TRATAMIENTO DE AGUAS DE LASTRE

MEDIANTE PROCESOS TÉRMICOS

Doble Grado en Ciencias del Mar y Ciencias Ambientales
Departamento de Tecnologías del Medio Ambiente

Tutores:
Enrique Nebot Sanz
Leonardo Romero Martínez

TRABAJO DE FIN DE GRADO

Sheila María Gámez Criado

Cádiz, 2023
Índice
Resumen................................................................................................................................... 4

Abstract .................................................................................................................................... 5

Listado de acrónimos ............................................................................................................... 6

1. Introducción ..................................................................................................................... 7

1.1. Análisis crítico de los antecedentes sobre episodios de invasiones biológicas

acuáticas ............................................................................................................................... 8

1.2. Normativa sobre el agua de lastre ........................................................................... 10

1.2.1. Convenio internacional para el control y la gestión del agua de lastre y los
sedimentos de los buques (OMI, 2004) ......................................................................... 10

1.2.2. Normas para los organismos vivos en el agua de lastre de buques descargada
en aguas de Estados Unidos (USCG, 2012) .................................................................. 12

1.3. Tratamiento térmico en el agua de lastre................................................................. 12

2. Hipótesis y objetivos ...................................................................................................... 15

3. Metodología ................................................................................................................... 16

3.1. Microorganismo empleado en la experimentación ................................................. 16

3.2. Preparación de los cultivos para el tratamiento ....................................................... 17

3.2.1. Obtención y manejo del cultivo de mantenimiento ......................................... 17

3.2.2. Preparación del cultivo previa al tratamiento .................................................. 19

3.3. Procedimiento experimental.................................................................................... 20

3.3.1. Descripción del dispositivo para el tratamiento térmico.................................. 20

3.3.2. Aplicación del tratamiento ............................................................................... 21

3.3.3. Incubación post-tratamiento y monitorización de la concentración celular .... 23

3.4. Análisis y tratamiento de datos ............................................................................... 25

3.4.1. Determinación de la supervivencia al tratamiento ........................................... 25

3.4.2. Determinación de los parámetros cinéticos de inactivación ............................ 26

3.5. Análisis estadístico .................................................................................................. 26

4. Resultados y discusión ................................................................................................... 27

2
 4.1. Análisis y modelización de las curvas de crecimiento ............................................ 27

4.1.1. Apariencia y características de las curvas de crecimiento ............................... 27

4.1.2. Determinación cuantitativa de la supervivencia al tratamiento ....................... 29

4.2. Análisis de las cinéticas de inactivación ................................................................. 33

4.2.1. Descripción y apariencia de las curvas de inactivación ................................... 33

4.2.2. Análisis estadístico de las curvas de inactivación ........................................... 34

4.2.3. Determinación de los parámetros cinéticos de inactivación ............................ 35

4.3. Valoración del organismo T. suecica como indicador para la eficacia del
tratamiento ......................................................................................................................... 38

4.4. Valoración del tratamiento térmico para la gestión de aguas de lastre ................... 38

4.5. Futuros estudios y perspectivas ............................................................................... 41

5. Conclusiones .................................................................................................................. 42

6. Bibliografía .................................................................................................................... 43

3
 Resumen

Cada vez es mayor el tráfico marítimo anual debido a que la mayor parte del transporte
internacional se realiza a través de buques. El vertido de aguas de lastre se ha convertido en
uno de los principales problemas ambientales, causado por intercambio de especies
contenidas en el agua de lastre que pueden convertirse en especies invasoras. Para solucionar
este problema, la Organización Marítima Internacional (OMI) aprobó en el año 2004 el
Convenio Internacional para el control y la gestión del agua de lastre y los sedimentos de los
buques (BWMC). El BWMC, en su regla D-2 establece unos estándares para la concentración
máxima de organismos viables en el agua de lastre descargada. Los buques de los países que
firmaron el convenio, más del 92% de la flota internacional, tienen hasta el 8 de septiembre
de 2024 para contar con un sistema de gestión del agua de lastre (BWMS) que cumpla los
estándares establecidos por el BWMC.

En el presente trabajo de fin de grado, se ha evaluado el tratamiento térmico como método de

inactivación de organismos fitoplántonicos, debido a que la mayoría de las investigaciones
realizadas hasta la actualidad han estado enfocadas a otros tipos de tecnologías de tratamiento.
El tratamiento térmico ha sido aplicado escala laboratorio en un rango de temperaturas (35,
40, 45 y 50 ºC) durante diferentes tiempos de exposición, hasta alcanzar un máximo de 48
horas de exposición al tratamiento térmico.

Con la ayuda de la modelización del crecimiento y de las curvas de inactivación se ha deter-

minado que 40 ºC la temperatura más baja eficaz en el tratamiento de desinfección del agua
de lastre.

Como organismo estudiado en los diferentes experimentos se ha utilizado la microalga Tetra-

selmis suecica por su facilidad de cultivo y de manejo en los sucesivos ensayos. En el presente
trabajo de fin de grado se propone la microalga T. suecica como organismo de prueba norma-
lizado (standard test organism, STO) para la categoría de organismos entre 10 y 50 µm de la
regla D-2 del BWMC.

4
 Abstract

Annual maritime traffic is increasing due to the fact that most international transport is car-
ried out by ships. The dumping of ballast water has become one of the main environmental
problems, caused by the exchange of species contained in the ballast water that can become
invasive species. To solve this problem, the International Maritime Organization (IMO) ap-
proved the International Convention for the Control and Management of Ships' Ballast Wa-
ter and Sediment (BWMC) in 2004. The BWMC, in its regulation D-2, establishes standards
for the maximum concentration of viable organisms in discharged ballast water. Ships from
the countries that signed the agreement, more than 92% of the international fleet, have until
September 8, 2024 to have a ballast water management system (BWMS) that meets the
standards established by the BWMC.

In this final degree project, caloric treatment has been evaluated as a method of inactivation
of phytoplankton organisms, because most of the research carried out to date has been fo-
cused on other types of treatment technologies. The heat treatment has been applied on a la-
boratory scale in a range of temperatures (35, 40, 45 and 50 ºC) for different exposure times,
up to a maximum of 48 hours of exposure to the heat treatment.

With the help of growth modeling and inactivation curves, it has been determined that 40 ºC
is the most effective and lowest temperature in the disinfection treatment of ballast water.

As the organism studied in the different experiments, the microalgae Tetraselmis suecica has
been used due to its ease of cultivation and handling in the successive tests. In this final de-
gree project, the microalgae T. suecica is proposed as a standard test organism (STO) for the
category of organisms between 10 and 50 µm of the BWMC rule D-2.

5
Listado de acrónimos

BWDS – “Normas para los organismos vivos en el agua de lastre de buques descargada en
aguas de Estado Unidos”.
BWMC – “Convenio internacional para el control y la gestión del agua de lastre y los
sedimentos de los buques” o simplificado como “Convenio sobre la gestión del agua de
lastre”.
BWMS – Sistema de gestión de las aguas de lastre.
CCMM – Colección de Cepas de Microalgas Marinas.
Código BWMS – Código para la aprobación de sistemas de gestión de aguas de lastre.
ICMAN – Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía.
OMI – Organización Marítima Internacional.
STO – Organismo de prueba normalizado.
TFG – Trabajo de Fin de Grado.
UCA – Universidad de Cádiz.
UFC – Unidades formadoras de colonias.
USCG – Guardia Costera de los Estados Unidos.

6
1. Introducción

Se presencia una invasión biológica cuando una especie de origen remoto alcanza un nuevo
territorio y se propaga por él a gran velocidad, alterando la estructura y funcionamiento del
ecosistema receptor, causando daños ecológicos, sociales y económicos (H.A. Mooney and
R.J. Hobbs, 2000). Se considera que las invasiones biológicas son una importante causa de
pérdida de biodiversidad en el mundo, por detrás de la destrucción de hábitats y la
fragmentación del paisaje (Williamson, 1996).

El comercio marítimo representa la vía principal de introducción de especies alóctonas en los

ecosistemas por los organismos adheridos en el caso y el uso de aguas de lastre (Davidson et
al., 2006). La Organización Marítima Internacional (OMI) en 2004 aprobó el “Convenio sobre
la gestión del agua de lastre” (BWMC), donde se especifican las concentraciones máximas de
organismos que pueden contener las aguas de lastre descargadas. Será durante este 2024
cuando todos los buques de los países que firmaron el convenio (más del 92% de la flota
internacional) se vean obligados a contar con un sistema de gestión del agua de lastre
(BWMS) que permita cumplir la directriz y que esté aprobado por la OMI. La cercanía de la
entrada en vigor de esta normativa incentiva la creación de estudios como el abordado en este
TFG.

Otro motivo que hace que resalte la importancia de este tema es la gran variedad de
organismos presentes en el agua de lastre. Entre estos se incluyen moluscos, algas, bacterias,
ctenóforos, equinodermos y artrópodos. Pero son las proliferaciones de algas y cianobacterias
nocivas las que llegan a causar graves problemas ecológicos (eutrofización y posterior
anoxia), económicos (acuicultura y turismo) y sanitarios (producción de toxinas), episodios
que han ido aumentando en los últimos años (Masó and Garcés, 2006).

Por la cercanía tanto en tiempo como con el lugar donde se ha realizado el presente TFG es
interesante comentar la reciente invasión biológica del alga Rugulopterix okamurae. Es de la
familia Dictyotaceae y su distribución nativa se restringe a las costas de China, Corea, Japón,
Taiwán y Filipinas (Ministerio para la transición ecológica y el reto demográfico, 2022). Fue
en 2015 cuando se detectó por primera vez al sur del Estrecho de Gibraltar (Ceuta) y al año
siguiente al norte (Tarifa), desde donde se ha ido extendiendo hacia la costa tanto Atlántica
como Mediterránea. Se piensa que fueron las aguas de lastre de los buques asiáticos las que
favorecieron su penetración en estas aguas. La agresividad del proceso de invasión y los
7
impactos ecológicos y paisajísticos son tan grandes que se puede decir que no hay precedentes
en aguas europeas (García-Gómez et al., 2020).

1.1. Análisis crítico de los antecedentes sobre episodios de invasiones biológicas

acuáticas

La problemática de las especies invasoras no es nueva. A partir de 1890, hasta la actualidad,

con la modernización de la industria naval y la utilización de acero para la construcción de
buques, el lastre seco (arena, rocas, madera, incluso conchas) ha sido sustituido por tanques
de lastre diseñados con un sistema de bombeo que introduce agua de mar, un recurso
abundante de fácil manipulación.

El agua de lastre es esencial para la seguridad y operación eficiente de los buques porque
provee balance, estabilidad, maniobrabilidad y eficacia de propulsión a los barcos sin carga
(Gollasch et al., 2007). Los buques realizan maniobras de lastrado y deslastrado durante las
operaciones de carga y descarga de mercancía, en condiciones de mar gruesa, al reducir el
calado en áreas costeras y/o debido a consumos de combustible (Figura 1).

Figura 1. Ciclo de las aguas de lastre. Fuente: programa Globallast.

Cuando un buque incorpora agua de lastre, lo hace junto con los organismos de ese
ecosistema, tanto planctónicos como bentónicos y nectónicos, y con frecuencia también
adicionan limos y sedimentos. A pesar de que no todos estos organismos sobreviven en el
tanque, debido a que es un medio hostil en movimiento, con falta de alimento y luz, algunos

8
lo hacen, tanto en su forma vegetativa como en forma de huevos, quistes o estadios de
resistencia (Abelando, 2021). Estos organismos supervivientes al ser liberados en un nuevo
ecosistema pueden llegar a convertirse en especie dominante, eliminando las especies
autóctonas. Esto es debido a que estas especies carecen de depredadores naturales que limiten
su crecimiento, en cambio, una vez que se alojan, consumen los alimentos de las especies
nativas e incluso algunas las eliminan, alternado el ciclo de vida natural y destruyendo el
equilibrio ecológico, pudiendo afectar a la salud humana.

La ciencia sitúa el primer caso con consecuencias medioambientales significativas en el año

1903, tras la aparición masiva en el Mar del Norte de las algas asiáticas conocidas como
Odontella (Biddulphia sinensis) (Gómez and Souissi, 2010). Este fenómeno se ha ido
agravando con el paso del tiempo debido a la expansión de la navegación, así como con la
apertura de nuevas rutas de navegación. En la actualidad, prácticamente todos los mares y
océanos del mundo están expuestos a estas translocaciones de especies, y por ende, a la
homogeneización biológica de las comunidades. Incluso, es probable que todavía no se haya
presenciado las consecuencias más graves derivadas de la incorrecta gestión del agua de
lastre.

Algunos ejemplos de las especies que han podido ser transportadas por la actividad humana
y que han derivado en daños ecológicos (desaparición de especies por depredación o
competencia), económicos (turismo, acuicultura) o problemas sanitarios (producción de
toxinas) son el ctenóforo americano (Mnemiopsis leidyi), de origen norteamericano, se ha
propagado por el Mar Negro, acabando con el plancton autóctono (Poorter and MacKay,
2003), el cangrejo de mar común o cangrejo verde europeo (Carcinus maenas), originario del
litoral atlántico nororiental, se encuentra tanto en la costa oriental como en la occidental de
Estados Unidos (Grosholz and Ruiz, 1995), el alga Caulerpa taxifolia, procedente de aguas
tropicales del Mar de China y Filipinas, se ha introducido en el Mar Mediterráneo (Meinesz
et al., 1993), o el mejillón cebra (Dreissena polymorpha), originario del Mar Negro y Mar
Caspio, ha invadido amplias zonas de Europa Occidental y Norteamérica (Karatakev et al.,
1997), entre otros (Figura 2).

9
 A B

C D

Figura 2. Mnemiopsis leidy (A); Carcinus maenas (B); Caulerpa taxifolia (C); Dreissena
polymorpha (D). Fuente: Shutterstock.

1.2. Normativa sobre el agua de lastre

A continuación, se exponen las principales regulaciones y convenios internacionales que están

en vigor, cuyo objetivo es minimizar los problemas tratados anteriormente.

1.2.1. Convenio internacional para el control y la gestión del agua de lastre y los
sedimentos de los buques (OMI, 2004)

Tras 14 años de negociaciones la Organización Marítima Internacional (OMI) aprobó el

“Convenio Internacional para el Control y la Gestión del Agua de Lastre y los Sedimentos de
los Buques” (BWMC) el 13 de febrero del año 2004 en Londres.

Es el convenio más importante en materia de manejo de aguas de lastre, ya que unificó los
estándares y procedimientos que deben cumplir los buques con respecto a estas. España firmó
el convenio el 14 de septiembre de 2005, siendo uno de los primeros países en hacerlo.

10
El BWMC está formado por 22 artículos y un anexo con 5 secciones (A-E) donde se especifica
como se deben de gestionar las aguas de lastre y los sedimentos. De las distintas secciones
del anexo serán importantes las siguientes reglas de la sección D que trata sobre los estándares
para el manejo de las aguas de lastre:

• Regla D-1. Norma para el cambio del agua de lastre.

Se exige a los buques que opten por la opción de realizar el cambio de lastre en mar abierto,
un cambio volumétrico del agua de lastre de al menos un 95%. Las condiciones para este
intercambio están reguladas en la regla B-4 donde se indica que el cambio de agua de lastre
ha de hacerse, siempre que se pueda, como mínimo, a 200 millas marinas de la tierra más
próxima, con una profundidad mínima de 200 metros. También en la regla B-4 se indican las
posibles alternativas cuando estas condiciones no se puedan cumplir en el trayecto del buque.
Los buques se pueden acoger a esta regla hasta el 8 de septiembre de 2024, después de esta
fecha toda la gestión del agua de lastre deberá realizarse siguiendo la regla D-2.

• Regla D-2. Norma de eficacia de la gestión del agua de lastre.

Establece la concentración máxima de organismos viables en el agua de lastre descargadas

(Tabla 1). Para que puedan cumplir con estos estándares los buques deberán contar a bordo,
antes del 8 de septiembre de 2024, con un sistema de tratamiento de aguas de lastre (BWMS).

Tabla 1. Concentraciones máximas de organismos viables en aguas de lastre descargadas.

Fuente: regla D-2 (BWMC). UFC: unidades formadoras de colonias.

Tamaño organismos Concentración máxima admisible

Mayores o iguales a 50 µm 10 organismos viables por m3

Entre 10 – 50 µm 10 organismos viables por mL

Microorganismos indicadores

Vibrio cholerae 1 UFC por 100 mL

Escherichia coli 250 UFC por 100 mL

Enterococci sp. 100 UFC por 100 mL

11
 • Regla D-3. Prescripciones relativas a la aprobación de los sistemas de gestión del
agua de lastre.

Establece que los BWMS utilizados para cumplir con el BWMC deben ser aprobados por la
Administración y ser seguros para el buque, el equipo y la tripulación. El proceso para la
aprobación de un BWMS, regulado en el Código para la aprobación de sistemas de
tratamiento de aguas de lastre (Código BWMS) incluye pruebas en tierra y a bordo para
determinar la eficacia de los sistemas de tratamiento en la inactivación de los organismos y
su aceptabilidad ambiental (IMO, 2018). Los procedimientos para la aprobación de los
BWMS que utilicen sustancias activas (sustancia u organismo que tiene una acción específica
sobre o contra organismos acuáticos nocivos y patógenos) o compuestos que contengan
sustancias activas tienen una regulación específica (directriz G9) (IMO, 2008). En caso de
que se revoque la aprobación de alguna sustancia, su uso quedará prohibido en un periodo
máximo de un año desde la fecha de revocación.

1.2.2. Normas para los organismos vivos en el agua de lastre de buques descargada
en aguas de Estados Unidos (USCG, 2012)

Estados Unidos no ha querido ratificar el BWMC y lleva a cabo su propia regulación de la

gestión de las aguas de lastre en sus aguas. En 2012 se aprobó la regla final “Normas para los
organismos vivos en el agua de lastre de buques descargada en aguas de Estado Unidos”
(BWDS) por parte de la de la Guardia Costera de los Estados Unidos (USCG) obligatoria para
todos los buques que operen en aguas estadounidenses (USCG, 2012). Aunque las directrices
de la BWDS se asemejan a las del BWMC, existen algunas diferencias de regulación. La
principal diferencia la encontramos en los requisitos para la aprobación de los BWMS, aunque
también hay cambios en la consideración del estado de los microorganismos en el agua de
lastre descargada. La IMO establece un número máximo de organismo viables, en cambio, la
USCG establece un número máximo de organismos vivos, incluyendo a los viables y a los no
viables, siempre y cuando estén vivos. Esto afecta a la aprobación de los BWMS debido a que
aquellos que provocan la inviabilidad de los organismos, pero no su muerte no recibirá la
aprobación por parte de los USCG (Čampara et al., 2019; IMO, 2004; USCG, 2012).

1.3. Tratamiento térmico en el agua de lastre

Los tratamientos de desinfección han estado presentes desde hace décadas en la inactivación
de organismos patógenos en aguas para el consumo humano y aguas residuales, siendo nueva
12
su aplicación en la desinfección del agua de lastre. Existe una gran variedad de BWMS debido
a que existen un gran abanico de técnicas capaces de eliminar las especies biológicas de los
tanques. Todos estos sistemas de tratamiento de aguas presentan ventajas e inconvenientes.
En ocasiones, las ventajas de una solución son las desventajas de la otra, por lo que, en la
mayoría de los casos, un BWMS consta de varias etapas, un primer tratamiento de filtración
o separación mecánica, y posteriormente de desinfección tipo físico, químico o una
combinación de ambos (Tsolaki and Diamadopoulos, 2010). El tratamiento de desinfección
más común es la radiación UV, seguido de la electrocloración aunque también existen otros
como la ozonización, los ultrasonidos, la desoxigenación o el calor (Gerhard et al., 2019;
Hess-Erga et al., 2019), siendo este último en el que se centra el presente trabajo. Estos
tratamientos se pueden aplicar en el momento de la carga, durante el trayecto o en la descarga.

Este sistema de tratamiento térmico consiste en llevar el agua de lastre hasta una temperatura
a la cual los organismos presentes sean eliminados. Con este tipo de tratamiento a bordo del
buque, existen tres opciones, el uso del calor residual producido por los motores del barco, el
uso del calor creado por los sistemas de calderas de reserva instalados a bordo del buque y/o
el calor residual de los gases de escape. En los tratamientos térmicos los tiempos de
exposición depende de la temperatura utilizada y la resistencia del organismo que se quiera
eliminar si bien, para la mayoría de ellos, suele ser suficiente temperaturas de 40 ± 5 ºC
(Rigby, 2004). Tanto en tratamientos prolongados a temperaturas medias (Rigby, 2004; Rigby
et al., 1999) como cortos a temperaturas altas (Quilez-Badia et al., 2008) han demostrado ser
viables en el tratamiento del agua de lastre.

El tratamiento térmico del agua de lastre cuenta con dos grandes problemas que son la alta
demanda energética y el tiempo necesario para calentar el gran volumen de agua de lastre que
se emplea, convirtiéndolo así en tratamientos costosos tanto energética como en algunos casos
también económicamente. Por lo tanto, debido a la necesidad de tiempos de tratamiento
prolongados se puede decir que este sistema no se podría aplicar en trayectos cortos, debido
a que el agua de lastre no conseguiría llegar a la temperatura idónea. Por otro lado, en caso de
que se consiguiera calentar el agua de lastre, en el momento del deslastrado se debe tener en
cuenta que la alta temperatura del agua de lastre no provoque daños en el ecosistema receptor.

De los BWMS homologados por la IMO hasta agosto de 2023, los más comunes son los
basados en radiación UV. Por otro lado, solo se han encontrado dos BWMS que durante el
proceso utilicen el calor como método de desinfección, ambos pertenecientes a la misma
13
empresa, Bawat Water Technologies. El primero, el BAWAT BWMS Mk2, opera a
temperaturas de pasteurización mayores de 64 ºC y tiene una capacidad de 50 – 5.000 m3 h-1.
Del otro sistema lo único que se conoce es que lo han nombrado como Bawat BWMS y que
combina el tratamiento térmico con una extracción del oxígeno presente. Se desconoce el
grado de implementación de este equipamiento en buques reales.

14
2. Hipótesis y objetivos

El objetivo principal del presente trabajo final de grado es evaluar la eficacia del tratamiento
térmico como método de desinfección del agua de lastre.

Se parte de dos hipótesis diferentes, la primera es que la microalga Tetraselmis suecica es una
especie adecuada como indicadora de la eficacia de tratamientos térmicos al ser fácil de
cultivar en el laboratorio y ser representativa de las microalgas presentes en el agua de lastre,
por lo que se supone que los cambios experimentados por parte de T. suecica durante el
experimento serán semejantes a las alteraciones sufridas por el resto de las microalgas
presentes en el agua de lastre en las mismas condiciones. En la segunda hipótesis se prevé que
a medida que incrementamos la temperatura y el tiempo de tratamiento térmico en el estudio
aumentará la desinfección del agua de lastre existiendo un óptimo que se pretende determinar
en este trabajo.

Para lograr el objetivo principal se proponen los siguientes objetivos específicos:

• Objetivo 1: Comprobar la aplicabilidad de T. suecica como bioindicador de la desin-

fección del agua de lastre mediante tratamiento térmicos.

• Objetivo 2: Evaluar la eficacia del tratamiento térmico a diferentes temperaturas e

intervalos de tiempo como método de inactivación de organismos fitoplanctónicos.

• Objetivo 3: Realizar un estudio tecnoeconómico para analizar la viabilidad de los

tratamientos térmicos como sistema de tratamiento del agua de lastre.

15
3. Metodología

Es este apartado se describen tanto los instrumentos como los equipos empleados en la parte
experimental, así como las técnicas de evaluación de la eficacia del tratamiento utilizado en
el presente TFG.

3.1. Microorganismo empleado en la experimentación

El organismo empleado para la evaluación de la eficacia del tratamiento fue la especie

fitoplanctónica T. suecica (phylum Chlorophyta, en la clase Prasinophyceae, orden
Chlorodendrales, familia Chlorodendraceae). El inóculo fue adquirido de la Colección de
Cepas de Microalgas Marinas (CCMM) del Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía
(ICMAN) perteneciente al Centro Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), situado en
el Campus de Puerto Real de la Universidad de Cádiz (UCA).

T. suecica (Figura 3) es una microalga marina unicelular y móvil, con un tamaño entre 10 y
40 µm, y especialmente común en hábitats marinos, aunque también se puede encontrar en
aguas salobres y dulces.

Figura 3. Imagen al microscopio de T. suecica. Fuente: Colección de Cepas de Microalgas

Marinas del ICMAN.

Debido a su tamaño, T. suecica se encuentra en un rango controlado por la regla D-2 del
BWMC, exigiéndose que su concentración en la descarga del agua de lastre sea menor de 10
individuos viables por mL. Además, presenta una elevada adaptabilidad a las condiciones

16
estandarizadas de cultivo en masa y una alta tasa de reproducción en ambientes artificiales.
Esta última característica hace que sea una microalga fácil de cultivar a gran escala en cultivos
de interior, siendo una especie bastante utilizada en la alimentación de rotíferos, bivalvos y
peces herbívoros, por lo que su disponibilidad también es elevada (Robert et al., 2001). Por
estos motivos, la especie T. suecica puede ser considerada un organismo de prueba
normalizado (standard test organism, STO) para la categoría de organismos entre 10 y 50 µm
(Lundgreen et al., 2019).

3.2. Preparación de los cultivos para el tratamiento

3.2.1. Obtención y manejo del cultivo de mantenimiento

Para los cultivos de la microalga T. suecica se elaboró agua salada sintética mediante sal
marina Instant Ocean, una sal utilizada frecuentemente en acuarios, y el medio de cultivo
utilizado fue el F/2, suministrado por la Planta de Cultivos Marinos de la Facultad de Ciencias
del Mar y Ambientales. Para que tanto el agua salada sintética elaborada como el medio de
cultivo utilizado se mantuviera en óptimas condiciones se conservaron refrigerados ambos en
recipientes a 2 ºC en oscuridad durante todo el periodo que abarcó la parte experimental del
presente trabajo.

Para la incubación de las muestras de T. suecica se utilizó una cámara de cultivo, que es un
equipo constituido por un habitáculo que permite condiciones controladas mediante el manejo
de parámetros como la temperatura, la iluminación, la humedad, etc. En el presente trabajo,
la cámara de cultivos empleada durante las etapas anteriores al tratamiento térmico tenía una
temperatura constante de 24 ºC con iluminación LED a 200 µmol m-2 s-1 y un fotoperiodo de
16:8 (Figura 4).

17
Figura 4. Fotografía del cultivo de T. suecica en una cámara de cultivo.

En primer lugar, una vez adquirido el vial de inóculo se procedió a diluir su contenido en 10
mL de la mezcla de agua salada y medio de cultivo en un tubo Falcon estéril. Este cultivo se
dejó incubando una semana en una cámara de cultivo. Pasado el periodo de incubación y con
la seguridad de que no se presentaba ninguna anomalía en el cultivo, se procedió a escalar el
cultivo una vez cada semana, pasando por volúmenes de 100 mL, 500 mL y finalmente de 1
L (Figura 5). De esta manera se consiguió tener un volumen de 1 L de cultivo de
mantenimiento de T. suecica a partir del volumen inicial del vial con el inóculo.

Figura 5. Esquema de la metodología del escalado del inóculo de T. suecica hasta alcanzar
un volumen de 1 L.

18
En el transcurso de las semanas que duró la parte experimental del presente trabajo se
realizaron renovaciones al cultivo de mantenimiento, así como decantaciones y cambios de
recipiente (Figura 6). Las renovaciones del cultivo se llevaron a cabo eliminado parte del
volumen del cultivo y adicionando nuevo medio de cultivo con el objetivo de producir una
renovación de los nutrientes, necesarios para un óptimo crecimiento y reproducción de la
especie. Para las decantaciones se utilizó un embudo de decantación de un litro y se dejó
reposar el cultivo durante aproximadamente dos horas; una vez pasado ese tiempo se eliminó
el volumen que contenía los precipitados y se devolvió el cultivo restante a una botella
autoclavada nueva. El cambio de botella lo que nos permitió fue la eliminación del fouling,
es decir, los incrustamientos y el crecimiento biológico de la superficie de la botella que
contenía el cultivo. De esta manera, se mantuvo el cultivo de mantenimiento en óptimas
condiciones para que siguiera creciendo y pudiera ser utilizado en los posteriores ensayos.

A B

Figura 6. Fotografía del cultivo de T. suecica decantando en un embudo de decantación (A).

Fotografía del cultivo decantado y libre de fouling (B).

3.2.2. Preparación del cultivo previa al tratamiento

Para cada experimento fueron necesarios 640 mL de cultivo en fase de crecimiento

exponencial a una concentración mínima de 1000 células mL-1, ya que el código BWMS en
su anexo 5 (2.33.3), indica que los experimentos de desinfección para aprobar un BWMS han
de llevarse a cabo con concentraciones mínimas de 1000 células mL-1 para los organismos de
entre 10 y 50 µm (IMO, 2018). Para ello se utilizó un volumen de aproximadamente 300 mL
del cultivo de mantenimiento, al que se le adicionó 500 mL de medio de cultivo, y se mantuvo
19
en la cámara de incubación hasta el momento del experimento. A este cultivo se le realizó un
seguimiento diario midiendo la fluorescencia y la actividad fotosintética mediante un
fluorómetro portátil a 500 nm (AquaPen, Photon Systems Instruments, Czech Republic)
(Figura 7) para asegurar de que se alcanzaba la concentración mínima establecida por el
código BWMS. La fluorescencia se relacionó con la concentración celular del cultivo
mediante una recta de calibrado que se comentará más adelante (Figura 12). De este modo, la
evolución de la fluorescencia permitía reconocer la fase de crecimiento exponencial, fase en
la que se realizaron todos los ensayos ya que las células se encuentran en momento óptimo de
actividad vital. Tras aproximadamente tres días de incubación, el cultivo preparado para el
tratamiento se encontraba en fase de crecimiento exponencial, con una concentración
aproximada de 200 000 células mL-1.

Figura 7. Fotografía del florómetro portátil (AquaPen, Photon Systemns Instruments, Czech
Republic) utilizado para realizar las mediciones de fluorescencia diarias.

3.3. Procedimiento experimental

3.3.1. Descripción del dispositivo para el tratamiento térmico

Los experimentos se llevaron a cabo en un baño termostático de agua caliente, que es un

equipo conformado por un recipiente lleno de agua, la cual se calienta mediante una
resistencia eléctrica sumergida a una temperatura constante, uniforme y lentamente (Figura
8). La máxima temperatura que alcanza el equipo son los 100 ºC, aunque en los ensayos que
20
se realizaron la temperatura máxima alcanzada fue de 50 ºC. Previamente a la realización de
los experimentos se monitorizó el equipo calentado el agua a 40 ºC durante dos horas, con el
objetivo de conocer con seguridad que la temperatura se mantenía uniforme y constante.
Durante el seguimiento se comprobó que el termostato de equipo funcionaba perfectamente,
de manera que la temperatura se mantuvo constante durante toda la monitorización. En cuanto
a la uniformidad, se establecieron las muestras céntricamente en el baño, evitando el contorno,
ya que este se encuentra menos influenciado por la resistencia que calienta el agua del equipo.

Figura 8. Fotografía del baño termostático utilizado para el tratamiento térmico.

3.3.2. Aplicación del tratamiento

El tratamiento para este estudio consistió en someter el cultivo de T. suecica a diferentes

temperaturas durante diferentes tiempos de exposición. Las temperaturas seleccionadas
inicialmente fueron 35 ºC, 40 ºC, 45 ºC y 50 ºC. Para cada temperatura se realizó un
experimento, obteniéndose muestras a tiempos de exposición de 0,5 h, 1 h y 2 h, además de
su correspondiente control (Figura 9). Adicionalmente, se recogió una muestra en el momento
en que el volumen de cultivo introducido en el baño a temperatura ambiente alcanzó la
temperatura establecida para el experimento, para determinar si existe una inactivación de
microorganismos durante ese calentamiento inicial. Tras analizar los efectos obtenidos tras el
tratamiento térmico, se decidió realizar dos ensayos adicionales a temperatura de 35 y 40 ºC

21
extendiendo los tiempos de exposición a 24 y 48 h, de manera que se aumentaron el número
de resultados con el objetivo de evaluar con más precisión el tratamiento térmico aplicado.

Figura 9. Esquema de la metodología de los experimentos que se llevaron a cabo durante un

tiempo máximo de 2 horas a la exposición del tratamiento térmico.

Para la realización de los experimentos se calentó el baño termostático a la temperatura

establecida en el ensayo y se transfirieron 40 mL de cultivo en dieciséis matraces de 50 mL
previamente autoclavados. Todos los matraces se cubrieron con papel de aluminio para evitar
la evaporación del medio de cultivo y la contaminación de las muestras. Tres de los dieciséis
matraces se devolvieron a la cámara de cultivo sin someterlos al tratamiento térmico; estos
fueron el control del experimento. El resto de los matraces se sumergieron en el baño. En uno
de los matraces se fue midiendo la temperatura del cultivo, y cuando este alcanzó la
temperatura fijada en el ensayo se sacaron los primeros tres matraces, además del matraz en
el que se estuvo tomando los valores de temperatura, con el fin de evitar cualquier tipo de
contaminación este matraz se desechó. El resto de los matraces se fueron sacando del baño
una vez alcanzados los tiempos de exposición marcados, siendo el tiempo cero el momento
en el que se sumergieron los matraces en el baño. De esta manera, finalmente en cada
experimento se obtuvieron un triplicado de matraces con 40 mL de cultivo por cada tiempo
de exposición a una determinada temperatura (Figura 10).

22
 A B

Figura 10. Fotografía de la medición de la temperatura del cultivo (A). Fotografía de la

medición de la temperatura del agua del baño termostático (B).

3.3.3. Incubación post-tratamiento y monitorización de la concentración celular

Una vez aplicado el tratamiento térmico en el baño termostático, los matraces se introdujeron
en una cámara de cultivo durante dos semanas para examinar su estado de actividad. Por
motivos de disponibilidad de espacio, las condiciones de la cámara de cultivos fueron
diferentes; la temperatura se encontraba de manera constante a 20 ºC y la iluminación LED
presentaba una irradiancia de 30 µmol m-2 s-1 con un fotoperiodo de 24:00.

En el transcurso de las dos semanas de incubación tras el tratamiento, se monitorizó

periódicamente la evolución de la concentración celular a través de medidas de fluorescencia
empleando un lector de microplacas (Tecan infinite F200, Tecan, Switzerland) con unos
parámetros establecidos (SOFTWARE Tecan i-control, 1.6.19.2; plate Corning 96 Flat
Bottom White Polystyrol; excitation at 360 nm, emisión at 670 nm, 25 flashes, 20 µs
integration time) (Figura 11).

23
Figura 11. Fotografía del lector de microplacas (Tecan infinite F200, Tecan, Switzerland)
mientras que se introduce una microplaca para realizar una medición de la fluorescencia del
cultivo de T. suecica.

Mediante un ensayo previo de calibración empleando varias diluciones del cultivo de

mantenimiento se determinó que existe una correlación lineal entre la fluorescencia
determinada por el lector de microplacas y la concentración determinada mediante recuentos
al microscopio con cámaras Neubauer (Figura 12). Además de ser más rápidas, las medidas
de fluorescencia presentaron menos desviación estándar entre triplicados de la misma
muestra, por lo que resultaron más precisas que los recuentos al microscopio. En cuanto a la
R2, presenta un valor de 0,9976, muy cercano a la unidad, de manera que se produce un buen
ajuste del modelo lineal.

24
Figura 12. Recta de calibrado de fluorescencia (u.a.) frente a la concentración teórica (células
mL-1).

3.4. Análisis y tratamiento de datos

3.4.1. Determinación de la supervivencia al tratamiento

Las curvas de crecimiento de las diferentes muestras se obtuvieron representando la

fluorescencia frente al tiempo de incubación post-tratamiento. Estas se ajustaron al modelo
logístico de Verhulst donde desde la fase inicial presenta un crecimiento exponencial, pero a
medida que la población se aproxima a la capacidad de carga, la tasa de crecimiento se hace
más lenta y finalmente se estabiliza (Peleg et al., 2007). Este modelo se aplicó intercambiando
en la ecuación el parámetro de la concentración celular por la fluorescencia, dado que se
comprobó que ambas están correlacionadas linealmente (Ecuación 1; Fv: fluorescencia de
organismos viables en un momento igual a t [d]; Fv0: fluorescencia inicial de organismos
viables; Fmax: fluorescencia máxima o capacidad de carga; y r: tasa de crecimiento [d-1]). Se
empleó la herramienta Solver (MS Excel) para determinar el conjunto de parámetros Fv0, Fmax
y r que minimiza el error cuadrático medio.

𝑁max · 𝐹v0 · 𝑒 𝑟𝑡
𝐹V (t) = Ecuación 1
𝑁max + 𝐹v0 ( 𝑒 𝑟𝑡 −1 )

25
Una vez obtenidos los parámetros del modelo, se pudo determinar la supervivencia (S) como
el cociente entre Fv0 de cada muestra y el Fv0 del control de la serie experimental, indicando
la proporción de organismos que conservan su viabilidad tras el tratamiento térmico.

3.4.2. Determinación de los parámetros cinéticos de inactivación

Tras la determinación de la supervivencia, se obtuvieron las curvas de supervivencia

enfrentando Log (S) al tiempo de exposición (horas). Mediante la herramienta de GInaFit para
MS Excel (Geeraerd et al., 2005) se ajustaron dichas curvas a diferentes modelos de
inactivación, utilizando la R2 como criterio de selección del modelo que mejor se adaptaba.
La herramienta de GInaFit permite el ajuste de los datos a nueve modelos diferentes que
abarcan las curvas de inactivación más comunes. El modelo que mejor se ajustó a las curvas
de supervivencia de todos los ensayos del presente trabajo fue el Log - linear con cola
(Ecuación 2). Tras la aplicación del modelo Log – linear con cola a cada uno de los ensayos
se obtuvieron los parámetros cinéticos de inactivación k: constante máxima de inactivación,
log (Sres): logaritmo de la supervivencia de los organismos residuales resistentes, y log (S0):
logaritmo de la supervivencia de los organismos viables al principio del proceso.

𝑆 = (𝑆0 − 𝑆res ) · 𝑒 − 𝑘·𝐷 + 𝑆res Ecuación 2

Para una interpretación conjunta de los resultados obtenidos experimentalmente se calcularon

los parámetros t1 y t2, el tiempo necesario para reducir uno y dos órdenes de magnitud,
respectivamente la fluorescencia inicial de organismos viables. Para ello se empleó la
herramienta “buscar objetivo” del análisis de hipótesis en MS Excel. De este modo, la eficacia
del tratamiento térmico puede ser evaluada de manera conjunta para todos los tiempos de
exposición y temperaturas empleadas en base a criterios homogéneos.

3.5. Análisis estadístico

Para evaluar la existencia de diferencias en la eficacia del tratamiento a diferentes

temperaturas, se realizó un ANCOVA mediante el software Statgraphics Centurion XVI
(v16.1.03). Se configuró Log (S) como variable dependiente, el tiempo de exposición como
covariable y la temperatura de tratamiento como factor; el nivel de confianza fue de 95% y el
método de discriminación fue el procedimiento de diferencia mínima significativa (least
significant difference, LSD). Con este análisis se discriminó si existía diferencias
significativas en la inactivación causada por las diferentes temperaturas.

26
4. Resultados y discusión

En este apartado se muestran y se discuten de manera conjunta todos los resultados obtenidos
en la totalidad de ensayos que conforman este presente trabajo, abordando algunos temas
transversales como el efecto del tratamiento o la aplicabilidad real en un buque, entre otros.

4.1. Análisis y modelización de las curvas de crecimiento

4.1.1. Apariencia y características de las curvas de crecimiento

Las curvas de crecimiento representan los valores de fluorescencia (u.a.) frente al tiempo de
incubación (d) (Figura 13); el término de fluorescencia se utiliza como aproximación de la
concentración celular a lo largo de la incubación pos-tratamiento.

Al representar la fluorescencia frente al tiempo en escala logarítmica, se puede determinar

visualmente si el crecimiento es exponencial ya que, en ese caso, los datos siguen una línea
recta creciente.

Se puede observar que, en general, la fase de crecimiento exponencial comienza tras un día
de incubación. A pesar de que el cultivo del pre-tratamiento se encontraba en crecimiento
exponencial, el cambio de condiciones de una cámara de cultivos a otra diferente, el transporte
y el tiempo que estuvieron fuera de la cámara pudo ser la causa de que los controles tardaran
un día en alcanzar de nuevo el crecimiento exponencial, debido a la necesidad de
aclimatación. Por tanto, el crecimiento exponencial, o continuo, se identifica a partir del
segundo día de incubación, donde se aprecia un aumento del valor de la fluorescencia cada
vez más rápido con respecto al tiempo. Tras varios días de incubación, el crecimiento presenta
una tendencia asintótica a un valor máximo semejante, en torno a una florescencia de 3.667,77
u.a., correspondiendo a una concentración aproximada de 1, 93 · 106 células mL-1.

En cuanto a las muestras tratadas, estas registraron diferentes tendencias en su evolución

dependiendo de la temperatura a la que se le sometió y el tiempo de exposición, presentando
un comportamiento inicial variable con incremento, descenso o invariabilidad en la
fluorescencia. Tras este periodo inicial, la fluorescencia comenzó a incrementar de forma
exponencial a una velocidad similar en todas las muestras. Finalmente, como en el caso de
los controles, pasado un tiempo el crecimiento presenta una tendencia asintótica a un valor

27
máximo semejante en todas las muestras tratadas. En este sentido, la mayor diferencia entre
los controles y las muestras tratadas se observa en el tiempo que tarda en observarse la fase
de crecimiento exponencial. En el ensayo a 35 ºC (Figura 13-A) los valores de fluorescencia
de los diferentes tiempos de exposición son semejantes a los del control. En el ensayo a 40 ºC
(Figura 13-B) los valores de fluorescencia del control y del tiempo de exposición más corto
se vuelven a parecer, difiriendo del resto. Los valores de fluorescencia de las muestras que
estuvieron expuestas durante 0,5 horas y 2 horas presentan diferencias poco apreciables,
siendo la muestra que estuvo expuesta durante 1 hora la que presenta fluorescencias más bajas.
El motivo por el que la muestra que estuvo más tiempo influenciada en el tratamiento no es
la que produce un descenso mayor de la fluorescencia es debido a la aleatoriedad de los
resultados. En el ensayo a 45 ºC (Figura 13-C) hay comportamientos muy semejantes entre
las dos muestras sometidas a 0,18 horas, es decir, 10 minutos y 0,5 horas respectivamente, y
entre las dos muestras sometidas a 1 hora y 2 horas respectivamente, donde estas últimas son
las que dan lugar a una disminución mayor de los valores de la fluorescencia. Por último, en
el ensayo a 50 ºC (Figura 13-D) las muestras sometidas a diferentes tiempos de exposición
tienen valores de fluorescencia similares, siendo la que estuvo sumergida durante más tiempo
la que experimenta un descenso de la fluorescencia mayor con el paso del tiempo de
incubación.

En los ensayos que se llevaron a cabo en una segunda fase, utilizando tiempos de exposición
mayores, también se obtuvieron las curvas de crecimiento correspondientes (Figura 14). En
el ensayo a 35 ºC (Figura 14-A) hay comportamientos muy semejantes entre el control y la
muestra que estuvo sometida a un tiempo de exposición más corto. A diferencia con el primer
ensayo, las otras dos muestras sometidas a 24 y 48 horas de exposición, aunque sus valores
son semejantes, ambas dan lugar a una disminución de los valores de la fluorescencia. En el
ensayo de 40 ºC (Figura 14-B) de nuevo el control y la muestra que estuvo sometida a un
menor tiempo de exposición tienen valores de fluorescencia muy parecidos. Es la muestra que
estuvo durante más tiempo sometida al tratamiento térmico la que da lugar a una mayor
disminución de la fluorescencia. De esta manera se tiene diferentes valores de fluorescencia
dependientes de la temperatura y del tiempo de exposición a la que se haya sometido la
muestra.

28
 4.1.2. Determinación cuantitativa de la supervivencia al tratamiento

La evolución de la fluorescencia tras el tratamiento, con una fase de crecimiento exponencial

seguida de una fase asintótica, puede asemejarse a una curva de crecimiento logístico de
Verhulst (Ecuación 1). La ecuación de esta curva tiene tres parámetros: la fluorescencia debida
a los organismos viables al inicio de la incubación (Fv0), la tasa de crecimiento (r) y el valor
asintótico de fluorescencia al final de la incubación (Fmax). Tanto la r como la Fmax es similar
entre los controles y las muestras tratadas, mientras que la mayor diferencia se da en el tiempo
transcurrido entre el inicio de la incubación y la aparición de la fase exponencial, el cual está
determinado por Fv0. Por tanto, la eficacia del tratamiento se evaluó en función de los valores
de Fv0. Esta modelización ha sido descrita y empleada en varios estudios previos para
determinar la eficacia a tratamientos de inactivación (Romero-Martínez et al., 2020, 2016).

Con el objetivo de ajustar las curvas de crecimiento mediante el modelo logístico de Verhulst
se procedió a descartar los puntos previos a la fase exponencial. En la aplicación del modelo
se utilizó una r promedio para todas las muestras de un mismo experimento. Tras la aplicación
del modelo, en su representación gráfica (Figura 13) junto a los valores de crecimiento, se
obtiene una línea diferente para cada muestra, que indica la tendencia que siguen los valores
de crecimiento. El ajuste de las curvas de crecimiento al modelo logístico de Verhulst también
se llevó a cabo en los experimentos adicionales de 24 y 48 horas de exposición (Figura 14).

29
Figura 13. Modelización de las curvas de crecimiento de las cuatro muestras de T. suecica
que estuvieron sometidas al tratamiento térmico durante un máximo de 2 horas.

Figura 14. Modelización de las curvas de crecimiento de las dos muestras de T. suecica que
estuvieron sometidas al tratamiento térmico durante un máximo de 48 horas.

30
A partir de la modelización de los datos experimentales se obtuvieron los parámetros
correspondientes a cada muestra expuesta tanto durante 2 horas como 48 horas (Tabla 2).

En términos generales, la Fv0 a tiempo de exposición 0 horas muestra valores semejantes en

los diferentes experimentos, con un promedio de 171,34 u.a., que corresponde con
aproximadamente 8,97 · 104 células mL-1. A medida que aumenta el tiempo exposición, los
valores de Fv0 disminuyen en todos los casos, en mayor o menor medida. En el caso de la
Fmax, los valores son parecidos a diferentes temperaturas y en cada uno de los tiempos de
exposición. La r no sufre grandes cambios al cambiar la temperatura del experimento,
teniendo un promedio de 0,94 d-1. Los valores de R2 representan la correlación entre los
valores estimados por el modelo logístico respecto a los valores experimentales. Se observa
que la R2 es mayor en los casos de las muestras tratadas a mayor temperatura y mayores
tiempos de exposición; esto se debe a que las curvas que comienzan a concentraciones altas
no se ajustan bien al modelo logístico. En cambio, en las muestras con mayor inactivación
hay una sección exponencial más larga antes de asintotizarse, esto hace que los datos se
ajusten mejor al modelo, y por tanto, tengan una R2 más alta.

31
Tabla 2. Parámetros del modelo logístico de Verhulst aplicado para los cuatro ensayos que
estuvieron sometidos al tratamiento durante un máximo de 2 horas.

Temperatura (ºC) Tiempo de exposición (h) Fv0 (u.a.) Fmax (u.a.) r (d-1) R2

0 126,89 3743 1,15 0,696

35
0,13 112,86 4057 1,15 0,766
0,5 107,56 3806 1,15 0,796
1 99,42 3545 1,15 0,748
2 82,28 3065 1,15 0,756
0 110,00 3413 0,96 0,788
40
0,13 65,00 2717 0,96 0,895
0,5 0,31 2645 0,96 0,993
1 0,08 2755 0,96 0,999
2 0,25 2673 0,96 0,949
0 185,45 4677 0,80 0,919
45
0,18 1,18 3592 0,80 0,949
0,5 1,27 3460 0,80 0,955
1 0,38 3458 0,80 0,984
2 0,32 3387 0,80 0,998
0 120,00 2208 0,85 0,681
50
0,16 0,80 2379 0,85 0,996
0,5 0,72 2102 0,85 0,996
1 0,57 2211 0,85 0,994
2 0,35 2102 0,85 0,982
0 173,29 2376 0,90 0,773
35
0,12 102,09 2104 0,90 0,723
24 14,49 2352 0,90 0,843
48 10,87 2418 0,90 0,823
0 312,41 3192 0,61 0,945
40
0,8 253,97 3095 0,61 0,978
24 0,45 4273 0,61 0,976
48 0,15 3520 0,61 0,995

Los valores de la Fv0 para el ensayo a temperatura de 35 ºC durante dos horas disminuyen
hasta alcanzar el valor de 82,28 u.a., lo que supone una concentración de organismos viables
de 4,28 · 104 células mL-1. En las muestras sometidas a mayores temperaturas durante dos
horas, la Fv0 disminuyó hasta 0,25, 0,32 y 0,35 u.a., correspondiendo a concentraciones de
organismos viables demasiado bajas para ser calculadas mediante la recta de regresión (Figura
12). Al incrementar los tiempos de exposición a 48 horas para el tratamiento a 35 ºC, la Fv0
disminuyó hasta 10,87 u.a., correspondiendo a una concentración aproximada de 5,22 · 103
células mL-1. En cambio, para el tratamiento a 40 ºC durante 48 horas no se observó una
disminución destacable en el valor de Fv0 respecto a una exposición de 2 horas.

32
Una vez obtenidos los parámetros, se pudo determinar la supervivencia (S) como el cociente
entre Fv0 de cada muestra y el Fv0 del control de la serie experimental, indicando la proporción
de organismos que conservan su viabilidad tras el tratamiento térmico.

4.2. Análisis de las cinéticas de inactivación

4.2.1. Descripción y apariencia de las curvas de inactivación

Las curvas de inactivación representan el log (S) frente al tiempo de exposición (horas). Para
una mejor comprensión de los resultados se agruparon las curvas de inactivación de los
ensayos de 2 horas en un gráfico (Figura 15-A) y los ensayos adicionales de 48 horas en otro
gráfico (Figura 15-B).

A 35 ᵒC 40 ᵒC 45 ᵒC 50 ᵒC B 35 ᵒC 40 ᵒC
0,5 0,5
0 0
-0,5 -0,5
-1 -1
Log (S)

Log (S)

-1,5 -1,5
-2 -2
-2,5 -2,5
-3 -3
-3,5 -3,5
0 0,5 1 1,5 2 0 8 16 24 32 40 48
Tiempo de exposición (h) Tiempo de exposición (h)

Figura 15. Modelización de las curvas de inactivación para los ensayos cuyo máximo de
tiempo de exposición fue de 2 horas (A). Modelización de las curvas de inactivación para los
ensayos cuyo máximo de tiempo de exposición fue de 48 horas (B).

En el ensayo a 35 ºC durante 2 horas los valores del log (S) se mantienen prácticamente
constantes sin producir una inactivación apreciable. Para el resto de las temperaturas, se
observa una inactivación superior a dos órdenes de magnitud a partir de 0,5 horas de
exposición, que no aumenta al incrementar el tiempo de exposición. En algunos casos la
inactivación es menor al aumentar la temperatura y el tiempo de exposición; esto puede
deberse a variaciones estocásticas al contener las muestras un número bajo de organismos
variables.

33
En la representación gráfica de los ensayos adicionales (Figura 15-B) se han representado
conjuntamente los resultados logrados en los ensayos iniciales y de los adicionales, con el
objetivo de obtener una representación gráfica con el mayor número posible de resultados.

A diferencia con el ensayo de 35 ºC de 2 horas, en este posterior experimento se alcanza una

inactivación de aproximadamente un orden de magnitud. En cuanto al ensayo de 40 ºC no se
produce un aumento de los órdenes de magnitud de inactivación.

4.2.2. Análisis estadístico de las curvas de inactivación

El ANCOVA indicó la existencia de efecto significativo por parte del tiempo de exposición
(p=0.011) y de la temperatura de tratamiento (p= 0.013) en los valores de Log (S) (Tabla 3).

El análisis diferenció dos grupos homogéneos en función de la temperatura (Tabla 4): un

grupo (a) con el tratamiento a 35 ºC y otro grupo (b) con las restantes temperaturas. Estos
resultados indican que no hay diferencias significativas entre los tratamientos a 40, 45 y 50
ºC.

Tabla 3. Resultados del ANCOVA para Log (S) como variable dependiente, tiempo de
exposición como variable y temperatura como factor.

Análisis de Varianza para Log (S) – Suma de cuadrados tipo III

Fuente Suma de Cuadrados G1 Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

COVARIABLES
1 6,55428 8,44 0,0109
EFECTOS PRINCIPALES
A:Temperatura 11,6761 3 3,89202 5,01 0,0132
Residuos 11,6422 15 0,77615
Total (corregido) 29,9328 19

34
Tabla 4. Grupos homogéneos relativos al efecto de las diferentes temperaturas sobre Log (S),
según el ANCOVA.

Método: 95.0 % LSD

Temperatura Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

35 5 -0,08627 0,393993 a
40 5 -1,71398 0,393993 b
45 5 -1,95482 0,393995 b
50 5 -1,85052 0,393992 b

4.2.3. Determinación de los parámetros cinéticos de inactivación

Mediante la herramienta de GInaFit para MS Excel (Geeraerd et al., 2005) se ajustaron dichas
curvas al modelo Log – linear con cola (Ecuación 2) que proporcionó un gráfico por cada
curva de supervivencia. Este modelo se representó junto a los valores de inactivación en forma
de línea, que muestra la tendencia que siguen los valores de inactivación (Figura 15).

Gracias a la aplicación del modelo Log – linear con cola a los valores de inactivación se puede
apreciar una bajada más pronunciada en los ensayos cuya temperatura era mayor, es decir,
alcanzan en menor tiempo de exposición el valor de inactivación al que tienden al entrar en
cola. Como novedad se observa que en el ensayo de 40 ºC, al prolongar el tiempo de
exposición a 24 y 48 horas, no se produce un aumento de los órdenes de magnitud de la
inactivación debido a que ya en la Figura 15-A se observa cómo alcanza los tres órdenes de
magnitud de la inactivación tras 1 hora de exposición y entra en cola, es decir, se estabiliza.

Con la aplicación del modelo Log – linear con cola en cada uno de los ensayos se obtuvieron
los parámetros cinéticos de inactivación k: constante máxima de inactivación, log (Sres):
logaritmo de la supervivencia de los organismos residuales resistentes, y log (S0): logaritmo
de la supervivencia de los organismos viables al principio del proceso (Tabla 4).

35
Tabla 4. Parámetros del modelo Log – linear con cola aplicado a la totalidad de ensayos
llevados a cabo.

Temperatura (ºC) Log (Sres) Log (S0) k (h-1) t1 (h) t2 (h) R2

35 -1,20 ± 0,02 -0,04 ± 0,01 0,16 ± 0,01 19,67 - 0,999

40 -2,99 ± 0,15 0,27 ± 0,21 13,11 ± 2,28 0,22 0,41 0,971

45 -2,53 ± 0,19 0,00 ± 0,32 31,46 ± 8,86 0,07 0,16 0,959

50 -2,36 ± 0,09 0,00 ± 0,16 37,91 ± 7,55 0,06 0,14 0,988

Entre los parámetros de cinéticos de inactivación obtenidos es interesante comentar tanto el

log (Sres) como la k. En el caso del log (Sres) se observa que al aumentar la temperatura no
aumenta la concentración residual, produciéndose el mayor valor a 40 ºC. En cuanto a la k,
para los experimentos de 45 y 50 ºC el valor real puede ser mayor que la obtenida debido a
que los datos a tiempos más bajos ya estaban en la cola.

Para una mejor interpretación conjunta de los resultados obtenidos experimentalmente se

calcularon los parámetros t1 y t2, el tiempo necesario para reducir uno y dos órdenes de
magnitud, respectivamente la fluorescencia inicial de organismos viables. De este modo, la
eficacia del tratamiento térmico puede ser evaluada de manera conjunta para todos los tiempos
de exposición y temperaturas empleadas en base a criterios homogéneos (Figura 16).

36
Figura 16. Parámetros cinéticos de inactivación t1 y t2 (horas) frente a cada una de las
temperaturas (ºC) de los experimentos.

Se puede observar una mayor resistencia por parte del cultivo frente a tratamientos térmicos
de menor temperatura, requiriendo tiempos mucho mayores para conseguir un determinado
grado de inactivación. En el caso del experimento de 35 ºC no se puede calcular el parámetro
cinético de inactivación t2 debido a que se alcanza el primer orden de magnitud de inactivación
casi a las 20 horas, tiempo mucho mayor en comparación con el resto de los ensayos, donde
se alcanzan los dos y casi los tres órdenes de magnitud en menos de una hora.

El parámetro cinético de inactivación t2 presenta un considerable interés debido a que

permitiría cumplir con el BWMC, ya que la concentración mínima en las pruebas en tierra es
de 1000 células mL-1, y la concentración máxima de descarga es de 10 células mL-1,
asumiendo que la eficacia al tratamiento no depende de las concentraciones iniciales.

37
 4.3. Valoración del organismo T. suecica como indicador para la eficacia del
tratamiento

El código BWMS en su anexo 5 (2.33.3), indica que los experimentos de desinfección

desarrollados para aprobar un BWMS han de llevarse a cabo con concentraciones mínimas de
1000 células mL-1 para los organismos de entre 10 y 50 µm (IMO, 2018). Ambos requisitos
son cumplidos en los ensayos realizados, ya que el valor del promedio de la fluorescencia de
los controles el mismo día de la aplicación del tratamiento fue de 380 u.a., es decir, en
términos de concentración celular se habla de más de 200 000 células mL-1, y en cuanto al
tamaño de los organismos, T. suecica suele rondar entre 10 y 40 µm, por lo que también se
cumpliría este requerimiento.

Durante el tiempo que duró la parte experimental del presente trabajo se pudo apreciar la
adaptabilidad del cultivo a las condiciones establecidas y la alta tasa de reproducción, ya que
los primeros ensayos se hacían uno por semana, marcados por el crecimiento del cultivo, y
durante la etapa final de los experimentos, estos se podían hacer dos semanalmente.

4.4. Valoración del tratamiento térmico para la gestión de aguas de lastre

En los experimentos llevados a cabo en el presente trabajo de fin de grado se ha comprobado

que el tratamiento térmico a 40 ºC es eficaz. Pero para su aplicación en la realidad se deben
contemplar otros factores que determinen su viabilidad como BWTS.

La aplicación del tratamiento térmico para la desinfección de aguas de lastre requiere de

intercambiadores de calor. Un intercambiador de calor es un dispositivo diseñado para
transferir temperatura entre dos fluidos, uno frío y otro caliente.

El proceso de calentamiento del agua se puede llevar a cabo durante el lastrado en el puerto
de descarga, durante el trayecto en el tanque de lastre o durante el el proceso de deslastrado
en el puerto de carga.

En general, la viabilidad de la instalación de los equipos del sistema de tratamiento de aguas

de lastre dependerá de los requerimientos técnicos y estructurales del buque en cuestión, es
decir, de su tamaño, la capacidad de los tanques de lastre, el diseño del sistema de
refrigeración del motor, la disponibilidad de vapor y la capacidad de adaptación a la cual
pueda ser sometido el buque.

38
Las principales opciones que se manejan para calentar el agua de lastre son la utilización del
calor residual producido por los motores del buque, el uso de calor creado por los sistemas de
una caldera auxiliar instalada a bordo o la utilización del calor procedente de los gases de
escape.

En el presente trabajo se apuesta por la utilización del calor de los gases de escape, debido a
que supondría una recuperación del calor emitido por los motores, reduciendo además las
emisiones de gases calientes a la atmósfera. Este sistema de recuperación del calor residual
ha sido descrito y empleado en varios estudios previos para buques marítimos de mediano
tamaño (Butrymowicz et al., 2021).

El sistema de recuperación del calor residual (Figura 17) comienza cuando se genera vapor
en el intercambiador de gases de combustión (1), este vapor pasa a través del separador de
fase líquida (2) y fluye hasta la estación de reducción (3), donde la presión se reduce hasta el
nivel deseado, correspondiente a la temperatura requerida en el intercambiador de calor. El
vapor del intercambiador de calor se condensa (4) y libera calor. El líquido condensado fluye
hacia un tanque receptor del líquido (5) y la bomba de circulación (6) se utiliza para transferir
de nuevo el agua líquida al conducto de gases de escape. El ciclo está equipado con un sistema
de seguridad de dos etapas que previene el aumento incontrolado de la presión. La primera
etapa es la válvula de purga (7) a través de la cual el refrigerante fluye hacia el colector de
condensado y la segunda etapa es la válvula de seguridad auxiliar (8), que no se muestra en
el esquema.

39
Figura 17. Esquema del prototipo de sistema de recuperación de calor (Butrymowicz et al.,
2021).

En los ensayos que se han llevado a cabo con este prototipo de sistema de recuperación de
calor, el sistema se ha configurado y acoplado según la distribución y el espacio disponible
del buque, procurando establecerlo en la zona más cercana en la que se encuentre los tubos
de escape de los motores de la embarcación en cuestión (Figura 18).

40
Figura 18. Fotografía del sistema de recuperación del calor residual probado en el astillero,
antes del montaje en el buque (Butrymowicz et al., 2021).

4.5. Futuros estudios y perspectivas

El tratamiento de aguas de lastre y su correspondiente cumplimiento del BWMC suponen en

la actualidad un gran desafío para el sector naval. Dado que la mayoría de las investigaciones
sobre desinfección de aguas de lastre están enfocadas a otro tipo de diferentes tecnologías, el
presente trabajo de fin de grado aporta información relevante sobre la eficacia del tratamiento
térmico en la inactivación de organismos fitoplanctónicos, también presentes en las aguas de
lastre y responsables de problemas ecológicos, y socioeconómicos.

Considerando los resultados obtenidos tras la aplicación del tratamiento térmico se han
observado posibles mejoras en las que se podrían centrar futuras investigaciones. Una posible
continuación del estudio del presente trabajo sería la aplicación del tratamiento térmico a
muestras de aguas donde hubiera una gran variedad de microorganismos presentes. Otra
posible continuación podría ser la aplicación del tratamiento a muestras de sedimentos, debido
a que son numerosas las especies incrustadas en los sedimentos que terminan acumulándose
en el fondo de los tanques de aguas de lastre. Y finalmente, la búsqueda de nuevos STO es
otra de las posibles futuras líneas de investigación a tener en cuenta.

41
5. Conclusiones

Para la evaluación del efecto del tratamiento térmico se usó un baño termostático orientado al
estudio en laboratorio, pero entre las principales opciones se apuesta por la utilización de un
sistema de recuperación del calor residual de los gases de escape en la aplicación del trata-
miento a una escala real.

Entre el rango de temperatura utilizada (35, 40, 45 y 50 ºC), la temperatura de 40 ºC es la

temperatura más baja eficaz en cuanto a inactivación.

El tiempo de exposición al tratamiento térmico durante el estudio en el laboratorio se ha ex-

tendido hasta alcanzar las 48 horas, en la aplicación del tratamiento a escala real el tiempo de
exposición estará marcado por el tiempo de tránsito del buque en cuestión. Siendo por ejemplo
la duración del trayecto de un buque portacontenedores de 35 a 50 días.

Durante la aplicación del tratamiento térmico a escala real se debe de tener en cuenta la tem-
peratura del deslastrado con el fin de no ocasionar un estrés térmico al medio receptor.

La modelización del crecimiento y de las curvas de inactivación son técnicas adecuadas para
la medición de la eficacia del tratamiento térmico.

La microalga T. suecica podría ser un interesante organismo de prueba normalizado (standard

test organism, STO) para la categoría de organismos entre 10 y 50 µm de la regla D-2 del
BWMC por su facilidad durante el cultivo y el manejo, además de su resistencia al tratamiento
térmico.

42
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