ROYAUME DU MAROC ‫المملكة المغربية‬

Ministère de l’Education Nationale, de la

Formation Professionnelle, de ‫وزارة التربية الوطنية والتكوين المهني‬
l’Enseignement Supérieur et de la ‫والتعليم العالي والبحث العلمي‬
Recherche Scientifique
Université Sidi Mohamed Ben Abdellah ‫جامعة سيدي محمد بن عبد اهلل‬
Faculté des Sciences Dhar El Mahraz – Fès ‫كلية العلوم ظهر المهراز ف اس‬

COURS
DU MODULE DE
MICROBIOLOGIE APPLIQUEE
SVI-S6-
Parcours : Biotechnologie
2019-2020

Pr. IRAQI HOUSSEINI ABDEL ILAH

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 SOMMAIRE

I- INTRODUCTION :1-1-HISTOIRE DE LA MICROBIOLOGIE APPLIQUEE 1-1-1-

l’homme chasseur et la microbiologie1-1-1-L’HOMME CHASSEUR ET LA MICROBIOLOGIE1-1-2-
L’HOMME ELEVEUR ET LA MICROBIOLOGIE 1-1-3- L’HOMME AGRICULTEUR ET LA
MICROBIOLOGIE1-1-4- L’HOMME CHERCHEUR ET LA MICROBIOLOGIE 1-2-DEFINITION1-3-
OBJECTIFS DU MODULE:1-3-1-OBJECTIFS PEDAGOGIQUES13-2- LES OBJECTIFS
PROFESSIONNELS1-3-2-1-- bien connaitre les microorganismes :13-2-2- former des experts en
microbiologie agroalimentaire 1-3-2-3- former des experts en microbiologie environnementale 1-
3-2-4 -former des spécialistes en microbiologie industrielle :1-3-2-5- former des spécialistes en
microbiologie biopharmaceutique1-3-2-5- former des spécialistes en Microbiologie moléculaire
(génétique)

II- TECHNIQUES DE BASE EN MICROBIOLOGIE APPLIQUEE2-1-LE

PRÉLÈVEMENT2-1-1- PRELEVEMENT EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE2-1-1-1-prelevement de l’eau2-1-
1-2-PRELEVEMENT A PARTIR DES CONSERVES 2-1-1-3-Produits en tranche, haché, divisés, plats cuisinés,
etc.2-1-1-4-viandes, produits de charcuterie et poisson entier.2-1-1-5-Produits laitiers et leurs dérivés2-1-
2-PRÉLÈVEMENT EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE2-1-2-1-Prélèvement du sang2-1-3- Prélèvement à partir
du sol2-1-3-1-Sol nu2-1-3-2- Horizons du sol2-1-3-3- Sol hydromorphe (Submergé)2-1-3-4- Rhizosphère2-
2- LA NUMERATION ET LA BIOMASSE DES MICROORGANISMES.2-2-1- les techniques microscopiques2-2-
1-1-2-2-1-2-les colorants utilisés en microscopie à transmission normale Préparation des frottis 2-2-1-3-
L’observation microscopique2-2-1-4-TECHNIQUES MICROSCOPIQUES DE DENOMBREMENT ET DE
BIOMASSE MICROBIENNES2-2-2 -TECHNIQUES CULTURALES DE QUANTIFICATION DES
MICROORGANISMES2-2-2-1- la suspension-dilution et culture2-2-2-2- dénombrement2-2-3- TECHNIQUES
CYTOLOGIQUES QUANTITATIVES DES MICROORGANISMES2-2-3-1- dosage des composés spécifiques2-2-4
LES TECHNIQUES METABOLIQUES DE QUANTIFICATION MICROBIENNE2-2-4-1-respiration productrice de
CO22-2-4-2-activité déshydrogénasique2-2-4-3) Dosage de l’adénosine triphosphate (ATP)2-2-4-4-activité
hydrolytique globale : hydrolyse du fluorescéine diacétate2-3- ISOLEMENT2-4-IDENTIFICATION DES
MICROORGANISMES2-4-1-l’identification des bactéries: 2-4-1-1-la technique classique2-4-1-2 les
techniques rapides: 2-4-2-identification des levures2-4-2-1-Caractères culturaux :milieu Sabouraud.2-4-2-

2
2-Caractères microscoiques:2-4-3-IDENTIFICATION DES MOISISSURES2-4-3-1-CARTE D’IDENTITÉ2-4-3-2-
Quelques milieux d’identification des moisissures2-4-3-3-techniques immunologiques(kits pour tests
cliniques)

III-LES BACTERIES DU SOL : 3-1- EUBACTERIES3-1-1- LES EUBACTERIES

PSEUDOMONODALE 3-1-2-ORDRE DES EUBACTERIALES3-1-3-LES PRINCIPALES FONCTIONS DES
EUBACTERIES DU SOL 3-1-3-1-Photosynthèse 313-2-) Déroulement du cycle de carbone:313-
3)Déroulement du cycle du soufre:313-4- Déroulement du cycle de fer:3135-5-déroulement du cycle
d’azote313-6) Transformation du phosphore:3-1-3-7)Transformation du potassium et du manganèse.313-
8) Humification et déshumification.3-1-3-9) Modification de la composition de l’atmosphère du sol et du
potentiel d’oxydo-réduction.3-1-3-9) genèse et dégradation de la structure3-1-3-10) Interactions
microflore-microflore ; microflore-végétation et microflore-faune. 3-2-CHLAMYDOBACTERIALES3-3-
BEGGIATOALES3-4-MYXOBACTERIALES3-5-LES ACTINOMYCETES3-5-1-caractéristiques3-5-2-Classification

IV-LES CHAMPIGNONS :4-1-GÉNÉRALITÉS: 4-2-LES PRINCIPALES SUBDIVISIONS

DES CHAMPIGNONS4-3-ETAT DES CHAMPIGNONS DANS LE SOL4-4- COLONISATION DES SOLS PAR
LES CHAMPIGNONS4-5- REPARTITION DES CHAMPIGNONS DANS LES SOLS4-5-1-Oomycètes: 4-5-
2-Zygomycètes:
4-6-LES LEVURES4-6-1- GENERALITES ;4-6-2 -CLASSIFICATION4-6-7-REPARTITION DES LEVURES
DANS LES SOLS(exemple)

V- LES ALGUES :5-1- GENERALITES5-2 -REPARTITION DES ALGUES DANS LES SOLS5-3-
ROLE DES ALGUES DANS LES SOLS

VI- LES PROTOZOAIRES : 6-1 -GENERALITES6-2-CLASSIFICATION DES PROTOZOAIRES

TELLURIQUES6-3 -REPARTITION DANS LES SOLS6-4-ROLE DES PROTOZOAIRES DANS LE SOL

VII-LES VIRUS :7-1- GENERALITES7-2 -LES VIRUS DU SOL

VIII- SEQUENCES MICROBIOLOGIQUES DES SOLS :8-1-Exemple :séquences
fongiques des feuilles mortes en dégradation8-2- PARAMETRES REGISSANT LES SEQUENCES
MICROBIOLOGIQUES8-2-1- Caractéristiques physico-chimiques de la source trophique.8-3- MECANISMES
REGISSANT LES SEQUENCES MICROBIENNES8-3-1- interactions: synergisme, antagonisme

I- INTRODUCTION

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1-1-HISTOIRE DE LA MICROBIOLOGIE APPLIQUEE

1-1-1-l’homme chasseur et la microbiologie

1-1-1-L’HOMME CHASSEUR ET LA MICROBIOLOGIE

L’alimentation de l’homme:
produits de la chasse (viande de gibier, d’oiseaux, etc.)
Produits de la pèche ( poisson)
fruits et légumes sauvages
Quand la totalité des produits était consommée, aucune question ne se
posait, mais quand il en restait, les viandes se putréfiaient et laissaient apparaitre
des larves, et les légumes et fruits pourrissaient. Ceci avait conduit à:
° la naissance de la notion de la « génération spontanée » controversée
par la démonstration de l’origine microbienne des différentes altérations;
°La recherche de moyens de conservation qui avait abouti à l’application
du froid, du salage, du fumage et du séchage qui sont de nos jours utilisés pour
prévenir les avaries d’origine microbienne des aliments;

ainsi la microbiologie appliquée commença à être utilisée, mais de

manière spontanée.

1-1-2-L’HOMME ELEVEUR ET LA MICROBIOLOGIE

Les produits de l’élevage sont essentiellement: le lait et la viande.

Le lait laissé au repos à la température ambiante se transformait en un
nouveau produit avec de nouvelles propriétés organoleptiques (raib, lben et jben
qui n’est autre qu’une variété de fromage.
La viande, si elle n’est pas traitée par salage, fumage et/ou séchage se
putréfiait.

1-1-3-L’HOMME AGRICULTEUR ET LA MICROBIOLOGIE

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 1-1-4-L’HOMME CHERCHEUR ET LA MICROBIOLOGIE

-Découverte du microscope au 17ème siècle

-Démonstration et confirmation de l’origine microbienne des différentes
transformations des produits de la chasse, de l’élevage et de l’agriculture
(Putréfaction, caillage du lait, vinification et acétification).

-Naissance de la microbiologie :
-description des microorganismes des différents milieux naturels
(Eau, sol, lait, salive, sang etc.)
-établissement de méthodes d’isolement de culture et
d’apprivoisement des microorganismes ;
-étude de la structure et de l’évolution des microorganismes ;
-étude de l’organisation interne des cellules microbiennes ;
-connaissance des caractéristiques physiologiques, métaboliques
et génétique ;

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 -classification des microorganismes ;
-compréhension des interactions entre les microorganismes et
leur environnement ;
-utilisation des microorganismes par l’homme.

1-2-DEFINITION

La microbiologie appliquée est une science fondée essentiellement sur

l’application (en médecine ; pharmacie ; agriculture ; industrie ; environnement ;
etc.) des microbes (êtres vivants microscopiques dont la taille est inférieure à 100
micromètres) et /ou leurs produits pour satisfaire des intérêts et des besoins ciblés.
L’aboutissement de ces applications, émane souvent de recherches scientifiques
qui permettent d’expliquer les relations entre les structures et les fonctions des
microorganismes, d’une part, et l’optimisation des conditions d’utilisation, d’autre
part.

1-3-OBJECTIFS DU MODULE:

1-3-1-OBJECTIFS PEDAGOGIQUES
Les objectifs généraux de l’enseignement de la microbiologie appliquée
changent selon le niveau ou cycle d’étude.
Dans le premier et le deuxième cycle universitaire ils consistent à donner
aux étudiants les notions théoriques et pratiques qui leur permettent d’acquérir un
niveau de performance satisfaisant qui les rend capable de pratiquer la
microbiologie selon les normes et de manière correcte dans les laboratoires
spécialisés ; de préparer et présenter des exposés ; de mettre en ordre les résultats
d’analyses microbiologiques, les analyser et les interpréter pour donner des
conclusions,

1-3-2- LES OBJECTIFS PROFESSIONNELS

1-3-2-1-- bien connaitre les microorganismes :

Organismes microscopiques(ø≤100µm) ou ultramicroscopiques unicellulaires
procaryotes (ADN non entouré d’une membrane : bactéries) ou eucaryotes (ADN entouré
d’une membrane : certaines algues ; moisissures ; levures et protozoaires) ou
multicellulaires d’organisation simple(colonies).

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 1-3-2-2- former des experts en microbiologie agroalimentaire :
Utilisation de microorganismes dans la production et la transformation des
aliments
-Etude du rôle des micro-organismes dans :
a) la production maraîchère et animale,
b) dans la conservation des aliments,
c) fermentation du fromage, yogourt, vin, bière,
d) production de probiotiques et prébiotiques,
e) asepsie des produits.

1-3-2-3- former des experts en microbiologie environnementale :

Évaluation de l’impact des microorganismes dans l’environnement :
-sciences des sols,
-épuration des eaux,
- interactions entre les microorganismes et les composantes biotiques et
abiotiques des milieux naturels,
-traitement des sites pollués, bio élimination des pesticides.
-Ils travaillent principalement pour les services de protection et de gestion
de l’environnement.

1-3-2-4 -former des spécialistes en microbiologie industrielle :

Utilisation du système enzymatique des microorganismes pour synthétiser

ou dégrader une grande variété de produits :
-industrie des pâtes et papier ;

Production de produits chimiques ;

Extraction de minéraux ;
Filtration des eaux ;
Production de cosmétiques.

1-3-2-5- former des spécialistes en microbiologie biopharmaceutique

Mélange de microbiologie médicale et moléculaire dans une optique

industrielle :
-Développement de nouveaux antibiotiques, antiviraux et de vaccins,
-Production de composés d’origine microbienne pour la fabrication des
médicaments.

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 1-3-2-5- former des spécialistes en Microbiologie moléculaire
(génétique) :

Étude des rôles et des fonctions des gènes chez les microorganismes
-physiologie et métabolisme,
-génétique,
Identification et développement des molécules microbiennes utiles en
biotechnologie
.
Remarque : Les qualités indispensables pour devenir microbiologiste ?

Pour choisir cette profession, il faut a priori avoir :

-Une grande curiosité scientifique,

- Être passionné par la biologie ;
- Ne pas avoir peur des études ;
- Il faut aussi être débrouillard, organisé, discipliné et persévérant ;
- Avoir de bonnes aptitudes à travailler en équipe ;
- Être minutieux, polyvalent et rigoureux ;
- Un bon sens de l’observation, de l’initiative, de l’analyse et de la
synthèse ;

- Avoir l’aptitude de communiquer des résultats, rédiger des rapports

officiels et des publications.

II- TECHNIQUES DE BASE EN MICROBIOLOGIE APPLIQUEE

Ces techniques sont: le prélèvement; la numération et la biomasse; l’isolement et
l’identification microbienne.
2-1-LE PRÉLÈVEMENT
C’est la prise d’une portion sur un total d’un milieu naturel ( eau, aliment d’origine
animale ou végétale, liquide organique). Il doit toujours se pratiquer selon les normes standards
adoptées par tous les systèmes d’analyses microbiologiques. Ces normes appellent au respect de:

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 -l’asepsie : le matériel utilisé pour le prélèvement doit être stérile, et le transport des
échantillons doit se faire dans des conditions évitant tout risque de contamination.
-l’homogénéité : les prélèvements doivent être fait en plusieurs répétitions sur
différents points du même milieu, puis homogénéisés dans le même emballage.
-l’état standard : l’échantillon doit être analysé dans son état le plus caractéristique.
Dans ce cas, le délai et les conditions de transport au laboratoire, doivent être fait de manière à

éviter tout risque de modification des propriétés physico-chimiques et microbiologiques .

2-1-1- PRELEVEMENT EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

2-1-1-1-prelevement de l’eau

. Eaux embouteillées, conteneurs

Procéder comme pour les eaux de réseau en prélevant un volume plus
Important : utiliser des flacons stériles de 1L contenant du thiosulfate de sodium.

. Eaux de surface
- Se désinfecter les mains.
- Sortir le flacon stérile contenant du thiosulfate de sodium de son emballage et le
plonger à l’horizontale (pour éviter le déversement du thiosulfate). Le redresser jusqu’à ce que le
volume d’eau recueilli soit suffisant tout en gardant un volume d’air dans le flacon (goulot) pour
permettre une agitation correcte avant l’analyse.
- Inscrire sur le flacon et sur la Fiche de demande d’analyse d’eau toutes les
informations concernant le prélèvement (site, lieu, date, heure, éventuels problèmes rencontrés….
NB : Si le point de prélèvement n’est pas accessible, utiliser un porte flacon stérilisé au
préalable.
A-Transport et conservation

.A1- Transport
-Le prélèvement ainsi réalisé doit être acheminé au laboratoire dans les plus brefs
délais.
-Pour les eaux potables, il convient dans l’idéal de commencer l’analyse le jour même.
-Durant le transport, les échantillons sont conservés dans une enceinte réfrigérée avec
blocs réfrigérants et à l’abri des rayonnements solaires.
-Il est recommandé de séparer les échantillons chauds des échantillons froids.
-Ne pas mettre de blocs réfrigérants en contact direct avec l’échantillon, car cela
pourrait entraîner sa congélation.
- La formation de glace peut entraîner la mort de la majorité des cellules. Seuls les
échantillons destinés à l’analyse des virus peuvent être conservés à-70°C.
NB : Pour les échantillons transportés pendant une durée supérieure à 8h, il est
nécessaire de surveiller et d’enregistrer la température.
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 A2- Conservation
Le tableau ci-après, tiré de la norme NF EN ISO 19458 :2006, propose des durées et
des températures de conservation acceptables pour les échantillons d’eau du prélèvement à
l’analyse. Des critères spécifiques à appliquer ont été déterminés par le laboratoire dans chaque
méthode
.

2-1-1-2-PRELEVEMENT A PARTIR DES CONSERVES

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 Le prélèvement doit être effectué en 5 répétitions, en nombre suffisant
pour avoir 25g de chair et de liquide inter valvaire.

2-1-1-3-Produits en tranche, haché, divisés, plats cuisinés, etc.

Le prélèvement porte sur les parties superficielles et les parties
profondes.

2-1-1-4-viandes, produits de charcuterie et poisson entier.

Le prélèvement se fait sur la partie profonde après cautérisation de la
surface.

2-1-1-5-Produits laitiers et leurs dérivés

Le prélèvement se fait selon la nature solide ou liquide du produit, sur les
parties superficielles et profondes ou sur les produits homogénéisés

2-1-2-PRÉLÈVEMENT EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE

2-1-2-1-Prélèvement du sang
* chez l’homme :
Il se fait par piqûre du lobule de l’oreille ou du doigt. Pour l’oreille, on
prend le lobule entre le pouce et l’index et on pique le bord. Pour le doigt, on pique
la face dorsale de la phalangette en arrière de la racine de l’ongle. La piqûre doit
être assez profonde pour que le sang sorte par simple flexion de la phalangette sans
compression du doigt. Si cette dernière est nécessaire, on comprime légèrement en
remontant les côtés du doigt (artère latérale), il ne faut pas presser fortement, car
il ya risque d’obtenir un mélange de sang et de lymphe.
*chez les grands mammifères :
On entaille le bord de l’oreille d’un léger coup de ciseaux, ou s’ils dociles,
on pique l’oreille au vaccinocyte, au niveau d’un petit vaisseau, après avoir coupé
ou arraché les poils.
*chez les rongeurs :
Le prélèvement se fait par entaillement du bout de la queue, soit selon la
technique de sabot (introduction de l’animal dans une boite, récupération de la
queue à travers un trou et découpage suivie de cautérisation de son extrémité), soit
selon les procédés classiques (prise de l’animal par la peau dorsale du cou,
étirement et entaillement du bout de la queue).
*chez le cobaye et le lapin :
On fend légèrement l’oreille, on récupère le sang et on cautérise la plaie.
*chez le singe :
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 Le sang se prélève à l’oreille.
*chez la chauve-souris :
On pique la veine qui réunit le membre postérieur à la queue qu’on voit
par transparence à travers la membrane

*chez les petits oiseux:

On pique une veine du genou et du coude, en cas de besoin de grandes
quantités de sang, on effectue des ponctions des cœurs.
Chez les amphibiens:
Le sang peut être récupéré par ponction de la veine faciale chez la
grenouille; par section de la queue chez la tortue; par piqûre de l’extrémité du
museau chez les gros lézards.
b) Prélèvement du liquide gastrique
Après un jeun de 12 à 24H, on prélève avec une sonde, les eaux de lavage
de l’estomac.
c) Prélèvements vaginaux (Chlamidia trachomatis-p; Mycoplasme-b;
Gonococcus-b; herpes II-v; Trichomonas vaginalis-p; Candida albicans-l)
Sont effectués par aspiration des mucosités du tiers postérieur du vagin,
au moyen d’un tube branché à une poire.
d) Prélèvement du liquide céphalo-rachidien (Torulopsis neoformans
(lev), Trypanosomes-p)
Par ponction lombaire.
e) Prélèvement du mucus nasal (Streptococcus A-B, Corynebacterium B)
Se fait soit localement à l’aide d’un écouvillon stérile, soit dans une
compresse stérile dans laquelle on fait moucher le sujet.
f) Prélèvement du pus (Gonococcus –b)
Se fait localement à l’aide d’un écouvillon.
g) Prélèvement du crachat (Pneumococcus –b, Mycoplasma-b, …); des
urines ( Escherichia coli, Klebsiella) et des sels (Salmonella, Yersinia, Shigella, …)
Se fait par versement dans une boite stérile.

2-1-3- Prélèvement à partir du sol

2-1-3-1-Sol nu

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 Les prélèvements sont de 500 à 1000g chacun. Ils doivent être effectués
à 10 à 15cm de profondeur, en plusieurs points choisis au hasard du champ à
analyser.

2-1-3-2- Horizons du sol

On réalise une section plane verticale et on repère les différents horizons;
On effectue dans chacun d’eux, une série de prélèvement partiels. Pour
cela, il faut gratter les premiers centimètres de la paroi avant de prélever à la cuillère
le sol qu’on met dans des emballages sur lesquels on indique le niveau de
prélèvement.

2-1-3-3- Sol hydromorphe (Submergé)

Il faut utiliser un système qui permet le prélèvement et la préservation du
sol : on peut utiliser un cylindre à double paroi glissante l’une sur l’autre. La paroi
interne à base fermée et à contour perforé de fenêtres de 5cm de diamètre à bord
saillant. Le prélèvement du sol se fait par introduction du cylindre, dégagement des
fenêtres de la paroi interne par glissement de la paroi externe. Par des mouvements
rotatoires, le sol est entrainé dans le cylindre, puis récupéré après fermeture et sorti
du système du milieu de prélèvement.

2-1-3-4- Rhizosphère
On effectue le prélèvement dans :
*le sol en jachère loin des racines : témoin ;
*la rhizosphère éloignée (édaphosphère) sol au voisinage des racines de
la plante ;
*la rhizosphère proche (rhizoplan) : terre adhérente aux racines. Elle est
récupérée par secouage puis lavage avec des jets de pissettes d’eau stérile des
racines de la plante.

2-2- LA NUMERATION ET LA BIOMASSE DES MICROORGANISMES

C’est l’ensemble de procédés qui permettent de dénombrer les
microorganismes. Elle est appliquée en recourant à des techniques microscopiques
et/ ou culturales ; des techniques se basant sur les dosages des composés
spécifiques des microorganismes et /ou sur l’évaluation de leurs activités
physiologiques.

2-2-1- les techniques microscopiques

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 Elles permettent de reconnaitre, de dénombrer, et de décrire les
propriétés morphologiques, chimiques et structurales des microorganismes. Elles
se basent sur l’analyse de frottis préparés selon des procédés appropriés. Cette
analyse peut se faire en microscopie photonique (à transmission normale, à fond
noir, à fluorescence et/ou à contraste de phase), et/ ou en microscopie électronique
(à balayage et à transmission).

2-2-1-1-Préparation des frottis

a) Frottis humides :
*À partir de cultures bactériennes ou de levures :
On dépose une goutte d’eau distillée stérile ou d’eau physiologique (9 ‰
NaCl) sur une lame propre préalablement dégraissée. On émulsionne dans cette
goutte une fraction de la colonie microbienne et on couvre avec une lamelle.

*À partir des liquides organiques ou de milieux naturels :

On réalise en cas de besoin, des suspensions-dilutions à partir desquelles
on fait un montage sans goutte d’eau.
Ces frottis peuvent être observés avec ou sans coloration.
Remarque : en cas de besoin, les montages peuvent se faire en
émulsionnant les prélèvements dans des solutions visqueuses (gélatine à 5%, ou
carboxyle-méthyle-cellulose à 2%) ces solutions immobilisent les cellules mobiles.

2-2-1-2-les colorants utilisés en microscopie à transmission normale :

- Rose Bengale : colore en rose, les cellules bactériennes vivantes ;

- Bleu de phénol-aniline : colore en bleu les cellules microbiennes ;
- Encre de chine : ne colore pas les bactéries vivantes et les montrent
comme des zones incolores sur un fond noir donné par l’encre ;
- Iodophényle-nitrophénole-tétrazolium-chloride (INT) et triphényle-
tétrazolium-chloride (TTC) : colorent en rouge les membranes des bactéries
vivantes, les cellules mortes restent incolores. Cette coloration consiste à ajouter à
la culture bactérienne (10ml), 1ml d’INT ou de TTC à 0,2%, après 10mn pour l’INT,
et 20mn pour le TTC, 0,1ml de la culture bactérienne est montée entre lame et
lamelle puis observé à l’immersion ;
- Orseilline BB bleu trypan et Bleu phénol- aniline : utilisés pour la
coloration des mycéliums des champignons filamenteux afin de mesurer leur
longueur et déduire leur biomasse ;
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 - Bleu de méthylène : colore en bleu les cellules mortes de levures et
laisse incolore les cellules vivantes.
* Les fluorochromes :
-acridine-orange ou 3-6 tétras méthyl-diamine-acridine avec lequel les
cellules bactériennes vivantes ont une fluorescence orange, les cellules mortes, une
fluorescence verte. Le principe de la coloration consiste à récupérer les bactéries
dans des filtres ayant des pores de 0,22µm de diamètre. Ces filtres sont trempés
pendant 2 à 15mn, dans une solution d’acridine-orange à 0,1mg/ml (dans du
tampon phosphate, 6,6mM, pH 6,7) avant d’être montés entre lame et lamelle, puis
observés en microscope à épi fluorescence ;
-isocyanate de fluorescéine : 4’-6’-diamino-2-phénylidole-
dihydrochlorure (DAPI) et Eucharistie 2GNX : ont la même fonction que l’acridine
orange, mais ils ont la particularité de mieux permettre la distinction de la matière
vivante et la matière morte. Ils sont utilisés à une concentration de 10µg/ml ;
-immunofluorescence : c’est une technique qui fait intervenir un anticorps
anti-lapin pour marquer des germes précis non liés à des particules (exemple :
Rhizobium, Nitrobacter)

2-2-1-3-L’observation microscopique
a) Microscopie photonique à transmission normale
Elle permet des grossissements de l’ordre de 4; 10; 40; et 100 fois. La plus
petite taille observable est de l’ordre de 1,6µ.

b) Microscopie à fond noir

Elle permet de voir comme des points lumineux, des objets difficilement
observables en éclairage direct. Ceci, grâce à la pénétration indirecte par réflexion,
réfraction, ou diffraction des rayons lumineux par les objets à observer.

c) Ultramicroscopie
Elle fonctionne de la même manière que le fond noir, mais permet
d’observer des objets trop petits pour être vus en microscopie ordinaire.

d)Microscopie à contraste de phase

Elle permet, grâce à un équipement spécifique qui modifie une partie de
la lumière traversant le microscope, d’examiner les frottis humides non colorés par
augmentation du contraste des objets à observer.

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 e) Microscopie électronique à transmission et à balayage
Elle utilise les électrons pour irradier les objets. Sa limite optique est
d’environ 0,00001µ. Elle permet l’étude sur photographie, de la structure des
cellules.

2-2-1-4-TECHNIQUES MICROSCOPIQUES DE DENOMBREMENT ET DE

BIOMASSE MICROBIENNES

a) Cellule de Malassez

b) Lame et oculaire micrométriques

On dénombre les microorganismes (bactéries, levures, spores
fongiques) dans plusieurs champ microscopique de surface connue ;
-on calcul le nombre moyen par champ puis par unité (ml ou gramme)
du milieu à analyser ;
Exemple:

17
 on peut traduire ce dénombrement en biomasse en considérant les
données suivantes:
*densité moyenne des microorganismes = 1,1 ;
*le taux de matière sèche des microorganismes = 20% ;
*le taux de carbone = 50% de matière sèche ;
*le poids spécifique d’un µ3 =10-12 g;

2-2-2 -TECHNIQUES CULTURALES DE QUANTIFICATION DES

MICROORGANISMES

Elles permettent l’isolement et le dénombrement de la microflore en milieux

électifs ou sélectifs liquides ou solides. Les principales techniques sont :

2-2-2-1- la suspension-dilution et culture

Elle consiste à ensemencer des milieux liquides ou solides par des
volumes connus de dilutions de substrat à analyser. Les premiers milieux permettent
de déterminer le nombre le plus probable de germes en utilisant la table de Mc.
Crady. Les seconds permettent l’isolement et le dénombrement des colonies
microbiennes résultantes de cellules vivantes.

2-2-2-2- dénombrement

-en milieu gélosé:

Les microorganismes sont dénombrés dans les boites contenants moins
de 300 colonies.
N = Nm / v x d
- N : nombre de cellule par ml prélèvement.
-Nm : nombre moyen de colonies pour une dilution donnée.
-v : volume du frottis.
-d : dilution à partir de laquelle le frottis est fait.

-en milieu liquide

On calcule le nombre le plus probable en utilisant la table de Mac Crady
ou en se référant aux normes.
Exemple de calcul en milieu liquide( 3 tubes/dilution) :
18
 2-2-3- TECHNIQUES CYTOLOGIQUES QUANTITATIVES DES
MICROORGANISMES

2-2-3-1- dosage des composés spécifiques

Ces techniques consistent à quantifier par des méthodes biochimiques,
certains composés propres à des groupes microbiens dans le substrat à analyser. Ces
quantifications donnent souvent une estimation de la biomasse microbienne. Les
plus utilisées de ces techniques sont :

a) dosage de l’acide acétyle-muramique

Ces constituants sont des mucocomplexes propres des parois
bactériennes. Leur dosage peut renseigner sur la biomasse bactérienne des milieux

19
naturels. Il se fait par colorimétrie après hydrolyse acide, suivie d’une purification
chromatographique.

b) Dosage des complexes lipo-protéine-polysaccharidiques

Ces constituants sont propres aux bactéries Gram-négatives pour
lesquelles ils représentent 20 à 35% du poids. Leur dosage renseigne sur la biomasse
de ce groupe microbien dans les milieux naturels.
c)Dosage de l’hexosamine et de l’ergostérol (alcools stéroïdes propres
aux membranes fongiques)
Permet de déterminer la biomasse fongique des milieux naturels.

d)Dosage des composés nucléiques :

- (ADN)
Renseigne sur la biomasse bactérienne et se fait par extraction après lyse
des cellules et traitement avec l’acide 3-5-diaminobenzoique ou avec la
mithramycine (antibiotique qui réagit spécifiquement avec la guanine), puis mesure
de la fluorescence.
La quantification de l’ADN peut aussi se faire par réaction de
polymérisation en chaine (PCR), et par hybridation de sondes d’ADN. (C’est un
fragment d’ADN capable de reconnaitre, dans un échantillon biologique une
séquence nucléotidique complémentaire à la sienne et de former avec celle-ci une
molécule double brin ou duplex stable au cours de l’hybridation).

- l’ADNr 16S :
-extraction de l’ADN( optimisation de la méthode d’extraction):on ajoute
une quantité donnée de cellules d’Escherichia coli à notre échantillon, et on pratique
plusieurs techniques d’extraction: sonication, congélation-décongélation, chelex
100°C/PCR directe, etc.);
-amplification spécifique du gène codant pour l’ARNr 16S par PCR;
-clonage des fragments d’ADNr 16S dans un plasmide;
-analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction des
clones afin de déterminer les classes de clones;
-séquençage des différents clones;
-analyse des séquences à l’aide d’outils informatiques et construction
d’arbre phylogénétique.

20
 -ARN ribosomale 16S (technique de phylogénie moléculaire)
Permet d’estimer la diversité de la communauté microbienne, par
extraction et amplification (par PCR) puis analyse par un logiciel approprié dans un
ordinateur d’une petite quantité d’ADN d’un échantillon de sol.

e)Méthodes immunologiques quantitatives des bactéries:

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Immunotransfert

L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un

de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes
immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire,
responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un signal par un
substrat chromogène ou fluorogène.
L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle
d'un anticorps dans un échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer
des concentrations sériques d'anticorps, que pour détecter la présence d'un
antigène. Il a également trouvé des applications dans l'industrie alimentaire, pour
détecter des allergènes alimentaires, comme le lait, les cacahuètes, les noix et les
œufs. C'est un test simple, facile d'emploi et peu coûteux. Il est limité par la
disponibilité en anticorps spécifique.

e1) IMMUNODOSAGE PAR COMPETITION

Les techniques d'immunodosage par compétition utilisent un Ac
spécifique qui peut être couplé à une phase solide et un antigène purifié marqué
soit à l'125I : RIA (Radioimmunoassay) soit couplé à une enzyme : ELISA (Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay).
Par référence à une courbe étalon obtenue avec une concentration en Ag connue, il
est possible de déterminer la concentration dans le liquide biologique.

21
 -e2) IMMUNODOSAGE EN SANDWICH

Les méthodes dites "en sandwich" (où l'Ag recherché se trouve entre
deux couches d'Ac) utilisent non pas des Ag marqués mais un deuxième Ac
marqué spécifique de l'Ag. Le signal obtenu augmente en fonction de la
concentration d'Ag ajouté jusqu'à atteindre un plateau correspondant à la
saturation de la réaction.

f) Méthode biocidale : fumigation extraction

Cette technique consiste à fumiger des échantillons( de sol ou d’autres
substrats) avec rayonnement ou avec des produits chimiques tels que le
chloroforme, puis de doser le carbone organique total des échantillons fumigés (
22
témoin) et incubés pendant 5 à 10 jours. La biomasse microbienne est estimée par
Ec, correspondant à l’augmentation de carbone organique extractible après
fumigation (Ec= COT extrait des échantillons non fumigés – extrait dans les témoins)
affecté d’un coefficient multiplicateur de 2,22.

C.total biomasse =2,22xEc

2-2-4 LES TECHNIQUES METABOLIQUES DE QUANTIFICATION

MICROBIENNE
2-2-4-1-respiration productrice de CO2
La mesure du dégagement de CO2 est souvent utilisée pour évaluer
l’activité globale des microorganismes des milieux naturels. Elle peut être pratiquée
selon deux techniques :
a) Méthode colorimétrique :
Consiste à effectuer une décarbonation par l’acide sulfurique « H2SO4 »
0,5N de la soude « KOH ou NaOH » ayant capté le CO2 dégagé par la microflore. Le
CO2 ainsi dégazé est mis au contact d’une solution tampon contenant un indicateur
coloré, la phénolphtaléine.
La fixation de CO2 provoque une diminution du pH de la solution tampon
et décolore la phénolphtaléine. Ce qui est mesuré à 550nm avec un colorimètre.
La quantité de CO2 est ainsi calculée par différence entre la densité
optique « DO » du témoin réalisé de la même manière que le test, mais sans
microflore. Cette valeur est ensuite rapportée sur la courbe étalon établi à partir
d’une solution de carbonate de sodium « Na2CO3 » qui a subi le même traitement.
b) Méthode titrimétrique
La quantité de CO2 trouvée peut-être traduite en biomasse en considérant
la relation selon laquelle : 1ml de CO2, produit par heure, correspond à 40mg de
carbone-biomasse.

2-2-4-2-activité déshydrogénasique
Les déshydrogénases sont classiquement définies comme des enzymes
qui catalysent le transfert d’hydrogène d’un substrat oxydable (par exemple,
composés des résidus végétaux) soit sur l’oxygène, soit sur un substrat existant
spontanément ou introduit artificiellement.
Il est plus juste de parler de système transporteur d’électron. Ces enzymes
sont connues par leur spécificité. Leur localisation au niveau des cellules végétales
a été depuis longtemps révélée en traitant les cellules avec une solution à 0,5 à 1%
de 2-3-5- Triphényl Tétrazolium Chloride (TTC) ou de nitrophényl-nitrophénol-
23
tetrazolium-chloride (INT). Ces sels donnant normalement une solution aqueuse
incolore, sont réduits en précipité rouge (Triphényl-formazan : TPF) insoluble dans
l’eau, mais extractible à l’acétone ou au méthanol.
Cette réduction à lieu au niveau de l’assise génératrice (cambium) et dans
le liber (phloème) et aussi au niveau des membranes des cellules vivantes
bactériennes.
Ce réactif avait été déjà utilisé pour rechercher la vitalité des graines, et
des levures ou des boutures d’arbres et arbustes.
L’utilisation du TTC pour la révélation des cellules vivantes a connu, depuis, un grand
succès pour entrer dans l’évaluation des activités respiratoires des bactéries des milieux naturels.

2-2-4-3) Dosage de l’adénosine triphosphate (ATP)

Du fait que l’adénosine triphosphate « ATP » est présent exclusivement
dans les cellules vivante, sa quantification peut renseigner sur la biomasse
microbienne. Pour ce faire, on extrait l’ATP avec l’acide trichloracétique ou l’acide
sulfurique ou avec le carbonate de sodium associé au chloroforme. On ajoute le
complexe luciférine-luciférase et on mesure la bioluminescence qui résulte de la
transformation du complexe substrat-enzyme en luciférine excité avec
décarboxylation. Le retour à l’état électronique stable s’accompagne d’émission de
la lumière.

2-2-4-4-activité hydrolytique globale : hydrolyse du fluorescéine

diacétate
La fluorescéine diacétate (FDA) est utilisé pour la révélation de l’activité
hydrolytique globale des microorganismes (surtout les champignons) des milieux
naturels.
Ce réactif est hydrolysé par les microorganismes en fluorescéine qui peut
être visualisé au microscope à fluorescence, puis quantifié par fluorimétrie ou
spectrophotométrie.

2-3- ISOLEMENT

L’isolement d’un groupe microbien se fait dans des milieux électifs, celui
des genres et des espèces, dans des milieux sélectifs enrichis.
Les principales méthodes d’isolement sont :

24
 -a) méthode monosperme ;
-b) méthode par dilution et ensemencement en milieux liquides
solidifiables en boites ou en tubes ;
-c)méthode par épuisement à la surface de milieux solides en boites ;

Remarques :
- pour parvenir à isoler un germe pur, il est recommandé de réensemencer,
après dilution en liquide isotonique, la colonie plusieurs fois jusqu’à ce que ses
caractères morphologiques soient stables.
- l’isolement des anaérobies strictes nécessite l’application de procédés
spéciaux qui respectent l’anaérobiose (manipulation et incubation dans des
conditions dépourvues d’oxygène

-d) séparation des bactéries et des champignons

Elle se pratique par :
-lavages répétés des échantillons à analyser. Les premiers lavages
entrainent les organismes les plus petits dont les bactéries, les suivants entrainent
les hyphes.
-centrifugation qui permet d’obtenir les champignons dans la fraction
profonde et les bactéries dans la couche la plus superficielle.
-utilisation de fongicides (mycostatine) pour favoriser le développement
des bactéries, ou d’antibiotiques (chloramphénicol) pour favoriser le
développement des champignons.
-prélèvement au binoculaire des hyphes et spores des champignons.

-e) dispersion sur boite

Cette méthode permet d’obtenir plus d’espèces qu’avec la suspension-
dilution. Elle consiste à effectuer un ensemencement dans la masse d’un milieu
gélosé en surfusion (45°C) avec une fraction de la dilution du substrat à analyser.

-f) enfouissement de lames, tubes et boites de Pétri.

Une lame enduite d’un milieu sélectif et enfoncée dans un sol, permet
d’obtenir le microorganisme recherché (Azotobacter, Agrobacterium, etc.).
Les tubes et les boites de Pétri contenant des substrats donnés (cellulose,
chitine, etc.) et couverts de voiles à mailles de diamètre connu et constant puis
enfoncés dans un sol, permettent de concentrer les souches spécialisées dans la
dégradation du contenu des boites et des tubes, l’isolement de ces souches devient
possible par repiquage des résidus dans des milieux de culture appropriés
25
 REMARQUE : les inconvénients des méthodes culturales se rapportent
aux : choix des milieux et des conditions de culture et cultuvabilité des
microorganismes, etc.

2-4-IDENTIFICATION DES MICROORGANISMES

C’est l’étude qui permet de classer un microorganisme dans le groupe
taxonomique qui lui convient.

2-4-1-l’identification des bactéries :

2-4-1-1-la technique classique

Elle est basée sur les caractères macro et microscopiques pour déterminer
le genre, sans pour autant négliger les propriétés biochimiques, physiologiques et
sérologiques pour déterminer l’espèce

A) -les caractères macro et microscopiques

Intéressent essentiellement, la couleur, la morphologie et la taille de la
colonie et de la cellule bactérienne, et aussi la présence de cils, de spores, de
capsule et de pigmentation.

26
 B- les propriétés biochimiques et physiologiques :
Fermentation des sucres ; effet sur le lait (coagulation ou digestion), sur
la gélatine ; pouvoir réducteur (tournesol, bleu de méthylène) ; production de gaz,
d’indole, d’hydrogène sulfuré ; assimilation des nitrates, de la cellulose, sels
d’ammonium ; températures de développement.
Pour de nombreux genres et espèces, l’identification ne doit pas se baser
sur un petit nombre de tests, mais sur un modèle connu, applicable, comme par
exemple le modèle utilisé pour l’identification des Enterobacteriaceae.

2-4-1-2 les techniques rapides :

Standards ; rapides ; reproductibles ; miniatures ; machinalisées et
automatisées. Elles comportent :
-les systèmes biochimiques manuels ;
-les systèmes mécanisés et automatisés ;
-les systèmes immunologiques
-lysotypie
-les techniques moléculaires

A- les systèmes biochimiques manuels :

Exemple :
-API 20 E d’identification rapide des entérobactéries :
Bande de plastique de 20 micro-cupules contenant des substrats
déshydratés capables de révéler certains caractères biochimiques. La bactérie
isolée est émulsionnées dans une solution physiologique stérile, puis inoculée

27
dans les micro-cupules, après 5h ou une nuit d’incubation, les résultats sont
convertis en une grille de 7 ou 9 données. Cette grille peut être traitée par
ordinateur, ou à l’aide d’un manuel (API profile index) pour donner le nom de la
bactérie.

B- les systèmes automatisés

-b1) l’autobac IDX :

Système mécanisé et automatisé d’identification des bactéries GRAM
négatifs ne fermentant pas le glucose, et les entérobactéries. Il est utilisé dans la
recherche des bactéries dans les urines et pour déterminer la sensibilité aux agents
antimicrobiens.
Colonie bactérienne cultivée en présence d’inhibiteurs de croissance, et
test de mobilité, nitritation, dénitrificatiion, fermentation et utilisation oxydative du
glucose et croissance sur milieu Mac Conkey . Les résultats sont imprimés
automatiquement.

-b2) le biolog :
Permet l’identification de 800 espèces gram + et gram – et repose sur la
capacité des bactéries à cataboliser 95 sources de carbone différentes

28
 b3) IDENTIFICATION PROTEOMIQUE PAR SPECROMETRIE DE MASSE :
MALDI-TOF/MS
L’identification protéomique par spectrométrie de masse consiste à
analyser les protéines des microorganismes. Cette analyse a l’avantage d’être liée à
l’identité génétique des derniers.
Avantages :
-Préparation simple des échantillons et acquisition de données d’analyse
extrêmement rapide.
Inconvénients :
-le nombre de protéines détectés par MALDI-TOF est généralement
inférieur à 100 qui ne représente qu’une petite fraction de 2000 à 5000 protéines
présentes dans les génomes bactériens. Cependant, il semble que la détection de
cette petite quantité protéique est suffisante pour la détermination des genres,
espèces, sous espèces et des souches

C- les techniques immunologiques

-c1) Immunotransfert
Technique permettant de mettre en évidence des antigènes séparés par
électrophorèse, ensuite transférés sur un support solide, pour être révélés par une
sonde radioactive : Southern-blot (du nom de son inventeur E. Southern) pour
l'ADN, northern-blot pour l'ARN, western-blot pour les protéines reconnues par
méthode immunoenzymologique (Eliza).
Applications médicales de l’Immunotransfert en diagnostic
Les tests VIH de confirmation emploient la méthode du transfert de
western afin de détecter un anticorps anti-VIH dans un échantillon de sérum. Des
protéines de cellules que l'on sait infectées par le VIH sont séparées et transférées
sur membrane comme décrit ci-avant. Le sérum à tester est appliqué. L'étape
d'incubation dans l'anticorps primaire ; les anticorps libres sont éliminés par rinçage
de la membrane, et un anticorps dirigé contre les protéines humaines secondaires
associés à une enzyme ou un chromophore est ajouté. Les bandes marquées
indiquent ensuite les protéines contre lesquelles le sérum du patient contient des
anticorps.
Le transfert de western est également utilisé pour le test de confirmation
de l'ESB (dite « maladie de la vache folle »).
Certaines formes de détection de la maladie de Lyme utilisent le transfert
de western.

29
 -c2) agglutination ;
À un anticorps déterminé correspond un antigène spécifique.
Tous les êtres vivants réagissent par un phénomène d’autodéfense à
l’introduction de corps étrangers dans leur organisme. Cette réaction est due à la
formation, dans le sérum sanguin, d’anticorps. Ces anticorps conservent, pendant
un certain temps, la propriété de se combiner aux antigènes qui leur sont
spécifiques.
Par la réalisation des interactions antigène-anticorps, on peut caractériser
l’espèce ou le groupe d’espèces auxquels appartient la bactérie qu’on veut identifier.
Pour ce faire, on mélange « in vitro » un anticorps connu avec un antigène
inconnu dans des conditions déterminées. Dans le cas de la présence d’une
agglutination ou d’une précipitation, on conclut que la bactérie qui porte l’antigène
testé, appartient au même groupe sérologique que celle utilisée pour l’élaboration
de l’anticorps connu.
L’agglutination est utilisée pour diagnostiquer Clostridium botulinum et
Streptococcus.

-c3) immunofluorescence directe et indirecte ;

L'immunofluorescence directe implique la fixation de l'échantillon (cellule
ou micro-organisme) contenant l'antigène d'intérêt, sur une lame. Des anticorps
marqués à la fluorescéine sont alors ajoutés à la lame et incubés. La lame est lavée
pour enlever les anticorps non fixés puis examinée au microscope à fluorescence
pour rechercher une fluorescence jaune-verte. La disposition de la fluorescence
indique la localisation de l'antigène. L'immunofluorescence directe sert à
l'identification d'antigènes tels que ceux de la surface des streptocoques de groupe
A et au diagnostic d'Escherichia coli et de Mycobacterium bovis.

- c4) fixation du complément ;

(Détection de salmonelles dans des échantillons alimentaires)
Le test de fixation du complément est un test immunologique médical qui
peut être utilisé pour détecter la présence d'anticorps spécifiques
d'un antigène dans le sérum d'un patient, selon que la fixation du complément se
produit ou non. Il a été largement utilisé pour diagnostiquer les infections, en
particulier avec les microbes qui ne sont pas facilement détectables par des
méthodes de culture, et dans les maladies rhumatismales. Cependant, dans les
laboratoires de diagnostic clinique, il a été largement remplacée par d'autres
méthodes sérologiques comme ELISA et par des méthodes basées sur la détection
de l'ADN des pathogènes, en particulier la PCR.
30
 En médecine humaineDétection des anticorps contre:
• la bactérie Listeria monocytogenes responsable de la listériose.
• les virus coxsackie A et B.
• les virus influenza responsables de la grippe.
• la bactérie Coxiella burnetii responsable de la fièvre Q ou coxiellose.
• la bactérie Treponema pallidum responsable de la syphilis.
• les bactéries du genre Mycoplasma.
En médecine vétérinaire
Détection des anticorps contre:
• les bactéries du genre Brucella responsables de la brucellose.
• la bactérie Burkholderia mallei responsable de la morve.
• la bactérie Mycoplasma mycoides responsable de la pleuropneumonie
contagieuse bovine (PPCB).
• Trypanosoma brucei
• Trypanosoma equiperdum responsable de la dourine.
• Leishmania donovani et Leishmania infantum

-c5) neutralisation : immunochromatographie

La détection rapide d'antigènes parasitaires, bactériens ou viraux par
immunochromatographie sur membrane consiste à déposer l'échantillon à tester
(sang, urines, selles, LCR, pus, ...) à l'une des extrémités d'une membrane de
nitrocellulose fixée sur un support plastique ou carton. Si l'antigène recherché est
présent, il se lie avec un anticorps marqué le plus souvent à l'or colloïdal. Sous l'effet
d'un tampon lyse-migration, les complexes antigènes-anticorps migrent par
capillarité et sont arrêtés par des anticorps de capture fixés sur la membrane. Un
résultat positif se traduit par l'apparition d'une ligne colorée. L'excès de complexe
conjugué continue à migrer et est immobilisé par un anticorps (anti-lapin ou anti-
souris), l'accumulation des complexes colorés entraîne l'apparition d'une ligne
colorée, cette seconde ligne ou ligne de contrôle valide le bon fonctionnement de
la réaction. En cas de réaction négative, seule la ligne contrôle est colorée.
L'apparition des bandes est rapide en 15 à 20 mn. Le principe de la détection rapide
d'anticorps par immunochromatographie sur bandelette est identique. Mais, alors
que les tests détectant des antigènes ne nécessitent aucun traitement préalable de
l'échantillon, les tests recherchant des anticorps imposent une centrifugation
préalable des tubes de sang. Mieux vaut travailler sur du sérum que sur du sang
total
-c6) immuno- électrophorèse
31
 -c7) les liposomes.
Un liposome est une vésicule sphérique microscopique, artificielle et
constituée d’une bicouche lipidique entourant un compartiment aqueux. Ce dernier
contient un colorant. Le liposome est sensibilisé en couplant un anticorps ( ou un
antigène) spécifique à sa surface. Les anticorps spécifiques d’un organisme
recherché sont attachés à une membrane dans un secteur de forme géométrique
précis tel un triangle. Après ajout de l’échantillon à analyser, la substance
recherchée se lie aux anticorps immobilisés sous forme d’un triangle, ce qui indique
une réaction positive.

D-Lysotypie

Technique employant des bactériophages pour une identification bactérienne au

niveau du genre ou de l'espèce (exemples : Salmonella, Brucella).

E- les techniques moléculaires

Exemple : sonde nucléique :

32
 La méthode Gen-probe Listeria monocytogenes est un test
d’identification utilisant une sonde d’ADN spécifique à marquage chimio-
luminescent, complémentaire de l’ARN ribosomal de Listeria monocytogenes : les
hybrides formés sont détectés au moyen d’un luminomètre. Ce test nécessite deux
phases d’enrichissement (bouillon FRASER au 1/2 puis gélose PALCAM). Les colonies
s’y développant sont soumises à une hybridation moléculaire après lyse
bactérienne. La méthode de détection utilise une sonde à ADN monocaténaire
marquée à l’ester d’acridium. Cette sonde a une structure complémentaire d’une
séquence de l’ARN ribosomial spécifique des Listeria monocytogenes. En cas
d’hybridation, les complexes ADN-ARN sont détectés par un luminomètre, les
sondes non hybridées étant préalablement éliminées.
La détection des hybrides résulte de la transformation en milieu alcalin
de l’ester en acridone avec libération de photons. Leur mesure exprimée en RLU
détermine la conclusion. Cette méthode donne 4 % de faux positifs (produits
carnés et produits de la pêche) et aucun faux négatif.
Cette méthode est rapide et permet dès les premières 24 heures
d’enrichissement de détecter les bactéries.
Test validé AFNOR pour tous produits alimentaires le 13 nov 1996.
Associées à la PCR l’intérêt de ces méthodes sera accru.

2-4-2-identification des levures

Levure= champignon à thalle unicellulaire prédominant, mais présentant

fréquemment des pseudomycéliums ou des mycéliums vrai. La multiplication
végétative se fait souvent par bourgeonnement.
Les levures peuvent être déterminées selon les travaux de
GUILLIERMOND ou LODER et KREGER VAN RIJ.

Les caractères morphologiques (macro et microscopique)

Présence ou absence de capsules, de basidiospore ou d’ascospores
permettent de constituer les familles.
La multiplication végétative ainsi que la reproduction sexuée
Permettent de distinguer le genre.
Les caractères physiologiques

33
 Fermentations, assimilation des sucres, nitrates, production de pigments
caroténoides, etc. permettent de différencier les espèces.

2-4-2-1-Caractères culturaux :milieu Sabouraud.

2-4-2-2-Caractères microscopiques :
a) morphologie et reproduction

TUBE GERMINATIF : dans Sérum de veau, de cheval ou de lapin (test de

blastèse)
- Inoculum léger
- Incubation 3 heures à 37 °C (bain-marie)
Longtemps considérée comme la méthode de référence, ce test présente
une fiabilité limitée puisque 5% des C. albicans ne produisent pas de tubes
germinatifs et que des espèces comme C. tropicalis et C. parapsilosis produisent
des structures similaires appelées « tubes germinatifs-like » De plus, C. dubliniensis
est également capable de produire des tubes germinatifs, raison pour laquelle il a
longtemps été confondu avec C. albicans. Pour ces raisons, ce test est de moins en
moins utilisé

ARTHROSPORE
Se fait par culture de la levure à identifier dans une gélose
cornmeal+tween, incubation 48-72H à 25°C.

b) Milieux fluorogéniques (cas des Candida).

Le plus utilisé est le Fluoroplate® Candida de Merck. Ce milieu de culture
contient, en plus d’une base nutritive d’extrait de levure, de la glycine, du glucose
et le substrat fluorogénique MUGal comme indicateur. 99% des souches de Candida

34
albicans contiennent l’enzyme N-acétyl-β-D-Galactosaminidase, qui agit sur le
substrat 4-méthylumbelliféril-N-acétyl-β-D-Galactosaminide (MUGal), formant le 4-
métylumbeliférone reconnaissable à sa fluorescence à la lumière UV (366 nm) .

c)Culture en milieux chromogéniques.

Ces milieux, auxquels sont ajoutés des substances chromogènes, confèrent aux
colonies qui s’y développent une coloration particulière, variable en fonction de
l’espèce. Cette coloration est dans la plupart des cas fondée sur la mise en évidence
d’une activité de type hexosaminidase (N-acétyl-β-D-galactosaminidase). La
multiplication des bactéries est également inhibée sur ces milieux.

d) CAPSULE
culture de la levure en milieu gélosé riche en extrait organique(sérum de
bœuf, cérébrinine) ; Encre de chine - Levure ronde avec capsule : Cryptococcus,
possiblement C. neoformans/gattii
e) Etude des caractères physiologiques.

f) Tests métaboliques.
Trois tests sont actuellement commercialisés pour la détection de C.
albicans : MUREX C. albicans (Murex Diagnostics), Albicans-Sure (Clinicat Standards
Laboratories) et BactiCard Candida (Remel).

35
 Ces trois tests se basent sur le fait que la double-activité β-
Galactosaminidase et L-proline aminopeptidase n’est rencontrée que chez C.
albicans. Les autres espèces peuvent présenter l’une ou l’autre de ces activités mais
jamais les deux associées. Ces trois tests présentent une sensibilité et une spécificité
comprise entre 98,7% et 100%.

g) -Identification moléculaire des levures : se base sur l’extraction de

l’ADNr 18S, purification, amplification par PCR séquençage puis identification bio-
informatiques.

h) techniques immunologiques

i)

36
 2-4-3-IDENTIFICATION DES MOISISSURES

2-4-3-1-CARTE D’IDENTITÉ
N°
ORIGINE : sol ; eau, aliment, liquide ou substrat organique etc.
ISOLEMENT : technique ; milieu ; Température ; pH, humidité

CARACTERES CULTURAUX ET STRUCTURAUX :

Aspects macro et microscopiques et vitesse de croissance
(photographiés) à différent stades de développement :
-milieux ; pigmentation ;
-températures (minimale, optimale, maximale);
-pH (minimum, optimum, et maximum);
-Saturation en eau de l’atmosphère d’incubation.
-CARACTERES METABOLIQUES
-hydrolases extracellulaires (produits phénoliques, protéines, cellulose,
lignine, hydrocarbures, sucres, colorants)
-CARACTERES IMMUNOLOGIQUES
-CARACTERES MOLECULAIRES
37
 -ANTIBIOGRAMME

2-4-3-2-Quelques milieux d’identification des moisissures

-Gélose Sabouraud glucose modifiée : Milieu de repiquage et

d’identification.
- Gélose pomme de terre glucose : Milieu de repiquage et d’identification,
favorise la sporulation et la production de pigments (ex.T. rubrum)
-Gélose cerveau-cœur (BHI) Gélose cerveau-cœur + 10 % sang de
mouton Conversion des champignons dimorphes (Histoplasma, Blastomyces,
Sporothrix)

2-4-3-3-techniques immunologiques (kits pour tests cliniques)

ELI.HA Aspergillus
ELI.HA Toxo - Test d'hémagglutination indirecte pour le sérodiagnostic de
la toxoplasmose
ELI.HA Kit
Segment de marché : Mycologie, tests de sérologie, microbiologie,
infections fongiques
Test d'hémagglutination indirecte pour sérodiagnostic d’aspergillose.
ELI.HA Aspergillus permet la détermination quantitative, par
hémagglutination indirecte, des anticorps sériques présents chez des patients
souffrant d'aspergillose (Aspergillus fumigatus).
Réactifs Liquides prêts à l'emploi

Test Rentable
Haute sensibilité et spécificité
Des résultats rapides pour les cliniciens (2 heures)
Lecture visuelle simple, sans interprétation d'experts

38
 III-LES BACTERIES DU SOL
Les groupes les plus représentés dans le sol sont :

ordre des
Pseudomonodales
-les Eubactériales ( eubactéries)
ordre des
Eubactériales
-les Chlamydobactériales (bactéries filamenteuses ferrugineuses);
-les Beggiatoales( bactéries sulfureuses filamenteuses);
-les Myxobactériales.

3-1- EUBACTERIES

3-1-1- LES EUBACTERIES PSEUDOMONODALES

Rhodospirillum rubrum ;utilisées dans les procédés de traitement des

eaux usées, pour la production de biomasse comme source d'aliments pour
animaux ou d'engrais agricoles, et la production d'hydrogène moléculaire par
évolution de la nitrogénase. Ils peuvent également être utilisés comme source de
systèmes sans cellule réalisant la photosynthèse et la formation d'ATP, ainsi que
pour la production de vitamines et d'autres molécules organiques

R. rubrum est également une bactérie fixant de l'azote ,

R. rubrum a plusieurs utilisations potentielles en biotechnologie :
• Accumulation quantitative de précurseurs PHB (poly-hydroxy-butrique-
acide) dans la cellule pour la production de plastique biologique
• La production du combustible à hydrogène biologiqu
• Système de modèle pour étudier la conversion de l' énergie
lumineuse à l' énergie chimique et des voies de régulation de la fixation de
l' azote du système.

PSEUDOMONODALES CHIMIO-LITHOTROPHES (exemple)

Les bactéries Methanomonas sont les seules qui peuvent utiliser le

méthane comme source d'énergie. Ces bactéries sont produites dans une culture
immergée dans une solution aqueuse de sels minéraux et une source d'azote

39
(ammoniac ou urée). La biomasse séchée obtenue contient environ 70-80% de
protéines qui peuvent être utilisées comme aliment.
•Hydrogenomonas/ capables d'oxyder l'hydrogène pour former de l'eau et
d'utiliser le dioxyde de carbone comme source de carbone pour la croissance
•Thiobacillus: utilisé dans la biolixiviation du cuivre
•Nitrsomonas Cette bactérie est capable de dégrader des composés
organiques aromatiques2 ou halogénés (comme le trichloréthylèneClCH=CCl2,
le chlorobenzène C6H5Cl et le chlorure de vinyle ClCH=CH2 3 ), ce qui pourrait être
utile à des fins de bioremédiation des environnements pollués. Plus précisément,
elle catalyse la première étape de la conversion de l'ammoniac en nitrates, de sorte
qu'elle intervient dans le traitement des eaux usées et des déchets industriels. Elle
serait responsable d'une part importante de la production mondiale de protoxyde
d'azote (oxyde nitreux N2O) et produit également de l'acide nitrique HNO3, ce qui
peut favoriser la solvatation des pierres et matériaux de construction de certains
monuments et bâtiments.
•Caulobacter crecentus
Non pathogène
-forte expression de la protéine Rasa, il a été utilisé pour exprimer et
assembler des protéines étrangères à des concentrations élevées.
-dans la thérapie de cancer, le microbicide anti-VIH, les vaccins de
cellules entières (contre Pseudomonas aeruginoa).
-le type sauvage C. crescentus a également été montré pour avoir des
propriétés immunostimulantes [5] et peut également être utilisé comme agent
prophylactique

Ferrobacteria (ou ferrobactéries

Sphaerotilus, Crenothrix, Clonothrix, Siderococcus, Siderosphaera, Nau
maniella et Gallionella. Certaines de ces bactéries peuvent pulluler dans des eaux
industrielles très polluées1. Avec les mangano-bactéries et d'autres bactéries
productrices de biofilms, elles peuvent contribuer, en présence d'ion Cl- à une
corrosion (biocorrosion) accélérée de certains tuyaux ou matériaux, mème en inox

-déferrisation biologique
Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus
En immobilisant les bactéries sur un support. Pseudomonas et
Staphylococcus ont montré un pouvoir dépolluant du benzène.

40
 3-1-2-ORDRE DES EUBACTERIALES

Cellules sphériques ou en bâtonnets droits ; lorsqu’elles sont mobiles,

elles sont dotées de flagelles périt riches ; pas de pigments photosynthétique ;
prennent facilement les colorants d’aniline ; ne sont pas acido-résistantes.

Azotobacter, Beijerinckia, DerxiaRhizobium ;Chromobacterium;

Agrobacterium
Sont très demandés et commercialisés comme fertilisants
Escherichia coli
Production et utilisation commerciale :Escherichia coli est très utilisée
pour sa capacité à produire l'enzyme de restriction EcoRI.
E. coli est également utilisée pour produire de l'acide succinique à partir
de sucres et résidus lignocellulosiques fermentés en atmosphère enrichie en
CO2L'acide succinique est notamment utilisé comme excipient dans les vaccins
Micrococcus luteus
Les caractéristiques de la souche ATCC 4698 de Micrococcus luteus
permettent son utilisation dans plusieurs applications, notamment la
biorestauration, la biodégradation, le traitement des eaux usées, le nettoyage et le
dégraissage des canalisations, la stimulation de la croissance des plantes et des
poissons, le traitement de la peau ainsi que la production d'enzymes et
d'antibiotiques.
Proteus spp dans les milieux naturels.
Dépollution des sols contaminés par les métaux lourds et les substances
toxiques.
Serracia marcescens
Utilisée pour la production des chitinases qui hydrolysent la chitine en
2H.D’autres souches de Serracia Serracia produisent la serrapeptase qui a plusieurs
effets sur la santé humaine.
Corynebacterium
41
 Des souches de C. glutamicum sont capables de co-fermenter la
cellobiose et le xylose.
De souches recombinantes de C. glutamicum sont utilisées pour une
conversion efficace de la biomasse lignocellulosique pour produire des produits
chimiques et des carburants à valeur ajoutée.
Bacillus pasteurii
Est utilisé pour transformer du sable en ciment :. Des chercheurs
américains ont eu l'idée de s'en servir pour solidifier un sol trop meuble. Voilà de
quoi protéger des bâtiments contre les effets d'un séisme.
Arthrobacter
Arthrobacter arilaitensis est utilisé dans la maturation et la coloration des
fromages à pâte cuite.
Bacillus subtilis
Utilisation de Bacillus subtilis GA1 pour la lutte contre les germes
d’altération de la mangue
3-1-3-LES PRINCIPALES FONCTIONS DES EUBACTERIES DU SOL

3-1-3-1-Photosynthèse
(Production de l’énergie par utilisation des radiations lumineuses)
CO2 + 2H2O CH2O + H20 + O2 ; les bactéries photosynthétiques ne
produisent pas d’oxygène) :

ex : -Thiorhodacées (eubactéries anaérobies strictes, sulfureuses,

pourpres utilisant les sulfures comme donneurs d’électrons : Thiobacillus,
Chromatium ayant la bactériochlorophylle)

-Chlorobactériacées (eubactéries anaérobies strictes, sulfureuses,

vertes : Chlorobium ayant la chlorophylle chlorobium)
L’oxydation du soufre s’effectue en deux étapes :
CO2+ 2H2S lumière CH2O + H2O + 2S
CO2 + 2S + 5H2O lumière 3(CH2O) +4H+ + 2SO4--

42
 313-2-) Déroulement du cycle de carbone:
Organisation du carbone, décomposition des substrats organiques : les
glucides, les substances aromatiques, et constituants hydrophobes ; (Amilolyse,
pectinolyse, hémicellulolyse, cellulolyse aérobie et anaérobie, etc.).

313-3) Déroulement du cycle du soufre :

Minéralisation du soufre organique, immobilisation du soufre minérale,
Oxydation des composés minéraux du soufre ou sulfooxydation, la
réduction des composés minéraux du soufre
313-4- Déroulement du cycle de fer :
Minéralisation des complexes organo-ferriques, réduction, solubilisation,
et précipitation du fer.

3135-5-déroulement du cycle d’azote

Fixation d’azote en aérobiose et anaérobiose ; protéolyse ;

ammonification ; nitrification ; et dénitrification.

313-6) Transformation du phosphore :

Solubilisation des phosphates, minéralisation du phosphore organique,
immobilisation du phosphore minéral.
313-7) Transformation du potassium et du manganèse.
313-8) Humification et déshumification.
4-9) Modification de la composition de l’atmosphère du sol et du
potentiel d’oxydo-réduction.
43
 313-9) genèse et dégradation de la structure
313-10) Interactions microflore-microflore ; microflore-végétation et
microflore-faune.

3-2-CHLAMYDOBACTERIALES
-ressemblent aux eubactéries mais diffèrent par la présence d’une gaine
à paroi lisse qui entoure les cellules en chaine. Cette gaine se colore en jaune
rouille sous l’influence de l’oxydation du fer ferreux contenu dans le milieu. Les
chlamydobactériales sont des ferrobactéries (oxydent le fer ferrique en fer
ferreux) et ont la même physiologie et écologie que les caulobactériacées et les
sidérocapsacées (eubactéries pseudomonodales ferrugineux). On les trouve
essentiellement dans certaines sources, dans les bous des marais et d’étang. Les
familles représentant ce groupe sont :
-les Chlamydobactériacées qui ressemblent à des algues. les principaux
genres sont : Leptothrix, Sphaerotilus et Toxothrix.

- Les Crénothrichacées qui sont proches des chlamydobactériacées mais

diffèrent par l ’absence de mobilité des conidies. Les principaux genres sont :
Crenothrix et Clonothrix.

3-3-BEGGIATOALES
Sont des bactéries sulfureuses filamenteuses mobiles par glissement et
ressemblent aux algues(Cyanophycées), mais diffèrent par l’absence de pigments.
Elles sont souvent associées avec les chlamydobactériales et oxydent les formes
réduites du soufre en soufre élémentaire puis en sulfate.

3-4-MYXOBACTERIALES
Ce sont des bactéries qui ont de grandes similitudes avec les eubactéries,
mais se distinguent par l’absence de flagelles. Elles sont mobiles par reptation au
contact des surfaces solides et sont répartie en deux groupes :

-Myxobactéries avec fructification et cellules de repos :

Les cellules de ce groupe sont indépendantes pendant la phase
végétative. Au vieillissement, elles s’associent en microkyste qui est une forme de
fructification. Les genres les plus connus sont : Myxococcus, Chondrococcus,
Archangium, Polyangium, Sorangium.
44
 -Myxobactéries ne possédant ni fructification ni cellules de repos :
Elles sont cellulolytiques et chitinolytiques. Le genre le plus connu est
Cytophaga.
Grâce à leur caractère bactériolytique et mycolytique, Les myxobactéries
sont surtout abondant dans les excréments animaux, les cyanophages sont plutôt
présent dans les substratums riches en cellulose. Dans le sol, la densité des
myxobactéries est de l’ordre de 2000 à 100 000.

3-5-LES ACTINOMYCETES

3-5-1-caractéristiques
Les actinomycètes sont des bactéries filamenteuses gram positives. Avec
les champignons elles présentent une convergence de forme (Structure mycélienne)
plutôt qu’une parenté génétique. Elles sont caractérisées par :
•-une morphologie d’allure bactérienne des fragments issus de la
segmentation quand elle a lieu ;
•- une morphologie typiquement bactérienne chez les formes simples
(Mycobacteriacées) ;
•Sensibilité aux attaques virales ;
•Structure interne procaryotique ;
•Reproduction par fragmentation, production de conidies par division
des extrémités des hyphes, et, production de sporanges ;
•Mycéliums de 0,2 à 1,2µ de diamètre, ramifiés, émettant des filaments
aériens et des conidies ;
•Absence de turbidité dans les milieux de culture liquides ;
•Croissance cubique ;
•-Présence dans les sols sous tous les climats et sur tous les résidus ; avec
des densités allant de 105 à 108 ;

45
 •-Aptitude à dégrader les substances organiques non biodégradables par
les champignons et les bactéries ;

•-Aptitude à produire des substances probiotiques ( vitamines B1 ,B2, B6,

B12, biotine, acide folique), antibiotiques (streptomycine, chlorotétracycline,
oxytétracycline, cyclohéximide) et toxiques ou stimulantes des plantes;

•-Intervention dans le processus d’humification par production de

composés à noyau aromatique similaires aux acides humiques doués d’une capacité
d’échange et constituant des précurseurs des acides humiques et fulviques ;
3-5-2-Classification

•
IV-LES CHAMPIGNONS

4-1-GÉNÉRALITÉS :
-Ce sont des thallophytes hétérotrophes, eucaryotes, appareil végétatif
souvent filamenteux (mycélium plurinucléé, pourvu ou non de cloisons
transversales incomplètes) ;

4-2-LES PRINCIPALES SUBDIVISIONS DES CHAMPIGNONS

b)-Les Chytridiomycota : Archimycètes
Ont une structure simple avec deux types de thalles :

46
 -sous forme de vésicule portant un bouquet de rhizoïdes(Chytridiales).
d) les Eumycota
Champignons vrais caractérisés par la présence d’un mycélium vrai à
membrane renfermant de la chitine et non de la cellulose, et par l’absence d’organes
reproducteurs flagellés. Ils comportent :
-les Zygomycètes (mycélium cénocytique produisant des sporanges,
copulation de deux articles plurinucléés produit des œufs, ex : Mucor mucedo,
Absidia cylindrospora, Mortierella polycephala),

4-3-ETAT DES CHAMPIGNONS DANS LE SOL

a)mycéliums :
*Se trouvent solitaires ou groupés( cordonnets = cynnémas
rhizomorphes);
b) fructifications :
Rarement observables dans les sols et se localisent dans les interstis et
sont en relation avec les débris organiques ;
*les micro conidies sont libérées par destruction du thalle et dispersées
par les mouvements de la méso-faune et de l’eau de pluie.
*les spores :- organes de propagation vivables quelques minutes
(zoospores des oomycètes), quelques jours (sporangiospores des mucorales et les
conidies de quelques champignons imparfaits);
c) organes de conservation : zoosporanges (de Pithium mamillatum:10
ans), chlamydospores, sclérotes( organes volumineux riches en réserves, entouré
d’un cortex noir et résistant), bulbilles ( petits massifs noirs, de forme variable
composées de cellules épaissies et sombres.

4-4- COLONISATION DES SOLS PAR LES CHAMPIGNONS

- Les Penicillium envahissent des particules organiques par les hyphes et
produisent des conidies sans s’étendre au sol voisin ;

4-5- REPARTITION DES CHAMPIGNONS DANS LES SOLS

47
 4-6-1-Oomycètes : dans les sols lourds, dans les terres cultivées, à pH
élevé, les Pythium : sous gazon et cultures maraichères et P.intermedium principal
habitant du sol.

4-6-2-Zygomycètes : dans les sols riches en matière organique fraiche,

dans les horizons superficiels des forêts ; des steppes ; des prairies ; des tourbières ;
des marécages et dans les sables du Sahara pendant la période pluvieuse.
Ces champignons exigent de l’azote organique facilement assimilable, et
des glucides simples pour se développer. Certaines espèces sont capables
d’attaquer l’amidon et des hémicelluloses, d’autres se développent en anaérobiose
et fermentent les sucres. Leur nombre est élevé dans les déjections des rongeurs,
des cervidés et des équidés.
Les genres Mucor, Mortierella, et Zygorhynchus sont présents dans les
sols des zones tempérées.
-Mortierella alpina exige des pH relativement élevés ; M.ramanniana
est répandu dans les sols forestiers acides, sous résineux et sous feuillus, les
Mortierella sont aussi présents dans les profondeurs des sols.
-Rhizopus : répandus dans les régions tempérées, fréquents sous les
tropiques.
-Cuninghamella et choanephora sont thermophiles, et sont signalés
dans les sols des régions tropicales et subtropicales.
-Sphériales (surtout les Mélanosporacées) : sous végétation
herbacée (steppe), sous jachère, et dans les sols cultivés des domaines tropicaux et
tempérés.

-Les Penicillium se trouvent dans tous les sols surtout vierges. Certains
produisent des antibiotiques, d’autres excrètent des substances toxiques pour les
végétaux supérieurs. Ce sont des humificateurs, des minéralisateurs des
monosaccharides, des disaccharides et d’amidon. Certaines espèces dégradent la
cellulose et utilisent l’azote des sels minéraux azotés et des acides humiques.

-Les Aspergillus sont souvent xérothermophile et sont abondants dans

les sols cultivés ( A. fumigatus, A. terreus, A. flavus, A. niger) . Certaines espèces
dégradent les tanins. La dominance d’Aspergillus dans une population est un
indicateur d’un climat ou d’un microclimat.

- Les Fusarium : parasites ou épiphytes des racines des végétaux

supérieurs. Saprophytes sur la matière organique incomplètement humifiée. Un
48
grand nombre est cellulolytique ( F.culmarum est le premier colonisateur de paille
de blé). On les rencontre dans les matériaux lignifiés (branches); dans la rhizosphère
de nombreuses plantes cultivées et dans les organes herbacés en décomposition.
Ils sont plus fréquents sous prairies et dans les sols cultivés que dans les sols des
forêts.

-LES BASIDIOMYCÈTES
se trouvent dans les litières, dans les bois pourrissants, et dans les racines
des arbres et des herbes.
Certains sont mycorrhiziens (Amanites, Russules, Bolets), d’autres sont
parasites des racines (Armilariella, Rhizoctone, Unglunia annosa). Marasmes,
Mycènes, Collibies, et Aphylophorales sont saprophytes et ont un fort pouvoir
cellulolytique ligninolytique, et déshumificateur. Certaines espèces sont seulement
cellulolytiques.

4-6-LES LEVURES

4-6-1- GENERALITES
Les levures sont abondantes dans les vergers ; les vignobles ; les sols
riches en matière organique fraiche et peu décomposée ; dans les litières
forestières ; et dans la rhizosphère des plantes cultivées ; sauf celle d’avoine qui est
inhibitrice. Leur diversité est contrôlée par les caractéristiques des sols. Un apport
de source d’azote les défavorise. Certaines levures sont stimulées quand les plantes
sont au maximum de croissance.
Les levures peuvent utiliser les nitrates et les sucres simples. Elles sont
incapables de dégrader les glucides complexes, sauf exceptionnellement, la pectine.
Les Lipomyces sont exclusivement telluriques et sont présentes dans tous
les sols. Ils s’associent aux bactéries fixatrices d’azote vis-à-vis desquelles elles
exercent un effet stimulant. Elles sont favorisées par les acides humiques, et
dégradent plus de carbone organique en présence de faibles doses d’azote dans le
sol. Leur croissance est stimulée par les débris organiques fournis par les cultures
vieillissantes.

Les Sporobolomyces roses et les Bullaria incolores sont phyllosphériques.

Leur présence dans le sol est le fait de lessivage des fruits et des feuilles. Elles ne
sont pas permanentes dans les sols.
La majorité des levures telluriques se multiplient par bourgeonnement
(Candida, Cryptococcus, Rhodotorrula, Torulopsis, Trichosporon.
49
5-2-CLASSIFICATION

4-7-REPARTITION DES LEVURES DANS LES SOLS(exemple)

V- LES ALGUES

5-1- GENERALITES

50
 Ce sont des thallophytes, pour la plus part aquatiques. Certaines sont
exclusivement terrestre et se trouvent dans tous les sols. Ce sont des productrices
de substances organiques. Leur rôle est primordial dans les premières étapes de la
pédogénèse. Leur densité varie de 20 à 1000kg/Hare.
Les algues se trouvent à la surface des sols et à des profondeurs dépassant
1m en association avec des bactéries.
La pluviosité, le régime des pluies, et le niveau de la nappe, agissent sur
l’intensité de croissance et sur la composition spécifique algale : certaines espèces
ont des exigences à l’eau, d’autres supportent bien la dessiccation.
Les algues sont stimulées par le K, Ca, P, et Na et des traces de Co. L’azote
minéral est sans effet.
Certaines algues exigent des acides organiques pour se développer, mais
la fumure organique est inhibitrice.
La diversité algale est plus importante dans les sols normaux que dans les
sols salins.
L’hiver des zones tempérés et arctiques entraine la diminution des
individus(le froid entraine la déshydratation des algues)
Les algues sont peu sensibles aux variations de pH (3.7 à 13).

Des cyanobactéries : Arthrospira (spirulines), algues vertes comme les

chlorelles, sont vendues comme complément alimentaire riche en protéines et en
vitamines.
Les algues vertes produisent des lipides à partir desquels on envisage
d'obtenir des biocarburants.
Marées vertes ». Certaines microalgues sont extrêmement toxiques et
peuvent avoir des effets fâcheux sur la conchyliculture (élevage des coquillages) ou
la consommation d'eau. Leur présence doit donc être contrôlée pour des raisons de
santé publique. Certaines saprophytes émettent en quantité significative un
composé volatile : le diméthylsulfure. Ce composé s'oxyde dans l'atmosphère
jusqu'à se transformer en acide sulfurique pouvant être à l'origine de pluies acides.
D'autres algues qui ont des représentants fossiles abondants, comme les
dinophytes, sont utilisées comme marqueurs stratigraphiques.
L'emploi traditionnel des macroalgues comme engrais riche en éléments
minéraux est encore pratiqué localement ; c'est un engrais qui présente l'avantage
de se décomposer lentement et donc de libérer progressivement ses éléments
fertilisants.

51
 5-2 -REPARTITION DES ALGUES DANS LES SOLS

La composition qualitative de la phycoflore, son abondance, l’équilibre

entre les groupes systématiques et l’identité des espèces dominantes, sont des
indices précieux pour la caractérisation des types pédologiques.

Les chlorophycées : sous climat tempéré, sols acides et frais, et sous

couvert forestier (podzols, sols hydromorphes).
Les cyanophycées :
- dans les sols des régions chaudes en milieux submergés (rizières),
- steppes (grandes plaines herbeuses ; sols châtains, chernozems:terre
noir riche en humus; et solonetz:argileux riche en sodium),
- dans les déserts et semi-désert ( entisols, aridisols),
- dans les déserts du froid, en Alaska,
- dans l’antarctique : continent blanc (Microcoleus, Nostoc).

Les xanthophycées se répartissent de la même manière que les

chlorophycées, mais en quantité moindre.
Les diatomées : rares dans les zones arides(précipitations inférieures à
l'évapotranspiration potentielle) et les sols hydromorphes(montre des marques
physiques d'une saturation régulière en eau).

5-3-ROLE DES ALGUES DANS LES SOLS

Alcalinisation des milieux par assimilation de CO2 atmosphérique et d’N
combiné des pluies et des poussières.
Hydrolyse des roches et naissance de la vie.
Equilibre biologique des sols, production d’enzymes et d’auxines,
inhibition de la microflore.

VI- LES PROTOZOAIRES

6-1 -GENERALITES
Ce sont des protistes eucaryotes unicellulaires et mobiles non
photosynthétiques, à l’exception des Phytomastigaphora (surtout Euglena à rôle

52
limité dans le sol). Les protozoaires sont dépourvus de chlorophylle. Leur cycle de
vie comporte deux phases :
-une phase d’activité pendant laquelle ils se déplacent, se nourrissent et
se reproduisent ;
-une phase de repos pendant laquelle ils s’enkystent et deviennent
inactifs
Les groupes flagellés et quelques ciliés sont saprophytes et se nourrissent
de substances organiques solubles diffusant à travers le cytoplasme.
Les protozoaires ciliés se nourrissent par ingestion des particules solides
et d’autres microorganismes (bactéries, levures, algues, et d’autres protozoaires).
Une augmentation de la densité bactérienne dans un sol est souvent
accompagnée de l’accroissement de la densité des protozoaires holozoiques.
-la réduction de la biomasse des protozoaires dans les sols est en partie
provoquée par l’augmentation de la biomasse fongique.

6-2-CLASSIFICATION DES PROTOZOAIRES TELLURIQUES

Les protozoaires sont présents dans tous les sols humides. Leur densité
diminue dans les sols secs, sahariens, et les lithosols (sols pauvres en strate).
53
 Les acidiphiles, les basiphiles, et les neutrophiles occupent
respectivement les sols acides, basiques, et neutres.
Les protozoaires sont généralement abondants dans la couche
superficielle (15cm) du sol (riche en bactéries et aérée),

6-3 -REPARTITION DANS LES SOLS

Les protozoaires sont présents dans tous les sols humides. Leur densité
diminue dans les sols secs, sahariens, et les lithosols (sols pauvres en strate).
Les acidiphiles, les basiphiles, et les neutrophiles occupent
respectivement les sols acides, basiques, et neutres.
Les protozoaires sont généralement abondants dans la couche
superficielle (15cm) du sol (riche en bactéries et aérée),

6-4-ROLE DES PROTOZOAIRES DANS LE SOL

- Les protozoaires libres participent à l'épuration des milieux, dépolluent
les eaux en surface, fixent l'azote aux sols, et consomment les microbes de plus
petite taille (400000 bactéries/ division cellulaire).
Bénéfiques (vie en symbiose)
Trichonympha (Trichonympha grandis) qui vit dans le tube digestif des
termites participe à la digestion du bois ingéré grâce à son activité enzymatique.
-action sur la rhizosphère :
L’augmentation et la diminution du nombre des protozoaires agit
indirectement sur l’atmosphère de la rhizosphère ;
L’action directe sur la rhizosphère est le fait de la production par Certains
protozoaires, de substances qui agissent sur les plantes supérieures.
-dissémination des spores fongiques
Les amibes peuvent déplacer les spores fongiques de 2cm, en 24h.

VII-LES VIRUS

7-1- GENERALITES
-entités biologiques constituées d’une protéine et d’un acide nucléique
(ADN ou ARN), sub-microscopiques (10 à 100mµ);
-ne contiennent ni lipides ni polysaccharides à l’exception des virus
animaux qui incorporent ces éléments en provenance de la cellule hôte ;
-parasites intracellulaires stricts ;
-incapable de produire de l’ATP ;
54
 -se reproduisent à partir du matériel génétique ;
-la synthèse de leurs constituants se fait indépendamment des cellules
mères ;

-Bien que le virus puisse contenir une ou plusieurs enzymes, son

équipement enzymatique reste insuffisant pour reproduire un autre virion ;
-le virus ne nait jamais directement d’un virion préexistant ;
-la croissance du virus implique la synthèse indépendante de son acide
nucléique et de sa protéine qui sont assemblés en une structure organisée après
leur synthèse.

7-2 -LES VIRUS DU SOL

Ce sont des bactériophages (attaquent les Azotobacter, Rhizobium,
Aerobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, et Pseudomonas), des acridophages, et
des cyanophages.
Ils n’attaquent pas généralement les champignons, les levures et les
algues, excepté, les cyanophycées.

VIII- SEQUENCES MICROBIENNES DES SOLS

8-1-Exemple : séquences fongiques des feuilles mortes en dégradation

55
8-2- PARAMETRES REGISSANT LES SEQUENCES MICROBIENNES

8-2-1- Caractéristiques physico-chimiques de la source trophique.

Exemple : Feuilles de Populus euramericana

56
57
8-3- MECANISMES REGISSANT LES SEQUENCES MICROBIENNES

8-3-1- interactions: synergisme, antagonisme

SYNERGISME
Association qui va du commensalisme à la symbiose nutritionnelle.

-la symbiose:

58
 Exemple : -symbiose lichéneuse (algue + champignon);
-la thiobactérie Chromatium vinosum vie et se multiplie dans
le protozoaire Spirostomum teres.

-le commensalisme : un individu tire bénéfice d’un autre:

Exemple : association Azotobacter et Corynebactéries cellulolytiques,
Saccharomyces cerevisiae (synthèse de la niacine) et Proteus
vulgaris

- la compétitivité

-compétitivité saprophytique (fixation d’une limite au nombre d’espèce

dans une communauté)

-compétitivité interférentielle (barrage de l’accès à une ressource

trophique) est une compétition forte. Elle se fait par la création, par une
communauté microbienne donnée, de conditions (pH, toxines etc.) défavorisant
l’installation de certaines espèces.

-compétition d‘exploitation (co-utilisation d’une ressource sans

interaction directe) qui est une compétition faible.

59