TALLER-P7.

BOMBEO DE PROTONES EN MEMBRANA CELULAR DE

LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS

Delgado Quintero, Freisy. Hernandez Benitez, Natalia A.

Biología
Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, Departamento de Ciencias
Químicas, Laboratorio de Bioquímica
Santiago de Cali, 19 de mayo de 2021

Para el desarrollo de este taller sea breve y preciso con sus respuestas; Lea previamente la
guía de laboratorio (Bombeo de protones), y apóyese en bibliografía. Haga un uso correcto
de la información consultada citando adecuadamente para referenciar las fuentes de
información utilizadas; evite caer en plagio de información.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
 Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las
levaduras.

 Explicar los cambios de pH por la generación de protones.

 Interpretar el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre el bombeo de

protones.

1. Describa el funcionamiento y mecanismo de acción de la cadena de fosforilación

oxidativa/cadena transportadora de electrones para generación de energía (ATP). Puede
complementarlo con esquemas.
La fosforilación oxidativa es el proceso por el que se forma ATP como resultado
de la transferencia de electrones desde el NADH o del FADH 2 al O2a través de un
serie de transportadores de electrones.

Figura 1: fosforilación oxidativa

La cadena de transporte de electrones es una serie de proteínas y moléculas

orgánicas que se encuentran en la membrana interior de la mitocondria. Los
electrones pasan de un miembro de la cadena de transporte al siguiente en una serie
de reacciones redox. La energía liberada en estas reacciones se captura como un
gradiente de protones, el cual se utiliza a su vez para para formar ATP en un
proceso llamado quimiosmosis. En conjunto, la cadena de transporte de electrones
y la quimiosmosis constituyen la fosforilación oxidativa(Fosforilación Oxidativa
(Artículo) | Khan Academy, n.d.).

A continuación, vamos a analizar con más detenimiento la cadena de transporte de

electrones

La cadena de transporte de electrones es un conjunto de proteínas y moléculas

orgánicas incrustadas en la membrana, la mayoría de las cuales se organizan en
cuatro grandes complejos nombrados del I al IV. En eucariontes, muchas copias de
estas moléculas se encuentran en la membrana mitocondrial interna. En
procariontes, los componentes de la cadena de transporte de electrones están en la
membrana plasmática. Conforme los electrones viajan a través de la cadena, se
desplazan de un mayor nivel de energía a uno inferior y se mueven de moléculas
menos ávidas de electrones o otras más ávidas. En estas transferencias de electrones
"cuesta abajo" se libera energía y varios de los complejos de proteína utilizan la
energía liberada para bombear protones desde la matriz mitocondrial al espacio de
intermembranal para formar un gradiente de protones(Fosforilación Oxidativa
(Artículo) | Khan Academy, n.d.).

Figura 2: Diagrama de energía libre (cadena de transporte)

Figura 3: Cadena de transporte de electrones (fosforilación oxidativa)

 Todos los electrones que entran en la cadena de transporte provienen de moléculas
de NADH y FADH 2 que se producen en fases más tempranas de la respiración
celular: glucólisis, oxidación del piruvato y el ciclo del ácido cítrico(Fosforilación
Oxidativa (Artículo) | Khan Academy, n.d.).

 El NADH es muy bueno donando electrones en reacciones redox (o sea que sus
electrones están en un nivel de energía alto), por lo que puede transferir sus
electrones directamente al complejo I y se transforma otra vez en NAD+¿ ¿. El
movimiento de los electrones a través del complejo I en una serie de reacciones
redox libera energía, la cual el complejo usa para bombear protones desde la matriz
hacia el espacio intermembranal(Fosforilación Oxidativa (Artículo) | Khan
Academy, n.d.).

 El  FADH 2  no es tan bueno para donar electrones como el NADH (o sea que sus
electrones se encuentran en un nivel de energía más bajo), por lo que no puede
transferir sus electrones hacia el complejo I. En su lugar, introduce los electrones a
la cadena de transporte a través del complejo II, el cual no bombea protones a través
de la membrana. Debido a esto, las moléculas de FADH 2  producen un menor
bombeo de protones (y contribuyen menos al gradiente de protones) comparadas
con las de NADH(Fosforilación Oxidativa (Artículo) | Khan Academy, n.d.). 

Después de los dos primeros complejos, los electrones del NADH y FADH 2 
 recorren exactamente la misma ruta. El complejo I y el II transfieren sus electrones
a un acarreador pequeño y móvil de electrones llamado ubiquinona (Q) que se
reduce y transforma en QH 2, se transporta por la membrana y entrega sus electrones
al complejo III. El movimiento de los electrones por el complejo III bombea más
protones a través de la membrana y luego los electrones se transfieren a otro
acarreador móvil llamado citocromo C (cit C). El cit C transporta los electrones
hacia el complejo IV, donde se bombea el último lote de iones de H +¿¿   a través de
la membrana. El complejo IV transfiere los electrones a O2, que se parte en dos
átomos de oxígeno y acepta protones de la matriz para formar agua. Se necesitan 4
electrones para reducir cada molécula de O2, mientras que en el proceso se forman
dos moléculas de agua(Fosforilación Oxidativa (Artículo) | Khan Academy, n.d.).

En resumen, la cadena de transporte de electrones a la célula tiene dos funciones

importantes:

 Regenera los acarreadores de electrones. El NADH y FADH 2donan sus

electrones a la cadena de transporte de electrones y se convierten otra vez en
NAD+¿ ¿ y FAD. Esto es importante porque las formas oxidadas de los acarreadores
 de electrones se utilizan en la glucólisis y en el ciclo del ácido cítrico, así que deben
estar disponibles para mantener estos procesos en funcionamiento.(Fosforilación
Oxidativa (Artículo) | Khan Academy, n.d.)
 Forma un gradiente de protones. La cadena de transporte genera un gradiente de
protones a través de la membrana interna de la mitocondria: en el espacio
intermembranal hay una concentración más alta de H +¿¿ y en la matriz hay una
concentración más baja. Este gradiente es una forma de energía almacenada que,
como veremos, se puede utilizar para generar ATP.(Fosforilación Oxidativa
(Artículo) | Khan Academy, n.d.)

Por último, es importante resaltar que el proceso en el que la energía del gradiente
de protones se utiliza para generar ATP se llama quimiosmosis. De manera más
general, la quimiosmosis se puede referir a cualquier proceso en el que la energía
almacenada en un gradiente de protones se utiliza para hacer un trabajo
(Fosforilación Oxidativa (Artículo) | Khan Academy, n.d.).

Como muchos otros iones, los protones no pueden atravesar directamente la bicapa
de fosfolípidos de la membrana debido a que esta es muy hidrofóbica en su interior.
Por el contrario, los iones H +¿¿ solo pueden moverse por su gradiente de
concentración con la ayuda de proteínas de canal que forman túneles hidrofílicos a
través de la membrana. En la membrana interna de la mitocondria, los iones de H +¿¿
solamente cuentan con un canal disponible: una proteína transmembranal conocida
como ATP sintasa. Conceptualmente, la ATP sintasa es muy parecida a las turbinas
de un planta de energía hidroeléctrica. Pero en vez de activarse con agua, se activa
con el flujo de iones de H +¿¿ que se desplazan por su gradiente electroquímico. Este
flujo causa que la ATP sintasa gire y catalice la adición de un fosfato a ADP, con lo
que captura la energía del gradiente de protones en forma de ATP (Fosforilación
Oxidativa (Artículo) | Khan Academy, n.d.).

La quimiosmosis es notable por contribuir con más del 80% del ATP obtenido de la
degradación de la glucosa en la respiración celular, pero no es exclusiva de esta
última. Por ejemplo, la quimiosmosis también es importante en las reacciones
dependientes de la luz en la fotosíntesis (Fosforilación Oxidativa (Artículo) | Khan
Academy, n.d.).

2. Identifique y describa brevemente las rutas metabólicas que se activan cuando en un

cultivo aerobio de levadura Saccharomyces cerevisiae en suspensión se le agrega
glucosa para aumentar su biomasa. Puede usar esquemas.

Primero, se debe de tener en cuenta que en la producción de levadura S. cerevisiae

la mayor fuente de energía es la glucosa y la glucólisis es la principal vía para la
 conversión de la glucosa a piruvato. La producción de energía en forma de ATP es
acompañada de la generación de intermediarios y disminución de energía en forma
de NADH para las vías biosintéticas (Londoño et al., 2007). Con la obtención de
este piruvato, se procedería a la formación de Acetil-Co A, con el cual iniciará el
ciclo de Krebs. Posteriormente, las moléculas de NADH y FADH 2 que se producen
en fases más tempranas de la respiración celular correspondientes a la glucólisis,
oxidación del piruvato y el mismo ciclo de Krebs, se dará inicio a la fosforilación
oxidativa, donde se encuentran en conjunto la cadena de transporte de electrones y
la quimiosmosis, lo que finalmente nos dará el ATP (energía) que necesita la
levadura para su supervivencia y reproducción. (Fosforilación Oxidativa (Artículo)
| Khan Academy, n.d.). El proceso previamente descrito se puede observar
brevemente esquematizado en la figura 4.

Figura 4: Metabolismo de la levadura bajo condiciones aeróbicas:

https://repository.eafit.edu.co/bitstream/handle/10784/399/LauraPatricia_DurangoL
ondo%F1o_2007.pdf;jsessionid=A8CE77DF3DB6D5F1F2AD167ED29DEF76?
sequence=1

Se realiza un cultivo aerobio de S. cerevisiae sometiéndola a dos tratamientos con

compuestos que afectan el metabolismo de generación de energía. Los compuestos
evaluados fueron 2,4-dinitrofenol (DNP) y Azida de sodio. El experimento se realizó por
duplicado empleando glucosa al 1 % (concentración final) como fuente de carbono para el
desarrollo de la levadura. Se realizó monitoreo de los tratamientos a través de los cambios
de pH en la solución durante 40 minutos. Tenga en cuenta que se tiene un control positivo
del experimento, que consiste en una solución de levadura con glucosa al 1 %,
representando el comportamiento normal del organismo.

Tabla Control (+) DNP Azida de sodio

1.
Monito
reo del
pH
durante
el
crecimi
ento de
S.
cerevis
ae en
una
solució
n de
acuosa
con 1
% de
glucos
a.
XTiem
po R1 R2 R1 R2 R1 R2
0 5,46 5,62 5,32 5,4 5,72 5,78
5 4,56 4,79 4,99 5,08 5,89 5,78
10 4,27 4,4 4,87 4,93 5,55 5,72
20 4,07 4,16 4,78 4,76 5,46 5,57
30 3,95 4,06 4,71 4,68 5,43 5,55
40 3,99 3,99 4,69 4,65 5,36 5,49

3. ¿Por qué se usa el cambio de pH como indicador del funcionamiento del metabolismo
de generación de energía (ATP) en la levadura?

Las H +¿¿ -ATPasas de las membranas plasmática y vacuolar (Pma1 y VMA) constituyen
el mayor sistema celular para la regulación del pH y la absorción de nutrientes. Estas
dos importantes funciones explican la correlación entre la actividad de la enzima y el
crecimiento de la levadura, observada en varios estudios (Serrano et al., 1986; Portillo y
Serrano, 1989; Vallejo y Serrano, 1989). Como se ilustra en la figura 5, Pmal energiza
la membrana plasmática mediante la expulsión de H +¿¿ , lo que genera un potencial
eléctrico de membrana (positivo en el exterior) y un gradiente de pH (ácido en el
exterior). Esto produce un flujo activo de entrada de nutrientes y salida de aniones y
iones sodio, los cuales son tóxicos para la célula. Para neutralizar la carga negativa del
interior de la célula, es necesario un balance eléctrico que ocurre a través de la entrada
de K +¿¿ gracias a las proteínas transportadoras Trk1 y 2 ( Madrid et al., 1998). También
regula el pH intracelular (pHi) y extracelular para que se produzca el crecimiento
celular y la acidificación externa, respectivamente (Serrano, 1985). Valores altos de pHi
(dentro del rango fisiológico normal) favorecen el crecimiento y proliferación celular.
Un ejemplo destacado son las células cancerosas, que tienen un pHi mayor que el de las
células normales (Reshkin et al., 2014). Esta alteración provoca el crecimiento activo de
las mismas (Perona y Serrano, 1988).(Río, n.d.)

Figura 5: Esquema de la homeostasis de pH en levaduras.

https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/69161/TRUJILLO%20-%20Regulaci
%C3%B3n%20de%20la%20H%2B-ATPasa%20de%20la%20membrana%20plasm
%C3%A1tica%20de%20levadura%20por%20la%20prote%C3%ADna%20kinas....pdf?
sequence=1
 Teniendo en cuenta lo anterior, el pH funciona como indicador del funcionamiento
del metabolismo de generación de energía (ATP) en la levadura, debido a que, para
mantener el pH intracelular es necesario los flujos de iones constituidos
principalmente por los movimientos de protones y potasio y el ciclo para estos
iones en la membrana plasmática se inicia con la salida de protones proveniente de
la hidrolisis del ATP y la generación del potencial electroquímico (Ramírez & Peña,
2000), por lo tanto, en el caso de que se aplique algún tratamiento con compuestos
que afectan el metabolismo de generación de energía en la levadura, estos van a
afectar la cadena transportadora de electrones o el gradiente que se genera
dependiendo del compuesto que se utilice, entonces si se genera un efecto negativo
sobre esta cadena la síntesis de ATP se va a ver afectada disminuyendo su
disponibilidad en la célula para llevar a cabo la hidrolisis del ATP para generar este
gradiente electroquímico de protones, afectando el transporte de nutrientes al
interior de la célula y el flujo de iones por los movimientos de protones y potasio,
generando de esta manera cambios en el pH que van a evidenciar que está pasando
con el metabolismo de generación de energía (ATP) en la levadura y como los
compuestos de los tratamientos lo están afectando.

4. Elabore en un mismo plano cartesiano las gráficas de pH en función del tiempo

correspondiente a cada uno de los tratamientos evaluado (Control (+), DNP y Azida de
sodio).

Se elaboró una gráfica de pH en función del tiempo (figura 5) correspondiente a cada

uno de los tratamientos evaluado (Control (+), DNP y Azida de sodio), para la
realización del gráfico, para cada tratamiento en su debido tiempo se realizó el
promedio de las réplicas 1 y 2.
 Figura 5: pH en función del tiempo correspondiente a cada uno de los tratamientos
evaluado (Control (+), DNP y Azida de sodio)

5. Explique los resultados obtenidos basándose en el mecanismo de acción de cada uno de

los compuestos (investigue). Resalte la diferencia en el comportamiento del pH entre
los tratamientos, tomando como punto de referencia el control positivo.

El dinitrofenol (DNP) es un agente desacoplante, porque tiene la capacidad de aislar el

flujo de los electrones y el bombeo de H + de la síntesis de ATP. Esto significa que la
energía de la transferencia de electrones no se puede usar para la síntesis de
ATP(Problemas de Metabolismo, n.d.).
El desacoplamiento se produce ya que el 2,4-dinitrofenol hace permeable a los protones
de la membrana interna mitocondrial deshaciendo la relación obligada entre la cadena
respiratoria y la fosforilación oxidativa. El efecto de esta sustancia por tanto es la
inhibición de la producción de ATP al no generarse el gradiente de pH, pero si permite
que la cadena de transporte de electrones continúe funcionando(2,4-Dinitrofenol -
Es.LinkFang.Org, n.d.). A partir de esto, si observamos los resultados del experimento,
la solución control tiende a tener un pH moderadamente ácido a medida que pasa el
tiempo, mientras que, la solución con el tratamiento con DNP a pesar de también
tiende a tener un pH ligeramente acido, esta es menos acida que la solución control,
aunque la diferencia no sea muy grande, esto se debe a que, como se mencionaba las
H +¿¿ -ATPasas de las membranas plasmática y vacuolar (Pma1 y VMA) constituyen el
mayor sistema celular para la regulación del pH y la absorción de nutrientes, Pmal
energiza la membrana plasmática mediante la expulsión de H +¿¿ , lo que genera un
gradiente de pH (ácido en el exterior). Esto produce un flujo activo de entrada de
nutrientes y salida de aniones y iones sodio, los cuales son tóxicos para la célula. Para
neutralizar la carga negativa del interior de la célula, es necesario un balance eléctrico
que ocurre a través de la entrada de K +¿¿ gracias a las proteínas transportadoras Trk1 y
2. Lo que también regula el pH intracelular (pHi) y extracelular para que se produzca el
crecimiento celular y la acidificación externa(Río, n.d.), de esta manera observamos
que, al añadir el DNP se está inhibiendo de la producción y síntesis de ATP y por tanto,
la cantidad disponible para la hidrolisis del ATP para generar esta gradiente de pH
acido va a disminuir, por lo tanto, el pH al agregar DNP va a ser menos acido que la
solución control, sin embargo, vemos que la diferencia no es muy grande debido a que
cantidad de DNP utilizada para el experimento era muy pequeña teniendo un efecto
menor en el cambio del pH.

La azida de sodio es uno de los inhibidores del transporte electrónico, estos

interrumpen el flujo de e-, por combinarse con alguno de los portadores EN los
complejos. Los inhibidores que actúan sobre los complejos provocan un descenso del
potencial de la membrana, ya que interrumpen el bombeo de H +¿¿ y en consecuencia
tampoco se produce ATP. La azida de sodio bloquea el flujo de electrones a nivel de la
citocromo c oxidasa, bloquea la forma férrica ( Fe3 +¿¿) del hemo a 3 (Disponibilidad de
ATP y Metabolismo, n.d.).
La azida de sodio inhibe la enzima llamada citocromo c oxidasa la cual se encuentra en
la mitocondria de las células y está involucrada de forma importante en la respiración y
generación de energía en esta. Su acción impide la generación del ATP un compuesto
clave en las actividades celulares y la célula se deteriora o daña(Azida de Sodio
(NaN3): Estructura, Propiedades, Usos, Riesgos, n.d.).
Teniendo en cuenta lo anterior, al añadir el tratamiento con azida de sodio a la solución,
este presentara un pH menos acido que la solución control al igual que el DNP, debido
a que, limitara el gradiente de protones que general el complejo I y II hacia la matriz
mitocondrial al verse interrumpido el bombeo de H +¿¿ , de esta manera se afectará la
generación del gradiente de pH acido de la solución, ya que, tampoco se dará la
producción de ATP, por lo cual, la disponibilidad de este para que se dé el proceso de la
hidrolisis se verá afectada junto con la generación del potencial electroquímico, al igual
que el gradiente que se generaba y el ingreso de nutrientes a la celular. Sin embargo,
aunque ambos tratamientos ocasionan que la solución sea menos acida cabe resaltar
que, mientras que, el DNP inhibe la producción de ATP porque aísla el flujo de los
electrones y el bombeo de H+ de la síntesis de ATP, lo que quiere decir que la energía
de la transferencia de electrones no se puede usar para la síntesis de ATP, la azida de
sodio si bloquea el flujo de electrones a nivel de la citocromo c oxidasa e interrumpe el
bombeo de H +¿¿ y en consecuencia tampoco se produce ATP. Por lo cual, esta es una de
las posibles razones por la cual la solución con el tratamiento con azida de sodio tenga
un pH menos acido que con el DNP en función del tiempo.
6. Además de los compuestos evaluados existen diversas moléculas que actúan como
inhibidores del metabolismo de producción de energía. Identifique compuestos
químicos con que generen impactos negativos en la producción de energía bioquímica
(ATP), y explique de dónde provienen y dónde actúan.

Algunas de las moléculas capaces de inhibir el transporte de electrones en la fosforilación

oxidativa que tiene como función principal la producción de ATP son: el monóxido de
carbono, ya que este se combina directamente con el citocromo oxidasa, el cual es el
citocromo terminal impidiéndole de esta manera su unión con el oxigo; también, los agentes
cianógenos como lo es el cianuro de hidrógeno (ácido cianhídrico) o el cloruro de
cianógeno, ya que estos contienen el ion cianuro (CN -), el cual se liga al ion férrico  (Fe+++)
del citocromo-oxidasa de esta manera impidiendo la transferencia de electrones,
produciendo un estado anaeróbico, conocido como envenenamiento; como otro inhibidor se
tiene al amital, el cual es un barbiturato que bloquea la cadena transportadora a nivel del
complejo I, entre la NADH deshidrogenasa y la coenzima-Q. La rotenona, es un producto
vegetal, el cual interfiere en la cadena respiratoria a nivel del complejo I, por lo que se usa
como insecticida y pesticida y la antimicina, que es un antibiótico producido por
Steptomyces griseous, el cual ha sido usado como veneno para controlar alguna especie de
peces, interfiriendo con el flujo de electrones en el complejo III. (5.-Inhibidores de La
Fosforilación Oxidativa | Volviendo a Lo Básico, n.d.)

Bibliografía

2,4-dinitrofenol - es.LinkFang.org. (n.d.). https://es.linkfang.org/wiki/2,4-Dinitrofenol

5.-Inhibidores de la fosforilación oxidativa | Volviendo a lo básico. (n.d.).
Azida de sodio (NaN3): estructura, propiedades, usos, riesgos. (n.d.).
https://www.lifeder.com/azida-de-sodio/#Propiedades
Disponibilidad de ATP y metabolismo. (n.d.).
http://www3.uah.es/bioquimica/Tejedor/bioquimica_ambiental/BA-RES-13.pdf
Fosforilación oxidativa (artículo) | Khan Academy. (n.d.). https://es.khanacademy.org/science/ap-
biology/cellular-energetics/cellular-respiration-ap/a/oxidative-phosphorylation-
etc#:~:text=Resumen%3A fosforilación oxidativa&text=La cadena de transporte de electrones
es una serie de,membrana interna de la mitocondria.&text=El gradiente de protones
producido,se utiliza para sintetizar ATP.
Londoño, L. P. D., Escobar, V. V., & Carvajal, F. O. (2007). Evaluación y escalamiento de la
producción de levaduras nativas tipo Saccharomyces spp. A nivel de laboratorio.
Problemas de Metabolismo. (n.d.).
http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/metabolism/04t.html
Ramírez, J., & Peña, Y. A. (2000). Intercambiadores catión/protón en levaduras (Vol. 42).
https://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2000/mi004h.pdf
Río, C. T. del. (n.d.). Regulación de la H +-ATPasa de la membrana plasmática de levadura por la
proteína kinasa TOR, la proteína fosfatasa Sit4 y la proteína de unión a RNA Ssd1.
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/69161/TRUJILLO - Regulación de la H%2B-
ATPasa de la membrana plasmática de levadura por la proteína kinas....pdf?sequence=1