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Métodos para determinar la actividad enzimática en suelos contaminados

Article in South Sustainability · March 2024

DOI: 10.21142/SS-0501-2024-e092

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5 authors, including:

Armando Vélez Azañero Maricielo Alejandra Vera Riega

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Sayda Valdez Chavez Danely Karem Martinez Caja

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 ARTÍCULO DE REVISIÓN

Métodos para determinar Methods to determine

enzymatic activity in
la actividad enzimática en contaminated soils
suelos contaminados

Armando Vélez1 * , Maricielo Vera2 , Sayda Valdez2 , 1 Facultad de Ciencias Naturales y Matemática,
Escuela de Biología, Universidad Nacional Federico
Danely Martínez2 y Fiorela Cutipa2 Villarreal. Lima, Perú.
2 Carrera de Ingeniería Ambiental, Universidad
Científica del Sur. Lima, Perú.

RESUMEN
El suelo es impactado por diversas actividades antropogénicas, como la minería, la agricultura
y la ganadería, lo que afecta negativamente a la biodiversidad y la seguridad alimentaria debido a
la contaminación. La actividad enzimática representa uno de los indicadores más importantes del
Citar como: Vélez et al. (2024).
estado del suelo. Además, permite realizar procesos de biorremediación y restauración, sin generar
«Métodos para determinar la actividad
enzimática en suelos contaminados». residuos. Por ello, el objetivo de esta investigación fue analizar la información bibliográfica disponible
South Sustainability, 5(1), e092. sobre los principales métodos para determinar la actividad enzimática en suelos contaminados, en
DOI: 10.21142/SS-0501-2024-e092 los portales de SciELO, Redalyc, Google Académico y Dialnet. En este trabajo fueron seleccionadas
cuatro enzimas fundamentales. La ureasa, una de las enzimas involucradas en el ciclo de nitrógeno,
además de participar en la hidrólisis de carbono, se determina por método descrito por Tabatabai y
Artículo recibido: 22/11/2023
Arbitrado por pares Bremmer. Las β-glucosidasas actúan en la hidrólisis de carbohidratos y son consideradas indicadores
Artículo aceptado: 20/2/2024 del metabolismo; el método aplicado es la colorimetría. Las fosfatasas se encargan de la hidrólisis
de ésteres para la disponibilidad de microorganismos y se determinan mediante el método
espectrofotométrico. Por último, las catalasas sirven como indicador de la actividad microbiana
aeróbica, y se determinan mediante el método de Johnson y Temple. Estos métodos son ampliamente
utilizados y aportan valiosa información sobre la actividad enzimática en el suelo. Presentan también
algunas limitaciones, principalmente por influencia de los factores ambientales. Esto sugiere la
© Los autores, 2024. Publicado por la necesidad de realizar un mayor desarrollo investigativo para superar las limitaciones actuales y lograr
Universidad Científica del Sur una mayor precisión en la medición de la actividad enzimática en suelos contaminados.
(Lima, Perú)
Palabras clave: enzimas remediadoras, suelos, biorremediación, contaminante de suelos
*E-mail de correspondencia: ABSTRACT
avelez@unfv.edu.pe
Soil is impacted by a range of anthropogenic activities, such as mining, agriculture and livestock,
with the resulting contamination negatively affecting biodiversity and food security. Enzymatic
activity constitutes one of the most important indicators of the state of soil, and it also enables the
conducting of bioremediation and restoration processes, without generating waste. In this context,
the aim of this research was to analyze the bibliographic information available on the main methods
for determining enzymatic activity in contaminated soils, on the Scielo, Redalyc, Google Scholar and
Dialnet portals. For this work, we selected four fundamental enzymes. Urease, one of the enzymes
involved in the nitrogen cycle, in addition to participating in carbon hydrolysis, is determined by the
method described by Tabatabai and Bremner. β-glucosidases act in the hydrolysis of carbohydrates
and are considered indicators of metabolism; the method applied is colorimetry. Phosphatases are
responsible for the hydrolysis of esters for the availability of microorganisms and are determined
using the spectrophotometric method. Finally, catalases serve as an indicator of aerobic microbial
activity, and they are determined using the Johnson and Temple method. These methods, which
are widely used and provide valuable information on enzymatic activity in soil, also have certain
limitations, due mainly to the influence of environmental factors. This suggests the need for further
research, in order to surmount current limitations and achieve greater precision in the measurement
of enzymatic activity in contaminated soils.
Keywords: Remediation enzymes, soils, bioremediation, soil pollutant

Vol. 5 / N.o 1 1
 Vélez et al.

Introducción como sustento alimentario, ya que solo el 6 % tiene

potencial para el desarrollo agrícola y el 13,94 % para
El suelo es una estructura dinámica, constituida
pastos naturales (Berg, 2015), lo cual ocasiona salinización,
por componentes orgánicos, minerales, aire y agua.
desertificación y erosión en la costa; y una elevada erosión
Está conformado por capas distintas a la roca original,
hídrica, sobrepastoreo, pérdida de fertilidad y la quema de
como resultado de cambios en la cantidad y tipo de
pajonales en la sierra y selva (Vergara, 2015).
materiales que se han perdido, añadido, transferido o
transformado (Hartemink, 2020). Es fundamental para El objetivo de esta investigación fue analizar la
el funcionamiento global de la biosfera, y pieza clave información disponible sobre los principales métodos
para el desarrollo de los ciclos biogeoquímicos (Ortiz, para determinar la actividad enzimática en suelos
2015), como proveedor de servicios ecosistémicos para contaminados, por su valor en las áreas de restauración,
el equilibrio terrestre, el soporte y el suministro de remediación y educación ambiental. Para ello, se realizó
alimentos (Torres y Rojas, 2018). Asimismo, sirve como una búsqueda de información en las fuentes bibliográficas
escenario bioquímico donde las enzimas ejercen funciones confiables como SciELO, Redalyc, Google Académico
cruciales en los procesos de descomposición de la materia y Dialnet, empleando las palabras claves «enzimas»,
orgánica (Ynfa, 2017), ya que generan hasta el 95 % de la «suelos contaminados», «biorremediación», en un
superficie terrestre (Torres y Rojas, 2018). El conocimiento intervalo específico de años, 2014-2023. Se obtuvo un total
sobre la actividad enzimática es de vital importancia en la de 1640 resultados, de los cuales se utilizaron 93 artículos.
evaluación y conservación de suelos (Aguilar, 2017). Asimismo, se hizo uso de fuentes bibliográficas externas.
La actividad enzimática corresponde a un conjunto Marco teórico
de reacciones catalizadas por enzimas, en un tiempo
determinado, y en función del pH, la temperatura, la 1. Contaminación de suelos
fuerza iónica y la presencia de inhibidores (Vasquez, El suelo es un ente vivo, que ha mejorado la calidad
2017). En el suelo, las enzimas aceleran los procesos de de vida de las personas a lo largo de los años (Lal, 2019).
descomposición de los sustratos y liberan nutrientes para Además, es una estructura vital para las plantas, al
mantener el funcionamiento del ecosistema (Dominguez, proporcionar soporte, y una fuente de nutrientes para su
2018). Asimismo, sirven como indicadores de la desarrollo y producción (Mori y Candell, 2017). Aunque
calidad del suelo y el grado de contaminación (Millán, posee una gran capacidad de resiliencia, es un sumidero
2015), catalizan reacciones esenciales en la vida de los sensible y vulnerable a la contaminación (Díaz, 2016). Las
microorganismos (Constanza et al., 2015), y contribuyen principales fuentes antropogénicas de contaminación del
al ciclo biogeoquímico de los nutrientes (Ynfa, 2017). suelo son los subproductos de las actividades industriales,
Existen diversos métodos para su análisis, entre los que ganaderas, los desechos domésticos, municipales, los
destacan las oxidorreductasas e hidrolasas en el manejo pesticidas y principalmente los derivados del petróleo
agronómico (Cruz, 2020). (Franco, 2017), liberados accidental o intencionalmente
Actualmente, uno de los principales problemas es al ambiente (Cortés y Montellano, 2018). Siendo el suelo
el efecto de los xenobióticos en el suelo, generado por un recurso natural no renovable, es importante mantener
subproductos químicos de actividades agropecuarias, un monitoreo constante, que nos permita alcanzar la
industriales, municipales, residuales (Hashmi, 2017; sostenibilidad a lo largo del tiempo.
Jiménez, 2017) y fertilizantes. Para 2050 estos productos
aumentarían su producción y demanda en más del 2. Tipos de contaminación
50 % (Rodríguez et al., 2018), lo que incrementaría la 2.1. Contaminación puntual
concentración de metales pesados (Naccarato et al.,
Este tipo de contaminación ocurre debido a un evento
2020), con impactos significativos sobre la red trófica y
puntual o una serie de eventos en una zona determinada,
la salud humana (Méndez, 2015). Estos metales pueden
donde es fácil identificar tanto los contaminantes
acumularse (Toledo et al., 2020) y persistir por periodos
liberados como las fuentes de contaminación (Cordero,
mayores a los mil años (Muyulema et al., 2019; Rosique,
2020), y proyectar de forma directa el perímetro
2016) por actividades como la minería (Menéndez y Muñoz,
afectado. Este tipo de contaminación suele encontrarse
2021), e incrementar el riesgo sobre la biodiversidad
principalmente en zonas urbanas (Rodríguez et al., 2019)
(Cabrera, 2018).
asociadas a espacios industrializados (Berrow y Reaves,
En 2018, se estimaron 22 248 100 hectáreas degradadas 2016), que representan un alto riesgo para los factores
en el territorio peruano, cifra que continúa en ascenso ambientales (agua y suelo principalmente). Sin embargo,
(Minam, 2020) por el incorrecto manejo y planificación estos problemas pueden solucionarse a mediano y largo
de los suelos (Ramsey, 2016). En comparación con otros plazo mediante programas de remediación y restauración
países de Sudamérica, el Perú presenta 25 525 000 ha ambiental de baja complejidad.
de suelo productivo (Diaz, 2016). La relación es más baja

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 Métodos para determinar la actividad enzimática en suelos contaminados

2.2. Contaminación difusa pueden ser disgregadas por acción de la erosión hídrica
Este tipo de contaminación se extiende con facilidad y eólica, y pueden alcanzar suelos agrícolas, lo que
en el suelo debido a la solubilidad de los contaminantes contribuye a la pérdida de especies vegetales y afecta
(Rodríguez et al., 2019), lo que dificulta identificar la salud del suelo (Enciso, 2018). Además, la extracción
la fuente y generar un punto crítico sobre el área de de petróleo y gas representan una gran fuente de
influencia. Implica el transporte de contaminantes a contaminación puntual del suelo, a causa de derrames de
otros factores ambientales, como el aire y el agua, por lo petróleo crudo y salmueras (Bayona, 2019). La presencia
que es importante realizar evaluaciones complejas para generalizada de depósitos de desechos de relaves en
entender el estado del ecosistema (Passatore et al., 2015). departamentos como La Libertad y Pasco agrava la
Se producen principalmente por actividades relacionadas situación, causa perturbaciones ecológicas y contamina
con armas nucleares, residuos sólidos, aguas residuales el entorno terrestre con metales pesados (Menéndez y
que ingresan a las cuencas, entre otros (Cachada et al., Muñoz, 2021; Uriarte et al., 2023; Huaranga et al., 2021),
2018). Este tipo de contaminación se relaciona con la lo cual crea nuevos suelos sujetos a severas limitaciones
degradación de suelos y la alteración de los cuerpos y físicas, químicas y biológicas que dificultan la regeneración
cursos de agua, que responden de manera directa al de la vegetación. En La Oroya, las actividades industriales
número con afecciones puntuales, y generan mayores y mineras han elevado significativamente los niveles de
problemas dispersivos o difusos. contaminación por arsénico, plomo y cadmio (Díaz, 2016),
y representan una amenaza directa para la salud humana
3. Fuentes de contaminantes del suelo y la estabilidad ambiental.
3.1. Fuentes naturales
3.2.2. Actividades agrícolas y ganaderas
Son aquellas que no provienen directamente de
La agricultura y la ganadería son actividades
actividades antropogénicas (Mora-Barrantes et al., 2020).
responsables de obtener productos esenciales para las
Muchos parentales del suelo son de origen natural,
poblaciones, así como una fuente de contaminación del
como los metales pesados y elementos radionúclidos,
suelo por malas prácticas agrícolas (Kanter, 2018). La
que comprenden un riesgo para el ambiente (Ballesta,
incorporación excesiva de fertilizantes, las malas prácticas
2017). Estos componentes varían en función de la región
de riego (Muñoz, 2019) y el uso de plaguicidas elaborados
estudiada (Rodríguez et al., 2019) y según el tipo de
con metales nocivos (Artiola et al., 2019) ocasionan
roca madre (Berrow y Reaves, 2016). El arsénico (As),
salinización, acumulación de metales y eutrofización.
de origen volcánico, es uno de los contaminantes más
El crecimiento de la población ganadera implica el
cuestionados a nivel mundial (Zorrilla, 2017). Muchos
sobrepastoreo, la deforestación, la pérdida de bosques, la
de estos minerales presentan una alta variabilidad
compactación, la erosión y la alteración química y biología
espacial y pueden encontrarse en concentraciones más
del suelo (Saucedo-Uriarte et al., 2023). En el Perú, los
altas en capas más profundas (Li et al., 2014). Este tipo
problemas de contaminación por plaguicidas se han
de contaminación se considera de baja importancia,
convertido en una amenaza que afecta departamentos
ya que las consecuencias en la salud humana no son
como Apurímac (Mendoza y Yupanqui, 2023), así como
significativas; sin embargo, podrían convertirse en la
las principales microcuencas, con metales migratorios,
principal causa de la contaminación del suelo, cuando se
provenientes de la agricultura (Correa et al., 2021). En
afectan principalmente los ciclos biogeoquímicos.
Madre de Dios, estas actividades vienen generando
3.2. Fuentes antropogénicas compactación, pérdida de la biodiversidad y alteraciones
en la composición del suelo (Escobar, 2022).
El Perú enfrenta diversos desafíos en el área de la
conservación de suelos, que repercuten de forma directa 4. Efectos de la contaminación de suelos
en la seguridad alimentaria, la producción de recursos
La contaminación del suelo conlleva una serie de
agrícolas (Bedoya et al., 2023) y la biodiversidad, tomando
efectos adversos que impactan tanto el ambiente como
en cuenta que nuestro país es considerado como uno de los
la salud humana (Rodriguez et al., 2018). Primero, la
puntos críticos para la degradación de suelos a mediano y
degradación de la calidad del suelo resulta en la pérdida
largo plazo (Hassani et al., 2021).
de su fertilidad y capacidad para sustentar la vida vegetal
3.2.1. Minería
y microbiana esencial para los ecosistemas saludables
(Puente y Astete, 2016). Segundo, la contaminación del
Los centros mineros y de fundición liberan elevadas suelo puede provocar la lixiviación de contaminantes
cantidades de metales pesados y otros elementos tóxicos hacia las aguas subterráneas, y así afectar la calidad
al ambiente. Perduran periodos extensos, mucho después del agua potable y amenazar la biodiversidad acuática.
del cierre de estas actividades (Benites, 2016). Los desechos La toxicidad de los contaminantes en el suelo tiene
tóxicos almacenados están formados principalmente por consecuencias directas en la flora y fauna, con el riesgo
partículas finas de concentraciones variables de metales de la pérdida de especies importantes (Longa y Rodriguez,
pesados (Jimenez, 2019). Las partículas contaminadas 2017). Estos xenobióticos pueden acumularse en los

Vol. 5 / N.o 1 3
 Vélez et al.

tejidos de plantas y animales, y generar problemas de ello, los suelos deben ser lo más homogéneos posible,
bioacumulación y biomagnificación, que amenazan la con una porosidad y permeabilidad al aire adecuados,
cadena alimentaria y la salud humana (Rai et al., 2019). teniendo en cuenta las condiciones óptimas de aireación,
Los suelos contaminados pueden afectar la producción pH, humedad, temperatura y los nutrientes del suelo en
agrícola, lo que conlleva a disminuir la calidad y cantidad relación nitrógeno/fósforo (N:P).
de los cultivos (Minaya, 2022). Además, la contaminación
del suelo puede contribuir a la contaminación del aire por 5.1.2. Bioaumentación
liberación de partículas contaminadas o gases volátiles. El método se basa en la adición de microorganismos
vivos que tienen la capacidad de degradar contaminantes,
5. Biorremediación de suelos contaminados para así fomentar la biodegradación o biotransformación
La biorremediación es una rama de la biotecnología (Zuñiga, 2018). Este proceso trata suelos contaminados
que busca soluciones ante problemas de contaminación por insecticidas, herbicidas y desechos con altas
usando el potencial enzimático de las bacterias, plantas u concentraciones de metales (INEI, 2015), donde se
hongos (Hernández et al., 2016) para degradar o destruir identifican las poblaciones de microorganismos y se
compuestos que generan desequilibrio en el ambiente realiza la caracterización del suelo, para luego evaluar
(Rodríguez et al., 2019). Es un método específico que qué microorganismos tienen la capacidad de colonizar y
permite atacar la presencia de xenobióticos en el suelo degradar a los contaminantes del suelo (Gutierrez, 2018).
(Simbaña, 2016). Con el desarrollo de la tecnología, se ha Por ello, se deben producir cultivos de enriquecimiento
hecho posible el mejoramiento genético de organismos y aislarse microorganismos metabólicos, que usen al
(principalmente en algas y plantas) para optimizar el proceso contaminante como fuente energética y ser cultivados
de biorremediación. Sin embargo, el uso de fertilizantes hasta adquirir proporciones grandes de biomasa, para que
convencionales y residuos orgánicos aún se considera el tratamiento sea más eficiente.
la alternativa principal de manejo a escala mundial.
5.1.3. Compostaje
5.1. Métodos de biorremediación Consiste en la descomposición biológica mediante
Son sistemas o procesos que utilizan métodos procesos de respiración aeróbica y anaeróbica, modificando
biológicos para transformar xenobióticos a desechos xenobióticos en sustancias no tóxicas, relacionadas con el
menos tóxicos, en los cuales las enzimas degradan o origen de los residuos, el tamaño de partícula, aireación,
transforman las sustancias peligrosas (Covarrubias et al., humedad y la población biológica activa (Medina et al.,
2015). Las técnicas de biorremediación pueden efectuarse 2018). Se ha comprobado que este proceso trata suelos
in situ realizando excavaciones en el terreno o ex situ en contaminados combinando con elementos orgánicos
biorreactores de instalaciones (Pinzón y Fajardo, 2018). como estiércol y desechos agrícolas para regularizar la
Los métodos más usados para la recuperación de suelos cantidad de nutrientes presentes en el suelo (Zhang et
contaminados los representan la bioestimulación, la al., 2015). Se desarrolla en un ambiente cerrado, donde
bioaumentación y el compostaje, donde las velocidades se obtienen temperaturas superiores a 70 ºC, para
enzimáticas pueden desarrollarse bajo condiciones eliminar patógenos del suelo (Ramos et al., 2018). Por ello,
favorables y controladas (Covarrubias et al., 2015). durante la biorremediación se generan dos resultados: la
Estos métodos no generan residuos y resultan ser más eliminación de contaminantes y la producción de compost
económicos que otros tratamientos fisicoquímicos; sin (Montenegro et al., 2020); así, este proceso es usado
embargo, el funcionamiento del tratamiento dependerá en tratamientos de residuos sólidos antropogénicos y
de la habilidad de los operadores para crear y mantener las metales, aunque la efectividad del producto requiere de
condiciones ambientales necesarias para el crecimiento mucha pericia y experiencia del operador.
microbiano.
6. Actividad enzimática en suelos
5.1.1. Bioestimulación La actividad enzimática brinda información sobre el
El método se basa en la adición de nutrientes en las estado microbiano y las condiciones fisicoquímicas del
principales fuentes de nitrógeno y fósforo (Rivera et al., suelo (Samuel et al., 2018). Además, es un indicador de la
2018) para mejorar la biodegradación de contaminantes calidad del suelo a causa de su sensibilidad a xenobióticos
orgánicos e inmovilizar los contaminantes inorgánicos. como los metales pesados, y su relación directa con los
Se debe garantizar el crecimiento de los microorganismos ciclos de C, N, P y S (Aponte et al., 2020). Se producen por
para intensificar la velocidad de la degradación (Vallejo efecto de los microorganismos que colonizan el suelo, o los
et al., 2016), mediante la adición de oxígeno y nutrientes restos de plantas que persisten en este sistema por tiempos
al suelo contaminado, con el fin de estimular la actividad muchas veces prolongados (Wei et al., 2019; Di Barbaro et
de los microorganismos autóctonos y la degradación al., 2020). Además, brinda información sobre conservación
de los contaminantes (Olaya y Triviño, 2019). El proceso de la biodiversidad y es clave para el funcionamiento
puede desarrollarse de forma aeróbica y anaeróbica; por de los agroecosistemas (Tortora, 2020; García, 2017).

4 DOI: 10.21142/SS-0501-2024-e092
 Métodos para determinar la actividad enzimática en suelos contaminados

Las enzimas determinan el tiempo y los procesos de 7. Métodos para determinar enzimas en el suelo
transformación química en el suelo, y son específicas del
7.1. Preparación de reactivos
sustrato o el contaminante (Millán, 2015). Por ello, es
importante el reconocimiento de las principales enzimas Preparación de tampón borato PH 10
del suelo como ureasas, β-glucosidasas, fosfatasas y las Mezclar 16 ml de solución de ácido bórico (H3BO3) al
catalasas (Lázaro, 2015). Sin embargo, estas enzimas 0,1 M y 14 ml de solución hidróxido de potasio (KOH) al
importantes (tabla 1) pueden verse afectadas por factores 0,1 M (ambas con agua libre de CO2), con el cual se obtiene
ambientales, principalmente metales, que distorsionan una solución de buffer borato de pH 10.
la estructura proteica al alterar su actividad. Asimismo,
existe un número limitado de enzimas tolerantes a los Solución Stock Tham (PH 12)
cambios ambientales como el pH, la conductividad ● Agregar 12,2 g de trihidroximetilaminometano (THAM).
eléctrica, la temperatura y la materia orgánica (Báez et al., ● Llevar a pH 12 con hidróxido de sodio 0,5 M.
2016), como las hidrolasas, esterasas, proteasas y lipasas, ● Enrasar a un litro con agua destilada.
las cuales son termoestables (Bhandari et al., 2021;
Mohammad et al., 2017; Sahay et al., 2017). Solución tampón mub (PH 6,5)
Tabla 1. Principales enzimas utilizadas en la determinación de actividad ● Agregar 200 ml de solución Tham (pH 12).
enzimática en el suelo ● Agregar 11,6 g de ácido maleico.
● Agregar 14 g de ácido cítrico.
Enzimas Características Función ● Agregar 6,28 g de ácido bórico.
Es una enzima que presenta Actúan en enlaces carbono- ● Agregar 488 ml de hidróxido de sodio 1 M, enrasado a 1 L
dos subunidades alfa y nitrógeno, además de de agua destilada.
gamma (Aguirre et al., 2016). catalizar la hidrólisis de la
Además, su actividad óptima urea a dióxido de carbono y
se desarrolla a un pH neutro, amoniaco en el suelo (Ruiz, Solución patrón
y una temperatura de 40 °C 2020). Está involucrada en el
●
Ureasa

(Parada, 2016); muestra ciclo del nitrógeno, e indica

Añadir 0,5 ml de 4-nitrofenol 0,025 M y 2 ml de agua
especificidad a la urea e la disponibilidad potencial destilada en un tubo de ensayo de vidrio.
hidroxiurea; asimismo, es de este, a partir de origen
inhibido por metales pesados microbiano en forma libre,
● Añadir 0,5 ml de cloruro de calcio 0,5 M, 2 ml de hidróxido
como mercurio y cadmio vinculada al humus o a los
de sodio 0,5 M y 5 ml de agua destilada.
(Ruiz, 2020). coloides del suelo (Monserrat ● Centrifugar y medir la absorbancia a 400 nm.
y Campaña, 2020).
Es una enzima compuesta Actúa en la hidrólisis de 7.2. Determinación de la actividad enzimática de la ureasa
por dos subunidades carbohidratos, fundamental
que conforman una para la obtención de energía Se basa en el método descrito por Tabatabai y Bremner
(1972), mediante la técnica de colorimetría a una longitud
β-Glucosidasa

glicoproteína, que se para los microorganismos

desarrolla a un pH óptimo del suelo (García, 2017). de onda a 635 nm, en la cual la enzima ureasa cataliza la
de 7 y una temperatura en el Es un indicador general de
rango entre 30 °C y 40 °C. metabolismo microbiano, reacción de hidrólisis de la urea liberando amonio (Paul,
Estas son susceptibles a asociado a mineralización de 2007). En este proceso de reacción, la urea se rompe
inhibidores como nitrógeno materia orgánica celulósica. formando dióxido y amonio, requiere de la presencia de
y heterociclos (Simas et al.,
2018). agua para su transformación en amoniaco. Este último se
puede determinar fácilmente, ya que es soluble en agua,
Es una enzima compuesta Se encarga de catalizar la
por dos subunidades hidrólisis de ésteres y de
menos tóxico, de fácil cuantificación (Borges et al., 2011); y
catalíticas y reguladoras anhídridos de ácido fosfórico, los costos son muy bajos.
(Degayón, 2018), que mineralizando el fósforo
Fosfatasa

tienen su actividad máxima orgánico (Monserrat y

Procedimiento
en un pH alcalino y una Campaña, 2020) en fósforo
temperatura de 30 °C. inorgánico para la disposición 1. Colectar la muestra de suelo y colocar en una bolsa ziploc
Ambas pueden ser inhibidas de microorganismos y plantas de 1 kg. Someterla a estufa por 72 horas a 60 °C. Tamizar
por metales pesados (Pérez, (Caballero y Mejia, 2015). en malla de 2 mm.
Nasello y Murno, 2016).
2. Pesar 1g de suelo tamizado (2 mm) en una balanza
Es una enzima antioxidante Cataliza la dismutación del
presente en la mayoría de peróxido de hidrógeno en
analítica y humedecer hasta aproximadamente capacidad
los organismos aerobios agua y oxígeno (Díaz et al., de campo (cuatro repeticiones).
(Farinango et al., 2021). 2017) producido por la cadena 3. Colocar el suelo pesado en tubos de plástico con tapa
Está constituida por cuatro de transporte electrónico
(tubos de centrífuga 15 ml), para formar tres muestras y
subunidades iguales que se mitocondrial. También
Catalasa

sostienen por interacciones participa en las reacciones un control.

no covalentes. Su desarrollo de oxidación e hidroxilación, 4. A las muestras añadir 4 ml de tampón borato pH 10, y 0,5
de actividad óptima se y tiene como productos el ml de solución de urea al 0,64 %, pero al control en lugar
encuentra a un pH 8 y una oxígeno y agua. Además, es
temperatura de 37 °C (Reyes, utilizado como indicador de la de urea añadir 0,5 ml de agua destilada.
2019). actividad microbiana aeróbica 5. Incubar los tubos bajo agitación por dos horas en un baño
y relacionado con la fertilidad maría a 37 °C. Cumplido el tiempo, añadir 6 ml de KCl 7,4 %
del suelo (Lázaro, 2015).

Vol. 5 / N.o 1 5
 Vélez et al.

a todos los tubos, para medir la presencia de amoniaco. 2. Pesar 0,5 g de suelo tamizado (2 mm) en una balanza
Después, agitar por treinta minutos. analítica y colocarlo en un tubo de centrífuga de 10 ml.
6. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min. Luego, extraer 9 ml Preparar un total de seis muestras con sus respectivos
del líquido sobrenadante de todos los tubos a otros tubos controles.
de plástico con tapa. 3. Añadir 0,5 mL de la solución de 4-nitrofenol-fosfato-p-
7. Determinar la cantidad de NH4+ mediante el nitrofenil-fosfato hexahidrato 0,025 M como sustrato
espectrofotómetro a 525 nm enzimático a las muestras.
4. Para los controles agregar un volumen similar de agua
7.3. Determinación de la actividad enzimática destilada.
β-glucosidasa 5. A todos los tubos agregar 2 mL de tampón MUB (pH
Toma como referencia al estudio de Eivazi y Tabatabai 6,5). Luego, agitar el tubo unos segundos para mezclar el
(1988), al usar el método de colorimétrico para determinar contenido y tapar.
el p-nitrofenol a una longitud de onda a 398 nm. Es 6. Incubar a una temperatura de 37 °C en baño de agua
uno de los métodos más usados por su selectividad y durante una hora.
sencillez en relación con las técnicas cromatográficas 7. Introducir a la nevera durante 15 minutos. Una vez
y electroforéticas (Quiceno et al., 2020). Por ello, para enfriado, añadir 0,5 mL de cloruro de calcio (0,5 M) y 2 mL
determinar la actividad enzimática β-glucosidasa se de hidróxido de sodio (0,5 M), en ese orden. Agitar para
realiza una reacción que cataliza la hidrólisis de residuos, homogeneizar.
lo cual se da durante la incubación. 8. Agregar 5 mL de agua destilada y centrifugar a 3500 RPM
por cuatro minutos.
Procedimiento 9. Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 398 nm.
1. Recolectar la muestra de suelo y colocar en una bolsa
ziploc de 1 kg. Además, someter a estufa 65 °C por 72 7.5. Determinación de la actividad de la enzima catalasa
horas. Luego, tamizar en malla de 2 mm. Se basa en el método de Johnson y Temple (1964),
2. Pesar en una balanza analítica 0,5 gramos de suelos seco cuya reacción enzimática se basa en la adición de una
y tamizado, y agregarlo a un tubo de centrífuga de 10 ml. determinada cantidad de H2O2 al suelo y en la incubación
Luego, añadir 2 ml de tampón MUB (pH 6,5). de la mezcla, durante un periodo de tiempo determinado
3. Agregar 0,5 ml de solución sustrato 4-Nitrofenil-β-D- en el que actúa la enzima. Ello provoca la descomposición
Glucopiranósido 0,025 M y 4,5 ml de agua desionizada. del H2O2 en H2O y O2 (Bécquer et al., 2016), donde se
4. Luego, preparar el control negativo, utilizando agua observará la formación de burbujas. Se mide el H2O2
destilada en lugar de suelo (enzima), para medir la residual, es decir, el peróxido de hidrógeno que permanece
actividad enzimática no específica. inalterado después que tuvo lugar la reacción enzimática,
5. Adicionar 2 ml de buffer maleato de pH 6,5 al control y a mediante una valoración con permanganato potásico
las muestras. (Aguilar, 2017). Si la disolución se torna de color rosado,
6. Tapar los tubos e incubar a 37 °C por una hora. significa que hay presencia de la enzima catalasa.
7. Dejar enfriar por 15 min en una nevera. Después, agregar
0,5 ml cloruro de calcio 0,5 M, 2ml de solución extracto Procedimiento
Tham y 5 ml de agua destilada. 1. Colectar 1 kg de muestra de suelo en dos bolsas de
8. Centrifugar por cuatro minutos por 4000 RPM y medir la papel. Conservar una bolsa y someterla a la estufa a una
absorbancia de los extractos a 400 nm. temperatura de 65 °C al menos dos horas previas a la
práctica para obtener el peso seco (SS).
7.4. Determinación de la actividad enzimática de la 2. Pasar por tamiz de 2 mm y pesar en una balanza analítica
fosfatasa 0,5 gramos de suelo. Colocarlos en un matraz Erlenmeyer
y agregar 40 ml de agua destilada.
Se basa en el método espectrofotométrico de Eivazi
3. Ingresar magnetos, tapar con Parafilm y llevar al agitador
y Tabatabai (1977). Es una técnica analítica que permite
magnético por un lapso de tres minutos (a una velocidad
determinar la concentración de un compuesto en solución. aproximada de 300 RPM). Luego, agregar 5 mL de solución
El método colorimétrico tiene una longitud de onda de de peróxido de hidrógeno, tapar y agitar por 10 min.
400 nm, que mide el 4-nitrofenol liberado (Alef y
4. Añadir 5 mL de ácido sulfúrico 1,5 M para detener la
Nannipieri, 1995). Se basa en el hecho de que las soluciones reacción enzimática y estabilizar el H2O2 residual.
alcalinas de este compuesto presentan coloración amarilla
5. Filtrar, tomar 25 ml y titular lentamente con
en medio ácido con un pH menor a 5 y son incoloras.
permanganato de potasio 1 % con agitación constante,
hasta que cambie de color a un tono rosado permanente.
Procedimiento
6. Preparar controles: control peróxido, se añade todo
1. Colectar una muestra de suelo de 1 kg en una bolsa ziploc. menos peróxido de hidrógeno, en el caso del control de la
Someter a la estufa durante 72 horas a 65 °C. Pasar por muestra se añade todo menos suelo.
tamiz de 2 mm.

6 DOI: 10.21142/SS-0501-2024-e092
 Métodos para determinar la actividad enzimática en suelos contaminados

Conclusiones relacionadas con el metabolismo y la obtención de

energía en los microorganismos del suelo; y las ureasas,
El suelo se degrada de forma acelerada por actividades
involucradas en el ciclo biogeoquímico del nitrógeno. Los
antropogénicas como la minería, la agricultura y la
métodos experimentales que permiten el análisis de estos
ganadería. Esto genera un desequilibrio de nutrientes,
indicadores brindan información de vital importancia para
destrucción de la biodiversidad y problemas con la
conocer el estado del ecosistema, aunque aún presentan
seguridad alimentaria a escala mundial. Los procesos de
ciertas limitaciones relacionadas con la relación con
biorremediación, entre los que destacan la bioestimulación
algunos parámetros como la temperatura, la humedad, la
y bioaumentación, representan las principales alternativas
materia orgánica, entre otros, lo que precisa continuar con
para atacar estos cambios y evaluar las condiciones del
el desarrollo de la investigación en suelos contaminados.
suelo mediante el estudio de la actividad enzimática.
Entre las principales enzimas del suelo se encuentran Agradecimientos
las catalasas, indicadores importantes de actividad
biológica aeróbica; las fosfatasas, relevantes para el A Kaori Ninoshka Baila Laurente, por sus valiosos
desarrollo del microbiota y las plantas; las glucosidasas, comentarios a nuestra investigación.

Vol. 5 / N.o 1 7
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Vol. 5 / N.o 1 11
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