UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

Estabilidad de Pigmentos Naturales, Polifenoles y

Capacidad Antioxidante del Jugo de Murta (Ugni
molinae Turcz)

TESIS DE MAGÍSTER

KAREN ARLETTE MATHIAS RETTIG

VALDIVIA – CHILE

2014
La Comisión evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de Graduados de la
Facultad de Ciencias Agrarias que la tesis de Magíster presentada por la candidata.
KAREN ARLETTE MATHIAS RETTIG
Ha sido aprobado en el examen de defensa de Tesis rendido el día 28 de agosto de 2014,
como requisito para optar al grado de Magíster en Ciencia de los Alimentos y, para que así
conste para todos los efectos firman.

Patrocinante: ________________________

Kong Shun Ah-Hen

Ingeniero en Alimentos, Dipl.-Ing., Dr.-Ing.

Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Austral de Chile

Profesor Co-Patrocinante: ________________________

Ociel Muñoz Fariña

Bioquímico, Dr. Ciencias Químicas.

Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Austral de Chile

Profesor Informante: ________________________

Roberto Lemus Mondaca

Ingeniero en Alimentos, Mg. Dr. Ing.

Departamento de Ingeniería en Alimentos
Facultad de Ingeniería
Universidad de La Serena
 ESTABILIDAD DE PIGMENTOS NATURALES, POLIFENOLES Y
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DEL JUGO DE MURTA (UGNI
MOLINAE TURCZ)

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile en

cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Magíster en Ciencia de los
Alimentos.

Por

KAREN ARLETTE MATHIAS RETTIG

Valdivia - Chile

2014
A los sueños por cumplir y a los que se fueron al cielo

Tu libertad está en el límite de tus pensamientos

 Agradecimientos
Esta tesis ha sido realizada gracias al soporte recibido por parte de los académicos Kong
Shun Ah-Hen, Ociel Muñoz F., Roberto Lemus M., Fernando Figuerola R, Fernando Asenjo,
Mariela Rademacher, Marcia Costa y a los funcionarios Marta Aranda y José Briceño del ICYTAL,
sin el apoyo de todos ellos, no podría estar escribiendo estas palabras hoy.

Gracias al programa de Magíster en Ciencia de los Alimentos y a la Escuela de Graduados

por otorgarme la beca de arancel, con la cual pude desarrollar mis estudios, a Vivi que más que una
secretaria, es la orientadora académica de pasos a seguir incluso en la vida.

Al profesor Kong, por todo su apoyo y ánimos constantes, así como por toda la confianza
que ha depositado en mí. Es difícil encontrar palabras de agradecimiento para expresar todo lo que
me ha aportado. Su disponibilidad en todo momento y sus orientaciones, han ido más allá de un
puro trabajo académico, siendo una experiencia muy positiva con tan excelente profesional y
persona.

Al académico Haroldo Magariños, quien no sólo fue mi profesor sino que también
orientador y amigo, siempre dándome los mejores consejos académicos y de la vida.

A todos los profesores que me hicieron clases a lo largo del programa, en especial a los
profesores ya nombrados y Renate Schöbitz , Peter Seemann y Andrea Báez

A mis compañeros y amigos de estudios Yolanda, Anne, Gabriela, Andrés, Pedro,

Alexandra, Susana y Olga con los cuales no sólo adquirí conocimiento, sino que fueron compañeros
de aventuras y un soporte emocional sin igual.

A mi familia, papá, mamá y hermano que con su apoyo y amor, me han ayudado a no
desanimarme en aquellos momentos difíciles y a seguir adelante. Parte de ella también mis perritos
quienes me dan armonía y libertad en mi alma.

A Yonny Nannig Casanova, mi compañero de aventuras, decisiones, pasiones, de amor

incondicional. Como no agradecer su apoyo, si fue quien me alentó a realizar el magister, busco,
estudio y aprendió de los alimentos conmigo motivándome y haciéndome sentir que mi profesión es
parte importante de la sociedad, y desde el cielo seguro me hizo barra y susurró en cada oído de los
profesores un siete.
 i

ÍNDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN 1

ABSTRACT 2

1 INTRODUCCIÓN 3

2 MATERIALES Y MÉTODOS 11

2.1 Ubicación del estudio 11

2.2 Materiales 11

2.3 Diseño experimental 11

2.4 Extracción por arrastre de vapor 12

2.5 Balance de materia 13

2.6 Determinación de concentración de polifenoles totales 14

2.7 Determinación del contenido de antocianinas 15

2.8 Determinación de clorofila total y de carotenos 15

2.9 Capacidad antioxidante por método DPPH 16

2.10 Medición del color 17

2.11 Análisis estadísticos 18

3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 20
 ii

3.1 Balance de materia 20

3.2 Variación del contenido de pigmentos, de la actividad antioxidante y

del color en función del tiempo de extracción 22

3.2.1 Pigmentos en función del tiempo de extracción 22

3.2.2 Variación del color del extracto en función del tiempo de extracción 26

3.3 Estabilidad de los pigmentos, de la capacidad antioxidante y del color, 28

en función de las condiciones de almacenamiento

3.3.1 Estabilidad de los pigmentos y de la capacidad antioxidante 28

3.3.2 Variación del color del jugo de murta en función del tiempo de
almacenamiento 37

4 CONCLUSIONES 43

5 BIBLIOGRAFÍA 46
 iii

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA Página

1 Variables independientes del modelo (Factores) 12

2 Rendimiento, sólidos solubles, pH y residuo por cada tiempo de 21

procesamiento

3 Composición de la murta residual a distintos tiempos de extracción 21

4 Comparación del sistema de extracción: contenido de pigmentos y 22

DPPH

5 Comparación del sistema de extracción de acuerdo a la diferencia de 27

color

6 Estabilidad de pigmentos y DPPH 28

7 Variación de color 38

8 Variación de color en función de la temperatura ANOVA 39

9 Regresión múltiple evaluada a 5 °C 42

 iv

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA Página

1 Estructura química de: a) Flavan-3-ol y b) Epicatequina 4

2 Compuestos fenólicos identificados en extractos etanólicos de hojas 5

de murta

3 Fotos de Ugni molinae Turcz 6

4 Olla extractora de jugo por arrastre de vapor 12

5 Curva de calibración utilizando ácido gálico como estándar a 765 nm 13

6 Curva de calibración capacidad antioxidante a 515 nm 16

7 Sólido de color del sistema Hunter Lab Sistema de color 17

tridimensional

8 Diagrama de Pareto estandarizado para la variable de respuesta

polifenoles 29

9 Efecto del factor tiempo de almacenamiento a 5 °C y tiempo de

extracción en relación a los polifenoles totales. 30

10 Efecto del factor tiempo y temperatura de almacenamiento a un

tiempo de extracción 30 min en relación a los polifenoles totales. 30

11 Diagrama de Pareto estandarizado para la variable de respuesta

antocianinas 31

12 Efecto del factor tiempo de almacenamiento a 5 °C y tiempo de

extracción en relación a la extracción de polifenoles totales (PFT) y 32
antocianinas (ACN)
 v

13 Efecto sobre la concentración de antocianinas de los factores tiempo

y temperatura de almacenamiento en un jugo de murta obtenido con 32
30 min de extracción

14 Efecto sobre las antocianinas de los tiempos de almacenamiento y de

extracción, en un jugo de murta almacenado a 5 °C 33

15 Efecto de los factores tiempo y temperatura de almacenamiento a 30

min de extracción en relación a los pigmentos fotosintéticos 34

16 Diagrama de Pareto estandarizado para las variables de respuestas: a)

DPPH y b) Porcentaje de inhibición del radical DPPH (%IRL) 35

17 Efecto del factor tiempo de almacenamiento en relación al DPPH,

para un tiempo de extracción de 30 min. 36

18 Efecto de las condiciones de almacenamiento en relación al DPPH, a)

30 min de extracción con vapor; b) 5 °C de almacenamiento 36

19 Efecto del factor condiciones de almacenamiento en relación al

%IRL. a) 30 min de extracción con vapor; b) 5 °C de almacenamiento 37

20 Variación de color en jugos almacenados a 5°C sobre los PFT y ACN 40

21 Variación del color en jugos almacenados a 5°C sobre las CHL y CRT 41
 vi

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

Et: Tiempo de extracción por vapor (min)

TA: Temperatura de almacenamiento (°C)

At: Tiempo de almacenamiento (días)

PFT: Polifenoles Totales

ACN: Antocianinas Totales

CHL a: Clorofila a

CHL b: Clorofila b

CRT: Carotenoides Totales

CHL T: Clorofila Total

E: Variación general de color

L: Variación de luminosidad o claridad

a: Diferencial de la desviación del punto acromático correspondiente a la luminosidad

hacia el rojo si a* es positiva, y hacia el verde si a* es negativa

b: Variación la desviación hacia el amarillo si b* es positiva, y hacia el azul si b* es

negativa

C: Diferencial del croma saturación del color

h: Diferencial del tono

Lab: Método de laboratorio para extractos vegetales

GAE: Ácido gálico equivalente

 vii

TE: Trolox equivalente

FC: Folin-Ciocalteu

DPPH: Radical 2,2 difenil-1-picril hidrazilo

SS: Sólidos solubles

GLM: Modelos lineales generalizados

DW: Estadístico de Durbin-Watson

 1

RESUMEN

Los jugos extraídos de bayas congeladas de murta (Ugni molinae Turcz) por condensación
en un extractor de jugo a vapor, fueron analizados por sus contenidos de polifenoles,
antocianinas, clorofilas, carotenoides, sus capacidades antioxidantes y color en muestras
almacenadas a tres temperaturas (5, 20 y 35 °C). Los análisis de los extractos fueron
realizados en triplicado en distintas instancias durante un periodo de 35 días. Los
polifenoles fueron analizados por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, la actividad
antioxidante fue determinada por la decoloración de radicales libres de DPPH (2,2-difenil-
1-picrilhydrazilo), el contenido de antocianinas totales mediante el diferencial de pH, la
clorofila y carotenoides totales por el método de AOAC 942.0 y el color a través de un
colorímetro de líquidos con el sistema CIE-XYZ.

Los contenidos de pigmentos en los jugos de los distintos tiempos de extracción eran
significativamente diferentes, siendo mayor en los jugos de 30 min de extracción y menor
en los jugos de 45 min, por lo cual se presume que el tiempo de extracción no debe superar
los 30 min. Durante el almacenamiento de los distintos jugos se observó un decrecimiento
continuo del contenido de pigmentos. Por lo general, se observó una buena correlación
entre el contenido de pigmentos y la actividad antioxidante. El color del jugo fue dado
principalmente por las antocianinas, las cuales resultaron ser altamente inestables a la
temperatura, siendo 5 °C la mejor temperatura de almacenamiento con la mayor retención.
Por otra parte, la capacidad antioxidante no fue afectada significativamente por la
temperatura, pero el almacenamiento causó una pérdida significativa en el día 26. Estos
resultados pueden ser útiles para la industria de los jugos como punto de partida para el
desarrollo de jugos de murta con altos niveles de compuestos bioactivos.
 2

ABSTRACT

Juices extracted from frozen murtilla berries (Ugni molinae Turcz) by steam condensation
using a steam juicer operated at three different extraction times (15, 30 and 45 min) were
analyzed for content of phenolic compounds, anthocyanins, chlorophylls, carotenoids, as
wells for antioxidant activity and color. The samples were stored at three temperatures (5,
20 and 35 °C). Analysis on murtilla juice extracts were performed in triplicate at different
time intervals during a period of 35 days. Phenolics were analyzed using the colorimetric
method of Folin-Ciocalteu, the antioxidant activity was determined by discoloration of
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radicals, the contents of total anthocyanins
through the method of pH differential, the chlorophyll and total carotenoids AOAC method
942.0 and color was measured using a colorimeter for liquids with CIE-XYZ system.

The pigment contents of the juices at different extraction times were significantly different
from each other, being highest at 30 min of extraction and lowest at 45 min, which led to
the assumption that extraction time should not be more than 30 minutes. During the storage
of the different juice samples, a steady decrease of pigment contents was observed.

In general a good correlation between pigments content and antioxidant activity was
obtained. The color of the juice was mainly due to anthocyanins, which were highly
unstable to temperature, being 5 °C the best storage temperature with highest retention. On
other hand, antioxidant capacity was not affected significantly by temperature, but during
the storage a significant loss was observed on the day 26. These results can be useful for
the juice industry as a starting point for the development of murtilla juice with high levels
of bioactive components.
 3

1 INTRODUCCIÓN

Chile tiene una alta variedad de productos gastronómicos y entre ellos una gran
diversidad de mirtáceas (familia de árboles o arbustos), las cuales incluyen la murta o murta
(Ugni molinae T.), una especie endémica de Chile que se encuentra en forma silvestre en
las zonas marginales costeras desde el centro al sur del país, entre la Región del Maule y la
Región de Aysén. Se cosechan las bayas de la murta, en grandes predios boscosos, tienen
un agradable aroma frutal y están siendo comercializadas, principalmente en estado fresco.
El cultivo es hoy una alternativa productiva de exportación y se vende no sólo en el
mercado informal, sino también se está comercializando en locales establecidos. La murta
tiene una baja durabilidad en post-cosecha y en condiciones ambientales normales dura
alrededor de 8 días. Es una baya globosa, utilizada en repostería y en la fabricación de
mermeladas, postres, jugos y licores de forma artesanal. Es por ello la importancia de
analizar nuevas alternativas de procesamiento y comercialización, potenciándola como
alimento funcional, al tener una composición rica y diversificada de compuestos con
propiedades curativas (Speisky et al., 2008; Schreckinger et al., 2010). Una alternativa de
procesamiento son los jugos saludables, que son ricos en antioxidantes; se demostró que al
incorporar jugos de frutas y hortalizas en la dieta de pacientes sanos, aumentó la capacidad
antioxidante total y disminuyó el contenido de malondialdehído en el plasma sanguíneo
(Yuan et al., 2013), comprobando así el funcionamiento de los antioxidantes de las frutas y
hortalizas en promover el mejoramiento de la salud. Aunque las acciones moleculares de la
actividad antioxidante de los polifenoles, no se conocen con exactitud, uno de los
mecanismos más aceptados es la capacidad de estos compuestos de insertarse en las
membranas celulares y modificar la estructura y fluidez de los lípidos de membranas
(Sakakibara et al 2003).

Los polifenoles son compuestos bio-sintetizados por las plantas, conformados por
un grupo hidroxilo (OH) unido a uno o más anillos bencénicos, los cuales no sólo se
caracterizan por ser antioxidantes; sino también por las actividades biológicas
 4

potencialmente beneficiosas para la salud. En diversos estudios realizados en la baya de

Ugni molinae T., se establece que contiene polifenoles, que al igual que las demás bayas
son también flavonoides, taninos y ácidos fenólicos (Rodríguez et al., 2014).

Los polifenoles presentes en la baya de murta se pueden dividir en dos grandes

grupos (Shene et al., 2009):

1. Glucósidos de flavonoides que son compuestos de flavonas y sus derivados. En la

baya de murta se encuentran principalmente cuatro glucósidos: miricetina,
quercetina, ramnósido y diramnósido.
2. Flavan-3-ol (monómero) derivado del flavano. Estos se encuentran en la murta en
menor proporción que los glucósidos de flavonoides, el principal representante es la
epicatequina (FIGURA 1).

a) b)

FIGURA 1. Estructura química de: a) Flavan-3-ol.y b) Epicatequina

En general, el contenido en polifenoles es alrededor de los 32 ± 4 mg ácido gálico/100g

masa seca (Ruiz et al., 2010). Los polifenoles presentes en la hoja de murta se han descrito
como: epicatequina, diramnósido de miricetina, ramnósido de miricetina, glucósido de
miricetina, diramnósido de quercetina, ramnósido de quercetina, glucósido de quercetina y
el glucósido de canferol (Rubilar et al., 2006), cuyas estructuras se presentan en la
FIGURA 2.
 5

a) b) c)

d)
e)

f) g)
h)

FIGURA 2. Compuestos fenólicos identificados en extractos etanólicos de hojas de murta

a)Epicatequina , b)Di-ramnósido de miricetina, c) Ramnósido de miricetina, d) Glucósido de miricetina, e) Di-ramnósido
de quercetina, f) Glucósido de quercitina , g) Glucósido de canferol, h) Ramnósido de quercetina

En las hojas también se encuentran derivados del ácido gálico en extractos

alcohólicos y acuosos respectivamente (Rubilar et al., 2006). Además, en extractos de
diclorometano y acetato de etilo se han encontrado triterpenos como el ácido asiático y el
ácido alfitólico, que han demostrado tener efecto antiinflamatorio tópico (Aguirre et al.,
2006; Delporte et al., 2007).

Dentro de los polifenoles totales se encuentran las antocianinas, que son los
principales pigmentos solubles en agua y a su vez una clase de flavonoides responsables de
los colores en las frutas y la mayoría de las flores de las plantas superiores. Ellos han sido
reportados por exhibir importantes funciones fisiológicas: antioxidantes, anti mutagénicas y
anti cancerígenas (Wang et al., 2013).

En la murta es complejo retirar sus peciolos y tallos para la elaboración de un jugo.

Esta investigación apunta a la preparación de un jugo que considera el fruto con sus tallos y
peciolos, preparado no sólo por la industria, sino por el consumidor común, considerando
un procesamiento rápido y fácil, utilizando toda la materia prima, sin importar calibre,
color, zona, variedad y frescura. Es por esto, que los compuestos bioactivos presentes en el
jugo de murta van a ser tanto del fruto como de partes verdes (tallos y peciolos), dentro de
 6

las cuales encontramos clorofila, que tiene un potencial beneficioso para la salud por su
efecto protector frente al cáncer atribuido a su actividad antioxidante y antimutagénica
(Ferruzzi, 2007). Por otra parte, las clorofilas también pueden provenir de la fruta sin
madurez fisiológica, dado que en la maduración se producen también cambios de color, que
se caracterizan por la desaparición de las clorofilas y la síntesis de pigmentos coloreados,
fundamentalmente carotenoides y antocianos.

a) b) c)

FIGURA 3. Fotos de Ugni molinae Turcz.

a) Hojas de murta: de forma perenne, lanceolada y de color verde oscuro; b) flores de murta: hermafroditas de forma
acampanada, de color rosado; c) frutos de murta: baya globosa de color rojo intenso.

Dentro de los posibles pigmentos a encontrar en la murta están los carotenoides.

Estos son compuestos ubicuos en la naturaleza, presentes en diversas estructuras de plantas
y en gran variedad de animales, algas, hongos y bacterias. Estos pigmentos son
responsables del color de flores y frutos, favoreciendo la polinización y dispersión de
semillas. También, se encuentran en estructuras animales como las plumas y picos de
algunos pájaros, el exoesqueleto de crustáceos y el músculo o la piel de algunos peces. Sin
embargo, su función fundamental en la naturaleza es tener participación en procesos
fotosintéticos (captación de luz, fotoprotección, disipación de excesos de energía,
desactivación de oxígeno singlete, etc.) (Meléndez et al., 2007).

Químicamente, los carotenoides son terpenoides, formados básicamente por ocho

unidades de isopreno, de tal forma que la unión de cada unidad se invierte en el centro de la
molécula. En los carotenoides naturales sólo se encuentran tres elementos: carbono,
hidrógeno y oxígeno. El oxígeno puede estar presente como grupo hidroxilo, metoxilo,
epoxi, carboxilo o carbonilo. Dentro de los carotenoides se puede distinguir dos grupos: los
 7

carotenos, que son hidrocarburos, y las xantofilas, que poseen oxígeno en su molécula
(Meléndez et al., 2007). En cuanto a sus actividades biológicas, los carotenoides han sido
relacionado con la reducción del riesgo de desarrollar enfermedades como el cáncer, las
enfermedades cardiovasculares, las cataratas y la degeneración macular (Sánchez et al.,
2014).

En la elaboración de jugo de murta para consumo humano se utiliza agua, lo que

indicaría mayor presencia de compuestos hidrosolubles, a diferencia de los estudios de
identificación y cuantificación, en los que se utilizan diferentes metodologías de extracción
con solventes orgánicos. Un parámetro a considerar en la elaboración del jugo es el color.
Debido a que consumidores manifiestan una fuerte preferencia por aquellos productos de
apariencia atractiva y el color es el primer atributo que se juzga.

El color es una cualidad organoléptica de los alimentos (FIGURA y Teixeira, 2007).

A parte de ser un fenómeno psíquico o psicológico, es el resultado de la evaluación de la
energía radiante (magnitud física) en términos de una correlación visual (psicológica) y está
basada en las propiedades del ojo humano (fisiológicas). Según Bello (2008) el color es la
propiedad que se aprecia por el sentido de la vista, cuando le estimula la luz reflejada por el
alimento que contiene sustancias con grupos cromóforos, capaces de absorber parte de las
radiaciones luminosas dentro de una determinada longitud de onda.

En el caso de un jugo natural sin aditivos ni colorantes, según Bello (2008) el color
está dado por la radiación luminosa que refleja, la cual es en función de las moléculas de
ciertos grupos funcionales orgánicos que integran sus estructuras químicas.

Para otorgar la propiedad de ser colorante necesita responder a tres requisitos

esenciales:

1.- Presencia de grupos cromóforos: un cromóforo es una parte o conjunto de

átomos de una molécula responsables del color. Estos se encuentran en sistemas
conjugados pi o complejos metálicos. En la primera forma, los niveles de energía
que alcanzan los electrones son orbitales pi generados a partir de series de enlaces
 8

simples y dobles alternados, como sucede en los sistemas aromáticos. Entre los
ejemplos más comunes podemos encontrar a los licopenos, β-carotenos, y
antocianinas. Los cromóforos de complejos metálicos surgen de la división de
orbitales d al vincular metales de transición con ligantes. Algunos ejemplos de estos
cromóforos son: la clorofila, la hemoglobina y la hemocianina. Una característica
común en bioquímica son los cromóforos formados por cuatro anillos de pirrol, que
pueden ser de dos tipos, 1) pirroles en cadena abierta, no metálica: fitocromo,
ficobilina, y bilirrubina y, 2) pirroles en anillo (porfirina), con un ion metálico en el
medio: hemoglobina, clorofila.
2.- Combinación de los grupos cromóforos con estructuras cíclicas, tal como el
radical bencilo (C6H5-).
3.- Incluir en la estructura total grupos auxocromos, es decir, grupos ácidos
(carboxilos) o básicos (aminos), capaces de estar ionizados según el pH del medio y
ofrecer de este modo una coloración determinada.

El color es un factor determinante de la calidad en la industria alimentaria.

Específicamente en jugos, puede ser un indicador de la calidad nutricional y funcional
durante el almacenamiento. La calidad de un alimento con propiedades curativas se ha
convertido en un problema importante de abordar, ya que no sólo debe considerar la
inocuidad alimentaria, sino también la perduración de las propiedades benéficas para la
salud. Por lo tanto, uno de los parámetros a evaluar es la degradación de los pigmentos
(Burdurlu et al. 2006) que a la vez se relaciona con la capacidad antioxidante y la
variabilidad del color.

La capacidad antioxidante o propiedades antioxidantes es una de las cualidades

beneficiosas cada vez más valorada en las frutas y las hortalizas por los consumidores.
Generalmente, un antioxidante es definido como aquella sustancia natural o artificial con
capacidad para neutralizar y proteger a un sistema biológico frente a radicales libres, tales
como los radicales de oxígeno, los de nitrógeno y los radicales lipídicos. En química, un
radical (antes radical libre) es una especie química (orgánica o inorgánica), caracterizada
 9

por poseer uno o más electrones desapareados. Se forma en el intermedio de reacciones

químicas, a partir de la ruptura homolítica de una molécula y, en general, es
extremadamente inestable y, por tanto, con gran poder reactivo y de vida media muy corta
(milisegundos). En esta investigación se estudia la relación existente entre la actividad
antioxidante de los jugos de murta, desarrollando una evaluación preliminar del efecto de
procesamiento sobre la murta en una extracción con vapor de agua, analizando el grado de
extracción y la estabilidad de pigmentos naturales, polifenoles, antocianinas, clorofilas,
carotenoides y capacidad antioxidante del jugo de murta, estableciendo la relación de los
pigmentos con la variación del color y capacidad antioxidante, por lo cual se postula lo
siguiente:

Hipótesis de trabajo Los compuestos bioactivos del jugo de murta (Ugni molinae T.)
obtenido por extracción con el vapor son de distinta naturaleza y tienen distinta estabilidad
durante el almacenamiento.

Objetivo General: Evaluar el proceso de degradación de los principales compuestos

bioactivos de jugo de murta extraído con vapor, bajo distintas condiciones de operación y
de almacenamiento.

Objetivos específicos:
 Cuantificar el contenido de polifenoles, antocianinas, clorofilas y carotenoides totales en
el jugo, para cada condición de almacenamiento.
 Determinar la actividad antioxidante en el jugo, para cada condición de almacenamiento.
 Evaluar el efecto de procesamiento con vapor de agua sobre los compuestos bioactivos
del extracto de murta.
 Evaluar el efecto del almacenamiento sobre los compuestos bioactivos del extracto de
murta.
 Evaluar el color del jugo, en función de la concentración de pigmentos, para cada tiempo
de procesamiento y para distintas condiciones de almacenamiento.
 10

2 MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 Ubicación del estudio

El presente trabajo de investigación se realizó en el Instituto de Ciencia y

Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias de
la Universidad Austral de Chile, en la ciudad de Valdivia, Chile.

2.2 Materiales

Materia prima: La murta (Ugni molinae Turcz) fue adquirida en el mes de abril de 2013 en
la ciudad de Valdivia-Chile y se mantuvo almacenada en un congelador a -20 °C hasta
enero del 2014, momento en que se utilizó para realizar los ensayos.

Reactivos y equipos: Estufa (Memmert 100-800, Alemania), espectrofotómetro (Rayleigh,

modelo UV-1601, CHINA), pH-metro Fischer Accumet modelo 210 y colorímetro
electrónico analizador de líquidos LMT1 Dr. LANGE. Los reactivos utilizados fueron
adquiridos de Merck, Chile, los cuales correspondieron a reactivo Folin-Ciocalteu,
carbonato de sodio anhidro p.a., ácido gálico (anhidro, para síntesis), Trolox, DPPH (2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl), éter de petróleo 0.1 N, acetona 85 % v/v, carbonato de calcio
precipitado.

2.3 Diseño experimental

El diseño experimental utilizado consiste en un diseño factorial multinivel

3131111 con tres repeticiones. En primer lugar, se utilizó el concepto de nivel,
representado por los números 3, 3 y 11, que significan 3 tiempos de extracción, 3
temperaturas de almacenamiento y 11 días no correlativos de tiempos de almacenamiento.
En la TABLA 1 se detallan los factores con sus respectivos niveles. A través de este diseño
 11

se buscó evaluar la estabilidad y cantidad de los pigmentos del jugo de murta en el tiempo,
considerando tres variables de respuesta: concentración de los pigmentos, capacidad
antioxidante y color.

TABLA 1. Variables independientes del modelo (Factores)

Factor Nivel
Tiempo de extracción por vapor (Et) 15- 30 - 45 min
Temperatura de almacenamiento (TA) 5- 20 -35 °C
Tiempo de almacenamiento (At) 1-2-5-8-12-14-20-23-16-30-34 días

Preparación de la muestra
Los ensayos consistieron en obtener extractos acuosos (jugos) desde la murta
congelada. Esto se realizó por arrastre de vapor a tres tiempos de operación (15, 30 y 45
min) y posteriormente, los extractos fueron almacenados en frascos color ámbar a tres
temperaturas (5, 20 y 35°C). Todas las muestras utilizadas para los análisis y los ensayos de
almacenamiento tenían la calidad de un jugo apto para el consumo humano. El método por
arrastre de vapor se describe en adelante (punto 2.4).

Como control se utilizó un método no térmico de laboratorio para extractos

vegetales, que consiste en agregar 25 g de murta a 100 ml de agua y luego triturar en una
licuadora. Se obtiene el filtrado o extracto, el cual se centrifuga durante 15 min a 4 °C y
3500 rpm. El extracto obtenido por este método, fue analizado del mismo modo que los
extractos obtenidos en el proceso de extracción por arrastre de vapor. Este método se define
a partir de ahora con la nomenclatura Lab.

2.4 Extracción por arrastre de vapor

Se basa en exponer la fruta a un flujo de vapor de agua, a temperatura de ebullición

a presión atmosférica (±100 °C), que fluye de manera ascendente, desde la base de un
recipiente de aluminio, hasta alcanzar el contenedor con los frutos, provocando su
 12

ablandamiento y iniciando la extracción. El vapor ascendente al entrar en contacto con la

fruta, se condensa y el agua condensada desnaturaliza la fruta, permitiendo extraer el jugo,
el cual se acumula en el receptáculo intermedio (receptáculo 2) y se mantiene caliente, por
lo cual se logra un efecto de pasteurización y una condición de asepsia con el embotellado
en caliente del producto pasteurizado (FIGURA 4).

Receptáculo 1 Receptáculo 2 Receptáculo 3

FIGURA 4. Olla extractora de jugo por arrastre de vapor.

Funcionamiento:

 Receptáculo 1: Este recipiente contiene el agua para la producción de vapor a la

temperatura de ebullición (100 °C, 1 atm) por contacto directo con una fuente de
calor (p. ej. Un cocinilla a gas). El vapor generado atraviesa el receptáculo 2 y luego
sube al receptáculo 3.
 Receptáculo 2: Este receptáculo es apilado sobre el receptáculo 1. Su función es
acumular el jugo producto que escurre del tercer receptáculo donde ocurre la
condensación del vapor sobre las frutas. Posee una válvula por donde se extrae el
jugo listo para embotellar.
 Receptáculo 3: Este receptáculo tiene el diseño de un canasto apilado sobre el
receptáculo 2. Su función es contener la fruta y permitir el paso del vapor a través
del lecho de fruta.

2.5 Balance de materia

El balance establece que la masa de un sistema permanece siempre constante,

debido a la ley de la conservación de la materia. En el experimento se realizaron los
 13

balances de materia mediante la determinación de la masa inicial y final de cada proceso y

un análisis proximal de las frutas residuales de la extracción. Para el análisis proximal se
liofilizaron las muestras. Las cenizas totales se determinaron en la muestra calcinada según
el método AOAC (N° 942.05, AOAC 1996). La proteína bruta se determinó según el
método AOAC (N° 990.03, AOAC 1996). La fibra cruda se determinó según el método
AOAC (N° 978.10, AOAC 1996). La materia seca se determinó según el método AOAC
(N° 930.15, AOAC 1996).

2. Determinación de concentración de polifenoles.

Los polifenoles fueron determinados como ácido gálico equivalente (GAE) por el
método colorimétrico de Folin-Ciocalteu (FC). A 40 µL de extracto se añadieron 3,16 ml
de agua destilada, 200 µL de reactivo de FC y 600 µL de carbonato de sodio
(Na2CO3•5H2O) al 20 %; la mezcla se agitó y se dejó en oscuridad por dos horas.
Transcurrido el tiempo, se leyó la absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro (Rayleigh
UV-1601, China) (Chuah et al., 2008). Para obtener la concentración de polifenoles por el
método Folin-Ciocalteu se realizó una curva de calibración, utilizando ácido gálico a
diferentes concentraciones y se midió en triplicado la absorbancia a 765 nm. Los valores se
expresaron en (μg/mL) de ácido gálico (FIGURA 5).

1
0,8
Absorbancia

0,6
0,4
y = 0,0009x - 0,0367
0,2
R² = 0,9956
0
0 200 400 600 800 1000 1200

(mg/mL) de ácido gálico

FIGURA 5. Curva de calibración utilizando ácido gálico como estándar a 765 nm

 14

2.7 Determinación del contenido de antocianinas

El contenido de antocianinas fue determinado según el método descrito por Wang et

al. (2000); el extracto fue diluido con buffers de pH 1 y 4,5 para luego medir la absorbancia
a 510 nm. Se eliminó la turbidez presente midiendo la absorbancia a 700 nm y sustrayendo
este valor de la absorbancia a la longitud de onda de 510 nm (Ecuación 1).

, , Ec. 1

La concentración de antocianinas (C) se determinó mediante la siguiente fórmula

expresada en (µg /ml)

Ec. 2
1000

Para el cálculo del contenido de antocianinas se utilizó el peso molecular (PM) y el

coeficiente de extinción molar (ε) del pigmento antociano presente en mayor proporción.
En la murta se encuentra cyanidin-3-glucósido con PM de 449,2 g/mol y ε de 46230
mol cm2 (RUIZ et al., 2010). En la ecuación 2 A es la absorbancia, FD es el factor de
dilución y L es la longitud en cm.

2.8 Determinación de clorofila total y de carotenos

Los pigmentos fotosintéticos y accesorios son componentes solubles en grasas por

lo que su extracción puede realizarse con solventes orgánicos como acetona, metanol o
etanol. En las extracciones de pigmentos hay que tomar en consideración la alta
sensibilidad de los pigmentos fotosintéticos a la luz. Por esto, la extracción se realizó en
condiciones de luz tenue, los pigmentos de la murta se determinaron a través de la
espectrofotometría, con ecuaciones que relacionan la concentración de pigmentos en el
extracto a muestrear con la absorbancia a distintas longitudes de onda.
 15

El procedimiento se llevó a cabo a través del método oficial AOAC N° 942.04,

(AOAC, 1996). Brevemente, a 10 ml de jugo de murta se le incorpora 0,4 g de carbonato de
calcio, 10 ml de acetona al 85 % v/v, 5 ml de éter de petróleo de 0,1 N, y se agitó hasta que
la separación completa de la pigmentación de la grasa y fibra soluble. Se incorporan 50 ml
de agua destilada a la solución, que se filtró finalmente y se leyó la absorbancia del filtrado
a 660, 642 y 470 nm con acetona como blanco. Las concentraciones en µg/ml se calcularon
con las siguientes fórmulas:

7,12 16.8 Ec. 3

9,93 0,777 Ec.4

17,6 2,81 Ec.5

1000 – 1.82 – 82.02 / 198 Ec.6

2.9 Capacidad antioxidante por método DPPH

Se determinó la capacidad antioxidante a través de la decoloración del radical libre

2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), propuesto por Brand-Williams et al., (1995). La
muestra del jugo almacenado se mezcló con 2,9 ml de DPPH en etanol con una absorbancia
de 0,8. A la muestra se le miden los valores de absorbancia a 515 nm después de 20 min.
La capacidad antioxidante se expresó en Trolox equivalente (mg TE/L). Para cuantificar la
inhibición se desarrolló una curva de calibración, usando el reactivo de Trolox y aforado
con metanol, logrando concentraciones de 25, 50, 75 y 100 ppm. Usando como blanco
DPPH a una absorbancia de 0,8 equivalente a 4 mM. Se dejó reaccionar la solución durante
30 min, midiendo la absorbancia en el espectrofotómetro a 515 nm a intervalos de 10 min.
De esta forma se cuantificó la capacidad antioxidante en Trolox equivalente (FIGURA 6).
El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente ecuación:
 16

Ec.7
% ó 100

0,8 y = ‐0,0076x + 0,896
R² = 0,9983
Absorbancia

0,6

0,4

0,2

0
0 20 40 60 80 100 120
mg TE/L

FIGURA 6. Curva de calibración capacidad antioxidante a 515 nm

2.10 Medición del color

El color se determinó a través del colorímetro de líquidos (Dr. Lange, Alemania),

con características del observador normal 10°, iluminante estándar D65. El blanco de
referencia utilizado fue de acuerdo a la norma DIN 5033 (modelo de referencia blanco
estándar LZM 076 de Dr. Lange, Alemania) y los valores de referencia son Xn = 78,2, Yn =
83,1, y Zn = 89,9. Los valores CIE XYZ definidos fueron trasformados al sistema esférico
para obtener los valores L*, a*,b*,H* y C*.

Las coordenadas L*, a*, b* son magnitudes adimensionales y su equivalencia con el

sistema CIE X, Y, Z es la siguiente:

∗
Ec.8
116 16
 17

∗
Ec.9
500

∗
Ec.10
200

Donde X, Y, Z son los valores triestímulo de la muestra y Xn, Yn, Zn los del punto
acromático correspondiente al iluminante empleado.

a b

FIGURA 7. Sólido de color del sistema Hunter Lab Sistema de color tridimensional

El croma (C*) y el tono (H*) se obtienen de la siguiente ecuación:

∗ ∗ ^2 ∗ ^2 Ec.11

∗
∗
arctan ∗ Ec.12

Se utilizó el valor E para medir el cambio de color total, que se calculó con la
siguiente ecuación (WU et al 2013):

 Ec.13

El estudio relacionó E, L, a, b, C y H con el tiempo de extracción,

almacenaje y las concentraciones de polifenoles, antocianinas y clorofilas.
 18

2.11 Análisis estadístico

El análisis estadístico para las pruebas de variables continuas como degradación de

pigmentos, pérdida de color y capacidad antioxidante a lo largo del tiempo, usó el diseño
factorial multinivel. Se utilizó el estadístico de Durbin-Watson (DW) ANOVA, para
establecer las relaciones entre las variables. Conjuntamente, se desarrollaron predicciones
del modelo a través de regresiones simples y múltiples.

Las diferencias entre los procesos de extracción se determinaron utilizando modelos

lineales generalizados (GLM). Para este efecto, las variables se consideraron de forma
categórica, a excepción de la variable (At), que se consideró de forma cuantitativa. Se
establecieron las diferencias entre los tratamientos a través de comparaciones múltiples
utilizando el test HSD de Tukey. Para todos los análisis estadísticos se consideraron las
pruebas de normalidad, homogeneidad de varianza e independencia. Los cálculos
estadísticos se realizaron utilizando StatGraphics® Centurion IV (Statistical Graphics
Corp., Herndon, VA, USA).
 19

3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El presente trabajo de investigación tiene como objetivo general evaluar el proceso

de degradación de los principales compuestos bioactivos de jugo de murta extraído con
vapor, bajo distintas condiciones de operación y de almacenamiento. Esta investigación
permitirá, 1) determinar que el jugo tiene una mayor vida útil que la murta fresca, 2)
identificar el tratamiento térmico más apropiado para la extracción de los pigmentos y, 3)
cuantificar los pigmentos presentes durante el almacenamiento. Además, a través de esta
investigación se fijan las condiciones de elaboración de un producto, en el cual se podrá
determinar la biodisponibilidad y bioaccesibilidad de los antioxidantes presentes en la
murta. En este capítulo se presentan los resultados y la discusión en torno a ellos.

3.1 Balance de materia

El balance de materia se obtuvo evaluando los parámetros que se muestran en las

TABLAS 2 y 3. En el jugo se midió el rendimiento, el contenido de sólidos solubles, el pH
y la cantidad de residuo de extracción (TABLA 2), al cual, se realizó el análisis proximal
que consistió en la medición de cenizas, proteínas, extracto etéreo, fibra cruda y
carbohidratos (TABLA 3).
El rendimiento del jugo para los tiempos de procesamiento de 15, 30, y 45 minutos,
entregó una diferencia significativa con un nivel de confianza del 90%, siendo el mayor a
45 min. Esto se debería a que la fruta estuvo expuesta durante más tiempo al efecto del
vapor, el cual produce ablandamiento del tejido, ruptura celular y por ende mayor
liberación de jugo. Por otro lado, también aporta al rendimiento la mayor cantidad de agua
de condensación.
Respecto a los sólidos solubles (SS) y el pH, se observó que el pH disminuyó a
medida que aumenta la concentración de los sólidos solubles. Esto pudo deberse a una
mayor extracción de ácidos orgánicos. La diferencia es significativa entre los valores de
concentración de SS obtenidos a 15 min y 30 min, no así, entre los de 30 y 45 minutos,
 20

aunque la concentración de SS obtenida a 45 min es levemente más baja. Esto se debe al

efecto de una dilución por la disminución de SS en las frutas y la mayor cantidad de
condensado que se tiene durante un tiempo prolongado de proceso. Esta baja junto con una
dilución significó una extracción total de los ácidos orgánicos liberados del tejido celular.
Se observó también una reducción en la cantidad residual de la murta extraída, lo cual
indicó una pérdida gradual de materia en las frutas, correspondiendo al aumento de SS en
el extracto.

En la TABLA 3 se muestra la composición de la murta después de la extracción a 3

distintos tiempos de proceso. Las muestras de murta fueron liofilizadas antes del análisis y
se expresan en porcentaje de la masa seca. Se observó que la proporción de carbohidratos
era mayor en la muestra fresca en comparación con el proceso de extracción con vapor; ésta
disminuyó significativamente al aumentar el tiempo de proceso, de 77,3% a 72,4%, lo que
indicó una lixiviación de azúcares y otras sustancias solubles en agua.

Por otra parte, la fibra cruda aumentó de 12,3% a 15,8% con el tiempo de proceso
en forma significativa, no existiendo diferencia significativa entre el tratamiento de 30 y 45
min, lo que indicó una retención de dicha fibra y una disminución de la cantidad de masa
seca total.

El extracto etéreo y las cenizas se mantuvieron estables en las distintas extracciones,

lo que indicó que estos componentes quedaron retenidos en el tejido celular y no son
arrastrados por el flujo de jugo.

TABLA 2. Rendimiento, sólidos solubles, pH y residuo por cada tiempo de procesamiento

Procesamiento Rendimiento Sólidos solubles pH Fruta residual
ml jugo/kg fruta °brix kg/kg
15 min 1450±28,2c 7,5±0,1b 3,78±0,01a 0,73±0,03a
30 min 1570±31,8b 7,9±0,1a 3,76±0,01b 0,64±0,03b
45 min 1660±16,6a 7,8±0,1a 3,76±0,01b 0,55±0,02c
Con un nivel de confianza del 95%. Las letras diferentes, dentro de cada tratamiento, indican diferencias estadísticas para la prueba de
Tukey (95%).
 21

TABLA 3. Composición de la murta residual a distintos tiempos de extracción

Composición de las muestras liofilizadas del residuo de extracción a
Componente distintos tiempos de proceso
0 min 15 min 30 min 45 min
Cenizas % 2,8 ± 0,1a 2,7±0,2a 2,8±0,1a 2,8±0,1ª
Proteína % 4,4 ± 0,1d 4,8±0,1c 5,0±0,1b 5,6±0,1ª
a a b
Extracto etéreo % 3,3 ± 0,1 3,3±0,1 2,7±0,2 3,4±0,1a
Fibra cruda % 12,3±0,1c 13,2±0,1b 15,7±0,1a 15,8±0,1a
Carbohidratos % 77,3± 0,1a 76,0±0,1b 73,7±0,1c 72,4±0,1d
Con un nivel de confianza del 95%. Las letras diferentes, dentro de cada tratamiento, indican diferencias estadísticas para la prueba de
Tukey (95%).

3.2 Variación del contenido de pigmentos, de la actividad antioxidante y del color en

función del tiempo de extracción

La extracción del jugo de murta tratada bajo distintas condiciones de operación,

generó diferencias altamente significativas (p>0,001) en cuanto al contenido de pigmentos,
la capacidad antioxidante y la variación de color (TABLA 5 y 6). Se observó también una
correlación directa entre el contenido total de pigmentos y la capacidad antioxidante.

3.2.1 Pigmentos en función del tiempo de extracción

El contenido de pigmentos del extracto obtenido por el método no térmico de
laboratorio resultó menor, que el del extracto obtenido por arrastre de vapor. Esto se debió
a que, al no aplicar tratamiento térmico, los tejidos celulares en la fruta no se
desnaturalizaron y los pigmentos quedaron atrapados en la matriz celular. A través de la
cuantificación de los pigmentos se advirtió también, que existió una relación entre la
cantidad de pigmentos y la capacidad antioxidante determinada. Para ambos parámetros se
obtuvo la mayor concentración en el tratamiento de 30 min (TABLA 4).
 22

TABLA 4. Comparación del sistema de extracción: contenido de pigmentos y DPPH

Capacidad antioxidante y concentración de pigmentos en jugo de murta
Tratamiento

DPPH PFT ACN CHL a CHL b CRT CHL T

µg TE/ ml µg GAE/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
*** *** *** *** *** *** ***
Lab 327,60±49 c 769,6 ± 7,21 d 2,1±0,10 d 1,0±0,1 b 2,1±0,2 d 1,2±0,0 c 3,3±0,3 d

15 min 3310,40±61 b 2573,3 ±1,90 b 4,4±0,20 c 4,2±0,3 b 9,2±0,1 c 5,2±1,1 cb 12,5±0,5 c

30 min 3643,70±37 a 2987,5±12,5 a 6,7±0,20 a 22,0±0,4 a 32,5±0,0 a 18,1±0,13 a 55,7±0,1 a

45 min 3381,80±65 b 2157,9± 8,32 c 5,6±0,20 b 17,6±0,2 a 30,3±0,0 b 8,4±1,0 b 47,5±0,1 b

Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de *** P <0,001 en ANOVA factorial. Las letras diferentes, dentro de cada
tratamiento, indican diferencias estadísticas para la prueba de Tukey (95%).

Polifenoles totales
Las muestras de murta fresca utilizadas para el proceso de extracción son de la
misma procedencia que las muestras utilizadas por Rodríguez et al., (2014). Se observó que
en el proceso de extracción por arrastre de vapor, sólo se logró extraer una porción de los
pigmentos existente en la fruta fresca. El porcentaje de pigmentos extraído en el jugo de
murta para los distintos tiempos de proceso fue de 6,23% (Lab), 7,55% (15 min), 9,50 %
(30 min) y 7,25 % (45 min). Esto indicó una extracción de menos del 10% de estos
compuestos bioactivos presentes en la fruta fresca al utilizar agua como solvente, lo que
dejó también un sub-producto con un importante contenido de PFT. La mayor
concentración de pigmentos se obtuvo después de 30 min de extracción.

Rodríguez et al., (2014) reportaron que el contenido de PFT en murta fresca es de

4941±399 mg GAE/100 g dm, estando dentro de la gama de valores reportados para las
frutas, tales como ciruelas, moras, arándanos y fresas (Balasundram et al., 2006.; Vasco et
al., 2008.; Fu et al., 2011). Por otra parte, Rubilar et al., (2011) reportaron un contenido de
PFT en murta fresca de 1010 ±160 mg GAE/100 g dm. Los resultados reportados por
Rodríguez et al., (2014) y Rubilar et al., (2011) son distintos y demuestran una posible
variación en el contenido de PFT en la murta. También es probable que estas diferencias se
deban al uso de otras metodologías de extracción con diferentes solventes orgánicos,
 23

además de la variabilidad propia entre bayas de murta. El método de extracción utilizado

por Rubilar et al., (2011) hace uso de éter de petróleo y acetona, lo que explica también el
menor contenido de los polifenoles, comparando con los valores reportados por Rodríguez
et al., (2014).

Antocianinas.
La mayor concentración de antocianinas se obtuvo a los 30 minutos de extracción,
seguida por la de 15 min y finalmente la de 45 minutos. Esto indicó que después de 45 min,
comenzó una dilución, debido a que el vapor condensado empezó a disolver cada vez
menor cantidad de pigmentos,cayendo así la concentración de antocianinas. En el caso de la
muestra Lab los pigmentos quedan atrapados en el filtrado sobre todo en las cáscaras.

Aunque las antocianinas son pigmentos hidrosolubles, las concentraciones fueron

bajas, producto de la alta vulnerabilidad de estos compuestos a la temperatura (Kirca y
Cemeroglu, 2003; Kirca et al., 2007; Harbourne et al., 2008), a la presencia de oxígeno
(Starr y Francis, 1968), ácido ascórbico (Shrikhande y Francis, 1974) y peróxido de
hidrógeno (Özkan M et al 2002, 2005), así como a cambios en el pH (Kirca et al., 2007;
Fossen et al., 1998). Entre las antocianinas presentes en la murta se han reportado la
peonidina-3-glucósido y la cianidina-3-glucósido, con una alta variabilidad entre las zonas
de cosecha. Para la ciudad de Valdivia se reportaron concentraciones de 0,19 ± 0,01 y
0,24 ± 0,02 µmol/g murta fresca (Ruiz et al, 2010). Estos valores indicarían que se
transfiere al jugo solo entre 8 y 12 % de las antocianinas.

Clorofilas

La mayor concentración de clorofilas al igual que los demás pigmentos se obtuvo en

la extracción de 30 minutos, siendo la clorofila b la más estable a la temperatura. Sin
embargo, a los 45 min ocurre el proceso de dilución como con los demás pigmentos.

Las principales clorofilas en las plantas incluyen clorofilas a y b, que se producen en

una relación aproximada de 3:1 (Ferruzzi y Blakeslee, 2007). A través de la extracción por
 24

vapor no se mantuvo esta relación (TABLA 4). Durante el tratamiento térmico se degradan
las clorofilas, produciéndose reacciones químicas, que implicaron la formación de
derivados de clorofila. Teng y Chen (1999) reportan que las principales transformaciones
son isómeros de clorofila (clorofilas aʼ y bʼ) y feofitinas a y b. Las clorofilas aʼ y bʼ tienen
el mismo espectro de absorción y por lo tanto, su formación no causa cambios de color. Sin
embargo, la formación de feofitina está acompañada por la modificación de color verde
brillante a marrón oliva (Clydesdale y Francis, 1976). Las feofitinas se forman a partir de
las clorofilas a través del reemplazo de magnesio en el anillo de porfirina, por los ácidos
orgánicos liberados del tratamiento térmico. Se han propuesto opciones con tratamiento
térmico para conservar el color verde brillante de la clorofila. Por ejemplo, la neutralización
de los ácidos presentes, el procesamiento de alta temperatura con tiempos cortos y
aplicación de complejos metalo. No obstante, la mayoría de estos métodos han tenido un
éxito limitado.

A pesar de la baja concentración de clorofilas en los jugos debido al severo

tratamiento térmico, el impacto real sobre los beneficios para la salud no es totalmente
reducido. La metodología empleada no midió los derivados de las clorofilas, que se
producen durante la extracción y, se ha demostrado que las clorofilas y sus derivados son
importantes promotores de la salud en funciones anti-mutagénicas, anticancerígenas y
antiinflamatorias (Ferruzzi y Blakeslee, 2007).

Carotenos
La mayor concentración de carotenos fue obtenida a los 30 min, y a los 45 min
ocurre una baja importante, lo cual pudo deberse al mayor tiempo de exposición a la fuente
de calor, causando la degradación de los carotenos (CRT). También pudo deberse al efecto
de dilución descrito anteriormente. La concentración de carotenos obtenido a 45 min de
extracción no se diferenció significativamente de la concentración obtenida con 15 min de
proceso, la cual también fue igual a la concentración de la muestra Lab.
 25

Las bajas concentraciones de carotenoides en el jugo de murta puede deberse

también a que son compuestos lipídicos, aunque existen algunas excepciones, por lo que
son insolubles en agua y solubles sólo en disolventes orgánicos como acetona, metanol, éter
dietílico, hexano, cloroformo y piridina, entre muchos otros.

Dentro de las excepciones que son solubles en agua están los carotenoides ácidos
que pueden formar sales sódicas o potásicas solubles en agua después de un tratamiento
con álcali, como es el caso de bixina, astaceno o mitiloxantina (Britton et al., 1992) y
(Schiedt et al., 1995). Las caroteno proteínas son también solubles en agua y muy estables
(Britton, 1983). El color de estos complejos es estable durante años a temperatura ambiente
y en contacto con el aire, por lo que adquieren un gran interés como posible colorante
(Armenta et al., 2002).

La acción de los carotenoides en la salud humana está íntimamente relacionada con

su estructura y su eficacia, es disímil en diferentes carotenoides (Britton et al., 2004). Por lo
tanto, es necesaria la identificación y cuantificación precisa de los carotenoides de forma
individual. En murta está presente el β caroteno y se informó con 44,26 ±1,17 mg por 100 g
de materia seca (Rodríguez et al., 2013). Posiblemente, los carotenoides extraídos con
vapor son de otra naturaleza, debido a la baja solubilidad que presenta el β caroteno al agua
como solvente. Aunque el calor pudo ayudar a extraer, no se podría afirmar en este estudio
que se logró obtener carotenos hidrofílicos. Por otra parte si llegó a estar presente, el
carácter hidrofóbico de la mayoría de los carotenoides hace que tiendan a la segregación y
la cristalización en el medio acuoso (Britton, 1995).

Capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante tiene relación directa con la concentración de pigmentos
presentes; al igual que los pigmentos la mayor extracción fue a los 30 min, no hubo
diferencia significativa entre el tratamiento de 15 y 45 min. La baja capacidad antioxidante
indicaría que a 15 min no se alcanzan a extraer todos los pigmentos, mientras que a los 45
 26

min ocurre un efecto de dilución. Sin embargo, a 45 min de proceso la dilución fue menor
que en el caso de los pigmentos, lo que pudo deberse a que los pigmentos se transformaron
en algún otro compuesto con capacidad antioxidante. Rodríguez et al. (2014), reportan que
la capacidad antioxidante en murta fresca es de 45.656± 2.367 μmol TE/ 100 g. Dado que
utilizaron la misma cosecha que en este estudio, se podría afirmar que se extrajo alrededor
de solo 4% de la capacidad antioxidante de la murta. Dado que se extrajeron mayor
cantidad de pigmentos, existe la posibilidad que el tratamiento térmico tuvo un efecto sobre
la capacidad antioxidante de los pigmentos.

3.2.2. Variación del color del extracto en función del tiempo de extracción

El color es una característica de valoración física y de calidad en los alimentos, la

cual tiene diferencias altamente significativas en el jugo de murta, en todos sus
componentes (p≤0,0001). La variación de color total E, respecto al tratamiento de
extracción por vapor se incrementó a medida que aumentó el tiempo de proceso, teniendo
el mayor diferencial a los 45 min. Sin embargo, el tratamiento no térmico Lab, tuvo un
valor mayor de E que en el tratamiento térmico de 15 min, esto pudo deberse a posible
eliminación de pigmentos en el proceso de filtración o pudo haber ocurrido una oxidación
de los compuestos, lo que llevó a cambios importantes en el color. El valor de b, el cual
otorga las tonalidades desde el amarillo al azul, tuvo una mayor diferencia a los 45 min de
extracción, al igual que C y CHLa que no demostró diferencia significativa entre los jugos
de 30 y de 45 min de extracción. Esto indicó una correlación significativa entre la variable
b y CHLa por la tonalidad, además indicó también que CHLa fue la responsable de la
saturación del color observada en el valor de C. Por otra parte, Roca (2006) encontró que
CHLb se transforma en CHLa, por lo cual ambos serían responsables de la saturación del
color. La variación del tono H indicó que el color fue definido a los 15 min de extracción
y después de ello sólo hubo una saturación del color.
 27

En cuanto a la variación de luminosidad (L), el valor mayor de la claridad se

obtuvo en el tratamiento no térmico (Lab). La luminosidad en el tratamiento térmico fue
menor que en el tratamiento no térmico. Sin embargo, se observó que la luminosidad
aumentó con el tiempo de operación (TABLA 5). Esto pudo deberse a que en el tratamiento
no térmico, hubo menor paso de pigmentos, contrario a lo que ocurrió después de 15 min
de extracción, donde el tono ya fue definido. Tanto en 30 como en 15 min hay cierta
destrucción de pigmentos, favoreciendo el aumento en L con el tiempo de extracción
(TABLA 5).
En el caso de la variación de color a, el cual otorgó las tonalidades desde el verde
al rojo, hay un comportamiento similar a lo ocurrido con los pigmentos, indicando que a
puede ser una posible herramienta de valoración de los pigmentos.

TABLA 5. Comparación del sistema de extracción de acuerdo a la diferencia de color

Componente del color del jugo de murta
Tratamiento
L a b C h 

*** *** *** *** *** ***

Lab 88,90±0,00 a 28,60±0,01 c 29,8±0,00 d 41,30±0,00 d 0,80±0,00 c 98,10±0,00 c

15 min 58,20±0,07 d 22,10±0,68 d 45,6±0,11 c 50,70±0,39 c 1,11±0,01 a 77,20±0,31 d

30 min 64,70±0,06 c 66,30±0,36 a 57±0,10 b 87,40±0,22 b 0,70±0,00 d 108,80±1,10 b

45 min 78,50±0,18 b 61,90±0,63 b 80,6±0,30 a 101,70±0,21 a 0,91±0,01 b 128,40±0,15 a

Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de *** P <0,001 en ANOVA factorial. Las letras diferentes,
dentro de cada tratamiento, indican diferencias estadísticas para la prueba de Tukey (95%).

3.3 Estabilidad de los pigmentos, la capacidad antioxidante y el color en función de las

condiciones de almacenamiento

En los jugos tratados con distintos tiempos de extracción con vapor, se evaluó la
estabilidad de los parámetros: cantidad de pigmentos, capacidad antioxidante y color, para
las condiciones de almacenamiento que fueron definidas en función de la temperatura y del
 28

tiempo. En términos generales, como era de esperar, los pigmentos y el color se degradan y
la capacidad antioxidante disminuye a lo largo del tiempo de almacenamiento.

3.3.1 Estabilidad de los pigmentos y capacidad antioxidante

El tiempo de almacenamiento es la causa de mayor impacto sobre la degradación,
tanto en los pigmentos como en la capacidad antioxidante (TABLA 6), lo cual confirmó la
relación existente entre ambos parámetros.

TABLA 6. Estabilidad de pigmentos y DPPH

DPPH % IRL PFT ACN CHL a CHL b CRT CHL T
1. Et ns *** ** ** ns ns ns ns
2. TA ns *** *** *** ns * *** *
3. At *** *** *** *** *** *** *** ***
1vs 2 ns ns * *** ns ns ns ns
1 vs 3 ns ns * * *** *** ns ***
2 vs 3 ns *** ns ns ns ns * ns
R 2
89% 81% 72% 70% 33% 35% 23% 35%
DW 0,000 0,000 0,985 0,801 0,000 0,000 0,201 0,000
Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de * P <0,1; ** P <0,05, *** P <0,001 en ANOVA. (At:
tiempo de almacenamiento (días); Et: Tiempo de extracción (min); TA: temperatura de almacenamiento °C); estadístico
de Durbin-Watson (DW)

Polifenoles

En el jugo, los polifenoles fueron afectados significativamente (p≤0,0001) por el

tiempo de extracción (Et), el tiempo de almacenamiento (At) y la temperatura de
almacenamiento (TA) con un 99% de confianza. La interacción tiempo de almacenamiento
(At) versus temperatura de almacenamiento (TA) (p≤0,0155) y la interacción tiempo de
extracción (Et) versus tiempo de almacenamiento (At) (p≤0,0323) fueron significativas al
90 % como se observa en la FIGURA 8.
 29

C:At +
-
B:TA

A:Et

AB

AC

BC

0 2 4 6 8 10 12

FIGURA 8. Diagrama de Pareto estandarizado para la variable de respuesta polifenoles.

( At: tiempo de almacenamiento (días); Et: Tiempo de extracción (min) ; TA: temperatura de almacenamiento °C)

Estos resultados concuerdan con el comportamiento de los polifenoles en el vino,

donde los principales procesos de degradación de los compuestos fenólicos tienen lugar en
los primeros pasos de la vinificación y continúan durante el almacenamiento (Gómez y
Cano, 2011).

En el gráfico de superficie para el almacenamiento del extracto de murta a 5 °C

(FIGURA 9), se predice que la mayor extracción ocurrió ya a un tiempo de 27 min con una
variabilidad de 72% sobre los polifenoles totales (PFT), en el cual sólo fue altamente
significativo el tiempo de almacenamiento (At) (p≤0,0001).

Por lo general, se observa también un descenso del contenido de los PFT en la

interacción del tiempo de almacenamiento versus la temperatura de almacenamiento
(FIGURAS 10 y 12). Por lo tanto, a medida que aumenta la temperatura de
almacenamiento disminuye la concentración de PFT, siendo la temperatura más adecuada
de conservación 5 °C y la máxima degradación 20,5% por 30 min de extracción medidos al
día 34. En jugo de membrillos almacenados por 6 meses, la mejor conservación se obtuvo a
4 °C con degradación máxima de 15 % y, a 30 °C se degradó 37 % (Wojdyło et al., 2014).

Al analizar el modelo con los 3 factores la predicción se redujo a 53 % sobre la

variabilidad de los polifenoles, el modelo de predicción se muestra en la ecuación 14.
 30

2609,08 5,03137 6,05254 19,4027 0,196213 ∙ Ec.14

0,393462 ∙ 0,192286 ∙

2800
mgTEGAE/L
/L

2600

2400
PFT mg
PFT

2200
40
30
2000 20
15 10
20 25 30 35 0 At (días)
40 45
Et (min)

FIGURA 9. Efecto del factor tiempo de almacenamiento a 5°C y tiempo de extracción en relación a los
polifenoles totales.

2800
mgTEGAE/L
/L

2600

2400
PFT mg
PFT

2200
40
30
2000 20
0 5 10
10 15 20 25 30 0 At (días)
35 40
TA (°C)

FIGURA 10. Efecto del factor tiempo y temperatura de almacenamiento a un tiempo de extracción 30 min
en relación a los polifenoles totales.

Antocianinas

La principal causa de degradación de las antocianinas fue el tiempo de

almacenamiento (At) (p≤0,000), posteriormente la temperatura de almacenamiento (TA)
(p≤0,0000) y la interacción tiempo de extracción (Et)*(TA) (p≤0,001). (Et) (p≤0,0026)
afectó incrementando las antocianinas, no afectando negativamente sobre la degradación en
el tiempo (FIGURA 11).
 31

C:At +
-
B:TA

AB

A:Et

AC

BC

0 3 6 9 12 15 18

FIGURA 11: Diagrama de Pareto estandarizado para la variable de respuesta antocianinas.

At: tiempo de almacenamiento (días); Et: Tiempo de extracción (min) ; TA: temperatura de almacenamiento °C)

El tiempo de almacenamiento como también de procesamiento tiene un efecto

significativo (FIGURA 12), sobre las antocianinas, altamente inestables y muy susceptibles
a la degradación. La estabilidad de las antocianinas es generalmente afectada por varios
factores tales como pH, temperatura de almacenamiento, estructura química, concentración,
luz, oxígeno, solventes, presencia de enzimas, flavonoides, proteínas e iones metálicos
(Owusu, 2005; Castañeda et al., 2009; Olaya et al., 2009). La mayor concentración de
antocianinas después de 22 días de almacenamiento se logró a 5 °C con una retención de
91 %, luego a 20 °C hubo una retención de 48 %, mientras que a 35 °C se mantuvo estable
solo el 17 %. De acuerdo a lo reportado por Saucier (2010), la temperatura de
almacenamiento, los tratamientos térmicos y enzimáticos en condiciones anaeróbicas son
factores responsables de la pérdida de antocianinas, desplazando los equilibrios de éstas
hacia las formas de chalconas, las cuales se les atribuyen características como de los
flavonoides, que cuentan con diversas actividades biológicas.
 32

15 p 30 p 45 p 15 a 30 a 45 a
3100
7,0
2900
6,0
2700

ACN mg/mL
5,0
PFT mg/mL

2500
4,0
2300

2100 3,0

1900 2,0

1700 1,0

1500 0,0
1 5 12 14 22

Tiempo de almacenamiento (días)

FIGURA 12. Efecto del factor tiempo de almacenamiento a 5 °C y tiempo de extracción en

relación a la extracción de polifenoles totales (PFT) y antocianinas (ACN) (15 p: 15 min de extracción de PT; 30
p: 30 min de extracción de PT; 45 p: 45 min de extracción de PT; 15 p: 15 min de extracción de An; 30 p: 30 min de extracción de An; 45 p: 45 min de
extracción de An)

Se construyó un modelo para describir la variación de la concentración de

antocianinas durante el almacenamiento (FIGURA 13). El modelo explicó el 69 % de la
variabilidad de éstas con el tiempo de 30 min y manteniendo la temperatura a 5 °C con una
concentración inicial de antocianinas de 6,18 mg/L. Se observó una marcada relación entre
la degradación y la temperatura (Ec.15).

8
/L/L

6
GAE
mgmg

4
ACN
ACN

2
24
20
16
0 8 12
0 10 4 At (días)
20 30 0
40
TA (°C)

FIGURA 13. Efecto sobre la concentración de antocianinas de los factores tiempo y

temperatura de almacenamiento en un jugo de murta obtenido con 30 min de extracción
 33

7,5

/L/L
6,5
GAE
ACNmgmg 5,5
4,5
3,5
ACN

2,5 24
20
16
1,5 8 12
15 20 25 4 At (días)
30 35 40 0
45
Et (°C)

FIGURA 14. Efecto sobre las antocianinas los factores tiempos de almacenamiento y
extracción, en un jugo de murta almacenado a 5°C.

En las FIGURAS 12 a 14, se observa que el efecto de temperatura, tiempo de

extracción y almacenamiento sobre la concentración de la extracción de antocianinas no
aumenta significativamente entre 30 a 45 min de proceso. Se puede predecir con una
variabilidad de 69 % la concentración de antocianinas con el siguiente modelo
multifactorial de la ecuación 15.

3,91423 ∙ 0,0852047 ∙ 0,0105754 ∙ 0,131533 ∙ 0,00206123 ∙ Ec. 15

∙ 0,00216449 ∙ ∙ 0,000782367 ∙ ∙

Clorofilas a, b y carotenos

Se observó un decrecimiento de los pigmentos fotosintéticos (clorofilas a, b y total)

a lo largo del almacenamiento. Esta reducción después de dos semanas y posteriormente
llegó a valores constantes (FIGURA 15).
 34

15 20
12 16
CHL a mg/L

CHL b mg/L
9 12
6
8
3 30
20
25 4 30
0 25
10 15 0 20
0 10 20 30 0
5 At (días) 10 15
40 0 10 5 At (días)
TA °C 20 30 0
40
TA °C

40 12
30 10
CHL T mg/L

CRT c mg/L
8
20
6
10 4
30 30
25 25
20 20
0 2 10 15
10 15 0 5
0 10 5 At (días) 10 20 30 0 At (días)
20 30 0 40
40 TA °C
TA °C

FIGURA 15. Efecto sobre los factores tiempo y temperatura de almacenamiento a 30 min
de extracción en relación a los pigmentos fotosinteticos.Carotenoides (CRT) y Clorofila (CHL)

Sé encontró en el jugo una baja detección de clorofilas y carotenoides. Para las

clorofilas existe una correlación demostrada a través de Durbin-Watson, no así, para los
carotenoides (TABLA 6). Lo más probable es que sólo existe correlación entre las
clorofilas dado que se está midiendo también derivados de clorofila aʼ y bʼ que tienen el
mismo espectro de absorbancia. Estas fueron afectadas altamente por la interacción Et
versus At, lo cual se atribuye a la conversión de la clorofila en feofitina, dado que se perdió
el átomo de magnesio o se rompió el anillo porfirínico por el efecto de la temperatura de
almacenamiento a lo largo del tiempo. El tiempo es altamente significativo en las clorofilas
o derivados de clorofilas detectados en el jugo.

El tiempo de extracción (Et) no fue significativo en los pigmentos fotosintéticos,

esto pudo deberse a la destrucción y transformación de las clorofilas y los carotenoides, al
igual que la interacción (Et) y (TA), ambas relacionadas con la temperatura, lo que
indicaría que los pigmentos que lograron mantenerse al tratamiento son resistentes a la
temperatura.
 35

Capacidad Antioxidante

El tiempo de almacenamiento es altamente significativo sobre la capacidad

antioxidante (FIGURA 16), en relación al porcentaje de inhibición del radical DPPH
(%IRL) sigue siendo At (p≤0,0001). Sin embargo, este es afectado además por los otros
factores: tiempo de extracción (p≤0,001), temperatura de almacenamiento (p≤0,001) y la
interacción TA versus At (p≤0,0001).

a) C:At +
b) C:At +
- -
A:Et BC

BC A:Et

AB B:TA

AC AC

B:TA AB

0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 30

FIGURA 16. Diagrama de Pareto estandarizado para la variables de respuestas: a) DPPH

y b) Porcentaje de inhibición del radical DPPH (%IRL)
( At: tiempo de almacenamiento (días); Et: tiempo de extracción (min) ; TA: temperatura de almacenamiento °C)

El diseño experimental a través de ANOVA indicó con un 95% de confianza, que el

tiempo de almacenamiento es altamente significativo. El modelo correspondiente de la
variabilidad del DPPH tiene un coeficiente de determinación de R2 de 89 %, El test de
Durbin-Watson indica que existe una correlación significativa entre los datos (P=0,0001) y
de esta forma se obtiene un modelo que predice con 89 % la variabilidad de la capacidad
antioxidante, con respecto a las variables de almacenamiento y procesamiento (Ec. 16).

3044,59 0,658287 ∙ 7,76564 ∙ 72,4113 ∙ 0,123539 ∙ ∙ 0,0329422 ∙ ∙ Ec.16

0,233511 ∙ ∙

En cuanto a cambios a lo largo del periodo de almacenamiento, no hubo diferencias

significativas entre las tres temperaturas estudiadas. Efectos similares fueron observados
por Wojdyło et al. (2014) en jugo de membrillo almacenado por 6 meses. La capacidad
antioxidante fue bastante constante en cuanto a la temperatura. No obstante, el tiempo de
 36

almacenamiento provocó una reducción considerable de 70% de pérdidas a 5 °C y 72 % a

los 35 ºC al día 34. En el efecto del tiempo de almacenamiento, se observó, independiente
de la temperatura, una caída pronunciada de la capacidad antioxidante en el día 26
(FIGURA 17).

4000
3500
3000
mg TE /L

2500 5°C
2000 20 °C
1500 35 °C
1000
500
1 2 5 8 12 13 14 23 26 34
Tiempo de almacenamiento (días)

FIGURA 17. Efecto del factor tiempo de almacenamiento en relación al DPPH, para un
tiempo de extracción de 30 min.

En el gráfico de superficies (FIGURA 18), tanto para una extracción de 30 min, como para
el almacenamiento de 5 °C, se demuestra el descenso en el tiempo de almacenamiento.

a) b)
(X 1000,0) (X 1000,0)
4 4
DPPH mg TE/L

3
DPPH mg TE/L

3
2 2
1 1
36 40
30
24 30
0 12 18 0 20
15 20 25 6 At (días) 0 10
30 35 40 45
0 10 20 0 At (días)
30 40
Et (min) TA (°C)

FIGURA 18. Efecto del factor condiciones de almacenamiento en relación al DPPH. a) 30 min de
extracción con vapor; b) 5 °C de almacenamiento
 37

a) b)

70 80
75
66 70

% IRL
% IRL

62 65
60
58 55 40
40 30
30 50 20
54 20 0 10
15 20 10 10 20 30 0 At (días)
25 30 35 0 At (días) 40
40 45 TA (°C)
Et (min)

FIGURA 19. Efecto del factor condiciones de almacenamiento en relación al %IRL. a) 30 min de
extracción con vapor; b) 5 °C de almacenamiento

Relación entre capacidad antioxidante y los pigmentos

La capacidad antioxidante en el extracto fue otorgada por los pigmentos allí
presentes, de la cual se obtuvo una regresión múltiple ajustada a un coeficiente de
determinación R2 = 65 %, es decir, los polifenoles (PFT) totales, las antocianinas (ACN),
las clorofilas totales (CHT) y los carotenoides (CRT) otorgan el 65 % de la variabilidad de
la capacidad antioxidante del extracto. Obteniendo relación entre ellas de DW (P=0,0000),
siendo las clorofilas altamente significativas en el modelo.

La ecuación del modelo predictivo ajustado fue:

831,695 0,459064 9,44212 13,8891 26,7531 Ec.17

3.3.2 Variación del color del jugo de murta en función del tiempo de almacenamiento
La estabilidad del color establecida por E, a, b, C y h fue afectada altamente
por el tiempo de extracción (Et), la temperatura de almacenamiento (TA) y los días de
almacenamiento (At). La diferencia en el tono, h, no fue afectado por las interacciones
Et/TA y Et/At. La diferencia en la croma, C, indicó la saturación del color o grado de
color y fue altamente significativo en todos los factores e interacciones. La diferencia en el
valor de luminosidad, L, fue afectado significativamente por la temperatura de
almacenamiento, el tiempo de almacenamiento y por la interacción Et/TA. El estadístico de
 38

Durbin-Watson, indicó que existió una correlación entre los datos de La y h. Sin
embargo, en b y C no hubo ninguna correlación.

TABLA 7. Variación de color

E L a b C h

1. Et *** * *** *** *** ***

2. TA ** *** *** *** ** **
3. At *** *** *** ** *** **
1vs 2 ** *** ** *** *** ns
1 vs 3 *** Ns Ns * *** ns
2 vs 3 * Ns ** * ** *
R 2
49% 47% 48% 56% 58% 26%

DW P=0,0184 P=0,0043 P=0,005 P=0,1200 P=0,7734 P=0,000

Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de * P <0,1; ** P <0,05; *** P <0,001 en ANOVA. (At: tiempo de
almacenamiento (días); Et: Tiempo de extracción (min); TA: temperatura de almacenamiento °C); estadístico de Durbin-Watson (DW)

Al evaluar el color en función de la temperatura se observó que el modelo que más

se ajustó para explicar la variabilidad fue a 5 °C, esto se debió que a medida que pasaron
los días, se produjo aglomeración o polimerización de los pigmentos allí presentes en las
temperaturas de almacenamiento de 20 y 35 °C (TABLA 8).

Al relacionar el almacenamiento de 5 °C con la concentración de pigmentos se

comprobó que a medida que aumentó la diferencia, disminuyó la concentración de éstos.
En el FIGURA 20 se ilustra la variación de color en polifenoles y antocianinas a través de
una regresión lineal simple, la cual demostró la correlación que existe entre ellos con un
estadístico de DW de P= 0,00 en todas las diferencias. Fue altamente significativo E, a,
C y h tanto para polifenoles como antocianinas y no fue significativo para b y L.

En la ilustración de la FIGURA 21 se presenta la variación de color en los

pigmentos fotosintéticos (clorofila y carotenoides), para ambos casos E, h y C fue
 39

significativo. Sólo para las clorofilas fue significativo L y b, lo cual indicó que influyó
en la claridad y que los pigmentos que van desde el amarillo al azul, tuvieron un cambio en
el tiempo de almacenamiento. Para a no fue significativo, lo que indicó la ausencia de
pigmentos rojos en las clorofilas. En cuanto a los carotenoides, no hubo afecto sobre la
luminosidad L y tampoco sobre b, dado que no debe presentar carotenoides con
pigmentos que fluctúen desde el amarillo al azul.

TABLA 8. Variación de color en función de la temperatura ANOVA

5°C E L a b C h
1.Et *** *** *** *** *** ***
2.At ** *** *** ns ** **
1 vs 2 *** ns *** ns *** ns
R2 70% 69% 79% 48% 77% 61%
20°C
1.Et *** * *** ns *** ***
2.At *** *** *** * *** **
1 vs 2 Ns ns ns ns ns ns
R2 38% 51% 41% 10% 47% 36%
35°C
1.Et Ns *** *** *** *** **
2.At ** *** ns ** * ns
1 vs 2 Ns * ns ** ns ns
R2 46% 32% 32% 60% 58% 13%
Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de * P <0,1, ** P <0,05, *** P <0,005 en ANOVA. (At: tiempo de
almacenamiento (días); Et: tiempo de extracción (min); TA: temperatura de almacenamiento °C); estadístico de Durbin-Watson (DW)
 40

FIGURA 20: Variación de color en jugos almacenados a 5°C sobre los PFT y ACN
100 40

80 30

60

DL
20
DE

40
10
20

0
0
1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000
1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000

*** ;R2= 44,9687 ; ∆ 254,109 0,0909656 ∙ ns ;R2= 2,86838; ∆ 20,4274

,
0,0048203
,
∙
100 30

80
20
60

Db
Da

40
10

20

0
0
1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000
1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000
2 2
*** ;R = 42,7674; ∆ 271,744 0,100084 ∙
DC 234,624 0,0858577 FT
ns ;R = 1,88782; ∆ 24,2815 0,0061891 ∙
100 1

80 0,8

60 0,6

Dh
DC

40 0,4

20 0,2

0 0
1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000
2 2
*** ;R = 41,3815; ∆ 234,624 0,0858577 ∙ *** ;R = 40,9042; ∆ 1,5465 0,000526323 ∙
100 40

80
30

60
DL
DE

20
40

10
20

0 0
0 2 4 6 8 0 2 4 6 8
2 2
***;R =28,1083; ∆ 68,4712 7,9117 ∙
Da 79,8754 11,2131 AN
* ;R =8,71526; ∆ 0,970696 1,12881 ∙
100 60

50
80
40
60
Db

30
Da

40 20

20 10

0
0
0 2 4 6 8
0 2 4 6 8

*** ;R2 =51,1479%; ∆ 79,8754 11,2131 ∙ ns ;R2=3,63518 ; ∆ 2,16776 1,24067 ∙

120 1

0,8
90
0,6
Dh
DC

60
0,4

30
0,2

0 0
0 2 4 6 8 0 2 4 6 8
2 2
*** ;R = 47,2281; ∆ 64,1856 8,67413 ∙ *** ;R = 43,52% ; ∆ 0,674507 0,085983 ∙
Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de * P <0,1, ** P <0,05, *** P <0,001 en ANOVA regresión lineal simple,
Polifenoles totales (PFT), antocianinas (ACN).
 41

FIGURA 21. Variación del color en jugos almacenados a 5°C sobre las CHL y CRT
, , , ,
200 40

160
30

120

DL
DE

20
80
10
40

0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
2 2
***; R = 21 %; DW=0,000; ∆ , 43,9229
, 0,867784 ∙ CHT **; R =16 %; DW=0,000; ∆ , 11,8135
, 0,231117 ∙
100 60

50
80
40
60

Db
30
Da

40 20

20 10

0
0 0 10 20 30 40 50 60
0 10 20 30 40 50 60
2 2
ns; R = 11% ;DW=0,000; ∆ ,
39,4701
,
0,74258 ∙ **; R = 14% ; DW=0,000;Dh∆ 12,218
0,377058 0,00728547 CHT
0,27096 ∙
100 1

80 0,8

60 0,6

Dh
DC

40 0,4

0,2
20

0
0
0 10 20 30 40 50 60
0 10 20 30 40 50 60
2
*; R2= 12%; DW=0,000; ∆DE 46,1085
32,8269
2,85564 CRT
0,62048 ∙ **; R = 19% ; DW=0,000; ∆ 0,377058
, ,
0,00728547 ∙
100 40

80 30

60
DL

20
DE

40
10
20

0
0
0 4 8 12 16 20
0 4 8 12 16 20

**; R2= 18%; DW=0,000; ∆ , 46,1085

, 2,85564 ∙ CRT ns; R2= 5% ; DW=0,000; ∆ ,10,7341
, 0,454419 ∙ CRT
100 60

50
80
40
60
Db

30
Da

40
20

20 10

0 0
0 4 8 12 16 20
0 4 8 12 16 20
2 2
**; R = 15%; DW=0,000; ∆ 43,3697
DC 35,5062 2,28035 CRT
2,94438 ∙ ns; R =6% ; DW=0,000; ∆Dh = 0,398709
11,5259 0,619172 ∙
0,0253692 CRT
100 1

80 0,8

60 0,6
Dh
DC

40 0,4

20 0,2

0 0
0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20

*; R2= 13%; DW=0,000; ∆ 35,5062 2,28035 ∙ **; R2= 19% ; DW=0,000; ∆ 0,398709 0,0253692 ∙
Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de * P <0,1; ** P <0,05; *** P <0,001 en ANOVA regresión lineal simple.
Carotenoides (CRT) y Clorofila total (CHT)
 42

Al relacionar la suma de los pigmentos con la diferencia de color, se observó que el

pigmento con mayor significancia sobre las variables de respuestas diferenciales fueron las
antocianinas, afectando de forma significativa sobre L, a, b, C y H. Sin embargo,
sobre E afectó sólo significativamente polifenoles y clorofilas (TABLA 9), lo que
concuerda con los resultados del color en variación al tiempo de extracción.

TABLA 9. Regresión múltiple evaluada a 5 °C

W R2 % PFT ACN CRT CHL Ecuaciones

∆ 161,466 0,0471396 ∙ 3,28795 ∙ 2,62272

E 0,000 50% * ns ns **
1,06555 ∙

∆ 9,27158 0,00436734 ∙ 2,13172 ∙ 0,114736

L 0,000 41% ns ** ns ns
∙ 0,18186 ∙

∆ 88,6822 0,0051172 ∙ 9,61696 ∙ 0,612686

a 0,000 56% ns *** ns ns
∙ 0,154913 ∙

∆ 44,6445 0,0216938 ∙ 3,58629 ∙ 0,988572

b 0,000 32% * ** ns *
∙ 0,47612 ∙

∆ 96,5896 0,0162388 ∙ 6,88143 ∙ 0,933485

C 0,000 54% ns *** ns ns
∙ 0,48114 ∙

∆ 0,851292 0,0000865721 ∙ 0,0708206 ∙

H 0,000 53% ns *** ns ns
0,00431096 ∙ 0,00493624 ∙

Con un nivel de confianza del 95% la diferencia significativa de * P <0,1; ** P <0,05; *** P <0,001 en ANOVA regresión lineal
múltiple. Estadístico de Durbin-Watson (DW), polifenoles totales (PFT), antocianinas (ACN), carotenoides (CRT) y clorofila total (CHT)

Las antocianinas son pigmentos vegetales con un gran potencial para el reemplazo
competitivo de colorantes sintéticos, representando el grupo más importante de pigmentos
hidrosolubles detectables en la región visible por el ojo humano (Strack y Wray, 1994).
 43

4. CONCLUSIONES

Al concluir esta investigación los objetivos han sido logrados gracias a la

rigurosidad utilizada en el proceso investigativo. El tema de la tesis permite dar un valor
agregado a la murta que de ser una producción local, de carácter estacional, se
transformaría en un producto de consumo anual. Esto implica que la producción del jugo
podría ser permanente como consumo y como negocio.
Se ha demostrado que los antioxidantes naturales en las infusiones de murta al 1%
tienen actividad antioxidante por el método ORAC en plasma humano. En esta
investigación se obtuvo la extracción de compuestos antioxidantes en la baya de murta
alrededor del 10%, lo que indicaría una buena posibilidad de tener compuestos
biodisponibles.
En relación a la cuantificación del contenido de polifenoles, antocianinas, clorofilas
y carotenoides totales en el jugo obtenidos en 15, 30 y 45 minutos de extracción por vapor
se puede decir que, el mejor tiempo de extracción fue a los 28 minutos, obteniendo un 10%
de los polifenoles de la murta, dejando un subproducto de importancia comercial. En las
antocianinas no hubo diferencia significativa entre la extracción de 30 y 45 minutos y en el
mejor caso se extrae alrededor de un 12 %. En las clorofilas no existen reportes de
extracción de clorofilas en murta, siendo la mejor extracción a 30 minutos con 55,7 mg/L.
En los carotenoides existen reportes de β carotenos, sin embargo, los que se extraen en este
proceso tienen que ser de otra naturaleza, dado que éstos son liposolubles, una posibilidad
es que sean carotenoides ácidos o carotenoproteínas, los cuales son solubles en agua y
estables a temperaturas.
En los polifenoles y antocianinas el mejor tratamiento de almacenamiento fue a
5 °C. En las clorofilas no hubo diferencias significativas. Los carotenoides son afectados
por la temperatura, sin embargo, no hubo correlación entre los datos, por lo que no se
podría predecir cuál es la mejor temperatura. En función de los días de almacenamiento los
polifenoles tienen un marcado decrecimiento al día 26. Las antocianinas tienen un marcado
 44

decrecimiento al día 22. Las clorofilas y los carotenoides tienen un marcado decrecimiento
al día 14.
Al determinar la actividad antioxidante en el jugo, para cada condición de
almacenamiento se concluye que la mejor extracción se obtiene a los 30 minutos,
obteniendo alrededor de un 4% de la capacidad antioxidante de la baya de murta.
La evaluación del procesamiento con el modelo de superficie de respuesta indica
como mejor punto de operación la extracción en 28 min y el almacenamiento a 5 °C. Los
jugos almacenados a 5 °C presentaron mayor retención de antocianinas y polifenoles.
La cantidad de polifenoles y la capacidad antioxidante (DPPH) en el extracto de
murta disminuyen en los tratamientos térmicos para un tiempo de extracción mayor que 28
min.
La temperatura de almacenamiento influyó en la estabilidad de antocianinas y
también en los parámetros de color, siendo la temperatura de 35 °C, la que produce mayor
velocidad de degradación.
La capacidad antioxidante de los compuestos bioactivos en todos los extractos de
murta decrece significativamente con el tiempo, independiente de la temperatura de
almacenamiento. Al final del almacenamiento de 26 días los jugos mostraron una pérdida
significativa en la actividad antirradical y todos los jugos mostraron una pérdida
significativa en los pigmentos. Se observó una correlación lineal significativa entre los
resultados de las mediciones y la actividad antirradical DPPH (R2 = 0,65). Siendo las
clorofilas que aportan mayor significancia, lo que indica la importancia de estudiar con
mayor profundidad las clorofilas aʼ y bʼ que son resistentes a los tratamientos térmicos, lo
que podría dar valor agregado al jugo si se demuestra que son beneficiosas para la salud.
En relación al color, éste está afectado principalmente por las antocianinas, esto
queda demostrado en las regresiones lineales y múltiples, sobre todo a, C y h. Otros
pigmentos que también afectan al modelo son los polifenoles y clorofilas, principalmente
en la variación de color general E.
 45

En el caso de utilizar el color como herramienta de cuantificación la variable que

tiene mayor correlación con los pigmentos es a. Para medir la claridad del jugo, el valor
de L entrega una buena correlación.
Finalmente, se concluye que la murta, con sus peciolos y tallos, es una potencial
materia prima para elaborar jugos con características funcionales. Este jugo tiene una vida
útil respecto a la capacidad antioxidante de 26 días sin aditivos y sin importar la
temperatura de almacenamiento. No obstante, la temperatura de almacenamiento afecta al
color, presentándose una variación de éste. En relación al rendimiento, de un kg de murta se
obtiene alrededor de un litro y medio de jugo, mediante el método de arrastre por vapor.
Además, existe un residuo de frutas como un potencial subproducto, dado que en el jugo
sólo se retiran aproximadamente un 10% de los pigmentos. La murta es una baya con un
alto potencial de producción para la Región de Los Ríos, la que ya es conocida por los
arándanos, frambuesas y cranberries, entre otras bayas. Estos resultados pueden ser útiles
para la industria de los jugos, como punto de partida para el desarrollo de jugos de murta
con altos niveles de compuestos bioactivos.
 46

5. BIBLIOGRAFÍA

Aguirre, M. C., Delporte, C., Backhouse, N., Erazo, S., Letelier, M. E., Cassels, B.
K., Silva, X., Alegría, S & Negrete, R. 2006. Topical anti-inflammatory activity of 2α-
hydroxy pentacyclic triterpene acids from the leaves of Ugni molinae. Bioorganic y
Medicinal Chemistry 14 (16): 5673-5677.

AOAC .1996. Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th Ed.,

AOAC International, Gaithersburg, MD, USA.

Armenta‐López, R., Guerrero, I. L., & Huerta, S. 2002. Astaxanthin extraction from
shrimp waste by lactic fermentation and enzymatic hydrolysis of the carotenoprotein
complex. Journal of Food Science, 67(3), 1002-1006.

Bello Gutiérrez José. 2008. Ciencia Bromatológica; Principios Generales de Los

Alimentos, Díaz de Santos, España, 596 p

Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., & Berset, C. 1995. Use of a free radical
method to evaluate antioxidant activity. LWT-Food Science and Technology, 28(1), 25-30.

Britton G. Carotenoids .1992. En: Hendry GAF, Houghton JD, editores. Natural
food colorants. Glasgow and London: Blackie p. 141-182.

Britton G. 1983. The biochemistry of natural pigments. Cambridge, United

Kingdom: Cambridge University Press.

Britton, G. 1995. Structure and properties of carotenoids in relation to function. The

FASEB Journal, 9(15), 1551-1558.

Britton, G., Liaaen-Jensen, S., & Pfander, H. (2004). Carotenoids. Volume 4:

Natural functions. In G. Britton, S. Liaaen-Jensen, y H. Pfander (Eds.), Carotenoids.
Handbook (pp. 1–6). Basel-Boston-Berlin: Birkhäuser Verlag.
 47

Burdurlu H.S., Koca N. & Karadeniz F. 2006. Degradation of vitamin C in citrus

juice concentrates during storage. Journal of Food Engineering, 74, 211–216.

Castañeda, A., M. Pacheco, M. Páez, J. Rodríguez & C. Galán 2009 Chemical

studies of anthocyanins: A review. Journal Food Chemistry 113: 859–871

Chuah, A. M., Lee, Y.-C., Yamaguchi, T., Takamura,H., Yin & L.-J. Ymatoba, T.
2008. Effect of cooking on the antioxidant properties of coloured peppers. Food Chemistry
111, 20-28.

Clydesdale, F. M., Y Francis & F. J. 1976. Pigments. In O. R. Fennema (Ed.), Food

Chemistry (pp. 417–430). New York: Marcel Dekker.

Delporte, C., Backhouse, N., Inostroza, V., Aguirre, M. C., Peredo, N., Silva, X.,
Negrete & R., Miranda, H. F, 2007.Analgesic activity of Ugni molinae (murtilla) in mice
models of acute pain. Journal of Ethnopharmacology 112 (1): 162-165.

Ferruzzi, M. G., Y Blakeslee, J. 2007. Digestion, absorption, and cancer

preventative activity of dietary chlorophyll derivatives. Nutrition Research, 27(1), 1–12.

FIGURA Ludger O & Teixeira Arthur A. 2007. Food Physics: Physical Properties,
Measurement and Applications, Berlin Heidelberg New York, Springer-Verlag, 550 p.

Flores-Álvarez, M. C., Vergara-Balderas, T., & Guerrero-Beltrán, J. A., 2011.

Efecto del tiempo de almacenamiento y tipo de procesamiento en los antioxidantes de
nopal.

Fossen, T., L. Cabrita & O. Andersen. 1998. Colour and stability of pure
anthocyanins influenced by pH including the alkaline region. Food Chemistry 63(4): 435-
440.

Francis, F. J., & Clydesdale, F. M. 1975. Food colorimetry: theory and applications.
AVI Publishing Co. Inc.

Gómez-Plaza, E., & Cano-López, M. 2011. A review on micro-oxygenation of red

wines: Claims, benefits and the underlying chemistry. Food Chemistry, 125(4), 1131–1140.
 48

Harborne, J. B. 1993. The flavonoids advances in research since 1986 (Vol. 4). CRC
Press.

Harbourne, N., J. Jacquier, D. Morgan & J. Lyng. 2008. Determination of the

degradation kinetics of anthocyanins in a model juice system using isothermal and non-
isothermal methods. Food Chemistry 111(1):204–208.

Kirca, A. & B. Cemeroglu. 2003. Thermal degradation of blood orange

anthocyanins. Food Chemistry 81(4): 583–587.

Kirca, A., M. Özkan & B. Cemeroglu. 2007. Effects of temperature, solid content
and pH on the stability of black carrot anthocyanins. Food Chemistry 101(1): 212–218.

Leong, S.Y. & Oey, I. 2012. Effects of processing on anthocyanins,carotenoids and

vitamin C in summer fruits and vegetables. Food Chemistry, 133, 1577–1587.

Lichtenthaler, H. K. 1987. Chlorophylls and carotenoids: pigments of

photosynthetic biomembranes. Meth. Enzymol. 148: 350–382.

Meléndez-Martínez, A., Vicario, I. M., & Heredia, F. J. 2007. Pigmentos

carotenoides: consideraciones estructurales y fisicoquímicas. Archivos Latinoamericanos
de Nutrición, 57(2), 109-117.

Olaya, C., M. Castaño & G. Garzón, 2009. Stability of anthocyanins from Rubus
glaucus Benth and Solanum betaceum Cav. dark-red strain as affected by temperature,
storage time and water activity. Acta Biológica Colombiana 14 (3): 141-156.

Owusu, A. 2005. Chemistry Postharvest. En: Introduction to Food Chemistry.

Primera Edición. Editorial CRC Press. United States of America. P. 219.

Özkan, M., A. Yemenicioglu, N. Asefi, & B. Cemeroglu. 2002. Degradation

kinetics of anthocyanins from sour cherry, pomegranate and strawberry juices by hydrogen
peroxide. Journal of Food Science 67(2): 525-529.
 49

Roca, M., & Mínguez-Mosquera, M. I. 2006. Chlorophyll catabolism pathway in

fruits of Capsicum annuum (L.): stay-green versus red fruits. Journal of agricultural and
food chemistry, 54(11), 4035-4040.

Rodríguez, K., Ah‐Hen, K., Vega‐Gálvez, & López, J., Quispe‐Fuentes, I., Lemus‐
Mondaca, R., & Gálvez‐Ranilla, L. 2014. Changes in bioactive compounds and antioxidant
activity during convective drying of murta (Ugni molinae T.) berries. International Journal
of Food Science y Technology, 49(4), 990-1000.

Ruiz, A., Gutierrez, I., Mardones, C., Vergara, C., Herlitz, E., Vega, M., Dorau, C.,
Winterhalter, P & Von Baer, D. 2010. Polyphenols and antioxidant activity of calafate
(Berberis microphylla) fruis and other native berries from southern Chile. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 58 (10): 6081-6089

Ruiz, A., Hermosín-Gutiérrez, I., Mardones, C., Vergara, C., Herlitz, E., Vega, M.,
& Von Baer, D. 2010. Polyphenols and antioxidant activity of Calafate (Berberis
microphylla) fruits and other native berries from Southern Chile.Journal of agricultural and
food chemistry, 58(10), 6081-6089.

Sakakibara, H., Honda, &., Nakagawa, S., Ashida, H., & Kanazawa, K. 2003.
Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits, and teas. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 51(3), 571-581.

Saucier, C. 2010. How do wine polyphenols evolve during wine ageing. Cerevisia,
35(1), 11–15.

Schiedt K & Liaaen-Jensen S. Isolation and analysis. En: Britton G, Liaaen-Jensen

S, Pfander H, editores. Carotenoids. Volume 1A: Isolation and analysis. Basel, Switzerland:
Birkhäuser; 1995. p. 81-108.

Schreckinger, M., Lotton, J., Lila, M., & Gonzalez De Mejia, E. 2010. Berries from
south america: a comprehensive review on chemistry, health potential, and
commercialization. Journal of Medicinal Food 13(2), 233–246.
 50

Shene, C., Reyes, A. K., Villarroel, M., Sineiro, J., Pinelo, M., & Rubilar, M. 2009.
Plant location and extraction procedure strongly alter the antimicrobial activity of murta
extracts. European Food Research and Technology, 228(3), 467-475.

Shrikhande, A. & F. Francis. 1974. Effect of flavonols on ascorbic acid and

anthocyanin stability in model systems. Journal of Food Science 39(5): 904–906.

Speisky, H., Peña, A., Gómez, M., Fredes, C., Hurtado, M., Gotteland, M., &
Brunser, O. 2008. Antioxidants in chilean berries. Acta Horticulturae 777, 485–492.

Starr, M.S. & F. Francis. 1968. Oxygen and ascorbic acid effect on the relative
stability of four anthocyanin pigments in cranberry juice. Food Technology 22(10): 91–93.

Teng, S. S., & Chen, B. H. 1999. Formation of pyrochlorophylls and their

derivatives in spinach leaves during heating. Food Chemistry, 65(3), 367–373

Wang S. &. Y Lin H. S. 2000. Antioxidant activity in fruit and leaves of blackberry,
raspberry and strawberry is affected by cultivar and maturity. Journal Agricultural and
Food Chemistry, 48, 140-146.

Wang, H., Fan, W., Li, H., Yang, J., Huang, J., & Zhang, P. 2013. Functional
characterization of dihydroflavonol-4-reductase in anthocyanin biosynthesis of purple
sweet potato underlies the direct evidence of anthocyanins function against abiotic stresses.
PloS one, 8(11), e78484.

Warris, P. D., & Brown, S. N. 1995. The relationship between reflectance (EEL
value) and colour (L*) in pork loins. Animal Science, 61(1), 145-148.

Wojdyło, Aneta, Teleszko, Mirosława & Oszmiański, Jan, 2014. Antioxidant

property and storage stability of quince juice phenolic compounds. Food chemistry, vol.
152, p. 261-270.

Wu, Di; Sun, Da-Wen. 2013. Colour measurements by computer vision for food
quality control–A review. Trends in Food Science y Technology, vol. 29, no 1, p. 5-20.
 51

Yuan, L., Zhang, L., Ma, W., Zhou, X., Ji, J., Li, N., & Xiao, R. 2013. Glutathione
S-transferase M1 and T1 gene polymorphisms with consumption of high fruit-juice and
vegetable diet affect antioxidant capacity in healthy adults. Nutrition, 29(7), 965-971.

Zhonggao, J., Liu J. & Wang, S. 2005. Antioxidant activities of total pigment
extract from blackberries. Food Technology Biotechnology 43: 97–102.