TEKNIK ISOLASI DNA GENOM TANAMAN

PEPAYADAN JERUKDENGAN
MENGGUNAKAN MODIFIKASI
BUFFERCTAB

Kelompok 2 :
Megananda Kory R.
Mega Pramesti
M . Agil Nur Hidayat
Nabila Chalisya Ilyas
Novia Noor R.
OUTLINE

1. PENDAHULUAN
2. TUJUAN PERCOBAAN
3. ALATDANBAHAN
4. TEKNIK ISOLASIDNA
5. HASILDANPEMBAHASAN
6. KESIMPULAN
PENDAHULUAN

Isolasi DNA adalah metode untuk mendapatkan asam

deoksiribonukleat dari suatu makhluk hidup.

Menurut Wilson, Keith and John, (2010) Isolasi DNA

merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau
dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan
murni kandungannya.
PENDAHULUAN

Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi

merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi
molekuler, terutama dalam pencandraan sidik jari DNA. Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang
umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang
banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol
(Lumaret et al. 1998; Jose dan Usha2000).

Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Pemuliaan Balai

Penelitian Tanaman Buah Tropika (Balitbu Tropika), Solok Buletin
Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16 pada bulan
September-Desember 2006.
Prinsip isolasi DNA :
Prinsip dasar DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan
mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang
terdiri dari DNA, RNA, dan substansi dasar lainnya.
Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel
(lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA(Nicholl 1993; Surzycki2000).

Pemisahan
Lisis dinding Pemurnian
DNA dari
sel DNA
bahan padat
TUJUANPERCOBAAN

Percobaan bertujuan untuk mendapatkan teknik isolasi

DNA berkualitas tinggi dari daun pepaya dan jeruk
tanpa menggunakan nitrogen cair.
 Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan
• Contoh daun muda tanaman pepaya
dan jeruk yang diperoleh dari Kebun
Percobaan Sumani, Balitbu Tropika
• PuRe TaqTM Ready To-GoTM
berbentuk butiran (Kit) (GE
Healthcare)
• Primer RAPD 1-6 yang mempunyai
untaian nukleotida RAPD1, RAPD2,
RAPD3,RAPD4,RAPD5, RAPD6
• Lambda (λ) DNA
• 1 kb DNAladder
 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan

• timbangan • mortar dan

analitik pestel
• microwave • Spatula
oven • Gunting
• lemari es dan • pipet ukur
freezer • pipet mikro
• perangkat • pH meter
elektroforesis
• tabung
• vortex mixer mikrosentrifus
• mesin PCR
(Mastercycler) • sarung tangan
karet.
• Waterbath
• sentrifus
(Prymo R)
• gelas ukur 100
ml
• botol bufer
(Scaatt Duran)
Tahapan Isolasi DNA

Persiapan
Sampel

• Ekstraksi DNAGenom
• Kuantifikasi DNA
Menggunakan
Teknik Isolasi Elektroforesis
DNAGenom • Pewarnaan dan
Visualisasi Hasil

• Amplifikasi
Prosedur DNAGenom
RAPD-PCR • Gel
Elektroforesis
Tahapan Isolasi DNA
A. Persiapan Sampel
1. Contoh daun muda tanaman pepaya dan jeruk
disiapkan mengikuti kaidah Santoso et al. (2003).
2. Contoh daun dipetik lalu dimasukkan ke dalam
plastik berklip ukuran 10 cm x 7 cm yang berisi 2-3
ml bufer CTABditambah 1%ß-mercaptoetanol.
3. Plastik berisi contoh lalu ditekan menggunakan
kedua telapak tangan untuk mengeluarkan udara
sehingga seluruh contoh terlindungi oleh bufer dan
menempel pada plastik.
4. Plastik berisi contoh lalu diberi label dan disimpan
dalam freezer bersuhu -20°C dan siap untuk
digunakan.
B. Teknik isolasi DNA genom
Ekstraksi DNAGenom

 Contoh daun dikeluarkan dari freezer dan ditimbang 100 mg tanpa tulang daun
lalu diletakkan dalam mortar pestel dan ditambah 0,5 ml bufer ekstraksi CTAB
(CTAB: 4,1 g NaCl, 10 g CTAB, 0,5 M EDTApH 8,0, 18,61 g disodium etilendiamin
tetra asetat 2H2 O, 1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base, 1,40 M NaCl, 29,22
g sodium khlorida, 2%PVPdan 0,20% ß-mercaptoetanol).
 Lima belas menit sebelum proses ekstraksi, bufer dipanaskan dalam waterbath
dengan suhu 65°C, lalu contoh daun yang telah ditambah bufer ekstraksi CTAB
dan PVP 0,01 g digerus hingga menjadi bubur halus sambil ditambah bufer lagi
sampai 1 ml.
 Selanjutnya bubur halus dipindahkan ke dalam tabung sentrifus ukuran 1,5ml.
 Proses lisis dinding sel dilakukan dengan menginkubasi tabung berisi contoh ke
dalam waterbath suhu 65°C selama 30-90 menit atau sampai fase padat
terpisah dari fase cair.
 Selanjutnya, tabung diangkat dari waterbath dan dibiarkan beberapa menit
sampai suhu contoh menurun.
Skema proses isolasi DNA genom
C. PROSEDURRAPD-PCR
Amplifikasi DNA Genom
Tabung PCRberisi PuRe TaqTM Ready To-GoTM berbentuk butiran (Kit)
(GE Healthcare) dilarutkan dengan ddH2O lalu ditambahkan 2,5 µl RAPD
primer dan 1 µl DNA contoh sehingga total larutan untuk tiap reaksi
menjadi 25 µl. Masing-masing tabung berisi contoh diamplifikasi dengan
pemanasan pendahuluan pada 95°C selama 5 menit sebanyak satu siklus
diikuti 45 siklus yang terdiri atas pemanasan untuk denaturasi pada 95°C
selama 1 menit, anealing pada suhu 36°C selama 1 menit, pemanjangan
pada suhu 72°C selama 2 menit, dan pada siklus terakhir ditambah waktu
pemanjangan pada suhu 72 °Cselama 10menit.

Gel Elektroforesis
Setelah proses PCR,campuran contoh dan loading dye dengan
perbandingan 3:1 dimasukkan dalam sumuran gel 1,2% dalam kamar
elektroforesis yang sudah diisi bufer TBE0,5x, diisikan satu sumuran
pertama dengan 1 Kb DNAladder. Setelah itu elektroforesis dijalankan
dengan daya 50 volts sampai penanda loading dye berada sekitar 1 cm di
atas batas gel bagian bawah.
HASILDANPEMBAHASAN
Ekstraksi DNA menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat
mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung dalam larutan
penyangga yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan
dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan
penghangatan pada suhu 65°C. Detergen seperti sodium dodecil sulfat
(SDS), sarkosil, dan CTAB dapat digunakan untuk proses lisis (Subandiyah
2006).
Penggunaan bufer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair untuk
ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang
ditunjukkan oleh pita DNA genom. Dengan demikian, bufer CTAB dapat
digunakan untuk mengisolasi DNA pada tanaman jeruk dan pepaya. Produk
ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang
terlihat tebal dan bersih bila divisualisasi menggunakan image gel
elektroforesis. Setelah proses elektroforesis DNA genom dan dihasilkan pita
DNA yang berkualitas dilanjutkan proses PCR, yaitu metode in vitro yang
secara cepat dapat melipatgandakan sekuen-sekuen DNA target yang ada di
dalam DNAsumber. Produk-produk PCRakan menjadi DNAawal. Sekitar 105
kopi dari sekuen DNA target dengan mudah dapat divisualisasikan sebagai
pita diskret dengan ukuran spesifik ketika diseparasi pada elektroforesis gel
agarose (Tridjatmiko 2006).
Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yaitu
teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada
amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang
menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya
ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya
berukuran 10 basa. PCRdilakukan pada suhu anealing yang
rendah yang memungkinkan primer menempel pada
beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer
adalah terdiri atas 1828 susunan basa dengan persentase
G+C50-60% (Tabel 1, Subandiyah 2006).
Tabel 1. Kode primer, susunan basa
dan kandungan GCpada primer

Kode primer Susunan basa primer G +C

(%)

RAPD1 GGTGCGGGAA 70
RAPD2 GTTTCGCTCC 60
RAPD3 GTAGACCCGT 60
RAPD4 AAGAGCCCGT 60
RAPD5 AACGCGCAAC 60
RAPD6 CCCGTCAGCA 70
OPW19 CAAAGCGCTC 60
KESIMPULAN DAN SARAN

Pemisahan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak,dan

karbohidrat dilakukan melalui ekstraksi. Penggunaan
nitrogen cair lebih memudahkan proses ekstraksi, namun
ekstraksi dengan bufer CTABditambah 0,2% β-
mercaptoetanol dan PVPmampu mengurangibroning.
Ekstraksi dengan bufer ini tidak memerlukan nitrogencair
dan menghasilkan DNA genom yang cukup baik. Ekstraksi
tanpa nitrogen cair lebih efisien, terutama bagi
laboratorium yang sulit mendapatkan nitrogen cair.
DAFTARPUSTAKA

• Ardiana, DW.2009. TeknikIsolasi DNA GenomTanamanPepaya dan Jeruk

denganMenggunakanModifikasi BuferCTAB. Buletin Teknik Pertanian.14(1):
12-16
• Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15.
• Santoso, P.J.2005. Modified CTAB-basedDNAisolation procedure for fruit
crops. JurnalStigma XIV(1): 1-4.
• Subandiyah, S.2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau
Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA.
Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNAdengan Aplikasi PCR.Malang.
hlm. 43- 50.
• Surzycki, S.2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, NewYork.