales présentes dans
le col.
- Chez l’homme, l’échantillon recueilli est l’urine notamment les premiers jets
d’urine car ils vont nettoyer l’urètre et en transportant en même temps les
cellules épithéliales contenant la bactérie.
b.) La phase de traitement ou d’inactivation de l’échantillon
Après avoir collecter l’échantillon, il est déposé dans la salle d’inactivation et on veille
à enregistrer le patient dans le registre destiné aux analyses du Chlamydia. Le mode de
traitement des échantillons varie en fonction des spécimens reçus.
▪ L’échantillon d’urines
- Apprêter deux micro tubes sur lesquelles ont écrit le nom et le code laboratoire
du patient ;
- Remuer le pot d’urines puis pipeter 400 µl qu’on met dans l’un des micro tubes,
par la suite placer ce micro tube au vortex pour qu’il homogénéise parfaitement ;
- Après avoir vortexer le premier micro tube, pipeter 100 µl de ce micro tube et le
mettre dans le second ;
- Ces deux micro tubes seront conservés dans le réfrigérateur à moins – 60°c.
▪ L’échantillon du PCV+Endocol
- Apprêter deux micro tubes sur lesquelles ont écrit le nom et le code charge virale
du patient.
- Mettre dans l’un des micro tubes, 400 µl du milieu de transport virale et tremper
l’écouvillon à l’intérieur de ce micro tube et puis casser le pour juste laisser le
coton de l’écouvillon à l’intérieur du micro tube.
- Placer ce micro tube sur vortex pour qu’il homogénéise bien et ensuite, pipeter
100 µl de ce micro tube pour le mettre dans le second micro tube.
- Les deux micro tubes seront conservés à -60°c au réfrigérateur.
c.) La procédure d’extraction de l’ADN Chlamydia
La procédure est la suivante :
- Distribuer 10 µl de Control Interne dans chaque micro tube, puis ajouter 100 µl
d´échantillon et 300 µl de la solution de lyse, il s’agit de l’inactivation chimique.
10
- Vortexer et incuber pendant 5min á 65°c le contenu des micro tubes, il s’agit
d’une inactivation thermique.
- Centrifuger 14000 tr/min les micro tubes sur ‘la thermo – scientific’, cette étape
va libérer l’ADN en effectuant une mini-lyse.
- Vortexer le sorbant et l’ajouter 20 µl de ce dernier dans les tubes. Le sorbant
joue un rôle de résine chargé négativement dans chaque micro tube,
l’importance de cet ajout est de créer des liaisons ioniques entre les acides
nucléiques (Chargés positivement) et les protéines, tous les autres éléments
seront éliminés.
- Vortexer à 2400 trs et incuber les tubes à température ambiante pendant 3
minutes, cette étape se déroule deux fois dans le but de solidifier les liaisons.
- Centrifuger à 15 000 trs/min puis retirer et jeter le surnageant.
- Ajouter 500 µl de la solution de lavage par tube, puis vortexer et centrifuger les
pendant 1000 tr/min, avant de retirer délicatement le surnageant des tubes.
- Ouvrer les tubes et incuber les pendant 10 minutes à 65°C, puis ajouter 100 µl
de l’éluant de l’ADN qui a pour but de purifier la molécule d’ADN et de la
séparer de la silice
- Fermer les tubes et incuber les pendant 5 minutes à 65°c puis vortexer.
- Centrifuger ces tubes à 12 000trs/min avant de transférer le surnageant contenant
l’ADN 75 µl dans les tubes d’élution, puis centrifuger le surnageant
14000trs/2min pour séparer l´ADN des protéines qui sont éliminés. Les deux
dernières centrifugations consistent suite aux lavages d’éliminer toutes les
impuretés.
d.) La préparation de la solution mix
La solution mix contient la Taq polymérase qui va synthétiser la molécule d’ADN à

partir des nucléotides présents dans la réaction utilisant les amorces ou oligonucléotides
dans chaque étape de synthèse.
▪ Préparation du mix
Le mix est constitué de sonde, amorce, tampon
- Mélanger le mix 1+mix 2+taq polymérase ;

- Centrifuger 12000trs/1min ;
- Ajouter 15ul de mix dans chaque puits de la plaque PCR.
11
Le Taq polymérase est une enzyme très résistante à la dénaturation et elle intervient à
la réaction de polymérisation, elle est extraite de la bactérie thermusaquaticus, qui est un
microorganisme extrêmophile.
Les Amorces permettent de délimiter la région d’ADN à amplifier en s’hybridant à

l’ADN matrice.
Les Sondes permettent de détecter l’ADN en émettant une fluorescence
e.) La pré-amplification
Cette étape permet de préparer la plaque pour la phase d’amplification, alors la

procédure se déroule comme suite :
- Distribuer 15 µl dans les puits sur la plaque ou les plaques adaptée(s) ;

- Distribuer 10 µl de l’ADN de chaque échantillon dans les puits contenant le mix
(protéger la plaque d’un biofilm pour éviter l’évaporation et protéger la plaque
des contaminations ;
- Disposer la plaque sur un portoir réfrigéré, puis centrifuger la plaque pendant 3
minutes à 1070 G (2500trs/min), cette phase permet d’éliminer les bulles d’air.
- Dés que la plaque est prête, placer la dans le thermocycleur ‘ampliLab’.
f.) Interprétation des résultats Chlamydia
Les deux gènes recherchés lors de l’analyse sont :
- Le contrôle interne permet de valider l’étape d’extraction dont le but est

d’isoler la molécule d’ADN de tous les autres constituants d’un tissu et les
molécules fortement liées à l’ADN. C’est la raison pour laquelle ce gène doit
être détecter dans tous les échantillons qu’ils soient positifs ou négatifs.
- Le contrôle positif, il s’agit du gène Chlamydia. Ce gène est retrouvé chez les
sujets positifs.
Les échantillons sont considérés positif, doivent être < 33 et ceux négatifs doivent être > 33.
II.1.3.2. Le COVID 19
Il s’agit d’une maladie infectieuse causé par le coronavirus du syndrome respiratoire

aigu sévère 2 (SRAS-Cov 2). Le coronavirus est un virus d’origine zoonotique, avant de se
propager d’une personne à une autre. Le diagnostic repose sur « la réaction en chaine par
polymérase après transcription inverse en temps réel (RT-PCR) ».
12
Le prélèvement est nasopharyngé par rotation de l’écouvillon dans l’une des narines
pour recupèrer autant de cellules que possible. Les échantillons reçus par l’unité sont au
nombre de trois :
- Ag COVID-19 destiné pour les stagiaires ;

- Ag COVID et RT-PCR pour les patients ;
- RT-PCR pour les voyageurs.
b.) Test rapide antigénique COVID-19
C’est un test de diagnostic rapide permet de détecter directement la présence ou non

d’un antigène, il ne renseigne pas sur la présence des anticorps. Ce test est préconisé chez les
patients suspectés d’être porteur du COVID-19.
▪ La procédure de réalisation du test

- Après avoir collecter l’échantillon, retirer la cassette de test de son étui ;
- Mettre l`écouvillon dans la colonne contenant le diluant, mélanger ;
- Mettre 3 à 5 gouttes du mélange dans la cassette de test ;
- Laisser migrer pendant 15 min ;
- Noter les résultats sur les fiches des résultats ;
- Ramener les fiches des résultats au laboratoire pour la validation par le
biologiste.
En cas de positivité au test, on réalise directement la RT-PCR pour confirmer la

présence d’antigène COVID-19.
c.) RT-PCR COVID 19
Comme la plupart des virus à ARN, pour être détecter le SRAS-Cov 2 subit d’abord une
reverse transcription suite à la présence d’un enzyme virale « transcriptase inverse ou
rétrotranscriptase » qui permet de convertir l’ARN en ADN. Le brin d’ADN résultant de
cette réaction est appelé « ADN complémentaire » sera ensuite utilisé pour la PCR.
▪ Le principe du RT-PCR COVID 19
La méthode utilisée pour l’extraction permet de purifier la molécule d’ARN basé sur le
principe de chromatographie échange d’ions sur la colonne portant une résine de silice.
13
Après lyse (thermo-chimique) et précipitation (par l’alcool et centrifugation), l’ARN
immobilisé sur la résine échange d’anions est lavé plusieurs fois, les déchets passent dans les
tubes collecteurs qui sont éliminés à chaque étape.
Après purification, l’ARN est décroché de la résine par action d’une solution d’élution,
l’éluant est recueilli dans un micro tube stérile. L’extrait obtenu est prêt pour la phase
d’amplification.
▪ La procédure d’extraction d’ARN à partir d’un écouvillon COVID
o PSM 2 : Lyse et inactivation

- Distribuer 50 µl de protéinase K (Cette enzyme digère les protéines
contaminantes et dégrade les nucléaires) ;
- Distribuer 200 µl de l’échantillon ;
- Distribuer 200 µl de tampon de lyse contenant RNA carrier dans les tubes.
o L’extraction d’ARN dans la salle d’extraction

- Incubation à 72°c pendant 10 minutes ;
- Brève centrifugation (environ 30 secondes) ;
- Précipitation à l’éthanol absolu (250 µl) ;
- Brève vortexage (environ 15 secondes) ;
- Centrifuger le tube pendant 30 secondes ;
- Absorption de tout liquide, puis centrifuger 12000 g pendant 1 minute ;
- Transfert des colonnes sur les nouveaux tubes collecteurs ;
- Faire le premier lavage avec 500 µl inhibitor remover qui inhibe tout ce qui peut
nuire à la réaction, centrifuger 12000 g pendant 1 minute et transférer les
colonnes sur des nouveaux tubes collecteurs
- Faire un second et un troisième lavage avec 500 µl Deionized solution qui
ressort l’action des ions, puis centrifuger 12000 g pendant 1 minute et transférer
les colonnes sur des nouveaux tubes collecteurs ;
- Centrifuger les tubes 14000 g pendant 3 minutes, puis transférer des colonnes
sur les micro tubes de 1,5 ml identifiés ;
14
- Incuber à 72°c pendant 2 minutes avec les colonnes ouvertes et ajouter 50 µl du
tampon d’élution ensuite préchauffé à 72°c pendant 10 minutes ;
- Vérifier les identités colonnes et tubes, puis centrifuger 14000 g pendant 1
minute.
o La préparation du mix, il est important d’avoir des contrôles d’amplification

(négatif et positif).
o La phase d’amplification, comme tous virus à ARN le COVID 19 subira une
retro-transcriptase avant d’effectuer la PCR. Au cours de l’amplification, on
recherche trois gènes dont deux gènes sont spécifiques au COVID « ORF et N »
et l’autre gène est celui du contrôle interne qui sert de contrôle pour la phase
d’extraction.
▪ L’interprétation des résultats après RT-PCR
On considère un échantillon positif si les deux gènes COVID sont < 37 mais dans le cas
où ORF < 37 et N > 37, on considère le résultat douteux et on refait la procédure.
II.1.3.3. La charge virale VIH
La charge virale est un test qui permet de mesurer la quantité de VIH dans le sang. Le
résultat du test de la charge virale s’exprime en nombre de copies par millilitre (ml) de
sang, plus le nombre est faible moins il y a de virus dans le sang.
Le type de prélèvement utilisé est sanguin, les échantillons sont recueillis dans deux tubes
EDTA, ces types de tubes permettent de la conservation des virus à ARN.
L’utilisation de l’EDTA empêche la dégradation de l’ARN par les enzymes présentes dans le
sang, permettant ainsi une meilleure préservation de l’ARN viral.
b.) La phase de traitement des échantillons de CV-VIH
Le traitement des échantillons de charge virale se déroule comme suite :
15
- Pour ce test, deux tubes EDTA correspondent à un patient alors après réception
des échantillons, enregistrer le patient dans le registre correspondant dans lequel
on met le numéro d’ordre du registre, le code labo, le traitement pris par le
patient, le code TARV, l’âge et le sexe, le FOSA ;
- Centrifuger les tubes à 2500 tours pendant 10 minutes ;
- Transporter les tubes dans la salle d’inactivation, prendre 3 micro tubes sur
lesquels ont inscrits le numéro d’ordre du registre, le nom et le prénom du
patient ;
- Mettre dans chaque micro tube 900 – 1000 µl du plasma obtenu de suite à la
centrifugation ;
- Deux de ces micro tubes sont conservés à -60°c et le troisième micro tube est
conservé à -20°c jusqu’à extraction.
c.) Extraction sur Abbott RealTime HIV-1

▪ Le principe biologique d’Abbott RealTime HIV-1
Ce test utilise la RT-PCR afin de générer un produit amplifié du génome ARN du VIH
dans les échantillons cliniques. Une séquence d’ARN non liée à la séquence cible du VIH-1
est introduit dans chaque spécimen en début de leurs préparations. Cette séquence d’ARN non
liée est simultanément amplifiée par RT-PCR, et sert de contrôle interne.
La quantité de séquence cibles de VIH-1 présente à chaque cycle d’amplification est

mesurée à l’aide de sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence sur l’Abbott
m2000rt. Les sondes ne renvoient aucun signal à moins d’être spécifiquement liées au produit
amplifié.
Au cas où le signal fluorescent est détecté par l’Abbott m2000rt et ce signal est
proportionnel au log de concentration d’ARN VIH-1 présente dans l’échantillon d’origine.
▪ La préparation des échantillons
Le but de cette préparation est d’extraire et d’isoler les molécules cibles d’ARN, afin
de rendre les cibles accessibles pour l’amplification et d’éliminer tout inhibiteur potentiel de
l’amplification de l’extrait.
L’Abbott m2000sp est la technologie magnétique utilisé pour la phase d’extraction, les
billes magnétiques présentes dans cet appareil vont capturer les acides nucléiques et laver les
16
particules afin d’éliminer tout composant non lier de l’échantillon. Les acides nucléiques sont
élués et transférés vers les tubes de sortie ou une plaque à 96 puits profonds, dès que les
acides nucléiques prêts passent à l’amplification. Le contrôle interne est soumis à l’intégralité
de la procédure de préparation des échantillons, avec les calibrateurs, les contrôles et les
échantillons.
La solution mix est préparé une fois à l’intérieur d’Abbott m2000sp sera distribué dans
les aliquots des échantillons.
▪ Amplification
La réaction d’amplification se déroule sur l’Abbott m2000rt, l’ARN cible sera converti
en ADNc grâce à l’activité de transcription inverse de la polymérase thermostable r Tth ADN.
L’amplification exponentielle du produit est obtenue grâce aux cycles répétés entre
hautes et basses températures, entrainant l’amplification au milliardième ou des séquences
cibles. Les deux cibles (VIH-1 et contrôle interne) sont amplifiées simultanément au cours de
la réaction.
▪ Détection
Pendant les cycles de lecture des amplifications sur l’Abbott m2000rt, la température
est abaissée de manière à permettre la détection par fluorescence des produits d’amplification
au cours de l’hybridation des sondes VIH-1 et CI avec leurs cibles respectives (détection par
fluorescence en temps réel). Chaque type de sonde est marqué par un fluorochrome différent,
ce qui permet de détecter simultanément les deux produits amplifiés lors de chaque cycle.
Le cycle d’amplification au cours duquel le signal fluorescent est détecté par Abbott
m2000rt est proportionnel au log de concentration d’ARN VIH-1présente dans l’échantillon
d’origine.
En de l’extraction magnétique, celle manuelle peut également réalisée.
II.1.3. L’unité d’immuno- Sérologie
Cette unité met en œuvre des analyses dont le but est de rechercher dans le sérum du
patient soit les anticorps dirigés les antigènes bactériens, parasitaires et viraux responsables de
maladies. En dehors des anticorps recherchés, on y recherche également les antigènes et tout
ceci est possible grâce aux différentes techniques immuno- enzymatiques.
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Cette paillasse se situe entre l’unité de biochimie, la salle de distribution de la banque
de sang et en face de la salle de stérilisation. Elle est en étroite collaboration avec la banque
de sang et est sous la responsabilité de quatre membres du personnel :
- Mr CHUENGOUE Achille, chef d’unité ;

- Mr TSAGUE Franklin ;
- Mr.FANGA Billy Martial
- Mme MANGA ADA Raymonde ;
- Mme Salimatou DIALLO ;
- Mme TCHIO Yolande.
▪ Les différents postes de l’unité Immuno- Sérologie
Elle est repartie comme suite :
- Le poste d’enregistrement est composé d’une dizaine de registres

correspondant chacun à certaines analyses, par exemple le registre de la
sérologie courante destiné pour l’analyse du TPHA/VDRL ; FR et ASLO, le
registre des marqueurs tumoraux, le registre des hormones.
- Le poste de centrifugation est équipé d’une centrifugeuse nommée Rotofix 32
du fabricant Hettich.
- Le poste d’aliquotage où l’on sépare le sérum du tube primaire du patient (le
tube sec), le sérum recueilli est mis dans un tube à hémolyse sur lequel est écrit
le nom et le code labo du patient. Les échantillons pour la détection des maladies
infectieuses seront laissés sur le poste d’aliquotage et ceux qui doivent analyser
à l’instant, sont analysés sur VIDAS. En dehors de l’aliquotage, on réalise aussi
sur ce poste les tests d’agglutination rapide et de TDR.
- Le poste de réalisation des ELISA manuels ;
- Le poste VIDAS est composé de 02 VIDAS dont le principe utilisé est celui
ELFA qui est une méthode immuno- Enzymatique avec une lecture finale à
fluorescence. Sur ce poste, il y’a également un ordinateur ayant le logiciel
VIDAS où l’on enregistre le code du patient et l’analyse qui lui ai destinée.
- Le poste d’incubation où l’on retrouve l’incubateur Jouan qui fournit une
température nécessaire pour les réactions enzymatiques.
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- Le poste de validation qui a également un ordinateur ayant le logiciel Kalysis
où l’on met les résultats des analyses du jour précédent.
▪ L’appareillage de l’unité
Les autres appareils retrouvés sont :
- L’agitateur de plaque pour les tests d’agglutination.

- Le lecteur de plaque ELISA est un spectrophotomètre spécialisé dont le rôle est
de détecter les anticorps ou antigènes en produisant de façon directe ou indirecte
une réaction coloré et en donnant les valeurs sous forme de densité optique.
- Le Finecare est un analyseur d’immunochromatographique par fluorescence qui
aide dans le diagnostic des conditions telles que le diabète (HbA1c), les
maladies cardiovasculaires (CKMB, NT-proBNP), les lésions rénales (Micro-
albumine), les cancers (AFP, PSA), les marqueurs de coagulation (D-Dimer) et
même les infections (CRP, PCT). Il fournit des résultats fiables, rapides et
quantitatifs de divers analytes dans le sang ou l’urine en quelques minutes.
- Le Sysmex est un automate d’hématologie réalisant la numération des éléments
figurés du sang et la formule leucocytaire.
- Le Cobas
- Deux réfrigérateurs où sont rangés les réactifs des tests.
II.1.4.1. Les ELISA manuels utilisés
Sur cette unité, on réalise de nombreuses ELISA manuelles dans le but de détecter la
présence d’une infection virale en recherchant soit les anticorps, soit les antigènes. En
fonction de l’analyse de chaque infection, on effectue une recherche précise.
Le matériel utilisé :
- La fiche de paillasses ;
- Le lecteur de plaque ;
- L’incubateur ;
- Le papier buvard ;
- Les embouts ;
- La poubelle ;
- Les micropipettes de 50 µl, 100 µl et 200 µl ;
19
- Les solutions de dilution propres à chaque analyse ;
- Les réactifs FORTRESS (Ag/Ac VIH 4éme génération, AgHBS et AcHCV) ;
- Les plaques en fonction des tests à réaliser.
II.1.4.1.1. ELISA Sandwich
Cette technique ELISA consiste à piéger entre un anticorps de capture utilisé pour
enrober le puits et un anticorps de détection, les antigènes d’intérêt. Elle est utilisée pour la
détection des infections aux VIH et à l’hépatite C, mais le mode opératoire entre le deux varie
grandement différent.
a.) ELISA Ag/Ac VIH de 4éme génération

▪ Le principe de l’Ag/Ac VIH de 4éme génération
Il s’agit d’un test immuno- enzymatique « sandwich » ayant trois étapes d’incubation
utilisant des barrettes de micro puits préenduits d’Ag VIH (gp41 du VIH-1 recombinant,
gp120 de ce même VIH-1 recombinant et gp36 du VIH-2 recombinant) et les Acs anti VIH
(P24).
Dans un premier temps, les anticorps biotinylés anti VIH (P24) et le sérum du patient
sont ajoutés dans les puits. Pendant l’incubation, les anticorps spécifiques du VIH ½ et / ou
l’antigène p24 du VIH présents dans l’échantillon sont capturés à l’intérieur du puits sous
forme d’un complexe « sandwich » à double Acs comprenant : l’Ac enrobé- Ag p24- l’Ac
biotinylé. Après cette incubation, les micro puits subiront un lavage dans le but d’éliminer
toutes les protéines sériques non liées.
La détection du complexe Ag p24 du VIH-Ac biotinylé capturé ou des anticorps anti-

VIH ½ est obtenue au cours de la deuxième incubation par l’ajout de l’enzyme HRP qui a été
conjugué aux seconds antigènes recombinants du VIH 1 et 2 et à l’avidine.
▪ La procédure FORTRESS d’Ag/Ac VIH
- Etape 1 : Retirer les réactifs du frigo et les mettre à température ambiante.
20
- Etape 2 : Pendant que les réactifs prennent la température, établir une fiche de
paillasse où sera mise les codes de tous les échantillons à tester y compris ceux
de la banque de sang, ne pas oublier de réserver les puits pour le blank (A1), les
trois contrôles négatifs (B1, C1, D1) et les trois contrôles positifs (HIV1 ‘E1’,
HIV2 ‘F1’ et Ag HIV ‘G1’).
- Etape 3 : Dès que les réactifs ont pris la température, ajouter 20 µl le réactif de
biotine-conjugué dans tous les micro puits étant sur la plaque sauf le blank.
- Etape 4 : Ajouter 100 µl des contrôles positifs, des contrôles négatifs et des
spécimens dans les micro puits respectifs.
- Etape 5 : Recouvrir la plaque d’un couvre plaque, et l’incuber pendant une
heure à 37°c.
- Etape 6 : Après la première incubation, passer au lavage où l’on utilise la
solution de lavage dilué au vingtième. Pendant le lavage, bien remplir les micro
puits et les laisser tremper pendant 30- 60 secondes. Après chaque lavage, rejeter
d’un coup sec la solution de lavage contenu dans les puits et tapoter le contenu
restant sur un papier buvard.
NB : Le lavage se fait 5 fois enfin de bien éliminer les protéines non liées ou non fixées
au complexe formé s’il y a présence d’antigène p24 ou anticorps du VIH
- Etape 7 : Après la période de lavage, on ajoute le HRP-conjugué dans tous les

micro puits sauf celui du blank, recouvrir la plaque d’un couvre plaque et passer
ensuite à la seconde incubation pour une période de 30 minutes.
- Etape 8 : Après cette seconde incubation, on fait également un second lavage en
reprenant les mêmes actions du premier lavage.
- Etape 9 : Distribuer 50 µl du chromogène A et 50 µl du chromogène B dans
tous les puits y compris celui du blank, recouvrir la plaque d’un couvre plaque et
réincuber pour la troisième fois.
NB : Lors de l’ajout des chromogènes dans les puits, il faut protéger la plaque de la
lumière car cette dernière fait rapidement apparaitre la couleur bleue.
- Etape 10 : Après avoir mis les chromogènes, incuber la plaque pendant 15

minutes si le lavage a été bien fait. La réaction enzymatique entre les
chromogène et le HRP-conjugué va produire une coloration bleue (signe de
21
positivité indiquant la présence d’antigènes ou d’anticorps VIH1/2 dans le puit
ce qui traduit une infection).
- Etape 11 : Après ce temps ajouter la solution stop dans tous les puits y compris
le blank dans le but d’arrêter la réaction car si cette dernière continue, il y’a des
forts risques d’avoir des faux positifs. Ensuite installer immédiatement la plaque
dans le lecteur de plaque pour mesurer l’absorbance, calculer la valeur du cut-off
et évaluer les résultats.
▪ Interprétation des résultats
Après avoir mesurer les absorbances des puits à partir du lecteur de plaque. On passe au
calcul du cut-off de cette réaction dont la valeur doit être égale à 0,15, on procède comme
suite :
Cut-off (CO) = la moyenne des contrôles négatifs + 0,12
A partir de ce CO, on calcule le Les résultats sont calculés reliant la densité optique ou
l’absorbance de chaque échantillon à la valeur du cut-off de la plaque. On procède comme
suite :
Résultat = Densité optique de l’échantillon/Cut-off
- L’échantillon est considéré comme négatifs si son résultat est inférieur à 1. Ce

résultat indique l’absence des anticorps VIH1/2 ou de l’antigène p24 dans cet
échantillon.
- L’échantillon est considéré comme positif si son résultat est supérieur ou égale à
1 alors cela veut dire que son absorbance est supérieure à la valeur du CO et
aussi que l’antigène p24 ou les anticorps VIH1/ sont présents dans l’échantillon
du patient.
- Un échantillon peut aussi avoir un résultat dit « équivaut » si ce dernier a pour

valeur ‘0,9 – 1,1’. Dans ce cas, on relance l’échantillon sur le VIDAS et si le
résultat est toujours le même, alors ceci nous montre que le patient est
réellement positif au test. On peut aussi utiliser un kit de PAREESHAK pour
révéler le type du VIH.
Après toutes ces interprétations, les résultats des patients sont reportés dans le registre
des infections au VIH et pour les donneurs de la banque de sang, leurs résultats sont transmis
dans le registre correspondant.
22
b.) ELISA d’Ag Hbs
▪ Le principe de l’Ag Hbs
Ce test est basé sur la méthode d’ELISA sandwich ayant trois étapes d’incubation
utilisant des barrettes de micro puits préenduits d’anticorps monoclonal anti-AgHbs qui
constituent l’anticorps. Au cours de la première incubation du spécimen, si l’Ag Hbs est
présent dans l’échantillon alors il va se lier à l’anticorps préenduit.
Par la suite l’Ac-conjugué sera également ajouté, cet anticorps conjugué va se lier au
complexe AgHbs-Ac préenduit précédemment formé. Après la seconde incubation, le substrat
sera ajouté pour produire une coloration bleue signe d’une réaction enzymatique dans le puit,
cette réaction sera stoppée par l’acide sulfurique qui donnera une couleur jaune. Les puits où
les échantillons ne contiennent pas d’Ag Hbs, l’Ac-conjugué ne se lie pas à l’Ac enduit et une
faible coloration va se développer.
▪ La procédure FORTRESS d’Ag Hbs

- Etape 2 : Pendant que les réactifs prennent la température, établir une fiche de
paillasse où sera mise les codes de tous les échantillons à tester y compris ceux
de la banque de sang, ne pas oublier de réserver les puits pour le blank (A1), les
trois contrôles négatifs (B1, C1, D1) et les deux contrôles positifs (E1 et F1).
- Etape 3 : Dès que les réactifs ont pris la température, préparer les barrettes des
micro puits et ajouter 50 µl du contrôle positif, du contrôle négatif et des
échantillons dans leurs puits respectifs. Rien ne sera ajouté dans le puits destiné
au blank.
- Etape 4 : Recouvrir la plaque d’un couvre plaque, et l’incuber pendant une
heure à 37°c.
solution de lavage de cette réaction dilué au vingtième. Bien remplir les micro
NB : Le lavage se fait 5 fois
23
- Etape 6 : Après la période de lavage, ajouter une goutte du chromogène A et du
chromogène B dans tous les micro puits y compris celui du blank et placer la
plaque dans l’incubateur pour une période de 15 minutes. Lors de l’ajout des
chromogènes protéger la plaque de la lumière en la couvrant après ajout du
substrat.
- Etape 7 : Ajouter 50 µl de la solution stop dans tous les puits de la plaque y
compris le blank.
- Etape 8 : Mesurer l’absorbance des micro puits de la plaque sur le lecteur de
plaque. Après avoir mesurer l’absorbance, mesurer le cut-off et évaluer les
résultats.
suite :
Cut-off (CO) = la moyenne des contrôles négatifs × 2,1
suite :

résultat indique l’absence de l’AgHbs dans l’échantillon du patient.
- L’échantillon est considéré comme positif si son résultat est supérieur ou égale à
aussi que l’antigène Hbs est présent dans l’échantillon du patient.
- Un échantillon peut aussi avoir un résultat dit « équivaut » si ce dernier a pour
valeur ‘0,9 – 1,1’. Dans ce cas, on relance l’échantillon sur le VIDAS et si le
résultat est toujours le même, alors ceci nous montre que le patient est
réellement positif au test.
Les résultats sont transmis dans le registre correspondant, pour les patients dans le
registre des hépatites B et C. Les résultats des donneurs dans l’un des registres de la banque
de sang destiné pour les maladies infectieuses.
24
II.1.4.1.2. ELISA Indirect
Il s’agit d’une méthode en deux étapes utilisant un anticorps secondaire marqué pour
la détection. Au cours de la procédure, l’anticorps primaire est incubé avec l’antigène. Par la
suite l’anticorps secondaire marqué reconnaissant l’anticorps primaire ajouté.
a.) Ac HCV
▪ Le principe du test
Le principe se base sur la méthode d’ELISA Indirecte pour la détection des anticorps
anti VHC au travers deux étapes d’incubation. Les barrettes de micro puits sont préenduits
d’antigènes recombinants hautement immunoréactif correspondant au noyau et aux régions
non structurelles du VHC.
Au cours de la première incubation si les anticorps anti VHC spécifiques sont présents,
s’ils vont se lier aux antigènes préenrobés en phase solide. Lors du lavage, les protéines
sériques non liées sont éliminées par la suite l’HRP- conjugué sera ajouté.
A la deuxième incubation, les anticorps conjugués vont se lier aux complexes Ag- Ac
précédemment formés et s’il n’y a pas formation de complexes, les anticorps conjugués seront
éliminés lors du second lavage.
Les chromogènes ajoutés dans les puits après le second lavage, ils seront hydrolysés par
les anticorps conjugués dans les puits ayant les complexes anticorps – antigènes du virus,
cette réaction produira une coloration bleue qui vira au jaune lors de l’ajout de la solution
stop. Dans les puits négatifs, la coloration reste incolore.
▪ Procédure de la réaction

- Etape 2 : Etablir une fiche de paillasse où sera mise les codes de tous les
échantillons à tester y compris ceux de la banque de sang, ne pas oublier de
réserver les puits pour le blank (A1), les trois contrôles négatifs (B1, C1, D1) et
les deux contrôles positifs (E1 et F1).
- Etape 3 : Dès que les réactifs ont pris la température, préparer les barrettes des
micro puits suffisant pour la réalisation du test dans. Dans ces micro puits,
ajouter 100 µl du diluant, rien ne sera ajouté dans le puits destiné au blank.
25
- Etape 4 : Ajouter 10 µl du contrôle négatif, contrôle positif et du spécimen
dans leurs puits respectifs.
- Etape 5 : recouvrir la plaque d’un couvre plaque, la tapoter légèrement avant de
l’incuber pour 30 minutes à 37°c.
solution de lavage de cette réaction dilué au vingtième. Bien remplir les micro
- Etape 7 : Ajouter 100 µl de l’HRP-conjugué dans tous les puits à l’exception du
blank.
- Etape 8 : Faire une seconde incubation pendant une période de 30 minutes à
37°c, ensuite effectuer le second lavage comme à l’étape six.
- Etape 9 : Ajouter 50 µl du chromogène A et du chromogène B dans tous les
micro puits y compris celui du blank et placer la plaque dans l’incubateur pour
une période de 15 minutes. Lors de l’ajout des chromogènes protéger la plaque
de la lumière en la couvrant après ajout du substrat.
- Etape 10 : Ajouter 50 µl de la solution stop dans tous les puits de la plaque y
compris le blank.
- Etape 11 : Mesurer l’absorbance des micro puits de la plaque sur le lecteur de
plaque. Après avoir mesurer l’absorbance, mesurer le cut-off et évaluer les
résultats.
suite :
Cut-off (CO) = la moyenne des contrôles négatifs + 0,12
suite :
26
résultat indique l’absence de l’Ac VHC dans l’échantillon du patient.
- L’échantillon est considéré comme positif si son résultat est supérieur ou égal à
aussi que l’anticorps VHC est présent dans l’échantillon du patient.
- Un échantillon dont le résultat est inférieur ou égal au Cut-off multiplier par
deux, est considéré comme équivaut. Alors le sérum de ce patient sera relancé
sur le VIDAS et s’il est toujours dans cet intervalle, on le considère comme
positif à l’hépatite C.
registre des hépatites B et C. Les résultats des donneurs dans l’un des registres de la banque
de sang destiné pour les maladies infectieuses.
II.1.4.2. Les tests d’agglutinations
De nombreux tests d’agglutinations sont réalisés sur cette unité tels que
II.1.4.2.1. TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutination Assay)
C’est un test d’agglutination passive directe ou sensible utile pour la détection des
anticorps dirigés contre l’antigène du Treponema pallidum responsable de la syphilis. La
particularité de ce test est qu’il a pour support les hématies d’où le nom d’hémagglutination.
- Les réactifs de Dialab ;

- La plaque de titration ;
- Les embouts ;
- La poubelle ;
- Les micropipettes de 50 µl, de 100 µl et de 200 µl.
▪ Le principe de l’hémagglutination
Dans ce type d’agglutination, les globules rouges forment des petits amas visibles à
l’œil nu. Dans le cas du TPHA, les hématies jouent le rôle de support inerte sur lequel
on fixe de façon artificielle les antigènes solubles. Elles seront agglutinées par les
anticorps spécifiques, ce qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps.
27
▪ La procédure du TPHA par DIALAB

- Etape 2 : Préparer la plaque de micro titration.
- Etape 3 : Comme pour les tests d’ELISA manuels, faire une fiche de paillasse
qui nous donne un aperçu des nombres de micro puits disponibles sur la plaque.
- Etape 4 : Sur la plaque, les micro puits A1 et B1 réservés aux contrôles
doivent rester vide.
- Etape 5 : Pipeter 190 µl de diluant dans les micro puits réservés aux
échantillons des patients ou donneurs, et puis ajouter 10 µl de sérum de patient
dans les puits respectifs de chaque patient puis tapoter légèrement la plaque.
NB : Lorsque les micro puits (C1 à H1) de la première colonne sont déjà remplis, laisser
les micro puits des deux autres colonnes vides et continuer de distribuer les sérums des autres
patients à partir de la quatrième colonne avant de laisser encore deux colonnes vides.
- Etape 6 : Dans les micro puits A2 et A3, mettre 25 µl du contrôle négatif et 25

µl du contrôle sera mis dans les micro puits B2 et B3.
- Etape 7 : Pipeter 25 µl du mélange réalisé lors de l’étape 5 qu’on introduit dans
les micro puits suivants ceux de la première dilution. Ceci veut dire qu’après
avoir fait la première dilution par exemple dans le puit C1, prendre 25 µl des
200 µl qu’on va mettre dans les puits C2 et C3.
- Etape 8 : Pipeter 75 µl du control cell, qu’on introduit uniquement dans les
colonnes 2, 5, et 8. Ces colonnes suivent directement les colonnes (1, 4 et 7) où
la première dilution a été faite.
- Etape 9 : Ajouter 75 µl du test cell dans les micro puits suivants les micro
puits contenant le control cell, alors il s’agit des colonnes 3, 6 et 9.
NB : Avant l’utilisation du control cell et du test cell, il faut les homogénéiser

doucement enfin de ne pas lyser les hématies.
- Etape 10 : Tapoter doucement la plaque, ensuite la recouvrir d’un couvercle et

l’incuber pendant 45 à 60 minutes.
28
Après l’incubation, on observe s’il y’a présence d’agglutinations ou pas. Les
agglutinations formées dans les puits des patients contenant le test cell sont signe de positivité
au Treponema pallidum. Dans ce cas, on passe à l’étape de titration de l’échantillon
soupçonné d’être positif. La titration se déroule comme suite :
- On utilisera uniquement la première colonne de la plaque de micro titration,

dans le premier puit on va mettre 190 µl et 10 µl du spécimen positif ;
- Dans les autres puits de la colonne, on va ajouter 25 µl du diluant ;
- On pipetera 25 µl du mélange réalisé dans le premier puit, pour le mettre dans le
second puit ayant le diluant. On homogénéise bien ce volume à l’intérieur du
second puit, puis on reprend 25 µl du contenu du second puit qu’on mettra dans
le troisième puit contenant également le diluant et ce volume sera aussi
homogénéisé dans le troisième puit avant d’être transmis dans le quatrième puit.
- Le même processus se fera dans les autres puits restants, mais après avoir
homogénéiser les 25 µl du sixième puit dans le septième puit, rejeter cette
quantité dans la poubelle appropriée.
- Après avoir effectuer toutes ces dilutions, ajouter 75 µl du test cell dans les puits
B1, C1, D1, E1, F1, G1, H1.
- Recouvrir la plaque d’un couvercle et l’incuber pendant 45 minutes.
Après l’incubation, on observe les puits ayant les agglutinations dans le but de titrer le
TPHA (1/20, 1/40, 1/60, 1/80, etc…)
registre destiné au TPHA/VDRL. Les résultats des donneurs dans l’un des registres de la
banque de sang destiné pour les maladies infectieuses.
II.1.4.1.2. VDRL (Venereal Disease Research Laboraty)
C’est un test non spécifique de la syphilis encore dit « non tréponémique », mais très
sensible en cas de présence du germe vénérien. La technique utilisée est celle d’une
agglutination passive des anticorps dirigés contre un antigène cardiolipidique fixé sur un
support en latex. Il s’agit alors d’un test qualitatif ou semi-quantitatif par réalisation de
dilutions successives (pur, ½, ¼, etc…).
29
- Le kit de Dialab ayant déjà tous les réactifs ainsi le plaque ;
- L’agitateur de plaque ;
- Le minuteur.
▪ La procédure de VDRL proposée par le fabricant du kit
La procédure utilisée est la suivant :
- Etape 1 : Retirer les réactifs du frigo et les mettre à température ambiante et

lorsque cela est bon, prendre la micro plaque.
- Etape 2 : Pipeter 50 µl du sérum patient que l’on met dans l’un des cercles de
la plaque.
- Etape 3 : Mettre une goutte du contrôle négatif dans l’un des cercles, et une
goutte du contrôle positif dans un autre cercle.
- Etape 4 : Ajouter une goutte du réactif dans les cercles ayant le sérum du
patient, le contrôle négatif et le contrôle positif.
- Etape 5 : Placer la micro plaque sur l’agitateur et chronométrer pendant huit
minutes, si le temps excède il y’a des risques d’avoir des faux positifs.
Comme pour le test du TPHA, l’interprétation des résultats se fait de façon

macroscopique c’est-à-dire en observant la présence des agglutinations ou non après le
passage de la plaque sur l’agitateur.
II.1.4.3. Les autres examens réalisés dans l’unité d’Immuno- Sérologie
En dehors des analyses réalisés sur les ELISA manuels et sur les différents supports
d’agglutination, cette paillasse permet aussi d’effectuer d’autres examens au travers des
appareils de VIDAS utilisant des méthodes immuno- enzymatiques avec une lecture à
fluorescence.
30
Tableau 2: Les marqueurs d'urgence
MARQUEURS D’URGENCE
Valeur de Type de tube utilisé en

Paramètres Description Clinique
référence fonction de l’analyse
Pro hormone de la calcitonine, et cette Marqueur biologique spécifique des 0,05 – 200 ng/ml Tube sec
dernière qui est une hormone fabriquée infections bactériennes, son élévation
Procalcitonine
par les cellules C situées au niveau de la sérique est très importante au cours des
(PCT)
thyroïde. infections bactériennes, parasitaires et
fongiques invasives.
Le produit de la dégradation de la La présence de D-dimère dans le sang est 45 – 10 000 ng/ml Tube citraté
fibrine lors du processus de fibrinolyse. non pathologique à faible taux. Lorsque le
La fibrine est une protéine insoluble taux est très élevé, cela indique la présence
essentielle lors de la coagulation du d’un thrombus.
D-dimère
sang. Le dosage effectué en cas de suspicion de
thrombose veineuse profonde ou embolie
pulmonaire
31
Protéine permettant le stockage du fer Son dosage sanguin permet d’évaluer les 20 – 400 ng/ml ou Tube hépariné ou tube
dans l’organisme. réserves de fer aidant dans le diagnostic 15 -12 000 ng/ml sec
Elle joue un rôle dans le métabolisme d’une anémie ou d’une surcharge en fer.
Ferritine
du fer, permettant de réguler son
absorption intestinale en fonction des
besoins de l’organisme.
C’est l’une des trois iso- enzymes Il s’agit alors d’un bon marqueur cardiaque 0,8 – 300 ng/L Tube sec
CK-MB cytosolique de la créatine kinase que dont le dosage permet de faire le diagnostic
(Créatine l’on retrouve dans le myocarde. ou le suivi d’un infarctus du myocarde.
Kinase-Muscle La CK est impliquée dans la production
Brain) d’énergie nécessaire à la contraction des
muscles.
C’est un fragment du BNP (peptide Des taux élevés de BNP et de NT-proBNP Valeur normale Tube hépariné ou sec
NT-proBNP
natriurétique), est une hormone sécrétée sont des signes d’une tension pariétale de la BNP : < 100
(N-Terminal par le cœur, qui permet d’apporter le accrue autrement dit une surcharge du cœur. pg/ml
pro-Brain sang dans tout le corps. Ce dosage permet aussi de distinguer une Valeur normale
natriuretic
Le BNP est sécrété par les myocytes du insuffisance cardiaque d’une atteinte du NT-proBNP :
peptide)
ventricule gauche. pulmonaire. 15 – 25 000pg/ml
32
C’est une protéine que l’on retrouve Le dosage de la troponine permet de 15 - 40 000 pg/ml Tube hépariné ou tube
dans les muscles du cœur. Il s’agit d’un diagnostiquer une atteinte cardiaque. sec
complexe de trois protéines régulatrices Une très grande élévation de la troponine est
(Troponine C, I et T).
Troponine un signe évocateur d’un infarctus du
Il entre dans la constitution des fibres myocarde aigue.
musculaires, elle régule également leur Le taux de la troponine survient environ 4 à
concentration. 8 heures après le début des douleurs
Tableau 3: Les analyses hormonales
HORMONES
Paramètres Description Clinique Valeur de référence Type de tube utilisé
Hormone produite par les follicules à Son dosage permet de mesurer la 0,02 – 9 ng/ml Tube sec
l’intérieur des ovaires de la femme. réserve ovarienne et aussi la fertilité
AMH (Hormone Le taux d’AMH mesure donc indirectement la de la patiente.

Antimulletienne) quantité d’ovocytes chez la femme.
Son dosage doit être effectuer en début du

cycle J3 et J5.
33
FSH Hormone synthétisée par l’hypophyse. Son dosage consiste à évaluer la < 8UI/L ou 1 – 10 Tube sec
(Hormone de Elle intervient dans la régulation du cycle réserve ovarienne et la qualité de mIU/ml
stimulation menstruel chez la femme et à la régulation de l’ovulation.
folliculaire) la production du sperme chez l’homme
Hormone synthétisée par l’hypophyse. Elle Son dosage chez l’adulte est indiqué 1 – 100 mIU/mL Tube sec
LH (Hormone intervient dans la production de la dans les cas d’infertilité et de trouble
lutéinisante) testostérone chez l’homme et régule du cycle menstruel chez la femme.
l’ovulation chez la femme.
Hormone stéroïdienne principalement Son dosage est demandé en cas de 0,25 - 80 ng/ml Tube sec
sécrétée par les cellules du corps jaune des suspicion d’infertilité
ovaires et du placenta chez la femme
enceinte.
Progestérone Elle intervient dans le cycle menstrue de la
femme en préparant l’utérus à recevoir
l’embryon et chez l’homme, elle est produite
en faible quantité mais elle régule la
température corporelle
Oestradiol Hormone féminine appartenant à la famille Elle est prescrite dans le suivi de la 9 – 3000 pg/mL Tube sec
(Hormone grossesse, dans le diagnostic des
34
des œstrogènes secrétée par les ovaires. aménorrhées et en cas de suspicion de
Elle est responsable du développement des tumeur ovarienne.

stéroïdienne)
caractères sexuels secondaires chez la femme.
Son taux augmente au cours de l’ovulation.
Hormone stéroïdienne du groupe des Meilleur moyen d’évaluer le 0,06 – 1350 ng/mL Tube sec
androgènes nécessaire à la spermatogénèse, fonctionnement hormonal des
Testostérone au développement des organes génitaux males testicules.
et l’apparition des caractères sexuels Son dosage permet aussi de
secondaires chez l’homme. diagnostiquer le cancer de la prostate.
Hormone peptidique sécrétée par les cellules Hyperprolactinemie peut provoquer 0,5 – 200 ng/mL Tube sec
lactotropes de la partie antérieure de une infertilité et peut également
Prolactine l’hypophyse. altérer progressivement les fonctions
Elle intervient dans la production du lait sexuelles et la libido de la femme.

maternel.
TSH (Thyroid Hormone sécrétée par hypophyse dont le rôle Son dosage permet de diagnostiquer 0,05 – 60 µIU /mL Tube sec
stimulating est de stimuler et de réguler la sécrétion es l’hyper ou hypothyroïdie et le suivi
Hormon) hormones thyroïdiennes (T3 & T4). du traitement de ces maladies
35
Son rôle est crucial dans le fonctionnement de
la glande thyroïde
Hormone produite par la glande thyroïde, elle Son dosage permet l’exploration des T3 : 0,5 – 45 pmol/L Tube sec
est produite suite à la transformation d’une hypers et hypothyroïdies. FT3 : 0,4 – 9
partie de la T4.
T3 L ou FT3 Mettre en évidence une maladie mmol/ml
(Tri-iodo- Seule la fraction libre (FT3) peut être dosée thyroïdienne provoquer par une
Thyronine) spécifiquement. action trop forte ou trop faible de la

1 – 100 pmol/ml pour
Représente plus de 80% des hormones thyroïde. T4
produites par la thyroïde, elle intervient dans Son dosage permet l’exploration des Tube sec
6 – 300 mmol/ml
le fonctionnement des organes vitaux. hypers et hypothyroïdies.
pour FT4
Mettre en évidence une maladie
FT4 ou T4L thyroïdienne provoquer par une
(Thyroxine) action trop forte ou trop faible de la
thyroïde.
36
Tableau 4: Les analyses tumorales
Marqueur tumoraux
Paramètres Description Clinique Valeur de référence Tube utilisé
CA 15.3 Antigène de différenciation de Marqueur de première intention du cancer du 2 – 400U/mL Tube sec
l’épithélium mammaire sein.
(Cancer antigen
chiffre définisant Affection bénigne et maligne (ovaires, pancréas,
l’Ac) colon-rectum)
Glycoprotéine de surface reliée au Marqueur tumoral pour la détection des cancers 3 – 500 U/ml Tube sec
groupe sanguin LEWIS qu’on détecte à du pancréas.
CA 19.9 (Cancer
la surface de certaines cellules Son dosage permet de vérifier la réaction au
antigen
cancéreuses.
carbohydrate 19.9) traitement, de vérifier les récidives.
Mesure l’efficacité du traitement anticancer.
CA 12.5 Marqueur tumoral retrouvé en quantité chez les 4 – 600 U/ml Tube sec
patients atteints des cancers de l’endomètre, des
trompes, du col de l’utérus et des organes de
37
l’appareil digestifs.
Elle peut aussi être élevée en cas de grossesse.
ACE (Antigen Glycoprotéine de surface impliquée Son dosage permet d’exprimer diagnostiquer les 0,5 – 200 ng/mL Tube sec
Careino dans les fonctions d’adhésion cellulaire adénocarcinomes.
Embryonnaire) dans les tissus épithéliaux.
Glycoprotéine qui est similaire à Son dosage est important dans le diagnostic et le 0,5 – 400 U/mL Tube sec
l’albumine, elle est normalement suivi des hépatocarcinomes, des tumeurs
AFP (Alpha Foéto produite par le fœtus et chez l’enfant germinales.
protéine) jusqu’à l’âge d’un an, par le sac vitellin, Il permet aussi de faire le suivi des cancers du
le foie et le tube digestif. pancréas et de l’estomac.
C’est un marqueur peu spécifique.
PSA (Prostatic Sécrété exclusivement par les cellules Marqueur du cancer de la prostate 0,07 – 100 ng/mL Tube sec
Sérum Antigen) épithéliales de la prostate.
38
II.1.4. L’unité de parasitologie
Comme son nom l’indique, cette paillasse vise à s’intéresser particulièrement aux
éléments parasitaires et non parasitaires qui sont présents dans les échantillons qui lui sont
transmis. Les échantillons qui lui sont destinés :
- Hémoparasite ;
- Coprologie ;
- Spermogramme ;
- Sang occulte.
L’unité de parasitologie se situe juste à coté de la salle de distribution de la banque de sang et

elle est sous la responsabilité de deux membres du personnel dont :
- Mme DIMITTE Emma, chef d‘unité ;

- Mme MOUNJONGUE Danielle.
Cette paillasse est subdivisée en trois postes dont
- Le poste d’enregistrement qui est constitué de deux registres dont le registre de

goutte épaisse et celui de la coprologie, dans ces registres tous les échantillons
de toute la journée sont enregistrés. Une machine servant pour le report et la
validation des analyses effectuées le jour précédent.
- Le poste de microscopie équipé d’un microscope Optika, d’un paquet de lame
dégraissés, de lamelles, d’huile d’immersion, des compteurs cellulaires et des
portoirs de lame.
- Le poste de coloration constitué de la solution pure de Giemsa, de méthanol.
- Le poste pour la réception des échantillons de coprologie et de spermogramme,
il est constitué d’une hotte étant équipé de pipettes pasteur, d’eau
physiologique, d’anse et de lamelles.
II.1.6.1. L’examen d’hémoparasite
C’est un test qui consiste à rechercher la présence des parasites dans le sang, comme
hématozoaire pouvant être détecter : Plasmodium sp., Trypanosoma sp., microfilaires
sanguicoles, etc…
Le matériel utilisé pour ce test :
- Lame ;
39
- Lamelle ;
- La coloration de Giemsa dilué à 1/10éme ;
- Le méthanol ;
- Le microscope ;
- L’appareil de comptage des parasites ;
- Les pipettes pasteurs.
La procédure de la réalisation d’une hémoparasite comprend deux étapes essentielles
▪ L’état frais
Il consiste à :
- Après avoir bien homogénéiser le tube EDTA, on pipette une goutte de sang
qu’on étale entre lame et lamelle ;
- On dépose le spécimen sur la platine et tout en réglant le révolver à l’objectif
10X, tout en baissant le condensateur et en fermant totalement le diaphragme à
10 ;
- Lorsqu’on a bloqué la lame à l’objectif 10X, on redescend tout doucement
jusqu’à observer le champ.
NB : Cette étape consiste à rechercher ou à détecter la présence de microfilaires qui sont

facilement révéler par leurs mouvements rapides dans les hématies.
Dans le cas où l’on observe les microfilaires ou non à cette étape, on passe à l’état
coloré qui permet également rechercher les microfilaires. L’état coloré consiste à réaliser le
frottis sanguin et la goutte épaisse, dont le but est de bien identifier les différentes espèces et
les caractéristiques propres des sous-espèces.
▪ L’état coloré
Sa procédure est la suivante :
- Après avoir bien homogénéiser le tube, on déposer deux gouttes de sang de
chaque côté de la lame dont l’une correspond au frottis sanguin et l’autre pour la
goutte épaisse ;
- Pour la réalisation de la goutte épaisse, après avoir étaler la goutte effectuer
un mouvement circulaire de l’intérieur vers l’extérieur dans un sens unique avec
l’extrémité d’une autre lame dans le but d’écraser les hématies en vue de bien
ressortir les trophozoïtes.
40
- Pour la réalisation du frottis, après avoir étaler l’autre goutte de sang de
l’autre côté de la lame, placer au-dessus de cette goutte une autre lame à 45°,
laisser fuser le sang par capillarité en conservant toujours la même inclinaison et
tirer la goutte vers l’extrémité libre de la lame sans arrêt.
- Laisser sécher la lame en position horizontal à température ambiante à l’abri de
la poussière, on peut aussi la déposer dans la Poupinel pendant 5 minutes ;
- Après ce laps de temps, on fixe le frottis au méthanol en veillant à ce que celui
ne touche pas la goutte épaisse et le laisser sécher pendant 5 minutes ;
- Ensuite recouvrir la lame entièrement du Giemsa dilué à 10% et attendre
pendant 20 minutes ;
- Après rincer la lame avec douceur et placer la ensuite de façon verticale pour
qu’elle sèche.
- La lecture commence d’abord à l’objectif 10X où l’on fait descendre le
condensateur et on ferme ou ouvre légèrement le diaphragme. A cet objectif, on
note la présence des microfilaires qu’il faut différencier des artéfacts qui sont
costaud contrairement aux microfilaires qui sont des fils très fins ;
- Ensuite on passe à l’objectif 40X pour une identification précise des éléments
observés à 10X, on veille à monter le condensateur puis on règle le diaphragme
à 40.
- On passe ensuite à l’objectif 100X qui est destiné pour l’état coloré. A ce niveau
on dépose sur la lame, l’huile d’immersion qui permet de bien concentrer les
parasites (que ce soit les microfilaires ou les plasmodium). Sur cet objectif, on
fait monter le condensateur et l’on ouvre le diaphragme complétement. On fait
descendre doucement le spécimen avec la vis macrométrique jusqu’à voir une
image floue que l’on règle avec la vis micrométrique.
Si on observe les trophozoïtes au cours de notre lecture à l’objectif 100X, on calcule la densité
parasitaire du patient dans le cas où la NFS a été réalisée, Sa formule est la suivante :
Nombre de trophozoites comptés × Nombre de leucocytesréalisés sur NFS

Densité parasitaire=
Nombre de leucocytes comptés sur≥¿ ¿
41
Dans le cas où la NFS du patient n’a été réalisée, on prendra le taux de leucocytes
normalement retrouvé chez un homme et ce taux est de 8000 Globules blancs. Ainsi la
formule sera la suivante ;
Nombre de trophozoites comptés × 8000Globules blancs

Densité parasitaire=
Nombre de leucocytes comptés
La numérotation de la densité parasitaire est de parasites par µl de sang.
Le comptage des parasites et des leucocytes commence dès qu’on observe un parasite, alors
on compte les parasites de formes asexués lorsque le nombre de parasites comptés est
supérieur ou égale à 100 et après avoir compter près de 200 leucocytes, on arrête le comptage
pour appliquer la formule. Mais si le nombre de parasites comptés est inférieur à 100, on
continue le comptage jusqu’à atteindre 500 leucocytes
Figure 2: Trophozoïte dans une lame de GE

Si les microfilaires sont observées lors de l’état coloré, on passe à la technique de
concentration des microfilaires qui se déroule comme suite :
- On va diluer l’échantillon avec du formol à 2% c’est-à-dire on prend 100 µl de

l’échantillon pour 900 µl de formol à 2% ;
- On fait hémolyser ce mélange pendant 15 à 20 minutes, puis on le passe à la
centrifugeuse pour 3000 tours /10 minutes ;
- Par la suite, on déverse le surnageant et l’on recueille 10 ou 20 µl du culot que
l’on dépose entre lame et lamelle puis on l’installe au microscope pour effectuer
le comptage sous l’objectif 10X ;
- Lors de la lecture, le comptage se fera sur tout l’étalement et on passera ensuite à
la règle de 3 enfin de ramener le comptage à 100 ou 1000 µl.
42
Figure 3: Microfilaires à l'état coloré
Figure 4: Les microfilaires sur dilution au formol

II.1.6.2. La coprologie
L’examen des selles permet de rechercher les KOAH (Kystes ; Œufs ; Amibes et
Helminthes), il se fait en deux étapes qui sont la macroscopique et la microscopique mais
quand même il faudrait savoir comment se passe le prélèvement de cet échantillon.
Les matériaux utilisés sont les suivant :
- Lame ;
- Lamelle ;
- Eau physiologique ;
- La solution de lugol ;
- Les pipettes pasteurs ;
43
- Les anses stériles ;
- Le microscope.
▪ Prélèvement des selles
Les selles sont prélevées dans un contenant propre à ouverture large et si possible, le
couvercle doit être accompagner d’une petite cuillère. Il faut noter que la quantité de selles
dans le pot doit être très petite c’est à dire 20 ou 40 grammes.
Les conditions à respecter pour un bon prélèvement de l’échantillon :
- Eviter de consommer la veille les légumes, les graines d’arachides et même les
aliments dures ;
- Eviter lors du recueillement de mettre la selle au contact des urines, c’est pour ça
qu’on demande de vider complétement sa vessie avant de faire les selles ;
- Eviter que les selles soient également en contact avec le sol et de l’eau.
Enfin d’avoir des résultats fiables, les selles doivent être transmises vers la salle
d’analyse dans les 45 minutes après émission des selles.
▪ Examen macroscopique
Elle consiste à noter les éléments observés sur la selle à l’œil nu, comme élément
observé on a :
- L’aspect des selles : Homogène (lorsque la selle est uniforme) et Hétérogène

(lorsque la selle contient des fibres ou des résidus).
- La consistance de la selle : Molle, semi-liquide, liquide ; diarrhéique, dure,
pâteuse.
- La coloration de la selle : Jaunâtre, verdâtre, marronne, noirâtre (cette coloration
indique le plus souvent la présence des kystes.
On note aussi la présence de sang, de mucus (caractérisé par la présence de rosée au-dessus du
couvercle) et de glaire.
▪ Examen microscopique
Elle passe par l’examen direct qui permet de détecter les parasites, sa méthode se passe
comme suite :
- Après avoir effectuer la macroscopie, mettez à l’aide la pipette pasteur deux

gouttes d’eau physiologique ;
44
- Aide d’une anse stérile, recueillir la selle et la décharger d’abord dans une
première goutte d’eau physiologique puis la seconde goutte ;
- La lecture se fait d’abord à l’objectif 10X pour la mise au point, ensuite on passe
à l’objectif 40X pour la précision des éléments observé.
Mais si ces parasites ne sont pas assez visibles on peut passer à la concentration de lugol
qui permet de mettre en évidence les kystes de protozoaires, spécialement les amibes et aussi
les inclusions de chlamydiae dans les cellules épithéliales.
Le mode opératoire de la coloration au Lugol :
- Déposer sur la lame identifiée une goutte de lugol et une goutte d’eau
physiologique ;
- Déposer un petit morceau de selles ou le culot de concentration par une
technique de Kato ou Ritchie dans chaque goutte ;
- Mélanger la préparation et la recouvrir de lamelle en évitant la formation de trop
de bulles d’air ;
- Observer la préparation au microscope sur l’objectif 40X : la membrane des
kystes et aussi leurs noyaux sont colorés en jaune-brun.
En dehors des kystes ; des levures et autres, on observe aussi des éléments non
parasitaires mais les plus observés sont les cristaux d’oxalate de de calcium qui ont une forme
de petites enveloppes et les cristaux de charcot leyden ayant la forme d’éclat.
Figure 5: Forme végétative d'Entamoeba histolytica
II.1.6.3. Le spermogramme/le spermocytogramme
45
Il s’agit de deux examens d’analyses médicales permettant d’évaluer la fertilité
masculine. En ce qui concerne le spermogramme, il consiste d’évaluer les paramètres
constituants le sperme et pour le spermocytogramme, il correspond à faire une analyse
cytologique et morphologique des spermatozoïdes.
- Lame ;
- Lamelle ;
- La cellule de malassez ;
- Les pipettes pasteur ;
- Le microscope ;
- La solution de formol 2% ;
- Le compteur de cellule.
▪ Les précautions à faire pour un bon prélèvement du spermogramme
- Un délai d’abstinence sexuelle de 3 à 5 jours doit être respecté avant l’analyse
du sperme ;
- Une bonne hydratation dans les jours précédents le recueil du sperme afin de
permettre grâce à des mictions régulières, un lavage naturel des voies par
lesquelles l’éjaculat passe ;
- Si le patient a de la fièvre les jours précédents le recueil du sperme, il faut
reposer le jour de prélèvement du sperme.
▪ Le mode de recueil du sperme
Il se fait par masturbation dans un pot stérile après avoir uriné et fait sa toilette intime.
Le prélèvement se fait au sein du laboratoire de préférence.
▪ Spermogramme
Les paramètres entrant dans l’étude physico-chimique sont :
- La couleur du sperme qui peut être soit transparente ; soit blanchâtre ou même
jaunâtre ;
- La présence ou non de la viscosité du sperme ;
- Le volume de l’éjaculat dont la valeur normale est de 2 ml ;
- Le PH est également recherché dont la valeur normale se situe entre 7,2 à 8 ;
- On note également la présence de sang ou de pus.
46
Les paramètres évalués au cours de l’étude dynamique sont :
- La vitalité des spermatozoïdes exprimée en pourcentage ;

- La mobilité du sperme exprimée en pourcentage, l’évaluation de la mobilité se
fait après une heure d’éjaculation, après quatre heures après l’éjaculation et si
possible après vingt-quatre heures.
Au cours de l’étude dynamique, on fait le comptage des spermatozoïdes à mobilité

rapide, à mobilité lente, ayant une mobilité surplace et ceux étant immobiles.
L’étude dynamique se fait à l’état frais à l’objectif 40x après avoir étaler une petite
quantité de sperme entre lame et lamelle. Pour le comptage, on fait la lecture dans 1 cadran ou
champ si la quantité de spermatozoïdes est importante mais si ceci n’est pas le cas, on fait la
lecture sur 4 cadrans ou champs si l’on souhaite augmenter le nombre des spermatozoïdes
mobiles.
▪ Spermocytogramme
Cette étape se subdivise en deux études qui vont permettre d’évaluer la morphologie des
spermatozoïdes et le pourcentage des formes atypiques (formes anormales). Le matériel
utilisé pour ces études est : la cellule de Malassez où le comptage des spermatozoïdes
normaux et anormaux, et aussi des cellules non spermatiques.
Au niveau de l’étude cytologique, on répertorie :
- La numérotation des spermatozoïdes normaux et anormaux ;

- La présence d’agglutinats spontanés (la présence d’agglutinats est détecté quand
les têtes ou les queues sont collés) ;
- La présence des agrégats (lorsqu’une masse qui empêche les spermatozoïdes de
migrer) ;
- Les cellules rondes (ceux sont des spermatozoïdes qui ne sont pas encore
matures)
Si des anomalies sont observées, ils sont très rapidement pris en compte tels que :
- Anomalies de la tête (tête allongée ou effilée ; macrocéphales ; microcéphales ;

les têtes multiples et la présence ou non de l’acrosome) ;
- Anomalies de la pièce intermédiaire (reste cytoplasmique ; grêle ; angulation) ;
- Anomalies du flagelle (Absent ; court ; enroulé ; calibre irrégulier ; multiple).
47
Dans le but de numéroter les spermatozoïdes au cours de notre lecture microscopique, on
utilise la cellule de Malassez qui est une cellule composée de 10 bandes horizontales, de 10
bandes verticales et de 100 rectangles par bandes qu’elle soit verticale ou horizontale. Pour le
comptage, on peut soit effectuer la numérotation comme suite :
- Dans 2 ou 5 bandes qu’elles soient quadrillées ou non ; ensuite on effectue la

moyenne par bandes qu’on va multiplier par 10 (qui correspond au nombre de
bandes totales) et par le facteur de dilution s’il a été utilisé pour effectuer la
lecture.
Nombre de spermatozoides comptés ×10×le facteur de dilution

Moyenne=
Nombre de bande utilisées pour≤comptage
- Si le comptage s’effectue au maximum dans 5 rectangles, la formule utilisée est

la suivante :
Nombre de spermatozoides comptés

Moyenne= ×100×le facteur de
Nombre de rectangleutilisées pour ≤comptage
dilution
Le comptage dans les rectangles se fait si on a une forte densité de spermatozoïdes.
NB : L’étude cytologique du sperme, il est conseillé d’utiliser une solution de dilution qui est
le formol 2% dans le cas où l’échantillon a une forte densité mais dans le cas contraire, la
lecture au microscope peut se faire sans solution de dilution.
▪ Interprétation des analyses du spermogramme
Tableau 5: Les paramètres interprétés lors d'un spermogramme
Valeurs
Paramètres normales Valeurs anormales Pathologies
(selon l’OMS)
0 ml Aspermie
Volume à l’éjaculat ≥ 2ml < 2 ml Hypospermie
>6 ml Hyperspermie
PH 7,2 à 8 - -
48
0/ml Azoospermie
<1 million/ml Cryptozoospermie
Numérotation des ≥ 20
<5 millions /ml Oligozoospermie sévère
spermatozoïdes millions /ml
<20 millions/ml Oligozoospermie
>250 millions/ml Polyzoospermie
≥ 50% de
Mobilité à 1 heure mobilité < 50% Asthénozoospermie
progressive
Vitalité à 1 heure ≥ 75% < 30% Nécrozoospermie
Formes typiques ≥ 30% < 30% Tératozoospermie
Leucocytes < 1 millions/ml ≥ 1 million/ml Leucospermie
< 500
Cellules rondes - -
millions/ml
Agglutinats Absence - -
Présence de sang
Hémospermie
Présence de pus
Pyospermie
Autres -
Association Oligo-
Asthéno-
OATS
Tératozoospermie
II.1.6.4. Les rôles des réactifs utilisés en parasitologie
Plusieurs réactifs sont utilisés au niveau de l’unité de parasitologie, tels que :
49
Tableau 6: Les rôles des différents utilisés en parasitologie
Réactifs Rôles
Permet de voir les œufs ; les larves ; les

Eau physiologique formes kystiques et les formes végétatives
des protozoaires
Permet de colorer la membrane et les

Lugol noyaux des kystes. Il permet également de
fixer les parasites.
Permet de colorier les cellules sanguines des

Giemsa
tissus hématopoietiques.
II.1.5. L’unité de bactériologie
Cette unité a pour mission de prendre en charge les échantillons biologiques dans le but
de diagnostiquer, de dépister d’une infection d’origine bactérienne. Cette paillasse permet
également de suivre l’efficacité d’un traitement antibiotique ou antifongique.
Cette paillasse est sous la responsabilité de trois membres du personnel :
- Mr. MENGUE Emmanuel, chef d’unité ;

- Mr. BANYAKWE Jean-P ;
- Mr. KENTSOP NGOULA M.
Cette paillasse est subdivisée en 06 postes dont :
- L’enregistrement où l’on inscrit dans les différents registres les codes, les
noms, les prénoms et les analyses à réaliser. Après cette étape d’enregistrement,
on établit des feuilles de paillasse pour chaque analyse.
- La microscopie où l’on effectue la cytologie des échantillons à l’exemple des
urines, des liquides de ponction et des prélèvements gynécologiques (PCV, PU).
Les éléments observés lors de la cytologie que se soient dans l’état frais ou
coloré sont transcrits sur la feuille de paillasse.
- L’ensemencement sur lequel on fait un étalement d’un échantillon biologique
dans un milieu nutritif en vue d’obtenir une culture bactérienne. Sur ce poste, on
50
réalise aussi les frottis de certains échantillons à l’exemple des échantillons de
PCV, de PU, de liquide de ponction et même de coproculture.
- L’incubateur où se réalise la croissance bactérienne que ça soit dans les boites
de pétri ou dans les galeries d’antibiotique au cours de 18 ou 24 heures
d’incubation à température ambiante.
- La coloration où l’on fait des différents types de coloration à l’exemple de celle
de Gram, de Giemsa et de KINYOUN. Pour certains échantillons, les types de
coloration à réaliser se font selon la demande du clinicien à l’exemple du liquide
céphalo-rachidien où l’on peut faire seulement la coloration de Giemsa ou celle
de Gram ou même les deux à la fois.
- Le poste d’antibiogramme ou d’antifongique, l’unité de bactériologique
utilise un automate nommé « Vitek 2 compact » où l’identification se fait par
colorimètrie avancée, ce qui permet d’avoir les résultats le plus rapidement
possible et de façon améliorer.
- Le poste de dépôt des échantillons ; où les échantillons sont déposés après
lecture cytologique ou après ensemencement dans les bacs qui leurs sont
réservés.
- Le BactAlert est un système automatisé de détection microbienne qui sert à
tester la présence des microorganismes dans le sang prélevé chez un patient
suspecté de bactériémie ou de fongémie. Ce système et ces flacons sont associés
aux milieux de culture offrant des conditions nutritionnelles et
environnementales adaptés aux germes habituellement rencontrés en cas
d’infection du sang.
L’équipement utilisée sur cette paillasse :
- Les lames et lamelles ;

- L’eau physiologique ;
- Le bec de bunsen ;
- Les anses à usage unique ;
- La cellule de malassez
- Deux microscopes ;
- Les différents colorants (le Giemsa, la coloration de Gram ; le Lugol, l’encre de
chine et le Kinyoun) ;
- Les micropipettes de 200 µl et de 1000 µl ;
51
- Les pipettes pasteur ;
- La bouteille de gaz ;
- Les milieux de culture ;
- Deux incubateurs dont un destiné pour les boites de pétri et l’autre pour les
hémocultures qui ne sont pas destinées pour le BactAlert ;
- Le réfrigérateur ;
- L’autoclave ;
- La centrifugeuse.
II.1.7.1. Les différents types de prélèvements reçus dans l’unité
Plusieurs types d’échantillons sont reçus au sein de l’unité, ces derniers doivent
répondre à certains critères
a.) Prélèvements génitaux
Ces prélèvements doivent être réaliser si possible avant la prise d’antibiotique
▪ Prélèvement vaginal et d’endocol

- Au niveau du vagin, on recherche d’un déséquilibre de la flore vaginal (vaginose
bactérienne), d’une vaginite (Trichomonas vaginalis par exemple), d’une
mycose. Prélever au niveau du cul de sac postérieur.
- Au niveau du col de l’utérus, le prélèvement consiste à rechercher de Chlamydia
trachomatis, de Neisseria gonorrhoeae et des mycoplasmes urogénitaux. Cette
recherche se fait dans les cellules épithéliales où les germes se fixent.
NB : Avant de faire le prélèvement, veiller à demander la date des dernières règles, des
derniers rapports sexuels et aussi lui demander comment la patiente à effectuer sa toilette
intime.
▪ Prélèvement urétral
Il doit être réaliser au moins une heure après la dernière miction et toujours avant le
premier jet d’urines. Ce type de prélèvement est indiqué pour les analyses de mycoplasmes et
des infections urétrales chez l’homme. Alors à l’aide d’un écouvillon, faire un grattage de
l’urètre.
▪ Premier jet d’urines pour PCR Chlamydia trachomatis
52
Ce type de prélèvement est réalisé chez l’homme et pour cela le patient ne doit pas
uriner pendant au moins une heure avant le prélèvement. Les urines sont recueillies dans
un pot stérile.
b.) Examen cytobactériologique des urines
Cette analyse est le plus demandée de cette unité, il s’agit d’un examen microscopique
des urines, ce type de test consiste à rechercher la présence d’éventuelle hématies, leucocytes,
de cristaux et même des parasites urinaires. L'ECBU est couramment utilisée pour
diagnostiquer une infection urinaire, une maladie inflammatoire de la vessie (cystite
interstitielle), une bactériurie asymptomatique ou une hématurie microscopique.
▪ Le mode de prélèvement
Il varie en fonction de l’âge du patient.
- Chez l’adulte et l’enfant, le prélèvement demandé est celui du milieu du jet afin
d’éliminer les bactéries de la flore commensale de l’urètre antérieur (donc
éliminer le premier jet d’urines), on utilise un pot stérile pour cet examen.
- Chez le nourrisson et le jeune enfant, on utilise un collecteur d’urines ou une
poche plastique stérile adhésive. Alors dès que les urines sont dans la poche,
transférer les dans une poche stérile.
- Chez le porteur de sonde urinaire, veiller à bien désinfecter la zone où le
prélèvement s’effectuera avec de la bétadine jaune et rouge. Avec la seringue,
recueillir les dans le tuyau et après les urines contenues dans la seringue seront
transférer dans le pot.
NB : Chez la femme, les urines doivent être recueillies en dehors de période des
menstrues.
c.) La coproculture
Il s’agit d’une méthode de recherche de parasites et de bactéries entériques pathogènes

dans les selles. L’échantillon de selles est recueilli dans un pot stérile accompagné de
spatule sur le bouchon rouge.
▪ Les conditions de prélèvement

- Recueillir les selles dès émission dans un récipient propre.
53
- Prélever l’équivalent d’une noisette de selles (portion muco-purulente ou
sanglante lorsqu’il en existe) à l’aide d’une spatule ou d’un flacon-cuillère puis
transférer cet aliquote dans un pot stérile.
▪ Transport et conservation
Après prélèvement, l’échantillon doit être immédiatement acheminé au laboratoire afin

d’éviter la dessiccation ou la prolifération des germes commensales.
▪ Les bactéries enteropathogènes
Les bactéries recherchées sont :
- Les Salmonella.sp et les Shigella.sp ; sont recherchés dans les conditions

aérobiques à une température de 35-37°c pendant 18 à42 heures ;
- Les Campylobacter.sp et les Yersinia sont également recherchés mais dans les
conditions microaérophilies.
d.) Hémoculture
Le diagnostic des bactériémies repose sur une mise en culture des bactéries
éventuellement présente dans le sang, appelée hémoculture. En règle générale, une
hémoculture correspond à une paire de flacons : un flacon aérobie (Bouchon vert) et un flacon
anaérobie (Bouchon orange).
▪ Les conditions de prescription
Une hémoculture est prescrite en cas de :
- Présence des signes de sepsis (hyperthermie > 38.5°, hypothermie < 36.5°, ·
frissons…) ;
- Suspicion d’endocardite infectieuse (fièvre, souffle au cœur.) ;
- Existence d’une fièvre inexpliquée chez une femme enceinte, un nouveau-né ou
un patient immunodéprimé ;
- Les patients à risque (aplasie par exemple).
NB : la recherche du foyer infectieux primaire et de la porte d’entrée est primordiale pour

arrêter l’infection. En conséquence, il faut analyser des prélèvements de plusieurs sites (urine,
sécrétions bronchopulmonaires,) et enlever et analyser les matériels étrangers.
▪ Le mode de prélèvement
54
L’échantillon est prélevé soit par ponction veineux, soit sur cathéter et dès que ce
dernier est recueilli, il doit être rapidement transmit notamment moins de quinze minutes au
laboratoire pour être mis soit dans le bactAlert, soit l’incubateur.
e.) La spermoculture
Cet examen consiste à rechercher la présence de germes pathogènes dans le sperme mettant
en évidence une infection génitale qui est parfois responsable d’une infertilité masculine. Pour
avoir des résultats fiables, il faut bien respecter les recommandations du personnel.
▪ Recommandations à respecter
Il faut suivre une période d’abstinence de 3 à 7 jours, boire beaucoup d’eau la veille du
prélèvement (au moins 2 litres).
▪ Mode de prélèvement
Le prélèvement se fait au sein du laboratoire par masturbation, mais avant ça le patient

doit uriner pour vider sa vessie, ensuite réaliser une toilette intime et se laver les mains avec
précaution.
f.) Les autres échantillons reçus par l’unité de bactériologique
Plusieurs autres échantillons sont recueillis au sein de cette paillasse, il s’agit

notamment des liquides de ponctions (liquide céphalo-rachidien, liquide d’ascite, liquide
articulaire, liquide bronchopulmonaire et liquide pleurale), les échantillons de plaie et de pus.
Ces derniers sont prélevés au niveau des services appropriés soit à l’aide d’un
écouvillon pour les plaies et les pus, les liquides de ponction quant à eux sont recueillis dans
des pots stériles.
II.1.7.2. Les milieux de culture
Au laboratoire de microbiologie, plusieurs milieux de cultures sont rencontrés et l’usage

de chaque gélose est destiné à une recherche spécifique de bactéries ou de levures.
a.) Les milieux enrichis
Ce sont des milieux de culture à utilisation générale auxquels on ajoute des nutriments
spéciaux afin de favoriser le développement d’organismes fastidieux.
▪ Le milieu au sang frais
55
C’est une gélose qui permet de mettre en évidence le pouvoir hémolytique de certaines
bactéries à l’exemple des Streptococcus.sp et de Neisseria méningitidis, ceci est due à la
présence de lecithinase.
Certaines caractéristiques de ce milieu sont très favorables à la croissance des

streptocoques telles que la neutralisation de certains inhibiteurs contenus dans les peptones,
les activités peroxydase et catalase
Bien que cette gélose soit préconisée pour la croissance des streptocoques, elle convient
également à la pousse d’autres Gram positifs à l’exemple des staphylocoques.
Les trois types d’hémolyse sont observées dont :
- Streptoccus à Hémolyse α, il s’agit d’une hémolyse partielle avec une

dégradation incompléte de l’hémoglobine, les colonies ont des bords verdâtres.
Comme germe ayant cette caractéristique, « Streptococcus.pneumoniae».
- Streptococcus à Hémolyse β, il s’agit d’une hémolyse totale qui est due à une
digestion entière de l’hémoglobine, les colonies forment une auréole ayant une
coloration jaune clair. Comme exemple de germe : Streptococcus agalactiae.
NB : Cette beta hémolysine est causée par deux hémolysines dont « O » (inactif la
présence d’oxygène) et « S » (cytotoxine stable à l’oxygène).
- Streptococcus à hémolyse gamma ou non hémolytique, il s’agit des

streptocoques des voies buccaux, leurs colonies ne présentent pas d’auréoles.
▪ Milieu sang cuit ou chocolat
C’est une gélose moins riche que le précédent, d’où l’ajout de compléments poly
vitaminique. Ce milieu est différent du milieu au sang frais car le chauffage lent à 80°c va
lyser les hématies, ceci va donner une coloration marrone d’où le nom « chocolat ».
Cette gélose est favorable à la croissance des bactéries respiratoires exigeantes comme
les Neisseriae.sp, l’Haemophilus.influenzae, etc…Toutes ces bactéries ont besoin de facteurs
de croissance tels que l’hémine (précurseur de coenzyme), NAD (transporteur d’électron des
cytochromes) se trouvant à l’intérieur des globules rouges.
 Les additifs de la gélose chocolat

 Le polyvitex est un supplément de croissance permettant la pousse de tous
germes mêmes des plus exigeantes. À l’exemple de l’Haemophilus.influenzae.
56
 La VCN (Vancomycine, colistine et Nystatine), cet ajout rend le milieu sang
cuit sélectif car les antibiotiques et antifongiques auront un rôle spécifique.
La vancomycine inhibe la pousse des « Cocci Gram positifs », la colistine inhibe
la pousse des « bacilles Gram négatives » et la nystatine inhibe celle des
« levures ».
Cet ajout permet notamment la croissance des Cocci Gram négatifs notamment
« Neisseria.gonorrhea et Neisseria meningitidis » au bout de 48h.
57
▪ Le milieu CLED (Cystine Lactose Electrolyte Déficience)
Il s’agit d’une gélose enrichie en cystine, en lactose mais pauvre en ions, permettant la
croissance des germes présents dans le tractus urinaire. Bien qu’elle permette la croissance
des germes non exigeantes, cette gélose est très favorable à la pousse des entérobactéries.
La faible teneur en électrolyte limite l’envahissement excessif des espèces de Proteus

sur le milieu sous forme de nappage. La présence du lactose permet de révéler le caractère
lactose des bactéries et la présence de la cystine permet la croissance des colonies coliformes
« colonie naine ».
Toutes les bactéries consommant le lactose, leurs colonies ont une coloration jaune
indiquant par ailleurs l’acidification du milieu. Par fermentation du lactose Et les colonies
bleues ou vertes, indiquent la non acidification du milieu.
b.) Les milieux sélectifs
Ce sont des milieux contenant de molécules inhibant la croissance de certains

microorganismes tout en favorisant la croissance d’autres isolats. Dans l’unité de
bactériologie de l’HGD, on rencontre plusieurs milieux sélectifs tels que :
▪ Milieu CHAPMAN
C’est une gélose sélective et différentielle hypersalé favorisant le développement des

bactéries halophiles. Elle est notamment utilisée pour la culture et l’isolement des
staphylococcaceae.
La sélectivité de ce milieu est due à sa forte concentration en NaCl qui inhibe la pousse
de Bacilles Gram négatifs et de ceux Gram positifs. Et la différentiation provient de la
capacité à fermenter ou non « le mannitol », la fermentation en mannitol donne une coloration
jaune au milieu cela est due à l’acidification du milieu.
▪ Milieu EMB (Eosine-methylene-blue)
C’est une gélose sélective et différentielle qui permet l’isolement et l’identification des
Bacilles Gram négatifs. Elle est constituée de deux colorants dont l’Eosine et le bleu de
méthylène qui inhibent la croissance d’autres germes.
58
Ce milieu est composé de lactose qui en cas de fermentation acidifie le milieu, et dans
ces conditions acides, les colorants produisent une coloration violette sur les colonies à
l’exemple des colonies de Klebsiella.sp, de Pseudomonas.sp, etc… Seules les colonies d’E.
coli sont spécifiques avec un violet foncé, avec des reflets métalliques en dos de scarabée.
▪ Milieu Sabouraud +Chloramphénicol
C’est une gélose rendue sélective par l’ajout du chloramphénicol qui un antibiotique à
large spectre inhibant la croissance des Cocci Gram positifs, des bacilles Gram positives et
négatives. Cet ajout est alors très favorable à la pousse des levures.
▪ Milieu HEKTOEN
C’est une gélose sélectif utilisé pour l’isolement des bacilles Gram négatives non
exigeantes. Sa sélectivité est due à la présence de desoxycholate de sodium inhibant la
croissance des bacilles Gram positives, ce qui la rend spécifique à la croissance des
Salmonella.sp et des Shigella.sp.
Trois glucides présents dans ce milieu dont lactose, saccharose et salicine, rendent ce
milieu très discriminant. En cas de culture bactérienne, les colonies se présentent comme
suite :
- Colonies jaunes ou orangés prouvant l’acidification du milieu suite à la

fermentation d’au moins un des glucides présents dans le milieu.
- Colonies vertes signifiant la non fermentation des glucides et l’acidification du
milieu. Et ce sont ces colonies qui nous intéressent lors de l’interprétation, car
elles sont indicatrices de salmonelle (colonies vertes à centre noir) et de shigella
(Colonies vertes sans centre).
▪ Bouillon sélénite
C’est un milieu enrichissement sélectif pour l’isolement de Salmonella.spp, les

composants de ce milieu inhibent la pousse des Bacilles Gram négatives et positives.
II.1.7.2. Cheminement des échantillons au sein de l’unité
Il faut d’abord savoir que la plupart des échantillons bactériologiques prennent trois
jours d’analyses car lors de cette période, on a l’étape cytologique, d’interprétation et
d’antibiogramme en cas de colonies indiquant un germe pathologique.
Chaque
59
60
a.) La cytologie des échantillons
Cette étape comprend deux sous étapes importantes dont :
▪ La macroscopie des échantillons
Elle permet de noter :
- Pour les échantillons de PCV, on note l’odeur, la texture, la couleur des

sécrétions et pour le PU on note la présence ou non d’écoulement.
- Pour les urines, on note la turbidité, la couleur qui est soit jaune, soit hématique,
soit pâle.
- Pour Les selles, on note la consistance, la couleur, l’aspect et même la présence
de mucus, de sang et de glaire.
- Pour le LCR, on note également la turbidité et la couleur soit clair « eau de
roche », trouble « eau de riz », soit xanthochromique en cas de présence d’une
couleur.
▪ La microscopie des échantillons
Dans cette étape, nous avons de sous étapes dont :
 L’état frais qui permet de noter de la présence d’une flore bactérienne et des éléments
importants tels que les hématies, les leucocytes, levures et les cellules épithéliales.
Dans les urines, d’autres éléments sont aussi notés il s’agit des cylindres ou des
cristaux.
NB : Deux méthodes cytologiques sont utilisées dont la méthode semi-quantitative (lame

et lamelle) destinée pour les PCV et PU. La méthode quantitative (cellule de malassez) est
destinée pour les liquides de ponction et les urines
 L’état coloré, on réalise un frottis avant de faire la coloration Plusieurs types

méthodes de coloration sont utilisées dont :
- Coloration de Gram permet de différencier les bactéries selon deux critères
principaux : la forme (lancettes, chaines, paires ; etc…) et l’affinité pour les
colorants ((Gram négatifs qui ont une fine couche de peptidoglycane et un taux
élevé de lipides) et (Gram positifs qui ont une couche épaisse de
peptidoglycane)).
61
- Coloration de Giemsa permet de réaliser la formule leucocytaire sur les
différents épanchements en révélant la présence des cellules sanguines dans le
frottis effectué. La formule leucocytaire permet d’apprécier notamment les
mononucléaires, les polynucléaires et les lymphocytes.
- La coloration à l’encre de chine est appliquée sur le LCR, elle permet de
visualiser les capsules des germes. Cette coloration ne pénètre pas les cellules
mais forme un fond contrasté, les capsules entourant les germes apparaissent
comme un halo-lumineux grâce à la réflexion de la lumière.
- La coloration de KINYOUN est une modification de celle de ZIEHL-
NIELSEN mais contrairement à cette dernière, elle se réalise à froid. Son but est
de différencier les BAAR et des bacilles non acido-résistantes.
b.) L’ensemencement
Les différents échantillons reçus sont ensemencés dans des milieux spécifiques dont :
Gélose utilisé Echantillon destiné
Gélose sang cuit +chocolat PCV, PU, Hémoculture, Spermoculture,

Les liquides de ponction, Bout de
cathéter, de stérilet
Gélose sang cuit+VCN PCV PU, spermoculture, LCR
Gélose sang frais Liquide bronchique, LCR, PCV chez la

femme enceinte de plus de 7 mois
Sabouraud + Chloramphénicol PCV, PU, spermoculture, LCR (si

présence de levures) et le bout de sonde
urinaire
CLED ECBU, Sonde urinaire
CHAPMAN PU, pus, plaie, hémoculture, sperme,

bout de cathéter et de stérilet
EMB Hémoculture, urine, pus, plaie, bout de
62
cathéter, de drain et de stérilet
HEKTOEN Fèces
Bouillon sélénite Fèces
NB : Pour les fèces l’ensemencement est réalisé trois fois c’est-à-dire le premier jour,
on fait des ensemencements sur la gélose HEKTOEN et le bouillon Sélénite et ensuite le jour
suivant, on fait repiquage du bouillon sélénite dans une nouvelle gélose HEKTOEN, en vue
d’isoler les salmonelles.
c.) Interprétation des boites pétri
Après la période d’incubation de 18 à 24 heures à 37°c dans un incubateur approprié, on le

retire de ce dernier pour passer à l’interprétation des échantillons ensemencés la veille.
Figure 6: Klebsiella sur CLED
Figure 7: Escherichia.coli sur EMB
63
Figure 8: Salmonella sur HEKTOEN
Figure 9: Pseudomonas sur EMB
d.) Antibiogramme
Cette étape en bactériologie consiste ou sert à déterminer la sensibilité ou la résistance

des germes vis-à-vis d’un ou de plusieurs antibiotiques ou antifongiques. Au niveau de cette
unité, on utilise deux méthodes dont :
▪ Les galeries d’ATB
Deux types de galeries d’ATB sont uttilisés dont :
- ATB UR destinée aux germes uropathogènes, enfin de mettre en évidence la

sensibilité ou résistance aux antibiotiques ;
- ATB G- destinée aux entérobactéries révélées sur la gélose EMB, les actions de
cette galerie est la même que la précédente.
▪ Le Vitek 2 compact
Il s’agit d’un système automatisé dont le principe est le remplissage par chambre à
vide qui assure l’inoculation des cartes. Chaque carte possède 64 cupules pour plus de tests et
de précision, elle est aussi munie d’un code barre unique pour assurer la sécurité du test et la
traçabilité totale.
64
De nombreux types de cartes sont utilisées par l’automate, cette variété de cartes
correspond à certains types de germes. Alors comme type de cartes, on a :
- AST 2 GN, pour les BGN

- AST 2 GP, pour le BGP
- AST YST, pour les levures
- AST N233, pour les BGN non fermentaires
- AST N240, BGN fermentaires
- AST XN12, les bactéries multirésistants.
▪ L’appareillage d’antibiogramme
Pour réaliser l’antibiogramme, il faut :
- Les tubes d’hémolyse ;

- Les micropipettes de 200 et de 1000 µl ;
- Le densitomètre ;
- Les anses ;
- Les ATB médium ;
- Le support Vitek ;
- La solution d’eau saline.
- Les cassettes Vitek
▪ Procédure d’antibiogramme
La procédure e déroule comme suite :
 Préparation de la suspension bactérienne

- Prendre les tubes à hémolyse et les stériliser sur le feu du bec de bunsen ;
- Pipetter 3000 µl de la solution d’eau saline dans les tubes nécessaire pour
l’antibiogramme ;
- Mesurer la densité de cette solution sur le densitomètre, cette valeur doit être
égale à 0,00 McFarland ;
- Recueillir dans les boites de pétri des colonies de préférence isolées que l’n met
dans les tubes à hémolyse ;
- Laisse les colonies se dissoudre dans le tube avant d’homogénéiser à l’aide
d’une anse la solution afin d’observer la turbidité.
- Après homogénéisation, on mesure la densité des tubes. Cette densité varie en
fonction du germe, du type d’ATB à utiliser. Pour la galerie, la valeur fixée est
65
de 0,50 à 0,52 McF ; pour les cartes Vitek, la valeur fixée est de 0,50 à 0,63 et en
ce qui concerne les levures, la valeur indiquée pour le Vitek est de 02 McF.
 Les étapes pré antibiogramme
- Pour les galeries, quand la valeur recommandée est respectée alors on recueille
10 µl à l’aide d’une anse qu’on introduit dans l’ATB médium. Puis on pipete
135 µl de l’ATB médium que l’on mettra dans chaque puit de la galerie qu’on va
par la suite recouvrir d’un couvercle avant de le mettre dans l’incubation.
- Pour le Vitek lorsque la densité entre dans l’intervalle fixée, on veille à
enregistrer le code du patient au niveau de l’automate. Mais avant de mettre la
cassette, on pipete soit 180 µl pour les GN ou 240µl pour les GP.dans le tube
d’hémolyse primaire que l’on mettra dans le second tube où la cassette sera
mise.
NB : Pour le Vitek après avoir pris le volume requis dans le tube primaire,
homogénéiser ce dernier dans le second tube avant de le rejeter.
Les milieux utilisés pour la réalisation de l’antibiogramme ou antifongique sont

Sabouraud, CHAPMAN, CLED et EMB. Les résultats de cet antibiogramme seront observés
le lendemain.
e.) Antigène soluble
C’est un examen destiné à la détection des antigènes spécifiques d’une espèce

bactérienne présents dans le liquide céphalo-rachidien. Le kit utilisé pour ce test est
celui du réactif de Wellcogen, ce dernier offre une série de latex rapides destinés à la
détection qualitative des Antigènes des Streptocoques du groupe B, de l’Haemophilus
influenzae, de Streptococcus pneumoniae (pneumocoques), et de Neisseria meningitidis
(méningocoques) des groupe A, C, W135 et d’E. Coli.
▪ Le principe de ce test
Le réactif utilise les particules de latex sensibilisées avec les anticorps spécifiques des
antigènes solubles. Ces particules de latex s’agglutinent en présence d’une quantité suffisante
d’antigène homologue.
▪ La procédure du test
Cette procédure s’applique quand la cytologie du LCR montre des leucocytes ≥10E4 et
aussi lorsque son échantillon présente une turbidité. Alors la procédure est la suivante :
66
- Centrifuger le spécimen dans un tube à hémolyse à 2500 tours/min pendant 10
minutes ;
- Recueillir le surnageant de ce tube à hémolyse pour le mettre dans un second
tube à hémolyse ;
- Chauffer le surnageant dans une marmite chauffante à 100°c pendant 5 minutes ;
- Retirer le tube de la marmite chauffant et laisser le à température ambiante, puis
recentrifuger le pour 5 minutes à 2000 tours/min ;
- Pipeter une goutte de ce surnageant qu’on met dans les cercles de la plaque sauf
dans celui du contrôle ;
- Ajouter ensuite la goutte de chaque réactif correspondant à la bactérie
recherchée par l’antigène soluble, que l’on mélange avec un bâtonnet ;
- Tourner pendant 2 minutes dans le but de rechercher les agglutinations dans les
cercles, si l’un des cercles présentent des agglutinations on passe au contrôle en
mettant une goutte de ce dernier puis on ajoute le réactif de la bactérie ayant
agglutiné.
NB : Après agglutination, on prépare directement l’antibiogramme à partir de

l’échantillon car le LCR est un liquide totalement stérile protégé par la barrière
hématopoïétique.
- Dans le cas où il n y’a pas agglutination, on dit que le test est négatif
f.) Mycoplasme
En dehors des examens des selles, urines et prélèvement génitaux (PCV et PU) dont la
détection des germes pathogènes se font dans les milieux de culture, l’examen de mycoplasme
destiné aux examen urogénitaux se fait dans une casquette mettant en évidence deux germes
dont le Mycoplasma.horminis et Ureaplasma.urealyticum qui sont des germes commensaux
des voies génitales. La galerie du MCP est composée de 06 antibiotiques dont :
- Levofloxacine (LVX) ;
- Moxifloxacine (MXF) ;
- Tetracycline (TET) ;
- Erythromycine (ERY) ;
- Telithromycine (TEL) ;
- Clindamycine (CLI).
67
Ces bactéries présentent des résistances naturelles, le germe Uu est naturellement
résistant à la CLI et le germe Mh a pour résistance naturelle ERY et TEL.
Le matériel utilisé pour l’examen :
- La galerie Biomérieux Mycoplasma IST ;

- Les réactifs destinés au test.
▪ La procédure du MCP
La procédure se déroule comme suite :
- Après avoir recueillir les échantillons au niveau du col de l’urètre chez la femme
ou au niveau de l’urètre chez l’homme ;
- Mettre les réactifs sur température ambiante et lorsqu’ils ont pris la température
adéquate ;
- Tremper l’écouvillon dans le milieu de dilution, bien frotter la tige de ce dernier
sur les parois du réactif R1 et laisser la pendant 10 minute à l’intérieur du réactif.
- Après ce laps de temps, transférer le contenu du R1 dans le second flacon (R2)
et vortexer parfaitement ce mélange.
- Pipeter 55 µl de ce mélange que l’on mettra dans tous les puits de la galerie, il
est préférable de commencer par le puit témoin, ensuite de continuer dans les
puits d’identification des germes et ceux des différentes concentrations et finir
par les puits des antibiotiques.
- Ajouter deux gouttes d’huile de paraffine dans chaque puit avant de recouvrir la
galerie puis placer cette dernière dans l’incubateur à 37°c.
La galerie passera deux jours dans l’incubateur parce que la détection du germe Mh
prend plus de temps pour être révéler sur la galerie.
▪ Interprétation de la galerie
Cette galerie a pour but de mettre en évidence l’action métabolique qui alcalinise le milieu et
le fait virer du jaune au rouge phénol (indicateur de pH) en cas de positivité d’un des germes
ou des deux germes, et aussi en cas de résistance aux antibiotiques mais si les puits des
antibiotiques restent jaune, cela veut dire qu’ils sont sensibles.
Si les puits destinés à l’identification des germes restent jaune, cela veut dire que le
germe n’est pas présent dans l’échantillon.
68
NB : Le puit témoin est très important car il confirme la présence d’un ou des mycoplasmes.
Chez l’homme, le Mh n’est pas pathologique, ceci n’est pas le cas chez la femme où l’Uu et le
Mh sont pathologiques.
Figure 10: Kit de mycoplasma
69
CHAPITRE 3. BILAN DE STAGE
III.1. Apport du stage
Durant la période de stage, grâce aux personnels de service m’ayant encadré et prodigué
des conseils techniques contractifs tant dans le domaine professionnel que dans domaine
social et culturel nous avons acquis de nouvelles connaissances telles que :
 Accueil et orientation du patient ;

 Préparation du matériel de prélèvement notamment la maitrise des rôles de
chaque tube ;
 Acquisition d’une nouvelle technique de prélèvement par ponction veineuse dit
« le goutte à goutte » ;
 Maitrise des procédures et techniques utilisés dans nos unités respectives
notamment :
- Bactériologie, nous avons appris comment recevoir, apprécier et traiter les
échantillons. Nous avons appris également comment interpréter les cultures
bactériennes et juger le rendu obtenu.
- Biologie moléculaire, c’était une première pour nous et c’est une unité très
passionnante qui pousse à l’apprentissage sur les différentes techniques utilisées
ainsi que leurs buts.
- Immuno-sérologie où nous avons appris les techniques d’ELISA manuels ;
- Parasitologie a également été une unité passionnante car nous avons appris à
réaliser le spermogramme
 Pratique de l’assurance qualité dans chaque unité du laboratoire
III.2. Difficulté rencontrées
Tout au long de notre stage, nous avons eu à faire face à certaines limites dont :
 La non maitrise de certains examens d’hématologie à l’exemple des tests de

COOMBS direct et indirect, ce qui représentait un blocus au moment des
gardes.
 La forte pression observée au niveau de l’accueil de la part des patients, ce qui
n’est pas toujours facile à gérer.
70
III.3. Recommandations
Cette partie de notre devoir nous permet de mettre en exergue les suggestions faites au
laboratoire de biologique clinique de l’HGD. La seule suggestion sera de renforcer l’accueil
de personnel
71
CONCLUSION
Parvenue au terme de notre travail où il était question de présenter la structure

d’accueil ; les activités effectuées pendant notre séjour au laboratoire de biologie clinique de
l’HGD et de faire à la fin un bilan relatant les difficultés rencontrées, les apports reçus. Il en
ressort que ce stage qui s’est effectué pendant une période de 05 mois, nous a permis de
conforter aux objectifs pédagogiques tels qu’effectuer de manière correcte les analyses
microbiologiques, de connaitre la composition des milieux de culture, des différents colorants
ainsi que les techniques d’identifications des germes . Ce stage nous a également apporté
satisfaction dans la mesure où nous nous sommes imprégnés des réalités du métier qui ont
réveillé des envies d’exercer dans le corps médical.
72

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RÉPUBLIQUE DU CAMEROUN

Rapport de stage académique effectué au sein du

Durée de stage : Du 12 Juillet au 08 décembre 2023

Pr. OKALLA EBONGUE Cécile Pr. ASSOB NGUEDIA JULES

(Encadreur professionnel) (Encadreur Académique)

- Au Doyen de la Faculté de Médecine et des Sciences pharmaceutiques pour les

LISTE DES ABREVIATION ET ANCRONYME...........................................................v

LISTE DES FIGURES.....................................................................................................vi

LISTE DES TABLEAUX...............................................................................................vii

CHAPITRE 1. Présentation de structure d’accueil.........................................................3

I.1. Situation géographique de l’hôpital général de Douala....................................3

I.2. Historique de l’HGD.........................................................................................3

I.3. Organisation de l’HGD.....................................................................................4

I.4. Organisation du laboratoire de l’HGD..............................................................7

CHAPITRE 2. Déroulement du stage.............................................................................9

II.1. Activités menées...............................................................................................9

II.1.1. L’unité d’accueil..........................................................................................9

II.1.2. L’unité de biologie moléculaire.................................................................10

II.1.3. L’unité d’immuno- Sérologie.....................................................................19

II.1.4. L’unité de parasitologie..............................................................................41

II.1.5. L’unité de bactériologie.............................................................................52

CHAPITRE 3. BILAN DE STAGE.............................................................................70

III.1. Apport du stage..............................................................................................70

III.2. Difficulté rencontrées....................................................................................70

ADN : Acide Désoxyribonucléique

AcHCV : Anticorps Hépatite C

AgHbs : Antigène Hépatite B

ARN : Acide Ribonucléique

BAAR : Bacille Acido Alcoolo Résistant

BGN : Bacille Gram Négatif

BGP : Bacille Gram Positif

CLED : Cystine Lactose Electrolyte Deficient

ECBU : Examen Cyto-Bactériologique des Urines

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EMB : Eosine Methylene Blue

HGD : Hopital Général de Douala

LCR : Liquide Céphalo-rachidien

PCV : Prélèvement Cervico-Vaginal

VDRL : Veneral Disease Research Laboratory

VIH : Virus de l’Immunodéfience Humaine

Figure 1: Ordre de prélèvement des tubes......................................................................10

Figure 2: Trophozoïte dans une lame de GE..................................................................44

Figure 3: Microfilaires à l'état coloré.............................................................................45

Figure 4: Les microfilaires sur dilution au formol.........................................................45

Figure 5: Forme végétative d'Entamoeba histolytica.....................................................47

Figure 6: Klebsiella sur CLED.......................................................................................63

Figure 7: Escherichia.coli sur EMB...............................................................................63

Figure 8: Salmonella sur HEKTOEN.............................................................................64

Figure 9: Pseudomonas sur EMB...................................................................................64

Figure 10: Kit de mycoplasma........................................................................................69

Tableau 1: Les services médicaux de l'HGD...................................................................4

Tableau 2: Les marqueurs d'urgence..............................................................................33

Tableau 3: Les analyses hormonales..............................................................................35

Tableau 4: Les analyses tumorales.................................................................................39

Tableau 5: Les paramètres interprétés lors d'un spermogramme...................................50

Tableau 6: Les rôles des différents utilisés en parasitologie..........................................51

Pour une meilleure rentabilité de notre secteur de santé, le MINSANTE s’engage à

I.1. Situation géographique de l’hôpital général de Douala

L'Hôpital Général de Douala est situé dans la région du littoral, le département du