Sesion 8

IDENTIFICACIÓN DE MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS EN MUESTRAS DE
ESPUTO
La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para

identificar microorganismos alcohol-ácido resistentes (BAAR). El
nombre de este procedimiento de microbiología hace referencia a
sus autores: el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich
Neelsen.
Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el

uso de distintos colorantes con la finalidad de crear contraste
entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y
posteriormente identificar. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve para
identifica ciertos tipos de microorganismos.


No obstante, algunos grupos bacterianos requieren otros métodos

para poder identificarlos. Técnicas como la tinción de Ziehl-
Neelsen requieren combinaciones de colorantes con calor para fijar
el primero a la pared celular.
Luego viene un proceso de decoloración que permite obtener dos

resultados: resistencia o sensibilidad a la decoloración por ácidos y
alcoholes.
FUNDAMENTO:
El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades

de la pared celular de estos microorganismos. La pared está
formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos;
estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas.
Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos
pueden retener los colorantes con mayor facilidad. Algunos géneros
de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de Gram,
debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared celular.
En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico

carbol fucsina, un colorante básico. Este tiene la capacidad de
interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de
textura cerosa a temperatura ambiente.
La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor,

debido a que la cera se derrite y las moléculas de colorante se
mueven con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.
El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células

que no fueron teñidas porque su pared no era lo suficientemente
afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del decolorante ácido es
capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta
decoloración se llaman ácido-resistentes.
COLORANTE SECUNDARIO
Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con

otro colorante llamado colorante secundario. Generalmente se
utiliza el azul de metileno o el verde de malaquita.
El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en

consecuencia, crea contraste a las estructuras que fueron teñidas
en el primer paso. Solo las células decoloradas absorben el segundo
colorante (contra-tinción) y toman su color, mientras que las células
ácido-resistentes conservan el color rojo.
Este procedimiento se usa frecuentemente para la identificación

de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, las cuales
son llamadas bacilos ácido-alcohol resistentes.
REACTIVOS:
Colorante primario
Se usa carbol fucsina al 0,3 % (filtrado). Este colorante se prepara

a partir de una mezcla de alcoholes: fenol en etanol (90 %) o
metanol (95 %), y en esta mezcla se disuelven 3 gramos de fucsina
básica.
Solución decolorante
En este paso se pueden emplear soluciones de ácido alcohol al 3 % o

ácido sulfúrico al 25 %.
Colorante secundario (contra-colorante)
El colorante más empleado para realizar el contraste en las

muestras suele ser el azul de metileno al 0,3 %. Sin embargo,
también se pueden emplear otros, como el verde malaquita al 0,5 %.
TÉCNICA:
Procedimiento de tinción ácido-rápida
Preparar un frotis bacteriano
Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio y seco,

siguiendo las precauciones de esterilidad.
Secado del frotis
Dejar que el frotis se seque a temperatura ambiente.
Calentar la muestra
La muestra se debe calentar aplicando fuego al portaobjeto por

debajo. Se puede hacer una fijación con alcohol cuando el frotis no
se ha preparado con esputo (tratado con hipoclorito de sodio para
blanquearlo) y si no se va a teñir inmediatamente.
M. tuberculosis se elimina con lejía y durante el proceso de tinción.

La termofijación del esputo no tratado no matará a M. tuberculosis,
mientras que la fijación con alcohol es bactericida.
Cubrir la mancha
La mancha se cubre con la solución de carbol fucsina (colorante

básico primario).
Calentar la mancha
Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un desprendimiento de

vapor (aproximadamente a 60 °C). Es importante no sobrecalentar y
evitar quemar la muestra.
Con relación al calentamiento de la mancha, se debe tener mucho

cuidado al calentar la carbol fucsina, especialmente si la tinción se
lleva a cabo sobre una bandeja u otro recipiente en el que se hayan
recogido productos químicos altamente inflamables de la tinción
previa.
Solo se debe aplicar una pequeña llama debajo de los portaobjetos
usando un hisopo encendido previamente humedecido con unas gotas
de alcohol ácido, metanol o etanol al 70 %. Evitar usar un hisopo
grande empapado en etanol porque esto es un riesgo de incendio.
Lavar la mancha
Este lavado debe hacerse con agua limpia. Si el agua del grifo no
está limpia, lavar el frotis con agua filtrada o destilada,
preferiblemente.
Cubrir el frotis con alcohol ácido
Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La cobertura se lleva a cabo

durante 5 minutos o hasta que el frotis esté lo suficientemente
decolorado, es decir, de color rosa pálido.
Hay que tomar en cuenta que el alcohol ácido es inflamable; por lo

tanto, debe usarse con mucho cuidado. Se debe evitar estar cerca
de fuentes de ignición.
Lavar la mancha
El lavado debe ser con agua limpia, destilada.
Cubrir el frotis con colorante

Puede ser colorante verde de malaquita (0,5 %) o azul de metileno
(0,3 %) durante 1 o 2 minutos, utilizando el tiempo más prolongado
si el frotis es delgado.
Lavar la mancha
Nuevamente debe utilizarse agua limpia (destilada).
Drenar
Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar la

mancha en un estante de drenaje, para que esta se seque al aire (no
usar papel absorbente para el secado).
Examinar el frotis en el microscopio
Debe usarse el objetivo de 100X y el aceite de inmersión. Escanear

el frotis sistemáticamente y anotar las observaciones pertinentes.
Interpretar los resultados
Teóricamente, los microorganismos que se tiñan de un color rojizo

se consideran ácido alcohol resistente positivos (BAAR+).
Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde,

dependiendo del colorante utilizado como contra-colorante, se
consideran ácido alcohol resistente negativos (BAAR-)

Sesion 8

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Sesion 8

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Sesion 8

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

IDENTIFICACIÓN DE MYCOBACTERIUM

La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para

Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el

No obstante, algunos grupos bacterianos requieren otros métodos

Luego viene un proceso de decoloración que permite obtener dos

El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades

En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico

La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor,

El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células

Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con

El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en

Este procedimiento se usa frecuentemente para la identificación

Se usa carbol fucsina al 0,3 % (filtrado). Este colorante se prepara

En este paso se pueden emplear soluciones de ácido alcohol al 3 % o

Colorante secundario (contra-colorante)

El colorante más empleado para realizar el contraste en las

Preparar un frotis bacteriano

Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio y seco,

Secado del frotis

Dejar que el frotis se seque a temperatura ambiente.

La muestra se debe calentar aplicando fuego al portaobjeto por

M. tuberculosis se elimina con lejía y durante el proceso de tinción.

La mancha se cubre con la solución de carbol fucsina (colorante

Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un desprendimiento de

Con relación al calentamiento de la mancha, se debe tener mucho

Cubrir el frotis con alcohol ácido

Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La cobertura se lleva a cabo

Hay que tomar en cuenta que el alcohol ácido es inflamable; por lo

El lavado debe ser con agua limpia, destilada.

Cubrir el frotis con colorante

Nuevamente debe utilizarse agua limpia (destilada).

Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar la

Examinar el frotis en el microscopio

Debe usarse el objetivo de 100X y el aceite de inmersión. Escanear

Interpretar los resultados

Teóricamente, los microorganismos que se tiñan de un color rojizo

Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde,

También podría gustarte