Guia II Unida

UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA” DE ICA
Facultad de Medicina Humana “Daniel Alcides Carrión”
GUÍA DE
MICROBIOLOGÍA
II UNIDAD
BACTERIAS
DR. RAMOS RAMOS, Ronny Emiliano
PADIN SILVA, Sara Cristina Angelica
IV CICLO
ICA-PERU
2019
PRACTICA N° 11
DIACNOSTICO INMUNOLOGICO: REACCIONES

SEROLOGICAS DE AGLUTACION
Tradicionalmente el diagnostico definitivo pasa por la identificación, el aislamiento en

cultivo puro del patógeno, de este modo la morfología, actividad bioquímica y patrón
de sensibilidad a los antimicrobianos podrán ser examinados y evaluados. Sin embargo
algunos microorganismos no se pueden cultivar in vitro como Treponema pallidum,
Mycobacterium Leprae y en algunos otras enfermedades infecciosas un diagnóstico
serológico es mucho mas económico y ráp ido, pero no definitivo. Otra forma de
diagnostico es por la detección de un producto específico del agente infeccioso que no
puede formarse sin la presencia del agente en el material clínico obtenido del paciente.
El método serológico tradicional para el diagnóstico de enfermedades infecciosas

demuestra (mediante un aumento significativo del titulo) una respuesta de anticuerpos
específicos humorales contra el microorganismos en cuestión. Ejemplos de reacciones
serológicas de aglutinación son las pruebas p ara anticuerpos contra Brucella y
Salmonella que son parte de un panel de pruebas para aglutinaciones febriles.
Aglutinación bacteriana
Una de las aplicaciones de aglutinación bacteriana es la llamada prueba de
“Reacciones febriles” que esta basada en la investigación de la presencia de aglutininas
(anticuerpos) contra la fiebre tifoidea, La brucelosis y el tifo, que indican que el
individuo padece enfermedad o que ha estado en contacto con el germen (antígeno)
sin llegar a contraerla. Estas reacciones febriles comprenden la Reacción de W idal para
la fiebre tifoidea y paratifoidea, La Reacción de Huddlesson para la brucelosis y La
Reacción de W eil- Félix para el tifo.
Reacción de Widal
La reacción de W idal utiliza como antigeno una sepa de Salmonella Typhi en fase O
(o sea sin flagelos) y otra en fase H (flagelo). Además se tienen otros antigenos
Salmonella paratyphi A-B.
Reacción de Huddlesson
Se lleva a cavo con antigeno de Brucella abortus para detectar anticuerpos contra
fiebre de malta.
Reacción de WEIL-Félix
La reacción de W eil-Félix utiliza Proteus OX-19 como antígeno para detectar
anticuerpos contra Rickettsia prowaseki, debido a que posee los mismos antígenos y
por la facilidad de su manejo en el laboratorio.
Material.
 Suero de paciente
 Antigeno (tifico O y H, paratífico A y B, brucela, proteus OX -19.
 Láminas de vidrio para aglutinaciones
 Pipetas serológicas de 0,2 ml
 Palitos mondadientes
GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 1

Procedimiento.
Técnica cualitativa:
1. Colocar una gota de suero problema en cada uno de los espacios marcados en
la lámina
2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos sobre la gota de suero problema
3. Mezclar uniformemente con un mondadientes cada gota, rotar la lámina por 3

minutos y observa los resultados.
Lectura.
Positivo: Aparición de grumos de tamaño variables que tienden a agruparse en la

superficie de la gota.
Negativo: La mezcla permanece homogénea.
Técnica cuantitativa.
1. Con una pipeta de 0,2 ml. Depositar 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005 del suero
problema en la lámina.

2. Añadir una gota de antígeno que dio aglutinación en la prueba cualitativa a cada
cuota del suero.
3. Con el mondadientes mezclar y rotar la lámina durante 3 minutos.
Lectura:
Realizar la lectura teniendo en cuenta la presencia de grumos de acuerdo a la siguiente
equivalencia:
Suero problema: Título:
0.08 ml 1/20
0,04 ml 1/40
0,02 ml 1/80
0,01 ml 1/160
0,005 ml 1/320
Títulos mayores de 1/80 tienen significación diagnóstic o.
Resultados:
Títulos de Suero
Antigeno
1 2 3
Tífico O
Tífico H
Paratífico A
Paratífico B
Brucella
Proteus OX-19

CUESTIONARIO:
1. Explique alguna (s) desventajas en el diagnóstico serológico

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2. ¿Qué es título en serología?

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3. ¿Qué enfermedades a parte de las ya mencionadas , se diagnostica mediante

serología?
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4. Mencione otras pruebas usadas para el diagnóstico inmunológico.

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5. Señale en que condiciones las pruebas de W idal y Huddlesso n, puede comportarse

como falso negativo y falso positivo.
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PRACTICA N° 12
CONTROL MICROBIANO: ACCION DE LOS AGENTES

FISICOS Y QUIMICOS
El crecimiento de los agentes infecciosos causales de las enfermedades y de sus

mecanismos de transmisión trajo como consecuencia muy importante la posibilidad de
tomar medidas para su control. La inhibición del crecimiento y la destrucción de
microorganismos patógenos se realizan ya sea por medios físicos o químicos. Algunos
métodos de control microbiano solo se aplica a objetos inanimados, en tanto que otros
muestran una toxicidad selectiva y pueden utilizarse in vivo.
Agentes físicos:
El control de microorganismos potencialmente patógenos en el ambiente, se lleva a
cabo por métodos físicos mediante la desinfección o la est erilización. Entre estos
tenemos:
a. Calor.
El calor es el método de elección mas usada para la esterilización de todos los
materiales, excepto los que puedan ser alterados por el.
 Llama directa.-Para estirilizacion del asa bacteriológica.
 Esterilización con calor seco.-Se hace uso del horno, para esterilizar
materiales como placas Petri.
 Esterilización con calor húmedo.-Se usa el autoclave, el papel del agua en la
desnaturalización de proteínas por el calor se evidencia en la utilización del
vapor de agua. Se utiliza para esterilizar muestras clínicas.
 Pasteurización.-consiste en el calentamiento a 62°C durante 30 minutos tres
veces. Se utiliza en alimentos.
b. Congelación.
Los cristales de hielo pueden lesionar a las bacterias.
c. Radiación ultra violeta. Cuando se usan radiaciones de onda cada vez mas cortas
a partir de 330 nm se produce estirilizacion bacteriana, la luz UV lesiona el DNA
bacteriano que impide su replicación. Estas radiaciones tienen acción esterilizante
sobre la mayoría de los microorganismos y se les emplea en ambientes quirúrgicos,
cubilos bacteriológicos ya que su acción se limita a superficies o partículas
suspendidas en el aire.
d. Radiaciones ionizantes. Pueden utilizarse fuentes de radiactividades intensas
para esterilizar materiales hospitalarios, alimentos, etc. pero sobre todo en estos
últimos, donde deben utilizarse dosis elevadas (millones de Rad.) alteran
notablemente el sabor de los alimentos.
Agentes mecánicos:
a. Ondas sónicas y supersónicas.- Los ultrasonidos (con frecuencias que oscilan

entre 15,000 y varios centenarios de miles de vibraciones por segundo)
desnaturalizan proteínas y destruyen bacterias.
b. Filtración.- Si se utilizan filtros con poros menores de 1nm, se pueden obtener
filtrados libres de bacterias. Esto se utiliza con soluciones que no se pueden
esterilizar con calor.

Agentes Químicos:
La acción de las sustancias químicas sobre los microorganismos varia dependiendo de
la composición fisicoquímica del medio ambiente, la concentración, la temperatura y el
tiempo que dura este contacto. En relación al efecto biológico se tiene una acción
“bactericida”, es decir, destrucción de la bacteria; y una acción “bacteriostática”, ósea
que inhibe el crecimiento bacteriano. Dentro de los agentes químicos tenemos a los
desinfectantes, aquellos que son utilizados en superficies inanimadas y antisépticos
usados sobre piel.
 Metales pesados
 Halógenos
 Agentes alquilantes
 Agentes con propiedades tensioactivas o tensoactivas
 Fenoles
 Alcoholes
Material.
 Cultivos bacterianos de Bacillus, E.coli, Salmonella, Pseudomonas.

 Tubos con caldo BHI o nutritivo, pH7, pH9, pH3
 Placas con agar BHI o nutritivo
 Discos estériles de papel de filtro
 Pinza estéril
 Hisopos o torundas estériles
 Frascos con alcohol, fenol, mertiolate, mercurio cromo, violeta de genciana.
 Asa bacteriológica
Procedimiento.
1. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo pH7 por agitación, incubar por 18 -24 hrs.,
uno a 60°C, otro a 37°C, y finalmente otro a -8°C.
2. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo o BHI, uno a pH7, otro a pH9 y otro a
pH3, incubar todos a 35-37°C por 18-24 hrs.

3. Introduzca un hisopo estéril es la cepa bacteriana, y siembre en tod a la superficie
de la placa con agar BHI o nutritivo, deje reposar 5 minutos y proceda a colocar los
discos de papel de filtro embebidos en los diferentes desinfectantes y antisépticos
(un disco para cada desinfectante o antiséptico) coloque una a distanci a prudente
del otro. Luego incube las placas a 35-37°C por 18-24 hrs.
Resultados.
1. En los tubos incubados a diferente temperatura observe si hubo crecimiento por la

presencia o ausencia de turbidez. Explique a que se debe ese resultado.
2. En los tubos sembrados a diferentes pH, también observe si hubo crecimiento por
la presencia y ausencia de turbidez, anote los resultados y explique el por que.
3. Observe alrededor de los discos impregnados con cada uno de los deferentes
antisépticos o desinfectantes, si hay o no un halo alrededor, que demuestra si el
agente químico es eficaz o ineficaz para actuar contra el microorganismo. Anote
todos los resultados y explique por que algunos químicos son eficaces y otros no.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué bacterias son más resistentes al calor?

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2. ¿Qué agente químico era utilizado por Lister, hoy en día se sigue
Usando?
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3. ¿Qué antisépticos son los más usados?

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4. ¿Qué desinfectantes son de uso común en el laboratorio?

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PRACTICA N° 13 Y 14.
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO ANTIBIOGRAMA
El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente con frecuencia no es

suficiente para establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos
presentan resistencia a los agentes antimicrobianos y algunos virus han desarrollado
resistencia a los agentes antivirales más nuevos. Los patrones de resistencia cambian
en forma constante. No importa cuan rápidamente se introducen los nuevos agentes
terapéuticos, los microorganismos parecen estar dispuesto a sobrepasarles.
Cuando no se conoce o no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos
y virus a los agentes antimicrobianos, es nec esario estudiar la sensibilidad individual
de cada agente a estas drogas, pudiendo elegir entonces el agente adecuado (el mas
activo contra el patógeno, el menos toxico para el huésped, con la características
farmacológico apropiadas el mas económico y que se encuentre en el mercado), que
proporciona mayores posibilidades de una evolución favorable. El clínico toma la
decisión final, contando con los resultados obtenidos in vitro enfermedad subyacente,
condición clínica del paciente, la administración de ot ros agentes terapéuticos,
experiencia clínica y otros factores.
Para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro, es necesario emplear un inóculo

estándar que contenga 10 6 a 10 8 microorganismo por ml; un medio de cultivo que no
interfiere con la eficacia de los antibióticos ni con el crecimiento del microorganismo,
en cantidad conocida y un pH regulado como el Miuller Hinton en caldo o Agar medio
suplementado con los cationes magnesio y calcio.
Método de dilución en caldo

Método que sirve para evaluar cuantitativamente la actividad de un antibiótico. Se
colocan concentraciones decreciente del agente antimicrobiano, generalmente
diluciones al medio (1:2), en tubos con caldo de cultivo Miuller Hinton que sostendrá el
desarrollo del microorganismo, luego se inocula el microorganismo. Un tubo de caldo
se mantiene sin el antibiótico y es conocido como el control, luego se llevan a incubar
todos los tubos y al día siguiente se observa la turbidez que indicara desarrollo
bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que no
contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir el desarrollo. La
concentración mas baja que impide el crecimiento bacteriano se considera
concentración inhibitoria mínima (CIM) del fármaco y est a es detectada por falta de
turbidez.
Material.
 Cultivo bacteriano que contenga 10 6 - 10 8 microorganismo por ml.

 Solución de antibiótico que contenga 1000 unidades
 Tubos 13x 100 ml. Estériles
 Pipetas estériles
 Caldo Miuller Hinton

Procedimiento.
 Colocar 10 tubos 13x100 ml estériles enumerados del 1al 10.
 Diluir el antibiótico que contenga 1000 U. en proporción 1:5 en caldo,

obteniendo una concentración 200 u. por ml.
 Con una pipeta estéril colocar 0.5 ml del caldo en los tubos marcados d el 2 al
10.
 Agregar 0.5 ml del antibiótico a los tubos 1 y 2, mezcle el contenido del segundo
tubo y trasvase 0.5 ml al tubo 3, continuando de igual forma hasta el 9no tubo.
Retirar 0.5 ml del 9no tubo y descartar; el 10mo no recibe antibiótico y si rve
como control.
 Agregue 0.5 ml de la cepa bacteriana a todos los tubos

Incubar a 35-37°C por 24 horas
Resultado.
 Realice la lectura e interprete los resultados obtenidos.

 Determine la CIM del fármaco estudiado.
 Determine si el microorganismo probado es sensible o resistente al fármaco
probado haciendo uso de la tabla.
 Interprete correctamente el resultado obtenido

Método de difusión de Agar.
Conforme se dispuso de mayor numero de agentes antimicrobianos para el tratamiento
de una gran variedad de bacterias, se hicieron aparentes las limitaciones del macro
método de dilución en caldo. Por este método se prueba simultáneamente un germen
aislado de un paciente frente a mas de un agente antimicrobiana, y esto se consigue
inoculando la superficie de la placa de agar Miuller Hinton con el microorganismo en
estudio, transcurrido 5 minutos se procede a colocar los discos de antibióticos (con
una concentración conocida) equidistante uno de otro, los antibióticos difunden en el
medio en forma radial alrededor del disco e inhibe el desarrollo microbiano en la zona
donde su concentración es suficientemente alta (halo de inhibición), trascurrido la
incubación a 35-37°C por 24 hrs. Este método también es conocido como disco-difusión
y es una técnica cualitativa. En 1966 después del estudio Kirby -Bauer y otros se
uniformizaron criterios y se estandarizó la prueba tomando en cuenta los conceptos de
concentración mínima inhibitoria (CIM ) y la co ncentración promedio en sangre de las
drogas frecuentemente usadas.
Material.
 Placas con agar Miuller Hinton

 Disco de antibióticos
 Torundas estériles
 Pinzas estériles
 Cepa bacteriana en caldo con una concentración de 10 6 – 10 8 microorganismo
por ml
Procedimiento.
 Introduzca la torunda en la cepa bacteriana, escurrir oprimiendo contra las

paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de Agar
Miuller Hinton.
 Dejar reposar 5 minutos y colocar con la ayuda de la pinza los di scos de

diferente antibióticos en la superficie del Agar y presionarlos suavemente.
 Los discos deben estar equidistantes unos de otros

Incube a 35°C 24 hrs.

Resultados
 Para realizar la lectura, mida el halo de cada disco de antibiótico en mm,

conocidos los diámetros utilice la tabla para categorizar si el microorganismo
es sensible, moderadamente sensible o resistente a los diferentes antibióticos.
 Explique cual es o son los mejores antibióticos según el antibiograma in vitro.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué es limite crítico de un agente antimicrobiano para este tipo de prueba?

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2. ¿ La CIM y CBM ( concentración bactericida mínima ) de un agente antimicrobiano

son iguales?. Explique.
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PRACTICA N° 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Staphylococcus.
El genero Staphylococcus es miembro de la familia micrococaceae; forman parte de

la flora microbiana normal de la piel y mucosas del hombre y en ciertas circunstancias
pueden comportarse como patógeno. El Staphylococcus aureus (en general
estafilococos coagulasa positivos) ha sido reconocido históricamente como un
patógeno humano virulento e importante causante de abscesos, diversas infecciones
piogénas, neumonía, endocarditis e incluso septicemia mortal. También durante los
últimos años los estafilococos coagulasa negativos han surgido como patógenos
importantes, principalmente de huéspedes deficientes incluyendo pacientes con algún
tipo de prótesis, estos son los Staphylococcus epiderminis, los Staphylococcus
saprophyticus son responsables de ITU en mujeres jóvenes. Últimamente los
estafilococos coagulasa negativos son responsables de bacteriemia en pacientes
neutropénicos, de infecciones relacionadas con catéteres permanentes.
Los antifilococos son cocos esféricos, grampositivos, inmóviles, aerobios anae robios
facultativos y Catalasa positivo, no esporulados, agrupados en racimos, tetradas o
aislados. Crecen en cualquier medio de cultivo que permita el desarrollo de los
grampositivos, dando colonias redondas, opacas y lisas, por lo general consistencia
cremosa.
Material
 Placas con Agar sangre

 Placas con Agar Manitol hipertónico o baird Parker
 Láminas portaobjeto
 Set de colorantes Gram.
 Tubos con caldo tioglicolato
 Plasma citratado
 Disco de novobiocina
 Peróxido de hidrógeno
 Asa de kolle
 Muestra clínica: Absceso, S. nasal, ántrax.etc.
Procedimiento
 Examen directo de la muestra clínica. Realizar una Tinción Gram de la

muestra y buscar cocos Gram +.

 Cultivo.
a. Enriquecer en caldo tioglicolato, inoculando la muestra previamente incube
a 35-37°C x 18-24 hrs.
b. Aislar en Agar sangre y/o Agar Manitol hipertónico u otro medio selectivo,
sembrado por estiras y agotamiento en 4 cuadrantes: Incube a 35 -37°C x
18- 24 hrs.
c. Identificación:
1. Identificación preliminar de las colonias tí picas de Staphylococcus.
2. Observación de la morfología bacteriana mediante una coloración Gram
a partir de la colonia seleccionada.
3. Pruebas bioquímicas o enzimáticos
Realizar las pruebas de:
 Catalasa
 Coagulasa
 Hemolisina
 Resistencia a la novobiocina

Resultado
 Anotar lo obtenido en el examen directo

 Anotar el crecimiento en caldo tioglicolato
 Describir las colonias típicas de los diferentes Estafilococos según el medio en
el que se aislado, luego la morfología microscópica bacteriana y las reacciones
en las pruebas bioquímicas
 Anotar el Staphylococcus aislado e identificado y si hay correlación con el ex.
Directo
CUESTIONARIO.
1. ¿Qué característica tiene el tioglicolato que permite crecer a estafilococos?

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2. Qué otras pruebas se utilizan para confirmar la identificación de S. aureus?

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3. Si aísla S. epidermidis de lesión a nivel de piel, ¿Consideraría el patógeno?,

explique.
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4. ¿Qué otras especies de estafilococos coagulasa negativos son de importancia

clínica?
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PRACTICA N° 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION Streptococcus Pyogenes
Los miembros del genero Streptococcus son cocos Gram. Positivo, Catalasa negativos
que tienden a crecer desarrollando cadenas en los medios líquidos, son anaer obios
facultativos, son miembros de la FMN y además de agentes etiológicos, de varios
enfermedades graves como faringitis exudativa es treptocócica infecciones de herida,
piel y abscesos. La fiebre reumática aguda y la glomerulonefritis posestreptocócica son
secuelas secundarias de una infección por Streptococcus Pyogenes. En Agar sangre
forman colonias betas hemolíticas, pequeñas, ci rculares, transparentes a lechosas,
aunque existen variantes.
Material
 Placas con Agar sangre y otros con medio selectivo CNA

 Tubos con caldo tioglicolato
 Láminas portaobjetos
 Set de Gram.
 Discos de bacitracina
 Muestra clínica: hisopado faríngeo
Procedimiento
 Examen directo de la muestra clínica: Realizar un Gram. o determinación del

carbohidratos de la pared o antigeno de grupo, utilizando un suero que contiene
los anticuerpos contra estos antígenos
 Cultivo:
a. Enriquecer la muestra en caldo tioglicolato, in oculando el espécimen clínico
en el medio de cultivo y dejar incubar a 35 -37°C por 18-24 hrs.
b. Aislar en Agar sangre y CNA, sembrando por estría y agotamiento e
incubando a 35-37°C por 18-24 hrs.
c. Identificación:
1. El paso inicial de la identificación es realizar un examen cuidadoso de la
morfología de la colonia.
2. Realice un Gram. de la colonia y observe la morfología bacteriana
microscópica.
3. Pruebas bioquímicas o enzimáticas.
Realizar las siguientes pruebas:
 Catalasa
 sensibilidad a la bacitracina
 determinación los carbohidratos de la pared celular o antigeno de
grupo.

Resultados:
 Anotar los resultados obtenidos en el examen directo.

 Anotar características del crecimiento en caldo tioglicolato.
 Describir las colonias típicas del S. Pyogenes, morfología microscópica y
reacciones bioquímicas.
 Anotar si el resultado definitivo se correlaciona con el examen
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué hemolisina es responsable de la zona de hemólisis?

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2. señale otras pruebas bioquímicas que permiten identificar al S. Pyogenes.

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3. ¿Qué es ASO, y explique la importancia?

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PRACTICA N° 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Streptococcus

pneumoniae
Al igual que los S. Pyogenes, son cocos lanceolados Gram positivos, que se pueden
presentar en pareja o formando cadenas c ortas, encapsulados, se encuentran en la
flora nasofaringea y oro faríngea normal de muchos niños y adultos, son alfa
hemolíticos es decir en Agar sangre desarrollan colonias pequeñas con un halo de color
verde, por eso también se denomina hemólisis parcia l, estas colonias tienen aspecto
mucoide y lustroso, y con tendencia a hundirse en el centro al prolongarse el tiempo
de incubación debido a la acción de enzimas autolíticas.
Material
 Placas de Agar sangre

 Láminas portaobjetos
 Set de Gram.
 Peroxido de hidrogeno
 Disco de etilhidrocupreina u optoquinona
 Muestra clínica: Esputo
Procedimiento
 Examen directo de la muestra clínica.- Realizar un Gram. de la muestra directa

o la prueba de Quellung previamente y luego llevar al microscopio.
 Cultivo
a. Inocular la muestra en Agar sangre por estría y agotamiento, dejar incubar
por 18-24 hrs. a 35-37°C.
b. Identificación :
1. Pasado las 18-24 hrs., reconocer las colonias típicas.
2. Hacer una frotis de la colonia y teñir con Gram.
3. Realice las pruebas bioquímicas.
 Catalasa
 Sensibilidad a la optoquinona
 Solubilidad en bilis
Resultado
 Anotar lo obtenido en el examen directo.

 Describir las colonias típicas, morfología microscópica y reacciones bioquímicas.

PRACTICA N° 18
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Neisseria
La familia Neisseriaceae incluye varios géneros entre ellos el género Neisseria y

Branhamella. La Neisseria son cocos gramnegativos. Algunas Neisserias son
comensales y otras como N. gonorrhoeae y N. meningitidis son patógenos. En un
frotis de muestra clínica coloriado con Gram., estos microorganismos se presentan
como diplococos de forma arriñonada (o granos de café) y se puede n observar dentro
de los neutrófilos polimorfonucleares, esta presentación se conoce como diplococos
intracelulares gramnegativos y contribuyen a la identificación de una verdadera
infección .
Aunque estos cocos son aerobios estrictos desarrollan mejor en un medio enriquecido
con atmósfera de 2-10% de co2. Las Neisseria patógenas son muy sensibles a las
variaciones de temperatura, por la que las muestras clínicas deben ser inoculadas lo
más pronto posible. Luego de 24-48 hrs. de incubación la N. gonorrhoeae forma
colonias pequeñas (0.5.- 2 mm), traslucidas, grisáceas, convexas, brillantes, con
bordes lisos, con frecuencia se despegaran completamente de la superficie del Agar
y pueden ser mucoides o gomosas. Son autolítico
Material
- Placas con agar chocolate y Thayer Martín modificado

- Láminas
- Set. De Gram.
- Reactivo para Oxidasa
- Muestra: Uretral, cervix y canal anal y de otros locali zaciones LCR.
Procedimiento
 Examen directo de la muestra clínica.- Hacer un frotis de la muestra y teñir

con Gram.
 Cultivo
a. Sembrar la muestra en agar chocolate y/o Thayer Martín modificado por
estría y agotamiento para obtener colonias aisladas, incubar 24 -48 hrs. a
37°C y con CO2 2-10%.
b. Identificación:
1. Identificar las morfologías típicas de las colonias
2. Realizar un Gram. de estas colonias.
3. Realizar las siguientes pruebas bioquímicas o enzimáticas.
- Test de oxidasa
- Fermentación de glucosa, maltosa, fructuosa, Sacarosa, Lactosa.

Resultados
- Anotar los resultados obtenidos en el examen directo.

- Describir las colonias típicas aisladas, morfología microscó pica y reacciones
bioquímicas.
CUESTIONARIO:
1. Las Neisserias patógenas desarrollas a 22°C.

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2. ¿Cómo se encuentran localizadas los gonococos en los PMN en un proceso agudo

y crónico?
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PRACTICA N° 19
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae son los que se aíslan con
mayor frecuencia de las muestras clínicas, son bacilos gramnegativos, desarrollan bien
en Agar sangre, chocolate y forman colonias distintas en los medios selectivos qu e
permiten su crecimiento dependiendo de sus propiedades y de los componentes, del
medio. Algunas especies son patógenas clásicas y su sola presencia en las muestras
clínicas los señalan como agentes etiológico de enfermedad, independientemente del
numero de unidades formadoras, otras especies pueden colonizar sin estimular
ninguna patología, como las que colonizan el tracto intestinal. Si estos
microorganismos “comensales”son introducidos en algún sitio susceptible (como
cavidad peritonial, pulmones de un huésped inmunosuprimidos, LCR, etc.). Son
capaces de provocar enfermedad.
UROCULTIVO
Uno de los cultivos más comunes que se solicitan a un laboratorio son los cultivos de
orina. Se calcula que aproximadamente 20% de las mujeres tienen una ITU por lo
menos una vez en la vida, en los hombres es muy bajo, pero aumenta después de los
60 años donde la hipertrofia prostática facilita el desarrollo de ITU. Ciertos
microorganismos colonizan la uretra anterior por lo tanto son considerados como FMN,
así tenemos a los estafilococos coagulasa negativos, estreptococos no hemolíticos y
del grupo viridans, lactobacilos, difteroides, Neisserias saprofitas micobacterias
saprófitas y otros bacilos gramnegativos. Puesto que con los métodos no invasores
para recolectar la orina se obtienen una muestra que a pasado por un medio
contaminado, la interpretación de los resultados de los cultivos de dichas muestras
requiere la aplicación de algunos criterios discriminatorios.
La mayoría de infecciones que afectan las vías urinarias son adquiridas por vías
ascendentes y muy pocas por vías hematógena, linfática o vía descendente. Las
bacterias que se aíslan mas a menudo son E. coli, Klebsiella, Enterobacter y S.
Saprophyticus.
Material.
- Láminas portaobjetos y cubre objetos

- Tubos de ensayos limpios
- Asa bacteriológica
- Placas con agar sangre, Mac Conkey, Manitol Hipertó nico
- Set de Gram.
- Muestra : Orina patológica
Procedimiento.
I. Pruebas de selección rápida de las muestras para ITU.

Son pruebas de diagnostico presuntivo:
 Gram de gota fresca (Washington)
Colocar una gota de orina total en una lamina portaobjetos, dejar sec ar y
colorear con Gram, observar al microscopio a 1000 x.
 Prueba de Griess
Se introduce una cinta o tira reactiva en el espécimen.

 Sedimento urinario
Colocar en un tubo de ensayo limpio 6 ml de orina, centrifugar por 3 minutos a
2500 RPM; decantar y colocar una gota del sedimento en una lamina
portaobjeto, cubrir con laminilla y observar a 400 x.
II. Cultivo – Urocultivo.

Una vez que se ha clasificado la orina como presuntamente patológico se procede
a sembrar en el medio de cultivo elegido con un asa bacteriológica calibrada, se
incuba a 35-37°C generalmente por 18-24 hrs. y se realiza la lectura. Luego la
identificación bioquímica sembrando en TSI, LIA, citrato et c. y las pruebas de
sensibilidad a los antimicrobianos
Resultados
- En la técnica de Washington se debe observar 01 microorganismo por 20 campos

que vendría a considerarse bacteriuria significativa por lo tanto orina
presuntamente patológica.
- En la prueba de sedimento urinario se debe observar de 5 -10 leucocitos por
campo, bacterias, hematíes y otros de menor importancia.
- En el cultivo se debe realizar el recuento de colonias en unidades formadores de
colonias por mililitros de orina (UFC/ml d e orina) en toda la placa, luego se
multiplica por el factor del calibre del asa de siembra y se debe interpretar
dependiendo del tipo de muestra.
UFC/ml. de orina = N° de colonias totales x factor del asa

A. Muestra chorro medio:
- Urocultivo negativo : <10,000 UFC/ml de orina
- Urocultivo dudoso de : 10,000 a 100,000 UFC/ml de orina.
- Urocultico Positivo : > 100,000 UFC/ml de orina
B. Muestra punción suprapúbica: En este caso cualquier número es importante.

C. Muestra por cateterización vesical. Recuentos mayores de 100 UFC/ml de
orina se considera positivo
- Finalmente se realiza la identificación interpretando la reacción de las diferentes

pruebas bioquímicas y anotando a que droga es sensible el patógeno
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué microorganismos están implicados en una ITU vía hematógena?

…………………………………………………………………………………………………………
………..
…………………………………………………………………………………………………………
………..
2. Indiqué aproximadamente con que frecuencia las enterobacterias son agentes

casuales de ITU.
…………………………………………………………………………………………………………
………..
…………………………………………………………………………………………………………
………..
3. ¿Qué significa bacteriuria y piuria significativa?

…………………………………………………………………………………………………………
………..
…………………………………………………………………………………………………………
………..
4. ¿Por qué en una muestra de orina obtenida por punción suprapúbica, cual quier
número de bacterias aisladas se considera patológico?
…………………………………………………………………………………………………………
………..
…………………………………………………………………………………………………………
………..

PRACTICA N° 20
COPROCULTIVO
Viene a ser el cultivo de las heces con la finalidad de aislar a patógenos intestinales
como Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, Vibrio cholerae, E. coli
patógenos. Se utiliza medios en algunas ocasiones para enriquecer las muestras y
otros se aíslan directam ente en medio selectivos o altamente selectivos, estos medios
tienen capacidad de inhibir el desarrollo de la flora acompañante. Los patógenos
intestinales son generalmente lactosa negativos excepto las E.coli patógenos.
Material
- Muestras de heces diarreicas o hisopado rectal.

- Tubos con caldo selenito y agua peptonada alcalina.
- Placas con Agar Mac.Conkey.
- Placas con agar Eosina Azul de metilino.
- Placas con Agar Salmonella - Shigella
- Tubos con TSI, citrato, Urea, agua peptonada, SIM.
- Asa bacteriológica.
- Placas con agar TCBS.
- Reactivo de Oxidosa
Reactivo de Kowac’s.
- Desoxicolato de sodio al 0.5%
Procedimiento
a. Enriquecimiento de la muestra.
Inocular una asada de heces o introducir el hisopo en caldo Selenito si se deja
enriquecer la muestra para Salmonella, Shigella o APA si se desea enriquecer
para Vibrio cholerae.
Incubar 6-12 horas a 35-37°C.
b. Aislamiento
A partir de la muestra enriquecida (Selenito) sembrar por estría y agotamiento en
placas de MacConkey, EMB y SS si desea aislar Salmonella y en TCBS a partir del
APA, si se desea aislar Vidrio Cholerae. Incubar 18 -24 horas a 35-37°C.
c. Identificación
- Si en los medios MacConkey, SS, y EMB se obtienen colonias lactosas
negativas se consideran sospechosas de ser algún patógeno intestinal. Y si en
el TCBS se observan colonias amarillas sacarosas positivas, se considera
sospechoso de Vibrio cholerae.
- Se realiza la identificación microscópica realizando un Gram de la colonia.
- Luego se realiza la identificación enzimático o bioquímica para Salmonella,
Shigella: Apartir de la colonia sospechosa se siembra en TSI, LIA, citrato, urea,
caldo peptonado, SIM.Incubar 18-24horas a 35-37°C.
Para tipificar se usa serologia.
Vibrio cholerae: A partir de la colonia sospechosa se realiza oxidasa y String
Test. Si resulta positivas las pruebas se procede a sembrar en TSI, LIA, citrato,

urea, caldo peptonado, SIM. Luego se incuba por 18-24 hrs a 35-37°C. Para
tipificar se usa serología.
Resultados
- Anotar las características de las colonias sospechosas de ser algún patógeno

en los diferentes medios de aislamiento indicando el posible patógeno.
- Anotar las características microscópicas de la colonia.
- Anotar el comportamiento bioquímico y concluir si se identifico o no el patógeno.
CUESTIONARIO.
1. ¿Si se desea mantener la muestra de heces por más de 2 horas, cual es

procedimiento ideal?
…………………………………………………………………………………………………………
………..
…………………………………………………………………………………………………………
………..
2. ¿Cuál es la finalidad incubar en los medios de enriquecimiento solo 6 a 12 horas?

…………………………………………………………………………………………………………
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…………………………………………………………………………………………………………
………..
3. ¿Qué características tienen las muestras de heces generalmente para un

coprocultivo?
…………………………………………………………………………………………………………
………..
…………………………………………………………………………………………………………
………..

PRACTICA N° 21
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Mycobacterium

Tuberculosis
Las micobacterias han causado enfermedad en el hombre desde el comienzo mismo

de la época histórica; en momias egipcias han sido identificadas claramente lesiones
causadas por micobacterias. Mycobacterium tuberculosis, es el agente causal de la
tuberculosis y es responsable de un gran número de muertes y de una gran morbilidad
en muchos países. La pared celular de las bacterias contiene ácido mícólico que son
ácidos grasos de cadena larga con múltiples uniones cruzadas. Los ácidos micólicos
hacen que sea difícil colorear su pared y le confiéren la características de ácido alcohol
resistencia. Otra micobacteria de importancia es Mycobacterium Leprae,
microorganismos mismo no cultivable in Vitro. Estos microorganismos son aerobios
inmóviles.
La investigación bacteorologica en tuberculosis comprende la realización de la

baciloscopía, cultivos, pruebas de sensibilidad y tipificación.
Material
- Muestra de esputo de pacientes sospechosos de tuberculosis

- Tubos con medio de ogawa
- Láminas portaobjetos nuevos
- Set. De colorantes Ziehl Neelsen
Procedimiento.
 Examen directo
Es una herramienta fundamental rutinaria para el diagnóstico de la tuberculosis y
el seguimiento del tratamiento de los pacientes con tuberculosis.
El examen directo de esputo se realiza mediante la coloración Ziehl Neelsen
denominado Baciloscopía, tiene una especificidad del 98% y sensibilidad del 60 -
80%.
Otros métodos directos son Kinyoun y Rodamina -auromina
 Cultivo
a. El cultivo de Mycobacterium Tuberculosis permite diagnosticar los casos
que presentan baciloscopía negativa, y aporta hasta un 20% más de
conformidad bacteriológica (especificidad del 100% y sensibilidad del 80 -
90%).
Antes de la siembra se debe de descontaminar las muestras que así lo

requieran, como esputo y otras contaminadas, para ello se procede a
agregarle igual cantidad al de la muestra de un álcali como el NaOH por un
tiempo promedio de 20 minutos, durante ese t iempo se debe hacer
centrifugado e incubado en baño Maria acto seguido siembran y las muestras
como LCR se siembran directamente.Se deja incubar a 37°C hasta 60 días.

b. Identificación
1. Calificar las colonias típicas que deben haber desarrollado transcurrido

las 8 días a mas, con las siguientes características: Colonias secas,
rugosas, polimorfas y con dimensiones muy variables de color crema y
excepcionalmente algo rosado “cabeza de coliflor”.
2. Realizar la identificación microscópica, haciendo un Ziehl Neels en de la

colonia.
3. Realizar las pruebas bioquímicas:

- Test. de niacina
- reducción de nitratos
actividad Catalasa
- Hidrólisis del Tween 80
- Reducción de telúrico
Resultados
- Cuantificar los BAAR en el Ziehl Neelsen del examen directo.

- Cuantificar las colonias:
(-) no se observan ninguna colonia
No de colonias totales cuando son menos de 20
(+) De 20 – 100 colonias
(++) Mayor de 100 colonias
(+++) Toda la superficie
CUESTIONARIO:
1. Mencione cuales son las muestran que en la actualidad se remiten para cultivo d e
M. Tuberculosis.
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………..
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………..
2. ¿si tiene un SR, cuantas veces como mínimo debe remitir la muestra al laboratorio
para los análisis respectivos?
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………..
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…
3. ¿en aquellos pacientes que por diversas causas no producen esputo, cual es la
muestra ideal, si se sospecha de tuberculosis pulmonar?
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………………..

PRACTICA N° 22
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Treponema pallidium
El género Treponema incluye especies no patógenas y patógenas como el Treponema

causante de sífilis, pinta, pian y bejel. Las cepas virulento de estas espiroquetas son
de dificil cultivo, solo se pueden cultivar en testículo de conejo o almohadilla plantar
del ratón, en 1981 Fieldsteel y Col. obtuvieron el cultivo de T. pallidum, biotipo
pallidum, agente causal de la sífilis, empleando un cultivo celular muy complejo
constituido por monocapas de fibroblasto. S on microorganismos microaerófilos,
Gramnegativos. Como el microorganismo no es cultivable por métodos convencionales,
el diagnóstico de laboratorio se realiza básicamente por serología, visualización en
microscopio de campo oscuro y la sintomatología clínica.
En la muestra de una lesión primaria de sífilis en la fase precoz denominada chancro
sifilítico se puede observar la prese ncia de espiroquetas móviles con un microscopio
de campo oscuro.
Pruebas Serológicas
I. Pruebas no treponémicas.
Son de gran sensibilidad y baja especificidad, de fácil ejecución, bastante usado en
Screning, pueden ser cualitativos y cuantitativos, pueden da r falsos positivos que
pueden ser atribuidas a una variedad de condiciones agudas o crónicas como
embarazo, lupus eritematoso etc.las pruebas no treponémicas son VDRL y RPR.
II. Pruebas treponémicas

Es más específica, se usa para confirmar al diagnóstico sero lógico de sífilis si la
prueba resultara positivo con las pruebas no treponémicas. Dentro de ellos
tenemos:
- FTA – ABS
- TPI
- Hemoaglutinación
Material
 Muestra: suero sospechoso

 Reactivo de RPR, VDRL y controles
 Micropipetas o pipetas automáticas
 Láminas de vidrio con hoyos
Procedimiento Cualitativo
1. Colocar 50 ul (1 gota) de suero muestra en un círculo de la lámina

2. Añadir al lado de la anterior 20 ul de suspensión de reactivos RPR o UDRL.
3. Mezclar ambas gotas y rotar durante 4 minutos con VDRL y 8 minutos con RPR.
4. La técnica con VDRL se lleva al microscopio y se observa si hay floculación o

agrupación y la técnica RPR se observa a simple vista
Resultado
Reactivo: Presencia de floculación

No reactivo: ausencia de floculac ión
Para determinar el título se debe de usar la técnica en forma cuantitativa, haciendo uso
de tubos.
Tubo 1 Tubo2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
-0.5 ssf - 0.5 ssf - 0.5 ssf -0.5 ssf - 0.5 ssf
-0.5 suero - 0.5 del T. 1 - 0.5 del T. 2 - 0.5 del T. 3 -0.5 del T. 4
1 : 2, 2 dils 1:4, 4 dils 1:8, 8 dils 1:16, 16 dils 1:32, 32 dils
CUESTIONARIO.
1. Mencione cinco casos que puedan dar pruebas falsas positivas en RPR.
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2. ¿En que casos esta indicado la prueba de FTA – ABS?

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UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA” DE ICA

Facultad de Medicina Humana “Daniel Alcides Carrión”

DR. RAMOS RAMOS, Ronny Emiliano

PADIN SILVA, Sara Cristina Angelica

DIACNOSTICO INMUNOLOGICO: REACCIONES

Tradicionalmente el diagnostico definitivo pasa por la identificación, el aislamiento en

El método serológico tradicional para el diagnóstico de enfermedades infecciosas

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 1

3. Mezclar uniformemente con un mondadientes cada gota, rotar la lámina por 3

Positivo: Aparición de grumos de tamaño variables que tienden a agruparse en la

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 2

3. Con el mondadientes mezclar y rotar la lámina durante 3 minutos.

Suero problema: Título:

Títulos mayores de 1/80 tienen significación diagnóstic o.

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 3

1. Explique alguna (s) desventajas en el diagnóstico serológico

2. ¿Qué es título en serología?

3. ¿Qué enfermedades a parte de las ya mencionadas , se diagnostica mediante

4. Mencione otras pruebas usadas para el diagnóstico inmunológico.

5. Señale en que condiciones las pruebas de W idal y Huddlesso n, puede comportarse

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 4

CONTROL MICROBIANO: ACCION DE LOS AGENTES

El crecimiento de los agentes infecciosos causales de las enfermedades y de sus

a. Ondas sónicas y supersónicas.- Los ultrasonidos (con frecuencias que oscilan

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 5

 Cultivos bacterianos de Bacillus, E.coli, Salmonella, Pseudomonas.

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 6

1. En los tubos incubados a diferente temperatura observe si hubo crecimiento por la

1. ¿Qué bacterias son más resistentes al calor?

3. ¿Qué antisépticos son los más usados?

4. ¿Qué desinfectantes son de uso común en el laboratorio?

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 7

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO ANTIBIOGRAMA

El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente con frecuencia no es

Para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro, es necesario emplear un inóculo

Método de dilución en caldo

 Cultivo bacteriano que contenga 10 6 - 10 8 microorganismo por ml.

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 8

 Colocar 10 tubos 13x100 ml estériles enumerados del 1al 10.

 Diluir el antibiótico que contenga 1000 U. en proporción 1:5 en caldo,

 Agregue 0.5 ml de la cepa bacteriana a todos los tubos

 Realice la lectura e interprete los resultados obtenidos.

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 9

 Placas con agar Miuller Hinton

 Introduzca la torunda en la cepa bacteriana, escurrir oprimiendo contra las

 Dejar reposar 5 minutos y colocar con la ayuda de la pinza los di scos de

 Los discos deben estar equidistantes unos de otros

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 10

 Para realizar la lectura, mida el halo de cada disco de antibiótico en mm,

1. ¿Qué es limite crítico de un agente antimicrobiano para este tipo de prueba?

2. ¿ La CIM y CBM ( concentración bactericida mínima ) de un agente antimicrobiano

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 11

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Staphylococcus.

El genero Staphylococcus es miembro de la familia micrococaceae; forman parte de

 Placas con Agar sangre

 Examen directo de la muestra clínica. Realizar una Tinción Gram de la

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 12

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA PÁG. 13

 Anotar lo obtenido en el examen directo