Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Escuela de Química Biológica Departamento de Bioquímica Dr Rubén Velasquez. Biol; PhD. Curso: Bioquímica I 1er Semestre 2020 Marian Regina Barrera Gómez 201804355 Sección B Veronica Andrea Dessire Vásquez Díaz 201804137 Sección B Sheyla María González Estrada 201804306 Sección B TÓPICO SELECTO DE BIOQUÍMICA: MOLÉCULAS DEL SARS CoV 2 Introducción Los coronavirus se encuentran ampliamente distribuidos e infectan mamíferos y aves; pueden ocasionar enfermedades respiratorias, entéricas, hepáticas y neurológicas. De acuerdo con el Comité Internacional de Taxonomía de Virus pertenece al orden Nidovirales, familia Coronaviridae, subfamilia Coronavirinae, la cual consta de cuatro géneros: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus y Deltacoronavirus. Son virus envueltos, con diámetro aproximado de 125 nm, genoma ARN de cadena simple con sentido positivo. (Aragón, Vargas, & Miranda, 2020). Existen tres Coronavirus causantes de neumonía en la especie humana desde los comienzos del siglo XXI. “Severe Acute Respiratory Syndrome” (SARS-CoV) emergió en Guangdong una provincia de China en el 2002 la cual se esparció por cinco continentes através de las rutas aéreas infectando a 8,098 personas y causando 774 muertes. En el 2012, “Middle East Respiratory Syndrome” (MERS-CoV) emergió en la Península Arabica el cual sigue siendo un problema de salud pública y se ha transmitido a 27 países infectando a más de 2,500 personas y cobrando más de 860 vidas. Recientemente SARS-CoV-2 fue descubierto en diciembre 2019 en la provincia de Wugan Hubei; siendo secuenciado y aislado en enero 2020 (Walls, y otros, 2020). Los análisis genéticos revelaron que el SARS-CoV-2 está filogenéticamente relacionado con aislados específicos de coronavirus de tipo pangolín y murciélagos; por lo tanto este virus es un evento de traspaso de un reservorio natural al ser humano (Bianchi, y otros, 2020). El 11 de marzo del 2020 SARS-CoV-2 fue considerado pandemia por la Organización Mundial de la Salud (OMS); a la fecha 16 de mayo del 2020 a las 14:00 existen 4.605.673 casos confirmados en 188 países (Gardner, 2020). Estructura general El SARS- CoV-2 es un Betacoronavirus envuelto, contiene un ARN de cadena sencilla, no segmentado en sentido positivo con nucleocápside. Posee morfología pleomórfica, habitualmente redondeada o elíptica con un diámetro de 60 y 140 nm, por lo que por su morfología se clasifica como helicoidal. Su genoma contiene 29.891 nucleótidos y codifica 9.860 aminoácidos (Oliva, 2020).Posee una sola molécula de ARN monocatenario de cadena positiva como material genético.El SARS-CoV-2 contiene espículas de glicoproteína (S) y Hemaglutinina esterasa; además posee una proteína de membrana (M), una proteína transmembrana; las proteínas de nucleocápside (N) y las proteínas de envoltura (E) se ubican en la nucleocápside y en la parte externa del virus respectivamente (Aragón, Vargas, & Miranda, 2020). Moléculas que constituyen el virus ● Glicoproteína S como componente de las espículas: La entrada de coronavirus en las células huésped está mediada por la glicoproteína de la espícula transmembrana S, que forma homotrímeros que sobresalen de la superficie del virión (Millet & Whittaker, 2014). S comprende dos unidades funcionales responsables de la unión al receptor de la célula huésped, ubicada en el extremo N-terminal (s1) y la fusión de membranas viral y celular; en el extremo C-terminal (s2). Ambas subunidades glicoproteicas permanecen unidas de forma no covalente en la conformación de perfusión (activación de la proteína de espícula mediante escisión proteolítica) (Walls, y otros, 2020). El análisis de secuencia del SARS-CoV-2 revela la presencia de una inserción de 4 residuos de aminoácidos en el límite entre las dos subunidades, no presente en otros SARS estudiados. Esto da como resultado la introducción de un sitio de inserción de furina (una enzima de anclaje para el SARS-CoV-2)(Walls, y otros, 2020). La estructura de la proteína S puede poseer dos conformaciones (abierto y cerrado) las glicoproteínas S del coronavirus están densamente decoloradas por glicanos heterogéneos unidos a N que sobresalen de la superficie del trímero (ver Figura 1). Estos oligosacáridos participan en el plegamiento de S y pueden modular el reconocimiento de anticuerpos (Walls, y otros, 2020). Figura 1. Organización de los glicanos ligados al SARS-CoV-2 S N (A – C) Diagramas de cinta de la estructura cerrada SARS-CoV-2 S representados como una superficie con glicanos resueltos en el mapa cryoEM representado como esferas de color azul oscuro. Fuente: (Walls, y otros, 2020). ● Proteína de Nucleocápside N: La proteína CoV N es una proteína de unión a ARN multifuncional necesaria durante la replicación, transcripción y modulación del metabolismo celular infectado. Sus principales funciones son la unión al genoma viral del ARN y su empaque en una estructura de nucleocápside helicoidal larga o compleja de ribonucleoproteína (RNP), además, regula las interacciones huésped patógeno como la reorganización de la actina, progresión del ciclo celular y apoptosis, por lo que se le considera altamente inmunogénica (Kang, y otros, 2020). La arquitectura de dominio para la proteína N (ver Figura 2) consiste en tres partes distintas muy conservadas: un dominio de unión ARN N-terminal (NTD), un dominio de dimerización C-terminal (CTD) y un dominio (SR) de Ser/Arg central intrínseco y de carácter enlazador (Kang, y otros, 2020). Estudios han revelado que los NTD son responsables de la unión ARN, los CTD para la oligomerización y el conector rico en (SR) para la fosforilación primaria (Kang, y otros, 2020). La proteína N del SARS-CoV-2 de 29,9 Kd presenta un genoma similar al de SARS-CoV de 27,7 Kd, y se ha demostrado en SARS-CoV que la proteína es estable a pH entre 7 y 10, con estabilidad conformacional máxima a pH 9 (Surjit & Lal, 2008). Figura 2. Descripción estructural de SARS-CoV-2 N-NTD. A Los círculos de trazos indican la estructura intercalada compuesta por la región de bucle 1, el núcleo de la lámina β y la región de bucle 2. La cadena β está marcada con β1 a β7. Fuente: (Kang, y otros, 2020). ● Proteínas de Envoltura y Membrana: El SARS-CoV-2 se encuentra además rodeado por una proteína de envoltura E y una proteína de membrana M en su bicapa lipídica , además poseen proteínas Hemaglutinina esterasa, estructuras típicas de los SARS. La proteína E es una proteína no glicosilada bien conservada entre los β-coronavirus, es un componente menor de la membrana del virus aunque se considera muy importante para muchas etapas de la infección y replicación, la proteína E difiere de la de otros coronavirus principalmente en un residuo cargado positivamente, Arg, reemplaza Glu y Gln, cargados negativamente y neutro respectivamente, en el lado C-terminal así como una deleción en la posición 70 correspondiente a Gly o Cys y un reemplazo de Ser-Phe por Thr-Val (Bianchi, y otros, 2020). Por otro lado, la proteína M es un proteína estructural transmembrana bien conservada especialmente en los SARSCoV, esta proteína interactúa con la nucleocápside, envoltura, espículas y glicoproteínas de membrana (Bianchi, y otros, 2020). La importancia de la proteína M radica en su capacidad de cooperar con las espículas durante el ataque y entrada a las células del hospedero, además es la proteína de membrana más importante (Bianchi, y otros, 2020). Figura 3. Conformación de la Proteína M. La proteína M posee una una predominante conformación alfa, los residuos de mayor importancia se encuentran señalados.Fuente: (Bianchi, y otros, 2020). ● Nucleótidos y Ácido Nucléico: El genoma final de SARS-CoV-2 secuenciado consiste en un solo ARN de cadena positiva de estructura de tapa 5’ y cola poli (A) 3’ que permite la expresión de replicasa, proteínas y además representa su material genético. Esta cadena de ARN tiene 29,811 nucleótidos de largo, desglosado de la siguiente manera: 8,903 (29.86%) adenosinas; 5,482 (18.39%) citocinas; 5,852 (19.63%) guaninas y 9,574 (32.12%) timinas , dicho resultado fue obtenido a partir de una muestra (BetaCoV/Nepal/61/2020), una prueba positiva en un paciente proveniente de Wuhan (Ranjit Sah, 2020). El SARS-CoV-2 posee además porciones de ARN subgenómicos que se usan para la síntesis de varias proteínas que se requieren para el comienzo del linaje del virus. Estas porciones de ARN del virus codifican 4 proteínas estructurales esenciales, incluida la glicoproteína espiga (S), la proteína de membrana (M) responsable del transporte transmembrana de nutrientes, liberación de la partícula viral y eventual formación de sus envoltura; las proteínas de nucleocápside (N) y las proteínas de envoltura (E) (Aragón, Vargas, & Miranda, 2020). Ciclo de reproducción del virus El ciclo (ver figura 4) comienza cuando la proteína de espiga (S) del SARS-CoV-2 se une al receptor huésped la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) la cual se encuentra expresada en los pulmones, arterias, corazón, riñones e intestino. Mientras S1 se une a ACE2; S2 se escinde aún más y es activada por la TMPRSS2 (proteasa transmembrana de serina 2 asociada a la superficie del huésped) por lo que el virus ingresa a la célula por endocitosis y fusión con las vesículas ácidas; ó alternativamente pueden fusionarse directamente con la membrana plasmática por un mecanismo dependiente de la proteasa lo que permiten la liberación de la nucleocápside y el ARN genómico en el citoplasma (Cavallaro, 2020). Los ORF1a y ORF1b están formados por ARN genómico, los cuales luego se traducen en proteínas pp1a y pp1ab, respectivamente. Estas proteínas se dividen por la proteasa para formar un total de 16 proteínas no estructurales. Algunas de ellas forman un complejo de replicación/transcripción que utiliza el ARN genómico de la cadena positiva como plantilla. El ARN genómico de la cadena positiva Figura 4. Ciclo de vida SARS-CoV-2. Representación del ciclo de vida del SARS-CoV-2 donde se visualiza la unión de la proteína S al receptor; el proceso de replicación/transcripción; la representación del aparato de golgi y el retículo endoplasmático; así como la salida del virus por exocitosis. Fuente: (Fernandez, 2020) producido a través del proceso de replicación se convierte en el genoma de la nueva partícula viral. Los ARN sub genómicos producidos a través de la transcripción se traducen a proteínas estructurales S,E,M y N que forman la partícula viral. Las proteínas S,E y M ingresan al retículo endoplásmico y la proteína N se combina con el ARN genómico de la cadena positiva para convertirse en un complejo de nucleoproteína. Se fusionan en la partícula viral completa en el aparato de golgi y retículo endoplásmico y se excretan en la región extracelular a través del aparato de Golgi y la vesícula por medio de exocitosis (Fernandez, 2020). Posibles blancos para tratamientos/vacunas Los tratamientos actuales para otros coronavirus se basan principalmente en la proteína S como objetivo, ya que es la glicoproteína encargada de mediar la entrada del coronavirus en la célula del huésped (Walls, y otros, 2020). El SARS-CoV-2 puede además utilizar la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) de murciélagos, gatos de civeta, cerdos, gatos, hurones, primates no humanos y humanos como receptor, lo que convierte a la erradicación del virus en un verdadero desafío (Amanat & Krammer, 2020). La estructura de la proteína S en la superficie del virus es un objetivo ideal para una vacuna. Tanto en SARS-CoV-1 como en SARS-CoV-2, esta proteína interactúa con el receptor ACE2 y los anticuerpos dirigidos a la espícula pueden interferir, por lo tanto, con esta unión, neutralizando así al virus. Esto quiere decir que la proteína S representa un antígeno objetivo que se puede incorporar en plataformas de vacunas avanzadas (Amanat & Krammer, 2020). Experimentos y diseños de vacunas para el SARS-CoV-1 que utilizan como blanco a la proteína muestran por lo general buenos resultados en modelos animales, sin embargo se han detectado casos en los que no inducen inmunidad esterilizante, producen complicaciones como daño pulmonar e infiltración de eosinófilos. La creación de la vacuna debe ser por lo tanto segura y superar todo estos desafíos (Amanat & Krammer, 2020). Además, la cinética de la unión del SARSCoV-2 comparada con la del SARS-CoV-1 hacia ACE2 (ver tabla 1) muestra una mayor afinidad para SARS-CoV-2, lo que indica que algunas mutaciones han hecho de esta nueva cepa tan eficiente para la transmisión y propagación, por lo tanto se requiere de una vacuna mucho más específica para el SARS-CoV-2 que supere dicha afinidad hacia ACE2 (Walls, y otros, 2020). Tabla 1. Análisis cinético de la unión de hACE 2 a SARS-CoV-2 S B y SARS-CoV S B La conservación de muchos residuos de contacto clave podría explicar las afinidades de unión similares. El resultado menor de Kd en la nueva cepa explica su mayor afinidad hacia el ACER 2 humano (Walls, y otros, 2020). Discusión En el país de Guatemala el 16 de mayo de 2020 presenta 1763 casos positivos de SARS-CoV-2 y en el mundo existen 4.605.673 casos confirmados en 188 países, en un plazo aproximado de 5 meses (Gardner, 2020). La propagación del virus de una manera exponencial es debido a su estructura molecular (National Institutes of Health, 2020). Un equipo colaborativo que incluye científicos del laboratorio del Dr. Jason McLellan en la Universidad de Texas en Austin y el Centro de Investigación de Vacunas del NIAID (VRC) aislaron una parte del genoma para ello utilizaron una técnica llamada microscopía crioelectrónica para tomar imágenes detalladas de la estructura de la proteína espiga (National Institutes of Health, 2020). De esta manera se dedujo que el ciclo de reproducción comienza cuando la proteína de espiga (S) del SARS-CoV-2 se une al receptor huésped la enzima convertidora de angiotensina 2, los científicos mencionados descubrieron que el pico del SARS-CoV-2 tenía 10 a 20 veces más probabilidades de unirse a ACE2 en las células humanas que el pico del virus del SARS de 2002; esto puede permitir que el SARS-CoV-2 se propague más fácilmente de una persona a otra que el virus anterior provocando que la cifra de casos confirmados en los países aumenten (National Institutes of Health, 2020). Existen varias etapas para el control de una pandemia, empezando con anticipación y terminando con la erradicación, pero con la cantidad de casos reportados, las únicas opciones que se promueven son la contención y la mitigación lo cual permitirá "aplanar la curva" lo cual significa ralentizar (o frenar) la propagación del SARS-CoV-2. La contención implica asegurarse de que todos los casos son identificados, controlados y aislados; y la mitigación requiere un distanciamiento social riguroso. Al realizar estas dos acciones se reducirían las infecciones, provocando que los sistemas sanitarios sean capaces de gestionar los casos de mejor manera, reduciendo la tasa de letalidad. Y si se extendiende esto en el tiempo, se llegará a un punto en el que la sociedad podrá ser vacunada, eliminando todo el riesgo a la vez. Siendo el objetivo no eliminar los contagios por coronavirus sino que posponerlos (Pueyo, 2020). Conclusiones ● El SARS-CoV-2 se propaga de una manera más fácil de una persona a otra ya que existe una probabilidad mayor de unirse a ACE2 lo cual favorece el ciclo de reproducción. ● Para controlar la pandemia de SARS-CoV-2 se promueve la contención y mitigación para lograr ralentizar la propagación, de modo que el número de casos se distribuya en el tiempo en lugar de experimentar un fuerte aumento. ● La proteína S representa un antígeno objetivo que se puede incorporar en plataformas de vacunas avanzadas. Referencias Amanat, F., & Krammer, F. (14 de Abril de 2020). SARS-CoV-2 Vaccines: Status Report. Immunity, 52(4), 583-589. doi:https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.03.007 Aragón, R., Vargas, I., & Miranda, M. (2020). COVID-19 por SARS-CoV-2: La nueva emergencia de salud. Revista Mexicana de Pediatría, 86(6), 213-218. Bianchi, M., Benvenuto, D., Giovanetti, M., Angeletti, S., Ciccozzi, M., & Pascarella, S. (9 de Mayo de 2020). 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