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EFECTOS S DE LA AS STAXANTI INA EN LA A FUNCIN N VASCULAR, REMOD DELADO CA ARDIOVAS SCULAR Y ESTRS OXIDATIV VO ASOC CIADOS A LA HIPER RTENSIN

Jos Monroy M Ruz z 2 2008

EFECTOS DE LA ASTAXANTINA EN LA FUNCIN VASCULAR, REMODELADO CARDIOVASCULAR Y ESTRS OXIDATIVO ASOCIADOS A LA HIPERTENSIN

Memoria que presenta Jos Monroy Ruz para optar al Grado de Doctor Salamanca, octubre de 2008

Fdo. Jos Monroy Ruz

FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Fisiologa y Farmacologa Campus Miguel de Unamuno 37007 Salamanca

Da. M JOS MONTERO GMEZ, Da. M NGELES SEVILLA TORAL y Da. ROSALA CARRN DE LA CALLE, Profesoras de Farmacognosia y Farmacologa, del Departamento de Fisiologa y Farmacologa, de la Universidad de Salamanca CERTIFICAN: Que la memoria titulada Efectos de la astaxantina en la funcin vascular, remodelado cardiovascular y estrs oxidativo asociados a la hipertensin., que presenta D. Jos Monroy Ruz para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Salamanca, ha sido realizada bajo su direccin en el Laboratorio de Farmacognosia y Farmacologa (Departamento de Fisiologa y Farmacologa) de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Salamanca y, considerndola finalizada, autorizan su presentacin para que sea juzgada por el tribunal correspondiente. Para que asvconste, expiden y firman la presente certificacin en Salamanca, a 23 de octubre de dos mil ocho.

Fdo. M Jos Montero

Fdo. M ngeles Sevilla

Fdo. Rosala Carr

D. RAFAEL JIMENEZ FERNNDEZ, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE FISIOLOGA Y FARMACOLOGA DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

CERTIFICA: Que la memoria titulada Efectos de la astaxantina en la funcin vascular, remodelado cardiovascular y estrs oxidativo asociados a la hipertensin., presentado por D. Jos Monroy Ruz para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Salamanca, ha sido realizada bajo la direccin conjunta de las Dras. Da. M Jos Montero Gmez, Da. M ngeles Sevilla Toral y Da. Rosala Carrn De La Calle, en el Departamento de Fisiologa y Farmacologa de la Universidad de Salamanca. Y para que as conste, expide y firma la presente certificacin en Salamanca, a 30 de octubre de dos mil ocho.

Fdo. Rafael Jimnez Fernndez

Esta Tesis Doctoral ha sido financiada con los siguientes proyectos

PROYECTO SAN/1052/SA25/05 Hipertensin y remodelado cardiovascular. Efectos beneficiosos de la astaxantina Financiado por la Junta de Castilla y Len PROYECTO SA047A06 Estrs oxidativo e hipertensin inducida por angiotensina II: Estudios de antihipertensivos que interfieren con el sistema renina-angiotensina (SRH) Financiado por la Junta de Castilla y Len

Agradecimientos

Quiero expresar mi ms sincero agradecimiento a las directoras de este trabajo, las doctoras Mara Jos Montero Gmez, Mara ngeles Sevilla Toral y Rosala Carrn de la Calle por haber puesto su inters, sus conocimientos, su paciencia en el desarrollo del mismo y en mi formacin acadmica. As como por los buenos momentos compartidos en el trabajo. A Miriam por su solidaridad constante, discreta e invaluable. Por su buena disposicin al trabajo en el da a da. Al doctor Bustelo y al doctor Sauzeau por haberme brindado la posibilidad de trabajar con los ratones Vav3-/-. Tambin quisiera agradecer el apoyo tcnico recibido por Teresa. Al mismo tiempo quiero extender mi agradecimiento a todos los integrantes del Laboratorio de Farmacognosia y Farmacologa. A los Laboratorios BASF por el suministro de la astaxantina.

Abreviaturas

AC - Adenilato ciclasa ACh - Acetilcolina Ang I - Angiotensina I Ang II - Angiotensina II bFGF - Factor de crecimiento fibroblstico bsico BH4 - Tetrahidrobiopterina Bk - Bradicinina CAT - Catalasa CMLV - Clulas del msculo liso vascular COX - Ciclooxigenasa CSAm - rea seccional de la capa media DAG - Diacilglicerol DHE - Dihidroetidio ECA - Enzima convertidora de angiotensina ECV - Enfermedad cardiovascular EDHF - Factor hiperpolarizante dependiente del endotelio EDRF - Factor relajante derivado del endotelio Emax - Efecto mximo eNOS - xido ntrico sintasa endotelial

ERN - Especies reactivas de nitrgeno ERO - Especies reactivas de oxgeno ET - Endotelina FC - Frecuencia cardiaca FE - Fenilefrina sGC - Guanilato ciclasa soluble cGMP - Guanosin 3-5-monofosfato cclico GPx - Glutatin peroxidasa GSH - Glutatin reducido GSSG - Glutatin oxidado GTP - Guanosintrifosfato HO- - Radical hidroxilo H2O2 - Perxido de hidrgeno HDL - Lipoprotenas de alta densidad HO2 - Radical perhidroxilo o hidroperxido HTA - Hipertensin arterial ICAM-1 - Molculas de adhesin intercelular 1 IFN - Interfern gamma IL - Interleucinas iNOS - xido ntrico sintasa inducible IP3 - Inositol-1,4,5-trifosfato

Abreviaturas

L - Lumen LDL - Lipoprotenas de baja densidad L-NAME - N-nitro-L-arginina metil ster MDA - Malondialdehdo MLCP - Miosina de cadena ligera MLKC - Miosina cinasa de cadena ligera NA - Noradrenalina NADPH - Nicotinamida adenindinucletido fosfato reducido NFkB - Factor nuclear o de transcripcin kappa B nNOS - xido ntrico sintasa neuronal NO - xido ntrico NTP - Nitroprusiato sdico O2- - Anin superxido ONOO- - Peroxinitritos PA - Presin arterial PAD - Presin arterial diastlica PAM - Presin arterial media PAS - Presin arterial sistlica pD2 - Logaritmo cambiado de signo de la concentracin del agonista que provoca el 50% del efecto mximo

PDGF - Factor de crecimiento derivado de las plaquetas PGH2 - Prostaglandina H2 PGI2 - Prostaciclina PKC - Protena cinasa C

ndice

ndice

Introduccin
CAROTENOIDES. REALACIN ESTRUCTURA FUNCIN 1. Generalidades 2. Astaxantina HIPERTENSIN ARTERIAL 1. Definicin y clasificacin 2. El sistema renina-angiotensina 3. Endotelio vascular y disfuncin endotelial Factores derivados del endotelio Disfuncin endotelial Especies reactivas de oxgeno Relacin entre disfuncin endotelial y antioxidantes

1 3 3 7 17 17 22 31 32 40 41 56 67 71 73

Objetivos Mtodos y Resultados

ndice

MODELO 1. RATAS SHR 1. Presin arterial sistlica, frecuencia cardiaca y peso 2. Estudios in vitro Estudios de funcionalidad: arteria aorta Estudios de funcionalidad: rin 3. Hipertrofia cardiaca 4. Morfometra en arterias 5. Produccin de anin superxido Evaluacin por quimioluminiscencia Evaluacin por fluorescencia MODELO 2. RATONES CON HIPERTENSIN INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II 1. Presin arterial sistlica 2. Estudios in vitro Estudios de funcionalidad: arteria aorta Estudios de funcionalidad: rin 3. Hipertrofia cardiaca e hipertrofia renal 4. Determinacin de colgeno 5. Produccin de anin superxido

77 78 85 85 98 106 108 116 116 120 123 124 127 127 140 145 147 150

ndice

6. Peroxidacin lipdica 7. Evaluacin de la actividad de enzimas antioxidantes MODELO 3. RATONES Vav3-/1. Presin arterial sistlica 2. Estudios in vitro Estudios de funcionalidad: aorta Estudios de funcionalidad: rin 3. Hipertrofia cardiaca 4. Hipertrofia de las glndulas suprarrenales 5. Produccin de anin superxido

152 155 163 163 167 167 175 180 182 184 187 221 225 259 261

Discusin Conclusiones Bibliografa

Introduccin 1

Introduccin

2 Introduccin

Introduccin 3

CAROTENOIDES. RELACIN ESTRUCTURA-FUNCIN 1. Generalidades Durante ms de cien aos los carotenoides han atrado la atencin de muchos investigadores en diferentes mbitos de las ciencias como la qumica, bioqumica, biologa, ciencia y tecnologa de alimentos y farmacologa, debido a sus propiedades como pigmentos naturales y a que muchos de ellos son precursores de vitamina A. Los carotenoides se distribuyen ampliamente en la naturaleza y los encontramos como pigmentos responsables de los colores rojos, amarillos y naranjas en frutos, races, flores, peces, aves y crustceos. Adems se encuentran en microorganismos como algas, hongos y levaduras. En general los carotenoides tienen un esqueleto bsico con estructura qumica simtrica lineal de 40 carbonos, construida con ocho isoprenoides de cinco carbonos cada uno. Esta estructura puede estar modificada de diversas maneras ya sea por hidrogenacin, deshidrogenacin, ciclacin, isomerizacin, etc. Se ha identificado una gran variedad de carotenoides, aquellos que poseen slo la estructura de la cadena hidrocarbonada se conocen como carotenos, mientras que los que contienen oxgeno se conocen con el nombre de xantofilas. Los grupos sustituyentes ms comunes son los grupos hidroxi (OH) y epoxi (los ms comunes 5,6 y 5,8epoxi). Los carotenoides, independientemente si son carotenos o xantofilas, pueden ser acclicos como el fitoflueno o el licopeno, o cclicos ya sea mono o bicclicos. La ciclacin puede ocurrir en cualquiera de los extremos terminales o en ambos. El caroteno es un ejemplo de carotenoide monocclico, mientras que el - y -caroteno son bicclicos al igual que la zeaxantina y la astaxantina1.

4 Introduccin

En las ltimas dcadas, los carotenoides presentes en los alimentos se han asociado a procesos biolgicos que pueden tener relevancia fisiolgica para la salud y enfermedades crnico-degenerativas. Algunas de las acciones biolgicas de los carotenoides incluyen la actividad antioxidante, comunicacin intercelular, diferenciacin celular, estimulacin del sistema inmune e inhibicin de los procesos de mutagnesis. Diversos estudios en modelos in vitro y en modelos animales in vivo, han hecho surgir una serie de hiptesis relacionadas con el papel de los carotenoides en la salud y en la enfermedad. Krinsky2 ha clasificado y descrito adecuadamente los efectos biolgicos de los carotenoides en trminos de funciones, acciones y asociaciones con la salud. La nica funcin biolgica universalmente aceptada de los carotenoides en relacin con la salud humana es su papel como precursores de vitamina A. Como es de esperar las funciones biolgicas, acciones y asociaciones de los carotenoides estn relacionadas con su estructura qumica y propiedades fisicoqumicas. Un anillo ionona sin sustituir, parte de la estructura qumica del -caroteno, -caroteno y -criptoxantina, otorga a estos carotenoides la capacidad de metabolizarse a vitamina A en los mamferos. Por otro lado, el sistema conjugado de dobles enlaces es responsable de las propiedades antioxidantes in vitro, por lo que se ha atribuido a estos compuestos un papel protector contra del estrs oxidativo asociado a las enfermedades crnico-degenerativas. Sin embargo in vivo, resulta difcil identificar un mecanismo de accin especfico y su relacin con alguna de estas enfermedades, por lo que existen vacos en el conocimiento de las funciones, acciones y asociaciones con estados patolgicos especficos. En este sentido las relaciones entre la estructura y la funcin podrn ser un punto de partida para nuevas hiptesis y usos potenciales en la salud de estos compuestos.

Introduccin 5

Se han identificado y aislado ms de 600 carotenoides diferentes de fuentes naturales3. Afortunadamente los carotenoides pueden ser considerados como un grupo en trminos de su estructura qumica bsica y de sus propiedades fsicas. Los carotenoides se sintetizan por la unin extremo-extremo de molculas de 20 carbonos de geranio-geranil difosfato, por lo que se produce un esqueleto comn de 40 carbonos a partir del cual se derivan las variaciones individuales. En la figura 1 pueden verse dos estructuras que muestran los extremos estructurales y funcionales de este grupo de compuestos.

Licopeno
HO

OH

Zeaxantina

Figura 1.- Estructura qumica de licopeno, un carotenoide acclico y de zeaxantina, un carotenoide cclico.

6 Introduccin

Tradicionalmente los carotenoides han recibido nombres triviales, usualmente de las fuentes naturales de las que se aislaron por primera vez. Esto sigue siendo una prctica comn sobre todo en la biologa aunque la IUPAC ha publicado reglas especficas4. A partir de esto se ha desarrollado una forma semisistemtica de nomenclatura donde se usa el trmino caroteno precedido de la letra griega que designa los dos grupos terminales. Debido a que muchos carotenoides tienen actividad ptica, la quiralidad se indica con el sistema convencional R-S. Algunos carotenoides tienen una estructura de menos de 40 tomos de carbono debido a la prdida del esqueleto original. Las reacciones qumicas de los grupos en los extremos de los carotenoides son importantes para la caracterizacin, derivacin y sntesis. En general, la cadena polieno es la parte ms importante en la molcula en cuanto a su reactividad con otros compuestos. Esto es debido a que es un sistema rico en electrones y susceptible de ser atacada por reactivos electroflicos. En este sentido, se puede decir que es la responsable de la inestabilidad y oxidacin de los carotenoides y es la caracterstica ms importante en relacin a las propiedades antioxidantes. En los organismos vivos los carotenoides normalmente se localizan en las membranas, donde forman parte integral de stas. El estudio del comportamiento de estas molculas en sistemas de membranas ha dado informacin acerca de la interaccin y de la orientacin de los carotenoides. Se sabe que esta ltima depende de las propiedades fisicoqumicas de la molcula. Adems, la presencia de carotenoides en las membranas ser capaz de modificar las propiedades mecnicas, la fluidez e inclusive la permeabilidad de diferentes tipos de molculas incluyendo el O2. Los carotenoides estn fuertemente estabilizados por protenas, por lo que in vivo son mucho ms estables que aquellos que son sintetizados en el laboratorio. El transporte y la funcionalidad de los carotenoides en

Introduccin 7

ambientes hidrfilos dependen de su asociacin con los dominios hidrfobos de las protenas. Las interacciones con protenas, tambin modifican las propiedades fisicoqumicas. En la interaccin de la astaxantina con protenas en los crustceos, para formar caroteno-protenas como la -crustacianina, se produce un efecto batocrmico del espectro de absorcin de la luz por una modificacin en la distribucin de la densidad electrnica, cambiando de un mximo de absorcin de 480 nm a 632 nm5Muchas de las enfermedades crnico-degenerativas, incluyendo el cncer y las enfermedades cardiovasculares, tienen en alguna etapa como factor comn procesos de oxidacin que son mediados por radicales libres. Para ser un antioxidante efectivo, una molcula debe ser capaz de retirar esos radicales ya sea reaccionando con ellos para dar productos inocuos o frenando las reacciones en cascada de los radicales libres6, aspectos que se describen ampliamente para la astaxantina ms adelante. 2. Astaxantina La astaxantina es una xantofila u oxicarotenoide (3,3-dihidroxi-, caroteno-4, 4-diona) responsable de la coloracin de los salmones, truchas, langostas, langostinos, flamencos; as como de varias especies de algas y levaduras. Histricamente este pigmento se ha obtenido de fuentes naturales, con el fin de aumentar la pigmentacin de salmnidos criados de manera intensiva, ya que la coloracin del msculo es uno de los criterios ms importantes en la calidad de estos productos que determina su valor en el mercado. Debido a que las fuentes naturales de astaxantina no aseguraban una calidad constante del pigmento, algunas empresas de importancia en el rea de la qumica intentaron la sntesis en el laboratorio. Es a partir de la mitad de la dcada de los 80 cuando se tiene disponible este producto en el mercado en dos presentaciones: una con el 5% y otra con el 10% de pigmento7. A partir del uso en la cra de peces se observan una serie de ventajas en su utilizacin, que no solamente se refieren a la coloracin de los productos, sino al rendimiento de los sistemas de

8 Introduccin

produccin donde se utilizan, ya que la mortalidad de los animales se reduce, presentan menos estrs fisiolgico y les permite un mayor crecimiento8. En la figura 2 se muestra la estructura qumica de la astaxantina que se puede encontrar en tres ismeros pticos 3R,3R; 3R,3S; 3S,3S. Estructuralmente est relacionada con el -caroteno, la lutena y la zeaxantina, sin embargo, tiene caractersticas muy particulares debido a la presencia de grupos OH y ceto (C=O) en los dos anillos extremos. Esto le confiere una serie de caractersticas nicas como la posibilidad de esterificarse, un poder antioxidante no solamente limitado a sus dobles enlaces conjugados sino a los grupos mencionados en sus dos anillos, y una polaridad alta con respecto a la generalidad de xantofilas9. Se encuentra en forma natural conjugada con protenas o esterificada con uno o dos cidos grasos y en forma libre es especialmente susceptible a la oxidacin. Debido a su estructura de dobles enlaces conjugados, es capaz de absorber luz en el intervalo de la luz visible por lo que es un cromforo. Las variaciones en la luz absorbida vienen dadas por la concentracin de la astaxantina as como por su asociacin con otras molculas. Es insoluble en agua, soluble en la mayora de los solventes orgnicos, ya que debido a su mayor polaridad es soluble en solventes donde otros carotenoides no lo son como el etanol y el metanol.

Introduccin 9

O OH

HO O

ASTAXANTINA

Figura 2.- Estructura qumica de astaxantina (3,3-dihidroxi-, -caroteno-4, 4diona).

En la figura 3 se muestran resumidas sus propiedades fsicas y qumicas. Muchas de las actividades biolgicas de esta molcula han sido atribuidas a su capacidad antioxidante. Algunos autores han resaltado su capacidad de desactivar radicales libres y sobre todo de estabilizar el oxgeno singlete. Otros autores mencionan que esa capacidad antioxidante es debida a sus grupos C=O por lo que al compararlo con el -caroteno y la zeaxantina resulta interesante esta capacidad especialmente alta9. Irnicamente, la misma cadena de polieno y los grupos C=O son la principal causa de su inestabilidad qumica.

10 Introduccin

Estabiliza oxgeno singlete

Bloquea reacciones mediadas por especies reactivas

Absorcin de luz

Astaxantina

Lipoflico

Se oxida e isomeriza fcilmente

Se une fcilmente a superficies hidrfobas y membranas

Figura 3.- Principales propiedades fisicoqumicas de la astaxantina.

Debido a su alta capacidad como antioxidante, se le han atribuido diversas propiedades y beneficios para la salud, aspecto que se revisa ms adelante. Se han publicado pocos trabajos acerca de la farmacocintica y de la biodisponibilidad de la astaxantina. Un trabajo reciente demuestra la presencia de ismeros geomtricos Z/E y pticos R/S de astaxantina sin esterificar en plasma, despus de haber administrado una dosis nica de astaxantina como mezcla de ismeros 3R/S3 de disteres de cidos grasos. Los autores muestran que el ismero Z se absorbe de manera selectiva alcanzando una concentracin plasmtica que representa el 32% del total despus de 6 a 7,5 horas postprandial y que el ismero E se asocia preferentemente a las lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL) y a las

Introduccin 11

protenas de quilomicrones plasmticos en comparacin con la cantidad encontrada en asociacin con las lipoprotenas de baja densidad (LDL) y en las de alta densidad (HDL). Sus resultados sugieren que existe un proceso selectivo para que el ismero Z predomine sobre el E y que este proceso puede estar ligado a una hidrlisis selectiva o diferencial de los steres de cidos grasos de astaxantina durante el proceso de digestin y absorcin10. Tambin se han reportado datos sobre biodisponibilidad y farmacocintica de astaxantina, se administr oralmente en dosis nica de 40 mg en adultos sanos. Se utilizaron tres formulaciones con base lipdica en igual concentracin y se compar con una referencia con base no lipdica (dextrina y gelatina). Cabe resaltar que la biodisponibilidad de las presentaciones con base lipdica fue de 1,7 a 3,7 veces superior a la de referencia, siendo mejor la formulacin con polisorbato 80. El rea bajo la curva de concentracin de astaxantina en plasma frente al tiempo, estuvo entre 1347 y 4960 g/h/l. Se menciona que la cintica sigue un modelo monocompartimental, con una vida media de 15,9 5,3 h, con valores de concentracin mxima de 55,2 15,0 a 191,5 59,3 g/l11. Existen diferentes trabajos sobre los beneficios de la astaxantina para la salud, lo comn en estos trabajos es que la capacidad antioxidante tan alta con respecto a otros antioxidantes naturales es la clave de sus diversas propiedades. As se encuentran datos de sus propiedades como fotoprotector a las cuales se asocia su posible aplicacin en la salud de la piel y de los ojos, sus propiedades anti-inflamatorias, anticancergenas, como inmuno-modulador, su aplicacin en enfermedades neurodegenerativas, en la funcin heptica y desintoxicacin y sus beneficios para el sistema cardiovascular. Si bien se han encontrado trabajos sobre otros aspectos como la salud reproductiva y en diabetes, aqu slo se mencionarn de manera muy general los ms importantes haciendo nfasis en la parte que corresponde al sistema cardiovascular.

12 Introduccin

La astaxantina, como otros carotenoides, tiene un papel en la naturaleza como fotoprotector en contra de los posibles daos causados por la radiacin ultravioleta. La exposicin de los tejidos a este tipo de radiacin produce oxgeno singlete y otros radicales libres, lo que lleva a la posible foto-oxidacin de los lpidos de las membranas celulares y por extensin de los tejidos. La capacidad fotoprotectora y antioxidante de la astaxantina puede ser superior a la del -caroteno y de la lutena12, por lo que se ha visto la posibilidad de desarrollar fotoprotectores en forma oral13. Entre las principales causas de la disminucin de la funcin visual y de la ceguera se encuentran la degeneracin macular relacionada con la edad y la aparicin de cataratas en los adultos mayores. Estas a su vez estn relacionadas con un proceso de oxidacin inducido por la luz, en este sentido no es una sorpresa que a nivel epidemiolgico el riesgo de la degeneracin macular relacionada con la edad se reduce con el consumo de productos que contienen carotenoides, especficamente lutena y zeaxantina pues stos se concentran en la mcula. Desde este punto de vista tambin se piensa que por sus propiedades la astaxantina pudiese derivar en otras aplicaciones en este campo14. Es bien sabido que en los procesos inflamatorios, la concentracin de fagocitos y la produccin de especies reactivas de oxgeno (ERO) llevan a un desequilibrio entre las especies pro-oxidantes y los mecanismos celulares de proteccin contra estas condiciones. Del mismo modo conocemos que los oxidantes que producen los fagocitos, como el anin superxido (O2-), estn directamente relacionados con la estimulacin de genes asociados con el proceso inflamatorio en clulas endoteliales. Tambin se ha demostrado que la astaxantina ayuda a reducir los signos asociados a la inflamacin producida a nivel gstrico por Helicobacter pylori en ratones15. Existen varios trabajos que describen propiedades anticancergenas de la astaxantina, entre stos cabe mencionar el de Tanaka y col.,16 en el que

Introduccin 13

describen que reduce la incidencia de cncer producido por un carcingeno qumico en vas urinarias de ratones. En otro estudio donde se alimentan ratas con un carcingeno y con astaxantina, sta reduce de manera significativa la incidencia de cncer en la cavidad bucal de las ratas con resultados superiores a los del -caroteno17. Del mismo modo se ha visto una menor incidencia de cncer de colon en un modelo de ratas18. En un modelo de cncer de mama con ratones la administracin de astaxantina reduce en ms del 50% la incidencia de tumores, los resultados son superiores a los mostrados por el -caroteno y la cantaxantina19. Se ha propuesto el uso de astaxantina en humanos para inhibir la enzima 5-reductasa, responsable del crecimiento de la prstata en hiperplasia prosttica benigna20. Al parecer el papel de la astaxantina y de otros carotenoides estara relacionado con la regulacin al alza de la conectina 43 y la comunicacin intercelular21. Entre las funciones ms importantes del hgado destacan la oxidacin de lpidos para producir energa, la desintoxicacin por eliminacin de contaminantes y la destruccin de microorganismos, as como de glbulos rojos muertos. En todos estos procesos se libera una cantidad significativa de radicales libres y subproductos de la oxidacin por lo que un buen balance de mecanismos antioxidantes en las clulas hepticas es importante. En este sentido algunos trabajos indican que la astaxantina es ms efectiva que la vitamina E en la proteccin de las mitocondrias de hepatocitos frente a la peroxidacin y que induce la actividad de enzimas que metabolizan xenobiticos22,23. Se ha demostrado en varios ensayos in vitro e in vivo, usando diferentes modelos animales, que la astaxantina influye significativamente en la funcin inmune. Por ejemplo en glbulos rojos de ratn tratados con astaxantina existe una mayor produccin de anticuerpos a antgenos T dependientes24. Tambin se ha indicado que es capaz de restablecer la

14 Introduccin

respuesta inmune en ratones de edad avanzada25. Otras evidencias en el mismo sentido refuerzan un papel inmuno-modulador de la astaxantina26,27. En cuanto a las enfermedades neurodegenerativas solamente se ha comentado el papel cada vez ms relevante del estrs oxidativo en la patognesis de enfermedades como la de Alzheimer, Huntington, Parkinson y esclerosis amiotrfica lateral28,29,30,31. Debido a las propiedades antioxidantes de la astaxantina, se considera que pudiera ser un buen candidato para evaluar su efecto en los estados patolgicos mencionados. En el sistema cardiovascular, las ERO juegan un papel fisiolgico esencial para mantener la integridad del sistema y en la generacin de situaciones patolgicas como la hipertensin arterial (HTA), diabetes y aterosclerosis. Entre las ERO asociadas a estos estados destacan: el O2-, perxido de hidrgeno (H2O2), radical hidroxilo (HO-), especies reactivas de nitrgeno (ERN), xido ntrico (NO) y peroxinitritos (ONOO-). En condiciones normales, las ERO se producen en concentraciones bajas, de manera controlada y funcionan como molculas de sealizacin en la regulacin de la contraccin y relajacin del tejido muscular liso as como de su crecimiento. Por otro lado, en condiciones patolgicas el incremento en las ERO lleva, entre otras cosas, a32: Disfuncin endotelial. Incremento de la contractilidad. Crecimiento y apoptosis de las clulas del msculo liso vascular. Migracin de monocitos. Peroxidacin de lpidos. Inflamacin. Formacin de depsitos extracelulares de matrices protenicas

Introduccin 15

Existen excelentes revisiones sobre el papel de los antioxidantes en la proteccin del endotelio y su funcin33. Sin embargo cabe destacar que los trabajos de la astaxantina como cardioprotector34,35 o regulador de la presin son pocos y muy recientes36,37,38. En uno de ellos se demuestra un claro efecto antihipertensivo debido a un mecanismo relacionado con la produccin de NO. Del mismo modo se considera que la astaxantina tiene un efecto neuroprotector presumiblemente debido a su capacidad antioxidante36. De manera complementaria se menciona que el efecto antihipertensivo tambin est relacionado con un efecto modulador de la fluidez de la sangre, no relacionado con los cambios de fibringeno, ya que ste mantiene sus valores en los grupos experimentales y control. En el mismo estudio no se encontr una mejor relajacin dependiente del endotelio por la administracin de astaxantina, por lo que los cambios los pueden atribuir a la capacidad de deformacin o flexibilidad y de agregacin de las clulas sanguneas, sin embargo, sugieren profundizar en estos estudios37. En el ltimo trabajo publicado por este grupo38, se destacan dos aspectos interesantes: uno relacionado con la menor produccin de metabolitos de la oxidacin de NO en relacin a la administracin de astaxantina as como una mejora en la morfometra de las arterias coronarias y la aorta, aspectos que se retomarn ms adelante. En la figura 4, se representan los posibles mecanismos de accin antihipertensivos de la astaxantina y su relacin con las ERO39.

16 Introduccin

Astaxantina
Sangre Ang II ERO(O2-) + Endotelio Agregacin plaquetaria Fluidez Circulacin efectiva + Relajacin vascular Tono vascular + Presin arterial + + NO Fenilefrina ( receptores) CMLV

Accin anti-hipertensiva

Figura 4.- Mecanismos implicados en la accin antihipertensiva de la astaxantina. Adaptado de Hussein et al39.

Introduccin 17

HIPERTENSIN ARTERIAL 1. Definicin y clasificacin La HTA es un estado patolgico caracterizado por un aumento crnico de la tensin arterial por encima de los valores normales. No es una enfermedad en el sentido habitual de la palabra, de hecho se la conoce como la asesina silenciosa, ya que durante la mayor parte de su historia natural no presenta sntomas y cuando stos se presentan puede ser demasiado tarde, pues corresponden a graves complicaciones cardiovasculares como son el infarto de miocardio y la enfermedad cerebrovascular, entre otras (Figura 5)40. Unas cifras elevadas de tensin arterial, por s mismas, no determinan ningn tipo de sintomatologa, sin embargo la HTA va produciendo dao en rganos diana como el corazn, los vasos sanguneos y el rin. Estos rganos son los elementos ms importantes en la regulacin de la presin arterial (PA) y quizs por ello son los que sufren de forma ms directa el impacto de la hipertensin. En todos ellos se produce un proceso de remodelado que inicialmente puede ser adaptativo o reparador, pero si las cifras de PA se mantienen elevadas o su control es ineficaz degenera hacia daos importantes, que predisponen al organismo a ciertas patologas, que a su vez agravan el proceso hipertensivo, creando as un crculo vicioso. La HTA podra simplemente definirse como una elevacin crnica de la PA (sistlica y/o diastlica), pero en la prctica clnica resulta difcil saber qu niveles tensionales deben considerarse normales y cules son elevados, puesto que no se trata de unos valores fijos e idnticos para todas las poblaciones y no permanecen inalterables durante toda la vida en el individuo normal. Las cifras de tensin arterial se modifican con la edad, sexo, raza y otros muchos factores, adems de modificarse a lo largo del da en cada individuo en relacin con diferentes determinantes, como el ejercicio, el fro, la digestin o la carga emocional.

18 Introduccin

Factores genticos Ingesta de sal Obesidad Estrs Dieta rica en grasas etc

Pre hipertensin . Taquicardia . Trastornos lpidos . Tras metab glucosa

HTA sin compromiso rgano diana

HTA + Dao . Hipertrofia VI . Hipertrofia vascular . Deterioro leve F renal . Dao microvascular

Enfermedad cardiovascular . Enfermedad coronaria . Insuficiencia cardiaca . ACV isqumico, hemorrgico . Insuficiencia renal avanzada . Enfermedad vascular perifrica . Muerte

Evolucin de 10 a 50 aos Riesgo cardiovascular

Figura 5.- Evolucin de la hipertensin arterial. Adaptado de Williams B.40

Dada la dificultad de establecer unas cifras normales de tensin arterial vlidas para toda la poblacin, se han establecido unos valores convencionales. Por acuerdo entre expertos se consideran anormales aquellos valores que con toda seguridad implican un determinante de riesgo cardiovascular (RCV) y, de acuerdo a este criterio, se ha establecido el diagnstico de HTA cuando tras tres determinaciones separadas, como mnimo por una semana, se obtiene un promedio de presin arterial diastlica (PAD) igual o superior a 90 mmHg y/o una presin arterial sistlica (PAS) igual o superior a 140 mmHg, para un adulto a partir de los 18 aos.

Introduccin 19

No obstante, la progresiva consideracin mdica de categoras de PA no hipertensivas, y del riesgo absoluto de enfermedad cardiovascular (ECV) en funcin de los niveles de la PA (y de otros factores de riesgo y trastornos clnicos) podra estar cambiando el paradigma de definicin y manejo de la HTA hacia el concepto de caso de PA para tratar (en funcin de sus cifras y el riesgo)41. La hipertensin puede clasificarse en categoras en funcin de los valores de PA. En la tabla 1 se muestra la clasificacin de los valores de PA propuesta en las guas conjuntas de la Sociedad Europea de Hipertensin (SEH) y la Sociedad Europea de Cardiologa (SEC)42 actualizadas en 200743, asumida por la Sociedad Espaola de Hipertensin-Liga Espaola para la Lucha contra la Hipertensin Arterial (SEH-LELHA). Existen algunas discrepancias, no sustanciales, con la clasificacin publicada en el ao 2003, en el Sptimo Informe del Comit Nacional Conjunto de Prevencin, Deteccin, Evaluacin y Tratamiento de la Hipertensin de EE.UU., conocido por sus siglas en ingls como JNC-744. La clasificacin del JNC-7 utiliza el trmino prehipertensin para las categoras de PA con valores de 120-139/80-89 mmHg, con el fin de identificar a aquellos sujetos en los que la intervencin temprana con medidas de estilo de vida sano podra reducir la PA y el progreso a HTA con el paso de los aos. En cambio, la SEH considera estos niveles dentro de la normalidad ya que desde hace unos aos ya no se habla de hipotensin, sino de presin arterial ptima porque se ha demostrado que cuanto ms baja se tenga la PA, mejor es la prevencin de la ECV. Esto est basado en el estudio Framingham45 en el que se seala que el riesgo de desarrollar HTA es ms alto en sujetos con PA normal-alta que en individuos con PA normal.

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Tabla 1.- Clasificacin de la presin arterial propuesta por la Sociedad Europea de Hipertensin (SEH) y la Sociedad Europea de Cardiologa (SEC)42.

CATEGORA
PTIMA NORMAL NORMAL-ALTA HTA GRADO 1 HTA GRADO 2 HTA GRADO 3 HTA SISTLICA AISLADA

SISTLICA (mmHg) < 120 120-129 130-139 140-159 160-179 180 >140 y y/o y/o y/o y/o y y

DIASTLICA (mmHg) < 80 80-84 85-89 90-99 100-109 110 <90

La SEH ha decidido no utilizar el trmino prehipertensin por varias razones: Hay poca razn para juntar los dos grupos, pues incluso en el estudio Framingham el riesgo de desarrollar HTA es ms alto en los individuos con PA normal-alta. El trmino prehipertensin puede crear ansiedad y solicitar visitas mdicas innecesarias en muchos sujetos. Aunque la gua americana recomienda cambios en el estilo de vida para todos los prehipertensos y esto es una estrategia positiva, en la prctica nos encontramos tanto con individuos que no necesitan

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ninguna intervencin (personas mayores con PA normal) como con individuos con un perfil de RCV alto o muy alto (personas con diabetes) en los que se requiere tratamiento. En definitiva, que el umbral para considerar HTA debe ser flexible, siendo ms alto o ms bajo en funcin del RCV total de cada individuo. Por otro lado, se considera que la HTA es el resultado de una interaccin compleja entre factores genticos y factores ambientales. Esto determina cambios en factores y sistemas efectores que conducen a las alteraciones de las dos variables fisiolgicas de las que depende la PA: el gasto cardiaco (GC) y las resistencias vasculares perifricas (RVP). PA = GC x RVP El aumento de estas variables lleva a la elevacin de la PA y finalmente, a travs de cambios funcionales y estructurales, al establecimiento de la HTA. Con el conocimiento actual no es posible proponer de manera concluyente el origen de la HTA y, en este sentido, se considera la existencia de una variedad de factores que participan en el desarrollo y mantenimiento de la HTA46. Adems del GC y las RVP contribuyen otros dos factores directos como la impedancia y el volumen arterial diastlico. El GC depende del volumen sistlico y de la frecuencia cardiaca (FC). A su vez, el volumen sistlico vara segn la contractilidad cardiaca y el retorno venoso. Por su parte, las RVP estn reguladas por factores nerviosos, humorales y locales47. Sobre estos factores directos intervienen los denominados indirectos como: la actividad nerviosa central y perifrica autnoma, la reserva corporal de sodio y lquido extracelular, el sistema renina-angiotensina (SRA) y hormonas locales como prostaglandinas, cininas, factor natriurtico auricular y otros pptidos.

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El sistema nervioso autnomo, especialmente el sistema simptico (SNS), juega un papel importante en el control circulatorio por mecanismos reflejos o actuando sobre el tono vascular. En situaciones normales el reflejo neural sirve para aumentar la PA cuando baja y reducirla cuando sube. Los mecanismos que regulan la PA a largo plazo estn relacionados con la excrecin de sodio y el lquido extracelular que es un factor hemodinmicamente importante. El rin juega un papel esencial en la regulacin de la PA y del balance de agua y de electrolitos. Los niveles de sodio estn influenciados tanto por la ingesta como por la capacidad de excrecin renal48. El SRA participa en la regulacin de todo el sistema, se activa cuando se reduce el volumen minuto lo que conduce a la formacin de angiotensina II (Ang II)49. Debido a la importancia de este sistema, a la interaccin de la Ang II con otras molculas que se producen en los vasos sanguneos y a que uno de los modelos de HTA utilizados en esta tesis fue mediante la infusin de Ang II en ratones Swiss Albino-CD1; a continuacin se detalla un poco ms de las caractersticas del SRA. 2. El sistema renina-angiotensina La llamada cascada del SRA se inicia con la renina, una enzima proteoltica que procede de una molcula mayor, la preprorrenina. La transformacin de prorrenina en renina tiene lugar mediante la accin de diversas peptidasas, como la plasmina, la tonina, la calicrena, la elastasa, el activador tisular del plasmingeno, la catepsina G y la enzima activadora de la renina derivada del endotelio. La renina acta sobre su sustrato, el angiotensingeno, una -2 globulina de origen heptico, generando un decapptido inactivo, la angiotensina I (Ang I). A su vez, la Ang I sirve de sustrato a la enzima covertidora de angiotensina (ECA) para dar lugar al octapptido Ang II, que es el factor biolgicamente ms activo del sistema

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y su principal efector. La Ang II, por accin de la aminopeptidasa A, origina la angiotensina III o angiotensina (2-8), con acciones similares a la anterior aunque de menor potencia. Asimismo, la accin de la aminopeptidasa B sobre la Ang II da lugar a la angiotensina IV, cuyo papel fisiolgico an se sigue investigando. Mediante la accin de una endopeptidasa sobre la Ang I o sobre la Ang II se produce la angiotensina (1-7) cuyas acciones parecen ser dependientes de las prostaglandinas y del NO y opuestas a las de la Ang II 50. Recientemente se ha destacado la existencia de vas enzimticas de sntesis de la Ang II distintas del SRA que tienen la capacidad de generar Ang II directamente a partir del angiotensingeno, como la catepsina G, la tonina y el activador tisular del plasmingeno. Adems de la ECA, se ha demostrado que la catepsina G, la quimasa y la enzima generadora de Ang II sensible a la quimoestatina tambin tienen capacidad de producir Ang II a partir de Ang I. Aunque la importancia fisiolgica o fisiopatolgica de estas vas de sntesis de Ang II permanece todava por esclarecer, recientemente se ha sugerido que la va de la quimasa en el corazn y en la pared vascular podra tener importancia tanto en el aspecto funcional como en las alteraciones estructurales que la Ang II produce en estos rganos51,52. Tradicionalmente se ha considerado la existencia de un SRA circulante. Sin embargo, no es el nico SRA, ya que se ha detectado la presencia de todos los componentes del SRA y de su cido ribonucleco mensajero (ARNm) en diferentes tejidos, como el cerebro, las glndulas suprarrenales, el corazn, los vasos sanguneos y los rganos reproductores. Se ha propuesto que el SRA circulante tiene una accin fundamentalmente endocrina, mientras que los SRA tisulares tienen acciones autocrinas y paracrinas. Aunque se acepta este esquema actualmente, cada vez parece ms difcil establecer una frontera clara entre el SRA circulante o sistmico y los tisulares. Ello es debido a que algunos

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componentes circulantes, como el angiotensingeno o la renina, podran ser captados por los tejidos y participar en la produccin tisular de Ang II; asimismo, la Ang II producida localmente podra pasar a la circulacin y formar parte del SRA circulante. Como consecuencia de esto, la visin ms actual propugna la existencia de un SRA que englobara al circulante y a los tisulares, y que realizara tanto funciones endocrinas como paracrinas, autocrinas e intracrinas53. La ECA se ha encontrado en la capa adventicia, en las clulas de msculo liso y en el endotelio54. En este sentido tanto el angiotensingeno como su ARNm se han detectado en las clulas vasculares de msculo liso, en el endotelio y en la grasa perivascular. Debido a que presumiblemente la renina no est presente en los vasos, la generacin local de Ang II estara regulada por la ECA tisular que a su vez sera dependiente de la renina en circulacin; se piensa que la Ang II producida localmente es ms importante en la vasoconstriccin que la Ang II circulante. El componente sistmico participa en la homeostasis circulatoria a corto y medio plazo, mientras que a nivel tisular contribuye a la regulacin de la funcin cardiovascular y puede dar lugar a cambios estructurales, en los cuales la Ang II puede actuar como factor de crecimiento55,56. La Ang II ejerce sus acciones a travs de su unin a receptores especficos. Se han descrito varios tipos de receptores para la Ang II, pero los ms conocidos en la actualidad son los AT1 y los AT2. Los receptores AT1 se localizan principalmente en los vasos, el rin, el corazn, el cerebro, el tero, los adipocitos, el ovario, el bazo y el pulmn. Los receptores AT2 se han detectado fundamentalmente en tejidos embrionarios o en crecimiento, y en individuos adultos se han encontrado en la pared vascular, las glndulas suprarrenales, el sistema nervioso central, el miometrio y en los folculos ovricos atrsicos. El receptor AT1 pertenece a la familia de receptores acoplados a las protenas G o protenas fijadoras de guanosin trifosfato (GTP), con siete

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dominios transmembrana. La unin de la Ang II a este receptor activa la fosfolipasa C, que a su vez hidroliza el fosfatidil-4,5-bifosfato, formndose inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). El IP3 acta sobre receptores especficos localizados en la membrana del retculo sarcoplsmico y facilita la liberacin del calcio y la posterior entrada de calcio extracelular a travs de canales de calcio. El resultado final es un aumento de la concentracin intracelular de este in. A su vez, el DAG activa y transloca la protena cinasa C (PKC) hacia la membrana celular, donde estimula la fosforilacin de diversas protenas, activa el intercambiador Na+/H+ y la fosfolipasa A2 y conduce finalmente a la activacin de canales de calcio voltaje-dependientes. El receptor AT2 presenta tambin una estructura con siete dominios transmembrana. Tiene poca homologa (34%) con el receptor AT1, y la transduccin de la seal no parece estar asociada a la activacin de los fosfoinositoles ni a incrementos de la concentracin intracelular de calcio. La unin de la Ang II a su receptor AT2 conduce a la activacin de la enzima tirosina fosfatasa que inhibe la fosforilacin de diversas protenas57,58,59. La mayora de las acciones bien conocidas de la Ang II, es decir, aquellas que ejerce sobre rganos diana como el rin, el corazn, las arterias, los sistemas nerviosos central y perifrico, y las glndulas suprarrenales, tienen lugar mediante la interaccin con receptores AT1. Dichas acciones, de una manera directa o indirecta, afectan a la homeostasis cardiovascular y renal y como consecuencia participan en el desarrollo y mantenimiento de trastornos tales como la HTA, la insuficiencia renal, la nefropata diabtica, etc60. Aunque se desconoce en gran medida el papel funcional de los receptores AT2, la marcada expresin de los receptores AT2 en tejidos embrionarios ha llevado a suponer que stos desempean un papel importante en el crecimiento y desarrollo celular, particularmente durante el perodo fetal, y que podra sobreexpresarse en ciertas situaciones patolgicas. Mediante la

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utilizacin de antagonistas especficos de los receptores AT2 se ha atribuido a estos receptores acciones opuestas a las de los AT1 sobre el tono y el crecimiento de las clulas vasculares de msculo liso y sobre la funcin renal61. En la tabla 2 se presentan las caractersticas farmacolgicas de los receptores de Ang II62. En el sistema nervioso central la Ang II participa en procesos tan diversos como los relacionados con la memoria, la atencin, el comportamiento, la regulacin vasomotora, la secrecin de vasopresina, el mecanismo de la sed, la ingestin de sal y la secrecin de la hormona adrenocorticotrpica. A nivel perifrico, la Ang II, a travs de los receptores AT1, amplifica o facilita la actividad del SNS, por lo que este mecanismo contribuye a la accin vasoconstrictora de la Ang II63. Esta accin facilitadora acta a nivel presinptico, mediante un aumento de la liberacin y de la sntesis de catecolaminas en las terminales nerviosas, as como mediante una reduccin de su recaptacin. A nivel postsinptico, la Ang II potencia el efecto contrctil de la noradrenalina mediante la sensibilizacin de los receptores de sta. La Ang II participa en la regulacin del tono vascular mediante su accin vasoconstrictora del msculo liso vascular y a travs de su accin facilitadora de la transmisin adrenrgica. Asimismo, la Ang II participa en el crecimiento vascular, al estimular la proliferacin de clulas vasculares de msculo liso (CMLV), clulas endoteliales o fibroblastos, as como la accin y la produccin de diversos factores mitognicos. Ello posibilita la angiognesis, pero tambin el engrosamiento patolgico de la pared vascular. Las modificaciones estructurales de la pared arterial pueden ser debidas a tres procesos distintos: la hipertrofia, la hiperplasia y el remodelado de los componentes de la pared vascular64. Esta modificacin de la estructura de los vasos arteriales tiene importantes repercusiones no slo morfolgicas, sino tambin funcionales para diversos rganos como el corazn, el sistema nervioso central y el rin.

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Tabla 2.- Caractersticas farmacolgicas de los receptores de angiotensina II

RECEPTOR AT1 AT2

Vasoconstriccin ( NO, Cai++ Desarrollo de tejido fetal intracelular y O2-) y PA Inflamacin ( factor de transcripcin o Vasodilatacin ( de bradicinina nuclear kappa (NF-kB) (Bk) y NO), as como de PA Crecimiento y proliferacin celular Inflamacin (NF-kB) (va c-fos, c-myc, c-jun) Mejora de la funcin cardiaca y Antinatriuresis del efecto cronotrpico Incremento de aterogenicidad Diferenciacin de clulas ( Ox LDL) vasculares Modulacin de la actividad del SNS Flujo sanguneo renal Contraccin del miocardio, Actividad simptica Arritmias, inhibidor del activador del plasmingeno 1 (PAI-1) Liberacin de endotelina Inhibicin de crecimiento ( cinasas de protenas activadas por mitgenos (MAP cinasas))

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La Ang II, a travs de los receptores AT1, ejerce en el corazn un efecto inotrpico y cronotrpico positivo que conduce a un aumento del volumen minuto. Es importante destacar que estos efectos tienen lugar con cantidades de Ang II que carecen de efecto vasoconstrictor. Adems de estas acciones directamente relacionadas con la funcin miocrdica, la Ang II participa en la regulacin del flujo coronario mediante un efecto vasoconstrictor similar al descrito para las arterias en general. La Ang II ejerce tambin una funcin trfica sobre los cardiomiocitos. Tiene una accin vasoconstrictora selectiva sobre la arteriola eferente. Ello no implica que no se produzca vasoconstriccin aferente, ni que no existan receptores a este nivel, sino que la accin vasoconstrictora de la Ang II se encuentra compensada por factores vasodilatadores como la prostaciclina (PGI2) y el NO. La Ang II participa adems en el proceso de autorregulacin renal, es decir, en el mantenimiento del flujo sanguneo renal (FSR) y de la tasa de filtracin glomerular (TFG) cuando se modifica la presin de perfusin renal. Cuando se produce una reduccin de la presin arterial y por lo tanto de la presin de perfusin renal, disminuye la presin hidrosttica glomerular y con ella la filtracin glomerular. Como consecuencia, la concentracin de sodio y cloro que alcanza la mcula densa se reduce; ello conduce a la activacin de la secrecin de renina y al consiguiente aumento de la generacin de Ang II; sta aumenta la vasoconstriccin eferente, que eleva la presin hidrosttica glomerular y ayuda a mantener la TFG, a costa de una disminucin del FSR. La Ang II es uno de los factores con mayor efecto antinatriurtico, ya que es capaz de disminuir la excrecin urinaria de sodio a niveles casi indetectables. Adems de los efectos hemodinmicos, con consecuencias para la funcin excretora renal anteriormente citados, la Ang II aumenta de forma directa la reabsorcin de sodio en varias porciones de la nefrona, como el tbulo proximal y el segmento ascendente del asa de Henle.

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Asimismo, la Ang II parece ser responsable de algunos mecanismos que desencadenan lesiones glomerulares que se producen durante el envejecimiento, la HTA, la diabetes, etc., y que participan en el desarrollo de la insuficiencia renal. La mayora de estas acciones dependen de las acciones de la Ang II sobre la arteriola eferente, el tbulo y las clulas mesangiales65. La Ang II es uno de los principales estmulos para la sntesis y liberacin de la aldosterona en la zona glomerular de la corteza suprarrenal. Sin embargo, la participacin de la aldosterona en la accin antinatriurtica de la Ang II en condiciones normales parece ser secundaria, aunque hay que destacar que la aldosterona contribuye a evitar una prdida excesiva de sodio en situaciones de una ingesta baja en sal. La regulacin de la sntesis y liberacin de la renina es un factor decisivo para la formacin de Ang I y por tanto de Ang II, ya que la cantidad de angiotensingeno disponible, que es sintetizado por el hgado, es prcticamente constante y la reaccin renina-angiotensingeno depende casi exclusivamente de la tasa de secrecin de la enzima. Por ello, el control de la secrecin de renina a travs de diferentes mecanismos, es el principal punto de regulacin del SRA. La estrecha asociacin anatmica que se observa entre la mcula densa y las clulas yuxtaglomerulares hizo pensar en la existencia de una relacin funcional y no slo anatmica entre ambos tipos de clulas. Las clulas de la mcula densa detectan las variaciones en el flujo y en la concentracin de NaCl en el tbulo distal, modificando consecuentemente la liberacin de renina por parte de las clulas yuxtaglomerulares. Por tanto, una disminucin de la cantidad de NaCl que llega al tbulo distal induce un aumento de la secrecin de renina. No se conoce muy bien el mecanismo a travs del cual la mcula densa media los cambios en la secrecin de renina, aunque se han sugerido como posibles mediadores las prostaglandinas y la adenosina.

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Las variaciones en la PA y en la presin de perfusin renal tambin modifican la secrecin de renina, ya que un aumento de las mismas reduce la secrecin de esta enzima. Estos cambios son detectados por la mcula densa, y podran ser mediadores el NO o el calcio. El SNS desempea un importante papel regulando la secrecin de renina en situaciones que requieren una respuesta inmediata, como el ejercicio, el cambio postural o la prdida de volumen. Se ha observado que la inervacin de las clulas yuxtaglomerulares es predominantemente simptica y, en general, un incremento de esta actividad determina un aumento de la liberacin de renina. El aumento de la secrecin de renina producido por la estimulacin nerviosa simptica se bloquea con un antagonista de los receptores -adrenrgicos, como el propranolol, lo que sugiere que estos receptores estn implicados en dicha accin. El principal mecanismo hormonal regulador de la secrecin de renina es el efecto inhibidor de la Ang II sobre sta. Este mecanismo de retroalimentacin negativa supone un autocontrol del sistema, ya que si se produce un aumento de la secrecin de renina y consiguientemente de la produccin de Ang II, sta va a ser capaz de autorregular su sntesis actuando sobre la secrecin de renina. La Ang II y el NO presentan acciones opuestas en muchos rganos, de forma que el mantenimiento de un equilibrio entre las acciones de ambos parece tener una especial relevancia para la homeostasis cardiovascular y renal; en concreto, la Ang II y el NO interaccionan modulando la actividad glomerular y tubular. Asimismo, el NO inhibe la secrecin de la renina66. Las interrelaciones entre la Ang II y la endotelina 1 (ET-1) son tambin conocidas67. La Ang II aumenta la produccin de ET-1 en las clulas endoteliales vasculares y en las clulas mesangiales de los glomrulos renales, mediante la estimulacin de la enzima convertidora de endotelina.

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Asimismo, la Ang II aumenta la secrecin del tromboxano A2 (TXA2), que podra mediar parte sus efectos biolgicos. El pptido natriurtico auricular (PNA) antagoniza casi todos los efectos fisiolgicos del SRA68. En estudios realizados en clulas yuxtaglomerulares aisladas se ha demostrado que el PNA inhibe la secrecin de renina, efecto mediado por un aumento del guanosin 35monofosfato cclico (cGMP) en dichas clulas. Asimismo, el PNA se opone a las acciones de la Ang II: reduce el efecto presor de la Ang II y su efecto constrictor de las clulas mesangiales, antagoniza los efectos de la Ang II sobre la hemodinmica renal y la reabsorcin proximal de sodio, e incluso inhibe la liberacin de aldosterona inducida por la Ang II. Aunque se mencion anteriormente, un aspecto que debe sealarse es que los datos actuales apuntan a destacar cada vez ms los sistemas SRA tisulares y sus funciones tanto paracrinas como autocrinas. Ahora se sabe que el endotelio vascular tiene una importante participacin en la regulacin de la vasoconstriccin por va de la Ang II local adems de la vasodilatacin conocida por la va del NO. Muchos de estos factores estn interrelacionados en circuitos de autorregulacin consiguiendo mantener la PA en unos lmites estrechos. 3. Endotelio vascular y disfuncin endotelial El endotelio vascular est situado en una posicin anatmica estratgica entre la sangre y la pared vascular que le permite actuar como transmisor y receptor de seales. Las clulas endoteliales son capaces de registrar cambios hemodinmicos de la sangre, como la presin y las fuerzas de cizallamiento, cambios en sus interacciones con las plaquetas, los leucocitos, modificaciones de los mensajeros qumicos circulantes o procedentes de clulas vecinas por lo que responden a dichos cambios mediante la liberacin de numerosos factores vasoactivos. Por esta razn, el concepto de endotelio vascular considerado clsicamente como una

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simple barrera de separacin entre la sangre y la pared vascular ha cambiado de forma sustancial. El endotelio vascular es considerado como el principal rgano de regulacin vascular con acciones exocrina, paracrina y autocrina, que est implicado en diversos procesos vasoactivos, metablicos e inmunitarios69. Entre los factores biolgicamente activos sintetizados y liberados por las clulas endoteliales cabe destacar la PGI2, el NO, el factor hiperpolarizante dependiente del endotelio (EDHF), la ET, la prostaglandina H2 ( PGH2), el TXA2, el factor de crecimiento transformante (TGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento fibroblstico bsico (bFGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el activador tisular del plasmingeno (t-PA), el PAI-1, ERO, interleucinas, quimocinas, molculas de adhesin vascular e intercelular (VCAM-1, ICAM-1) y otros70,71,72. Factores derivados del endotelio Prostaciclina La PGI2 fue el primer factor relajante derivado del endotelio aislado e identificado, se sintetiza por la va de las ciclooxigenasas (COX1 y COX2). Sus principales acciones son: inhibicin de la agregacin plaquetaria y relajacin de las CMLV, sin embargo, su accin sobre el control de la PA no es tan relevante en condiciones normales. Su mecanismo de accin depende de la activacin de la adenilato ciclasa (AC), tiene una semivida muy corta y se inactiva mediante su degradacin a 6-ceto-1-prostaglandina que se elimina por la orina. Los principales factores capaces de estimular la sntesis y la liberacin de la PGI2 son la Ang II, la acetilcolina (ACh) o la Bk, as como productos liberados de las plaquetas como la serotonina y el PDGF. La capacidad de sintetizar PGI2 disminuye con la edad, la arterioesclerosis y la diabetes

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mellitus, lo que sugiere una relacin entre estos estados patolgicos y los niveles de la PGI273. xido ntrico Furchgott y Zawadzki demostraron en 1980 en aortas de conejo, que la ACh y agentes muscarnicos relacionados con ella relajaban el tejido vascular previamente contrado slo cuando su endotelio estaba intacto74, atribuyendo este fenmeno a la presencia de un factor humoral producido in situ al que denominaron factor relajante derivado del endotelio o EDRF por sus siglas en ingls. Tambin sealaron que el EDRF es un potente inhibidor de la adhesividad y agregacin plaquetaria, y activador de la guanilato ciclasa soluble (sGC) provocando aumento de cGMP en las CMLV o en las plaquetas, con la consecuente inhibicin de la contraccin vascular. Aos despus Palmer y col.75, comprobaron que este EDRF era NO. La formacin de NO tiene lugar por una reaccin enzimtica en la que la enzima xido ntrico sintasa (NOS) cataliza la conversin de L-arginina a L-citrulina dando como producto NO. La NOS presenta tres isoformas (Tabla 3), la neuronal (nNOS, tipo I) y la endotelial (eNOS, tipo III) se expresan constitutivamente y su actividad est regulada por la concentracin intracelular de calcio76. La forma inducible (iNOS, tipo II) la expresan los macrfagos cuando son estimulados por citocinas, lipopolisacridos u otras sustancias inmunolgicas y su expresin est regulada tanto a nivel transcripcional como postranscripcional, por factores de transcripcin sensibles al estado redox como el NF-kB o las MAP cinasas77. Actualmente se sabe que los genes de estas tres isoformas se localizan en locus y genes diferentes78. Como se puede observar, el NO juega un papel fundamental en numerosos procesos fisiolgicos. Entre otros, acta como regulador del flujo sanguneo local, inhibidor de la agregacin plaquetaria, se produce por los

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macrfagos activados contribuyendo a la defensa inmunitaria primaria y tambin acta como neurotransmisor, siendo el cerebro el rgano con mayor actividad NOS76.
Tabla 3.- Caractersticas de las isoformas conocidas de NOS.

Nombre

Nombre comn nNOS

Peso molecular 161 kDa

Cromosoma

NOS I

12

NOS II

iNOS

131 kDa

17

NOS III

eNOS

133 kDa

Funcin principal del NO producido Neurotransmisor, plasticidad sinptica y modulacin de la respuesta a glutamato Respuesta inmune a microorganismos, elemento de la respuesta inflamatoria Regulacin del flujo y presin sangunea e inhibicin de la activacin de plaquetas

A nivel vascular, el NO es un vasodilatador poderoso que acta de manera sinrgica con la PGI2, y adems inhibe el crecimiento de las CMLV. En trminos generales este proceso de vasodilatacin producido por el NO en el msculo liso vascular es debido a una cascada de seales. La formacin de cGMP, por parte de la sGC que es estimulada por el NO, conduce a la activacin de la protena cinasa G (PKG), que produce la fosforilacin de los residuos de serina y de treonina de una protena pequea, Rho A, la

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cual es inactiva en su forma fosforilada (Rho A-P) lo que conlleva la inactivacin de Rho A cinasa76.

NO

cAMP Rho A-P inactivo Rho A activo Rho A cinasa

Catecolaminas

sGC

Ca 2+

Miosina cGMP PKG MLCP Miosina -P Contraccin de Msculo liso Miocina cinasa de cadena ligera (MLCK)

Unin a actina

Figura 6.- Rutas de sealizacin del NO y catecolaminas y su relacin con la vasodilatacin y vasoconstriccin en clulas de msculo liso vascular.

Adems de la funcin ya descrita, el NO participa en la inhibicin de la adhesin de plaquetas, monocitos y neutrfilos. Cuando se activa el sistema de factores de coagulacin, se produce trombina que formar fibrina a partir de fibringeno, causando vasodilatacin e inhibiendo las plaquetas por medio de un mecanismo dependiente del endotelio.

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Otro efecto del NO reside en su capacidad de reaccin con el hierro de protenas intracelulares, principalmente mitocondriales. El NO inactiva la mayora de las enzimas que poseen un grupo prosttico hemo, adems, puede reaccionar con cidos nucleicos dando lugar a mutaciones y roturas del ADN y tambin puede producir necrosis, entre otras cosas. El NO posee una accin antiinflamatoria importante, a la vez que tiene la capacidad de promover la disfuncin celular y tisular a travs de un efecto proinflamatorio. Para entender este doble efecto, se piensa que los efectos reguladores y antiinflamatorios del NO ocurren con concentraciones bajas, en tanto que los efectos adversos se producen con concentraciones altas, como en situaciones de inflamacin donde puede reaccionar con el oxgeno o el O2-. As pues, un exceso de NO es citotxico, es capaz de inducir la peroxidacin lipdica en lipoprotenas e interferir con la sealizacin celular por nitracin de residuos de tirosina en protenas. El NO genera ONOO- al reaccionar con el O2 - de acuerdo a: O2 - + NO ONOO- + H + ONOOH NO3El ONOO- est en equilibrio con su cido conjugado (ONOOH). En soluciones neutras es un potente agente oxidante, capaz de oxidar grupos tioles o tioteres, capaz de nitrar residuos de tirosina, de nitrar y oxidar guanosina, de degradar carbohidratos, de iniciar peroxidacin lipdica y de fragmentar el ADN79. Como sabemos, la produccin de O2 - y NO es diferente tanto en su fuente como en las condiciones en que se lleva a cabo. Sin embargo, la produccin de ONOO- ocurre siempre cuando se rompe el equilibrio por la formacin excesiva de uno o de otro. Algunos autores establecen que tanto las reacciones de oxidacin como de nitracin mediadas por el ONOOestn influenciadas en gran medida por el flujo de produccin relativo de O2- y NO80. Dichos autores establecen que las tasas ms altas de oxidacin se producen con exceso de NO, producindose la oxidacin a travs del

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OH y del NO2 formados a partir del ONOO-. Sin embargo, la reaccin del ONOO- con el CO2 es la va ms importante por la que se descompone el ONOO-, formando al final N2O3, que es un potente agente nitrante81. Adems de las reacciones de oxidacin, el ONOO- tiene la capacidad para nitrar compuestos fenlicos en condiciones fisiolgicas, como los anillos de tirosina. Los residuos de tirosina son oxidados por los radicales derivados del ONOO- formando el radical tirosilo, que a su vez reacciona con el NO para formar 3-nitrotirosina82,83. Factor hiperpolarizante dependiente del endotelio Adems de los factores mencionados anteriormente, el endotelio libera otro factor que produce relajacin en el msculo liso vascular al inducir hiperpolarizacin de las membranas celulares en las CMLV, que se conoce como el EDHF. En la actualidad no se conoce bien su naturaleza, aunque se sabe que se libera in vitro por la accin de concentraciones elevadas de ACh y Bk por lo que es de suponer que acta como un mediador en la accin vasorrelajante de estos agentes. Mientras que la relajacin dependiente de NO es sostenida, la hiperpolarizacin es transitoria. La hiperpolarizacin y la relajacin inducidas por el EDHF parecen ser debidas a un incremento en la conductancia del K+ a travs de canales activados por calcio y ATP dependientes en el msculo liso vascular, ya que la ouabana, un inhibidor de la bomba Na+/K+-ATPasa, inhibe su accin84,85,86. Se ha sugerido la posibilidad de que este factor sea un metabolito lbil de la ruta del cido araquidnico en la cual parece estar implicada la va del citocromo P450, aunque tambin se ha sugerido la posibilidad de otra va relacionada con la superxido dismutasa (SOD) como se mencionar ms adelante. Respecto a su papel fisiolgico o fisiopatolgico, parece ser un mediador muy importante en la relajacin dependiente del endotelio en las arterias mesentricas de resistencia.

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Endotelina La ET es una protena de 21 aminocidos de la que se han encontrado tres tipos diferentes, ET-1, ET-2 y ET-3, que slo se diferencian en algn aminocido en su secuencia. Los tres tipos tienen actividad biolgica y slo cambian sus caractersticas farmacolgicas. La ET-2 es la de mayor potencia vasoconstrictora en tanto que la ET-3 es la de menor. Las clulas endoteliales sintetizan ET-1 a partir de la pre-proendotelina, que por medio de una endopeptidasa da lugar a un pptido de 38 a 39 aminocidos que se denomina gran endotelina. La accin de la endopeptidasa llamada enzima convertidora de endotelina da finalmente lugar a la ET-1. Esta conversin es necesaria para que se induzca su actividad biolgica, sta se produce por estimulo mecnico, qumico y humoral como sucede con otros mediadores. El estmulo ms importante para la produccin de ET in vitro es el ionforo de calcio A23187, lo que demuestra que un aumento del calcio intracelular en las clulas endoteliales es crucial para la produccin de ET. La hipoxia es otro estmulo importante para la produccin de ET en tejido vascular aislado as como en individuos sanos expuestos a presiones menores de oxgeno como sucede en las grandes altitudes. La PGI2 y el NO reducen la liberacin de la ET en tanto que la Ang II, la adrenalina, los steres de forbol y la interleucina-1 (IL-1) estimulan su produccin. La ET acta mediante receptores especficos, de los que se han descrito dos tipos, los ETA y los ETB. Los ETA se encuentran en las CMLV y median la contraccin inducida por ET-1 y la proliferacin de stas. Los receptores ETB se encuentran tambin en dichas clulas, pero principalmente en las clulas endoteliales y median la liberacin de PGI2 y NO inducida por ET-1 y ET-3, produciendo por tanto relajacin vascular, que podra modular su accin vasoconstrictora87. Adems de su accin vasoconstrictora y secretora a corto plazo, la ET-1 induce a largo plazo acciones mitognicas en diversos tipos de clulas como las clulas endoteliales, las CMLV, fibroblastos, clulas gliales y

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clulas mesangiales. Esta accin sugiere un posible papel de este pptido en procesos de crecimiento cardiovascular y renal, como el remodelado vascular, la hipertrofia ventricular y las alteraciones glomerulares proliferativas. Esta estimulacin de crecimiento celular se produce mediante el incremento de la expresin de varios protooncogenes que se han implicado en la regulacin de la transcripcin del ADN, incluyendo cmyc, c-fos y c-jun. Aunque la ET-1 es por s misma dbilmente mitognica, sta puede estimular la proliferacin de msculo liso de forma indirecta facilitando la produccin local de otro potente mitgeno como la Ang II; adems se ha descrito que la ET-1 potencia la actividad mitognica de otros factores de crecimiento88. Citocinas Son molculas peptdicas que actan aisladamente o en combinacin para promover la sntesis de protenas y el crecimiento celular, de manera autocrina y paracrina. Estas molculas se acoplan a receptores especficos de la membrana celular y activan sistemas de seales intracelulares, que inducirn la sntesis proteica regulada por protooncogenes. La sntesis de estos precursores est regulada, como se mencion, por factores de transcripcin, siendo uno de los ms importantes el NF-kB89. Dentro de las citocinas se distinguen las interleucinas, que se nombran por las siglas IL, seguidas de un nmero (IL-1, IL-6, etc), y otras molculas vinculadas a su efecto preponderante, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-). Las citocinas pertenecen a una familia de pptidos dentro de los cuales se encuentran factores de crecimiento, prolactina, eritropoyetina, factor de crecimiento transformante alfa (TGF-) y citocinas proinflamatorias. Estos pptidos tienen la capacidad de activar sistemas de transduccin de seales que regulan sntesis de protenas y expresin de genes, as como apoptosis90.

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Las IL son citocinas que estimulan las actividades vinculadas con el crecimiento de los leucocitos y otros tipos de clulas. Incrementan la proliferacin y diferenciacin celular, sntesis de ADN, secrecin de otras molculas biolgicamente activas y respuestas a estmulos inmunolgicos y/o inflamatorios. Como se ha observado a travs de esta seccin, el endotelio vascular posee funciones tan diversas como ser barrera selectiva, actuar en la regulacin de la homeostasis y la trombosis, la regulacin de las interacciones de los leucocitos con la pared vascular, la regulacin del tono vasomotor y el crecimiento de la mayora de los grupos celulares relacionados con el sistema cardiovascular. Sin embargo, en condiciones particulares el endotelio vascular puede modificar su fenotipo facilitando la vasoconstriccin, inflamacin y eventos relacionados con la trombognesis. Estas respuestas anormales se manifiestan en condiciones tales como hipercolesterolemia, hipertensin, diabetes mellitus, sin que en las primeras etapas de tales condiciones se produzca un cambio morfolgico91. Por otro lado, no hay que perder de vista las evidencias que existen de que estos cambios son precursores de aterosclerosis y predictores de futuros eventos vasculares92. Disfuncin endotelial La etiologa de la disfuncin endotelial es multifactorial, y los mecanismos subyacentes son complejos y no han sido completamente dilucidados. Entre esos factores destacan los cambios en la sealizacin de receptores por cambios en la membrana, alteraciones en la expresin y actividad de la eNOS, disminucin de la disponibilidad de tetrahidrobiopterina (BH4) e incremento de la produccin de O2-93. Sin embargo, el mecanismo ms comnmente propuesto como el causante de la disfuncin endotelial es la produccin excesiva de ERO. stas disminuyen la biodisponibilidad de NO y exacerban el estrs oxidativo local, reaccionando directamente con el NO para formar ONOO- el cual, a

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su vez, produce dao al endotelio94. Si la hiptesis de un desequilibrio entre la formacin de ERO y la capacidad del endotelio para destruir esas ERO es la causa de la disfuncin endotelial, las molculas denominadas antioxidantes que sean capaces de eliminar esas ERO, deberan revertir o prevenir dicha disfuncin. Esto es, que cualquier intervencin con antioxidantes podra proteger el endotelio por medio de la eliminacin de esas ERO y restablecer la biodisponibilidad de NO. En trminos generales, la disfuncin endotelial se define como la menor capacidad del endotelio vascular para producir vasodilatacin. Si bien el tono vascular est determinado por el balance entre los agentes vasoconstrictores y vasodilatadores, la disfuncin endotelial es debida en forma primaria a una reduccin en la biodisponibilidad de NO. El NO, como se mencion en los prrafos anteriores, es el principal responsable de la vasodilatacin arterial adems de regular la agregacin de plaquetas. La biodisponibilidad de NO se modifica por diversos mecanismos entre los que destacan la baja actividad de la eNOS o la degradacin misma del NO por un incremento en el estrs oxidativo, aspecto que se detalla ms adelante. Por otro lado, aunque la eNOS es una enzima constitutiva, diferentes factores patolgicos pueden regular su expresin. Uno de los ms importantes es el incremento de estrs oxidativo, el cual a su vez es definido como la ruptura en el balance de la produccin de agentes antioxidantes y pro-oxidantes. Especies reactivas de oxgeno Como se ha visto, las ERO y su funcin en el sistema vascular son de suma importancia para lograr un equilibrio en los mecanismos de comunicacin celular, de este modo el trmino estrs oxidativo tiene una acepcin muy amplia, sin embargo en la literatura se usa comnmente para referirse a condiciones en las que las clulas estn expuestas a niveles excesivos de

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ERO. En este sentido, es importante discriminar las ERO ms importantes no solamente por el posible dao que pueden causar, sino tambin desde un punto de vista de las vas de sealizacin que son relevantes en los procesos celulares. En las dcadas pasadas la investigacin de las ERO en el sistema cardiovascular ha sido objeto de mucho inters. stas constituyen un conjunto de molculas que, adems de las propiedades fisicoqumicas particulares, tienen una gama amplia de funciones a nivel celular. Debido a su importancia a continuacin se har una descripcin breve de aquellas ERO que son relevantes en los cambios patolgicos asociados a la hipertensin y posteriormente los mecanismos de comunicacin que se han encontrado. Anin superxido El O2- procede de la reduccin univalente del oxgeno molecular. A diferencia de otros radicales libres, caracterizados por su gran reactividad, el O2- slo es capaz de reaccionar eficazmente con un grupo reducido de molculas. Puede iniciar y propagar la oxidacin por radicales libres de catecolaminas, BH4 y otros compuestos relacionados, de ah su importancia en el desacoplamiento de la eNOS. No ataca de manera significativa a los cidos grasos insaturados o al ADN. Sin embargo es muy importante en fisiopatologa porque se genera en gran cantidad y fcilmente sufre una conversin hacia otras especies derivadas del oxgeno que son muy reactivas y dainas, tales como el OH95. El O2- se convierte rpidamente en perxido de hidrgeno a travs de una dismutacin: 2 H+ + 2 O2- H2O2 + O2

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Por otro lado, el O2- puede captar un electrn y dar lugar al radical hidroperxido (HO2), mucho ms reactivo que el O2-- No obstante, a pH fisiolgico menos del 1% del O2- estar en forma de hidroperxido: O2- + H+

HO2

La enzima ms importante en cuanto a la cantidad de O2- que produce es la NAD(P)H oxidasa, sin embargo, la NOS, en cualquiera de sus tres isoformas, tambin lo puede producir en condiciones de deficiencia, ya sea de L-arginina o su cofactor la BH4. Adems, existen otros sistemas enzimticos capaces de generar ERO en los vasos, tales como la xantina oxidasa (XO), citocromo P450, las enzimas de la cadena respiratoria mitoconrial y la mieloperoxidasa derivada de fagocitos32. Ms adelante se har una descripcin completa de la formacin de O2- por parte de la NAD(P)H oxidasa. Perxido de hidrgeno El H2O2 no es un radical libre como tal, pues no posee electrones desapareados en su capa de valencia. Es la forma menos reactiva de las ERO. Su importancia recae en el hecho de que participa en numerosas reacciones que dan lugar a la generacin de radicales libres y sobre todo a que est involucrado en mecanismos de sealizacin celular. La fuente ms importante de H2O2 es la dismutacin de O2- por las diferentes isoformas de SOD. Sin embargo, existen otros sistemas enzimticos capaces de producir H2O2 como es el caso de la NAD(P)H oxidasa que contiene la sub-unidad NOX496. En los ltimos tiempos se han incrementado las evidencias de que el H2O2 tiene un papel muy importante en la biologa vascular. Las propiedades fisicoqumicas de esta molcula le proporcionan caractersticas interesantes desde muchos puntos de vista como su mayor estabilidad en comparacin con el O2-, as como su permeabilidad en las membranas celulares va la utilizacin de

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aquaporinas97. El efecto de esta ERO en los vasos sanguneos a corto y largo plazo se est estudiando de manera intensiva. Se sabe que el H2O2 produce relajacin en muchos vasos sanguneos, pero puede producir vasoconstriccin dependiendo de la seccin de los vasos donde se ubique y de su concentracin98,99. La vasorrelajacin mediada por el H2O2 puede realizarse indirectamente por va dependiente e independiente del endotelio100,101. El H2O2 puede mediar respuestas vasculares a diversos estmulos como agonistas endotelio dependientes, estmulos modulados por el flujo sanguneo y al cido araquidnico102,103. Esta ERO tambin puede facilitar la formacin de otros vasodilatadores de los comnmente conocidos como EDHF adems de modificar la permeabilidad del endotelio104,105,106. Si se analizan los efectos a ms largo plazo, el H2O2 tiene la capacidad potencial de alterar la expresin de algunos genes que son fundamentales en la biologa cardiovascular. El H2O2 activa factores de transcripcin incluyendo NF-kB, estimula la expresin de eNOS e iNOS y componentes de la NAD(P)H oxidasa107,108,109. Por otro lado, existen evidencias sustanciales de que el H2O2 funciona como un mediador del crecimiento vascular contribuyendo de esta manera a la hipertrofia vascular producida en la hipertensin y a la progresin de la aterosclerosis110,114. Estudios recientes sugieren otro mecanismo mediante el cual el H2O2 puede alterar negativamente la funcin endotelial. Thengchaisri y col.111, mencionan que la aplicacin de H2O2 exgeno, incrementa tanto la expresin de arginasa I como la disminucin selectiva de la respuesta endotelio dependiente mediada por el NO en arteriolas coronarias. Las arginasas metabolizan la L-arginina a urea y L-ornitina, por lo que un incremento en la actividad de esta va reduce la disponibilidad de Larginina necesaria para la produccin de NO112.

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El H2O2 se puede originar a partir de diversas fuentes: - Por reduccin directa de una molcula de oxgeno por dos electrones. 2 O2 + 2 e- + 2H+
-

H2O2

- Por dismutacin del O2 , como se indic anteriormente.

- Como producto de algunas enzimas como glucosa oxidasa, uricasa, etc. - Por reacciones qumicas de autooxidacin. La detoxificacin del H2O2 se lleva a cabo por accin de la catalasa (CAT) y de la glutation peroxidasa (GPx), con la consecuente formacin de agua. Radical hidroxilo Se obtiene cuando el oxgeno molecular es reducido por tres electrones. Es la especie derivada de oxgeno ms reactiva. Su vida media estimada es muy corta, apenas de alrededor de 10-9 s, de modo que reacciona muy cerca de su lugar de formacin con la mayora de las biomolculas113. Este radical se genera por: 1. La ruptura del agua o del H2O2 por accin de las radiaciones ionizantes. H2O + h OH + H H2O2 + h 2 OH De este modo, puede formarse in vivo a consecuencia de radiacin de alta energa (rayos X, rayos ) que puede provocar rotura del agua corporal de acuerdo a la primera reaccin. Si bien la luz UV no tiene suficiente energa como para escindir una molcula de agua, pero puede dividir el H2O2 en 2 molculas de OH como en la segunda reaccin.

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2. Debido a la reduccin del H2O2 por iones de metales de transicin. El proceso ms importante en la formacin del OH es la llamada reaccin de Fenton en la que intervienen compuestos metlicos. H2O2 + Fe2+ Fe3+ + - OH + OH 3. Es posible que se genere tambin a partir de H2O2 y de O2- por la reaccin de Haber-Weiss. H2O2 + O2- O2 + - OH + OH

Produccin de ERO en el sistema vascular y fuentes enzimticas de ERO en los tejidos vasculares Las ERO se forman como intermediarios en los procesos celulares de xido-reduccin que llevan a la produccin de H2O a partir de O2. La reduccin univalente de oxgeno en presencia de un electrn libre forma O2- , H2O2 y HO. El O2- tiene un electrn desapareado de ah su alta reactividad y vida media corta. Es soluble en agua, sin embargo puede utilizar los canales aninicos para traspasar las membranas celulares, acta como agente oxidante cuando se reduce a H2O2, o como agente reductor cuando l se oxida formando ONOO- a partir de NO. En condiciones fisiolgicas, soluciones acuosas y pH neutro, se favorece la dismutacin de O2- a H2O2. Sin embargo, la formacin excesiva de O2- nos lleva a la formacin de ONOO- con el consecuente dficit de NO en las concentraciones fisiolgicamente adecuadas tan importantes para el mantenimiento de la relajacin vascular. El H2O2 se produce de manera espontnea a partir de la dismutacin del O2- o puede formarse de manera catalizada por la enzima SOD. Esta reaccin se favorece en concentraciones bajas de O2- y altas de SOD.

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En los tejidos vasculares, todas estas ERO se forman en diferentes concentraciones dependiendo de las condiciones que la misma homeostasis requiere y al mismo tiempo son reguladas por la SOD, CAT, tiorreductasa y el conjunto de vitaminas antioxidantes. En condiciones normales la velocidad de formacin de ERO est en equilibrio con su velocidad de eliminacin, sin embargo, un fallo en este equilibrio llevar a un incremento en la biodisponibilidad de las ERO y as, a un estado de estrs oxidativo. Las ERO se producen en el endotelio, capa adventicia, y en el msculo liso. Derivan principalmente de la NAD(P)H oxidasa que es una enzima de mltiples subunidades que cataliza la produccin de O2- mediante la reduccin de O2 con un electrn usando el NAD(P)H como donador de ste: 2 O2 + NAD(P)H 2 O2- + NAD(P)- + H + La NAD(P)H oxidasa vascular muestra cierta similitud, pero tambin notables diferencias con la NAD(P)H oxidasa de los fagocitos. Las enzimas vasculares tienen una velocidad y una actividad diferente a la de los fagocitos, ya que en stos la actividad es intermitente y violenta, propia del sistema inmunolgico mientras que en las clulas vasculares la velocidad es menor pero con una actividad ms sostenida. De hecho, la NAD(P)H oxidasa en el sistema vascular es estructuralmente diversa, ya que la estructura de las sub-unidades que la componen vara de acuerdo a su ubicacin, ya sea en las clulas del msculo liso o clulas endoteliales como se ver a continuacin. Estructura y funcin de la NAD(P)H oxidasa La NAD(P)H oxidasa que est mejor caracterizada y que es prototipo de estudios, como se mencion anteriormente, es la NAD(P)H oxidasa de

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fagocitos, de ah el nombre de las subunidades que la forman. La NAD(P)H oxidasa de fagocitos, tiene al menos cinco componentes: p47phox, p67phox, p40phox, p22phox y gp91phox. Como algunos componentes adicionales se incluyen algunas protenas G de tamao medio a pequeo Rac2 (Rac1 en algunas clulas) y Rap1A. En clulas sin estimular p40phox, p47phox y p67phox existen como unidades citoslicas, mientras que gp91phox y p22phox se encuentran en las membranas como una flavoprotena dimrica, citocromo b558. Cuando se fosforila se estimula el componente p47phox, las unidades citoslicas forman un complejo que migra hacia la membrana donde se asocia con el citocromo b558 para formar la enzima activa y de este modo poder transferir el electrn del NAD(P)H al sustrato que es el oxgeno molecular para formar el O2-114 (Figura 7). La fosforilacin de p47phox y p67phox es esencial para la activacin de la enzima, en contraste con p40phox que es un regulador negativo. La NAD(P)H oxidasa de los fagocitos, se activa slo con una estimulacin y reacciona de manera intermitente y violenta, con produccin de O2extracelular, mientras que en el sistema vascular la enzima es constitutivamente activa, preensamblada y produce O2- con efecto en el interior de las mismas clulas, esta produccin es lenta y sostenida, sirviendo como molculas de sealizacin intracelular (Tabla 4). Todas las subunidades de esta enzima caracterizadas en los fagocitos se expresan en los vasos. Las subunidades p47phox, p67phox, p22phox y gp91phox se expresan en las clulas del endotelio y de la capa adventicia, sin embargo, en las clulas del msculo liso, slo se expresan consistentemente p22phox y p47phox. Por ejemplo, en las clulas del msculo liso de aorta de rata se expresan p22phox y p47phox pero no gp91phox. Mientras que en las mismas clulas de msculo liso, pero de aortas humanas, se expresan todas las subunidades mayores incluyendo gp91phox. Estudios recientes han demostrado la existencia de homlogos

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de gp91phox (Nox1, Nox4 y Nox5) en el sistema vascular. En el msculo liso de aortas de rata, la expresin del ARNm de Nox1 parece apoyar el hecho de que sta es un sustituto de gp91phox115.

Figura 7.- Representacin de la estructura y funcin de la NAD(P)H oxidasa.

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Tabla 4.- Caractersticas de NAD(P)H oxidasa en fagocitos y en clulas vasculares.

Caracterstica Actividad en estado basal Inducida por: Nox2 homlogos Cintica de liberacin O2Concentracin de O2Sitio de generacin O2Sustrato Protena G

Neutrfilos Inactiva

Vascular

Activa Agentes vasoactivos, factores de Citocinas y patgenos crecimiento, citocinas Nox1/Nox2/Nox4/ Nox2 Nox5 Intermitente y violenta Alta Extracelular NAD(P)H Rac 2 Lenta y sostenida Baja Intracelular NADH/NAD(P)H Rac 1

La NAD(P)H oxidasa vascular estara regulada por varios factores humorales, incluyendo citocinas, factores de crecimiento, agentes vasoactivos y factores como la tensin de cizalladura y la velocidad de deformacin. De particular importancia con respecto a la hipertensin es la Ang II, que estimula la activacin de la NAD(P)H oxidasa, aumenta la expresin de las subunidades de la enzima e induce la formacin de ERO en las CMLV, clulas endoteliales y fibroblastos en la capa adventicia. Los mecanismos de comunicacin Ang II/AT1 y NAD(P)H oxidasa no han sido totalmente dilucidados, sin embargo se sabe que, por ejemplo, la PKC, fosfolipasa A (PLA) y Rac, estn asociados en la sealizacin de AT1 a NAD(P)H oxidasa. Del mismo modo que el PDGF y el TGF-, el TNF- y la

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trombina, activan la NAD(P)H oxidasa de las CMLV, la ET-1 lo hace en las clulas endoteliales116. En el sentido contrario, las estatinas y los antihipertensivos como los bloqueantes, los bloqueantes de canales de calcio, inhibidores de la ECA y los bloqueantes de los receptores AT1, regulan negativamente la expresin de las diferentes subunidades y la actividad de la enzima. Otras fuentes enzimticas de ERO en el sistema vascular La NOS que es la enzima responsable de la produccin de NO tambin puede generar O2- en deficiencia de concentraciones de sustrato, es decir, bajas concentraciones de L-arginina, y/o de su cofactor BH4. Esto nos lleva al concepto de eNOS desacoplada, que a su vez produce una concentracin deficiente de NO, y a la produccin de O2- asociada a la misma enzima. La eNOS desacoplada est altamente correlacionada con la aterosclerosis, diabetes, hiperhomocisteinemia e hipertensin117,118,119,120. En la hipertensin, la produccin de O2- por parte de la NAD(P)H oxidasa, aumenta la biodisponibilidad de ERO con la consecuente oxidacin de BH4 a BH3, el desacoplamiento de la eNOS y una produccin de ERO aadida a la que ya existe. Llama la atencin que la transferencia del gen de la GTP ciclohidrolasa, enzima responsable de la regeneracin de BH4, restablece la actividad enzimtica arterial, el incremento de los niveles de BH4, reduce la produccin de ERO y mejora la relajacin dependiente del endotelio en ratas hipertensas. En definitiva, en los ltimos aos se han descrito una serie de asociaciones entre diferentes patologas como la hipertensin y la hipercolesterolemia con una mayor produccin de ERO, en particular de O2-, por parte de la NAD(P)H oxidasa121.

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Molculas diana y efectos vasculares de las ERO A pesar de que las ERO han sido identificadas como transductores de seales en muchas vas celulares, las molculas diana no han sido perfectamente definidas. Las ERO exgenas activan las MAPcinasas que son importantes en el crecimiento celular, inflamacin, apoptosis y diferenciacin celular. Sin embargo, las molculas diana de las ERO mejor identificadas son las tirosn-fosfatasas y sus factores de transcripcin. La oxidacin de un residuo de cistena por H2O2 produce el estado inactivado de la tirosn-fosfatasa. De este modo las ERO inhiben la actividad de estas enzimas, se produce un incremento en la fosforilacin de tirosina que conlleva la activacin del receptor de la protena tirosn-cinasa inducido por estrs oxidativo. Adems de estos procesos asociados al crecimiento celular y a la inflamacin las ERO modulan la concentracin intracelular de Ca++ libre, que es un elemento importante en la contraccin-relajacin vascular. Se puede considerar que los efectos vasculares de las ERO se dividen en dos grandes reas: el crecimiento e inflamacin vascular y los efectos en la contraccin-dilatacin. Las ERO estimulan los factores de crecimiento y multiplicacin celulares tales como la fosforilacin de las MAPcinasas, la tirosin-cinasa activadora de la sntesis de ADN e incrementan la expresin de protooncogenes122. Las ERO tambin regulan la estructura vascular en la hipertensin, mediante el incremento en la formacin de matrices proteicas extracelulares de fibronectina y colgeno. El O2- y el H2O2 promueven la degradacin de la elastina. Este proceso, sensible a los cambios redox, es inflamatorio e incluye la expresin de otras molculas como la IL-6, VCAM-1, ICAM-1 y la peroxidacin de lpidos. Aspectos, que sumados, contribuyen al remodelado vascular en la hipertensin123.

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Produccin de ERO en el desarrollo de hipertensin arterial Las ERO tienen un papel primordial en la fisiopatologa de la HTA. Esto se ha puesto en evidencia debido a que las diversas maneras de medir el estrs oxidativo han demostrado que ste se encuentra aumentado en la HTA y a que el tratamiento con diferentes agentes antioxidantes o con inhibidores de la NAD(P)H oxidasa reducen el estrs oxidativo, la PA e inclusive pueden prevenir el incremento de la misma en modelos animales de hipertensin. En ratas genticamente hipertensas (SHR) o ratas genticamente hipertensas Stroke Prone (SHR-SP) se manifiesta un incremento en la generacin de O2- mediado por la NAD(P)H oxidasa en arterias de resistencia, vasos de conductancia y en rin124,125. Estos procesos estn asociados a un aumento en la expresin de algunas sub-unidades de la NAD(P)H oxidasa, particularmente p22phox y p47phox, as como un incremento en la actividad propia de la enzima. De la misma manera, los marcadores de dao en el ADN generado por el estrs oxidativo como la 8-hidroxi-2-desoxiguanosina y la carbonilacin de protenas, marcador del estado de oxidacin de protenas, estn incrementados en la aorta, corazn y rin de ratas SHR y SHR-SP en comparacin con los animales normotensos Wistar Kyoto. Tambin se ha observado un aumento en la expresin de p47 phox en el lecho vascular renal y mcula densa de ratas SHR jvenes, sugiriendo una regulacin al alza de la NAD(P)H oxidasa a nivel renal que precede al desarrollo de la HTA126. La importancia de p47phox ha sido demostrada mediante ratones que no codifican para esta protena (p47phox-/-) en los cuales el desarrollo de hipertensin producida por la infusin de Ang II falla127. Adems, la disminucin de la biodisponibilidad de NO como consecuencia del aumento en la generacin de O2- vascular puede tambin contribuir al estrs oxidativo en modelos SHR y SHR-SP. Tratamientos con vitaminas antioxidantes, inhibidores de la NAD(P)H oxidasa, BH4 y bloqueantes del receptor AT1 disminuyen la

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produccin vascular de O2- y atenan en diferentes grados el desarrollo de la HTA en esos modelos animales. Tratamientos muy prolongados o de por vida en modelos SHR pueden inclusive prevenir el desarrollo de la HTA128. En modelos experimentales donde se provoca la HTA: infusin de Ang II, induccin por sal en ratas sensibles Dahl, HTA inducida por mineralocorticoides, etc, tambin se ha observado que el incremento de la presin arterial, se asocia a una mayor actividad de la NAD(P)H oxidasa, XO y a un desacoplamiento de la eNOS como ya se ha mencionado. La inhibicin de la produccin de ERO con alopurinol o apocinina y la eliminacin de radicales libres con antioxidantes disminuyen la presin arterial y previenen el desarrollo de la HTA en esos mismos modelos129. Esas mejoras, van acompaadas con cambios positivos en la disfuncin endotelial, con regresin en la hipertrofia vascular, as como con una menor inflamacin vascular130. Es importante mencionar que la induccin de HTA por norepinefrina no se asocia a un aumento en el estrs oxidativo vascular y que la SOD no previene el aumento en la PA, lo que sugiere que la PA, por s misma, no es la causa primaria del estrs oxidativo en la HTA131. Estudios clnicos indican que los pacientes con HTA esencial producen una cantidad excesiva de ERO y tienen disminuida su capacidad antioxidante132. En la mayora de los estudios, los pacientes hipertensos son sensibles a la sal y presentan algn grado de disfuncin renal133. De la misma manera, se ha demostrado que existe estrs oxidativo en otras patologas como la hipertensin maligna y la pre-eclampsia134,135.

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La disminucin de la actividad antioxidante y niveles reducidos de antioxidantes y scavengers de ERO, como vitamina E, glutatin, SOD y una actividad mayor de la NAD(P)H oxidasa, contribuyen al estrs oxidativo en pacientes con HTA. La puesta en marcha del sistema reninaangiotensina se ha propuesto como el mediador ms importante en la activacin de la NAD(P)H oxidasa y la produccin de ERO en hipertensos136. De hecho, algunos de los efectos de la disminucin de la PA de los bloqueantes del receptor AT1 y de los inhibidores de la enzima convertidora de Ang II, se atribuyen a una menor actividad de la NAD(P)H oxidasa y por lo tanto una menor produccin de ERO137. Basados en las evidencias experimentales y clnicas, se sabe que el estrs oxidativo tiene un papel importante en el dao vascular por lo que ha habido gran inters en el desarrollo de estrategias que tienen como objetivo las ERO para el tratamiento de la HTA y otras enfermedades cardiovasculares. Algunas aproximaciones teraputicas han considerado incluir mecanismos para incrementar la disponibilidad de antioxidantes por medio de la dieta o por medio de suplementacin, con el fin de reducir la cantidad de ERO138. En la tabla 5 se resumen las formas clnicas y experimentales de hipertensin y su relacin con el estrs oxidativo.

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Tabla 5.- Diferentes formas experimentales y clnicas de HTA y su relacin con 33 el estrs oxidativo. Adaptada de Touyz y Schiffrin 2004 .

Tipo de hipertensin HTA Humana: - Moderada - Severa - Sensible a la sal - Maligna - Renovascular - Pre-eclampsia Formas genticas de HTA: - SHR - SHR-SP HTA inducida experimentalmente - Infusin de Ang II - Infusin de Norepinefrina - Dahl sensible a sal - Asociada a obesidad HTA postmenopausia HTA mineralocorticoide

Biodisponibilidad de ERO Sin cambio Incrementa Incrementa Incrementa Incrementa Incrementa Incrementa Incrementa Incrementa Sin cambio Incrementa Incrementa Incrementa Incrementa

Relacin entre disfuncin endotelial y antioxidantes Todas las clulas aerbicas estn sujetas a la presencia de ERO, que tienen un papel muy importante desde el punto de vista fisiolgico, especficamente en la sealizacin. Sin embargo, cuando se pierde el balance sugerido en la figura 8 aparece el estrs oxidativo y con l la cascada de reacciones no deseadas como aquellas que se asocian a las vas metablicas del NO139.

Introduccin 57

Hipertensin

Xantina oxidasa

NAD(P)H oxidasa

eNOS desacoplada

SOD

O2NO

Oxidacin BH4

H2O2

Estrs oxidativo
ERO

Biodisponibilidad de NO Hipertrofia Agregacin plaquetaria Remodelado

Disfuncin endotelial
Prdida de vasodilatacin Inflamacin

Figura 8.- Relacin entre disfuncin endotelial, estrs oxidativo y fuentes enzimticas de especies reactivas de oxgeno. Adaptado de Cai98.

As, el organismo ha desarrollado una serie de mecanismos de defensa antioxidante enzimtica y no enzimtica diseados para protegerse de la accin de los radicales libres140.

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Los antioxidantes pueden actuar de las siguientes formas: Previniendo la formacin de ERO. Interceptando el ataque de ERO. Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtindolos en molculas menos reactivas. Amplificando la resistencia de las dianas biolgicas sensibles al ataque de ERO. Facilitando la reparacin del dao causado por ERO. Manteniendo un ambiente favorable para la actuacin de otros antioxidantes.

Desde el punto de vista de la fisiologa celular, los antioxidantes se clasifican en: antioxidantes primarios, secundarios y terciarios. Los antioxidantes primarios previenen la formacin de nuevas especies de radicales libres. Actan eliminando los radicales libres o especies que sirven como sustrato o coadyuvantes para generarlos convirtindolos en molculas menos dainas, o impidiendo su formacin. Dentro de este grupo se incluye a la SOD, la GPx, la CAT y las protenas ligadoras de metales como la ferritina. Los antioxidantes secundarios son protectores no enzimticos que intervienen cuando hay superproduccin de radicales libres y los sistemas enzimticos estn desbordados, previniendo as las reacciones en cadena. Se comportan como tal el glutatin, la vitamina E, la vitamina C, el cido rico, la bilirrubina, la albmina y toda la gama de carotenoides y xantofilas. En ltima instancia, los antioxidantes terciarios ejercen su defensa mediante la reparacin de biomolculas daadas por los radicales libres. Entre ellos se encuentran los sistemas proteolticos intracelulares, que actan degradando protenas oxidadas, evitando de este modo su acumulacin. Tambin podemos destacar las enzimas reparadoras de ADN y la metionina sulfxido reductasa.

Introduccin 59

Debido a su importancia en los mecanismos asociados a la HTA a continuacin se describen las principales caractersticas de las tres enzimas consideradas como antioxidantes primarios. Superxido dismutasa Existen tres isoformas de SOD, que proceden de diferentes genes, pero catalizan la misma reaccin: 2 H+ + 2 O2- H2O2 + O2 Las tres isoformas de SOD son: la citoslica o cobre-zinc SOD (CuZnSOD o SOD-1), la manganeso SOD (MnSOD o SOD-2) situada en las mitocondrias y una forma extracelular de Cu-ZnSOD (EC-SOD o SOD-3). Slo en los ltimos tiempos se ha puesto nfasis en la importancia de estas tres isoformas de SOD en los vasos sanguneos, su expresin y actividad presumiblemente tiene un importante efecto en la respuesta de las clulas vasculares al estrs oxidativo agudo y crnico. La compartimentalizacin de varias ERO tiene una relacin directa sobre la actividad y caractersticas de las SOD141. Como se mencion la SOD dismuta el O2- en H2O2 y O2. Existen varias consecuencias funcionales de esta actividad. Primero la SOD protege contra la citotoxicidad mediada por O2- que implica la inactivacin de protenas mitocondriales que contienen hierro y azufre como la fumarasa y la aconitasa. Esta proteccin es de vital importancia, ya que el dao a esos complejos protenicos produce hierro libre con la subsecuente formacin de OH. Adems, el NO reacciona con el O2- a una velocidad tres veces mayor que la dismutacin del O2- por la SOD79,142. Debido a la alta eficiencia de la primera reaccin, la concentracin local de SOD es una clave fundamental en la biodisponibilidad del NO. Por ello, otra funcin importante de la

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SOD es proteger el NO, aumentar su biodisponibilidad y, en consecuencia, las vas de sealizacin donde ste est involucrado como la vasorrelajacin. Por otro lado, se sabe que la reaccin del NO con el O2produce ONOO- un oxidante muy potente que puede producir citotoxicidad133. Cada vez se acumulan ms evidencias de que el ONOOpuede tener diversos efectos negativos: Nitracin selectiva de los residuos de tirosina en protenas como prostaciclina sintasa y MnSOD143. Activacin de poli ADP-ribosa polimerasa y la expresin de la iNOS ambos mediadores importantes en la disfuncin vascular en estados patolgicos144,145. Oxidacin de BH4146. Oxidacin del complejo zinc-tiolato en la eNOS.

Estos dos ltimos efectos, producen el desacoplamiento de la eNOS con la subsecuente formacin de ms O2-147. Una tercera consecuencia funcional de la actividad de la SOD es la formacin de H2O2. Como se ha mencionado, el H2O2 es relativamente estable y puede difundir incluso a travs de las membranas celulares, por lo que se considera otra molcula de sealizacin como el NO. Por ejemplo, el H2O2 participa en la expresin de los genes relacionados con el crecimiento de msculo liso vascular y por ende en la hipertrofia vascular148. Tambin puede activar factores de transcripcin especficos y participar como EDHF en algunos tipos de vasos100,149,150,151. Cu-ZnSOD Se sabe que esta isoforma de SOD es la que se expresa en mayor cantidad en todas las clulas, includos los vasos sanguneos. Este patrn se ha observado en modelos animales como ratones y en seres humanos. Sin embargo, la importancia funcional de esta isoforma no ha sido sencilla de

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evaluar, ya que sus inhibidores no son especficos152. Mediante ratones modificados genticamente, se ha observado que la deficiencia en Cu-Zn SOD conlleva un incremento en los niveles de O2- y de ONOO-, incremento en el tono biognico, respuesta vasoconstrictora aumentada y deficiencia en la respuesta relajante endotelio dependiente mediada por el NO tanto en arterias como en microvasos153,154,155. Las alteraciones en la expresin de esta isoforma pueden modificar la estructura vascular produciendo, por ejemplo, hipertrofia en arteriolas cerebrales. Estos hechos son las primeras evidencias directas de que la Cu-ZnSOD est involucrada en la inhibicin de la hipertrofia vascular y en el concepto, cada vez ms importante, del papel de las ERO en el mismo proceso156. Diversos estudios con modelos animales donde se ha sobre-expresado la Cu-ZnSOD han servido para dilucidar la importancia de sta en la homeostasis y en los mecanismos de sealizacin157,158,159. De hecho, en la medida que se compruebe el papel del H2O2 como EDHF, se estara pensando en la CuZn SOD como una verdadera EDHF-sintasa161. MnSOD En condiciones normales, la cadena respiratoria o cadena de transporte de electrones mitocondrial es la fuente ms importante de produccin de O2convirtiendo aproximadamente el 5% del O2 en O2-160. Debido a su localizacin subcelular, la MnSOD es considerada como la primera lnea de defensa contra el estrs oxidativo. Esta afirmacin ha sido respaldada por el hecho de que ratones deficientes en MnSOD mueren en apenas unas semanas despus de su nacimiento o presentan una serie de fenotipos anormales: dao neurodegenerativo, anormalidades cardiacas y dao mitocondrial extensivo. En trminos generales los niveles de MnSOD en los vasos sanguneos son bajos comparados con Cu-ZnSOD y EC-SOD. Sin embargo, a nivel del endotelio se expresan niveles altos de MnSOD161. Adems se ha comprobado que existe una expresin diferencial de la MnSOD en los vasos sanguneos dependiendo de la regin

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anatomofisiolgica de que se trate162,163. Tanto la actividad como la expresin de MnSOD pueden modificarse por condiciones fisiolgicas severas o condiciones patolgicas. La MnSOD se regula al alza por estrs oxidativo, el gen que codifica para este enzima, contiene factores de iniciacin que son sensibles a factores de transcripcin que, a su vez, son dependientes del estado redox como la AP-1 y el NF-kB152. La sobreexpresin de la MnSOD mediante la transferencia de genes ha producido efectos beneficiosos en varios modelos de patologas vasculares reduciendo la concentracin de O2 y mejorando la funcin endotelial en hipercolesterolemia, diabetes e hipertensin164,165. EC-SOD La EC-SOD es la nica forma de SOD que se expresa a nivel extracelular, se une a los tejidos mediante un dominio de heparina que le da afinidad por el sulfato de heparina de los pptidoglicanos presentes en la superficie celular, en las membranas basales y en la matriz extracelular. La EC-SOD se localiza en toda la pared de los vasos, particularmente entre el endotelio y las clulas de msculo liso166,167. La fuente ms importante de EC-SOD est en las clulas musculares, pues al parecer el endotelio no la produce168. Excepto para algunos tejidos como en el cerebro, la EC-SOD representa la mayor proporcin de actividad SOD. La actividad de la EC-SOD en los vasos puede alterarse en respuesta a varios estmulos como el ejercicio, factores de crecimiento, citocinas, Ang II, NO y estados patolgicos como hipertensin, diabetes y aterosclerosis169,170. Con base a su localizacin extracelular, se han hecho hiptesis de que al menos uno de los principales papeles de la EC-SOD es proteger al NO en su difusin del endotelio a las CMLV171. Con el fin de dilucidar el papel de la EC-SOD en los vasos sanguneos, se han realizado diversos experimentos en modelos animales modificados genticamente. En aorta de ratones deficientes en EC-SOD se ha encontrado incremento en O2 , deficiencia en la actividad basal del NO

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y prdida de la relajacin endotelio dependiente172,173,174. Por otro lado, estudios con estrategias de sobre-expresin de EC-SOD han revelado efectos protectores reduciendo los niveles de PA en ratas SHR175. Como se mencion con anterioridad, se ha sugerido que la EC-SOD es determinante en la biodisponibilidad del NO en los vasos168. Su funcin es proteger el NO durante todo el trayecto desde su lugar de produccin en el endotelio hasta el msculo liso. Desde este punto de vista es notable que la deficiencia de EC-SOD y de Cu-ZnSOD sobre la funcin endotelial es muy parecida y la expresin normal de estas dos isoformas ser esencial en la homeostasis. Catalasa La CAT es una enzima que se encuentra normalmente en los peroxisomas de las clulas de los mamferos. Es una enzima que tiene una estructura tetramrica que contiene cuatro subunidades idnticas de 60 KDa dispuestas de manera tetradrica. Cada una de estas subunidades tiene un centro activo con un grupo hemo y NAD(P)H. Se puede considerar en general que este grupo de enzimas tiene dos actividades que dependen de la concentracin de H2O2. Por un lado, si la concentracin de H2O2 es alta, esta enzima cataliza su conversin a O2 y H2O. Sin embargo, a bajas concentraciones de H2O2 y en presencia de un donador asequible de hidrgeno, como etanol, metanol, fenoles u otro, la CAT acta produciendo peroxidacin, eliminando el H2O2 pero oxidando su sustrato. Es un hecho que el estrs oxidativo participa en diversas enfermedades vasculares en los seres humanos, por lo que tambin se ha utilizado en modelos animales para discernir su papel en las patologas mencionadas. Sin embargo, dada la complejidad de las interacciones de las ERO en los vasos sanguneos y debido a su compartamentalizacin, ha sido difcil definir completamente el papel de cada ERO. Actualmente existe gran

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inters en el papel del H2O2 en la biologa vascular tanto como molcula de sealizacin como por su relacin con diversas patologas. Glutation peroxidasa La GPx es en realidad un conjunto de isozimas ampliamente distribuidas en los tejidos de los vertebrados, que promueven la degradacin de H2O2 mediante el uso de glutatin reducido (GSH) a H2O y glutatin oxidado (GSSG) de acuerdo a: H2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG Como se mencion, se distribuye ampliamente en los tejidos y puede tener actividad sobre otros perxidos diferentes al H2O2 lo que la hace relevante para la homeostasis en los vasos. Cataliza la reduccin GSH dependiente de cualquier lipoperxido (LOOH) a su correspondiente alcohol (LOH). LOOH + 2GSH LOH + H2O + GSSG Esta conversin representa un mecanismo de defensa antioxidante muy importante. Las enzimas de este grupo son tetramricas y requieren de selenio para su actividad. Este selenio participa en la reaccin cataltica y es la base de la importancia que se le da al consumo de selenio como micronutriente. Investigaciones sobre la estructura y el mecanismo cataltico de la GPx han revelado que un residuo selenocistena presente en el sitio activo es fundamental para su actividad. En el ciclo cataltico, el selenol en el residuo selenocistena reducido es oxidado por el hidroperxido para producir cido selnico, el cual es posteriormente convertido a selenio sulfuro por ataque nucleoflico de GSH. Posteriormente el selenio sulfuro reacciona con un segundo equivalente de GSH para regenerar el estado reducido176. La mayora de las GPx actan sobre el H2O2 e hidroperxidos de cidos grasos y de colesterol, pero no sobre lpidos esterificados como los presentes en las lipoprotenas, sin

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embargo, otras isoformas pueden actuar sobre estos ltimos. Como se ha observado, el GSH tiene un papel fundamental en la actividad de esta enzima, pero tambin est involucrado en otras vas antioxidantes incluyendo la eliminacin directa de oxidantes, el metabolismo del ascorbato, el mantenimiento de los grupos SH de las protenas y la detoxificacin de xenobiticos mediante las enzimas glutation Stransferasas. En los ltimos aos, se han incrementado los esfuerzos para evaluar el papel de diferentes antioxidantes en la hipertensin, en la disfuncin endotelial asociada, en la hipertrofia cardiaca y el remodelado vascular125,177,178,179,180.

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Objetivos

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Cada vez existen ms evidencias de que la hipertensin est asociada con el estrs oxidativo, que es un evento precoz en el desarrollo de la disfuncin endotelial y la subsecuente enfermedad cardiovascular. La etiologa de la disfuncin endotelial es multifactorial, en la que destacan los cambios en la sealizacin de receptores, alteraciones en la expresin y actividad de la eNOS, disminucin de la disponibilidad de BH4 e incremento de la produccin de O2-. El mecanismo ms comnmente propuesto como causante de la disfuncin endotelial es la produccin excesiva de ERO. Si la hiptesis de un desequilibrio entre la formacin de ERO y la capacidad del endotelio para destruirlas, es la causa de la disfuncin endotelial, entonces las molculas que sean capaces de limpiar esas ERO deberan revertir o prevenir dicha disfuncin. Previsiblemente la intervencin con antioxidantes podra ejercer este efecto, proteger el endotelio y restablecer la biodisponibilidad de NO. Teniendo en cuenta la relacin existente entre la HTA y el balance redox nos planteamos el presente estudio con astaxantina, un carotenoide de origen natural con elevado poder antioxidante, para lo cual nos propusimos los siguientes objetivos: 1. Determinar el efecto antihipertensivo que tiene la administracin de astaxantina, un antioxidante de naturaleza oxicarotenoide, en diferentes modelos animales de hipertensin. 2. Estudiar el efecto de astaxantina sobre las alteraciones funcionales y estructurales provocadas por la hipertensin en los rganos diana. 3. Evaluar el efecto de la astaxantina sobre la produccin de especies reactivas de oxgeno y su relacin con los cambios funcionales y estructurales.

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Mtodos y Resultados

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DISEO EXPERIMENTAL Con el fin de determinar el efecto antihipertensivo de la astaxantina, se utilizaron dos modelos de hipertensin gentica (modelos 1 y 3) y un modelo de hipertensin inducida (modelo 2): Modelo 1. Ratas espontneamente hipertensas (SHR). Este es un modelo de hipertensin desarrollado en 1963, a partir de ratas WistarKyoto, por medio de la seleccin y cruce de machos de hipertensin moderada y hembras con hipertensin establecida y se considera un modelo de hipertensin donde se ha seleccionado el fenotipo. Los animales tienen la PA elevada y presentan fenotipo de dao en rganos similares a los observados en la hipertensin esencial en humanos incluyendo hipertrofia del ventrculo izquierdo, ataque al corazn y fallo renal181. Modelo 2. Ratones Swiss Albino-CD1 con hipertensin inducida. Ratones macho Swiss Albino pertenecientes a la cepa CD1 (Swiss AlbinoCD1). La hipertensin se desarroll mediante la infusin, durante 14 das, de 1000 ng/kg/min de Ang II, utilizando minibombas osmticas (Alzet miniosmotic pump, model 1002, EE.UU.) que se insertaron en la zona dorsal de los animales. Modelo 3. Ratones modificados genticamente para las protenas Vav3. Estas protenas son factores de intercambio GDP-GTP que estimulan las GTPasas Rho y Rac, que a su vez son esenciales en la regulacin de la homeostasis del sistema cardiovascular. Los ratones que no expresan Vav3 (Vav3-/-) consituyen un nuevo modelo en la investigacin cardiovascular, ya que muestran taquicardia, hipertensin arterial sistmica y un remodelado cardiovascular extensivo. Estas disfunciones estn asociadas, entre otras cosas, a una hiperactividad de neuronas simpticas desde el nacimiento. Los altos niveles de

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catecolaminas relacionados con esta condicin conllevan la activacin del SRA, el incremento en los niveles de hormonas relacionadas con el rin y la prdida progresiva de la homeostasis cardiovascular y renal182. En los tres modelos, la astaxantina se incorpor a una dieta estndar preparada por nosotros, de acuerdo a las recomendaciones para estudios de nutricin del Instituto Americano de Nutricin183 (Tabla 6). La astaxantina utilizada (Lucatin Pink astaxantina 10% en polvo) fue suministrada por BASF. Los experimentos se han realizado teniendo en cuenta las disposiciones legales existentes referidas a la proteccin de los animales utilizados para experimentacin y otros fines cientficos: a) Directiva 2003/65/CE del Parlamento Europeo y del Consejo por la que se modifica la Directiva 86/609/CEE (Diario oficial de la Unin Europea). b) Real Decreto 1201/2005. BOE 21 de octubre de 2005. Los animales se mantienen en el estabulario del Servicio de Experimentacin Animal de la Universidad de Salamanca (USAL) (Registro N P.A.E.-SA001), alojados en jaulas a una temperatura constante de 22 C, con una humedad ambiental del 60% y con un tiempo de luz regulado con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Los animales se distribuyen en un mximo de tres por jaula con acceso libre a comida y bebida.

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Tabla 6.- Composicin del pienso elaborado para el estudio de acuerdo al Instituto Americano de Nutricin.

Ingrediente Casena1 Almidn2 Sacarosa6 Celulosa1 D/L metionina1 Minerales4 Vitaminas

Pienso control (g/kg pienso) 225 358,5 248 31 1 14 11 110 2,5 -

Aceite de maz Astaxantina*

Colato de sodio3

Sigma Aldrich, 2Panreac, 3Fluka, 4MP Biomedicals, 5ICN Biomedicals, Azucarera Ebro, 7USUA. * La astaxantina se adicion en los grupos tratados en csp.

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MODELO 1. RATAS SHR Utilizamos ratas SHR machos pertenecientes a la cepa SHR/Kyo@Rj, procedentes de los laboratorios Janvier en Francia. Los animales se adquirieron con una edad de 10 semanas, y tras dos semana de aclimatacin en el Servicio de Experimentacin Animal de la USAL, cuando los animales llegaron a las 12 semanas de edad, se inici el tratamiento que tuvo una duracin de 8 semanas. Previamente se pesaron y se midi la presin arterial sistlica (PAS) para distribuir aleatoriamente a los animales en los siguientes grupos: SHR-Control: ratas SHR SHR-Axt 200: ratas SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina SHR-Axt 75: ratas SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina El pienso y el agua consumidos se midieron cada tres das. Semanalmente se pesaron los animales con el objeto de ajustar la dosis de astaxantina a la cantidad correspondiente de acuerdo a los cambios en el peso corporal. Peridicamente se midieron la PAS y la FC.

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1. Presin arterial sistlica, frecuencia cardiaca y peso Metodologa La PAS se midi en la arteria caudal, mediante un mtodo incruento, con un equipo NIPREM 546 (Cibertec S.A., Espaa). El fundamento de la medida consiste en comprimir el tejido alrededor de la arteria de la cola mediante una banda neumtica, hasta la oclusin completa de la arteria, un detector de radiacin infrarroja colocado en la cola transforma la seal trmica en elctrica que se registra por medio de un ordenador. Segn se observa en la figura 9, la desaparicin de la seal (a) permite afirmar que se ha producido la oclusin de la arteria. La disminucin controlada de la presin en la banda neumtica se acompaa de la aparicin de la onda de pulso en la cola (b). La presin neumtica medida en ese punto es igual a la presin sistlica en la arteria (c). El registro de la onda pulstil permite medir simultneamente la FC, en pulsaciones por minuto (ppm), a partir de este registro (d). Este mtodo tiene la ventaja de ser simple, reproducible, no traumtico y permite trabajar con el animal despierto. Para obtener buenos resultados es conveniente habituar al animal a este tipo de manipulacin antes de realizar las medidas definitivas, para lo cual es importante comentar que, en todos los casos, la presin se midi al menos una semana antes del inicio de los tratamientos con el fin de que los animales reconocieran el manejo a que son sometidos y siempre en un lugar con temperatura, ruido y limpieza adecuados para su bienestar184.

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Las determinaciones se realizaron en animales despiertos situndolos en un cepo que deja la cola en libertad. Para captar mejor la seal se procedi primero a la dilatacin de la arteria caudal, colocando los animales en un entorno con una temperatura entre 36-38 C durante un periodo aproximado de 10 minutos. A continuacin se coloca el transductor y la banda neumtica y se procede al registro de la presin arterial tomando como criterio vlido la obtencin de diez valores seguidos con una variacin no superior a 10 mmHg y con seales claras de FC y pulso. En todos los casos se determin el valor de la PAS, as como la FC antes de comenzar el tratamiento y a las 1, 2, 3, 4, 6 y 8 semanas despus del inicio del estudio.

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10 10 P U L S O

PULSO

5 5 0 -5 -5 -10 -10

b b

200 P 200 R 150 150 E 100 S 100 I 50 50 0 N

PRESIN

FRECUENCIA

800 800

600 P 600 p 400 400 m 200 200 0 0 0, 5, 5, 10,

Figura 9.- Ejemplo de registro de presin arterial sistlica (mmHg) y frecuencia cardiaca (ppm).

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Resultados Todos los resultados se expresan como media aritmtica el error estndar de la media (EEM) de un mnimo de 10 experimentos, el anlisis estadstico se realiz de acuerdo al apartado 2 del anexo 2. Los valores de PAS al inicio y final del estudio se muestran en la tabla 7, donde se pueden observar tambin los valores de la FC y del peso corporal. Como se puede ver, al inicio del experimento no existi diferencia estadsticamente significativa en ninguno de los parmetros entre los grupos SHR-Control, SHR-Axt 75 y SHR-Axt 200. Como se observa, al final del estudio el tratamiento con astaxantina disminuy de manera significativa la PAS mientras que en los valores de FC y peso corporal no existi diferencia significativa. Por otro lado, al comparar los dos tratamientos de astaxantina entre s, se destacan algunos aspectos: en ambos casos disminuy la PAS y conforme avanz el experimento se observ un efecto dosis respuesta, quedando por abajo la PAS del grupo SHR-Axt 200 con una diferencia significativa con el grupo SHR-Axt 75 al final del experimento. La disminucin en la PAS producida por la astaxantina fue de 18 3 y 8 2 mmHg en las dos dosis usadas con respecto a sus propios valores iniciales y mayor con respecto al grupo SHR-Control si se tiene en cuenta que la PAS de ste subi a lo largo del estudio (Figura 10). Se puede observar que a partir de la primera semana de experimentacin se hizo evidente la diferencia en la PAS entre el grupo control y los dos grupos tratados con astaxantina, de hecho a partir de ese momento se present una diferencia significativa que se mantuvo hasta el final del experimento. En lo concerniente a los valores de frecuencia cardiaca, no existi diferencia entre los tres grupos de estudio. En cuanto a los valores de peso corporal no hubo diferencia significativa al inicio del experimento aunque los animales del grupo experimental SHR-

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Axt 75 tienen un peso un poco mayor pues corresponden a un lote de animales diferente aunque de la misma edad (Tabla 7). Las diferencias que se observaron en los valores posteriores, slo se asocian al mismo hecho. Este hecho es importante, ya que revela que el tratamiento con astaxantina no influy de manera negativa en el crecimiento y el desarrollo normal de los animales. En este sentido cabe adems comentar que este comportamiento, ofrece validez a los parmetros de hipertrofia cardiaca ya que los valores que se obtuvieron en este ndice no fueron alterados o sesgados por diferencias en la velocidad de crecimiento de los grupos experimentales.

Mtodos y Resultados 83

Tabla 7.- Valores de presin arterial sistlica (PAS), frecuencia cardiaca (FC) y peso en ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). ** p<0,01 frente al grupo SHR-Control * p<0,05 frente al grupo SHR-Axt 75.

Parmetro PAS (mmHg) SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75 SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75 SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Inicio del estudio 167 3 169 2 163 2 382 3 383 3 378 5 255 7 264 7 279 5

Fin del estudio 176 1 150 1** * 156 1** 394 5 386 5 383 6 312 5 319 5 334 3

FC (ppm) Peso corporal (g)

84 Mtodos y Resultados

SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Cambios de PAS (mmHg)

20 10 0 -10 -20 -30 0 2 4 6 8 10

** ** *

Tiempo (semanas)

Figura 10.- Cambios de la presin arterial sistlica (PAS) en ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). ** p<0,01 frente al grupo SHR-Control y * p<0,05 frente al grupo SHR-Axt 75.

Mtodos y Resultados 85

2. Estudios in vitro Finalizados los tratamientos, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sdico (60 mg/kg, i.p). A continuacin se canul la arteria cartida con un catter ( = 0,96 mm), por la que se perfundieron los tejidos con solucin Krebs. Mediante una incisin en la arteria femoral se permiti el drenaje de la sangre y el lquido de perfusin, posteriormente se realiz una laparotoma y se procedi a la extraccin de aorta y rin para estudios de funcionalidad, histolgicos y relacionados con el estrs oxidativo, y corazn para determinar la hipertrofia cardiaca. Parte de las muestras se congelaron a -80 C para otras determinaciones. 2.1. Estudios de funcionalidad: arteria aorta Metodologa Se utilizaron baos para rgano aislado, como el que se presenta en la figura 11, que poseen una doble pared de vidrio delimitando una cmara, que a su vez se encuentra conectada a un circuito cerrado por cuyo interior circula agua mantenida a una temperatura constante de 37 C, mediante una bomba termosttica (TECTRON 4373200 Selecta, Espaa), que acta al mismo tiempo como bomba, elemento calefactor y termostato. La parte inferior del bao tiene un orificio a travs del cual se hace llegar de manera controlada la cantidad deseada de carbgeno (95% O2 y 5% CO2, Air Liquide, Espaa). El interior del bao contiene una cantidad conocida de lquido nutricio que asegura la inmersin completa del tejido. Este lquido se elimina por una salida situada en la parte inferior de la copa, inmediatamente se rellena con solucin nutricia nueva a 37 C, de forma que los cambios de temperatura sean mnimos.

86 Mtodos y Resultados

Transductores de fuerza isomtricos (modelo UF-1 Harvard Apparatus Inc., EE.UU.), conectados a un sistema computarizado PowerLab/800 para Windows (AD Instruments, Reino Unido), constituyen el sistema de deteccin, registro y cuantificacin.

Transductor

Agua 37 C Drenaje Carbgeno

Figura 11.- Bao de rganos y transductor isomtrico para los estudios de funcionalidad en anillos de arteria aorta.

Mtodos y Resultados 87

Despus de extraer la arteria aorta se procede a la eliminacin del tejido conectivo y graso que la rodea, posteriormente se corta en anillos de 3 mm mediante un conjunto de cuchillas acopladas y dispuestas en paralelo e igualmente espaciadas. A travs de la luz de cada segmento se introducen dos alambres finos de acero inoxidable, uno se fija al bao de rganos y el otro se conecta al transductor isomtrico. Los anillos se colocan en los baos de rganos, ajustando la tensin basal a 2 g. La preparacin se deja estabilizar durante 60 minutos renovando la solucin nutricia cada 30 minutos y reajustando la tensin a 2 g si fuera necesario. La funcionalidad del tejido se comprueba aadiendo al bao fenilefrina (FE, 1x10-6 M), una vez alcanzada una meseta de contraccin se aade ACh (1x10-6 M) cuya respuesta relajante nos indica el estado funcional del endotelio. A continuacin se lavan repetidamente los anillos, se deja estabilizar durante 30 minutos, tiempo aproximado que tarda el anillo en recuperar la tensin basal, se renueva la solucin, se reajusta la tensin si es necesario y se dejan 30 minutos ms de estabilizacin. A partir de este momento se procede a la realizacin, en anillos diferentes, de los siguientes protocolos: Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes Previa contraccin de los anillos con una concentracin de FE 1x10-6 M y una vez alcanzada una meseta de contraccin estable, como se ha mencionado previamente, se realizaron curvas acumulativas concentracinrespuesta de los siguientes agentes relajantes: ACh (1x10-8-3x10-4 M), cuya accin relajante es endotelio dependiente y nitroprusiato sdico (NTP, 1x10-9-3x10-5 M), cuya accin relajante es endotelio independiente (Figura 12).

88 Mtodos y Resultados

Curva concentracin-respuesta

-6 FE 1x10 M FE 10-6 M

Contraccin (mg)

2000

1000

2:21:40

2:30:00

2:38:20

Tiempo de experimento

Figura 12.- Registro tpico de una curva de relajacin en aorta de rata.

Las curvas a ACh se repiten despus de la incubacin durante 30 minutos con indometacina (5x10-6 M), para estudiar la participacin de mediadores producidos por la COX en la respuesta relajante o con nitro-L-arginina metil ster (L-NAME, 1x10-4 M), un inhibidor de la eNOS. La relacin entre la respuesta contracturante obtenida con FE antes y despus de la incubacin con L-NAME nos indica la biodisponibilidad de NO. Los detalles de las sustancias utilizadas se pueden encontrar en el anexo 1.

Mtodos y Resultados 89

Resultados El efecto provocado por ACh y NTP se expresa como % de relajacin frente a la respuesta contrctil obtenida con FE. Los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 10 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en los apartados 2 y 3 del anexo 2. Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes: acetilcolina Como se puede ver en las curvas concentracin-respuesta, la relajacin endotelio dependiente en anillos de aorta no mejor con la administracin de astaxantina. Ntese en la figura 13, que las curvas del grupo control y de los dos grupos tratados se superponen casi por completo. No existen diferencias significativas en los valores del efecto mximo (Emax) y de pD2 (logaritmo cambiado de signo de la concentracin del agonista que provoca el 50% del efecto mximo) entre los tres grupos (Tabla 8). La incubacin con indometacina acentu la relajacin tanto en el grupo tratado con 200 mg/kg/da de astaxantina como con 75 mg/kg/da. Tanto en el grupo control como en el grupo SHR-Axt 200 la inhibicin de la COX determin un incremento en la respuesta relajante a ACh del orden de un 32% y una reduccin significativa del valor de pD2 (Figura 14, Tabla 8). Este mismo comportamiento se obtuvo al comparar las curvas concentracin-respuesta a ACh del grupo SHR-Control y SHR-Axt 75 en ausencia y en presencia de indometacina. En este caso el incremento en la relajacin fue de aproximadamente el 40% y tambin una reduccin significativa en el valor de pD2 (Figura 15, Tabla 8). Tampoco se observaron diferencias entre el grupo control y el grupo tratado.

90 Mtodos y Resultados

SHR-Control 0 SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Relajacin (%)

25 50 75 100 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

ACh (log M)

Figura 13.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-4 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-6 M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75).

Mtodos y Resultados 91

SHR-Control SHR-Axt 200 0 SHR-Control + indometacina SHR-Axt 200 + indometacina

Relajacin (%)

25 50 75 100 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

** **

ACh (log M)

Figura 14.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-4 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-6 M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) e incubadas con indometacina (5x10-6 M) cuando as se indica. ** p<0,01 frente a curva sin incubar con indometacina.

92 Mtodos y Resultados

Relajacin (%)

SHR-Control SHR-Axt 75 SHR-Control + indometacina SHR-Axt 75 + indometacina

25 50 75 100 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

** **
ACh (log M)

Figura 15.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-4 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-6 M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75) e incubadas con indometacina (5x10-6 M) cuando as se indica. ** p<0,01 frente a curva sin incubar con indometacina.

Mtodos y Resultados 93

Tabla 8.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-4 M) en aortas de ratas genticamente hipertensas (SHRControl), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200), SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75) e incubadas con indometacina (5x10-6 M) cuando as se indica. ** p<0,01 frente a curva de acetilcolina sin incubar con indometacina.

ACETILCOLINA Curva Parmetro Emax (%) Acetilcolina pD2 Acetilcolina Emax (%) + Indometacina pD2 7,3 0,2 82,6 3,5** 7,6 0,7** 7,4 0,2 77,8 3,1** 7,3 0,5** 7,2 0,1 83,4 2,7** 7,0 0,2** SHR-Control SHR-Axt 200 45,9 1,6 45,6 0,9 SHR-Axt 75 49,0 2,1

Como se mencion en la seccin de mtodos, se realizaron tambin curvas concentracin-respuesta a ACh despus de la incubacin durante 30 minutos con L-NAME para valorar si el tratamiento modifica la participacin del NO en la respuesta relajante. En la figura 16 se puede observar que la relajacin a ACh se perdi por completo en estas condiciones. Este efecto se observ tanto en el grupo SHR-Control como

94 Mtodos y Resultados

en el SHR-Axt 200. De hecho, se puede observar que se produjo una ligera contraccin que no fue superior a un 15% con una superposicin de las respuestas en ambos grupos experimentales. Sin embargo, los anillos de aorta del grupo SHR-Axt 75 tuvieron una contraccin menor pero no significativamente diferente al grupo control, como se observa en la figura 17.
SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Control +L-NAME SHR-Axt 200 + L-NAME -20

Relajacin (%)

5 30 55 80 -9 -8 -7 -6 -5 -4

** **

-3

ACh (log M)

Figura 16.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-4 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-6.M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) e incubadas con L-NAME (1x10-4 M) cuando as se indica. ** p<0,01 frente a curva sin incubar con L-NAME.

Mtodos y Resultados 95

SHR-Control SHR-Axt 75 SHR-Control + L-NAME -20 SHR-Axt 75 + L-NAME

Relajacin (%)

5 30 55 80 -9 -8 -7 -6 -5 -4

** **

-3

ACh (log M)

Figura 17.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-4 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-6 M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75) e incubadas con L-NAME (1x10-4 M) cuando as se indica. ** p<0,01 frente a curva sin incubar con L-NAME.

96 Mtodos y Resultados

La biodisponibilidad del NO que se determin al comparar la respuesta contracturante a FE antes y despus de la incubacin con L-NAME no cambi significativamente entre los tres grupos experimentales. Los valores fueron: 173,9 11,5% en el grupo SHR-Control, 157,7 10,0% en el grupo SHR-Axt 200 y 147,0 12,9% en el grupo SHR-Axt 75. Como se puede ver el tratamiento con astaxantina en las dos dosis utilizadas no mejor la produccin basal de NO. Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes: nitroprusiato sdico En la figura 18 se muestran las curvas de relajacin independiente del endotelio. El perfil de las curvas es semejante en los tres grupos de estudio e igualmente se puede ver que los parmetros que caracterizan estas curvas son similares en los tres grupos experimentales (Tabla 9).

Tabla 9.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-9-3x10-5 M) en aortas de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75).

NITROPRUSIATO SDICO Parmetro Emax (%) pD2 SHR-Control 79,7 4,7 7,7 0,3 SHR-Axt 200 77,6 3,9 7,5 0,2 SHR-Axt 75 75,5 3,4 7,6 0,2

Mtodos y Resultados 97

SHR-Control 0 SHR- Axt 200 SHR- Axt 75

Relajacin (%)

25 50 75 100 -10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

NTP (log M)

Figura 18.- Curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-93x10-5 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-6 M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75).

98 Mtodos y Resultados

2.2. Estudios de funcionalidad: rin Metodologa Una vez sacrificado el animal, el rin izquierdo se canula cuidadosamente por la unin entre la arteria renal y la aorta abdominal con un catter ( = 0,96 mm), se separa cuidadosamente y mediante el mismo catter se conecta simultneamente, por una llave de tres vas, con el transductor de presin y el sistema de perfusin (Figura 19). La perfusin se realiza con solucin Krebs gaseada con carbgeno a una temperatura de 37 C y a un flujo constante de 3 ml/min mediante una bomba de perfusin (Masterflex L/S, Cole-Palmer, EE.UU.). Los cambios de presin detectados por el transductor se registran con un sistema computarizado PowerLab/800 para Windows.

Figura 19.- Sistema de perfusin para evaluar la funcionalidad del lecho vascular renal.

Mtodos y Resultados 99

Despus de 15 min de estabilizacin, se comprob la funcionalidad del tejido con KCl (40 mM) en el lquido de perfusin hasta alcanzar una meseta de contraccin estable. En ese momento se retira el agonista del lquido de perfusin para recuperar la presin basal. Las curvas concentracin-respuesta a ACh (1x10-9-1x10-4 M) se realizaron previa contraccin con FE (1x10-6 M). Cuando se consegua una meseta de contraccin estable se perfundan las soluciones con concentraciones crecientes de ACh, esperando una respuesta estable antes de incorporar la siguiente concentracin. Despus de un periodo de estabilizacin de 30 minutos se repeta el mismo protocolo para realizar una curva concentracin-respuesta a NTP (1x10-9-1x10-4 M). En algunos experimentos, correspondientes a los grupos SHR-Control y SHR-Axt 200, se repiti la curva concentracin-respuesta de ACh en presencia de L-NAME (1x10-4 M) con el fin de determinar la participacin de la sntesis de NO en la respuesta relajante. La biodisponibilidad de NO se determin, como en el caso de las aortas, comparando las respuestas de FE antes y despus de la incubacin con L-NAME. Los detalles sobre las sustancias utilizadas se pueden encontrar en el anexo 1. Resultados La presin de perfusin basal y la respuesta a KCl se expresan en mmHg. La relajacin provocada por ACh se expresa como % de relajacin frente a la respuesta de contraccin obtenida con FE 1x10-6 M. Los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 10 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en los apartados 2 y 3 del anexo 2. No existi diferencia significativa en la presin de perfusin basal entre los tres grupos experimentales: 39,6 5,2 mmHg en el grupo SHR-Control, 43,6 2,2 mmHg en el grupo SHR-Axt 200 y 50,3 4,6 mmHg en el

100 Mtodos y Resultados

grupo SHR-Axt 75. En la respuesta a KCl (40 mM) tampoco hubo diferencia; los resultados en el mismo orden fueron: 103,2 17,8 mmHg, 113,9 14,1 mmHg y 138,1 12 mmHg. En la figura 20 se presentan las curvas concentracin-respuesta a ACh en rin. El perfil de estas curvas es similar en los tres grupos experimentales aunque con un desplazamiento a la izquierda de las curvas correspondientes a los dos grupos tratados con astaxantina. Se observan diferencias altamente significativas en la respuesta mxima y un ligero incremento en los valores de pD2, aunque estos ltimos no llegaron a ser significativos (Tabla 10). Con los datos obtenidos, podemos decir que la astaxantina mejora la relajacin endotelio dependiente en el lecho vascular renal mejorando los valores de pD2 e incrementando entre un 15 a un 18% el valor del Emax con respecto al grupo SHR-Control. La perfusin con L-NAME increment la respuesta contracturante a FE. Los valores de biodisponibilidad de NO reflejan que el tratamiento con astaxantina 200 mg/kg/da increment este parmetro de forma significativa (Figura 21).

Mtodos y Resultados 101

SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Relajacin (%)

25 50 75 100 -10

** **
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

ACh (log M)

Figura 20.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-9-1x10-4 M) en rin, perfundido y precontrado con fenilefrina (10-6 M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). ** p<0,01 frente a la curva del grupo SHR-Control.

102 Mtodos y Resultados

Tabla 10.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-9-1x10-4 M) en rin de ratas genticamente hipertensas (SHRControl), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). * p<0,05 y ** p<0,01 frente a la curva del grupo SHR-Control.

ACETILCOLINA Parmetro Emax (%) pD2 SHR-Control 71,1 2,9 7,0 0,1 SHR-Axt 200 82,1 3,8** 7,4 0,3* SHR-Axt 75 84,2 3,8** 7,7 0,3*

Mtodos y Resultados 103

Biodisponibilidad de NO (%)

150

100

50

0 SHR-Control SHR-Axt 200

Figura 21.- Biodisponibilidad de NO en rin perfundido de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200). * p<0,05 frente al grupo SHR-Control.

104 Mtodos y Resultados

La relajacin provocada por NTP en rin perfundido fue similar en los tres grupos estudiados como podemos observar tanto en las curvas concentracin-respuesta como en los parmetros calculados a partir del ajuste no lineal de la misma (Tabla 11 y Figura 22). Ntese que aunque el grupo SHR-Axt 75 tuvo valores de relajacin ligeramente superiores a los otros dos grupos, esta diferencia no fue significativa. De hecho, la curva concentracin-respuesta correspondiente a este grupo se desplaz a la izquierda dando un valor de pD2 ligeramente mayor pero no estadsticamente diferente.

Tabla 11.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-9-1x10-4 M) en rin de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75).

NITROPRUSIATO SDICO Parmetro Emax (%) pD2 SHR-Control 76,4 15,8 6,3 0,5 SHR-Axt 200 75,9 10,6 6,1 0,3 SHR-Axt 75 83,4 12,2 7,3 0,7

Mtodos y Resultados 105

SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Relajacin (%)

25 50 75 100 -10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

NTP (log M)

Figura 22.- Curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-91x10-4 M) en rin, perfundido y precontrado con fenilefrina (1x10-6 M), de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75)-

106 Mtodos y Resultados

3. Hipertrofia cardiaca Metodologa Una vez que se sacrifican los animales se extrae el corazn y se coloca inmediatamente en solucin Krebs a 37 C aireada con carbgeno. A continuacin se pasa a otra solucin de KCl 150 mM para detener el corazn en distole. Se eliminan cuidadosamente los restos de tejido graso, se separan las aurculas, se diseccionan el ventrculo derecho y el izquierdo dejando el septum intraventricular como parte del ventrculo izquierdo185. Se seca cuidadosamente para eliminar el exceso de lquido y se pesa. La relacin entre el peso del ventrculo izquierdo y el peso corporal se utiliza como ndice de hipertrofia cardiaca (HVI). Resultados Los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 10 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en el apartado 2 del anexo 2. En la figura 23 puede observarse que el tratamiento con astaxantina redujo de forma significativa la hipertrofia cardiaca. Cabe destacar que al comparar los dos tratamientos con astaxantina no se encontr diferencia significativa entre ellos. De acuerdo a lo anterior, podemos decir que la astaxantina reduce la HVI con las dos dosis utilizadas de manera estadsticamente significativa con respecto al grupo SHR-Control.

Mtodos y Resultados 107

3.00 2.75 2.50 2.25 2.00 SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Figura 23.- ndice de hipertrofia cardiaca (HVI) en ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). * p<0,05 y ** p<0,01 frente al grupo SHR-Control.

HVI (mg/g)

**

108 Mtodos y Resultados

4. Morfometra en arterias Metodologa La metodologa para arterias de conductancia (aorta) y de resistencia (lecho vascular renal) es comn, slo cambia la forma de obtener las muestras, lo que se especifica en las siguientes lneas. Todas las muestras se fijaron en formol tamponado al 10%. De la arteria aorta se fij un anillo, en tanto que para el caso de las arterias renales, la fijacin se realiz con la mitad del rin derecho seccionado longitudinalmente en su eje dorso-ventral. Posteriormente, en ambos casos, se realiza la inclusin en parafina sinttica entre 56 y 57 C, mediante el uso de un procesador automtico de tejidos Shandon-Elliot modelo Bench SCE 0400, EE.UU., con un programa de cambio de alcoholes y bencenos que se efecta de manera automtica. Una vez concluido este proceso se realizan los bloques en la unidad formadora de bloques marca Tissue-Teck, Japn. Para el estudio estructural se realizaron cortes seriados de estas muestras de 4-5 m de grosor con un micrtomo de rotacin (LEICA RM 2155, Alemania). A continuacin, se colocaron en portaobjetos previamente desengrasados y tratados con albmina-glicerina. Por ltimo los cortes se dejaron secar en una estufa a 37 C durante 16-18 horas. Las secciones se desparafinan en xilol y se hidratan pasando por una serie de alcoholes de concentracin decreciente. Para determinar los distintos parmetros morfomtricos de las arterias los cortes se tien con hematoxilina-eosina con el fin de aumentar el contraste. La hematoxilina es un colorante de carcter bsico con ms afinidad por componentes celulares cidos como el ncleo, que se tie de color violeta. En contraste, la eosina es de naturaleza cida, con mayor afinidad por el citoplasma que adquiere un color rosado.

Mtodos y Resultados 109

Una vez realizada la tincin, los cortes se observan al microscopio ptico (Olympus BX50, Japn), ajustando el objetivo para cada muestra de modo que se obtenga una visin completa de los anillos de aorta y de las secciones transversales de las arterias renales. En este caso, se eligieron arterias intrarrenales de entre 20 y 60 m de dimetro externo con el fin de asegurarnos que se trataba de vasos de resistencia. Las imgenes se captaron con la ayuda de una cmara de alta resolucin (Olympus DP50, Japn) adaptada al sistema y posteriormente, utilizando el software Scion Image 4,2 para Windows (desarrollado por US National Institutes of Health y disponible en http://rbs.info.nih.gov/nih-image/) se midieron los siguientes parmetros: Pi: permetro interno que delimita el lumen del vaso. Pe: permetro externo que delimita el margen exterior de la capa media. Ai: rea del lumen del vaso. Ae: rea delimitada por el margen exterior de la capa media.

Cada medida se realiz por duplicado por un mismo observador dando como valor de medida la media entre ambos valores. A partir de estos valores se calcularon los siguientes parmetros morfomtricos: Ri: radio del lumen del vaso. Se obtiene a partir de la frmula Pi = 2Ri. Re: radio externo del vaso, (Pe = 2Re). CSAm: rea seccional de la capa media que se obtiene por diferencia de reas (Ae-Ai). L: lumen del vaso (2xRi). Wm: grosor de la capa media que se obtiene por diferencia entre ambos radios (Re-Ri). Wm/L: relacin entre el grosor de la capa media y el lumen del vaso.

110 Mtodos y Resultados

Resultados Los resultados de morfometra se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en el apartado 2 del anexo 2. Morfometra de aortas Los valores de cada parmetro morfomtrico se pueden ver en la tabla 12. La administracin de astaxantina produjo cambios significativos en todos ellos, excepto en el valor de L del grupo SHR-Axt 200. La disminucin en el Wm en las aortas de ratas de los grupos tratados produjo cambios significativos en el rea seccional de la capa media y en la relacin Wm/L (Figura 24). Estos cambios en la morfometra de la aorta, implican una mejora estructural. Para ilustrar los resultados, en la figura 25 se muestran imgenes representativas.
Tabla 12.- Parmetros morfomtricos de arteria aorta de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). * p<0,05 y ** p<0,01 frente al grupo SHR-Control.

Parmetro L (m) Wm (m) CSAm (mm2)

SHR-Control 1514 18 130,0 3,4 0,659 0,014

SHR-Axt 200 1519 21 115,3 3,0* 0,589 0,014 *

SHR-Axt 75 1636 31** 112,0 3,9** 0,597 0,018 **

L= lumen del vaso, Wm= grosor de la capa media, CSAm= rea seccional de la capa media.

Mtodos y Resultados 111

0.10 0.08

* **

Wm/L

0.06 0.04 0.02 0.00 SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Figura 24.- Relacin entre el grosor de la capa media y el lumen (Wm/L) en secciones de aorta de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). * p<0,05 y ** p<0,01 frente al grupo SHR-Control.

112 Mtodos y Resultados

Figura 25.- Imgenes obtenidas de cortes histolgicos de secciones transversales de arteria aorta teida con hematoxilina-eosina. Ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y ratas SHR tratadas con astaxantina (SHR-Axt).

Morfometra de arterias renales La evaluacin de los cambios morfomtricos en arterias de resistencia se llev a cabo seleccionando un mnimo de 10 arterias intrarrenales para cada rin con un dimetro externo comprendido entre 20 y 60 m. El anlisis morfomtrico de estas arterias mostr que los tratamientos con astaxantina modificaron todos los parmetros morfomtricos, con excepcin del lumen en el grupo SHR-Axt 200. En la tabla 13 se puede ver que el lumen del grupo experimental SHR-Axt 75 mostr un incremento altamente significativo con respecto al grupo SHR-Control.

Mtodos y Resultados 113

Los dos grupos tratados con astaxantina mostraron una reduccin del Wm, siendo en ambos casos esta diferencia altamente significativa con respecto al grupo SHR-Control. El comportamiento para el CSAm fue el mismo que en el parmetro anterior, pero la diferencia encontrada entre los dos grupos tratados con astaxantina y el grupo SHR-Control fue menos significativa. Los cambios producidos por la administracin de astaxantina en la morfometra de las arterias renales en las dosis utilizadas, implican una mejora en la estructura de los vasos. Al comparar los dos grupos tratados para estos tres parmetros, no se encontr diferencia estadsticamente significativa. En la figura 26 se muestran los valores correspondientes a la relacin Wm/L para cada uno de los grupos experimentales. En tanto que en la figura 27, se muestran imgenes representativas.

Tabla 13.- Parmetros morfomtricos en arterias intrarrenales de resistencia de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). * p<0,05 y ** p<0,01 frente al grupo SHR-Control.

Parmetro L (m) Wm (m) CSAm (m2)

SHR-Control 17,30 0,83 10,32 0,36 847,6 55,9

SHR-Axt 200 18,02 0,86 8,58 0,38** 710,6 58,2 *

SHR-Axt 75 21,57 0,99** 7,99 0,29** 707,3 50,0*

L= lumen del vaso, Wm= grosor de la capa media, CSAm= rea seccional de la capa media.

114 Mtodos y Resultados

0.7 0.6 0.5

** **

Wm/L

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Figura 26.- Relacin entre el grosor de la capa media y el lumen (Wm/L) en secciones de arterias intrarrenales de ratas genticamente hipertensas (SHRControl), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). ** p<0,01 frente al grupo SHR-Control.

Mtodos y Resultados 115

Figura 27.- Imgenes obtenidas de cortes histolgicos de secciones transversales de arterias intrarrenales teidas con hematoxilina eosina. Ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y ratas SHR tratadas con astaxantina (SHR-Axt).

116 Mtodos y Resultados

5. Produccin de anin superxido 5.1. Evaluacin por quimioluminiscencia Metodologa La produccin de O2- se midi mediante quimioluminiscencia con lucigenina (LC), este mtodo se basa en la formacin de un catin de lucigenina (LC+) en presencia de O2-, a partir de este catin se forma un dioxetano de lucigenina (LCO2) tambin en presencia del O2-; posteriormente, para estabilizar la lucigenina, el dioxetano cede su energa en forma de ondas electromagnticas que son medidas por un fotoamplificador y un fotodetector, de acuerdo a las siguientes reacciones186: O2- + LC+2 LC+ + O2 LC+ + O2- LC O2 LC O2 2- N metilacridona + h Las determinaciones se realizaron en arteria aorta siguiendo las condiciones propuestas por Mnzel y col.187. Animales provenientes de cada uno de los grupos experimentales se sacrificaron como ya se mencion, se extrajo la arteria aorta y, una vez limpia de tejido conectivo y grasa, se cort en anillos. Los anillos se incubaron en una solucin tampn HEPES cuya composicin se detalla en el anexo de sustancias utilizadas (anexo 1). La incubacin se realiz durante 30 minutos a 37 C, con adicin constante de carbgeno y en presencia de cido dietilditiocarbamato (DDC, 10 mM).

Mtodos y Resultados 117

Se realizaron medidas de produccin de O2- tanto en forma basal como estimulada mediante la adicin de NADPH 100 M como sustrato de la NADPH oxidasa. En un tubo del luminmetro se pone HEPES a 37 C, se aade LC (5 M), por ltimo se pone el anillo de aorta y se lee inmediatamente. Al terminar esta lectura se aade 4,5-dihidroxi-1,3-benceno cido disulfnico (tirn 1 M), que es un scavenger de O2-, con el fin de hacer una segunda lectura y obtener por diferencia las unidades relativas de luminiscencia (URL) especficas del O2-. La mitad de los anillos se incubaron en presencia de NADPH para determinar la produccin de O2- cuando se estimula la NAD(P)H oxidasa con su sustrato. Todas las lecturas se realizaron en un luminmetro (Lumat LB 9507, Berthold, Alemania). Cada lectura fue el promedio de 10 medidas de 30 segundos con un retraso de 2 segundos. Terminado el experimento los anillos de aorta se secaron y se pesaron para posteriormente expresar los resultados como unidades relativas de luminiscencia por unidad de tiempo y respecto al peso seco de los anillos (URL/min/mg de seco).

118 Mtodos y Resultados

Resultados Los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en el apartado 2 del anexo 2. La produccin basal de O2- no fue estadsticamente diferente entre los tres grupos experimentales: 289,8 61,3 para el grupo SHR-Control, 351,0 34,1 y 253,3 26,4 URL/min/mg de tejido para los grupos SHR-Axt 200 y SHR-Axt 75 respectivamente. La produccin estimulada de O2- mediante la adicin de NADPH se increment entre 6 a 10 veces respecto a la produccin basal. En este caso, las diferencias en la produccin de O2- se hicieron patentes entre los grupos experimentales (Figura 28). En la figura se puede observar que el tratamiento con astaxantina, independientemente de la dosis, redujo en un 50% la produccin de O2- frente al grupo SHR-Control. Sin embargo, no existi diferencia estadsticamente significativa entre los dos grupos tratados.

Mtodos y Resultados 119

4000

y O2- (URL/min/mg)

3000 2000 1000 0 SHR-Control SHR-Axt 200 SHR-Axt 75

Figura 28.- Produccin de O2- estimulada con NADPH (100 M) en anillos de aorta de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control), SHR tratadas con 200 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 200) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). * p<0,05 frente al grupo SHR-Control.

120 Mtodos y Resultados

5.2. Evaluacin por fluorescencia Metodologa Debido a que el valor ms bajo de produccin de O2- basal entre los tres grupos experimentales se obtuvo con el grupo SHR-Axt 75, se decidi evaluar la produccin in situ de O2- tanto en este grupo como en el grupo SHR-Control, para lo cual se utiliz dihidroetidio (DHE), una sonda fluorognica especfica de O2-- Muestras de anillos de aorta provenientes de estos dos grupos experimentales fueron incluidas de manera inmediata a su obtencin en una mezcla de alcohol polivinlico y carbowax (O.C.T. Sakura Tissue Tek, Japn) y mantenidos a -80C hasta su utilizacin. A partir de estas inclusiones, se hicieron cortes de 2 m de espesor en un criostato (Microm HM 505N, Alemania). Una vez montados en portaobjetos se llevaron a temperatura ambiente y se rehidrataron con solucin tampn HEPES. Posteriormente se incubaron en la oscuridad durante cinco minutos en una solucin 1 M de dihidroetidio en tampn HEPES, se lavaron nuevamente con la solucin tampn y se observaron y fotografiaron mediante un microscopio confocal (Zeiss LSM 510, Alemania) usando una longitud de onda de excitacin de 530 nm y un filtro de emisin de rodamina. Las condiciones del detector y del laser se mantuvieron constantes para todas las muestras. Dihidroetidio + O2- etidio-DNA + Fluorescencia en rojo La fluorescencia del DHE se cuantific mediante un paquete de anlisis de imagen (Image J versin 1.4.3. NIH., EE.UU.). Las imgenes RGB del microscopio confocal fueron cargadas en este programa y convertidas a imgenes de 8 bits en escala de grises. La fluorescencia media se cuantific como la densidad integrada de fluorescencia (producto del valor medio en grises multiplicado por el rea de medicin). El valor medio de grises a su

Mtodos y Resultados 121

vez corresponde a la luminosidad en grises dividida entre el nmero total de pxeles. Resultados Los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 4 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en el apartado 2 del anexo 2. Como se ve en la figura 29, la produccin de O2- en el grupo control fue superior a la produccin del grupo tratado con astaxantina. El tratamiento con astaxantina a la dosis de 75 mg/kg/da redujo la produccin de O2- en los cortes de aorta en un 34% con respecto al grupo no tratado, lo que pondra de manifiesto el carcter antioxidante de la astaxantina. En la misma figura 29 se presentan dos fotografas caractersticas de esta evaluacin.

122 Mtodos y Resultados

400

Densidad integrada de fluorescencia x103

300 200 100 0 SHR-Control

SHR-Ax 75

Figura 29.- Produccin in situ de O2- en anillos de aorta de ratas genticamente hipertensas (SHR-Control) y SHR tratadas con 75 mg/kg/da de astaxantina (SHR-Axt 75). * p<0,05 frente al grupo SHR-Control.

Mtodos y Resultados 123

MODELO 2. RATONES CON HIPERTENSIN INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II El modelo se desarroll con ratones macho Swiss Albino pertenecientes a la cepa CD1 con ocho semanas de edad, procedentes del Servicio de Experimentacin Animal de la USAL. Previamente se pesaron y se midi la presin arterial sistlica (PAS) para distribuir a los animales en los siguientes grupos: Sham: ratones Swiss Albino-CD1 operados e implantados con las minibombas osmticas pero sin la infusin de Ang II. Ang II: ratones Swiss Albino-CD1 operados e implantados con las mini-bombas osmticas y la infusin de Ang II. Ang II Axt: ratones Swiss Albino-CD1 operados e implantados con las minibombas osmticas y la infusin de Ang II ms el tratamiento en la dieta con astaxantina a una dosis de 75 mg/kg/da. El pienso y el agua consumidos se midieron cada tres das. Semanalmente se pesaron los animales con el objeto de ajustar la dosis de astaxantina a la cantidad correspondiente de acuerdo a los cambios en el peso corporal. Con la misma frecuencia fue evaluada la PAS.

124 Mtodos y Resultados

1. Presin arterial sistlica Metodologa La PAS se midi en la arteria caudal, siguiendo el mtodo descrito en el modelo con ratas SHR. En este caso se utiliz un equipo NIPREM 645 (Cibertec S.A. Espaa). Las medidas se realizaron antes de la insercin de las minibombas y despus de 7 y 14 das. En este caso, adems, se determin la presin arterial media (PAM) por un mtodo cruento en animales anestesiados. Despus de terminar el tiempo de experimentacin, los ratones se anestesiaron con uretano (1,5 g/kg, i.p), a continuacin se canul la arteria cartida con un catter ( = 0,61 mm), que se conect a un transductor de presin. Los valores de presin detectados por el transductor se registraron con un sistema computarizado PowerLab/800 para Windows. Se midi la PAS, la presin arterial diastlica (PAD) y se calcul la presin arterial media de acuerdo a la siguiente frmula: PAM = {[PAS-PAD]/3} + PAD Resultados Los resultados de la PAS y de la PAM se expresan en mmHg como media aritmtica EEM de un mnimo de 10 experimentos, el anlisis estadstico se realiz como se menciona en el apartado 2 del anexo 2. En los valores de la PAS se encontr que, si bien al inicio no existieron diferencias significativas, conforme avanz el tiempo de tratamiento los tres grupos mostraron comportamientos diferentes. Durante los 14 das de tratamiento la PAS no se modific en el grupo Sham: al inicio fue de 102 1 mmHg y al final de 104 1 mmHg. En contraste la infusin de Ang II produjo un incremento de 45 1 mmHg en

Mtodos y Resultados 125

el grupo experimental Ang II. Por otro lado, en el grupo de animales que adems de Ang II recibi astaxantina en la dieta, el incremento de la PAS fue de 24 1 mmHg. En la figura 30 se puede observar el comportamiento en relacin a las PAS de los tres grupos. En la misma figura se observa la PAM al final del tratamiento, aunque las diferencias entre los grupos no fueron estadsticamente significativas, el comportamiento fue similar al de la PAS: el grupo Ang II mostr el valor ms alto, seguido del grupo donde se administr astaxantina, mientras que el menor valor de la PAM fue para el grupo Sham. En cuanto al peso de los animales, observamos que no existi diferencia estadsticamente significativa entre los tres grupos experimentales, tanto al inicio como al final del tratamiento, por lo que podemos decir que la infusin de Ang II y la administracin de astaxantina en el alimento no afectaron el crecimiento en peso de los animales.

126 Mtodos y Resultados

60

PAM (mmHg)

40

Ang II Ang II Axt

20

Sham 160 140 120 100 80 0 1

Sham

Ang II

Ang II Axt

** ** **

** ** **

PAS (mmHg)

Tiempo (semanas)

Figura 30.- Presin arterial sistlica (PAS) en ratones conscientes y presin arterial media (PAM) en ratones anestesiados Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). ** p<0,01 frente al grupo Sham y ** p<0,01 frente al grupo Ang II.

Mtodos y Resultados 127

2. Estudios in vitro Una vez determinada la PAM se realiza una laparotoma y se procede a la extraccin de aorta y rin para estudios de funcionalidad, corazn para determinar la hipertrofia cardiaca y fibrosis, adems de sangre e hgado para determinar parmetros relacionados con el estrs oxidativo. Parte de las muestras se congelan a 80 C hasta la realizacin de las determinaciones. 2.1 Estudios de funcionalidad: arteria aorta Metodologa Para los estudios de funcionalidad en aorta se utiliz un migrafo de cuatro canales (Multiwire Myograph System, DMT Modelo 610M, Dinamarca). Previamente al montaje de los anillos y despus de extraer la arteria aorta se procede a la eliminacin del tejido conectivo y graso que la rodea, a continuacin se corta en anillos de aproximadamente 2 mm de longitud. A travs de la luz de cada segmento se introducen dos alambres finos de acero inoxidable de 40 m de dimetro, uno se coloca en la parte fija o correspondiente al transductor, mientras que el otro se une a la parte mvil que a su vez est unida al tornillo micromtrico. Una vez que los anillos estn montados en los baos, con solucin Krebs y aereados con carbgeno se espera a que la temperatura se estabilice a 37 C. Posteriormente, se normalizan los anillos a una tensin equivalente a 100 mmHg, y se ajusta la tensin a 5 mN. En la figura 31 se muestran los distintos pasos en el montaje.

128 Mtodos y Resultados

Figura 31.- Migrafo y procedimiento para el montaje de anillos de aorta de ratn para los estudios de funcionalidad.

Cada anillo se deja estabilizar durante 60 minutos renovando la solucin nutricia cada 30 minutos. La funcionalidad del tejido se comprueba aadiendo al bao FE (1x10-7 M), una vez alcanzada una meseta de contraccin se aade ACh (1x10-6 M) cuya respuesta relajante nos indica el estado funcional del endotelio. Posteriormente, se lavan repetidamente los anillos, se dejan estabilizar durante 30 minutos, tiempo aproximado que tarda el anillo en recuperar la tensin basal, se renueva la solucin

Mtodos y Resultados 129

Krebs y se dejan estabilizar 30 minutos ms. A partir de este momento se realizaron, en anillos diferentes, los protocolos siguientes. Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes y contracturantes Previa contraccin de los anillos con FE (1x10-7 M) y una vez alcanzada una meseta de contraccin estable, se realizaron curvas acumulativas concentracin-respuesta de los siguientes agentes relajantes: ACh (1x10-83x10-4 M) y NTP (1x10-9-3x10-5 M). Las curvas a ACh se repitieron despus de la incubacin durante 30 minutos con apocinina (1x10-4 M), un inhibidor de la NADPH oxidasa, para valorar la participacin del O2- en la respuesta relajante. En otros anillos se realizaron curvas concentracin-respuesta a noradrenalina (NA 1x10-9-1x10-5 M) como se ve en la figura 32. Adems se obtuvieron respuestas a dosis nica de Ang II (1x10-7 M) en diversos anillos de cada grupo experimental. Las sustancias utilizadas se detallan en el anexo 1.

130 Mtodos y Resultados

Figura.- 32. Registro original de una curva concentracin-respuesta a NA en aorta de ratn.

Resultados El efecto provocado por ACh y NTP se expresa como % de relajacin frente a la respuesta contrctil obtenida con FE y las respuestas contracturantes a NA y Ang II se expresan en mN. En cada serie de experimentos los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 10 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en los apartados 2 y 3 del anexo 2

Mtodos y Resultados 131

. Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes: acetilcolina Como se puede ver en la figura 33, la relajacin endotelio dependiente en anillos de aorta no mejor con la administracin de astaxantina. La curva del grupo Sham queda desplazada hacia arriba del grfico, mientras que las curvas de los grupo Ang II y Ang II Axt estn muy prximas. Los valores de pD2 para los grupos Ang II y Ang II Axt fueron prcticamente los mismos. Del mismo modo se puede ver que no existi diferencia entre estas dos curvas en sus valores de relajacin mxima (Tabla 14). En contraste, los valores de pD2 y del Emax de la curva correspondiente al grupo Sham fueron estadsticamente diferentes frente a los presentados por los primeros. En la misma tabla tambin se observan los datos de las curvas concentracin-respuesta a ACh en presencia de apocinina. En el grupo Sham la incubacin con apocinina no modific esta respuesta. En los grupos Ang II y Ang II Axt al comparar las curvas concentracin respuesta en ausencia y en presencia de apocinina, los valores de Emax y de pD2 fueron menores por lo que se puede decir que la incubacin con apocinina de los anillos de aorta de estos dos grupos experimentales produjo una relajacin menor y un desplazamiento a la derecha en las curvas concentracin-respuesta. Esta disminucin fue menor para el grupo Ang II Axt (Figura 34).

132 Mtodos y Resultados

Ang II 0 Ang II Axt Sham

Relajacin (%)

25 50 75 100 -9 -8 -7 -6

** **
-5 -4

ACh (log M)

Figura 33.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-5 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-7 M), de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). ** p<0,01 frente al grupo Sham.

Mtodos y Resultados 133

Tabla 14.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-5 M) en ausencia y en presencia de apocinina (1x10-4 M) en aortas de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). # p<0,05 frente a curva sin incubar con apocinina. ** p<0,01 frente al grupo Sham.

ACETILCOLINA Curva Parmetro Emax (%) Acetilcolina pD2 Acetilcolina Emax (%) + Apocinina pD2 6,8 0,1 51,5 5,7 6,2 0,3 7,2 0,1** 50,8 6,5# 6,2 0,3# 7,5 0,1** 55,2 4,7# 7,0 0,3# Sham 60,9 1,5 Ang II 74,3 1,7** Ang II Axt 70,5 1,8**

134 Mtodos y Resultados

-25

Sham Sham + apocinina

-25

Ang II Ang II + apocinina

Relajacin (%)

0 25 50 75 100 -9 -8 -7

Relajacin (%)

0 25 50 75 100 -9 -8 -7 -6

-6

-5

-4

-5

-4

ACh (log M)

ACh (log M)

-25

Relajacin (%)

0 25 50 75 100 -9 -8 -7

Ang II Axt Ang II Axt + apocinina

-6

-5

-4

ACh (log M)

Figura 34.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-4 M), en ausencia y en presencia de apocinina (1x10-4 M), en aortas precontradas con fenilefrina (1x10-7 M), de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss AlbinoCD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). * p<0,05 frente a curva sin incubar con apocinina.

Mtodos y Resultados 135

Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes: nitroprusiato sdico En la figura 35 se muestran las curvas concentracin-respuesta a NTP. La forma y magnitud de la respuesta fue semejante en los tres grupos de estudio. La respuesta mxima alcanz el 100% en todos los grupos, sin embargo podemos observar un desplazamiento a la derecha de la curva del grupo Sham, lo que se refleja en una disminucin significativa del valor de pD2 (Tabla 15).
Tabla 15.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-9-3x10-6 M) en aortas de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt).

NITROPRUSIATO SDICO Parmetro Emax (%) pD2 Sham 98,3 1,9 7,6 0,1 Ang II 101,0 2,6 7,9 0,1 Ang II Axt 100,6 2,3 7,9 0,1

136 Mtodos y Resultados

Ang II 0 Ang II Axt Sham

Relajacin (%)

25 50 75 100 -10 -9 -8 -7 -6

-5

NTP (log M)

Figura 35.- Curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-93x10-6 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-7 M), de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt).

Mtodos y Resultados 137

Respuestas a agentes contracturantes La infusin de Ang II no se asoci a un incremento de la respuesta a NA en comparacin con el grupo Sham, mientras que el tratamiento concomitante con astaxantina dio lugar a respuestas significativamente menores en el grupo Ang II Axt (Figura 36). Los valores de pD2 y Emax confirman este comportamiento como se puede ver en la tabla 16.

Contraccin (mN)

5 4 3 2 1 0 -1 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

Ang II Ang II Axt Sham

**

NA (log M)

Figura 36.- Curvas concentracin-respuesta a noradrenalina (1x10-9-1x10-5 M), en aortas de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). ** p<0,01 frente a los grupos Sham y Ang II.

138 Mtodos y Resultados

Tabla 16.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a noradrenalina (1x10-9-1x10-5 M) en aortas de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). ** p<0,01 frente a los grupos Sham y Ang II.

NORADRENALINA Parmetro Emax (%) pD2 Sham 4,7 0,2 7,5 0,2 Ang II 4,9 0,2 7,4 0,1 Ang II Axt 1,9 0,1** 7,7 0,2**

La magnitud de la respuesta a Ang II fue muy pequea en todos los casos, como se muestra en la figura 37. En este caso la respuesta, aunque diferente desde el punto de vista de los valores medios encontrados, las comparaciones no alcanzaron significancia estadstica.

Mtodos y Resultados 139

0.4

Contraccin (mN)

0.3 0.2 0.1 0.0 Sham Ang II Ang II Axt

Figura 37.- Respuesta contracturante a dosis nica de angiotensina II (1x10-7 M) en aortas de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt).

140 Mtodos y Resultados

2.2. Estudios de funcionalidad: rin Metodologa La metodologa es semejante a la descrita para el rin perfundido en el modelo de ratas SHR, con la diferencia de que se utiliza un catter ms pequeo ( = 0,61 mm) y el flujo de perfusin es de 1 ml/min (Figura 19). Las curvas concentracin-respuesta a ACh (1x10-8-1x10-4 M) se realizaron previa contraccin con FE (1x10-6 M). Adems se realizaron curvas concentracin-respuesta a FE (1x10-7-1x10-5 M). Los detalles de las sustancias utilizadas se pueden consultar en el anexo 1. Resultados La presin de perfusin basal, la respuesta a KCl y la respuesta a FE se expresan en mmHg. La relajacin provocada por ACh se expresa como % de relajacin frente a la respuesta contrctil obtenida con FE 1x10-6 M. En cada serie de experimentos, los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 6 experimentos. El anlisis estadstico se realiz como se describe en los apartados 2 y 3 del anexo 2. Inicialmente, debe mencionarse que no existi diferencia significativa en la presin de perfusin basal y en la respuesta a KCl (40 mM) entre los tres grupos experimentales: la primera fue de 61,0 4,6 mmHg, 62,0 8,4 mmHg y 74,1 9,2 mmHg para los grupos Sham, Ang II y Ang II Axt respectivamente; mientras que las respuestas a KCl (40 mM) en el mismo orden fueron de 80,2 10,9 mmHg, 54,4 4,2 mmHg y 61,0 8,3 mmHg.

Mtodos y Resultados 141

En la figura 38 se presentan las curvas concentracin-respuesta a ACh en rin. Tanto las respuestas mximas como los valores de pD2 sugieren un comportamiento diferenciado entre los tres grupos, con un desplazamiento a la izquierda de las curvas correspondientes al grupo Ang II Axt y del grupo Sham respecto al grupo Ang II. La mayor respuesta mxima observada correspondi al grupo donde se administr astaxantina (Tabla 17). La respuesta contracturante a FE del lecho vascular renal en los tres grupos experimentales fue muy similar. No se encontraron diferencias significativas entre los valores de Emax y pD2 (Tabla 18 y figura 39).

142 Mtodos y Resultados

Ang II

0 Relajacin (%) 25 50

Ang II Axt Sham

**
75 100 -9 -8 -7 -6 -5 ACh (log M) -4 -3

Figura 38.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-1x10-4 M) en rin perfundido y precontrado con FE (10-6 M) de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). ** p<0,01 frente a los grupos Sham y Ang II Axt.

Mtodos y Resultados 143

250

Contraccin (mmHg)

200 150 Ang II 100 50 0 -8 -7 -6 -5 Ang II Axt Sham

FE (log M)

Figura 39.- Curvas concentracin-respuesta a fenilefrina (1x10-7-1x10-5 M) en rin perfundido de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt).

144 Mtodos y Resultados

Tabla 17.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-9-1x10-4 M) en rin de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). ** p<0,01 frente a las curvas de los grupos Sham y Ang II Axt.

ACETILCOLINA Parmetro Emax (%) pD2 Sham 77,0 3,2 8,7 3,7 Ang II 71,5 6,2** 7,1 0,4** Ang II Axt 89,6 3,9 7,8 0,5

Tabla 18.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a fenilefrina (1x10-7-1x10-5 M) en rin de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham),
Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt).

FENILEFRINA Parmetro Emax (%) pD2 Sham 195,4 6,0 6,2 0,1 Ang II 193,0 12,8 6,3 0,1 Ang II Axt 209,9 8,3 6,2 0,1

Mtodos y Resultados 145

3. Hipertrofia cardiaca e hipertrofia renal Metodologa Una vez que se sacrifican los animales se extrae el corazn, se coloca inmediatamente en solucin Krebs a 37 C, aireada con carbgeno. Se eliminan cuidadosamente los restos de tejido graso y se separan las aurculas. Los ventrculos se secan cuidadosamente para eliminar el exceso de lquido y se pesan. La relacin entre el peso de los ventrculos y el peso corporal se utiliz como ndice de hipertrofia cardiaca (HV). El rin derecho tambin se extrae, se limpia, se seca y se pesa. La relacin entre el peso del rin derecho y el peso corporal se utiliz como ndice de hipertrofia renal (HR). Resultados Los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. Los anlisis estadsticos se realizaron como se menciona en el apartado 2 del anexo 2. En la figura 40 puede observarse que la administracin continua de Ang II produjo un incremento altamente significativo del ndice de hipertrofia cardiaca. El tratamiento con astaxantina durante los 14 das del estudio impidi el desarrollo de la hipertrofia puesto que el valor de HV es similar al del grupo Sham. La HR no se modific por la administracin de Ang II. En tanto que la administracin de astaxantina redujo este ndice de forma significativa. Los valores de HR para los grupos Sham, Ang II y Ang II Axt fueron respectivamente: 7,7 0,2; 7,7 0,2 y 6,6 0,3 mg/g.

146 Mtodos y Resultados

5 4

**

HV (mg/g)

3 2 1 0
Sham Ang II Ang II Axt 75

Figura 40.- ndice de hipertrofia cardiaca (HV) en ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). ** p<0,01 frente a los grupos Sham y Ang II Axt.

Mtodos y Resultados 147

4. Determinacin de colgeno Metodologa Estos ensayos se han llevado a cabo en corazn. El protocolo fue diseado para pulmn188 y posteriormente optimizado para hgado por Fort y col.189. El mtodo cuantifica la hidroxiprolina (OH-Pro), un aminocido que forma parte del colgeno. Se basa en que la OH-Pro es oxidada por la cloramina T formando un compuesto que se convierte en cromforo al reaccionar con el reactivo de Ehrlich. Este mtodo consta de dos etapas: 1. Homogeneizacin del tejido e hidrlisis cida. El tejido se homogeneiza en agua destilada (10% p/v). Una alcuota de este homogeneizado se diluye con HCl 12 N (1:1) y se hidroliza durante 24 horas a una temperatura constante de 115 C. A continuacin se filtra mediante un filtro Millipore de 0,45 m. 2. Formacin del cromforo. Se toma por duplicado una muestra del filtrado (100 l) y se aade NaOH 6 N e isopropanol al 50%. Posteriormente se adiciona cloramina T 23,24 mM y 5 minutos despus se aade el reactivo Erlich 1,66 M. La mezcla obtenida se incuba durante 30 minutos a 60 C y finalmente se lee la absorbancia a 560 nm. La concentracin de OH-Pro en cada muestra se determin a partir de una recta patrn elaborada con concentraciones conocidas de OH-Pro entre 1,25 y 100 g/l. A partir de una alcuota de cada homogeneizado se determinaron las protenas por el mtodo de Bradford utilizando un reactivo comercial (BioRad, Alemania).

148 Mtodos y Resultados

Resultados Los resultados se expresan en g de OH-Pro/mg de protena y aparecen como la media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. Los anlisis estadsticos realizados se describen en el apartado 2 del anexo 2. Los resultados revelan que la infusin de Ang II en la dosis suministrada es capaz de producir fibrosis cardiaca. Como se puede ver en la figura 41, se produjo un incremento en la concentracin de OH-Pro en el grupo Ang II, este incremento fue estadsticamente significativo con respecto al grupo Sham. En el caso del grupo experimental Ang II Axt se observ un valor intermedio entre el grupo Ang II y el grupo Sham, sin mostrar diferencias significativas frente a ninguno por lo que podramos decir que la astaxantina previene slo en parte el desarrollo de la fibrosis provocada por la administracin de Ang II.

Mtodos y Resultados 149

mg OH-Pro/mg protena

60 50 40 30 20 10 0 Sham Ang II Ang II Axt

Figura 41.- Concentraciones de hidroxiprolina (OH-Pro) en corazones de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). * p<0,05 frente al grupo Sham.

150 Mtodos y Resultados

5. Produccin de anin superxido Metodologa Como se describi en el apartado 5.1 de los mtodos y resultados para el modelo con ratas SHR, la determinacin de O2- en vasos se llev a cabo mediante quimioluminiscencia utilizando lucigenina. Se valor tanto la produccin basal como la estimulada con NADPH. Para la realizacin de estos estudios se utiliz la arteria aorta de una parte de los animales de cada grupo experimental. Inmediatamente despus del sacrificio la aorta se extrae, se limpia, se corta en dos secciones y se mantienen en Krebs HEPES fro. En una mitad se determina la produccin basal y en otra la estimulada. Resultados La produccin de O2- se expresa como URL/min/mg de tejido. Los resultados se expresaron como media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. Los anlisis estadsticos se realizaron como se describe en el apartado 2 del anexo 2. La produccin basal de O2- no fue estadsticamente diferente entre los tres grupos experimentales, al igual que sucedi en el modelo de ratas SHR. La produccin estimulada de O2- mediante la adicin de NADPH se incremento de 6 a 10 veces respecto a la produccin basal (Figura 42). En este caso las diferencias en la produccin de O2- se hicieron patentes entre los grupos experimentales. El grupo Ang II mostr la mayor produccin de O2- en tanto que los grupos Sham y Ang II Axt mostraron valores menores.

Mtodos y Resultados 151

NADPH Grupo experimental Sham Ang II Ang II Axt O 2 - (URL/min/mg ) 268,3 46,1 229,7 19,3 242,2 53,3

6000

y O2- (URL/min/mg)

5000 4000 3000 2000 1000 0

**

NADPH +

Figura 42.- Produccin de O2- en aorta de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). Produccin basal (NADPH -) y produccin estimulada (NADPH +).* p<0,05 frente al grupo Sham y ** p<0,01 frente al grupo Ang II.

152 Mtodos y Resultados

6. Peroxidacin lipdica Metodologa En el organismo, como consecuencia del metabolismo celular, se producen radicales libres que pueden interaccionar con los lpidos sricos y tisulares provocando su peroxidacin. La determinacin de la peroxidacin lipdica se puede llevar a cabo por la medida de los aldehdos reactivos formados por la descomposicin de los perxidos lipdicos. El malondialdehdo (MDA) es el aldehdo ms importante obtenido en dicha degradacin. El mtodo del TBARS es el ms utilizado para medir la peroxidacin lipdica, se basa en la capacidad del MDA para reaccionar, a pH cido y alta temperatura, con el cido tiobarbitrico dando un producto coloreado que se cuantifica espectrofotomtricamente. Con el fin de determinar si el tratamiento con astaxantina modifica el grado de peroxidacin lipdica en este modelo de hipertensin, determinamos la produccin de MDA en plasma e hgado. La concentracin plasmtica de MDA se determin siguiendo el mtodo de Draper y col.190. El procedimiento seguido consiste en mezclar 500 l de plasma con 500 l de suero fisiolgico. A continuacin se aade una solucin que contiene cido tricloroactico al 15%, cido tiobarbitrico al 0,37% y cido clorhdrico 0,25 N. Despus de incubar 30 minutos a 90 C, se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 25 minutos y se recoge el sobrenadante para, finalmente, leer la absorbancia a 535 nm. El MDA se usa como patrn. Para calcular la concentracin plasmtica de MDA se utiliza su coeficiente de extincin molar (1,56x105 M-1 x cm-1). Los niveles de MDA en hgado se midieron por un mtodo basado en el ensayo descrito por Ohkawa y col.191 Las muestras de hgado se homogeneizan en KCl 1,15% (1:6 p/v) y se centrifugan durante 10 minutos a 4000 r.p.m.; 100 l del sobrenadante obtenido se aaden a la mezcla de

Mtodos y Resultados 153

reaccin que contiene: dodecilsulfato de sodio 8,1%; cido actico 20%; cido tiobarbitrico y H2O. Despus de incubar 1 hora a 95 C, se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 10 minutos. Finalmente leemos la absorbancia a 532 nm. La concentracin de MDA se determin a partir de una curva patrn construida con 1,1,3,3-tetrametoxipropano. Resultados La concentracin de MDA a nivel plasmtico se expresa en nmol/ml de plasma mientras que en hgado se expresa como nmol/g hgado. Todos los resultados se expresan como media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. El anlisis estadstico se realiz como se especifica en el apartado 2 de anexo 2. Como se puede observar, la infusin de Ang II apenas increment los niveles plasmticos de MDA. Cuando los ratones fueron tratados con astaxantina se produjo una reduccin significativa de dichos niveles (Figura 43). Resultados similares se pueden observar en el hgado, no se detectaron incrementos en los valores de MDA en los ratones tratados con Ang II, sin embargo, los niveles disminuyeron significativamente cuando los animales recibieron tambin astaxantina (Figura 43).

154 Mtodos y Resultados

MDA en plasma (nmol/ml)

7 6 5 4 3 2 1 0
Sham Ang II Ang II Axt

MDA en hgado (nmol/g)

20 15 10 5 0
Sham Ang II Ang II Axt

**

Figura 43.- Concentracin de MDA en plasma y en hgado de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). * p<0,05 frente al grupo Ang II y ** p<0,01 frente al grupo Sham.

Mtodos y Resultados 155

7. Evaluacin de la actividad de enzimas antioxidantes Metodologa El sistema antioxidante enzimtico constituye la primera y ms eficaz lnea de defensa contra los radicales libres. Est integrado por tres enzimas principales que funcionan en cadena para desactivar selectivamente las ERO, stas son la SOD, la CAT y la GPx. Otras enzimas como la glutatin reductasa (GR) y la glutatin-S-transferasa (GST) colaboran de forma paralela en el proceso de detoxificacin de las ERO. Tras perfundir el animal con suero fisiolgico heparinizado, se extrae el hgado y una porcin del lbulo mayor se homogeneiza en proporcin 1:4 (p/v), con una disolucin de tampn fosfato potsico (100 mM, pH 7,5) al que se aade EDTA (1 mM). Una parte se congela como tal para posteriormente determinar la actividad enzimtica de la CAT y el resto se centrifuga a 12000 r.p.m. El sobrenadante obtenido se congela a -80 C para la determinacin de la actividad de SOD y GPx. Se determina la cantidad de protenas de las muestras, para expresar la actividad de las enzimas por mg de protena. Actividad de la Superxido Dismutasa La SOD es una de las enzimas ms importantes del sistema de defensa antioxidante del organismo, y constituye la primera defensa frente a los radicales libres, encargndose de la dismutacin del O2- a H2O2 y O2, eliminando as uno de los principales radicales libres. La actividad de la SOD se determin utilizando un preparado comercial (SOD determination Kit, Fluka, Espaa). En el mtodo desarrollado recientemente por Peskin192, se emplea XO para formar radicales O2-, que pueden desaparecer por accin de la SOD o reaccionar con la sal de

156 Mtodos y Resultados

tetrazolio soluble (WST-1) dando lugar a un compuesto coloreado tambin soluble (WST-1 formazan), segn muestra el siguiente esquema:

xantina O2 XO H2O2 cido rico

2 O2

WST-1 formazan

2 O2-

WST-1

SOD

O2 + H2O2

La determinacin se realiza usando una placa multipocillos en la que se hacen 3 tipos de blancos para cada muestra, el blanco 1 cuantifica la actividad mxima de la enzima XO, con el blanco 2 se cuantifican los niveles de O2- inherentes a la muestra y con el blanco 3 se cuantifica la actividad residual de los reactivos. Los reactivos y los volmenes utilizados en cada caso aparecen en la siguiente tabla:

Mtodos y Resultados 157

Muestra Muestra Agua bidestilada WST-1 XO Tampn 20 l ------200 l 20 l -------

Blanco 1 ------20 l 200 l 20 l -------

Blanco 2 20 l ------200 l ------20 l

Blanco 3 ------20 l 200 l ------20 l

La placa se incuba durante 20 minutos a 37 C y posteriormente se mide la absorbancia a 450 nm. Se determina la inhibicin de la formacin del compuesto coloreado (WST-1 formazn) utilizando la siguiente ecuacin. [[(Blanco 1-Blanco 3) Muestra Blanco 2)] / (Blanco 1- Blanco 3)] x 100

Actividad de la Catalasa

Esta enzima cataliza la descomposicin de H2O2 en H2O y O2. El H2O2 se forma principalmente como producto de la dismutacin del O2- por la SOD. La eliminacin del H2O2 del interior de la clula mejora la proteccin frente al dao oxidativo. El esquema de reaccin es el siguiente:
CAT

2H2O2

H2O + 2 O2

158 Mtodos y Resultados

La actividad de la CAT se determin utilizando un preparado comercial (Catalase Assay Kit, Sigma, Espaa), basado en el mtodo descrito por Aebi193. Este mtodo consiste en el seguimiento espectrofotomtrico a 240 nm durante 30 segundos de la desaparicin de H2O2 (50 mM) a 25 C y pH 7. Para ello se mezcla una alcuota de 5 l de muestra con 195 l de la solucin tampn incluida en el preparado y con 200 l de una solucin que contiene H2O2. Una unidad enzimtica de CAT puede transformar 1M de H2O2 a H2O y O2 por minuto a pH 7 y 25 C con una concentracin de sustrato de 10 mM. Actividad de la Glutatin Peroxidasa La GPx cataliza la detoxificacin de hidroperxidos de distintas procedencias. Transforma tanto H2O2 como perxidos orgnicos (R-OOH) en sus correspondientes alcoholes estables y en agua consumiendo GSH. Esta reaccin juega un papel crucial en la proteccin de las clulas frente al dao por radicales libres formados por la descomposicin de hidroperxidos. Se han encontrado al menos 5 isoenzimas de GPx en mamferos. Cada una tiene diferentes afinidades segn el tipo de perxido que elimine pero la diferencia ms notable es que la isoforma GPx-5 es independiente de selenio y no reacciona con H2O2 lo que permite su determinacin aislada del resto de GPx al utilizar hidroperxido de cumeno como activador de la reaccin. La actividad de la GPx no selenio dependiente se determin mediante un mtodo indirecto basado en el propuesto por Lawrence y col.194. La reaccin que cataliza esta enzima produce la oxidacin de GSH a GSSG. Esta reaccin est acoplada a la recuperacin de GSH por la enzima GR en la que se consume NADPH. As el seguimiento de la desaparicin de

Mtodos y Resultados 159

NADPH a 340 nm durante 4 minutos se relaciona con la actividad de la GPx no selenio dependiente. Las reacciones descritas se muestran en el esquema siguiente:
GPx

R-OOH + 2 GSH

R-OH + GSSG + H2O

GSSG + NADPH + H

2 GSH + NADP+

Una alcuota de 25 l de muestra se mezcla en una cubeta con hidroperxido de cumeno (1,5 mM) y con una solucin compuesta por tampn fosfato sdico (50 mM), EDTA-Na (1 mM), azida sdica (1 mM), GR (1 UI), NADPH (0,2 mM) y GSH (1 mM) y se realiza el seguimiento de la desaparicin del NADPH. Una unidad enzimtica de GPx se define como la cantidad de enzima que cataliza la oxidacin de 1 mol de NADPH por minuto. Resultados La actividad de SOD se expresa como % de inhibicin de la formacin del compuesto coloreado. La actividad de la CAT y GPx, se expresa en U/mg protena. Todos los resultados se expresan como media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. El anlisis estadstico se realiz como se menciona en el apartado 2 del anexo 2. La actividad de SOD ms baja se present en el grupo Ang II, mejorando significativamente en el grupo Ang II Axt ya que se obtuvieron valores similares a los del grupo Sham (Figura 44). Los valores de la actividad CAT entre los grupos Sham y Ang II fueron muy similares y no presentaron diferencia estadsticamente significativa,

160 Mtodos y Resultados

mientras que el grupo Ang II Axt present la menor actividad de la CAT (Figura 44). En el caso de la actividad GPx, el grupo Ang II Axt mostr la mayor actividad seguido del grupo Sham, mientras que la menor actividad de la GPx correspondi al grupo Ang II (Figura 44).

Mtodos y Resultados 161

120

* *

(% de inhibicin)

100 80 60 40 20 0
Sham Ang II Ang II Axt

Actividad SOD

150

(U/mg protena)

Actividad CAT

120 90 60 30 0
Sham Ang II Ang II Axt

0 .2 5

(U/mg protena)

Actividad GPx

0 .2 0 0 .1 5 0 .1 0 0 .0 5 0 .0 0
Sham Ang II Ang II Axt

Figura 44.- Actividad de la superxido dismutasa (SOD), de la catalasa (CAT) y de la glutatin peroxidasa (GPx) en hgado de ratones Swiss Albino-CD1 (Sham), Swiss Albino-CD1 con infusin de angiotensina II sin tratamiento (Ang II) y tratados con astaxantina 75 mg/kg/da (Ang II Axt). * p<0,05 frente al grupo Sham y * p<0,05 frente al grupo Ang II.

162 Mtodos y Resultados

Mtodos y Resultados 163

MODELO 3. RATONES Vav3-/Se utilizaron animales de 10 semanas de edad Vav3 deficientes o Vav3-/(knockout), provenientes de la Unidad del generacin de organismos modificados genticamente-SEA de la USAL, proporcionados por el Dr. Bustelo del Centro de Investigacin del Cncer. Los animales se dividieron en dos grupos. Vav3-/-: ratones deficientes en Vav3 que constituyen el grupo control con HTA. Vav3-/-Axt: ratones deficientes en Vav3 tratados con astaxantina suministrada en la dieta a una dosis de 100 mg/kg/da. En este caso, el tratamiento se mantuvo durante 8 semanas. En este periodo, el alimento y el agua consumidos se midieron cada tres das. Semanalmente se midi la PAS y se pesaron los animales con el fin de ajustar la astaxantina en el alimento. 1. Presin arterial sistlica Metodologa Al igual que en los dos modelos anteriores, la PAS se midi en la arteria caudal, mediante un mtodo incruento, con un equipo NIPREM 645 (Cibertec S.A. Espaa). Los detalles de este mtodo tambin se muestran en la seccin correspondiente a la determinacin de presin arterial sistlica del modelo 1. Al igual que en el modelo anterior, tambin se midi la PA para calcular la PAM por un mtodo cruento como se refiere en la seccin 1 del modelo de HTA inducida por Ang II.

164 Mtodos y Resultados

Resultados Tanto los resultados de la PAS como de la PAM, se expresan en mmHg como media aritmtica EEM de un mnimo de 10 experimentos. Los anlisis estadsticos se realizaron como se menciona en el apartado 1 del anexo 2. Los valores de PAS y de peso corporal durante el estudio se muestran en la tabla 19, donde se puede apreciar que los valores de PAS al inicio del experimento corresponden a los valores esperados ya que los ratones del grupo Vav3-/- y Vav3-/-Axt estuvieron por encima de los 145 mmHg. Conforme avanz el tratamiento con astaxantina y, de manera evidente, a partir de la de la segunda semana los valores de PAS del grupo experimental Vav3-/-Axt empiezan a disminuir separndose del grupo Vav3-/- hasta que al final del estudio la presin se reduce en unos 25 mmHg frente a los valores iniciales, dando lugar a diferencias significativas respecto al grupo Vav3-/- (Figura 45). Estas diferencias tambin se observaron cuando la PAM se determin, en animales anestesiados, en la arteria cartida (Figura 45). Los datos correspondientes al peso corporal de los grupos Vav3-/- y Vav3-/Axt, que tambin se presenta en la tabla 19, no muestran diferencias ni al inicio ni al final del tratamiento.

Mtodos y Resultados 165

Tabla 19.- Valores de presin arterial sistlica (PAS) y peso en ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). ** p<0,01 frente al grupo Vav3-/-.

Parmetro PAS (mmHg) Peso corporal (g) Vav3-/Vav3-/-Axt Vav3-/Vav3-/-Axt

Inicio del estudio 146 1 149 2 24 2 24 2

Fin del estudio 145 0,7 123 0,4** 27 1 27 2

166 Mtodos y Resultados

70

PAM (mmHg)

Vav3 -/Vav3 -/- Axt 160

*
60

50

40 Vav3 -/Vav3 -/- Axt

PAS (mmHg)

140

120

**

100 0 2 4 6 8

Tiempo (semanas)

Figura 45.- Presin arterial sistlica (PAS) en ratones conscientes y presin arterial media (PAM) en ratones anestesiados Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). * p<0,05 y ** p<0,01 frente al grupo a Vav3-/-.

Mtodos y Resultados 167

2. Estudios in vitro De manera similar a los otros dos modelos experimentales, despus de finalizar las ocho semanas de estudio, los ratones se anestesiaron con uretano (1,5 g/kg, i.p). Posteriormente se realiza una laparotoma y se procede a la extraccin de aorta y rin para estudios de funcionalidad, corazn y glndulas suprarrenales (GSR) para determinar ndices de hipertrofia. 2.1 Estudios de funcionalidad: aorta Metodologa Para los estudios de funcionalidad en aorta se utiliz un migrafo de cuatro canales, siguiendo el mismo procedimiento utilizado en las aortas del modelo de infusin de Ang II. Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes y contracturantes Previa contraccin de los anillos con FE (1x10-7 M) y una vez alcanzada una meseta de contraccin estable, se realizaron curvas acumulativas concentracin-respuesta de los siguientes agentes relajantes: ACh (1x10-83x10-4 M) y NTP (1x10-9-1x10-5 M). En otros anillos se realizaron curvas concentracin-respuesta a noradrenalina (NA, 1x10-9-1x10-5 M). Adems se obtuvieron respuestas a dosis nica de Ang II (1x10-7 M) en diversos anillos de cada grupo experimental. Las sustancias utilizadas se detallan en el anexo 1.

168 Mtodos y Resultados

Resultados El efecto provocado por ACh y NTP se expresa como % de relajacin frente a la respuesta mxima contrctil obtenida con FE y las respuestas contracturantes de NA y Ang II se expresan en mN. En cada serie de experimentos, los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 7 experimentos. El anlisis estadstico de los resultados se realiz como se describe en los apartados 1 y 3 del anexo 2. Curvas concentracin-respuesta a agentes relajantes Las curvas concentracin-respuesta a ACh fueron similares en los dos grupos experimentales de este modelo de hipertensin (Figura 46). La comparacin de los parmetros que caracterizan la cintica de la curva concentracin respuesta, Emax y pD2, nos permite corroborar esta afirmacin (Tabla 20). En la figura 47 se presentan las curvas concentracin-respuesta a NTP. En ambos grupos se producen respuestas relajantes prximas al 100%, no se observ cambio en las curvas concentracin-respuesta del grupo tratado con astaxantina (Tabla 21).

Mtodos y Resultados 169

Relajacin (%)

25 50 75 100 -9 -8 -7 -6

Vav3 -/Vav3 -/-Axt

-5

-4

ACh (log M)

Figura 46.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-5 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-7 M), de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt).

170 Mtodos y Resultados

0 Vav3 -/-

Relajacin (%)

25 50 75 100 -10

Vav3 -/-Axt

-9

-8

-7

-6

-5

-4

NTP (log M)

Figura 47.- Curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-9-1x10-5 M) en aortas, precontradas con fenilefrina (1x10-7 M), de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt).

Mtodos y Resultados 171

Tabla 20.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-8-3x10-5 M) en aortas de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt).

ACETILCOLINA Parmetro Emax (%) pD2 Vav3-/49,4 1,5 7,7 0,2 Vav3-/-Axt 52,9 1,4 7,3 0,1

Tabla 21.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-9-3x10-5 M) en aortas de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt).

NITROPRUSIATO SDICO Parmetro Emax (%) pD2 Vav3-/95,9 2,7 7,7 0,1 Vav3-/-Axt 88,4 2,4 7,7 0,1

172 Mtodos y Resultados

Respuesta a agentes contracturantes El comportamiento de la respuesta contracturante a NA de los anillos de aorta de los dos grupos experimentales se presenta en la figura 48. Las curvas de los dos grupos fueron diferentes, siendo mayor la respuesta contracturante en el grupo Vav3-/-Axt. Estas diferencias se reflejan en los parmetros que definen la cintica de las curvas, ya que los valores de Emax y pD2 fueron estadsticamente mayores para el grupo tratado con astaxantina (Tabla 22). En lo que respecta a la respuesta a una dosis nica de Ang II (1x10-7 M) hemos de decir que la respuesta contracturante fue muy pequea y poco reproducible, de manera que aunque en el grupo tratado con astaxantina la contraccin fue mayor, debido a esta variabilidad, las diferencias no fueron significativas (0,06 0,01 y 0,11 0,07 para los grupos Vav3-/- y Vav3-/Axt respectivamente).

Mtodos y Resultados 173

Vav3 -/7 Vav3 -/-Axt 6 5 4 3 2 1 0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

Contraccin (mN)

**

NA (log M)

Figura 48.- Curvas concentracin-respuesta a noradrenalina (1x10-9-3x10-5 M) en aortas de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). ** p<0,01 frente al grupo Vav3-/-.

174 Mtodos y Resultados

Tabla 22.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a noradrenalina (1x10-9-3x10-5 M) en aortas de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). ** p<0,01 frente al grupo Vav3-/-.

NORADRENALINA Parmetro Emax (%) pD2 Vav3-/3,9 0,3 7,6 0,2 Vav3-/-Axt 5,6 0,5** 7,6 0,3**

Mtodos y Resultados 175

2.2. Estudios de funcionalidad: rin Metodologa La metodologa es semejante a la descrita para el rin perfundido en el modelo 2. Las curvas concentracin-respuesta a ACh (1x10-9-1x10-4 M) se realizaron previa contraccin con FE (1x10-6 M). De la misma manera se hicieron las curvas concentracin respuesta a NTP (1x10-8-1x10-4 M). Adems se determin la respuesta contracturante a dosis nica de Ang II (1x10-7 M). Los detalles de las sustancias utilizadas se pueden consultar en el anexo 1. Resultados La presin de perfusin basal, la respuesta a KCl y a Ang II se expresan en mmHg. La relajacin provocada por ACh y NTP se expresa como % de relajacin frente a la respuesta contrctil obtenida con FE 1x10-6 M. En cada serie de experimentos, los resultados se expresan como la media aritmtica EEM de un mnimo de 6 experimentos. El anlisis estadstico se realiz como se describe en los apartados 1 y 3 del anexo 2. No se obtuvieron diferencias significativas en los valores de presin de perfusin basal entre ambos grupos (79,2 8,9 mmHg para el grupo Vav3-/- y 82,6 5,5 mmHg para el grupo Vav3-/-Axt). Las respuestas a KCl (40 mM) fueron similares en ambos grupos: 87,9 14,2 y 104,5 23,7 mmHg.

176 Mtodos y Resultados

En la figura 49 se presentan las curvas concentracin-respuesta a ACh en rin. La curva del grupo experimental Vav3-/- est desplazada a la derecha y hacia arriba respecto a la curva del grupo Vav3-/-Axt, lo que implica que la administracin crnica de astaxantina mejor la relajacin endotelio dependiente en el lecho vascular renal. Debido a esto, los parmetros que definen la curva concentracin-respuesta de cada grupo (Emax y pD2) mostraron valores estadsticamente diferentes, como se muestra en la tabla 23. En la figura 50 se muestran las curvas concentracin-respuesta realizadas usando NTP. Como se puede ver en estas dos curvas no se encontr diferencia en la respuesta aunque al final muestran una tendencia a separarse, esta diferencia no fue estadsticamente significativa. Del mismo modo, no se observaron diferencias en los parmetros que definen cada curva (Tabla 24). La respuesta de los dos grupos experimentales a una dosis nica de Ang II (1x10-7 M), no mostr diferencia. Las respuestas de los grupos Vav3-/- y Vav3-/-Axt fueron respectivamente: 141,8 6,1 y 146,2 4,7 mmHg. La administracin de astaxantina no produjo un cambio en la respuesta a Ang II en el lecho vascular renal.

Mtodos y Resultados 177

0 Vav3 -/-

Relajacin (%)

25 50 75

Vav3 -/-Axt

*
100 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

ACh (log M)

Figura 49.- Curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-9-1x10-4 M) en rin, perfundido y precontrado con fenilefrina (1x10-6 M), de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). * p<0,05 frente al grupo Vav3-/-.

178 Mtodos y Resultados

0 Vav3 -/-

Relajacin (%)

25 50 75 100 -9 -8 -7 -6

Vav3 -/- Axt

-5

-4

-3

NTP (log M)

Figura 50.- Curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-81x10-4 M) en rin, perfundido y precontrado con fenilefrina (1x10-6 M), de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt).

Mtodos y Resultados 179

Tabla 23.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a acetilcolina (1x10-9-1x10-4 M) en rin, perfundido y precontrado con fenilefrina (1x10-6 M), de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). * p<0,05 frente al grupo Vav3-/-.

ACETILCOLINA Parmetro Emax (%) pD2 Vav3-/68,3 4,9 8,0 0,4 Vav3-/-Axt 84,4 4,1* 8,2 0,3*

Tabla 24.- Parmetros que caracterizan las curvas concentracin-respuesta a nitroprusiato sdico (1x10-8-1x10-4 M) en rin, perfundido y precontrado con fenilefrina (1x10-6 M), de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt).

NITROPRUSIATO SDICO Parmetro Emax (%) pD2 Vav3-/71,0 6,9 6,9 0,5 Vav3-/-Axt 79,3 9,2 6,8 0,6

180 Mtodos y Resultados

3. Hipertrofia cardiaca Metodologa Al igual que en el modelo anterior, una vez que se sacrifican los animales se extrae el corazn, se eliminan cuidadosamente los restos de tejido graso y se separan las aurculas. Los ventrculos se secan cuidadosamente para eliminar el exceso de lquido y se pesan. La relacin entre el peso de los ventrculos y el peso corporal se utiliz como HV. Resultados Los resultados de HV se expresan como media aritmtica EEM de un mnimo de 10 experimentos. Las comparaciones estadsticas se realizaron como se indica en apartado 1 del anexo 2. En la figura 51 se presentan los datos de HV, como puede observarse el tratamiento con astaxantina redujo la hipertrofia cardiaca de forma estadsticamente significativa con respecto al grupo Vav3-/-.

Mtodos y Resultados 181

4.0 3.5

HV (mg/g)

3.0 2.5 2.0 Vav3-/Vav3-/-Axt

Figura 51.- ndice de hipertrofia cardiaca (HV) en ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). * p<0,05 frente al grupo Vav3-/-.

182 Mtodos y Resultados

4. Hipertrofia de las glndulas suprarrenales Metodologa El fenotipo producido por la deficiencia de las protenas Vav3 incluye una serie de caractersticas relacionadas de manera importante con la funcin renal, pero no se observan cambios en la morfologa y el peso de los riones182, sin embargo, se ha observado que existe hipertrofia de las glndulas suprarrenales. Para valorar si el tratamiento con astaxantina modifica este parmetro, las GSR se separaron del rin, se limpiaron y se pesaron. La relacin entre el peso de las GSR y el peso corporal se define como el ndice de hipertrofia de las glndulas suprarrenales (HGSR). Resultados Los resultados se expresan en mg/g como la media aritmtica EEM de un mnimo de 6 experimentos. Las comparaciones estadsticas se realizaron como se indica en el apartado 1 del anexo 2. Como se observa en la figura 52, tanto el peso de las GSR como el HGSR fueron significativamente menores en los ratones tratados con astaxantina con respecto al grupo control.

Mtodos y Resultados 183

Grupo experimental

Peso GSR (mg) 2.1 0.1 1.8 0.01*

Vav3 -/ Vav3 Axt

0.12 0.09 0.06 0.03 0.00 Vav3-/Vav3-/-Axt

Figura 52.- Peso e hipertrofia de las glndulas suprarrenales (HGSR) en ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). * p<0,05 frente al grupo Vav3-/-.

HGSR (mg/g)

184 Mtodos y Resultados

5. Produccin de anin superxido Metodologa Al igual que en los dos modelos de hipertensin anteriores, la determinacin de O2- en vasos se llev a cabo mediante quimioluminiscencia utilizando lucigenina. Se valor tanto la produccin basal como la estimulada con NADPH. Para la realizacin de estos estudios se utiliz la arteria aorta de una parte de los animales de cada grupo experimental. Inmediatamente despus del sacrificio la aorta se extrae, se limpia, se corta en dos secciones y se mantienen en Krebs HEPES fro. En una mitad se determina la produccin basal y en otra la estimulada. Resultados La produccin de O2- se expresa como URL/min/mg de tejido. Los resultados se expresaron como media aritmtica EEM de un mnimo de 5 experimentos. Los anlisis estadsticos se realizaron como se describe en el apartado 1 del anexo 2. No se encontraron diferencias significativas en la produccin basal de O2-, pero el tratamiento con astaxantina redujo, de manera significativa, la formacin de O2- cuando se estimulaba con NADPH (Figura 53).

Mtodos y Resultados 185

NADPH Grupo experimental O 2 - (URL/min/mg ) 247,3 9,2 311,7 43,5

Vav3 -/ Vav3 -/- Axt

7500

y O2- (URL/min/mg)

*
5000

2500

0 Vav3-/Vav3 -/-Axt

NADPH +

Figura 53.- Produccin O2- en aorta de ratones Vav3 deficientes (Vav3-/-) y tratados con astaxantina 100 mg/kg/da (Vav3-/-Axt). Produccin basal (NADPH -) y produccin estimulada (NADPH +).* p<0,05 frente al grupo Vav3-/-.

Discusin 187

Discusin

188 Discusin

Discusin 189

La HTA es un problema de salud pblica a nivel mundial, por su elevada prevalencia y por ser uno de los factores de riesgo ms importantes para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. En el ao 2000 aproximadamente el 26,4% de la poblacin mundial con ms de 20 aos padeca hipertensin y se estima que llegue al 29,2% en el ao 2025. La prevalencia aumenta con la edad y a partir de los 50 aos de forma exponencial195. Las organizaciones internacionales y regionales de salud, han reconocido el papel que tiene la nutricin en el control de la hipertensin42,43,44. En estos estudios se ha sugerido que el manejo nutricional integral donde se combina el consumo de frutas y verduras, que incrementa el consumo de antioxidantes, la reduccin en la ingesta de azcares, caf, alcohol, tabaco y la promocin de la actividad fsica son elementos necesarios para la disminucin y control de los niveles elevados de PA. Por otro lado, en el sistema cardiovascular las ERO tienen un papel fisiolgico esencial en el mantenimiento de la homeostasis, as como un papel patofisiolgico en la disfuncin endotelial asociada a enfermedades como hipertensin, diabetes y aterosclerosis196,197. Entre las ERO ms importantes destacan el O2-, H2O2, y el NO. En condiciones fisiolgicas estas ERO son producidas de manera controlada a bajas concentraciones, funcionando como molculas de sealizacin regulando el tono vascular y el desarrollo de las CMLV198,199. Sin embargo, en condiciones patolgicas la produccin aumentada de ERO conlleva a la disfuncin endotelial, vasoconstriccin aumentada y a un desarrollo excesivo de las CMLV, entre otros procesos, que contribuyen al dao cardiovascular200. En modelos animales donde se han desarrollado patologas como las mencionadas se ha observado que la alteracin de la relajacin endotelio dependiente est asociada a una degradacin mayor de NO por las ERO. Esto tambin se ha estudiado en seres humanos, donde las vitaminas antioxidantes han demostrado incrementar la relajacin endotelio dependiente en la

190 Discusin

circulacin coronaria diabetes178,179,180.

radial

de

individuos

con

hipertensin

Esta relacin entre el balance de las ERO, los sistemas antioxidantes propios del organismo, de la dieta y la salud cardiovascular se ha reforzado en los ltimos aos. Por lo que con esta hiptesis de partida, nos propusimos evaluar el efecto que la astaxantina, un carotenoide de origen natural, tiene sobre la funcionalidad vascular, el remodelado cardiovascular y el estrs oxidativo asociados a la hipertensin. Para ello hemos utilizado tres modelos animales de HTA: el modelo con ratas SHR fue utilizado debido a que los animales presentan dao en rganos similares a los observados en la hipertensin esencial en humanos181. El modelo de infusin de Ang II nos pareci importante debido a que la cascada de sealizacin producida por la Ang II involucra la estimulacin de la NAD(P)H vascular por lo que se asocia a la produccin excesiva de ERO, mientras que los ratones Vav3-/- nos parecieron interesantes debido a que la expresin a la alza del SRA implica estrs oxidativo y a que es un nuevo modelo de HTA. En todos los casos, la astaxantina fue administrada en el pienso en las dosis mencionadas, y observamos que en ningn caso alter el desarrollo de los animales. El crecimiento de los grupos tratados con astaxantina fue igual al crecimiento de los grupos no tratados. Esto es importante debido a que le proporciona validez a las comparaciones donde se utiliza el peso corporal para la obtencin de ndices de hipertrofia. Adems, se observ que las velocidades de crecimiento en todos los casos fueron las adecuadas para los animales utilizados en relacin a su edad y bienestar. En parte esto es reflejo de que todos los grupos experimentales consumieron el mismo alimento. En los grupos experimentales donde se administr astaxantina, la composicin del pienso no cambi debido a que la cantidad de astaxantina administrada y el vehculo que se utiliza como soporte (dextrinas), se ajust con base a la

Discusin 191

cantidad de almidn, por lo que no existi diferencia en la ingesta calrica entre los grupos debido a la dieta utilizada183. El bienestar de los animales de los grupos experimentales est asociado a la cantidad y calidad del alimento recibido. Esto es importante debido a que se sabe que un cambio sustancial en la densidad calrica de la dieta puede modificar los datos experimentales e interferir en los resultados sobre todo en trabajos donde se involucra el sistema cardiovascular y el sistema nervioso en general201. La administracin de astaxantina en la dieta y en las dosis usadas fue capaz de disminuir la PAS o de ralentizar el incremento de sta segn el modelo de hipertensin utilizado (Figuras 10, 30, 45). Como podemos ver en los tres modelos, la reduccin en la PAS con respecto a los grupos con HTA fue del mismo orden de magnitud: de 26 y 20 mmHg en el modelo con ratas SHR, 21 mmHg en el modelo de infusin de Ang II y 22 mmHg en el modelo Vav3-/-. En este sentido, la administracin de astaxantina produce disminuciones de PAS discretas, propias de los antioxidantes como la vitamina C y E125. Hussein y col.36 han descrito el uso de astaxantina en ratas SHR y Wistar Kyoto (WKY) y han encontrado que la administracin oral en animales de 7 semanas de edad y en dosis nica de 5, 50 y 500 mg/kg no afectaba la PAS. Sin embargo, en el mismo estudio la administracin en una dosis diaria de 50 mg/kg durante dos semanas disminuy los valores de PAS de 198 a 173 mmHg. De la misma manera, cuando analizan el efecto de dos dosis diarias, 5 y 50 mg/kg, durante cinco semanas encontraron que la velocidad de diminucin de los valores de PA estaba relacionada con la dosis, de tal manera que con la dosis baja los cambios en la PA no se ponan de manifiesto hasta finalizar la segunda semana de administracin, mientras que con la dosis alta la disminucin fue evidente desde la primera semana de administracin. En promedio se encontr que la astaxantina en esas dosis disminuye la PA en ratas SHR alrededor de 18 mmHg.

192 Discusin

Si consideramos la disminucin que encontramos en nuestros experimentos, tambin con ratas SHR: 11,3% y 14,8% con dosis de 75 y 200 mg/kg/da respectivamente pareciera ser que la velocidad de disminucin de la PAS es dosis dependiente pero que estamos en el lmite de respuesta. Los resultados considerando los porcentajes de disminucin de la PAS encontrados en los otros dos modelos utilizados, son muy similares a los encontrados con ratas SHR, ya que tanto para el modelo de infusin de Ang II como en los ratones Vav3-/- la disminucin fue de un 15%. Con el fin de evaluar la disminucin de la PA producida por la astaxantina, Husein y col. administraron por va oral una dosis de 5 mg/kg/da durante 7 semanas en ratas SHR; los resultados fueron similares a los mencionados. La disminucin en la PAS fue de 13% y se evidenci a partir de la segunda semana de tratamiento37,38. En cuanto a la evaluacin de las propiedades antihipertensivas de otros antioxidantes, los estudios se han centrado sobre todo en las vitaminas E y C. En la primera se han usado modelos animales como ratas SHR pero hay pocos estudios en seres humanos, mientras que en el caso de la vitamina C, los trabajos se han centrado ms en humanos que en modelos animales. Newaz y Nawal202 administraron -tocotrienol a ratas SHR en una dosis de 15 mg/kg observando una disminucin de la PAS y un incremento en la actividad SOD. Estos mismos autores en otro estudio203 utilizando -tocoferol, en una dosis de 34 mg/kg en ratas WKY y SHR, observaron reducciones de la PAS considerables, de la peroxidacin de lpidos e incrementos de la actividad SOD de los grupos de animales tratados. Newaz y col.204 en un estudio en el que se relaciona el efecto dosis respuesta de -tocoferol utilizando dosis en la dieta de 17, 34 y 170 mg/kg en ratas SHR, describen que los mejores resultados se obtuvieron con la dosis de 34 mg/kg disminuyendo la PA e incrementando los valores de actividad de eNOS. En otras investigaciones con modelos animales, se ha analizado la influencia de la vitamina E sobre el metabolismo de los cidos grasos omega 3 y 6, la

Discusin 193

produccin de PGI2 y su efecto antihipertensivo205. En todos los casos, los mecanismos propuestos para la reduccin de la PA por medio de la vitamina E coinciden en que incrementa la capacidad antioxidante, la actividad de la eNOS, la biodisponibilidad del NO y reduce la oxidacin de las LDL. En el caso de la vitamina C se ha demostrado una clara disminucin de los valores de PAS en modelos animales, y esta disminucin es dosis dependiente206. Vasdev y col.207 encontraron que la administracin crnica de vitamina C durante 9 semanas con una dosis de 1000 mg/kg dieta/da en ratas SHR, disminua la PAS del orden de 20 a 30 mmHg desde la primera semana de administracin, pero esta reduccin nunca llegaba a ser de mayor magnitud pues los valores alcanzados en ese tiempo se mantenan constantes durante todo el estudio. Atribuyeron las propiedades antihipertensivas de la vitamina C a que sta es capaz de restituir los niveles de cistena y de glutatin con la mejora del estado oxidativo de los individuos. Adems, Chen y col.125 estudiaron el efecto de la vitamina C y E en la progresin de la HTA en un modelo de ratas SHR-SP. Las vitaminas C y E fueron administradas en una dosis de 1000 mg/da y de 1000 UI/da respectivamente durante seis semanas. En las primeras dos semanas el efecto de las dos vitaminas lleg a su mximo, 30 mmHg por debajo del grupo control, mantenindose as durante las semanas restantes. La disminucin de la PAS se atribuy a una mejora en el estado antioxidante de los grupos tratados, a una mejor vasorrelajacin endotelio dependiente y a una disminucin del remodelado vascular. En un estudio in vitro realizado por lker y col.208 se analizan los efectos de las vitaminas C y E en la funcin vascular y la actividad de la NAD(P)H oxidasa y la eNOS utilizando aortas de ratas SHR y su control normotenso (WKY), con el fin de discriminar los mecanismos involucrados en la reduccin de la PA asociada a la ingesta de estos dos antioxidantes. Sus resultados atribuyen la disminucin en los valores de la PA a una mejor

194 Discusin

funcin endotelial, a un incremento en la actividad de la eNOS y a una disminucin en la actividad de la NAD(P)H oxidasa. Diversos estudios en seres humanos han ayudado a proponer diferentes mecanismos para explicar la capacidad antihipertensiva de vitaminas antioxidantes209,210,211,212,213,214. Entre los mecanismos ms importantes destacan el incremento de la biodisponibilidad del NO, de la actividad de la eNOS, de la recuperacin de glutatin oxidado a glutatin reducido y una mejor funcin vascular. El licopeno, otro carotenoide como la astaxantina, ha demostrado su capacidad antihipertensiva reduciendo hasta en 9 mmHg la PAS de individuos de entre 40 a 65 aos de edad215. As, la accin antihipertensiva de la astaxantina, los posibles mecanismos de accin y su relacin con las ERO han sido propuestos en un trabajo de revisin,39 donde se han sugerido como posibles vas, una disminucin en la respuesta adrenrgica de las clulas vasculares de msculo liso, una disminucin en la agregacin plaquetaria, una menor respuesta a la activacin de la NAD(P)H oxidasa por parte de la Ang II y una reduccin en las concentraciones de ERO, sin embargo, ni en este trabajo ni en los que le preceden corroboraron estos mecanismos. Con los resultados de nuestros experimentos, podemos decir que la disminucin en la PAS encontrada en los tres modelos utilizados mediante la administracin de astaxantina, se asocia a cambios funcionales y estructurales de los vasos y a una mejora del estado de oxidacin, aspectos que se detallarn ms adelante. La prdida de la vasodilatacin endotelio-dependiente en la hipertensin ha sido asociada a la disminucin de la biodisponibilidad de NO. Este hecho tambin se ha relacionado con una disminucin en la sntesis de NO y/o un incremento en la degradacin del NO por interaccin con el O2- para formar

Discusin 195

ONOO-216,217 que es un vasodilatador muy pobre comparado con el NO, adems de que tiene propiedades inflamatorias218. En modelos experimentales de hipertensin se ha mejorado la funcin endotelial mediante antioxidantes o mediante precursores de BH4219,220. Por esta razn, uno de nuestros objetivos de estudio fue determinar si el tratamiento con astaxantina podra mejorar la funcionalidad de diferentes lechos vasculares. En el caso de la aorta de ratas SHR, la respuesta a ACh, que refleja el estado funcional del endotelio, no mejor con la administracin de astaxantina. Como aparece en la figura 13, las curvas del grupo SHR-Control y de los dos grupos tratados SHR-Axt 200 y SHR-Axt 75 fueron prcticamente iguales, lo que nos confirm que el tratamiento con astaxantina, no mejor la disfuncin endotelial asociada a la HTA en arterias de conductancia. Estos resultados estn parcialmente en concordancia con los trabajos del grupo de Hussein, que estudiaron la administracin oral de astaxantina en ratas SHR. En estas investigaciones no encontraron un efecto significativo en la respuesta relajante a ACh en anillos de aorta torcica, aspecto que atribuyen al hecho de que la produccin de NO endotelial no se altera con la astaxantina36,37. En comparacin con nuestros resultados, ellos s encontraron diferencias en la relajacin independiente del endotelio. Sin embargo, existen otros estudios donde se ha descrito que el uso de vitaminas antioxidantes mejora la relajacin endotelio dependiente221. Estudios realizados en anillos de aorta de ratas SHR y WKY incubados con vitaminas C y E en concentraciones de 10 M y 100 M cada una, han demostrado que se mejora la relajacin endotelio dependiente en SHR logrando relajaciones similares a las obtenidas en ratas WKY. Los resultados en ambos casos han sido positivos, siendo mejor la relajacin producida por la incubacin con vitamina C208. Al estudiar en estos mismos vasos la influencia de los prostanoides derivados de la COX mediante la inhibicin de esta enzima con indometacina, si bien

196 Discusin

como era de esperar mejor la relajacin con respecto a los anillos de aorta no incubados, no hubo diferencia entre los tres grupos experimentales lo que evidencia que la astaxantina adems de no mejorar la relajacin endotelio dependiente, no influye significativamente en la sntesis de las prostaglandinas (Figuras 14 y 15). Tampoco encontramos diferencias en la respuesta a NTP (Figura 18), ni en la biodisponibilidad de NO, pues la respuesta a FE no cambi en presencia del antagonista de la eNOS, L-NAME, evidenciando que el tratamiento con la astaxantina, con las dos dosis utilizadas, no mejor la produccin basal de NO. Estos datos nos sugieren que el hecho de no encontrar una mejor relajacin endotelio-dependiente en la aorta, se puede asociar a una falta de mayor biodisponibilidad de NO. El comportamiento funcional de la aorta en el modelo de infusin de Ang II tuvo similitudes y diferencias a lo encontrado en el modelo con ratas SHR. Si comparamos la respuesta de los grupos Ang II y Ang II Axt a ACh observamos que fue prcticamente igual. En este sentido podemos decir que la administracin de astaxantina no mejor la relajacin endotelio dependiente en este modelo de hipertensin. Algo que nos sorprendi, fue el hecho de observar que la curva concentracin respuesta a ACh en el grupo Sham se desplazara significativamente a la derecha, con respecto a los otros dos grupos experimentales como se aprecia en la figura 33. Los resultados de actividades enzimticas observadas en el hgado en este modelo de hipertensin nos sugieren que al presentarse valores altos de la actividad SOD, valores de la actividad CAT similares y mayor actividad de la GPx en el grupo Sham frente al grupo Ang II, podran estar relacionadas con una disminucin acusada de H2O2 y que ste participe en la mediacin de la relajacin endotelio dependiente en las aortas, pues se ha descrito la participacin del H2O2 en la hiperpolarizacin y el efecto relajante observado en vasos de conductancia como la cartida101,222. Aspecto que tambin estara relacionado con una ligera disminucin del MDA en plasma.

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En este modelo 2, no se realiz una incubacin con inhibidores de la va de la COX, sino que nos interesamos, adems de analizar la relajacin endotelio dependiente, en ver si sta cambiaba con la inhibicin de la NAD(P)H oxidasa utilizando apocinina como un inhibidor conocido de este sistema enzimtico. Los resultados no fueron los esperados, ya que si bien en el grupo Sham la apocinina no modific esta respuesta, en los grupos Ang II y Ang II Axt la incubacin con apocinina disminuy los valores de pD2 y de Emax de manera significativa (Figura 34 y Tabla 14). Las posibles razones de esto pueden atribuirse a que la misma apocinina pueda ser un agente pro-oxidante o como algunos autores sugieren puede producir un efecto negativo pues induce estrs oxidativo223. Los mecanismos qumicos involucrados en las acciones de la apocinina han sido estudiados en fagocitos, se ha encontrado que para poder inhibir la NAD(P)H oxidasa, es necesario que la apocinina se oxide en presencia de H2O2 y mieloperoxidasa (MPO). Una vez oxidada sta es capaz de formar dmeros o trmeros que son los compuestos con actividad metablica. No se sabe si la actividad de la apocinina es especfica de la MPO, si en las clulas vasculares la apocinina es capaz de inhibir la NAD(P)H oxidasa, a pesar de que no tienen MPO propia sino que la toman las clulas endoteliales a partir de la MPO secretada por neutrfilos y que de esta manera se active la dimerizacin y la actividad inhibitoria de la apocinina e inclusive si la apocinina en s misma es un antioxidante. Para aumentar la complejidad, algunos estudios han demostrado que la apocinina en clulas endoteliales puede ser un pro-oxidante que incrementa la formacin de ERO ms que disminuirla224,225,226. Lo que es cierto es que la complejidad de tales hallazgos ha abierto ms que una polmica un espacio para futuras investigaciones. En este modelo al igual que en el modelo anterior, la respuesta independiente del endotelio no mostr ninguna diferencia entre los tres grupos experimentales utilizados (Figura 35).

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En este mismo modelo al analizar la respuesta contracturante mediante curvas dosis respuesta a NA, encontramos una respuesta diferenciada. La respuesta contracturante en el grupo experimental Ang II y en el grupo Sham fue prcticamente igual, mientras que la respuesta del grupo Ang II Axt fue significativamente menor a la de estos dos grupos. Podemos decir que la infusin de Ang II no increment la respuesta a NA, mientras que la administracin de astaxantina regula a la baja esta respuesta (Figura 36). Los valores de los parmetros que definen las curvas correspondientes variaron de manera significativa (Tabla 16). Este hecho ha sido documentado en ambos sentidos, pues algunos autores hablan de una respuesta y una expresin aumentada de los receptores adrenrgicos 1d en modelos animales de hipertensin con respecto a animales normotensos227, mientras que otros autores han concluido que las ratas SHR y las ratas WKY no presentan diferencias en la respuesta a norepinefrina228, de hecho algunas investigaciones sugieren que los receptores adrenrgicos 1d y 1b no estn relacionados con la hipertensin inducida por Ang II229,230. Otros autores han encontrado que la Ang II, a travs de los receptores AT1, amplifica o facilita la actividad del SNS y que este mecanismo contribuye a la accin vasoconstrictora de la Ang II63. Nosotros pensamos que esto ltimo es posible, ya que en modelos de diabetes y disfuncin endotelial se ha observado una respuesta incrementada a NA en aortas, mientras que la utilizacin de antioxidantes como el resveratrol mejora la funcin endotelial que adems se asocia a una reduccin en la respuesta a NA231. En lo que respecta a la respuesta de los anillos de aorta de este modelo de hipertensin a una dosis nica de Ang II (1x10-7 M), los resultados no fueron diferentes, sobre todo considerando los valores del EEM. Nuestros datos no concuerdan con los de Hussein y col.37, quienes mencionan que la astaxantina reduce significativamente la respuesta contrctil a Ang II, en ratas SHR, sin embargo hay tambin que considerar que se trata de especies diferentes y por lo tanto la respuesta no necesariamente tendra que ser la misma. Lo que es

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evidente, como aparece en la figura 37, es que hay una tendencia de respuesta a la baja en los dos grupos experimentales donde se realiz la infusin con Ang II: grupos Ang II y Ang II Axt, probablemente esta respuesta pueda estar relacionada con un mecanismo de regulacin a la baja de los receptores AT1 como un mecanismo compensatorio por la concentracin de ligando que se est suministrando a travs de las minibombas osmticas, o que se presente un antagonismo regulatorio mediante los receptores AT257. Tambin cabe mencionar que si bien se ha observado una expresin a la alza del ARNm y de la protena propia de los receptores AT1 en modelos animales de hipertensin como las ratas SHR en comparacin con ratas WKY, esto no necesariamente se traduce en una mayor respuesta en los vasos232,233. En el modelo de hipertensin con ratones modificados genticamente para las protenas Vav3 encontramos un comportamiento muy similar en la funcionalidad de la aorta con respecto a los dos modelos precedentes. En la relajacin endotelio-dependiente, la respuesta a ACh no mejor por la administracin crnica de astaxantina. Este efecto podra estar relacionado con el hecho de que los ratones Vav3-/tienen niveles elevados de Ang II, que se incrementan con la edad, al mismo tiempo que expresan a la alza los receptores AT1 en las CMLV de la aorta. Dicha sobre-expresin de Ang II y de sus receptores AT1, conllevan una vasoconstriccin mediada por DAG, IP3 y la activacin de la NAD(P)H oxidasa y por lo tanto un incremento en la produccin de O2- que, a su vez, produce un crculo vicioso de activacin de la contraccin muscular disminuyendo la biodisponibilidad de NO y el posible desacoplamiento de la eNOS, por lo que la capacidad antioxidante de la astaxantina a pesar de que puede disminuir la produccin de O2-, como lo comprobamos mediante quimioluminiscencia (Figura 53), no es suficiente para incrementar la biodisponibilidad de NO y de esta manera reflejarse en una mejor relajacin endotelio-dependiente.

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En las curvas concentracin-respuesta a NTP, para analizar la respuesta endotelio-independiente, no se observ ninguna diferencia entre los dos grupos experimentales. Los valores de Emax y de pD2 que aparecen en la tabla 21, son muy parecidos entre s. Como se sabe el SNS participa en la homeostasis cardiovascular mediante la regulacin de la frecuencia cardiaca, la contraccin cardiaca, el tono vascular y la liberacin de renina234,235. Estas acciones se llevan a cabo por tres catecolaminas: adrenalina, noradrenalina y dopamina. Sauzeau y col.182 mencionan que en ratones Vav3-/- estas tres catecolaminas se encuentran elevadas desde su nacimiento hasta la edad adulta, lo que implica una hiperactividad del SNS. Al analizar las curvas correspondientes a la respuesta contracturante a NA se pudo observar que el grupo experimental Vav3-/present un menor valor del Emax que el grupo Vav3-/-Axt. Adems de esta diferencia, el valor del parmetro pD2 del grupo tratado con astaxantina tambin fue mayor, lo que implica que este grupo mostr una mayor sensibilidad en su respuesta a NA, lo que estara en oposicin con los datos de Hussein y col.39, quienes mencionan que la astaxantina es capaz de normalizar la respuesta de los receptores adrenrgicos. Por otro lado, esta respuesta aumentada a NA en el grupo Vav3-/-Axt podra deberse a una disminucin en la concentracin de catecolaminas en este grupo experimental, lo que llevara a una expresin al alza de los receptores adrenrgicos como un mecanismo de regulacin. Aunque cabra esperar una reduccin en la respuesta a NA en el grupo tratado con astaxantina como ocurra en el anterior modelo, ya que el uso de otros antioxidantes como el resveratrol se ha asociado a una menor respuesta de anillos de aorta a la NA como parte de la mejor funcin vascular observada231. Lo que es evidente, es que el conocimiento de este modelo en la ptica de la hipertensin est en sus primeras etapas y que queda mucho por investigar. La respuesta a dosis nica de Ang II (1x10-7 M) en anillos de aorta de este modelo de hipertensin, no fue significativamente diferente entre los dos

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grupos experimentales, tan slo se observ una tendencia de respuesta aumentada en el grupo Vav3-/-Axt, que de ninguna manera puede darnos elementos para relacionar este incremento con la administracin de astaxantina, sobre todo considerando los valores del EEM que se observaron. Cabe mencionar que aunque se sabe que los ratones Vav3-/- tienen una regulacin al alza del ARNm de los receptores AT1 en las CMLV y en el corazn, se conoce poco sobre el significado funcional de este hecho. Estudios en otros modelos animales de hipertensin, tambin han demostrado una expresin aumentada del ARNm y de la protena de los receptores AT1 y AT2 en aortas de ratas SHR en comparacin de ratas WKY232,233,236. Otros investigadores han confirmado que esta diferencia entre las cepas SHR y WKY se produce en la densidad de expresin y la afinidad que tienen estos receptores, pero esta diferencia slo se ha podido identificar a nivel de mdula adrenal, parte externa de la mdula renal y en el corazn pero no en los vasos; por lo que se ha sugerido que la regulacin a la alza de la sealizacin de Ang II en individuos hipertensos ocurre a nivel post-receptor237. De cualquier modo, con los datos obtenidos no podemos relacionar la respuesta a Ang II con algn cambio producido por la administracin crnica de astaxantina, sobre todo por la variabilidad observada en la respuesta. En los tres modelos de hipertensin, el lecho vascular renal se comport de manera diferente a los resultados que encontramos en la aorta. En este caso la mejora en la funcionalidad del lecho vascular renal asociada a la administracin de astaxantina, da respuesta a la disminucin en los valores de PAS observados y se relaciona con otros cambios estructurales y funcionales beneficiosos que se irn discutiendo durante el desarrollo de este captulo. Con los datos obtenidos en el modelo de ratas SHR, podemos decir que la astaxantina mejor la relajacin endotelio dependiente en el lecho vascular renal incrementando los valores de pD2 y aumentando entre un 15 a un 18% el valor del Emax (Figura 20 y Tabla 10). Esta mejor respuesta vascular adems la asociamos a un incremento significativo en la biodisponibilidad de NO de un

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84,8 11,5% en el grupo SHR-Control a un 132,0 15,5% en el grupo SHRAxt 200. En el modelo de hipertensin mediante infusin de Ang II, la astaxantina tambin mejor la relajacin endotelio dependiente en el lecho vascular renal. En este caso se observ en el grupo experimental Ang II Axt un incremento de 25% en el valor del Emax con respecto al grupo Ang II, esta relajacin mxima observada en el grupo Ang II Axt, inclusive, fue ligeramente superior a la del grupo Sham (Figura 38). Los valores mayores de pD2 correspondieron a los grupos Sham y Ang II Axt. En el modelo de hipertensin basado en la deficiencia de las protenas Vav 3, los resultados fueron alentadores, en este caso la administracin crnica de astaxantina tambin mejor la respuesta del lecho vascular renal a ACh, lo que se reflej tanto en el valor de pD2 como en la respuesta mxima del grupo Vav3-/-Axt que fue 22% superior a la del grupo Vav3-/- (Figura 49). Estos resultados nos sugieren que la disminucin de la PAS asociada a la administracin crnica de astaxantina en este modelo de hipertensin puede estar relacionada con la mejora en la funcin endotelio-dependiente en arterias de resistencia. Creemos que uno de los hallazgos ms importantes de este estudio es que la administracin de astaxantina disminuy los valores de PAS en los tres modelos utilizados, y que esta disminucin est asociada a una mejora en la funcin endotelial en arterias de resitencia, como demuestran los resultados obtenidos en el lecho vascular renal. Pensamos adems, que estos cambios estn relacionados con el estado redox, ya que en el modelo de ratas SHR esta mejora en la funcin endotelial del lecho vascular renal se asoci claramente a un incremento en la biodisponibilidad del NO en el mismo lecho vascular (Figura 21), esta asociacin entre funcin endotelial, biodisponibilidad de NO y astaxantina ha sido sugerida por algunos autores238. Estos datos son concordantes con los resultados de diversos estudios, donde se han suministrado de manera crnica vitaminas C y E encontrando una mejora en

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la relajacin endotelio dependiente en vasos de resistencia (segmentos de arterias mesentricas) que asocian a un incremento en el estado antioxidante del plasma y a la funcin de scavenger de estas vitaminas125. El uso de estas vitaminas, tambin ha sido asociado por otros autores con una estimulacin directa de la eNOS por medio de un aumento en la BH4 intracelular con la consecuente sntesis aumentada de NO202,204,221. Tambin se ha observado que la administracin de vitaminas antioxidantes en ratones deficientes en Apo E y con disfuncin endotelial, es capaz aumentar el estatus antioxidante del plasma, lo que se traduce en una menor disponibilidad de radicales libres, que mejora la defensa celular y la respuesta funcional del endotelio. En este caso, la respuesta se asocia a un incremento en la BH4, a una mayor actividad de la eNOS y niveles basales altos de cGMP, lo que sugiere que la vitamina C produce una estimulacin BH4 dependiente de la sntesis de NO177,239. En otros estudios, usando un modelo de hipertensin mediante la infusin de Ang II en ratones, se analiz el efecto del estado redox en la PA y la funcin endotelial de vasos de resistencia, mediante la administracin en la dieta de apocinina en una dosis de 2,5 mg/da. En este caso, ms all de que los diversos grupos de investigacin no se ponen de acuerdo en si la apocinina es un inhibidor de la NAD(P)H oxidasa o un antioxidante225, lo resultados son interesantes ya que la disminucin de los valores de PAS se asociaron a una mejora en la funcin endotelial de arterias mesentricas de segundo orden y a la disminucin de las concentraciones de O2-240. Estos resultados han sido respaldados por el hecho de que la infusin de Ang II produce una disminucin en la biodisponibilidad de NO241,242, que se ve mermada por los incrementos en O2 - cuando la hipertensin est plenamente establecida243 y al hecho de que la eNOS desacoplada produce ms O2-244,245, todo esto en detrimento de la funcin endotelial. De manera indirecta tambin se ha resaltado la importancia del equilibrio redox y del balance entre las ERO y las enzimas antioxidantes en el desarrollo

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de la hipertensin mediante la sobre-expresin de enzimas como la SOD y la CAT175. En lo que respecta a la respuesta independiente del endotelio en los dos modelos donde se realiz para el lecho vascular renal: modelo con ratas SHR y modelo de ratones Vav3-/-, podemos decir que en el caso del primero la administracin de dosis altas de astaxantina no modific la respuesta a NTP (Figura 22), sin embargo, cuando se administr en una dosis de 75 mg/kg/da, se produjo un Emax superior (83,40 12,2%) en comparacin a los valores del grupo SHR-Control (76,42 15,8%) sin que estos fueran significativos. Hasta el momento no se han realizado estudios con astaxantina en lechos vasculares de resistencia, por lo que no existe literatura al respecto; sin embargo Hussein y col.37 encontraron en aortas de SHR una relajacin independiente del endotelio mayor en el grupo experimental donde se administr va oral astaxantina en una dosis de 5 mg/da, en comparacin del grupo no tratado. Estos autores atribuyen esta diferencia en la respuesta a NTP, a que en el grupo tratado con astaxantina puede haber un incremento de los nucletidos cclicos y una disminucin en el calcio intracelular, a pesar de que esta hiptesis es interesante, ellos no lo corroboraron en su estudio. En el modelo con ratones Vav3-/-, las curvas concentracin respuesta a NTP de los grupos experimentales Vav3-/- y Vav3-/-Axt no fueron diferentes (Figura 50). Estos datos concuerdan con los resultados encontrados en diferentes investigaciones donde utilizan vitaminas antioxidantes o inhibidores de la NAD(P)H oxidasa como la apocinina. En estos estudios hay dos hechos principales: el uso de los antioxidantes mejora la relajacin endoteliodependiente y no modifica la relajacin a NTP208,125,240. Los datos que encontramos al realizar curvas concentracin respuesta a FE en el lecho vascular renal del modelo de hipertensin inducido por la infusin de Ang II, no reflejan un efecto producido por la administracin de la astaxantina. El comportamiento entre los tres grupos experimentales, como se coment en la seccin de resultados, fue igual. Esto estara en concordancia

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con los resultados mencionados, ya que investigaciones recientes han encontrado que los receptores adrenrgicos 1d y 1b no estn relacionados con la hipertensin inducida por Ang II229,230 o que no existe diferencia en la respuesta adrenrgica entre ratas hipertensas y normotensas228. Sin embargo, como sucedi en las curvas dosis respuesta a NA en aortas de este mismo modelo de hipertensin, tambin existen investigaciones que indican lo contrario227. Lo que s es un hecho es que la administracin de astaxantina no modific a la baja esta respuesta. La perfusin de Ang II en dosis nica no produjo una respuesta diferente entre los grupos experimentales Vav3-/- y Vav3-/-Axt. Sauzeau y col.182 mencionan que la disfuncin cardiovascular que caracteriza el fenotipo de los ratones Vav3-/- est relacionada con una expresin al alza del SRA, incluyendo los receptores AT1. Ensayos preliminares llevados a cabo en nuestro laboratorio utilizando rin perfundido indican que esto se corresponde con una mayor respuesta contracturante a Ang II en los ratones Vav3-/-. En este sentido, con los datos obtenidos podemos decir que la astaxantina no modific la respuesta a Ang II en la dosis y condiciones sealadas. Se sabe que las consecuencias nocivas de la hipertensin se deben tanto a factores hemodinmicos como no hemodinmicos y el hecho que la astaxantina disminuya de manera significativa la presin arterial nos llev a pensar que otros parmetros como la hipertrofia cardiaca y vascular podran mejorar en los modelos de HTA utilizados. As, otro de los objetivos de este trabajo fue determinar si la administracin de astaxantina influa sobre los procesos de remodelado cardiovascular propios de la HTA. El remodelado cardiaco se ha definido como la expresin de cambios moleculares, celulares e intersticiales que se manifiestan clnicamente como modificaciones que deterioran la forma, el tamao y la funcin del corazn246. La HTA est vinculada con el desarrollo de la hipertrofia cardiaca que se manifiesta fundamentalmente en el ventrculo izquierdo. Ello se debe a un aumento en el nmero o tamao de los cardiomiocitos y a la hiperplasia de

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fibroblastos del intersticio, que en ltimo trmino lleva a la disfuncin cardiaca. En este mismo sentido, el SRA est considerado uno de los sistemas reguladores ms importantes en el mantenimiento de la homeostasis cardiovascular. Actualmente se sabe que la Ang II puede actuar localmente como quimocina, induciendo la fosforilacin de tirosinas, el crecimiento, la hipertrofia y la diferenciacin celulares. Adems, evidencias recientes han demostrado que la Ang II es un estimulador importante de la produccin de ERO y por lo tanto de los mecanismos de inflamacin123. De los resultados obtenidos en nuestros experimentos, podemos decir que la administracin de astaxantina disminuy la hipertrofia ventricular de manera significativa en los tres modelos de hipertensin utilizados. En el modelo con ratas SHR encontramos que esta reduccin fue significativa para las dos dosis de astaxantina. Como se ve en la figura 23 la dosis menor de astaxantina se relacion con una reduccin ms eficiente de la HVI. En los trabajos sobre el uso de astaxantina como antihipertensivo no se hace referencia al anlisis de la HVI36,37,38; sin embargo, Gross y col.34,35 estudiaron el efecto cardioprotector de la astaxantina, observando que sta se acumula en el miocardio en forma libre y que esto reduce la cantidad de radicales libres, de MPO, TNF y prostaglandina E2. Si algo similar ocurre con los animales del grupo SHR-Axt, esto podra explicar en parte la reduccin del tamao del corazn. En otros estudios, utilizando el modelo de ratas SHR a las que se administra vitamina C, se ve que sta es capaz de reducir los valores de HVI con respecto al control SHR207. En otras investigaciones utilizando productos antioxidantes como la quercetina y polifenoles del vino se ha visto tambin una reduccin de los valores de HVI con respecto al control, aunque en ningn caso los valores se acercan a los valores de las ratas WKY247,248. En general, los valores de reduccin en la HVI logrados con antioxidantes presentes en los alimentos no llega a ser tan significativa como en el caso de los frmacos249,250.

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En el modelo de infusin de Ang II, los resultados fueron muy positivos ya que el grupo Ang II Axt tuvo valores de hipertrofia similares a los del grupo Sham, mientras que el grupo Ang II present valores ms altos (Figura 40). Estos resultados fueron bastante similares a los encontrados por varios autores utilizando el modelo de hipertensin mediante la infusin de Ang II y la interrupcin de las vas de sealizacin de sta en ratones modificados genticamente251,252. Lu y col.253 , en otro estudio, destacan el hecho de que las enzimas antioxidantes juegan un papel muy importante en el desarrollo de la HV y demuestran que la deficiencia en la SOD exacerba en el miocardio el estrs oxidativo, la fibrosis, la disfuncin y la HV producida por un modelo de sobrecarga de presin. As mismo, se ha destacado que la reduccin de ERO y de ERN mediante la administracin de BH4 aumenta la actividad correcta de la eNOS, produciendo NO, previniendo la HTA, reduciendo los niveles de peroxinitritos y la HV asociada a la infusin de Ang II254. Las evidencias de que el estrs oxidativo tiene un papel muy importante en la patognesis de la hipertensin son cada vez mayores y la Ang II incrementa la produccin de ERO mediante la activacin de la NAD(P)H oxidasa241. Tanto el O2- como el H2O2 generados son potentes mitognicos que producen sus efectos por medio de la activacin de la p38MAP-cinasa255, ERK-5 y NF-B256. Wenzel y col.257 han demostrado, mediante el cultivo de cardiomiocitos de ratas, que la reduccin del NO derivado de la eNOS contribuye a la hipertrofia de los cardiomiocitos. El cultivo de stos con un inhibidor de la eNOS produjo un incremento en la velocidad de sntesis de protenas y un aumento en el tamao de las clulas. Este proceso fue sensible a la inhibicin de la p38MAP-cinasa y lo ms relevante, al menos para nosotros, a antioxidantes. La inhibicin de la eNOS, produjo un rpido incremento de las ERO, una subsecuente activacin de p38MAP-cinasa y la expresin de TGF- y TNF. Debido a la participacin del NO y a la inhibicin de la p38MAPcinasa por parte de los antioxidantes, como es de suponer estos fenmenos estn asociados al balance redox La capacidad antioxidante y scavenger de las diversas ERO que tiene la astaxantina explicara la reduccin en la HV

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encontrada tanto en el modelo con ratas SHR como en el modelo de infusin de Ang II. En el modelo con ratones Vav3-/- encontramos que la administracin crnica de astaxantina tambin redujo la HV. El grupo experimental Vav3-/- tuvo un valor de HV de 3,8 0,1, mientras que el grupo tratado con astaxantina fue de 3,5 0,1 (Figura 51). En estos ratones la ausencia de las protenas Vav 3, que son factores de intercambio de GDP/GTP dependientes de la fosforilacin, produce HTA mostrando PAS y PAD elevadas, taquicardia, HVI, un mayor tamao en los cardiomiocitos, fibrosis del ventrculo izquierdo y un engrosamiento de la aorta, sin embargo, estos defectos no se observaron en el ventrculo derecho y en arterias pulmonares182. Estos defectos cardiovasculares se asocian a un incremento de renina en plasma, a una mayor concentracin de ECA en el corazn y a un incremento, dependiente de la edad, de los niveles de Ang II que a su vez va acompaado de una regulacin al alza del ARNm de los receptores AT1 en aorta y corazn pero no en el circuito pulmonar. Sin embargo no se describen cambios en los receptores de endotelina, sugiriendo que la hipertensin es dependiente del SRA, lo cual corroboraron farmacolgicamente. Por otro lado, los niveles altos de catecolaminas (adrenalina, noradrenalina y dopamina) en los ratones Vav3-/- indicaban que la estimulacin del SRA, que produca los defectos cardiovasculares, era dependiente del SNS. Este aspecto se corrobor utilizando un inhibidor selectivo de los receptores -adrenrgicos. Lo que es evidente es que la participacin del SRA y de la Ang II en particular, tienen el mismo papel en lo que se refiere a la activacin de diversas tirosn-cinasas, citocinas, factores de crecimiento y ERO como los mencionados en los modelos anteriores, lo que explicara que el papel antioxidante de la astaxantina redujera tambin en este modelo los valores de HV. Por ltimo cabe mencionar que la importancia de la Ang II en el desarrollo de la hipertrofia y de la fibrosis cardiacas ha sido bien documentada mediante

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antagonistas de los receptores AT1 como losartan y candesartan, que han sido capaces de atenuar tanto la hipertrofia cardiaca como la fibrosis asociada258,259. De acuerdo a lo anterior, decidimos evaluar en el modelo de hipertensin mediante la infusin de Ang II, la concentracin de OH-Pro como una medida de la fibrosis asociada a la hipertrofia cardiaca propia de la hipertensin. Los resultados de concentracin de OH-Pro obtenidos en el corazn de los ratones de los tres grupos experimentales, nos muestran que en el grupo Ang II la concentracin de OH-Pro fue 64% mayor que la obtenida en el grupo Sham y en el grupo experimental Ang II Axt la concentracin de OH-Pro fue un 20% menor a la del grupo Ang II, como se muestra en la figura 41. As, podemos decir que la infusin de Ang II produce HV, asociada a un incremento en la cantidad de colgeno en el corazn y que la astaxantina la disminuye, pero que no es capaz de revertirla a los niveles presentados por el grupo Sham. En general, estos datos concuerdan con los valores de HV encontrados en cada grupo experimental, ya que los valores menores de HV corresponden tambin a los animales con valores de OH-Pro menores, aunque en el caso del grupo donde se administr la astaxantina la diferencia no haya sido significativa. Esto concuerda con el hecho de que en la hipertrofia cardiaca, adems del aumento en la sntesis de colgeno, tambin juega un papel muy importante el tamao y disposicin de los cardiomiocitos como lo han demostrado algunos autores260. Por otro lado, el hecho de encontrar un incremento de OH-Pro en el grupo Ang II estara bien relacionado con la capacidad que tiene sta de producir hipertrofia activando diversas vas como las tirosn-cinasas, la p38MAPcinasa y la produccin de ERO a travs de la NAD(P)H oxidasa, como ya hemos comentado241,255,256. Del mismo modo que la presencia de la astaxantina en el grupo Ang II Axt nos sugiere que su capacidad antioxidante y scavenger de O2-261 estara relacionada con una concentracin menor de

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OH-Pro como lo han demostrado Lijnen y col.262. Estas mismas vas han sido sealadas como las vas de actuacin de la Ang II en la hipertrofa y depsito de matriz extracelular en clulas mesangiales. Block y col.263, mencionan que este proceso es regulado por la subunidad Nox4 de la NAD(P)H oxidasa a travs de Src y la subsecuente fosforilacin de la protena-cinasa-1 dependiente 3-fosfoinositol (PDK-1 cinasa); mientras que la regulacin al alza de Nox4 es inducida por Ang II y que esta cascada de sealizacin es redox dependiente. Este hecho tambin concordara con la disminucin de la hipertrofa renal observada en el modelo de infusin de Ang II cuando se administr astaxantina. Los valores promedio que correspondieron a cada uno de los grupos experimentales Sham, Ang II y Ang II Axt en el mismo orden fueron los siguientes: 7,7 0,2 mg/g; 7,7 0,2 mg/g y 6,6 0,3 mg/g. As, el carcter antioxidante de la astaxantina tambin se vio reflejado al disminuir la HR en este modelo de hipertensin. Estos datos adems concuerdan parcialmente con investigaciones en las que se ha administrado vitamina C durante nueve semanas en un modelo con ratas SHR. Se ha encontrado una reduccin, aunque sta no fue significativa, en HR sin embargo, los autores comentan que en la inspeccin al microscopio de los riones de las ratas SHR tratadas con vitamina C se encontr que tenan una menor hiperplasia en las CMLV y un menor valor de Wm207. Mientras que en otro estudio utilizando quercetina, tambin en ratas SHR, aunque se han logrados resultados positivos en la reduccin de la PAS y de la disfuncin endotelial, no se han modificado positivamente los valores de HR247. En el modelo con ratones Vav3-/- donde se evalu el peso de las GSR y el ndice de HGSR, podemos decir que la administracin de astaxantina en la dosis de 100 mg/kg/da, se asoci a una reduccin estadsticamente significativa en el peso de las GSR y en el ndice de HGSR (Figura 52). Como se mencion anteriormente en este modelo de hipertensin, la disfuncin cardiovascular se asocia a una expresin elevada de la renina, de ECA, de los niveles de Ang II y de los receptores AT1. Adems este mismo modelo tiene una expresin al alza de catecolaminas que a su vez se asocia a una sobre-

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estimulacin del SNS. Si consideramos que las vas de sealizacin de la Ang II son redox dependientes como lo hemos expresado en las lneas anteriores241,255,256,263; creemos que la reduccin del peso de las GSR y el ndice de HGSR puede asociarse al carcter antioxidante y de scavenger de O2- de la astaxantina261. Los cambios hemodinmicos y humorales presentes en la hipertensin, no slo producen alteraciones en el msculo cardiaco sino que se asocian con el remodelado vascular264,265, esta vinculacin ha sido importante en el desarrollo de frmacos antihipertensivos que adems puedan atenuar los cambios estructurales266,267. Como se ha mencionado, ahora tambin se sabe que las ERO participan en los mecanismos de sealizacin involucrados en el remodelado vascular por lo que la investigacin del papel de los antioxidantes en estos procesos ha tomado cada vez ms importancia. En este trabajo encontramos en ratas SHR que, tanto en la aorta como en el lecho vascular renal, la astaxantina produce una reduccin del Wm y de la CSAm. En esta reduccin, la dosis ms eficiente fue la de 75 mg/kg/da. En el caso del lumen, ste se increment tambin con astaxantina, pero este incremento fue significativo solamente para la dosis ms baja. Por estudios previos, se sabe que en modelos de hipertensin por infusin de Ang II y en ratas SHR, se produce un remodelado hipertrfico, ya que en el desarrollo de la hipertensin se incrementan los valores de la relacin Wm/L y de CSAm268,269,270. Con los resultados obtenidos, podemos decir que la astaxantina en las dos dosis utilizadas, es capaz de revertir la hipertrofia asociada a la hipertensin tanto en la aorta como en el lecho vascular renal. Hussein y col.38 compararon el remodelado de arterias en ratas SHR y ratas SHR tratadas crnicamente con astaxantina en una dosis de 50 mg/kg/da y encontraron tanto en ramas de arterias coronarias como en aortas, que las ratas tratadas con astaxantina tenan valores menores de Wm y valores mayores de L con respecto a las ratas control. Comentan que en las ratas SHR tratadas con astaxantina, las arterias coronarias presentaron una reduccin en Wm y que

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esta disminucin se vio reflejada en la relacin Wm/L, en el caso de la aorta este cambio tuvo el mismo comportamiento junto con una reduccin en el nmero de capas de elastina. En un estudio, Vasdev y col.207 encontraron que en el lecho vascular renal de ratas SHR los valores de Wm se incrementaban con una reduccin en L respecto de las ratas WKY. La administracin durante nueve semanas de vitamina C en ratas SHR, produjo una disminucin de Wm, aunque el cambio en L fue mnimo. En comparacin con el efecto de la vitamina C, en nuestro estudio, la astaxantina s produce cambios sustanciales en Wm y en L. En otro trabajo125 con vitamina C y E administradas a ratas SHR-SP durante un periodo de 6 semanas, se observ que estas vitaminas eran capaces de reducir la relacin Wm/L, consecuencia de una disminucin en los valores de Wm pero sin cambios en CSAm. La utilizacin de un modelo de hipertensin por infusin de Ang II en ratones machos BALB/c240 dio como resultado un incremento de Wm que no se produjo cuando adems se administraba apocinina. En ningn caso se modific el valor de L. Adems cabe destacar que en este trabajo tambin se asocia la produccin de ERO con el remodelado vascular. Al comparar los resultados obtenidos con astaxantina con un frmaco como el nebivolol en ratas SHR290, encontramos que en arterias intrarrenales de resistencia la reduccin que se logr en el valor de Wm con astaxantina (75 mg/kg/da durante dos meses) con respecto a su grupo control SHR fue del 20%, mientras que con nebivolol (8 mg/kg/da durante seis meses) esta reduccin fue del 25%. De la misma manera las reducciones correspondientes para la CSAm fueron respectivamente del 17% y 19%, mientras que el incremento en el valor de L fue de un 25% en ambos casos. Al comparar los cambios producidos por astaxantina y nebivolol en el remodelado de aorta, se obtuvo una reduccin en el valor de Wm de 14% con astaxantina y de 25% para el nebivolol, mientras que se redujo el CSAm un 10% y un 25% respectivamente; en tanto que en el valor medio de L los incrementos fueron

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de 8% y 5% respectivamente. Considerando las diferencias de concentracin y la naturaleza de la astaxantina como antioxidante, los beneficios producidos por sta son considerables. La progresin en la hipertensin incluye dos tipos diferentes de remodelado vascular: eutrfico e hipertrfico271. Estos dos fenmenos se pueden presentar en un mismo individuo dependiendo de la localizacin, del tipo de lecho vascular y del desarrollo mismo de la hipertensin. El remodelado vascular se ha definido como la modificacin estructural de los vasos que conlleva a la alteracin del grosor de la pared y del lumen. Estas alteraciones pueden ser inducidas por una adaptacin pasiva a cambios hemodinmicos crnicos y/o a travs de cambios neurohumorales incluyendo la Ang II y las ERO. El remodelado hipertrfico est caracterizado por un incremento en la CSAm predominantemente en arterias de conductancia y pequeas arterias en hipertensin secundaria, por ejemplo, pacientes con hipertensin renovascular y ratas hipertensas mediante la infusin de Ang II. En este caso se produce un incremento del tamao de las clulas y un aumento de la acumulacin de matriz extracelular como colgeno y fibronectina siguiendo el mismo patrn de los modelos animales272,273. As, para el remodelado hipertrfico es necesaria la hipertrofia de las CMLV y la sntesis de matriz extracelular, tanto el estrs mecnico de los vasos como los mediadores humorales como la Ang II contribuyen al remodelado hipertrfico274,275,276. Aunque se sabe por ensayos en cultivos de CMLV, que la hipertrofia inducida por Ang II est mediada por H2O2 generado a su vez de manera dependiente de la NAD(P)H oxidasa198,277; la contribucin de las ERO a este proceso est an por dilucidar278,279. El remodelado eutrfico est caracterizado por la reduccin en el L, engrosamiento Wm, incremento de Wm/L y usualmente poco cambio en el CSAm, en este caso el cambio en el tamao de CMLV es prcticamente nulo280, mientras que el crecimiento de la capa media hacia el lumen corresponde a una reorganizacin de clulas y de material extracelular

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existente en la pared vascular y apoptosis en la periferia del vaso281. Este proceso es comn en arterias pequeas de resistencia de ratas SHR282. A pesar de ello, las causas determinantes de cada tipo de remodelado no han sido claramente dilucidadas. Lo que las investigaciones han demostrado es que el remodelado vascular se puede mejorar por medio de tratamientos con tempol, vitaminas antioxidantes125, antagonistas de los receptores de Ang II e inhibidores de la NAD(P)H oxidasa, tanto en modelos animales como en estudios clnicos283,284. En los tres modelos de HTA estudiamos la produccin basal y estimulada de O2- en anillos de aorta y el comportamiento fue el mismo. La produccin basal no se modific significativamente entre los grupos control y los tratados con astaxantina. Sin embargo, cuando se estimul la produccin de O2- con NADPH, adems del incremento esperado en la magnitud de la respuesta, las diferencias entre los grupos experimentales se hicieron evidentes. En los tres modelos la produccin estimulada fue menor en los grupos experimentales donde se administr astaxantina (Figuras 28, 42 y 53). Cardounel y col.261 han evaluado la capacidad de la astaxantina como scavenger de radicales libres en un sistema in vitro con neutrfilos humanos donde se activ el sistema de generacin de O2-, en su trabajo encontramos dos hechos principales: que la astaxantina en las concentraciones que utilizaron (alrededor 100 M) puede eliminar de manera prcticamente completa la seal producida por el O2- y que no existe diferencia en la eficiencia como scavengers de los diferentes estereoismeros de la astaxantina, por lo que se intuye que la cadena hidrocarbonada con sus dobles enlaces conjugados es la responsable de este efecto. Estos datos estaran en concordancia con otros autores que han trabajado con antioxidantes como la quercetina y que encuentran diferencias significativas en la produccin estimulada de O2-, pero no as en la produccin basal247. Esto se corrobor adems mediante la utilizacin de una sonda fluorognica como el DHE. Mediante esta tcnica pudimos comprobar in situ que la

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produccin de O2- en aortas del grupo SHR-Axt 75 fue significativamente menor a la produccin de los anillos de aortas del grupo SHR-Control (Figura 29). Se sabe que la produccin observada corresponde a O2- debido a que el DHE es una sonda especfica del O2- y no de otras especies reactivas que son capaces de oxidar otro tipo de sondas fluorognicas285,286. En condiciones basales la infusin de Ang II no modific la produccin de O2- pero cuando sta se estimul con NADPH, el grupo Ang II fue el que mostr los valores ms altos. Hay que recordar que la Ang II estimula la produccin de O2- por medio del aumento en la expresin de Nox4, p22phox y de p47phox como lo han demostrado diversos estudios241,287,288. Los grupos Sham y Ang II Axt mostraron producciones significativamente menores de O2-, por lo que la administracin de astaxantina redujo la produccin de O2o la actividad NAD(P)H oxidasa a niveles similares a los presentados por el grupo Sham (Figura 42) En el modelo con ratones Vav3-/-, sucedi lo mismo en condiciones basales, a pesar de que el grupo donde se administr astaxantina tuvo una tendencia a disminuir, esta diferencia no fue estadsticamente significativa. Sin embargo, al estimular la actividad NAD(P)H oxidasa, la administracin de astaxantina s que reduce significativamente la produccin de O2- hasta en un 32% con respecto al grupo Vav3-/- (Figura 53). Se sabe que el O2- derivado de la NAD(P)H oxidasa tiene un papel muy importante en la hipertensin producida por la Ang II ya sea por una activacin elevada del sistema SRA o por la infusin directa de sta241,289. Se han realizado diversos estudios con frmacos donde se relaciona una mejor funcin vascular con reduccin de la actividad de la NAD(P)H oxidasa y por lo tanto de la produccin de O2-137,138. Sin embargo, los estudios utilizando vitaminas antioxidantes son ms escasos. Viridis y col.240, han relacionado la disminucin de la PA, una mejor relajacin endotelio dependiente y una mejor estructura vascular con la inhibicin de la NAD(P)H oxidasa por medio de apocinina suministrada en el alimento. Otros autores han demostrado que

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la administracin de vitaminas C y E disminuye la produccin vascular de O2- e incrementa el estado antioxidante en los animales tratados. Desde su perspectiva, estos resultados confirman las propiedades antioxidantes de las vitaminas utilizadas e indican que el tratamiento disminuye la generacin de radicales libres e incrementa la defensa antioxidante en su modelo de estudio. Estos hechos pueden relacionarse con la capacidad que tienen estas vitaminas como scavengers de radicales libres. Sin embargo, es posible que estas mismas vitaminas puedan tambin influenciar el estado redox a nivel vascular, modulando la actividad de los sistemas enzimticos que generan las ERO. En otros estudios relacionan los beneficios que se producen en la funcin endotelial de ratas SHR mediante la administracin crnica de quercetina con una regulacin a la baja de la expresin de uno de los componentes de la NAD(P)H oxidasa y con un incremento en la actividad de la eNOS247. As mismo, otros investigadores han encontrado una regulacin a la baja de la expresin de la NAD(P)H oxidasa en presencia de polifenoles, lo que se relacionara con una modulacin de la produccin de O2- por parte de los antioxidantes290. Nosotros hemos encontrado por medio de los modelos de HTA utilizados, que el tratamiento con astaxantina disminuye la actividad estimulada de la NAD(P)H oxidasa. Debido a que la NAD(P)H oxidasa es la principal fuente de O2- a nivel vascular283, la disminucin de la actividad de esta enzima encontrada en anillos de aorta, asociada a la administracin de astaxantina nos sugerira una menor produccin no slo de O2- sino de otras ERO derivadas de ste. Por otro lado, la mayor actividad de la SOD tambin asociada a la administracin de astaxantina en el modelo 2 de HTA conllevara a una mayor dismutacin del O2- y a la disminucin de su concentracin. Con nuestros datos, no podemos discriminar cul de estos factores contribuye ms a la mejora en el estado redox sugerido por la disminucin en la concentracin de MDA tanto en plasma como en hgado como se mostrar ms adelante (Figuras 43).

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Los mecanismos por los cuales las vitaminas antioxidantes regulan la NAD(P)H oxidasa, la SOD u otras enzimas antioxidantes, estn por definirse, aunque se estima que estas vitaminas tienen un papel importante en la regulacin a nivel transcripcional o post-translacional de estos sistemas enzimticos291. En este sentido se ha mencionado que vitaminas como la E, dado su carcter hidrofbico, al ubicarse en las membranas celulares pueden interferir en el acoplamiento de sistemas enzimticos como la NAD(P)H oxidasa238,291,292,293. Los mecanismos por los cuales los antioxidantes tienen influencia en la funcin vascular pueden estar relacionados con su papel de scavengers del O2-, ya que ste es capaz de reaccionar con el NO producido en el endotelio y disminuir su biodisponibilidad. Si la astaxantina es capaz de eliminar el O2- y esto se relaciona con un aumento de la biodisponibilidad del NO, tal como se ha demostrado en el lecho vascular renal del modelo con ratas SHR, la astaxantina tambin puede influir en la actividad de la eNOS aumentando los niveles de BH4 los cuales a su vez incrementan la sntesis de NO202,204,221. Aunque en nuestro trabajo no determinamos los nitritos y los nitratos, hay estudios que demuestran que las vitaminas antioxidantes incrementan la actividad eNOS y la sntesis de NO en arterias de SHR203. En los ltimos aos ha cobrado ms fuerza la relacin que existe entre la hipertensin y la prdida del balance entre la produccin de ERO y los antioxidantes94. En este sentido los sistemas antioxidantes tanto endgenos como exgenos juegan un papel muy importante en la prevencin y limitacin de los daos provocados por una produccin excesiva de ERO. No slo se relaciona la hipertensin con las ERO sino que stas tambin se han relacionado con el infarto de miocardio y con otras cardiopatas294. Se ha propuesto que la hipertensin estimula la produccin de diferentes tipos de ERO, que a su vez son mediadores del dao vascular y de la lipoperoxidacin de las membranas celulares, lo que est implicado en la disfuncin de las clulas endoteliales. Est demostrado que un incremento en

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las ERO produce prdida de dilatacin en diversos tipos de vasos, por ejemplo en pacientes con hipertensin severa se ha observado que existe una prdida de vasodilatacin en arterias de resistencia295. Como se ha mencionado en los prrafos anteriores, el SRA es parte fundamental en el desarrollo y establecimiento de la hipertensin, por otro lado, tambin se ha mencionado la importancia de la Ang II como inductora de la generacin de ERO296,297. Por estas razones nos pareci importante determinar las relaciones entre el desarrollo de la hipertensin mediante la infusin de Ang II y el estado de algunos parmetros relacionados con el estrs oxidativo como la concentracin de MDA en el plasma y en el hgado y las actividades enzimticas en hgado de SOD, CAT y GPx. En este modelo de hipertensin, encontramos que la infusin de Ang II produca un incremento del estrs oxidativo en los animales, ya que aument la concentracin de MDA en el plasma del grupo experimental Sham de 4,8 1,0 a 5,5 0,6 nmol/ml en el grupo Ang II. Y aunque en el hgado este incremento fue mnimo, concuerda con los resultados de otros autores que observan un incremento en los valores de MDA cuya magnitud depende del modelo de hipertensin del que se trate298,299. En este sentido la administracin de astaxantina tuvo un efecto positivo, ya que disminuy la concentracin de MDA en plasma un 42% y un 20% en el hgado. En el caso de la SOD se ha relacionado la hipertensin con una disminucin en su actividad. Nosotros encontramos que el aumento de las PAS asociado a la infusin de Ang II produjo una reduccin de la actividad de la SOD de 97,6 19,3% en el grupo Sham a un 51,0 17,8% en el grupo Ang II. Nuestros datos estaran en concordancia con datos publicados en modelos animales y en estudios clnicos298,300. Adems encontramos que la astaxantina revirti el efecto negativo de la Ang II en la actividad de la SOD, ya que en el grupo experimental donde se administr la astaxantina la actividad SOD fue, inclusive, ligeramente superior a la del grupo Sham. Esta asociacin entre la disminucin de la actividad de la SOD con la hipertensin, y su posterior

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recuperacin mediante el tratamiento con antioxidantes, se ha asociado adems a una mejora de la funcin endotelial de la PAS y del estado oxidativo total en modelos animales125,203. En lo que corresponde a la actividad de la catalasa, sta prcticamente no se modific por la infusin de Ang II, mientras que la administracin de astaxantina la redujo significativamente. La literatura existente para esta enzima es en algunas ocasiones contradictoria ya que existen investigaciones que mencionan incrementos de la actividad de la catalasa en los animales hipertensos en relacin a los normotensos298,301, en tanto que otras dan valores superiores de actividad de la catalasa para las ratas SHR302. La respuesta en la actividad de la GPx fue similar a la anterior, ya que la infusin de Ang II no produjo un cambio significativo en sta. Sin embargo en este caso, la astaxantina s incremento significativamente la actividad de la GPx, este incremento fue del 44% con respecto al grupo experimental Ang II. Nuestros resultados concuerdan con la literatura en este sentido ya que la actividad de la GPx normalmente es menor en los grupos experimentales hipertensos, producindose un incremento en tratamientos con antioxidantes, segn describen el grupo de Duarte303,304. Como hemos mencionado, la actividad de la catalasa fue la nica que disminuy con la administracin de la astaxantina, aspecto que nos llam la atencin sobre todo pensando en que encontramos un incremento en la actividad de la SOD, y que sta al dismutar el O2 - produce H2O2 que es el sustrato de la catalasa. Sin embargo, creemos que el incremento de la actividad de la GPx est relacionado con un efecto compensatorio, pues hay que recordar que la GPx es tambin capaz de utilizar el H2O2 como sustrato para producir H2O y O2. Con los datos obtenidos, podemos decir que la infusin de Ang II produce un incremento del estado de oxidacin, en tanto que la administracin de astaxantina disminuye el estrs oxidativo producido por la Ang II e inclusive en algunos parmetros llega a revertirlo como en el caso de la actividad de la SOD.

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Conclusiones

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La administracin de astaxantina en la dieta en las distintas dosis ensayadas fue capaz de disminuir la PA en los tres modelos de HTA utilizados: ratas genticamene hipertensas, ratones con hipertensin inducida por angiotensina II y ratones deficientes en la protena Vav3. La hipertrofia cardiaca que caracteriza a estos modelos de hipertensin, disminuy de manera estadsticamente significativa con la administracin de astaxantina. La reduccin de la fibrosis podra contribuir a este efecto. La astaxantina mejor la funcionalidad vascular en arterias de resistencia pero no en arterias de conductancia. El tratamiento con astaxantina redujo, de manera significativa, la formacin de O2- estimulada con NADPH en anillos de aorta procedentes de los tres modelos de hipertensin. En las condiciones del estudio, la astaxantina redujo el remodelado en vasos de resistencia y de conductancia de ratas SHR. En la hipertensin inducida por angiotensina, la astaxantina redujo el estrs oxidativo y la fibrosis asociados a este modelo.

Bibliografa 225

Bibliografa

226 Bibliografa

Bibliografa 227

Rodriguez-Amaya D. Carotenoids and food preparation: The retention of provitamin A carotenoids in prepared, processed and stored foods. pp 3-13. OMNI Proyect. Office of Health and Nutrition. U.S. Agency for International Development. Washington DC, 1997.
2

Krinsky N- Actions of carotenoids in biological systems. Annu Rev Nutr. 1993; 13:561-587. Kull D and Phander H. Appendix: List of new carotenoids. pp 295-317. In Britton G, Liaaen-Jensen S, and Pfander, H (Eds) Carotenoids: Isolation and Analysis. Volumen 1A. 1995. Birkhuser. Basel.

IUPAC Commission on the Nomenclature of Organic Chemistry and IUPACIUB. Commission on Biochemical Nomenclature. Nomenclature of carotenoides (Rules approved 1974). Pure Appl Chem. 1975. 41:407-431. Weesie R, Askin D, Hansen F, de Groot H, Lugtenburg J and Brirtton G. Protein-chromophore interactions in crustacyanin, the mayor blue carotenoprotein from the carapace of the lobster Homarus gammarus. A study by 13C magic angle spinning NMR. FEBS Lett. 1995; 362:34-38. Halliwell B, Gutteridge J. Free radicals in biology and medicine. 2nd Edition. Clarendon. 1989. Oxford.

Coral G, Huberman A, De la Lanza G, Monroy-Ruiz J. Muscle pigmentation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed on oil-extracted pigment from langostilla (Pleuroncodes planipes) compared with two commercial sources of astaxanthin. J Aquatic Food Prod Tech. 1998; 7:31-45. Civera R, Goytorta E, Rocha S, Nolasco H, Vega-Villasante F, Balart E, Amador E, Ponce G, Colado G, Lucero J, Rodriguez C, Solano J, Flores-Tom A, Monroy-Ruiz J, Coral G. Uso de la langostilla roja Pleuroncodes planipes en la nutricin de organismos acuticos. pp 349-365 En: Civera-Cerecedo R, PrezEstrada C, Ricque-Marie D, Cruz-Surez E. (Eds.) Avances en Nutricin Acucola IV. 2000. Mxico.

228 Bibliografa

Tero J. Antioxidant activity of -carotene-related carotenoids in solution. Lipids. 1989; 24:659-661. Coral-Hinostroza G, Ytrestbyl T, Ruyter B, Bjerkeng B. Plasma appearance of unesterified astaxanthin geometrical E/Z and optical R/S isomers in men given single doses of a mixture of optical 3 and 3R/S isomers of astaxanthin fatty acyl diesters. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2004; 139:99-110. Mercke J, Lignell A, Pettersson A, Hoglund P. Oral bioavailability of the antioxidant astaxanthin in humans is enhanced by incorporation of lipid based formulations. Eur J Pharm Sci. 2003; 19:299-304.

10

11

12

OConnor I, OBrien N. Modulation of UVA light-induced oxidative stress by beta-carotene, lutein and astaxanthin in cultured fibroblasts. J Dermatol Sci. 1998;16:226-230. Guerin M, Huntley M, Olaizola M. Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol. 2003; 21:210-216.

13

14

Landrum J, Bone R, Moore L, Gmez C. Analysis of zeaxanthin distribution within individual human retinas. Methods Enzymol. 1999; 299:457-467. Bennedsen M, Wang X, Willen R, Wadstrom T, Andersen L. Treatment of H. pylori infected mice with antioxidant astaxanthin reduces gastric inflammation, bacterial load and modulates cytokine release by splenocytes. Immunol Lett. 1999; 70:185-189. Tanaka T, Morishita Y, Suzui M, Kojima T, Okumura A, Mori H. Chemoprevention of mouse urinary bladder carcinogenesis by the naturally occurring carotenoid astaxanthin. Carcinogenesis. 1994; 15:15-19.

15

16

17

Tanaka T, Makita H, Ohnishi M, Mori H, Satoh K, Hara A. Chemoprevention of rat oral carcinogenesis by naturally occurring xanthophylls, astaxanthin and canthaxanthin. Cancer Res. 1995; 55:4059-4064.

Tanaka T, Kawamori T, Ohnishi M, Makita H, Mori H, Satoh K, Hara A Suppression of azomethane-induced rat colon carcinogenesis by dietary administration of naturally occurring xanthophylls astaxanthin and canthaxanthin during the postinitiation phase. Carcinogenesis. 1995; 16:2957-2963.

18

Bibliografa 229

19

Chew B, Park J, Wong M, Wong T. A comparison of the anticancer activities of dietary beta-carotene, canthaxanthin and astaxanthin in mice in vivo. Anticancer Res. 1999; 19:1849-1854. Anderson M. Method of inhibiting 5- reductase with astaxanthin to prevent and treat begnign prostate hyperplasia (BPH) and prostate cancer in human males. 2001. US Patent #6277417. Bertram J. Carotenoids and gene regulation. Nutr Rev. 1999; 57:182-191.

20

21 22

Kurashige M, Okimasu E, Inoue M, Utsumi K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin. Physiol Chem Phys Med NMR. 1990; 22:27-38. Gradelet S, Le Bon A, Berges R, Suschetet M, Astorg P. Dietary carotenoids inhibit aflatoxin B1-induced liver preneoplastic foci and DNA damage in the rat: role of the modulation of aflatoxin B1 metabolism. Carcinogenesis. 1998; 19:403411. Jyonouchi H, Zhang L, Tomita Y. Studies of immunomodulating actions of carotenoids. II. Astaxanthin enhances in vitro antibody production to T-dependent antigens without facilitating polyclonal -cell activation. Nutr Cancer. 1993; 19:269-280.

23

24

25

Jyonouchi H, Zhang L, Gross M, Tomita Y. Immunomodulating actions of carotenoids: enhancement of in vivo and in vitro antibody production to Tdependent antigens. Nutr Cancer. 1994; 21:47-58. Okai Y, Higashi-Okai K. Possible immunomodulating activities of carotenoids in vitro cell culture experiments. Int J Immunopharmacol. 1996; 18:753-758. Jyonouchi H, Sun S, Tomita Y, Gross M. Astaxanthin, a carotenoid without vitamin A activity, augments antibody responses in cultures including T-helper cell clones and suboptimal doses of antigen. J Nutr. 1995; 124:2483-2492. Grant W. Dietary links to Alzheimers disease. J Alzheimers Dis. 1997; 2:4255.

26

27

28

230 Bibliografa

29

Borlongan C, Kanning K, Poulos S, Freeman T, Cahill D, Sanberg P. Free radical damage and oxidative stress in Huntingtons disease. Folia Med. 1996; 83:335-341. de Rijk M, Breteler M, den Breeijen J, Launer L, Grobbee D, van der Meche F, Hofman A. Dietary antioxidants and Parkinson disease. The Rotterdam Study Arch Neurol. 1997; 54:762-765. Ferrante R, Browne S, Shinobu L, Bowling A, Baik M, MacGarvey U, Kowall N, Brown R, Beal M. Evidence of increased oxidative damage in both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 1997; 69:2064-2074. Touyz R, Schiffrin E. Reactive oxygen species in vascular biology: implications in hypertension. Histochem Cell Biol. 2004; 122:339-352. Pratic D. Antioxidants and endothelium protection. Atherosclerosis. 2005; 181:215-224. Gross G, Lockwood S. Cardioprotection and myocardial salvage by disodium diuccinate astaxanthin derivative (CardaxTM). Life Sci. 2004; 75:215-224.

30

31

32

33

34

Gross G, Hazen S, Lockwood S. Seven day oral supplementation with cardaxTM (disodium disuccinate astaxanthin) provides significant cardioprotection and reduces oxidative stress in rats. Mol Cell Biochem. 2006; 283:23-30. Hussein G, Nakamura M, Zhao Q, Iguchi T, Goto H, Sankawa U, Watanabe H. Antihypertensive and neuroprotective effects of astaxanthin in experimental animals. Biol Pharm Bull. 2005; 28:967-971.
37 36

35

Hussein G, Goto H, Oda S, Iguchi T, Sankawa U, Matsumoto K, Watanabe H. Antihypertensive potential and mechanism of action of astaxanthin: II. Vascular reactivity and hemorheology in spontaneously hypertensive rats effects of astaxanthin in experimental animals. Biol Pharm Bull. 2005; 28:47-52. Hussein G, Goto H, Oda S, Iguchi T, Sankawa U, Matsumoto K, Watanabe H. Antihypertensive potential and mechanism of action of astaxanthin: III. Antioxidant and histopathological effects in spontaneously hipertensive rats. Biol Pharm Bull. 2006; 29:684-688.

38

Bibliografa 231

39

Hussein G, Sankawa U, Goto H, Matsumoto K, Watanabe H. Astaxanthin, a carotenoid with potential in human health and nutrition. J Nat Prod. 2006; 69:443449. Williams B. Evolution of hypertensive disease: a revolution in guidelines. Lancet. 2006; 368:6-8. Sociedad Espaola de Hipertensin-Liga Espaola para la Lucha contra la Hipertensin Arterial. Gua espaola de hipertensin arterial 2005. Hipertensin. 2005; 22 :3-8.

40

41

42

European Society of Hypertension-European Society of Cardiology Guidelines Committee. European Society of Hypertension - European Society of Cardiology guidelines for the management of arterial hypertension. J Hypertens. 2003; 21:1011-1053.

43

Mancia G, De Backer G, Dominiczak A, Cifkova R, Fagard R, Germano G, Grassi G, Heagerty A, Kjeldsen S, Laurent S, Narkiewicz K, Ruilope L, Rynkiewicz A, Schmieder R, Boudier S, Zanchetti A. 2007 Guidelines for the Management of Arterial Hypertension: The Task Force for the Management of Arterial Hypertension of the European Society of Hypertension (ESH) and of the European Society of Cardiology (ESC). J Hypertens. 2007; 25:1105-1111. Chobanian V, Bakris L, Black R, Cushman C, Green A, Izzo L, Jones D, Materson B, Oparil S, Wright J, Roccela E, et al. Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. National Heart, Lung, and Blood Institute; National High Blood Pressure Education Program Coordinating Committee. Seventh report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Hypertension. 2003; 42(6):1206-1252.

44

45

Kannel B. Risk stratification in hypertension: new insights from the Framingham Study. Am J Hypertens. 2000; 13 Suppl 1:S3-S10. Lahera V, Cachofeiro Ramos V. La alteracin renal no es el principal mecanismo patognico en el desarrollo de la hipertensin arterial. Hipertensin 2004; 21:251-255.

46

232 Bibliografa

47

Dustan H. Pathophysiology of systemic hypertension. pp 1140-1150. In: Hurst JW (ed). The Heart, arteries and veins. McGraw Hill. 1990. New York. Navar L. The kidney in blood pressure regulation and development of hypertension. Med Clin North Am. 1997; 81:1165-1197.

48

49

Seravalle G, Cattaneo B, Giannattasio C, Perondi R, Saino A, Grassi G, Mancia G. RAA system and cardiovascular control in normal subjects, hypertensives and patients with congestive heart failure. J Hum Hypertens. 1993; 7:S13-S18. Esther R, Marino M, Howard E. The critical role of tissue angiotensin converting enzmes as revealed by gene targeting in mice. J Clin Invest.1997; 99:2375-2385. Naftilan A. Role of the tissue renin-angiotensin system in vascular remodeling and smooth muscle cell growth. Curr Opin Nephrol Hypertens. 1994; 3:218-227.

50

51

52

Saris J, van Dijk M, Kroon I, Schalekamp M, Danser A. Functional importance of angiotensin-converting enzyme-dependent in situ angiotensin II generation in the human forearm. Hypertension. 2000; 35:764-768. Urata H, Nishimura H, Ganten D Chymase-dependent angiotensin II forming systems in humans. Am J Hypertens. 1996; 9:277-284. Kramkowski K, Mogielnicki A, Buczko W. The physiological significance of the alternative pathways of angitension II production. J Physiol Pharmacol. 2006; 57:529-539. Schwartz SM, Liaw L. Growth control and morphogenesis in the development and pathology of arteries. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1993; 21:S31-49.

53

54

55

Taubman MB, Berk BC, Izumo S, Tsuda T, Alexander RW, Nadal-Ginard B. Angiotensin II induces c-fos mRNA in aortic smooth muscle. Role of Ca2+ mobilization and protein kinase C activation. J. Biol. Chem. 1989; 264:526-530.
57

56

Wagenaar L, Voors A, Buikema H, van Gilst W. Angiotensin receptors in the cardiovascular system. Can J Cardiol. 2002; 18:1331-9.

Bibliografa 233

58

Nicholls M, Robertson J, Inagami T. The renin- Angiotensin system in the twenty-first century. Blood Press. 2001; 10:327-343.

Schiffrin E. Vascular and cardiac benefits of angiotensin receptor blockers. Am J Med. 2002; 113:409-418.
60

59

Touyz R, Schiffrin E. Signal transduction mechanisms mediating the physiological and pathophysiological actions of angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Pharmacol Rev. 2000; 52:639-672. Siragy H. The role of the AT2 receptor in hypertension. Am J Hypertens. 2000; 13:62S-67S.

61

62

Ferrario C. Role of angiotensin II in cardiovascular disease. Therapeutic implications of more than a century of research. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2006; 7:3-14. Joles J, Koomans H. Causes and Consequences of Increased Sympathetic Activity in Renal Disease. Hypertension. 2004; 43:699-706. Intengan D, Deng Y, Li J, Schiffrin E. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension.1999; 33:569-574. Jia Z, Xiao L. Novel roles of intracrine angiotensin II and signaling mechanisms in kidney cells JRAAS. 2007; 8:23-33. Takizawa T, Gu M, Chobanian V, Brecher P. Effect of nitric oxide on DNA replication induced by angiotensin II in rat cardiac fibroblasts. Hypertension. 1997; 30:1035-1040. Lscher TF, Barton M : Endothelins and endotelin receptor antagonists. Therapeutic considerations for a novel class of cardiovascular drugs. Circulation 2000; 102:2434-2440. Teruhiko I, Michihiro Y, Shota N, Masafumi N, Yukio S, Eisaku H, Yuji M, Megumi Y, Masaki H, Yoshihiko S. Kazuwa N, Hiroki K, Hirofumi Y, Hisao O. Inhibitory effect of natriuretic peptides on aldosterone synthase. Gene expression in cultured neonatal rat cardiocytes. Circulation. 2003; 107:807-810.

63

64

65

66

67

68

234 Bibliografa

69

Gimbrone M. Vascular endothelium: an integrator of pathophysiologic stimuli in atherogenesis. Am J Cardiol. 1995; 75:67B-70B. Vogel A. Heads and hearts. The endotelial connection. Circulation 2003; 107:2766-68. Tran K, Ohashi K, Watanabe H. Calcium signaling in endotelial cells. Cardiovasc Res. 2000; 48:13-22. Forman B, Puett W, Virmani R. Endothelial and myocardial injury during ischemia and reperfusion: pathogenesis and therapeutic implications. J Am Coll Cardiol. 1989; 13:450-459. Flemming I, Busse R. Endothelium-derived epoxyeicosatrienoic acids and vascular function. Hypertension. 2006; 47:629-633. Furchgott F, Zawadzki V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 1980; 288:373-376. Palmer R, Ferrige A, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 1987; 327(6122):524-526.

70

71

72

73

74

75

Bruckdorfer R. The basics abaout nitric oxide. Molecular aspects of medicine. 2005; 26:3-31. McMicking J, Xie W. Nitric oxide and macrophage function. Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:323-350.
78 77

76

Xu W, Charles G, Moncada S. Mapping of genes encoding human inducible and endotelial nitric oxide synthase in the pericentric region of chromosome 17 and to chromosome 7, respectively. Genomics. 1994; 21:341-348 Beckman S, Koppenol H. Nitric oxide, superoxide, and peroxyinitrite: the good, the bad and ugly. Am. J. Physiol. 1996; 271:C1424-C1437.

79

Jourdheuil D, Jourdheuil L. Reaction of superoxide and nitric oxide with peroxinitrite. J. Biol. Chem. 2001; 276:28799-28805.

80

Bibliografa 235

81

Lymar V, Hurst K. Role of compartmentation in promoting toxicity of leukocyte-generated strong oxidants. J. Am. Chem. Soc. 1995; 117:8867-8868.

Goldstein S, Czapski G. Tyrosin nitration by simultaneous generation of NO and O2 - under physiological conditions. How the radicals do the job. J Biol Chem. 2000; 275:3031-3036.
83

82

Wink A, Mitchel B. The chemical biology of nitric oxide: insights into regulatory, cytotoxic a cytoprotective mechanisms of nitic oxide. Free Radical Biol Med. 1998; 25: 434-456. Vanhoutte P, Boulanger C, Mombouli J. Endothelium-derived relaxing factors and converting enzyme inhibition. Am J Cardiol. 1995; 76:3E-12E. Li P, Zou A, Campbell W. Regulation of potassium channels in coronary arterial smooth muscle by endothelial-derived vasodilators. Hypertension. 1997; 29:262-267. Vanhoutte P. Endothelial dysfunction in hypertension. J Hypertension. 1996; 14:S83-S93 Schiffrin E, Touyz R. Vascular biology of endothelin. J Cardiovasc Pharmacol 1998; 32:S2-S13. Neylon B. Vascular biology of endothelin signal transduction. Clin Exp Pharmacol physiol. 1999; 26:149-153.

84

85

86

87

88

89

Collins T, Cybulsky M. NF-B: pivotal mediator or innocent bystander in atherogenesis? J Clin Invest. 2001; 107:255-264.

90

Ferrari R, Bachetti T, Confortini R, Opasich C, Febo O, Corti A, Cassani G, Visioli O. Tumor necrosis factor soluble receptors in patients with various degrees of congestive heart failure. Circulation. 1995; 92:1479-1486. Drexler H. Endothelial dysfunction: clinical implications. Prog Cardiovasc Dis 1997; 39:287-324.

91

236 Bibliografa

92

Halcox J, Schenke W, Zalos G, Mincemoyer R, Prasad A, Waclawiw M, Nour R, Quyyumi A. Prognostic value of coronary vascular endothelial function. Circulation 2002; 106:653-658. Gokce N, Keaney J, Vita J. Endotheliopathies: clinical manifestations of endothelial dysfunction. p. 901-24. In: Loscalzo J, Scafer A. editors. Thrombosis and hemorrhage. Williams and Wilkins; 1998. Baltimore. Cai H, Harrison D. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the role of oxidant stress. Circ Res 2000; 87:840-844. Ames, B.N., Shigenaga, M., Hagen, T.M. Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci. 1993; 90:7915-792. Martyn D, Frederick M, Von Loehneysen K, Dinauer C, Knaus G. Functional analysis of Nox4 reveals unique characteristics compared to other NAD(P)H oxidases. Cell Signal. 2006; 18:69-82. Rhee G. H2O2, a necessary evil for cell signaling. Science. 2006; 312:18821883.

93

94

95

96

97

98

Faraci M. Reactive oxygen species: influence on cerebral vascular tone. J Appl Physiol. 2006; 100:739 -743. Suvorava T, Lauer N, Kumpf S, Jacob R, Meyer W, Kojda G. Endogenous vascular hydrogen peroxide regulates arteriolar tension in vivo. Circulation. 2005; 112:2487-2495. Miura H, Bosnjak J, Ning G, Saito T, Miura M, Gutterman D. Role of hydrogen peroxide in flow-induced dilation of human coronary arterioles. Circ Res. 2003; 92:e31- e40.

99

100

101

Chaytor T, Edwards H, Bakker M, Griffith M. Distinct hyperpolarizing and relaxant roles for gap junctions and endothelium-derived H2O2 in NOindependent relaxations of rabbit arteries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100:15212-15217.

Bibliografa 237

102

Liu Y, Zhao H, Li H, Kalyanaraman B, Nicolosi C, Gutterman D. Mitochondrial sources of H2O2 generation play a key role in flow mediated dilation in human coronary resistance arteries. Circulation Res. 2003; 93:573-580.

103

Paravicini M, Miller A, Drummond R, Sobey G. Flow-induced cerebral vasodilatation in vivo involves activation of n-phosphatidylinositol-3 kinase, NAD(P)H-oxidase, and nitric oxide synthase. J Cereb Blood Flow Metab. 2006; 26:836-845. Feletou M, Vanhoutte M. Endothelium-derived hyperpolarizing factor. Where are we now? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006; 26:1215-1225.

104

Shimokawa H, Matoba T. Hydrogen peroxide as an endothelium-derived hyperpolarizing factor. Pharmacol Res. 2004; 528:543-549.
106

105

Fischer S, Wiesnet M, Renz D, Schaper W. H2O2 induces paracellular permeability of porcine brain-derived microvascular endothelial cells by activation of the p44/42 MAP kinase pathway. Europ J Cell Biol. 2005; 84:687697.

107

Csiszar A, Smith E, Koller A, Kaley G, Edwards G, Ungvari Z. Regulation of bone morphogenetic protein-2 expression in endothelial cells. Role of nuclear factor-kB activation by tumor necrosis factor, H2O2 and high intravascular pressure. Circulation. 2005; 111:2364-2372. Han J, Kwon G, Chung T, Lee K, Simmons L, Billiar R, Kim M. Antioxidant enzymes suppress nitric oxide production through the inhibition of NF-kappa B activation: role of H2O2 and nitric oxide in inducible nitric oxide synthase expression in macrophages. Nitric Oxide. 2001; 5:504 -513. Djordjevic T, Pogrebniak A, BelAiba S, Bonello S, Wotzlaw C, Acker H, Hess J, Gorlach A. The expression of the NAD(P)H oxidase subunit p22phox is regulated by a redox-sensitive pathway in endothelial cells. Free Radical Biol Med. 2005; 38:616-630. Yang H, Roberts J, Shi J, Zhou C, Ballard R, Richardson A, Guo M. Retardation of atherosclerosis by overexpression of catalase or both Cu/Znsuperoxide dismutases and catalase in mice lacking apolipoprotein E. Circ Res. 2004;95:1075-1081.

108

109

110

238 Bibliografa

111

Thengchaisri N, Hein W, Wang W, Xu X, Li Z, Fossum W, Kuo L. Upregulation of arginase by H2O2 impairs endothelium-dependent nitric oxidemediated dilation of coronary arterioles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006; 26:2035-2042. Morris M. Arginine: beyond protein. Am J Clin Nutr. 2006; 83:508S-512S.

112 113

Fridovich I. Superoxide anion radical, superoxide dismutases, and related matters. J. Biol. Chem. 1997; 272:18515-18517.
114

Babior M, Lambeth D, Nauseef W. The neutrophil NAD(P)H oxidase. Arch Biochem Biophys. 2002; 397:342-344.

115

Hilenski L, Clempus E, Quinn T, Lambeth D, Griendlin K. Distinct subcellular localizations of Nox1 and Nox4 in vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24:1-8 Duerrschmidt N, Wippich N, Goettsch W, Broemme J, Morawietz H. Endothelin-1 induce NAD(P)H oxidase in human endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2000; 269:713-717.

116

117

Vasquez-Vivar J, Duquaine D, Whitsett J, Kalyanaraman B, Rajagopalan S. Altered tetrahydrobiopterin metabolism in atherosclerosis: implications for use of oxidized tetrahydrobiopterin analogues and thiol antioxidants. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002; 22:1655-1661. Bagi Z, Koler A. Lack of nitric oxide mediation of flow-dependent arteriolar dilation in type I diabetes is restore by sepiapterin. J Vas Res. 2003; 40:47-57.

118

119

Virdis A, Iglarz M, Neves F, Amiri F, Touyz R, Schiffrin E. Effect of hyperhomocystinemia and hipertensin on endotelial function in methylenetetrahydrofolate reductase-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 23:1352-1357. Landmesser U, Dikalov S, Price R, McCann L, Fukai T, Holland M, Mitch E, Harrison D. Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in hypertension. J Clin Invest. 2003; 111:1201-1209.

120

Bibliografa 239

121

Ohara Y, Peterson T, Harrison D. Hypercholesterolemia increases endothelial superoxide production. J Clin Invest. 1993, 91:2546-2551. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 2001; 82:47-95. Luft C. Mechanisms and cardiovascular damage in hypertension. Hypertension. 2001; 37:594-598.

122

123

124

Zalba G, Beaumont F, San Jose G, Fortuno A, Fortuno M, Etayo J, Diez J. Vascular NADH/NAD(P)H oxidase is involved in enhanced superoxide production in spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 2000; 35:10551061. Chen X, Touyz R, Park J, Schiffrin E. Antioxidant effects of vitamins C and E are associated with altered activation of vascular NAD(P)H oxidase and superoxide dismutase in stroke-prone SHR. Hypertension. 2001; 38:606-611.

125

126

Chabrashvili T, Tojo A, Onozato M, Kitiyakara C, Quinn M, Fujita T, Welch W, Wilcox C. Expression and cellular localization of classic NAD(P)H oxidase subunits in the spontaneously hypertensive rat kidney. Hypertension. 2002; 39:269-274. Landmesser U, Cai H, Dikalov S, McCann L, Hwang J, Jo H, Holland S, Harrison D. Role of p47(phox) in vascular oxidative stress and hypertension caused by angiotensin II. Hypertension. 2002; 40:511-515. Zhan C, Sindhu R, Vaziri N. Up-regulation of kidney NAD(P)H oxidase and calcineurin in SHR: reversal by lifelong antioxidant supplementation. Kidney Int. 2004; 65:219-227.

127

128

129

Sharma R, Hodis H, Mack W. Probucol suppresses oxidant stress in hypertensive arteries. Immunohistochemical evidence. Am J Hypertens. 1996; 9:577-590. Wilcox C. Reactive oxygen species: roles in blood pressure and kidney function. Curr Hypertens Rep. 2002; 4:160-166.

130

240 Bibliografa

131

Laursen J, Rajagopalan S, Galis Z, Tarpey M, Freeman B, Harrison D. Role of superoxide in angiotensin II-induced but not catecholamine-induced hypertension. Circulation. 1997; 95:588-593.

Russo C, Olivieri O, Girelli D, Faccini G, Zenari M, Lombardi S, Corrocher R. Anti-oxidant status and lipid peroxidation in patients with essential hypertension. J Hypertens. 1998; 16:1267-1271.
133

132

Manning R, Meng S, Tian N. Renal and vascular oxidative stress and saltsensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 2003; 179:243-250. Lip G, Edmunds E, Nuttall S, Landray M, Blann A, Beevers D. Oxidative stress in malignant and non-malignant phase hypertension. J Hum Hypertens. 2002; 16:333-336. Lee V, Quinn P, Jennings S, Ng L. Neutrophil activation and production of reactive oxygen species in preeclampsia. Hypertension. 2003; 21:395-402. Touyz R, Yao G, Schiffrin E. c-Src induces phosphorylation and translocation of p47phox: role in superoxide generation by angiotensin II in human vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 23:981-987. Ghiadoni L, Magagna A, Versari D, Kardasz I, Huang Y, Taddei S, Salvetti A. Different effect of antihypertensive drugs on conduit artery endothelial function. Hypertension. 2003; 41:1281-1286.

134

135

136

137

138

Cai H, Griendling K, Harrison D. The vascular NAD(P)H oxidases as therapeutic targets in cardiovascular diseases. Trends Pharmacol Sci. 2003; 24:471-478. Moncada S, Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med 1993; 329:2002-2012. Halliwell B, Aeschbach R, Loliger J, Aruoma O. The characterization of antioxidants. Food Chem Toxicol. 1995; 7:601-617.

139

140

141

Chan H. Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain. J Cerebral Blood Flow Metabol. 2001; 21:2-14.

Bibliografa 241

142

Darley-Usmar V, Wiseman H, Halliwell B. Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance. FEBS Letters. 1995; 369:131-135.

143

MacMillan-Crow A, Cruthirds L. Manganese superoxide dismutase in disease. Free Radical Res. 2001; 34:325-336. Oliver J, Murcia M, Nacci C, Decker P, Andriantsitohaina R, Muller S, de la Rubia G, Stoclet C, de Murcia G. Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kB activation in poly (ADP-ribose) polymerase-1 deficient mice. EMBO J. 1999; 18:4446-4454. Cooke L, Davidge T. Peroxynitrite increases iNOS through NF-kB and decreases prostacyclin synthase in endothelial cells. Am J Physiol. 2002; 282:C395-C402.

144

145

146

Laursen B, Somers M, Kurz S, McCann L, Warnholtz A, Freeman A, Tarpey M, Fukai T, Harrison D. Endothelial regulation of vasomotion in apoE-deficient mice. Implications for interactions between peroxynitrite and tetrahydrobiopterin. Circulation. 2001; 103:1282-1288. Zou H, Shi C, Cohen A. Oxidation of the zinc-thiolate complex and uncoupling of endothelial nitric oxide synthase by peroxynitrite. J Clin Invest. 2002; 109:817-826. Blanc A, Pandey R, Srivastava K. Synchronous activation of ERK 1/2, p38mapk and PKB/Akt signaling by H2O2 in vascular smooth muscle cells: potential involvement in vascular disease. International J Molec Med. 2003; 11:229-234. Sobey G, Heistad D, Faraci M. Mechanisms of bradykinin-induced cerebral vasodilatation: evidence that reactive oxygen species activate K+ channels. Stroke. 1997; 28:2290-2295.

147

148

149

150

Matoba T, Shimokawa H. Hydrogen peroxide is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in animals and humans. J Pharmacol Sci. 2003; 92:1-6. Morikawa K, Shimokawa H, Matoba T, Kubota H, Akaike T, Talukder H, Hatanaka M, Fujiki T, Maeda H, Takahashi S, Takeshita A. Pivotal role of Cn,Zn-

151

242 Bibliografa

superoxide dismutase in endothelium-dependent hyperpolarization. J Clin Invest. 2003; 112:1871-1879.

Marklund L. Extracellular superoxide dismutase. Methods Enzymol. 2002; 349:74-80.

153

Didion P, Ryan J, Didion A, Fegan E, Sigmund D, Faraci M. Increased superoxide and vascular dysfunction in CuZnSOD-deficient mice. Circ Res. 2002; 91:938-944. Veerareddy S, Cooke L, Baker N, Davidge T. Gender differences in myogenic tone in the superoxide dismutase knockout mouse: an animal model of oxidative stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004; 287:H40-H45. Cooke L, Davidge T. Endothelial-dependent vasodilation is reduced in mesenteric arteries from superoxide dismutase knockout mice. Cardiovasc Res. 2003; 60:635-642.

154

155

156

Baumbach L, Didion P, Faraci M. Deficiency of copper-zinc superoxide dismutase promotes cerebral vascular hypertrophy. FASEB J. 2003; 17:A63-A64. Ishibashi M, Hiasa K, Zhao Q, Inoue S, Ohtani K, Kitamoto S, Tsuchihashi M, Sugaya T, Charo F, Kura S, Tsuzuki T, Ishibashi T, Takeshita A, Egashira K. Critical role of monocyte chemoattractant protein-1 receptor CCR2 on monocytes in hypertension-induced vascular inflammation and remodeling. Circulation Res. 2004; 94:1203-1210. Zanetti M, Sato J, Katusic S, OBrien T. Gene transfer of superoxide dismutase isoforms reverses endothelial dysfunction in diabetic rabbit aorta. Am J Physiol. 2001; 280:H2516-H2523.

157

158

159

Miller J, Gutterman D, Rios D, Heistad D, Davidson L. Superoxide production in vascular smooth muscle contributes to oxidative stress and impaired relaxation in atherosclerosis. Circ Res. 1998; 82:1298-1305. Packer L, Ed. Methods in Enzymology, Volume 349. San Diego, California Academic Press; 2002.

160

Bibliografa 243

161

Suzuki K, Tatsumi H, Satoh S, Senda T, Nakata T, Fujii J, Taniguchi N. Manganese-superoxide dismutase in endothelial cells: localization and mechanism of induction. Am J Physiol. 1993; 265:H1173-H1178. Napoli C, Witztum L, de Nigris F, Palumbo G, DArmiento P, Palinski W. Intracranial arteries of human fetuses are more resistant to hypercholesterolemiainduced fatty streak formation than extracranial arteries. Circulation. 1999; 99:2003-2010.

162

163

Michelakis D, Hampl V, Nsair A, Wu C, Harry G, Haromy A, Gurtu R, Archer L. Diversity in mitochondrial function explains differences in vascular oxygen sensing. Circulation Res. 2002; 90:1307-1315. Zanetti M, Sato J, Jost J, Gloviczki P, Katusic S, OBrien T. Gene transfer of manganese superoxide dismutase reverses vascular dysfunction in the absence but not in the presence of atherosclerotic plaque. Human Gene Therapy. 2001; 12:1407-1416. Li L, Fink D, Watts W, Northcott A, Galligan J, Pagano J, Chen F. Endothelin1 increases vascular superoxide via endothelin(A)-NAD(P)H oxidase pathway in low-renin hypertension. Circulation. 2003; 107:1053-1058. Marklund L. Extracellular superoxide dismutase and other superoxide dismutase isoenzymes in tissues from nine mammalian species. Biochem J. 1984; 222:649-655.

164

165

166

167

Sandstrm J, Carlsson L, Marklund L, Edlund T. The heparin-binding domain of extracellular superoxide dismutase C and formation of variants with reduced heparin affinity. J Biol Chem. 1992; 267:18205-18209.

168

Fukai T, Folz J, Landmesser U, Harrison D. Extracellular superoxide dismustase and cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 2002; 55:239-249. Stralin P, Marklund L. Vasoactive factors and growth factors alter vascular smooth muscle cell EC-SOD expression. Am J Physiol. 2001; 281:H1621-H1629. Davis E, Cai H, McCann L, Fukai T, Harrison D. Role of c-Src in regulation of endothelial nitric oxide synthase expression during exercise training. Am J Physiol. 2003; 284:H1449-1453.

169

170

244 Bibliografa

171

Wolin S. Interactions of oxidants with vascular signaling systems. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000; 20:1430-1442. Jung O, Marklund L, Geiger H, Pedrazzini T, Busse R, Brandes P. Extracellular superoxide dismutase is a major determinant of nitric oxide bioavailability. In vivo and ex vivo evidence from ecSOD-deficient mice. Circulation Res. 2003; 93:622-629. Liu Q, Folz J. Extracellular superoxide enhances 5-HT induced murine pulmonary artery vasoconstriction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004; 287:L111-L118. Demchenko T, Oury D, Crapo D, Piantadosi A. Regulation of the brains vascular responses to oxygen. Circulation Res. 2002; 91:1031-1037. Chu Y, Iida S, Lund D, Weiss R, DiBona G, Watanabe Y, Faraci F, Heistad D. Gene transfer of extracellular superoxide dismutase reduces arterial pressure in spontaneously hypertensive rats: role of the heparin binding domain. Circulation Res. 2003; 92:461-468.

172

173

174

175

176

Morgenstern R, Cotgreave I, Engman L. Determination of the relative contributions of the diselenide and selenol forms of ebselen in the mechanism of its glutathione peroxidase-like activity. Chem Biol Interactions. 1992; 84:77-84.

dUscio L, Milstien S, Richardson D, Smith L, Katusic Z. Long-term vitamin C treatment increases vascular tetrahydrobiopterin levels and nitric oxide synthase activity. Circ Res. 2003; 92:88-95.
178

177

Levine G, Frei B, Koulouris S, Gerhard M, Keaney J, Vita J. Ascorbic acid reverses endothelial vasomotor dysfunction in patients with coronary arteriy disease. Circulation. 1996; 93:1107-1113. Ting H, Timimi F, Boles K, Creager S, Ganz P, Creager M. Vitamin C improves endothelium-dependent vasodilation in patients with non-insulin dependent diabetes mellitus. J Clin Invest. 1996; 97:22-28.

179

Bibliografa 245

180

Solzbach U, Horning B, Jeserich M, Just H. Vitamin C improves endothelial dysfunction of epicardial coronary arteries in hypertensive patients. Circulation. 1997; 96:1513-1519. McBride M, Charchar F, Graham D, Miller W, Strahorn P, Carr F, Dominiczak A. Functional genomics in rodent models of hypertension. J Physiol. 2003; 554:56-63. Sauzeau V, Sevilla M, Rivas-Elena J, Montero M, Lpez-Novoa J, Bustelo X. Vav 3 proto-oncogene deficiency leads to sympathetic hyperactivity and cardiovascular dysfunction. Nat Med. 2006; 12:841-845. American Institute of Nutrition. American Institute of Nutrition (AIN) report of the AIN ad hoc committee on standars for nutritional studies. J Nutr. 1977; 107:1340-1348.

181

182

183

184

Kurtz T, Griffin A, Bidani A, Davisson R, Hall J. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Hypertension. 2005; 45:299-310. Fulton R, Hutchinson E, Morgan-Jones A. Ventricular weight in cardiac hypertrophy. Br Heart J. 1952; 14:413-420.

185

Faukner K , Fridovich I. Luminol and lucigenin as detectors for O2-- Free Radic Biol Med. 1993; 15:447-451.
186 187

Mnzel T, Afanasev I, Kleschyov A, Harrison D. Detection of superoxide in vascular tissue. Aterioescler Thromb Vasc Biol. 2000; 22:1761-1768. Jamal I, Finelli V, Que S. A simple method to determine nanogram levels of 4hydroxyproline in biological tissues. Anal Biochem. 1981; 112:70-75.

188

189

Fort J, Pilette C, Oberti F, Veal N,Gallois Y, Douay O, Cals P. Long-term administration of PGE1 increases liver fibrosis and collateral blood flow in bileduct-ligated rats. J Hepatol. 1999; 30:70-76 Draper H, Squires E, Mahmoodi H, Wu J, Agarwal S, Hadley M. A comparative evaluation of thiobarbituric acid methods for the determination of malondialdehyde in biological materials. Free Rad Biol Med. 1993; 15:353-363.

190

246 Bibliografa

191

Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 1979; 95:351-358. Peskin V, Winterbourn C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clin Chim Acta. 2000; 293:157166.

192

Aebi H. Catalase. In: Methods of Enzymatic Analysis, 2nd ed. (Bergmeyer, H.U., ed.). Verlag Chemie, Weinheim, Germany. 1974. 673-684.
194

193

Lawrence R, Burk R. Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat liver. Biochem Biophys Res Commun. 1976; 71:952-958.

195

Kearny P, Whelton M, Reynolds K, Munter P, He J. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 2005; 365:217-223. Landmesser U, Harrison D. Oxidative stress and vascular damage in hypertension. Coron Artery Dis. 2001; 12:455-46. Zalba G, San Jos G, Moreno M, Fortuno A, Beaumont F, Diez J. Oxidative stress in arterial hypertension: role of the NAD(P)H oxidase. Hypertension. 2001; 38:1395-1399.

196

197

198

Zafari A, Ushio-Fukai M, Akers M, Griendling K. Role of the NADH/NADPH oxidase-derived H2O2 in angiotensin II induced vascular hypertrophy. Hypertension. 1998; 32:488-495.

199

Touyz R, Schiffrin E. Ang II-stimulated superoxide production is mediated via phospholipase D in human vascular smooth muscle cells. Hypertension. 1999; 34:976-982. Harrison D. Cellular and molecular mechanism of endothelial dysfunction. J Clin Invest. 1997; 99:2153-2157. Williams T, Chambers J, May O, Henderson R, Rashotte M, Overton J. Concurrent reductions in blood pressure and metabolic rate during fasting in the unrestrained SHR. Am J Physiol regulatory Comp physiol. 2000; R255-R262.

200

201

Bibliografa 247

202

Newaz M, Nawal N. Effect of -tocotrienol on blood pressure, lipid peroxidation and total antioxidant status in spontaneously hypertensive rats (SHR). Clin Exp Hypertens. 1999; 21:1297-1313. Newaz M, Nawal N. Effect of -tocopherol on lipid peroxidation and total antioxidant status in spontaneously hypertensive rats. Amer J Hypertens. 1998; 11.1480-1485. Newaz M, Nawal N, Rohaizan C, Muslim N, Gapor A. -Tocopherol increased nitric oxide synthase activity in blood vessels of spontaneously hypertensive rats. Amer J Hypertens. 1999; 12:839-844.

203

204

205

Koba K, Abe K, Ikeda I, Sugano M. Effects of alpha tocopherol and tocotrienols on blood pressure and linoleic acid metabolism in the spontaneously hypertensive rat (SHR). Biosc Biotechnol Biochem. 1992; 56:1420-1423. Yoshioka M, Aoyama K, Matsushita T. Effects of ascorbic acid on blood pressure and ascorbic acid metabolism in spontaneously hypertensive rats (SH rats). Int J Vitam Nutr Res. 1985; 55:301-307. Vasdev S, Ford C, Parai S, Longerich L, Gadag V. Dietary vitamin C supplementation lowers blood pressure in spontaneously hypertensive rats. Biol Mol Cell. 2001; 218:97-103.

206

207

208

lker S, McKeown P, Bayraktutan U. Vitamins reverse endothelial dysfunction through regulation of eNOS and NAD(P)H oxidase activities. Hypertension. 2003; 41:534-539. Hemila H. Vitamin C and lowering of blood pressure: Need for intervention trials? J Hypertens. 1991; 9:1076- 107.

209

210

Feldman B. The role of vitamin C and antioxidants in hypertension. Nutr MD. 1998; 24:1-4. Enster L, Dallner G. Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biochim Biophys Acta. 1995; 1271:195-204.

211

248 Bibliografa

212

Gale R, Martyn N, Winter D, Cooper C. Vitamin C and risk of death from stroke and coronary heart disease in a cohort of elderly people. BMJ, 1995; 310:1563-1566. Egan A, Garg R, Wilt J, Pettinger B, Davis B, Crouse J, Herd A, Hunninghake B, Sheps S, Kostis B, Probstfield J, Waclawiw A, Applegate W, Elam MB. Rationale and design of the Arterial Disease Multiple Intervention Trial (ADMIT) pilot study. Am J Cardiol. 1999; 83:569- 575.

213

Block G, Mangels R, Norkus P. Ascorbic acid status and subsequent diastolic and systolic blood pressure. Hypertension. 2001; 37:261-267.
215

214

Paran E, Engelhard Y. Effect of tomatos lycopene on blood pressure, serum lipoproteins, plasma homocysteine and oxidative stress markers in grade I hypertensive patients. Am J Hypertens. 2001; 14:141A.

List M, Kolsch B, Volker C, Gorren C, Sessa C, Werner R, Kukovetz R, Schmidt K, Meyer B. Characterization of bovine endothelial nitric oxide synthase as homodimer with down-regulated uncoupled NADPH oxidase activity: tetrahydrobiopterin bindin kinetics and role of haem in dimerization. Biochem J. 1997; 323:169-165.
217

216

Somers J, Harrison D. reactive oxygen species and the control of vasomotor tone. Curr Hipertens Rep. 1999; 1:102-108. Szabo C. Multiple pathways in peroxynitrite cytotoxicity. Toxicol Lett. 2003; 140:105-112.

218

219

Viridis A, Iglarz M, Neves M, Amiri F, Touyz M, Schiffrin E. Effect of hyperhomocystinemia and hypertension on endothelial function in methylenetetrahydrofolate reductase-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 1352-1357. Mitchel M, Dorrance M, Ergul A, Webb C. Sepiapterin decreases vasorelaxation in nitric oxide synthase inhibition induced hypertension. J Cardiovasc Pharmacol. 2004; 43:93-98.

220

Bibliografa 249

221

Taddei S, Viridis A, Ghiadoni L, Magagna A, Salvetti A. Vitamin C improves endothelium-dependent vasodilation by restoring nitric oxide activity in essential hypertension. Circulation 1998; 97:2222-2229.

Si H, Heyken W, Wlfle S, Tysiac M, Schubert R, Grgic I, Vilianovich L, Giebing G, Maier T, Gross V, Bader M, Wit C, Hoyer J, Khler R. Impaired endothelium-derived hyperpolarizing factor-mediated dilations and increased blood pressure in mice deficient of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel. Circ Res. 2006; 99:537-544.
223

222

Riganti C, Costamagna C, Bosia A, Ghigo D. The NADPH oxidase inhibitor apocynin (acetovanillone) induces oxidative stress. Toxicol Appl Pharmacol. 2006; 212:179-187. Touyz R. Apocynin, NADPH oxidase, and vascular cells. A complex matter. Hypertension. 2008; 51:172-174. Heumller S, Wind S, barbosa-Sicard E, Schmidt H, Busse R, Schrder K, Brandes R. Apocynin in not an inhibitor of vascular NADPH oxidases but an antioxidant. Hypertension. 2008; 51:211-217. Vejrazka M, Mcek R, Stpek S. Apocynin inhibits NADPH oxidase in phagocytes but stimulates ROS production in non-phagocytic cells. Biochim Biophys Acta. 2005; 1722:143-147.

224

225

226

227

Villalobos-Medina R, Lpez-Guerrero J, Ibarra M. Functional evidence of 1D adrenoreceptors in the vasculature of young and adult spontaneously hypertensive rats. Br J Pharmacol. 1999; 126:1534-1536. Kng F, Lsscher F. Different mechanisms of endothelial dysfunction with aging and hypertension in rat aorta. Hypertension. 1995; 25:194-200.

228

229

1d-adrenergic

Chu C, Kunitake T, Kato K, Watanabe S, Qiu D, Tanoue A, Kannan H. The receptor modulates cardiovascular and drinking responses to central salt loading in mice. Neurosci Lett. 2004; 356:33-36. Vecchione C, Fratta L, Rizzoni D, Notte A, Poulet R, Porteri E, Frati G, Guelfi D, Trimarco V, Mulvany M, Agabiti-Rosei E, Trimarco B, Cotecchia S, Lembo

230

250 Bibliografa

G. Cardiovascular influences of Circulation. 2002; 105:1700-1707.

1badrenergic

receptor defect in mice.

Silan C. The effects of chronic resveratrol treatment on vascular responsiveness of streptozoticin-induced diabetics rats. Biol Pharm Bull. 2008; 31:897-902. Touyz R, Endemann D, He G, Li J-S, Schiffrin E. Role of AT2 receptors in angiotensin II-stimulated contraction of small arteries in young SHR. Hypertension. 1999; 33:366-373.

232

233

Otsuka S, Sugano M, Makino N, Sawada S, Hata T, Niho Y. Interaction of mRNAs for angiotensin II type 1 and type 2 receptors to vascular remodeling in spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 1998; 32:467-472. Lifton P, Gharavi G, Geller S. Molecular mechanisms of human hypertension. Cell. 2001; 104:545-556. DiBona, G.F. The sympathetic nervous system and hypertension: recent developments. Hypertension. 2004; 43:147-150.

234

235

236

Otsuka F, Yamauchi T, Ogura T, Takahashi M, Kageyama J, Makino H. Renal c-fos expression induced by angiotensin II is enhanced in spontaneously hypertensive rats. Life Sci. 1998; 63:2089-2095. Schiffrin E, Thome S, Genest J. Vascular angiotensin II receptors in spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 1984; 6:682-688.

237

Pashkow F, Watumull D, Campbell C. Astaxanthin: a novel potential treatment for oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease. Am J Cardiol. 2008; 101 (suppl):58D-68D.
239

238

Matsumoto T, dUscio L, Eguchi D. Protective effect of chronic Vitamin C treatment on endothelial function of apolipoprotein E-deficient mouse carotid artery. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306:103-108. Viridis A, Neves M, Amiri F, Touyz R, Schiffrin E. Role of NAD(P)H oxidase on vascular alterations in angiotensin II-infused mice. J Hipertens. 2004; 22:535542.

240

Bibliografa 251

241

Rajagopalan S, Kurz S, Munzel T, Tarpey M, Freeman A, Griendling K, Harrison D. Angiotensin II-mediated hypertension in the rat increases vascular superoxide production via membrane NADH/NAD(P)H oxidase activation. Contribution to alterations of vasomotor tone. J Clin Invest. 1996; 97:1916-1923. Lassegue B, Sorescu D, Szocs K, Yin Q, Akers M, Zhang Y, Grant L, Lambeth D, Griendling K. Novel gp91(phox) homologues in vascular smooth muscle cells: nox1 mediates angiotensin II-induced superoxide formation and redox-sensitive signaling pathways. Circ Res. 2001; 88:888-894. Hamilton A, Brosnan J, McIntyre M, Graham D, Dominiczak F. Superoxide excess in hypertension and aging. A common cause of endothelial dysfunction. Hypertension 2001; 37:529-534. Hink U, Li H, Mollnau H, Oelze M, Matheis E, Hartmann M, Skatchkov M, Thaiss F, Stahl A, Wamholtz A, Meinertz T, Griendling K, Harrison D. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 2001; 88:E14-E22.

242

243

244

245

Oelze M, Mollnau H, Hoffmann N, Warnholtz A, Bodenschatz M, Smolenski A, Walter U, Skatchkov M, Meinertz T, Mnzel T. Vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation as a sensitive monitor of defective nitric oxide/cGMP signaling and endothelial dysfunction. Circ Res. 2000; 87:9991005. Cohn J, Ferrari R, Sharpe N. Cardiac RemodelingConcepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J Am Coll Cardiol. 2000; 35:569-582.

246

247

Snchez M, Galisteo M, Vera R, Villar I, Zarzuelo A, Tamargo J, PrezVizcano F, Duarte J. Quercetin downregulates NADPH oxidase, increases eNOS activity and prevents endothelial dysfunction in spontaneously hypertensive rats. J Hypertens. 2006; 24:75-84. Prez-Sepulveda R, Jimenez R, Romero M, Zarzuelo A, Snchez M, GmezGuzman M, Vargas F, OValle F, Duarte J. Wine polyphenols improve endotelial function in large vessels of females spontaneously hypertensive rats. Hipertension. 2008; 51:1088-1095.

248

252 Bibliografa

249

Sevilla M, Voces F, Carrn R, Guerrero E, Ardanaz N, San Roman L, Arvalo M, Montero M. Amlodipine decreases fibrosis and cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats: persistent effects after withdrawal. Life Sci. 2004; 75:881-891.

250

Pechnov O. Contribution of captopril thiol to the prevention of spontaneous hypertension. Physiol Res. 2007; (suppl. 1):S41-S48. Zhai P, Galeotti J, Liu J, Holle E, Yu X. Wagner T, Sadoshima J. An angiotensin II type 1 receptor mutant lacking epidermal growth factor receptor transactivation does not induce Angiotensin II-mediated cardiac hypertrophy. Circ Res. 2006; 99:528-536.

251

Graiani G, Lagrasta C, Migliaccio E, Spillmann F, Meloni M, Madeddu P, Quaini F, Martin I, Lanfrancone L, Pelicci P, Emanueli C. Genetic deletion of the p66Shc adaptor protein protects from angiotensin II-induced myocardial damage. Hypertension. 2005; 46:433-440.
253

252

Lu Z, Hu X, Zhu G, Zhang P, van Deel E, French J, Fassett J, Oury T, Bache R, Chen Y. Extracellular superoxide dismutase deficiency exacerbates pressure overload-induced left ventricular hypertrophy and dysfunction. Hypertension. 2008; 51:19-25.

254

Kasea H, Hashikabea Y, Uchidab K, Nakanishic N, Hattoria Y. Supplementation with tetrahydrobiopterin prevents the cardiovascular effects of angiotensin II-induced oxidative and nitrosative stress. J Hypertens. 2005; 23:1375-1382.

255

Paul A, Wilson S, Belham C, Robinson C, Scott P, Gould G, Plevin R. Stressactivated protein kinases: activation, regulation and function. Cell Signal. 1997; 9:403-410. Ushio-Fukai M, Alexander W, Akers M, Griendling K. p38 Mitogen activated protein kinase is a critical component of the redox-sensitive signaling pathways activated by angiotensin II. Role in vascular smooth muscle cell hypertrophy. J Biol Chem. 1998; 271:15022-15029.

256

Bibliografa 253

257

Wenzel S, Rohde C, Wingerning S, Roth J, Kojda G, Schlter S. Lack of endothelial nitric oxide synthase-derived nitric oxide formation favors hypertrophy in adult ventricular cardiomyocytes. Hypertension. 2007; 49:193200. Kojima M, Shiojima I, Yamazaki T, Komuro I, Yunzeng Z, Ying W, Mizuno T, Ueki K, Tobe K, Kadowaki T, Nagai R, Yazaki Y. Ventricular hypertrophy: angiotensin II receptor antagonist TCV-116 induces regression of hypertensive left ventricular hypertrophy in vivo and inhibits the intracellular signaling pathway of stretch-mediated cardiomyocyte hypertrophy in vitro. Circulation. 1994; 89:2204-221. Varo N, Etayo C, Zalba G, Beaumont J, Iraburu J, Montiel C, Gil J, Monreal I, Diez J. Losartan inhibits the post-transcriptional synthesis of collagen type I and reverses left ventricular fibrosis in spontaneously hypertensive rats. J Hipertens. 1999; 17:107-111. Rossi M. Pathological fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 1998; 16:1031-1041.

258

259

260

261

Cardounel A, Dumitrescu C, Zweier J, Lockwood S. Direct superoxide anion scavenging by disodium disuccinate astaxanthin derivarive: Relative efficacy of individual stereoisomers versus the statistical mixture of stereoisomers by electron paramagnetic resonance imaging. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 307:704-712.

262

Lijnen P, Papparella I, Petrov V, Semplicini A, Fagard R. Angiotensin II stimulated collagen production in cardiac fibroblasts is mediated by reactive oxygen species. J Hipertens. 2006; 24:757-766. Block K, Assaad E, Griendling K, Lee D, Wittrant Y, Gorin Y. Nox4 NAD(P)H oxidase mediates Src-dependent tyrosine phosphorylation of PDK-1 in response to angiotensin II. Role in mesangial cell hypertrophy and fibronectin expression. J Biol Chem. 2008; 283:24061-24076. Folkow B. Structural factor in primary and secondary hypertension. Hypertension. 1990; 16:89-101.

263

264

254 Bibliografa

265

Chamiot-Clerc P, Renaud J, Safar E. Pulse pressure, aortic reactivity, and endothelium dysfunction in old hypertensive rats. Hypertension. 2001; 37:313-21 Levy B, Duriez M, Phillipe M, Poitevin P, Michel J. Effect of chronic dihydropyridine (isradipine) on the large arterial walls of spontaneously hypertensive rats. Circulation. 1994; 37:3024-3033. Benetos A, Poitevin P, Prost L, Safar E, Levy I. Life survival and cardiovascular structures following selective beta-blockade in spontaneously hypertensive rats. Am J Hypertens. 1994; 7:186-92. Guerrero E, Ardanaz N, Sevilla M, Arevalo M, Montero M. Cardiovascular effects of nebivolol in spontaneously hypertensive rats persist after treatment withdrawal. J Hypertens. 2006; 24:151-158.

266

267

268

269

Griffin A, Brown C, MacPherson F, MacGrath C, Wilson G, Korsgaard N, Mulvany J, Lever F. Angiotensin II causes vascular hyperthrophy in part by a non-pressor mechanism. Hypertension. 1991; 17:626-635. Neves M, Viridis A, Schiffrin E. Resistance artery mechanics and composition in angiotensin II infused rats: effects of aldosterone antagonism. J Hipertens. 2003; 21:189-198. Schiffrin E. Remodeling of resistance arteries in essential hypertension and effects of antihypertensive treatment. Am J Hypertens. 2004; 17:1192-1200. Duprez DA. Role of the renin-angiotensin-aldosterone system in vascular remodeling and inflammation: a clinical review. J Hypertens. 2006; 24:983-991.

270

271

272

273

Rizzoni D, Porteri E, Guefi D, Piccoli A, Castellano M, Pasini G, Muiesan L, Mulvany J, Rosei A. Cellular hypertrophy in subcutaneous small arteries of patients with renovascular hypertension. Hypertension. 2000; 35:931-935. Heerkens H, Izzard S, Heagerty M. Integrins, vascular remodeling, and hypertension. Hypertension. 2007; 49:1-4. Loirand G, Rolli-Derkinderen M, Pacaud P. RhoA and resistance artery remodeling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 288:H1051-1056.

274

275

Bibliografa 255

276

Touyz R. Intracellular mechanisms involved in vascular remodeling of resistance arteries in hypertension: role of angiotensin II. Exp Physiol. 2005; 90:449-455.

277

Griendling K, Minieri A, Ollerenshaw D, Alexander W. Angiotension II stimulates NADH and NAD(P)H oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circ Res. 1994; 74:1141-1148. Intengan D, Schiffrin E. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 2001; 38:581-587.

278

279

Touyz R, He G, El Mabrouk M, Schiffrin E. p38 Map kinase regulates vascular smooth mucle cell collagen synthesis by angiotensin II in SHR but no in WKY. Hypertension. 2001; 37:574-580. Korsgaard N, Aalkjaer C, Heagerty M, Izzard S, Mulvany J. Histology of subcutaneous small arteries from patients with essential hypertension. Hypertension. 1993; 22:523-526.

280

281

Rizzoni D, Rodella L, Porteri E, Rezzani R, Guelfi D, Piccoli A, Castellano M, Muiesan L, Bianchi R, Rosei A. Time course of apoptosis in small resistance arteries of spontaneously hypertensive rats. J Hypertens. 2000; 18:885-891. Mulvany J. Small artery remodeling in hypertension. Curr Hypertens Rep. 2002; 4:49-55. Lassgue B, Clempus E. Vascular NAD(P)H oxidases: specific features, expression, and regulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003; 285:R277-R297. Zhou S, Jaimes A, Raij L. Vascular but not cardiac remodeling is associated with superoxide production in angiotensin II hypertension. J Hypertens. 2005; 23:1737-1743.

282

283

284

285

Zimmerman M, Lazartigues E, Sharma R, Davisson R. Hypertension caused by angiotensin II infusion involves increased superoxide production in the central nervous system. Circ Res. 2004; 95:210-216

256 Bibliografa

286

Carter O, Narayanan K, Robinson P. Intracellular hydrogen peroxide and superoxide anion detection in endothelial cells. J Leukoc Biol. 1994; 55:253-258. Poliozio A, Balestrasse K, Yannarelli G, Noriega G, Gorzalczany S, Taira C, Tomaro M. Angiotensin II regulates cardiac hypertrophy via oxidative stress but not antioxidant enzyme activities in experimental renovascular hypertension. Hypertens Res. 2008; 31:325-334. Mollnau H, Wendt M, Szcs K, Lassgue B, Schulz E, Oelze M, Li H, Bodenschatz M, August M, Kleschyov AL, Tsilimingas N, Walter U, Frstermann U, Meinertz T, Griendling K, Mnzel T. Effects of angiotensin II infusion on the expression and function of NAD(P)H oxidase and components of nitric Oxide/cGMP signaling. Circ Res. 2002; 90:58-65.

287

288

289

Kerr S, Brosnan J, McIntyre M, Reid J, Dominiczak A, Hamilton A. Superoxide anion production is increased in a model of genetic hypertension. Role of endothelium. Hypertension. 1999; 33:1353-1358. Ying C, Xu J, Ikeda K, Takahashi K, Nara Y, Yamori Y. Tea poliphenols regulate nicotinamide dinucleotide phosphate oxidase subunit expresin and ameliorate angiotensin II induced hyperpermeability in endotelial cells. Hypertens Res. 2003; 26:823-828. Chaudiere J, Ferrari-Iliou R. Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms. Food Chem Toxicol. 1999; 37:949-962. Carr A, Frei B. The role of natural antioxidants in preserving the biological activity of endothelium-derived nitric oxide. Free Rad Biol Med. 2000; 28:1806 1814. Carr A, Zhu Z, Frei B. Potential antiatherogenic mechanisms of ascorbate (vitamin C) and alpha-tocopherol (vitamin E). Circ Res. 2000; 87:349 -354. Singhal K, Khaper N, Palace V, Kumar D. The role of oxidative stress in genesis of heart disease. Cardiovas Res. 1998; 40:426-432. De Bruyn H, Nuns W, Cappelli-Biggazzi M, Dole R, Lamping G. Effect of acute hypertension in the coronary vessels. J Hypertens.1994; 12:163-172.

290

291

292

293

294

295

Bibliografa 257

296

Pravicini T, Touyz R. Redox signaling in hypertension. Cardiovas Res. 2006; 71:247-258.

297

Touyz R. Oxidative stress in vascular damage in hypertension. Curr Hypertens Reports. 2000; 2:98-105. Hong H , Johnson P. Antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels in exercised and hypertensive rat tissues. Int J Biochem Cell Biol. 1995; 27:923-931. Binda D, Nicod L, Viollon-Abadie C, Rodriguez S, Berthelot A, Coassolo P, Richert L. Strain difference (WKY, SPRD) in the hepatic antioxidant status in rat and effect of hypertension (SHR, DOCA). Ex vivo and in vitro data. Mol Cell Biochem 2001; 218:139-146.

298

299

300

Kashyap M, Yadav V, Sherawat B, Jain S, Kumari S, Khullar M, Sharma P, Nath R. Different antioxidants status, total antioxidant power and free radicals in essential hypertension. Mol Cell Biochem. 2005; 277:89-99.

301

Kabell K, Ma L, Johnson P. Effects of antihypertensive drugs on rat tissue antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels. Biochem Pharmacol. 1977; 54:133-141. Elhameur F, Courderot-Masouyer C, Nicod L, Guyon C, Richert L, Berthelot A. Dietary vitamin C supplementation decreases blood pressure in DOCA-salt hypertensive male Sprague-Dawley rats and this is associated with increased liver oxidative stress. Mol Cell Biochem. 2002; 237:77-83. Galisteo M, Garca-Saura M, Jimnez R, Villar I, Zarzuelo A, Vargas F, Duarte J. Effects of chronic quercetin treatment on antioxidant defence system and oxidative status of deoxycorticosterone acetate-salt-hypertensive rats. Mol Cell Biochem. 2004; 259(1-2):91-99. Duarte J, Galisteo M, Ocete M, Prez-Vizcano F, Zarzuelo A, Tamargo J: Effects of chronic quercetin treatment on hepatic oxidative status of spontaneously hypertensive rats. Mol Cell Biochem. 2001; 221:155-160.

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Anexo 1 Sustancias utilizadas.

Soluciones nutricias 1. Solucin Krebs. En todas las preparaciones aisladas se utiliza esta solucin nutricia, preparada con componentes de calidad de anlisis (Merck o Panreac) que se disuelven en agua ultrapura (Labconco-Water Pro, P.S.). Su composicin (mM) es la siguiente: NaCl, 118,7; KCl, 4,7; CaCl2, 2,5; KH2PO4, 1,2; NaHCO3, 25,0; MgSO47H2O, 1,2; Glucosa, 11,1. Una vez gaseada con carbgeno se ajusta el pH a 7,4. 2. Solucin tampn HEPES. Esta solucin se prepara con componentes de calidad de anlisis (Merck o Panreac) que se disuelven en agua ultrapura (Labconco-Water Pro, P.S.). Se utiliz en los mtodos de cuantificacin de la produccin de O2- por quimioluminiscencia e in situ; su composicin (mM) es: NaCl 119; HEPES 20; KCl 4,6; MgSO4 1,0; Na2HPO4 0,15; KH2PO40,4; NaHCO3 5,0; CaCl2 1,2 y glucosa 5,5 a un pH de 7,4. Sustancias utilizadas 1. Agonistas. Para los estudios de funcionalidad de vasos sanguneos se preparan soluciones madre (1x10-1-1x10-2 M) de los agonistas utilizados que se congelan en alcuotas. Las soluciones usadas en los experimentos se preparan diariamente a partir de stas. Ver lista de sustancias en la parte inferior de este anexo. 2. El resto de sustancias utilizadas se preparan diariamente de acuerdo a las necesidades de los experimentos y en las concentraciones mencionadas en el

captulo de mtodos y resultados. Las sustancias usadas aparecen a continuacin: -1,1,3,3-tetrametoxipropano. Sigma-Aldrich - 4-dimetilaminobenzaldehdo. Sigma-Aldrich -4-hidroxi-3-metoxiacetofenona (Apocinina). Sigma-Aldrich -4,5-dihidroxi-1,3-benceno cido disulfnico (Tirn). SigmaAldrich -Acetato de angiotensina II. Sigma-Aldrich - Acetato de sodio trihidrato. Panreac -cido actico. Sigma-Aldrich -cido ctrico monohidrato. Panreac -cido tiobarbitrico. SigmaAldrich - cido tricloroactico. Merck -Alcohol etlico. VWR - Alcohol polivinlico /carbowax (O.C.T). Sakura Tissue Tek -Azida sdica. Sigma-Aldrich -Benceno. Merk - Bitartrato de noradrenalina. Sigma-Aldrich -cis-4 Hidroxi L prolina. Fluka -Citrato de sodio .Panreac -Cloramina T. Sigma-Aldrich -Clorhidrato de fenilefrina. SigmaAldrich -Cloruro de acetilcolina. SigmaAldrich -Cloruro potsico. Merk -Dihidroetidio (DHE). SigmaAldrich -Dimetil sulfxido.VWR - Dinitrato de N,N-dimetil 9,9biacridinio (lucigenina). Sigma-Aldrich - Dodecilsulfato de sodio (SDS). Fluka -EDTA de sodio. Sigma-Aldrich -Eosina. Panreac -Fosfato sdico. Panreac - Glutatin reductasa. SigmaAldrich - HCl. J T Baker -Hematoxilina. Panreac - Hidroperxido de cumeno. Sigma-Aldrich -Indometacina. Sigma-Aldrich -Isopropanol. Panreac -L-glutatin reducido. SigmaAldrich

-N-nitro-L-arginina metil ster (L-NAME). Sigma-Aldrich - N, N-cido dietil-ditiocarbamato de amonio (DDC). Sigma-Aldrich - NADPH. Sigma-Aldrich -NaOH. VWR -Nitroprusiato sdico dihidratado. Sigma-Aldrich -Reactivo de Bradford. SigmaAldrich -Xilol. VWR

Anexo 2 Expresin y anlisis estadstico de los resultados

Todos los resultados se expresan como media aritmtica el error estndar de la media (EEM) del nmero de experimentos especificado en cada caso. 1. Para comparar los valores obtenidos entre dos grupos se emple una prueba t de Student para datos no pareados considerndose diferencias significativas cuando p0,05 y diferencias altamente significativas cuando p0,01. 2. Para comparar los valores obtenidos entre ms de dos grupos se emple un anlisis de varianza (ANOVA) de una va y la prueba post hoc de NewmanKeuls. Considerndose diferencias significativas cuando p0,05 y diferencias altamente significativas cuando p0,01. 3. Para ajustar las curvas dosis respuesta, se utiliz el ajuste a un modelo logstico no lineal utilizando el programa Graph Pad Prism versin 4 (GraphPad software Inc. EEUU). En todas las curvas se obtuvo el valor del efecto mximo (Emax) y pD2 (logaritmo cambiado de signo de la concentracin del agonista que provoca el 50% del efecto mximo). Para comparar las curvas y sus parmetros se utiliz una prueba F de Snedecor.