UNIVERSIDAD NACIONAL DE

MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

TEMA:
EQUIPO Y TÉCNICA DE EXTRACCIÓN ADN DE
BACTERIAS
PRESENTADO POR:
Saul, HUARAYA LARICO
CURSO:
BIOTECNOLOGIA
DOCENTE:
Dr. Hebert Hernán, SOTO GONZALES
CICLO:
VII

ILO - 2020
RESUMEN:
La extracción del ADN constituye el primer y fundamental paso para cualquier tipo
de estudio o propósito científico en el campo de la Biología Molecular, por lo que es
de vital importancia tener una muestra de ADN de buena calidad. Para obtener un
ADN de buena calidad, frecuentemente se requiere tener conocimiento de un buen
método de aislamiento. En este estudio se realizó el método fenol cloroformo
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1) de SIGMA Labs., basado en el método
de fenol-cloroformo, que se fundamenta en el uso de solventes orgánicos que por
diferencia de densidades y por su capacidad para degradar proteínas permite la
purificación de aislamiento de ADN
Las características de un organismo están especificadas en su información
genética, la cual se establece como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la
suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma.
Todos los avances acaecidos en los últimos años desde el comienzo del Proyecto
Genoma Humano (1990), han supuesto un gran salto en nuestro conocimiento de
la genética humana y han abierto la puerta a un sinfín de aplicaciones para mejorar
la vida de las personas.
Uno de los procedimientos más básico en genómica y biología molecular, es la
extracción y purificación de ácidos nucleicos. Por lo tanto, es necesario establecer
métodos seguros y fiables para la separación de estos componentes celulares. Para
lograr este objetivo, se utilizan diversos métodos de extracción dependiendo del tipo
de tejido a emplear y del posterior uso de ese material genético.
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN:
El proceso de extracción de ADN es un paso importante para poder realizar estudios
en el área de la biología molecular. Las bacterias son objetos de estudio
elementales en los campos de la biología, la genética y la bioquímica moleculares
debido a su capacidad para crecer rápidamente y a la facilidad relativa con la que
pueden ser manipuladas. Realizando modificaciones en el ADN bacteriano de
genes, enzimas y rutas metabólicas, pudiendo trasladar posteriormente estos
conocimientos y examinando los fenotipos que resultan, los científicos pueden
determinar la función a organismos más complejos a medida que la tecnología
avanza también los descubrimientos, es así que, recordamos un poco de historia de
cómo se obtuvo las primeras extracciones de ADN bacteria El ADN lo aisló por
primera vez en 1869, el médico suizo Friedrich Miescher. Miescher realizaba
experimentos acerca de la composición química del pus de vendas quirúrgicas
desechadas, cuando notó un precipitado de una sustancia desconocida que
caracterizó químicamente más tarde La llamó nucleína,debido a que lo había
extraído a partir de núcleos celulares. Se necesitaron casi 70 años de investigación
para poder identificar los componentes y la estructura de los ácidos nucleicos. En
1930 Levene y su maestro AlbrechtKossel probaron que la nucleína de Miescher es
un ácido desoxirribonucleico (ADN) formado por cuatro bases nitrogenadas, el
azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato, y que, en su estructura básica, el nucleótido
está compuesto por un azúcar unido a la base y al fosfato. Sin embargo, Levene
pensaba que la cadena era corta y que las bases se repetían en un orden fijo. La
función biológica del ADN comenzó a dilucidarse en 1928, con una serie básica de
experimentos realizados por Frederick Griffith, quien estaba trabajando con cepas
"lisas" (S) o "rugosas" (R) de la bacteria Pneumococcus (causante de la neumonía),
según la presencia (S) o no (R) de una cápsula azucarada, que es la que confiere
virulencia. Por tal razón vimos la importancia de realizar esta investigación porque
es necesario conocer y utilizar un método adecuado en el laboratorio, ya que el
objetivo dela extracción es el de obtener una muestra de buena calidad, es decir
que tenga buen porcentaje de pureza como de rendimiento, es por tal razón que
vimos la importancia de realizar un estudio de extracción de ADN.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:
Hoy en día, existen muchos métodos de extracción de ADN que son utilizados de
acuerdo a las características y objetivos de cada estudio, estos métodos muestran
variabilidad en su rendimiento, sobre todo aquellos métodos simples y de bajo costo.
Es necesario conocer la eficiencia cualitativa y cuantitativa de los diferentes
métodos de extracción de ADN con el fin de su correcta aplicación, ya que el éxito
de la aplicación de una técnica molecular dependerá de la calidad del ADN extraído.
En este sentido se pretender dar respuesta a las siguientes preguntas de
investigación:
1) Cuál será el método de extracción de ADN bacteriano de mejor calidad?,
2)Cuáles son las razones fundamentales para no utilizar el método casero más
económico?,
3)Cuáles son las razones para utilizar el método de extracción más caro.

OBJETIVO GENERAL
 Saber manejar los métodos de extracción de ADN de bacterias en el
laboratorio

MARCO TEORICO

Bacterias: son células procariotas muy abundantes que pueden encontrarse en

cualquier medio debido a la gran variedad de metabolismos que pueden presentar.
Y adherirse a las distintas superficies, como a nuestras mucosas o a los catéteres.
Pared bacteriana.. Las funciones de la pared bacteriana son: - Dar forma a la célula.
- Proteger a la célula frente al choque osmótico, las bacterias sueles sobrevivir en
ambientes hipoosmóticos, por lo que el agua de fuera tiende a entrar hacia el
citoplasma. Si entra demasiada agua en la célula esta se hincharía y explotaría. La
pared bacteriana evita que la célula se hinche demasiado.La pared bacteriana
tendrá siempre un componente que es el peptidoglicano, una macromolécula
formada por una parte peptídica y otra glucídica (N- acetilglucosamina y Ácido
Nacetilmurámico). Los polisacáridos se unen entre si por enlaces beta-1-4: NAM-
NAG-NAM-NAG NAM.... Esta cadena rodea totalmente a la bacteria, formando una
especie de anillo a su alrededor. El NAM, tiene un grupo carboxilo libre que ejerce
una gran atracción sobre los aminoácidos, que constituirán la parte peptídica que
conforma el peptidoglicano. Al carecer las células humanas de pared este proceso
es un buen lugar de actuación para los antibióticos. Las bacterias Gram+, está
compuesta por múltiples capas a de peptidoglicano, pudiendo alcanzar unas 20-30
capas. Para aumentar la cohesión entre las capas, existen unas moléculas
especiales llamadas ácidos teitoicos, que se sitúan perpendicularmente a las
distintas redes que cubren la bacteria. Por esta razón, la pared de estas bacterias
es muy grande y porosa. Las bacterias Gram-, tiene una única capa de
peptidoglicano rodeándola. Dicha capa se complementa con una capa más externa
denominada membrana externa que no gobierna los intercambios pero que tiene
una composición semejante a la membrana plasmática. Esta membrana dificulta la
entrada y salida de sustancias de la célula. Para ello, existen una especie de poros
perpediculares a la membrana, comunicando la parte de dentro con la de fuera.
ADN bacteriano: el ADN está constituido por una sola molécula circular de tipo
bicatenario, muy plegada, y que suele estar unida a los mesosomas. También puede
haber una o más moléculas pequeñas de ADN extracromosómico, denominadas
plásmidos. La región del ADN bacteriano que se encuentra condensada, asociada
a proteínas parecidas a las histonas, se denomina nucleoide. La función del ADN
es mantener y perpetuar la información genética y, mediante su expresión, dirigir el
funcionamiento del metabolismo.
Molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado
por enlace covalente. Dicha molécula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas
bacterias poseen además ADN extracromosómico, también circular y cerrado,
denominado ADN plasmídicopor estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan
información génica para muchas funciones que no son esenciales para la célula en
condiciones normales de crecimiento.
En términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos nucleicos
bacterianos, es la misma que para cualquier célula. Conviene recordar brevemente,
que los ácidos nucleicos son macromoléculas compuestas de nucleótidos unidos en
forma covalente por medio de enlaces fosfodiester entre los carbonos de las
posiciones 3´ y 5´ de dos residuos de azúcares adyacentes. Esta estructura forma
un esqueleto de azúcares y fosfatos constante en toda la macromolécula. La
variación entre los nucleótidos que constituyen la cadena de ácido nucleico, esta
dada por sus bases nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina (T), citocina
(C) y guanina (G) y para el ácido ribonucleico (ARN) son en lugar de timina, el uracilo
(U). La A y G se denominan bases púricas o purinas, mientras que T, U, y C se
denominan bases pirimidínicas o pirimidinas. Así, una cadena o hebra de ácido
nucleico, tendrá una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases
que la componen. El ADN como macromolécula, esta compuesto por dos cadenas
nucleotídicas o hebras antiparalelas que se enlazan entre sí formando una doble
hélice. Los enlaces entre ambas hebras de ADN están determinados por puentes
de hidrógeno entre las purinas de una cadena,con las pirimidinas de la otra.
Entonces, la A forma dos puentes de hidrógeno con la T, mientras que la C forma
tres puentes de hidrógeno con la G. Dicho fenómeno se conoce como
complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo
separa la G Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hélice deADN,
en la cual se pueden distinguir pares de nucleótidos o pares de bases (pb). Estos
pb.
REACCIÓN DE LOS REACTIVOS Y MATERIALES.
Fenol / cloroformo.Elimina las proteínas
Isopropanol y etanol: precipitación del ADN
Pepsina:disuelve el citoplasma sin atacar el núcleo
Ebullición (combinado con congelación). Algunos fabricantesincorporan un paso
de ebullición de la muestraprevio a la PCR como única acción para extraer el ADN
dela muestra.
Fenol: es, naturalmente, un poco soluble en agua, y da una interfaz difusa, que se
afila por la presencia de cloroformo y alcohol isoamílico reduce la formación de
espuma. La mayoría de las soluciones también tienen un antioxidante, como
oxidado daños fenol los ácidos nucleicos.. Para la purificación del ADN, el pH es por
lo general cerca de 7, momento en el que todos los ácidos nucleicos se encuentran
en la fase acuosa.
Alcohol isoamílico: alcohol isoamílico puede reducir la formación de espuma y
garantizar la desactivación de RNasas.
Gel de agarosa: El método se suele llevar a cabo sometiendo a las muestras de
ADN extraído a un campo eléctrico para que las moléculas se muevan, a través de
una matriz de agarosa que contiene bromuro de etidio, en función de su tamaño (la
técnica de electroforesis la veremos con detenimiento en el apartado 8 de este
trabajo). A la vez que las muestras problema, se procesanmuestras de ADN de
cantidad conocida (patrones) ypor simple comparación de unas con las otras
podremos estimara grosso modo la cantidad de ADN de cada muestra problema.
Se trata de un sistema de cuantificación poco sensible pues es realmente difícil
observar en el minigelcantidadesde ADN menoresque 5ηgr totales. Pero tiene la
gran ventaja de que con este método se puede visualizar el grado de degradación
de nuestras muestras problema; si el ADN está en buen estado aparecerá en el gel
como una banda nítida que no ha recorrido mucha distancia desde el punto de
aplicación de la muestra por tratarse de ADN de alto peso molecular, es decir, de
gran tamaño. Si, por el contrario, muestro ADN está fragmentado, aparecerá en el
gel una especie de “cola de degradación” (smear) a lo largo de la calle en la cual
hemos aplicado la muestra debido a que existen fragmentos de diferentes tamaños
que recorren diferentes distancias desde el punto de aplicación En este tipo de
muestras degradadas, la cuantificación se hace aún más difícil por no poder
realizarse una comparación adecuada con los patrones que son de alto peso
molecular y aparecen como bandas nítidas.
MATERIALES Y METODOS
METODOS DE EXTRACCION DE ADN BACTERIANO POR CLOROFORMO
 MATERIALES
 CULTIVO BACTERIANO E. COLI
 MICROPIPETA
 CENTRIFUGA
 VORTEX
 BUFFER – TE
 SDS
 FENOL CLOROFORMO
 ETANOL
 REFRIGERADOR
METODO FENOL CLOROFORMO
PRIMERO TOMAMOS 1.5ML de cultivo bacteriano E. coli, en un micro tuvo después
se lleva a centrifugar a 10,000 revoluciones por minuto durante 2 minutos esto
ayudara a concentrar el número de células, eliminando el sobrenadante por
inmersión luego agregamos, 400microlitros de buffer te luego damos vortex por 30
segundos después agregamos 50 micro litros de SDS al 10%y mezclar por
inmersión esto ayudara a romper la membrana, luego agregamos 400microlitros de
fenol cloroformo el cual precipito proteínas y lípidos, llevamos a vortex durante 30
segundos. Volvemos a centrifugar a 12,000 revoluciones x minuto durante 5minutos
esto ayudara a separar las faces luego de separar las fase acuosa y haberle
trasladado a otro micro tubo agregar un volumen de etanol, llevamos a refrigerar
a una temperatura de 0°centrigrados ha 10 minutos después centrifugar a 12.000
revoluciones por minuto durante 5 minutos luego descartar el sobre nadante por
inmersión luego se deja secar a temperatura ambiente y finalmente agregar 50
micro litros de buffer te.

Figura 1. Fuente propia

MAQUETA EQUIPO Y TECNICA DE EXTRACCION DE ADN DE BACTERIAS

Figura 2. Fuente propia

CONCLUSION
Actualmente se cuenta con muchas firmas comerciales, que ofertan kits de
extracción basados en diferentes principios. De acuerdo a los resultados obtenidos
en el presente estudio, será importante conocer la eficiencia de extracción de este
método, con fin de optimizar el proceso de extracción en función al tipo de material
biológico con el que se pretende trabajar.
Este trabajo nos enseña que podamos realizar en casa la extracción de ADN no es
difícil extraer el ADN el método de fenol cloroformo que se plazo en una maqueta
son masque todo los pasos más simples que pude hacer ya que hay muchos
métodos para extraer el ADN bacteriano como kits de extracción.
BIBLIOGRAFÍA
http://conogasi.org/articulos/gen-desde-el-codigo-genetico-hasta-la-ingenieria-genetica/

http://www.cua.uam.mx/pdfs/conoce/libroselec/Manual_practicas_laboratorio_biologia_molecul
ar.pdf

https://prezi.com/7at2uhi5zrjs/extraccion-de-adn-en-bacterias/

https://prezi.com/lse-xyxwmcn5/extraccion-de-adn/

https://prezi.com/bsdbqklxvvti/extraccion-amp-cuantificacion-de-adn-en-leucocitos/

https://bqexperimental.files.wordpress.com/2010/01/lisis-alcalina4.pdf

https://www.aulagenyca.com/extraccion-de-adn/

https://www.bioted.es/protocolos/EXTRACCION-ADN-BACTERIANO.pdf

https://redbiobancos.es/wp-content/uploads/pnt-extraccion-acidos-nucleicos.pdf

http://docs.bvsalud.org/biblioref/2019/03/981156/4996-texto-del-articulo-8462-1-10-
20190220.pdf#:~:text=Existe%20una%20cantidad%20considerable%20de,)%3B%20y%20la%20met
odolog%C3%ADa%20fenol%2D

https://ocw.ehu.eus/file.php/134/tecnicasmol/protocolo-1-obtencion-de-adn-de-bacterias-
patogenas.pdf