PRACTICA 13

SISTEMATICA MOLECULAR

INTRODUCCIÓN
La búsqueda y caracterización de genes y sus productos en bases de datos es una herramienta
fundamental de la Biología Molecular y sus aplicaciones. Existen multitud de bases de datos y
programas en internet que permiten identificar genes a partir de una secuencia de ADN o bien
encontrar secuencias de ADN de genes de interés. Una vez halladas estas secuencias, puede
estudiarse la estructura génica, el transcripto producido y el producto final, ya sea éste un
polipéptido o un ARN.
Secuenciación de ácidos nucleicos
El método consiste en establecer el orden en que están colocados los nucleótidos dentro de las
moléculas de ácidos nucleicos, basándose en el proceso biológico de replicación del ADN, donde
se utiliza un cebador o “primer” para comenzar la amplificación. Luego de la amplificación se
realiza una electroforesis para obtener un patrón de bandas del que se deduce la secuencia del
ADN introducido. Esta información es clave para la diferencia entre organismos.
Metodológicamente se trabaja con trozos cortos (pocos nucleótidos) tanto de ADN como ARN.
Para la taxonomía de bacterias las moléculas más utilizadas son la fracción de 16S del ARN
ribosómico (1500 nucleótidos) y el ADN de los plásmidos. Este último es muy importante para
organismos de interés funcional como los fijadores de N2, cuya enzima nitrogenasa se informa
en el ADN de los plásmidos.
Para establecer la identificación de los microorganismos se aplica un programa de similitud
genética entre las secuencias de los nucleótidos analizados y los de otras especies conocidas. En
la actualidad, toda la información sobre las secuencias de nucleótidos en especies identificadas
está disponible en la Web en lo que se conoce como “banco de genes”.

Figura 1. Proceso para la determinación de la identidad de bacteriana utilizando secuencias

genéticas.
OBJETIVOS

• Comprender los pasos del proceso para realizar la reacción en cadena de la polimerasa
• Aprender a procesar datos obtenidos de un secuenciador Sanger capilar y obtener
secuencias consenso.
• Construir archivos en formato fasta y determinar la identidad de un organismo, utilizando
la definición de especie filogenética.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales

• Material audiovisual
• Secuencias genéticas del segmento ADNr 16S – propios del laboratorio de genética.
• Base de datos del gen Bank
• Software MEGA
• Computadora
Métodos
Experimento 1

• Realice el protocolo de extracción de ADN de bacterias y describa la importancia de cada

uno de los componentes.

Protocolo de Extracción de ADN de Bacterias

COMPONENTES:

1. Pellets bacterianos E.coli 25 unidades

2. Solución de Lisis 20 ml
3. Solución Precipitación de Proteínas
4. Solución de Hidratación 10 ml 20 ml
5. Microcentrífuga.
6. Microtubos y micropipetas.
7. Baño de Incubación.
8. Etanol 70% e Isopropanol.
9. Sistema de electroforesis básico (aparatos y reactivos).
10. Sistema de detección de ácidos nucleicos.

PROTOCOLO RÁPIDO
El protocolo proporciona una extracción rápida de ADN cromosómico para que pueda
realizarse rápidamente con los estudiantes en sesiones prácticas. El primer paso es incubar
el sedimento bacteriano con lisado, que rompe las membranas celulares y libera ácidos
nucleicos. A continuación, se eliminan las proteínas y los restos celulares mediante la
adición de una solución de precipitación de proteínas. Después de la centrifugación, se
retuvo el sobrenadante y los ácidos nucleicos se precipitaron con isopropanol, se lavó con
etanol al 70% y finalmente se hidrató el ADN.

Lisis celular Precipitación de proteínas

• Añadir 1.5 ml de un cultivo overnight a • Enfriar la muestra a temperatura

un tubo de 1.5 ml. ambiente.
• Centrifugar a 14.000 x g durante 30 • Añadir 300 ul de Solución de
segundos. Eliminar el sobrenadante. precipitación de proteínas.
• Añadir 600 ul de Solución de Lisis al • Vórtex vigorosamente durante 20-30
pellet celular y pipetear para segundos.
resuspender y lisar las células. • Centrifugar a 14.000 x g durante 5
minutos. Se observará que el
precipitado proteico forma un pellet.
 • Incubar las muestras a 80ºC durante 5-
10 minutos. Enfriar a temperatura
ambiente.

Precipitación del ADN Hidratación del ADN

• Pasar el sobrenadante que contiene el

• Añadir 500-750 ul de Solución
ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga
de Hidratación del ADN.
600ul de isopropanol Mezclar por
inversión varias veces. Resuspender mediante
• Centrifugar a 14.000 x g durante 3 micropipeta el pellet blanco.
minutos. • La incubación a 55ºC con
• Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 ul periódicas agitaciones con
de etanol 70% e invertir varias veces vortex ayudará a la disolución
para lavar el pellet de ADN. del ADN.
• Centrifugar a 14.000 x g durante 2
minutos. Cuidadosamente eliminar
todo el etanol. Vigilar no perder el
pellet de ADN
• Invertir el tubo y dejar secar en papel
absorbente durante 15 minutos.

• Observe el video y describa los pasos para preparar el mix de reacción de una PCR.
https://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dy0E

REACTIVO PROCEDIMIENTO

▪ Tampón de reacción 10 ▪ Se añade en un tubo de 0.2 ml los

▪ DNTp siguientes volúmenes:
▪ Dos primers pK1 y Pk2 que 1. 16 μl de agua Mili-Q estéril
reconocen una región específica del 2. 2.5 μl de tampón de reacción
parásito 3. 1 μl de cada uno de los
▪ Espaciador IGS y que se encuentra cebadores
entre los genes que codifican para el 4. 1 μl de DNTp
ARNr 5. 0.5 μl de la enzima
▪ La enzima ▪ Se preparará una reacción de
▪ Agua Mili-Q estéril para completar PCR para cada una de las cuatro
el volumen de la reacción hasta 25 muestras a analizar y en cada
μl una de estas reacciones se añade
1 μl de ADN del extraído del
animal en el que queremos
diagnosticar (en este caso la
presencia del parásito).
▪ En total se tiene 4 reacciones de
PCR para analizar la presencia
del parásito en cuatro animales
diferentes además la relación de
PCR se utiliza siempre en
contra dispositivo y un control
negativo de la técnica, el
control positivo se utiliza ADN
de un animal infectado con el
parásito de modo que la PCR
siempre producirá
amplificación, mientras que en
el control negativo el volumen
 de ADN se sustituye por un
volumen de agua de modo que
no hay ADN presente en la
reacción y la PCR no producirá
ninguna amplificación.
▪ -La muestra una vez preparadas
las reacciones se incuban en un
aparato que aún tenemos
ciclado que puede subir y bajar
la temperatura de incubación
del bloque en el que se
depositan las muestras de modo
muy rápido y homogéneo, la
subida y bajada de temperatura
que lleva a cabo el
termociclador permite que se
lleven a cabo los tres etapas de
la PCR de forma automatizada
una vez que ha finalizada
recuperamos las muestras del
termociclador y analizamos el
resultado mediante
electroforesis en gel de agarosa.

• Esquematice y rotule un gel de agarosa con el gen ADNr 16S.

• El gen ADNr 16S pasa por un proceso de purificación y secuenciación. Observe el video
y describa el proceso de secuenciación por el método de sanger.
https://www.youtube.com/watch?v=NEu0mO-2ras

PROCESO DE SECUENCIACIÓN:
Una reacción de secuenciación consta de un cebador una cadena de ADN en molde que
queremos, nucleótidos libres y una molécula de ADN polimerasa que es la que va a llevar
a cabo la síntesis.

Cuando la ADN polimerasa extiende el cebador desde su extremo 3' e incorpora los
nucleótidos complementarios en cada una de las posiciones deseadas de la cadena molde,
 el cebador se une a la cadena molde a través de la complementariedad de bases. Cuando
la polimerasa incorpora los nucleótidos a la cadena molde a secuenciar, se inicia la
reacción. Cuando se incorpora uno de estos nucleótidos, se detiene la extensión de la
cadena, como ocurre en este caso con la adenina, que se marcará con un fluorocromo
específico y finaliza la cadena. Algunos nucleótidos de la mezcla de nucleótidos están
marcados con un fluorocromo, que detiene la síntesis de la cadena.

Según la lógica, hay cuatro tipos diferentes de moléculas terminadoras, cada una de las
cuales está marcada con un fluorocromo diferente. Como resultado, al final de la reacción,
tenemos cadenas que se han extendido a todos los tamaños posibles y cada una ha
terminado con un fluorocromo diferente, lo que nos permite obtener lecturas que varían
en longitud de 500 a 800 nucleótidos.

Todos estos fragmentos se introducen en un secuenciador, y en el capilar donde se

produce la electroforesis, la migración es diferente. Los fragmentos más pequeños
avanzan más rápido que los fragmentos más grandes, por lo que llegan antes al final del
capilar. Aquí, un láser excita fluorocromos, que emiten un halo de luz a diferente longitud
de onda, lo que nos permite ver la secuencia de nucleótidos que se han incorporado a la
reacción, lo que no es casualidad.

Finalmente, recibimos archivos que contienen un número significativo de picos

correspondientes a la secuencia de nucleótidos de la molécula original.

• A partir de los primeros 30 nucleótidos diseñe el gel de eletroforésis de tipo sanger.

>Problema

AGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCAGGCCTAACACATGCAAGTC
GAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTA
ATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATAC
CGCATAACGTCGCAAGCACAAAGAGGGGGACCTTAGGGCCTCTTGCCATCGGATGT
GCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCT
AGCTGGTCTGAGAGGA

TCAAACTAGTACCGAGTCTAACTTGCGACCGTCCGGATTGTGTACGTTCAGC
T
 T T
C C
G A
A A
C A
T C
T T
G A
C G
A T
T A
G C
T C
5’ G G 3’
T A
T G
A T
G C
G T
C A
C A
T C
G T
C T
C G
A C
G G
C A
G C
T C
T G
C T
A C
A C
T G
C G
T A
G T
3’ A T 5’
G G
C T
C G
A T
T A
G C
A G
T T
C T
A C
A A
A G
C C
T T
• Busque la secuencia anterior con la herramienta Blast del NCBI y responda ¿Qué gen
es? ¿Y a que organismo le pertenece?
16S
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearc
h&LINK_LOC=blasthome

1. El gen que corresponde a la secuencia es gen 16S de ARN ribosomal.

2. Corresponde al organismo de Escherichia coli,

• Use la base de datos subido a su práctica, mediante el software del mega cure su
secuencia y obtenga los consensos, estos guárdelos en un archivo fasta. Mediante la
herramienta del BLAST, determine la similaridad con otras secuencias.

Score % de
Código Gen Organismo similar GenBank similitud
Gen de ARN Streptomyces sp.
2A_fD1 ribosomal 16S MH700552.1 100.00%
1
Gen de ARN Streptomyces sp.
2A_rP2 ribosomal 16S MK638591.1 99.66%
Gen de ARN Streptomyces sp.
2B_fD1 ribosomal 16S MH700558.1 100.00%
2
Gen de ARN Streptomyces sp.
2B_rP2 ribosomal 16S MH700558.1 99.87%
Gen de ARN Streptomyces sp.
2E_fD1 ribosomal 16S MH700557.1 100.00%
3
Gen de ARN Streptomyces
2E_rP2 ribosomal 16S MH700554.1 100.00%
Gen de ARN Streptomyces
3A_fD1 ribosomal 16S MH700555.1 100.00%
novaecaesareae
4
Gen de ARN Streptomyces
3A_rP2 ribosomal 16S MH700555.1 99.84%
novaecaesareae
Gen de ARN
3B_fD1
ribosomal 16S
Bacillus sp. MT542325.1 99.59%
5
Gen de ARN
3B_rP2
ribosomal 16S
Bacillus nealsonii MT533956.1 99.81%
Gen de ARN
3B_fD1
ribosomal 16S
Bacillus sp. MT354191.1 98.34%
6
Gen de ARN
3B_rP2
ribosomal 16S
Bacillus nealsonii MT533956.1 99.60%
Gen de ARN Streptomyces
3E_fD1 ribosomal 16S MH700556.1 100.00%
cirratus
7
Gen de ARN Streptomyces
3E_rP2 ribosomal 16S MT083996.1 99.87%
cirratus
 Gen de ARN Actinomycetia
3F_fD1 ribosomal 16S MT613868.1 100.00%
bacterium
8
Gen de ARN
3F_rP2
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MF925425.1 99.85%
Gen de ARN
3G_fD1
ribosomal 16S
Bacillus sp. JN082455.1 99.09%
9
Gen de ARN
3G_rP2
ribosomal 16S
Bacillus nealsonii MT533956.1 99.83%
Gen de ARN
5A_fD1
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700558.1 100.00%
10
Gen de ARN
5A_rP2
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700558.1 99.89%
Gen de ARN
5B_fD1
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700559.1 100.00%
11
Gen de ARN
5B_rP2
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700559.1 100.00%
Gen de ARN
5C_fD1
ribosomal 16S
Streptomyces aureus LC551878.1 100.00%
12
Gen de ARN
5C_rP2
ribosomal 16S
Streptomyces aureus MH700560.1 100.00%
Gen de ARN
8A_fD1
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700562.1 100.00%
13
Gen de ARN
8A_rP2
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700562.1 99.89%
Gen de ARN
8B_fD1
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700562.1 100.00%
14
Gen de ARN
8B_rP2
ribosomal 16S
Streptomyces sp. MH700562.1 100.00%
Gen de ARN Virgibacillus
H1_fD1 ribosomal 16S LT671586.1 100.00%
siamensis
15
Gen de ARN Virgibacillus
H1_rP2 ribosomal 16S LT671586.1 100.00%
siamensis
Gen de ARN
H2_fD1
ribosomal 16S
Halobacillus sp. DQ448764.1 99.89%
16
Gen de ARN Halobacillus
H2_rP2 ribosomal 16S LT714153.1 99.88%
hunanensis
Gen de ARN
H3_fD1
ribosomal 16S
Halobacillus sp. MG893156.1 99.06%
17
Gen de ARN Halobacillus
H3_rP2 ribosomal 16S LT714153.1 99.89%
hunanensis
Gen de ARN
H4_fD1
ribosomal 16S
Bacillus sp. LC198067.1 93.69%
18
Gen de ARN
H4_rP2
ribosomal 16S
Bacillus sp. LC198067.1 95.10%
Gen de ARN
H5_fD1
ribosomal 16S
Salinicola zeshunii KX389578.1 99.90%
19
Gen de ARN
H5_rP2
ribosomal 16S
Salinicola zeshunii MF928399.1 100.00%
Gen de ARN
H6_fD1
ribosomal 16S
Salimicrobium sp. MW036445.1 99.36%
20
Gen de ARN
H6_rP2
ribosomal 16S
Salimicrobium sp. KP159337.1 99.80%
Gen de ARN
H7_fD1
ribosomal 16S
Kushneria konosiri CP021323.1 99.71%
21
Gen de ARN
H7_rP2
ribosomal 16S
Kushneria konosiri CP021323.1 100.00%
Cuestionario
1. ¿Qué es el gen ADNr 16S? describa su estructura y que regiones se utilizan para
determinar la identidad de una especie bacteriana.

▪ El ARNr 16S es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos

codificado por el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S. La
amplificación de una región estandarizada del ADN por la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), y la región propuesta fue un fragmento de 600 pares de
bases del ADN mitocondrial, que codifica para la subunidad I del citocromo c
oxidasa (COI). El uso de la región COI fue excelente herramienta para la
clasificación taxonómica de muchos animales, incluso para distinguir entre
especies; sin embargo, su utilidad para estudios taxonómicos y/o filogenéticos
en plantas, hongos y microorganismos es limitada (González, 2015).

2. ¿Cuántos tipos de ADN ribosomal existen? Describa cada uno de ellos y ¿Cuál
es su importancia?

▪ ARN mensajero (ARNm): Estructura lineal con alguna horquilla. Se sintetiza en

el núcleo de la célula a partir del ADN. Es el resultado del proceso de la
transcripción.
▪ ARN transferente (ARNt): Tienen una estructura peculiar con forma de trébol.
Su función es transportar aminoácidos específicos hasta los ribosomas para
conseguir completar ese proceso de traducción (de ARNm a aminoácidos que
se unen para formar proteínas) de que hablábamos anteriormente.
▪ ARN ribosómico (ARNr): Es el más abundante y el ARNr unido a proteínas
forma los ribosomas, orgánulos encargados de la traducción.
▪ ARN nucleolar (ARNn): Se origina a partir de diferentes segmentos de ADN
denominados región organizadora nucleolar. Una vez formado el ARNn se
fragmenta y da lugar a los diferentes ARNr.

3. ¿Como se determina la identidad molecular de los animales, plantas, hongos y

virus? Describa cada uno de los genes utilizados.

▪ El código de barras de ADN se ha establecido recientemente como la técnica de

identificación estándar de oro. Los códigos de barras son secuencias cortas
universales de ADN (500-800 pb) estandarizadas, fáciles de amplificar, que son
divergentes a nivel de especie, lo que permite una identificación rápida en
comparación con una colección de secuencias de referencia validada. Para
garantizar la consistencia de la identificación, los códigos de barras deben ser
únicos para una sola especie y estables dentro de cada especie (Hebert et al.,
2003). Adicionalmente, la variación interespecies debe exceder la variación
intraespecies, generando una “ruptura” en la distribución de distancias, lo que
se denomina “brecha del código de barras” (Meyer & Paulay, 2005).
▪ COI: El gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI) es la subunidad principal
del complejo citocromo C oxidasa (complejo proteico transmembrana o
complejo respiratorio IV), se encuentra en bacterias y en la mitocondria de
eucariotas, es la última enzima en la cadena de transporte de electrones
respiratorios y a menudo se usa como un código de barras de ADN para
identificar especies animales debido a que tiene una alta tasa de sustitución,
presentando variación de la secuencia entre especies del mismo género.En la
última década, estudios realizados en grupos animales como aves, peces,
mamíferos, lepidópteros, hemípteros y otros insectos han demostrado que el
fragmento COI presenta una variación interespecífica lo suficientemente amplia
 para permitir una buena correspondencia entre la identificación molecular y la
identificación basada en caracteres morfológicos de las especies.
▪ Para la identificación de plantas y de hongos COI no es utilizable como código
de barras de ADN lo que ha llevado a buscar secuencias alternativas, pero dos
regiones de genes en el cloroplasto, matK y rbcL, han sido aprobadas como las
regiones de código de barras para plantas terrestres.
▪ El gen de la maturasa K (matK) propuesto por el Consortium for the Barcode of
Life como gen de identificación en conjunto con el gen rbcL, subunidad grande
de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa, han dado resultados favorables para un
gran número de plantas (Orozco et al., 2019).
▪ Gen β -tubulina. Este gen codifica para una de las dos familias conservadas de
las proteínas tubulinas, las cuales juegan un rol crucial en el proceso celular
eucariótico, ya que son el mayor componente de los microtúbulos, los cuales, al
asociarse con otras proteínas, forman la dinámica de los polímeros de los que
participan en la segregación de cromosomas durante la mitosis. Bruns et al.
(1991), indican que el gen β-tubulina se encuentra más conservado y la
alineación de sus secuencias es menos ambigua en comparación a las del ADN
nuclear ribosomal; y Villa et al. (2006), señalan que se ha encontrado útil en la
reconstrucción de las relaciones filogenéticas entre las distintas especies de
hongos.
▪ Para la identificación de virus y bacterias a nivel molecular se hace uso de:
ARNr 16S; La identificación molecular basada en el análisis del ARNr 16S (o
del gen que lo codifica) permite una rápida identificación de virus. El ARNr 16S
es un polirribonucleótido de aproximadamente 1.500 nt, codificado por el gen
rrs, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya
secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica (Del Rosario
et al., 2004).

4. ¿Qué es la tecnología ilúmina de secuenciación? Describa los pasos para realizar

una secuenciación en esta plataforma.

▪ Esta secuenciación implica la fragmentación aleatoria de ADN y la ligación de

fragmentos de ADN mediante adaptadores presentes en una lámina. Esta
metodología se basa en la secuenciación por síntesis de la cadena
complementaria, amplificación en puente y detección a partir de fluorescencia
de nucleótido (Mancipe et al., 2020). La secuenciación por medio de Illumina
se caracteriza básicamente por la ejecución de los siguientes procesos: a. La
amplificación de los fragmentos de ADN para la generación del clúster (colonias
del mismo fragmento) se realiza mediante el método de PCR en puente. b. La
detección de bases en la secuenciación se hace a través de etiquetas
fluorescentes.
▪ Generación del clúster: Este proceso se logra mediante el método de
amplificación en puente. Los fragmentos de ADN se colocan sobre una
superficie sólida de vidrio separada por carriles. Cada carril está completamente
recubierto por oligonucleótidos complementarios a los adaptadores de cada
fragmento que se va a secuenciar, por lo que permiten que cada fragmento se
pueda anclar a la celda de flujo. Una vez anclados los segmentos, la polimerasa
inicia el proceso de copia en la hebra de ADN y genera una hebra reversa
complementaria. La hebra original es entonces retirada; mientras que la hebra
reversa, a través de una secuencia terminal, se pliega y se ancla a su respectiva
secuencia complementaria de oligonucleótido, y así queda en forma de puente.
Posteriormente, la polimerasa genera una hebra complementaria idéntica a la
original, que resulta en dos hebras clonadas del segmento inicial. Este proceso
se repite masivamente hasta formar millones de copias de cada fragmento.
▪ Secuenciación: Al finalizar la amplificación clonal, se retiran todas las hebras
reversas y quedan únicamente las hebras idénticas a las originales. En este
 punto, en la placa se introducen nucleótidos modificados con etiquetas
fluorescentes específicas para cada tipo. Los nucleótidos utilizados presentan
una modificación química (terminadores reversibles) que evita la unión de más
de un nucleótido marcado en cada sitio de reacción, de tal manera que se puede
ubicar el que corresponde a cada punto en la secuencia y se disminuye el riesgo
de errores en la secuenciación. Cada vez que una base se adhiere emite una
fluorescencia propia que permite su identificación. La etiqueta debe ser
removida antes de la colocación del siguiente nucleótido para evitar que dos
bases emitan señal a la vez. Al finalizar la primera lectura, el fragmento
resultante es retirado. Este paso se repite simultáneamente con todas las hebras
del mismo clúster de forma paralela hasta completar la secuenciación. La
exactitud de la secuenciación en el secuenciador Illumina será determinada por
la intensidad de la señal, y la longitud de las lecturas, por el número de ciclos
realizados. Actualmente, alcanzan una longitud por lectura de hasta 300 pares
de bases (Rubio et al., 2020).

5. ¿Qué es la secuenciación nanopore? Describa los pasos para realizar una

secuenciación en esta plataforma.

▪ La secuenciación de nanoporos es una tecnología única y escalable que permite

el análisis directo y en tiempo real de fragmentos largos de ADN o ARN.
Funciona al monitorear los cambios en una corriente eléctrica a medida que los
ácidos nucleicos pasan a través de un nanoporo de proteína. La señal resultante
se decodifica para proporcionar la secuencia específica de ADN o ARN.
▪ SECUENCIAR: Secuenciación del DNA a partir del paso de la cadena
ssDNA/RNA a través del nanoporo, el cual posee una corriente eléctrica que se
ve afectada con el paso de los nucleótidos de la cadena, aportando así unos datos
a analizar. Existe la preparación manual o actualmente se han desarrollado unas
técnicas automatizadas.
▪ ANALIZAR: El dispositivo que realiza la secuenciación se conecta a un
ordenador, en el cual se utiliza un programa informático (como el Min KNOW,
aunque existen muchos otros). Este adquiere y analiza los datos, guardándolos
como un archivo FAST5, y estos hay que analizarlos para convertirlos en una
secuencia de nucleótidos (este proceso de denomina basecalling).

6. ¿Qué es el formato fasto y en qué diferencia con el formato Fastq?

▪ FASTA (oficialmente) solo almacena el nombre de una secuencia y la

secuencia, extraoficialmente, las personas también agregan campos de
comentarios después del nombre de la secuencia. FASTQ se inventó para
almacenar secuencias y valores de calidad asociados (p. ej., de instrumentos de
secuenciación).
▪ FASTA almacena un número variable de registros de secuencia y, para cada
registro, almacena la secuencia en sí y un ID de secuencia. Cada registro
comienza con una línea de encabezado cuyo primer carácter es >, seguido del
ID de secuencia. Las siguientes líneas de un registro contienen la secuencia real.
El ID puede estar en cualquier formato arbitrario, aunque existen varias
convenciones. FASTA se usa principalmente para almacenar dato de referencia;
es decir, datos extraídos de una base de datos seleccionada.
▪ FASTQ fue concebido para resolver un problema específico que surge durante
la secuenciación: debido a cómo funcionan las diferentes tecnologías de
secuenciación, la confianza en cada llamada de base varía. Esto se expresa en la
puntuación de calidad Phred. FASTA no tenía una forma estandarizada de
codificar esto. Por el contrario, un registro FASTQ contiene una secuencia de
puntuaciones de calidad para cada nucleótido.
EXPERIMENTO 2
Análisis evolutivo por inferencia filogenética.
A partir de una muestra de suelo se aíslo en una placa de agar sin nitrógeno cepas de la rizosfera
de maíz, el cual se logró identificar el 99% de bacterias por métodos culturales y bioquímicos
(Frankia y Paenibacillus), sin embargo, una de las cepas no pudo ser identificada. (Figura 1).
Según sus características sus características culturales y morfológicas son similares a hongos, sin
embargo, el análisis por microscopia electrónica indica que es un procariota.

Figura 1. Aislado del microorganismo con potencial fijador de nitrógeno

Problema
¿De acuerdo con sus relaciones evolutiva con que organismo estará más emparentado el
procarionte encontrado?
Hipótesis
Dado que existen evidencias de que el organismo encontrado corresponde al grupo de los
procariotas por la ausencia de membrana nuclear, y al no encontrarse mayor evidencia, el análisis
genético de sus secuencias ADNr 16S nos permitirá encontrar con que organismos está más
emparentado, y al ser aislado en medio sin nitrógeno esta cepa tiene mucha relación con
procariontes fijadores de nitrógeno, entonces la cepa desconocida se relaciona con procariontes
fijadores de nitrógeno no simbiontes como Azotobacter, Beijerinckia, Azospirilum,
Methanosarcina, Methanococcus, Frankia, Nostoc, Strptomyces y Anabaena y existe una alta
posibilidad de que el organismo encontrado pueda corresponder a una nueva especie.
Metodos:
a) La secuenciación del Gen ADNr 16S permitió obtener el consenso:

>ST-3G_ADN_16S
GGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCGG
GAAACGGGGTCTAATACCGGATAATCCTTTTCTACTCATGTAGAAGGGTTGAA
AGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAA
CGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACA
CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT
GCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCT
TCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCA
GAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGC
AAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCACGT
CGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCGGAC
TAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGA
TATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCT
 GAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG
CCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCA
GCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCA
AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAC
GCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCTCCCGGAAACCCTAAGAGAT
GGGTCCCCCCTTGTGGTCGGTGAACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG
TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGC
CAGCATTCCCTTGGGTGATTGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGG
AGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAC
ACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGCGAAACCGCGAGGTGGAGCGAA
TCTCAAAAAGCCAGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAA
GTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCG
GGCCTTGTACACACCGCC

b) Realice una búsqueda de secuencias 16S en la base de datos del GenBank, de las
especies de Azotobacter, Beijerinckia, Azospirilum, Methanosarcina, Methanococcus,
Frankia, Nostoc, Streptomices y Anabaena (mínimo 5 especies de cada uno), guarde las
secuencias en formato fasta.

No se encontraron datos de Anabaena ni de Azospirilum

c) Agregue a la lista, la secuencia del gen16S de un protista (Grupo externo)

Las secuencias se alinean:

d) Realice un análisis de modelo de mutación que mejor se ajuste a los datos que ha
recolectado.

El modelo TN93+G es el que tiene mayor ajuste:

e) Obtenga la matriz de distancias genéticas.

Distancias genéticas de la matriz:

f) Realice un árbol filogenético con el método del vecino más cercano (Neighbor-Joining
Tree)
 CLADOS QUE COMPARTEN UN ANCESTRO EN COMÚN.

¿Cantos clados se han formado? ¿Qué clado se encuentra más

emparentado con la secuencia del protista? ¿En qué clado se ha agrupado
el organismo desconocido?

El organismo desconocido se encuentra en el clado Streptomyces, que esta

señalado junto a otros 6 CLADOS

g) A partir de la filogenia obtenida de una explicación desde el punto de vista evolutivo

(use rasgos morfológicos, bioquímicos, habitad) y ¿Cómo pudo separarse el clado del
organismo desconocido de su clado hermano?

▪ La filogenia es una herramienta importante para entender la evolución de los

organismos. A partir de la filogenia obtenida, se pueden explicar las relaciones
evolutivas entre los organismos y cómo se separó el clado del organismo
desconocido de su clado hermano.
▪ La rápida especiación en procariotas se fomenta por varias propiedades únicas del
intercambio genético procariótico incluyendo la rareza de su intercambio genético
A diferencia de los eucariotas, los procariotas tienen una baja tasa de intercambio
genético, lo que significa que las poblaciones pueden divergir ecológicamente sin
necesidad de aislamiento sexual. Esto permite que los procariotas se especien
rápidamente por divergencia ecológica.

h) Con los resultados obtenidos realice un análisis más específico con las especies del
mismo clado, puede aplicar valores Bootstrap y responda ¿Es una nueva especie la
 secuencia encontrada? ¿Cuál es la distancia genética que presenta con especie más
cercana?

Según la información obtenida, es posible que el organismo desconocido pueda ser una
nueva especie, pero sería necesario un estudio más exhaustivo para confirmarlo. El hecho de
que la especie más cercana, Streptomyces arboris, tenga una distancia de 0,0160 sugiere que
el organismo desconocido es genéticamente distinto de las especies conocidas de
Streptomyces.

Experimento 2
Se colecto un espécimen de reptil del grupo de los saurios en el desierto de Arequipa, al
realizar el análisis morfométrico se logró identificar que corresponde al género
Liolaemus, al no poder identificar la especie, se propuso realizar un análisis de secuencias
del gen Cit-b, del cual se obtuvo la siguiente secuencia genética.

Liolaemus
>Liolaemus sp
Atgttaaacttaatttctgcatgatggaacttcgggtccctcctaggattatgcctaattatccaaattt
ttactggactattcctagcaatacactatacagcagacatctcctcagccttttcatcagtggcacatat
ttgtcgagatgttcaatacggctgacttatccgaaatattcatgcaaacggagcctcaatattctttatc
tgtatttaccttcatatcggacgtggactctactacggctcctatctatataaagagacctgaaatattg
gagttattattcttctacttgtaatagctactgcatttgtaggatatgtcctgccatgaggacaaatatc
attctgaggcgcaaccgttatcaccaacctcctatcagctatcccatatgtcggagcaaccttagttgaa
tgaatctgaggggggttctccgtagacaatgccaccctaacacgattctttacatttcactttctacttc
catttattattattggtgcctccgcagtccacttactatttcttcatgaaacaggttcaaacaacccaac
aggacttcaatcaaactcagataaaatcccattccacccatacttctcatacaaagatctgttaggagca
ctattaattattatgctattacttctactcgccttattatcaccaaacctcttaggagacccagaaaact
ttaccccagctaacggggtg

Obtenga secuencias del grupo de saurios correspondientes a la región de Arequipa,

construya una filogenia (Utilice 500 réplicas) en base a secuencias nucleotídicas y en
base a secuencias peptídicas, compare sus secuencias y analice.
Región Arequipa (Paniur, 2016).
Familia Dipsadidae:
• Oxyrhopus fitzingeri
• Philodryas simonsii
• Philodryas tachimenoides
• Pseudalsophis elegans
• Tachymenis peruviana
Familia Leptotyphlopidae:
• Epictia tesselata
Familia Liolaemidae:
• Ctenoblepharis adspersa
• Liolaemus etheridgei
• L. insolitus
• L. signifer
• L. annectens
• L. walkeri
Familia Phyllodactylidae:
• Phyllodactylus gerrhopygus
• Phyllodactylus angustidigitus
Familia Tropiduridae:
• Microlophus peruvianus
• M.quadrivittatus
• M. tigris
• M. theresiae
• M. thoracicus
Familia Viperidae:
• Bothrops pictus

SECUENCIAS FASTA:
>Liolaemus etheridgei
CTCCTAGGATTATGTCTAATTATCCAAATTTTTACCGGCTTATTTCTAGCAATACACTACACAGCAGATA
TCTCCTCAGCCTTTTCATCAGTAGCACATATCTGCCGAGATGTCCAATACGGGTGACTTATCCGAAATAT
TCATGCAAACGGAGCCTCAATATTCTTTATCTGTATCTACCTTCACATCGGCCGCGGACTCTATTACGGC
TCCTACCTATATAAAGAAACCTGAAACATTGGAGTTATTTTACTTCTACTTGTAATAACCACGGCATTTG
TTGGGTATGTACTACCATGGGGCCAAATATCATTCTGAGGCGCAACCGTTATTACCAACCTCTTATCAGC
CATCCCATATGTCGGAGCAACCTTAGTTGAGTGAATCTGAGGGGGGTTCTCCGTAGACAATGCCACCCTA
ACACGATTCTTTACATTTCATTTTCTACTTCCATTTATCATTATCGGAGCATCCGCAGTCCACTTACTGT
TTCTTCACGAAACAGGCTCAAACAACCCAACAGGACTCCAATCAAACTCAGATAAAATCCCATTCCACCC
ATACTTCTCATACAAAGACATATTAGGAGCACTACTAATTATTATACTACTTCTCCTACTCGCCTTACTA
TCACCAAACCTTT
>Liolaemus insolitus
CCCATCATAAAAATTATTAACGGCTCATTTATTGACTTACCAACCCCATCAAACATCTCTGCATGATGAA
ACTTCGGATCCCTTCTAGGATTATGCCTGATCATCCAGATTCTCACTGGACTATTTCTAGCAATACACTA
CACAGCAGATATCTCCTCAGCCTTTTCATCAGTAGCACATATTTGTCGAGACGTTCAATACGGCTGACTT
ATCCGAAATATTCATGCAAACGGAGCCTCAATCTTCTTTATCTGCATCTACCTTCATATCGGACGCGGAT
TATACTATGGCTCTTACCTGTACAAAGAAACCTGAAATATCGGAGTTATCTTACTTCTACTTGTAATAGC
CACTGCATTTGTAGGATACGTATTACCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGCGCAACCGTTATTACCAAT
CTCTTATCAGCCATTCCTTATGTCGGAACAACTTTAGTTGAATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAGTGGACA
ATGCAACCCTAACACGATTCTTCACATTCCACTTTCTACTCCCATTTATTATTATTGGTGCATCCGCAGT
TCACTTACTATTTCTCCATGAAACAGGCTCAAACAACCCAACTGGACTTAAATCAAACTCAGACAAAATT
CCATTCCACCCGTACTTCTCGTATAAAGATCTACTAGGAGCACTACTAATTATCATACTATTACTCATAC
TTGCTCTACTATCACCAAACCTTCTAGGAGACCCAGAAAACTTTACACCAGCTAACCCCCTAGTCACACC
ACCACACATCAAACCAGAATGATATTTCCTATTTGCCTACGCAATCTTACGCTCAATCCCAAACAAGCTC
GGAGGTGTATTAGCCCTACTATTTTCAATCCTAGTACTATTTATAGTCCCAATTCTTCACACATCAAAAC
AACGCGGAAGCATATTTCGACCCCTATCACAAACCTTATTTTGGCTACTTGTAACCAACATTATTATCTT
AACATGAATCGGGGGACAACCAGTAGAACACCCATTTATCCTAATCGGACAAGTAGCATCACTAACCTAT
TTTATTATTTTTTTACTCCTTTTTCCAACCACAGCACTAG TAGAAAATAAACTTCTTAACTGATA
>Liolaemus signifer
AACATTTCTGCATGATGGAACTTCGGGTCCCTCCTAGGATTATGCCTAATTATCCAAATTTTTACTGGAC
TATTCCTAGCAATACACTATACAGCAGACATCTCCTCAGCCTTTTCATCAGTGGCACATATTTGTCGAGA
TGTTCAATACGGCTGACTTATCCGAAATATTCATGCAAACGGAGCCTCAATATTCTTTATCTGTATTTAC
CTTCATATCGGACGTGGACTCTACTACGGCTCCTATCTATATAAAGAGACCTGAAATATTGGAGTTATTA
TTCTTCTACTTGTAATAGCTACTGCATTTGTAGGATATGTCCTGCCATGAGGACAAATATCATTCTGAGG
CGCAACCGTTATCACCAACCTCCTATCAGCTATCCCATATGTCGGAGCAACCTTAGTTGAATGAATCTGA
GGGGGGTTCTCCGTAGACAATGCCACCCTAACACGATTCTTTACATTTCACTTTCTACTTCCATTTATTA
TTATTGGTGCCTCCGCAGTCCACTTACTATTTCTTCATGAAACAGGTTCAAACAACCCAACAGGACTTCA
ATCAAACTCAGATAAAATCCCATTCCACCCATACTTCTCATACAAAGATCTGTTAGGAGCACTATTAATT
ATTATGCTATTACTTCTACTCGCCTTATTATCACCAAACCTCTTAGGAGACCCAGAAAACTTTACCCCAG
CTAAC
>Liolaemus annectens
CTCCTAGGATTATGTCTAATTGTCCAAATTTTTACCGGCTTATTCCTAGCAATACACTACACAGCAGACA
TCTCCTCAGCCTTTTCATCAGTGGCACATATCTGCCGAGATGTTCAATACGGCTGACTTATCCGAAATAT
TCATGCAAACGGAGCCTCAATATTCTTTATCTGCATTTACCTTCACATCGGCCGCGGACTTTATTACGGC
TCCTACCTATATAAAGAAACCTGAAATATTGGAGTTATCCTACTTCTACTTGTAATAGCCACCGCATTTG
TTGGCTACGTATTACCATGGGGCCAAATATCATTCTGAGGCGCAACCGTTATCACCAACCTCCTATCCGC
CATCCCATATGTTGGAACAACCCTGGTTGAATGAATTTGAGGTGGATTTTCCGTAGACAATGCCACCCTA
ACACGATTCTTTACATTTCACTTTTTACTTCCATTTATCATTATTGGGGCCTCCGCAGTCCACCTACTGT
TTCTTCACGAAACAGGTTCAAACAACCCAACAGGACTTCAATCAAACTCAGATAAAATCCCATTCCACCC
ATACTTCTCATATAAAGATATATTAGGAGCATTACTAATTATTATACTACTACTCCTACTCGCCTTACTA
TCACCAAACCTTT
>Liolaemus walkeri
CTACTCGGACTCTGCCTAATCGTTCAAATCCTAACAGGCATCTTTCTAGCCATGCACTATACAGCAGACA
TTTCATCAGCCTTCTCATCAGTAGCCCACATCTGTCGAGATGTACAATACGGCTGACTCATCCGCAACAT
CCATGCAAATGGGGCTTCAATATTCTTCATCTGCATCTACCTGCACATTGGACGAGGGTTGTACTATGGA
TCCTATCTATATAAAGAAACCTGAAACATTGGAGTAATCCTTCTCCTGCTCGTCATAGCAACCGCTTTCG
TGGGCTACGTCCTACCATGGGGACAAATATCCTTCTGAGGTGCAACCGTTATCACCAACCTTCTATCTGC
CATCCCATACGTCGGAACAGCCCTAGTTGAGTGAATCTGGGGTGGGTTTTCTGTAGATAATGCAACCCTA
ACCCGGTTCTTTACATTCCACTTCTTACTACCATTTATCATCATCGGAGCATCAGCAGTTCATCTTTTAT
TTCTACACGAAACAGGGTCAAACAACCCAACTGGACTGCAATCAAACCCAGACAAAGTCCCATTTCACCC
ATACTTCTCATACAAAGACTTACTAGGTGCTCTACTAGCCATTATAGCCCTACTTCTACTCGCATTACTC
TCACCAAACCTACTAGGAGACCCGGAAAACTTTACACCA

>Microlophus peruvianus
ATGACAATCACACGAAAAACCCACCCAATCCTAAAACACATCAACAACTCATTCATTGACCTACCAACCC
CATCAAACATCTCTGCCTGATGAAACTTCGGATCCCTTCTAGGACTCTGCTTAATTATCCAAATCTTAAC
AGGACTATTCCTAGCAATACACTATACTGCGGAAGTCTCCATAGCCTTTTCTTCTGTAGCCCATATCTGC
CGAGATGTACAATACGGATGACTAATCCGAAACTTACACGCCAACGGAGCCTCTGTATTCTTCATCTGCC
TGTATCTACATATCGGCCGAGGCCTCTACTATGGATCATATTTATTCAAAGAAACATGAAACATCGGAAT
TATCCTACTCCTTCTCGTAATAGCAACCGCTTTTATAGGATACGTACTACCATGAGGACAAATATCCTTC
TGAGGCGCAACCGTAATCACAAATCTTCTATCAGCAGTCCCCTACGTCGGGACTACCCTGGTCCAATGAA
TTTGAGGCGGATTTTCAGTAGACAACGCTACCCTGACACGGTTCTTCACATTCCACTTTCTACTTCCATT
CATAATTACTGGAATAACAATCCTCCACTTATTATTCCTCCATGAAACCGGATCAAACAACCCAACAGGT
CTAAATTCAAACCCAGACAAAATCCCATTCCACCCATACTTCTCATACAAAGACCTCCTTGGTGCACTAA
TCCTAACACTATCCCTACTTTTACTAGTCCTCTTTTTCCCAAACCTGCTCGGAGATCCAGAAAACTTCAC
CCCCGCCAACCCCCTTGTAACCCCCCCACACATCAAACCAGAATGATACTTCCTATTTG
>Microlophus quadrivittatus
ATGACAATCACACGAAAAACCCACCCAATCTTAAAACACATCAACAATTCATTCATTGACCTACCAACCC
CATCAAACATCTCTGCCTGATGAAACTTCGGGTCCCTACTAGGACTCTGCTTAATTATTCAAATCTTAAC
AGGACTATTCCTAGCAATACACTACACCGCAGATATCTCCATAGCCTTTTCTTCTGTAGCCCATATCTGC
CGAGATGTACAATACGGATGACTCATCCGAAACTTACACGCCAACGGAGCCTCCATATTCTTCATCTGCC
TGTACCTACATATCGGCCGGGGCCTCTATTATGGATCATATCTATTTAAAGAAACTTGAAACATTGGCAT
CATCCTCCTCCTCCTTGTAATAGCAACCGCTTTTATGGGTTATGTACTACCATGGGGACAAATATCATTC
TGAGGCGCAACCGTAATCACAAATCTTCTATCAGCAGTTCCCTATGTAGGAACCACCCTAGTTCAATGAA
TTTGAGGTGGATTCTCAGTAGACAATGCTACCCTGACACGATTCTTCACATTCCACTTTCTACTTCCATT
CATAATCATTGGAGCAACAATCCTCCACCTATTATTCCTCCATGAAACTGGATCCAACAACCCCACAGGC
CTAAACTCAAACCCCGACAAAATCCCATTCCACCCATACTTCTCATACAAAGACCTCCTCGGAGCACTAA
TCCTAACACTCTTCCTACTTATACTAGTCCTCTTTTTCCCAAACCTGCTAGGAGATCCAGAAAACTTCAC
CCCAGCCAACCCCCTTGTTACCCCCCCACACATCAAACCAGAATGATACTTCCTATTTG
>Microlophus tigris
ATGACAATCACACGAAAAACTCACCCAATCTTAAAACACATCAACAATTCATTCATTGACCTACCAACCC
CATCAAACATCTCTGCCTGATGAAACTTCGGGTCCCTACTAGGACTATGCTTAATTATCCAAATCTTAAC
AGGACTATTCCTAGCAATACACTACACCGCAGATATCTCCATAGCCTTTTCTTCTGTAGCCCATATCTGC
CGAGATGTACAATACGGATGACTTATCCGAAACTTACATGCCAACGGAGCCTCCATATTCTTCATCTGCC
TATACCTACATATCGGCCGGGGCCTCTATTATGGGTCATATCTATTCAAAGAAACTTGAAACATTGGCAT
TATCCTCCTCCTTCTTGTAATAGCAACCGCTTTTATGGGATATGTACTACCATGAGGACAAATATCCTTC
TGAGGCGCAACCGTAATCACAAATCTTCTATCAGCAATCCCCTATGTAGGAACTACCCTAGTTCAATGAA
TTTGAGGTGGCTTTTCAGTAGACAATGCTACCCTGACACGATTCTTCACGTTCCACTTTCTACTTCCATT
CATAATTATCGGAATAACAATCCTCCACCTATTATTCCTCCACGAAACCGGATCCAACAACCCCACAGGC
CTAAACTCAAACCCCGACAAAATCCCATTCCACCCATACTTCTCATACAAAGACCTCCTCGGAGCACTAA
TCCTAACACTCTTCCTACTTATACTAGTCCTCTTCTTCCCAAACCTGCTAGGAGATCCAGAAAACTTCAC
CCCCGCTAACCCCCTTGTAACCCCGCCACACATCAAACCAGAGTGATACTTCCTATTTG
>Microlophus theresiae
ATGACAATCACACGAAAAACCCACCCAATCCTCAAACACATCAACAACTCATTCATCGACCTACCAACCC
CATCAAACATCTCTGCTTGATGGAACTTTGGCTCCCTACTAGGACTTTGCTTAGTAATCCAAATCCTCAC
AGGGTTATTTCTAGCAATACACTACACCGCAGACATCTCCATAGCCTTTTCATCTGTAGCCCACATCTGC
CGAGACGTACAATACGGATGACTCATCCGAAACTTACACGCCAACGGAGCCTCCATGTTCTTCATCTGCC
TGTACCTACACATCGGCCGAGGCCTCTACTACGGATCATACCTGTTCAAAGAAACATGAAACATCGGCAT
CATTCTCCTCCTGCTTGTAATAGCAACAGCCTTCATGGGATACGTACTACCTTGAGGACAAATATCCTTC
TGAGGTGCAACTGTAATCACGAACCTCCTATCAGCAGTCCCCTACGTAGGAACCACCCTTGTCCAATGAA
TCTGGGGTGGCTTCTCAGTAGACAATGCAACTCTTACACGATTTTTCACATTCCATTTTCTCCTACCATT
CTTAATCATCGGGACAACAGTTCTCCACTTGCTGTTCCTCCACGAAACCGGCTCCAACAACCCCACCGGC
TTAAACTCGAACCCCGACAAAATCCCATTCCACCCGTATTTCTCATACAAAGACCTCCTCGGAGCATTAC
TCCTAACCCTAATTCTCCTTACACTAGCCCTCTTCTACCCAAACTTACTAGGGGACCCAGAAAATTTCAC
ACCGGCTAACCCCCTTGTCACCCCCCCACACATTAAACCAGAATGATA

>Microlophus thoracicus
ATGACAATCACACGAAAAACCCACCCAATCTTCAAACACATTAACAACTCGTTTATTGACCTGCCAACCC
CCTCAAACATCTCAGCCTGATGAAACTTCGGATCCTTATTAGGGCTTTGCCTACTACTTCAAGTCTTCAC
AGGCCTATTTCTAGCAATACACTACACCGCAGATATCTCCATAGCCTTCTCATCAGTGGCCCACATCTGC
CGAGACGTACAATACGGGTGACTAATTCGAAACCTACATGCCAACGGAGCCTCCATATTTTTCATCTGCC
TGTACCTACACATTGGACGAGGTCTTTACTACGGATCATACCTTTTCAAAGAAACATGAAACATGGGCAT
TATCCTCCTCCTACTAGTAATAGCAACAGCCTTTATGGGCTACGTACTGCCATGAGGACAAATATCCTTT
TGAGGTGCAACCGTAATCACAAACCTCCTATCCGCAATCCCATACATCGGAACCACCCTGGTCGAATGAA
TCTGAGGCGGCTTCTCAGTAGACAACGCAACCCTCACACGATTTTTTACATTTCACTTCCTCCTACCATT
TCTAATCATTGGAGCAACCATCATCCACTTACTGTTCCTCCACGAGACTGGCTCCAATAATCCAACAGGA
CTAAACTCAAACCCAGATAAAATTCCATTCCATCCATACTTCTCACTTAAAGACCTCCTTGGAGCACTCA
TCCTAACCTTCTTACTTCTACTCCTGACCCTTTTCTCCCCAAACCTTTTAGGGGACCCAGAAAACTTCAC
CCCAGCCAACCCCCTCGTAACCCCACCCCACATCAAACCAGAATGATACTTCC
>Pseudalsophis elegans
CCACATAGCTTTCTCATCTGTAATCCACATTACCCGAGACGTCCCCTACGGCTGAATTATACAAAACCTC
CACGCAACCGGCGCATCCATATTCTTTATCTGCATCTACATTCATATCGCACGTGGGCTCTACTATGGCT
CCTACCTAAACAAAACAGTATGACTATCAGGGACAGCCCTGTTAATAACCTTAATAGCAACAGCCTTCTT
CGGGTACGTACTACCATGAGGACAGATATCATTCTGAGCGGCAACTGTTATCACCAACCTACTGACAGCC
GTACCCTACATTGGTGCCTCACTAACAACCTGACTATGGGGGGGATTCTCCATTAATGACCCCACCCTCA
CACGATTCTTTGCCCTCCACTTCATCCTACCATTTGCTATTATTTCACTATCTTCCATCCACATCATACT
ATTACACAACGAGGGTTCTAGCAACCCACTGGGCACAAACTCAGACATTGACAAAATCCCATTTCACCCC
TACCACTCCTATAAAGACACCCTTATACTATCTATCCATTATTACACTGCTATTCATC
>Phyllodactylus
GATCCTAACTGGCCTATTCCTGGCCATACACTACTCAGCCAACACCACCCTTGCCTTTACCTCAATCGCT
CATATCTGCCGTGACGTCCAATACGGATGGCTCATTCAAGCCCTTCACGCCAATGGCGCCTCCTTATTTT
TTATCTGCATCTACTCCCACATTGGCCGGGGGCTATACTACGGCTCCTACCTATACAAAGAAACCTGAAA
CACCGGGGTCGGACTACTGTTCCTAGTTATAGCAACAGCTTTTGTGGGCTATGTCCTCCCATGAGGCCAA
ATATCATTCTGAGGAGCGACCGTAATCACAAACCTGCTCTCCGCTATTCCGTACCTTGGGGCTCCCCTAG
TGGAGTGAGTTTGAGGGGGGTTTTCAGTTGACAACGCAACACTCACGCGATTCTTCACCTTTCACTTCCT
TCTCCCCTTCCTCCTAGTTGCCCTGATAATCTTACATCTCCTCTTCCTTCACGAAACTGGGTCCAACAAC
CCACTAGGACTCACCTCAAACCCAGATAAAATTCCCTTCCACCCATACTACTCTTTCAAAGACCTGCTCG
GCGCAGCTCTCGCACTTTTGGTCCTTCTTCTTCTTGCCCTGTTTTCACCATACCTTCTAGGAGACCCAGA
AAA
FILOGENIA DE LAS SECUENCIAS OBTENIDAS NCBI

CONCLUSIONES
La identificación de diferentes organismos se puede lograr mediante el análisis de secuencias
genéticas, como el ARNr 16S en el caso de la identificación bacteriana. Este enfoque permite
establecer las relaciones filogenéticas existentes entre los organismos procariotas. La
secuenciación del ARNr 16S es ampliamente utilizada debido a su conservación en las bacterias
y su capacidad para proporcionar información sobre la diversidad y la evolución de las especies
bacterianas (Araya, C. F., 2019).
El protocolo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica fundamental en el
análisis de secuencias genéticas. Permite generar millones de copias de una región de interés a
partir de una o muy pocas copias de ADN molde. La secuenciación de Sanger, basada en la
polimerización del ADN y el uso de dideoxinucleótidos como terminadores de la reacción, ha
sido una técnica muy utilizada en el pasado. En la actualidad, la secuenciación se basa en una
modificación de la PCR con dideoxinucleótidos marcados con fluoróforos, y las secuencias se
resuelven mediante electroforesis capilar para obtener secuencias consenso (Araya, C. F., 2019).
El formato de archivo Fasta es utilizado para almacenar secuencias de nucleótidos y permite
determinar la identidad de diferentes organismos a partir de una base de datos de nucleótidos. Esto
facilita la comparación y el análisis de secuencias genéticas para la identificación y el estudio de
la filogenia de los organismos (Araya, C. F., 2019).
La filogenia molecular analiza las diferencias moleculares para obtener información sobre las
relaciones evolutivas entre los organismos. Los análisis filogenéticos moleculares se representan
en árboles filogenéticos o cladogramas, que muestran las relaciones de parentesco entre los
diferentes taxones basados en características compartidas derivadas (sinapomorfías),
En resumen, el análisis de secuencias genéticas, como el ARNr 16S, la PCR, la secuenciación de
Sanger, el formato Fasta y los análisis filogenéticos moleculares, son herramientas importantes
para la identificación y el estudio de la filogenia de los organismos. Estas técnicas permiten
establecer relaciones evolutivas, datar divergencias y comprender la diversidad y la evolución de
los organismos.

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ANEXOS

Electroforesis en gel de Agarosa – Productos de PCR para el gen ADNr 16S