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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’enseignement Supérieur et de la recherche scientifique
Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou
Faculté des Sciences biologiques et des Sciences Agronomiques
Département de Biochimie-Microbiologie
Mémoire de fin d’études
En vue de l’obtention du diplôme de MASTER en biologie
Option : Biochimie appliquée
Thème :
Etude de l’effet combiné de l’acide lactique

et du chitosane sur la croissance de
quelques bactéries et mycètes pathogènes
Réalisé par
Melle : MALKI NASSIMA
Melle : BENYACOUB HAYET
Devant le jury :
Président : Mr Ouelhadj A.
Promoteur : Mr Amrouche T.
Examinateur 1 : Mme Abdoune-Ouali
Examinateur2 : Mr Ferdji A.
Promotion 2014 /2015

Remerciements
Avant tout, nous tenons à remercier notre bon Dieu « Tous puissant »
de nous avoir accordé la force, le courage et la patience afin de
réaliser ce modeste travail.
Au terme de ce travail, nous voulons d’abord adresser à notre

promoteur Dr AMROUCHE Tahar à qui on adresse nos sincères
remerciements pour avoir dirigé ce mémoire et mis à notre
disposition les moyens nécessaires pour le réaliser.
Nos remerciements s’adressent aussi à Dr KADDOUCHE Slimane qui

nous a bien accueillis dans son laboratoire chimie de l’université
Mouloud Mammeri Tizi-Ouzou, et nous aidé à obtenir le chitosane.
Que toutes les personnes ayant contribué de près ou de loin à la

réalisation de ce modeste travail soient vivement remerciées.
On tient à remercier aussi Mr KADDOUCHE Slimane qui nous a aidés

à suivre notre partie de stage pratique au niveau du laboratoire
chimie de l’université Mouloud Mammeri Tizi-Ouzou
Je dédie ce travail à mes
parents qu’ils trouvent ici
toute ma gratitude pour leur
soutien tout le long de mes
études.
A tous ceux qui me sont
chèrs
Hayet
Dédicaces
Je dédie ce travail à mes chers parents qui ont été pour moi la
force et le soutien dans tout mon cursus estudiantin et qui ont forgé de
moi la volonté et l’ambition je vous serais éternellement reconnaissante.
Que dieu les protège et leurs donne une vie pleine de bonheur.
A mon cher mari RABAH d'être toujours à mes côtés pour me

soutenir, pour m'aider dans la mesure du possible, mais surtout pour
donner du goût à ma vie par son amour et sa tendresse, j'espère qu'il
trouve ici le témoignage de mon profond amour, attachement et
respect.
A mes frères Amayes et Massinissa pour leur disponibilité,

leur soutien moral, leur encouragement incessant.
A ma sœur Karima d'être coopératif et d'assumer à ma place

certaine de mes responsabilités familiales.
A ma belle-famille pour leur soutien, gentillesse et sympathie.
A toute ma familles tantes et oncles et a tous mes cousins et

cousines
A ma meilleur amie Lynda sans oublier mon binôme Hayet
…. NASSIMA ….
Introduction
Liste des figures
Figure 1: La vitesse de croissance de quelques microorganismes en fonction du pH
Figure 2: Développement des microorganismes en fonction d’activité d’eau
Figure 3: Les principales interactions aliment / microorganisme / consommateur
Figure 4: La formation de métabolites toxiques à partir de protides
Figure 5: Formes optiques de l’acide lactique (SODERGARD et STOLT ,2002).
Figure 6: Les deux isomères de l’acide lactique (REZGUI et al., 2008)
Figure7 : Structures chimique de la chitine et du chitosane
Figure 8: Le procédé d’obtention de la chitine et de chitosane ( ONSOYEN ET SKAUGRUD, 1990)
Figure 9: Schéma d’une cellule de THOMAS
Figure10: Représentation schématique de la méthode des puits (ZAIKA, 1988)
Figure11 : Les zones d’inhibition des souches bactériennes
Figure 12 : Effet de l’acide lactique sur E.coli et P. aeruginosa
Figure13 : Effet de l’acide lactique sur B. subtillis et S. aureus
Figure 14 : Effet de l’acide lactique sur C. albicans
Figure15 : Effet de l’acide lactique sur A. niger
Figure 16 : effet de chitosane sur E.coli
Figure 17 : Effet de chitosane sur B. subtillis, P. aeruginosa et S. aureus
Figure 18 : Effet de chitosane sur C. albicans
Figure 19 :Effet de chitosane sur A. niger
Figure 20 : Effet combiné de l’acide lactique et le chitosane sur les souches bacteriennes
Figure 21 : Effet combiné e l’acide lactique et le chitosane sur C. albicans
Figure 22 : le test de la CMB pour les bactéries et la levure traité avec l’acide lactique
Figure 23 : le test de la CMB pour les bactéries et la levure traité avec le chitosane
1
Liste des tableaux
Tableau I : Classification des facteurs d’altération des aliments
Tableau II: pH minimum de croissance de quelques germes (Chene, 2002).
Tableau III : Les domaines d’application de l’acide lactique
Tableau IV: Sources potentielles de chitine (Mathur et Narang, 1990)
Tableau V: Activité antimicrobienne du chitosane de quelque microorganismes (Liu et al., 2001)
Tableau VI: Les domaines d’application de la chitine et le chitosane (KEDDOU, 2008)
Tableau VII: Les échantillons du chitosane selon le temps de traitement avec NaOH
Tableau VIII: Effet de l’acide lactique sur les souches bactériennes (méthode des puits)
Tableau IX: Effets de l’acide lactique sur les souches microbiennes testées
(Méthode des spots)
Tableau X: Effets du chitosane sur les souches bactériennes et fongiques
Tableau XI: Effet antimicrobien du mélange d’acide lactique et le chitosane sur les souches
microbiennes testées
Tableau XII : Les valeurs de la CMI pour l’acide lactique et le chitosane
2
Liste des abréviations :
CDC Centre américain de contrôle des maladies

CMB Concentration Minimale bactéricide
CMF Concentration Minimale fongicide
CMI Concentration Minimale Inhibitrice
COS chitooligosaccharides
DD degré de Désacétylation
DLC Date Limite de Consommation
DLUO Date Limite d'Utilisation Optimale
HPLC High-performance liquid chromatography
MH Mueller Hinton
OMS Organisation mondiale de la santé
PPM partie par million
TIA toxi infection alimentaire
3
Table des matières
Sommaire
Liste des figures………………………………………………………………………………..1
Liste des tableaux .......................................................................................................................2
iste des abréviations....................................................................................................................3
Introduction générale..................................................................................................................4
Synthèse bibliographique
Chapitre I : Altération microbienne des aliments

I. Définition.......................................................................................................................... 8
II. Origine et nature de la flore microbienne des aliments .................................................... 8
III. Les types d’altération microbienne................................................................................... 9
IV. Le mécanisme d’évaluation de la flore dans l’aliment .................................................... 9
V. Les facteurs d’altération des aliments............................................................................... 11
V.1. Les facteurs intrinsèques ..................................................................................................... 11
V.2. Les facteurs extrinsèques...................................................................................................... 14
VI. les conséquences ............................................................................................................... 15
VI.1. incidence sanitaire de la présence de microorganismes ...................................................... 15
VI.2. les maladies alimentaires..................................................................................................... 15
VI.3. Les maladies microbiennes transmises par les aliments .................................................... 16
VI.4. Principales flores et germes de contaminations des aliments ....................................... 18
Chapitre II : Les agents antimicrobiens
I. Définition des agents antimicrobiens................................................................................ 19

II. Types d’agents antimicrobiens ......................................................................................... 19
II.1. les agents naturels ....................................................................................................... 19
II.2. les agents synthétiques................................................................................................ 20
II.3. les agents biologiques ................................................................................................. 21
II.4. autres agents................................................................................................................ 21
III. Association d’agents antimicrobiens ................................................................................ 22
IV. Mode d’action des agents antimicrobiens......................................................................... 23
V. Les facteurs influençant l’activité antimicrobienne.......................................................... 23
VI. Détermination de la sensibilité/résistance des souches microbiennes aux agents
antimicrobiens ............................................................................................................ 24
VII. Détermination de la CMI (concentration minimal inhibitrice) des agents antimicrobiens ..26
VIII.Détermination de la concentration minimale fongicide (CMF) ..................................... 26
IX. Aromatogramme avec courbe de concordance................................................................. 26
Chapitre III: Mode d’action des agents antimicrobiens naturels : acide lactique et
chitosane
I. Généralités sur les agents antimicrobiens naturels ........................................................... 27

II. L’acide lactique
II.1. Définition .................................................................................................................. 27
II.2. Origine de l’acide lactique ........................................................................................ 28
II.3. La structure de l’acide lactique ................................................................................. 29
II.4. Les caractéristiques de l’acide lactique ................................................................... 29
II.5. Les propriétés de l’acide lactique ............................................................................. 29
II.6. Mécanisme d’action de l’acide lactique.................................................................... 31
II.7. Domaines d’utilisation de l’acide lactique................................................................ 31
III. Le chitosane
III.1. Historique ................................................................................................................. 32
III.2. La Source du chitosane............................................................................................ 32
III.3. La structure chimique de la chitine et de chitosane.................................................. 33
III.4. Procédés d’obtention de chitine et de chitosane....................................................... 34
III.5. Les caractéristiques du chitosane ............................................................................. 35
III.6. Les propriétés du chitosane ...................................................................................... 36
III.7. Le mécanisme d’action du chitosane........................................................................ 37
III.8. Les applications du chitosane ................................................................................... 38
La partie expérimentale
A. Matériel et méthodes ...................................................................................................... 39
II.1. Matériel
II.1.1.acide lactique .............................................................................................................. 39
II.1.2. le chitosane ................................................................................................................. 39
II.1.2.1.Le protocole d’obtention du chitosane................................................................. 39
II.1.3. Les microorganismes .................................................................................................. 40
II.1.3.1. Les bactéries .................................................................................................. 40
II.1.3.2. Levures ........................................................................................................... 40
II.1.3.3. Moisissures ...................................................................................................... 40
II.2. Méthodes
II.2.1. Vérification des souches de référence ............................................................................... 41
II.2.1.1. étude macroscopique............................................................................................. 41
II.2.1.2. étude microscopique ............................................................................................. 41
II.2.2. Préparation de la suspension microbienne et des solutions des agents antimicrobiens..... 42

II.2.2.1. Préparation de la solution du chitosane ................................................................... 42
II.2.2.2. Préparation des solutions de l’acide lactique ........................................................... 43
II.2.2.3. Préparation de la suspension bactérienne et levure ................................................. 43
II.2.2.4. Préparation de la suspension de spores.................................................................... 43
II.2.3. Méthodes utilisées pour détecter l’Effet antimicrobien de chitosane, de l’acide
lactique et de leur combinaison .................................................................................................... 44
II.2.3.1. la méthode de l’antibiogramme ................................................................................. 44
II.2.3.2. La méthode des puits ................................................................................................. 45
II.2.3.3. La méthode des spots ................................................................................................. 46
II.2.4. Détermination de la concentration minimale inhibitrice ................................................... 46
II.2. 5. Détermination des concentrations minimales bactéricides (CMB) .................................. 47
B. Résultats et discutions
I. La sélection des échantillons du chitosane ....................................................................... 49
II. Evaluation de l’activité antimicrobienne .......................................................................... 49
III. Effet antimicrobien de l’acide lactique sur les souches microbiennes ............................. 52
IV. Effet du chitosane sur les souches microbiennes.............................................................. 56
V. Effet combiné du chitosane et l’acide lactique sur les souches microbiennes ................ 60
VI. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ............................................................ 64
VII. Les concentrations minimales bactéricides (CMB)........................................................ 64
Conclusion générale ................................................................................................................... 66

Références bibliographiques
Résumé
Cette étude vise d’une part, à évaluer l’activité antimicrobienne de chitosane,

principal dérivé de la chitine extraite de la carapace des produits de mer, et de la comparer à
celle de l’acide lactique, d’autre part, à déterminer l’effet antimicrobien combiné de ces deux
susbtances. L’activité antimicrobienne a été évaluée sur quatre souches bactériennes :
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus et deux
souches fongiques : Aspergillus niger et Candida albicans; qui sont très impliquées dans les
infections microbiennes et dans les phénomènes de résistance aux antibiotiques.
Après application de la méthode des spots, l’acide lactique a montré un effet inhibiteur
vis-à-vis des souches fongiques (en particulier C. albicans) et un pouvoir antibactérien. Par
contre, aucun effet inhibiteur n’a pas été observé dans le cas d’Aspergillus niger. Quant au
chitosane, il s’est révélé potentiellement inhibiteur vis-à-vis de B. subtilis, S. aureus, P.
aeruginosa, E. coli. Ce composé inhibe la croissance de C. albicans , mais pas celle de A.
niger. L’association de ces deux substances a permis de mettre en évidence un effet
antimicrobien combiné sur les souches testées, l’effet combiné observé est d’autant plus
intéressant que les concentrations subinhibitrices sont plus basses que celles obtenues avec
chacune des deux substances testées individuellement. Nos résultats laissent suggérer la
possibilité d’utilisation de ces combinaisons dans les domaines alimentaire, pharmaceutique
et cosmétique.
Mots clés:
Chitine, chitosane, acide lactique, activité antimicrobienne, combinaison.
‫ﻣﻠﺨﺺ‬
‫ إﻟﻲ ﺗﻘﯿﯿﻢ اﻟﻨﺸﺎط اﻟﻀﺪ اﻟﻤﯿﻜﺮوﺑﻲ ﻟﻠﻜﯿﺘﻮزان اﻟﺬي ﯾﻌﺘﺒﺮ ﻣﻦ أھﻢ اﻟﻤﻮاد اﻟﻤﺴﺘﻤﺪة ﻣﻦ اﻟﻜﯿﺘﯿﻦ‬،
‫ ﺗﺤﺪﯾﺪ‬،‫ ﻣﻦ ﻧﺎﺣﯿﺔ أﺧﺮى‬،‫ وﻣﻘﺎرﻧﺘﮭﺎ ﻣﻊ اﻟﻨﺸﺎط اﻟﻀﺪ اﻟﻤﯿﻜﺮوﺑﻲ ﻟﺤﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ‬،‫اﻟﻤﺴﺘﺨﺮج ﻣﻦ أﺻﺪاف اﻟﺤﯿﻮاﻧﺎت اﻟﺒﺤﺮﯾﺔ‬
‫ ﻟﻘﺪ ﺗﻢ ﺗﻘﯿﯿﻢ ھﺪا اﻟﻨﺸﺎط اﻟﻀﺪ اﻟﻤﯿﻜﺮوﺑﻲ ﻋﻠﻰ أرﺑﻌﺔ أﻧﻮاع ﻣﻦ‬.‫ﺗﺄﺛﯿﺮ اﻟﺠﻤﻊ ﺑﯿﻦ ھﺎﺗﯿﻦ اﻟﻤﺎدﺗﯿﻦ اﻟﻤﻀﺎدات اﻟﻤﯿﻜﺮوﺑﯿﺔ‬
‫اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ و ﺳﻼﻟﺘﯿﻦ ﻣﻦ اﻟﻔﻄﺮﯾﺎت اﻟﺘﻲ ﺗﺸﺎرك ﻓﻲ اﻻﻟﺘﮭﺎﺑﺎت ذات اﻟﻤﺼﺪر اﻟﺠﺮﺛﻮﻣﻲ واﻟﻈﻮاھﺮ اﻟﻤﻘﺎوﻣﺔ ﻟﻠﻤﻀﺎدات‬
. ‫اﻟﺤﯿﻮﯾﺔ‬
‫ ( وﻧﺸﺎط ﻣﻀﺎد‬C. albicans : ‫ ﺣﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ أﻇﮭﺮ ﺗﺄﺛﯿﺮ ﻣﺜﺒﻂ ﻟﻠﺴﻼﻻت اﻟﻔﻄﺮﯾﺔ )ﺧﺎﺻﺔ‬، ‫ﺑﻌﺪ ﺗﻄﺒﯿﻖ ﻃﺮﯾﻘﺔ اﻟﺒﻘﻊ‬
‫ ﻓﻘﺪ اﺛﺒﺖ أن ﻟﮫ ﺗﺄﺛﯿﺮ ﻛﺎﺑﺢ‬، ‫ أﻣﺎ ﺑﺎﻟﻨﺴﺒﺔ ﻟﻠﻜﯿﺘﻮزان‬.Aspergillus niger‫ و ﻟﻜﻦ ﻟﻢ ﯾﻼﺣﻆ أي ﺗﺄﺛﯿﺮ ﻛﺎﺑﺢ ﻓﻲ ﺣﺎﻟﺔ‬.‫ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‬
‫ ﻣﺰج ھﺎﺗﯿﻦ اﻟﻤﺎدﺗﯿﻦ ﺳﺎﻋﺪ ﻋﻠﻰ ﺗﻮﺿﯿﺢ ﺗﺄﺛﯿﺮ‬. A. niger.‫ و ﻻ ﯾﻜﺒﺢ ﻧﻤﻮ‬C. albicans ‫ ھﺪا اﻟﻤﺮﻛﺐ ﯾﻜﺒﺢ ﻧﻤﻮ‬.‫ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‬
‫ ﺗﺸﯿﺮ‬.‫ﻣﺠﺘﻤﻊ ﻣﻀﺎد ﻟﻠﻤﯿﻜﺮوﺑﺎت ﻋﻠﻰ اﻟﺴﻼﻻت اﻟﻤﺨﺘﺒﺮة أﻓﻀﻞ ﻣﻦ ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ ﻛﻼ اﻟﻤﺮﻛﺒﯿﻦ ﻋﻨﺪ اﺳﺘﺨﺪاﻣﮭﻤﺎ ﺑﺸﻜﻞ ﻣﻨﻔﺼﻞ‬
.‫ﻧﺘﺎﺋﺠﻨﺎ إﻟﻰ إﻣﻜﺎﻧﯿﺔ اﺳﺘﺨﺪام ھﺬه اﻟﻤﺰج ﻓﻲ اﻟﻤﻮاد اﻟﻐﺬاﺋﯿﺔ واﻷدوﯾﺔ وﻣﺴﺘﺤﻀﺮات اﻟﺘﺠﻤﯿﻞ‬
‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎح‬
.‫ ﻣﺰج‬،‫ وﻧﺸﺎط ﻣﻀﺎد ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‬،‫ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ و اﻟﻔﻄﺮﯾﺎت‬،‫ ﺣﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ‬،‫ اﻟﻜﯿﺘﻮزان‬،‫اﻟﻜﯿﺘﯿﻦ‬
4 4
Abstract
This study aims both, has evaluate the antimicrobial activity of chitosan, main derived
from chitin extracted of the carapace of seafood, and comparing to that lactic acid, on the
other hand, to be determined the antimicrobial effect combined to these two substances. The
antimicrobial activity was evaluated on four microbial strains: Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and two fungal strains: Aspergillus niger
and Candida albicans; who are very involved in microbial infections and in antibiotic
resistance phenomenons.
After application of the spotlights method, lactic acid has shown an inhibitory effect on
the fungal strains (particular in C. albicans) and an antibacrerian effect. However, no inhitory
effect in Aspergillus niger. As to chitosan, he revelated an inhibitory effect in B. subtilis, S.
aureus, P. aeruginosa, E. coli. This compound inhibits the growth of C. albicans, but not the
gowth of A. niger. The association of the two substances allowed to bring out the combined
antimicrobial effect in the strains tested. The combined effect observed is all the more
interesting that the subinhibitory concentrations are lower those obtained with each of the two
substances individually tested. Our results suggests leaves the possibility of use of those
combination in the food industry , pharmaceuticals, cosmetics.
Key words
Chitin, chitosan, lactic acid, antimicrobial activity, combination, bioconservation.
5 5
4
Introduction
Introduction
En dépit des efforts consentis pour améliorer l'innocuité des aliments par la mise au point
de nouveaux procédés de conservation, les empoisonnements d'origine alimentaire n'ont pas
significativement diminué au fil du temps (MAPAQ, 2013). En effet, pour 91,8% des
intoxications alimentaires enregistrées en 2012, 93,9% étaient d'origine microbiologique et
seulement 6,1% étaient d'origine chimique. Présentement, l'innocuité alimentaire représente
un enjeu majeur dans le domaine bioalimentaire et celui de la santé publique puisque de 200 à
250 maladies sont transmises par l'intermédiaire d'aliments (CDC, 2000).
Les infections d’origine alimentaire sont causées par différents microorganismes, qui sont
principalement des bactéries, des virus, des champignons ou des parasites présents dans
certains aliments (fromage, yaourts….etc.).
Pour minimiser ces maladies, il est nécessaire d’ajouter des additifs alimentaires qui
protègent les aliments non seulement de la contamination microbienne, mais également des
phénomènes d’oxydation (des graisses par exemple). Ils assurent également la qualité du
produit jusqu’au moment de sa consommation. Mais malheureusement, ces additifs possèdent
plusieurs désavantages lors de leur utilisation dans un aliment puisqu'ils peuvent causer des
réactions allergiques, des défauts de saveur et des problèmes pour la santé, exemple des
nitrites ajoutés à certains aliments peuvent se transformer en nitrosamines suite à leur
ingestion et ces composés peuvent être cancérigènes chez l'humain. Par conséquent, certains
des agents antimicrobiens traditionnels présentent des risques pour la santé des
consommateurs et leur utilisation est de plus en plus limitée et controversée. Pour cela, on a
recours aux conservateurs alimentaires naturels ou bien des agents antimicrobiens et
antifongiques naturels comme l’acide lactique et le chitosane, quelle que soit leur utilisation,
seul ou bien combiné, ayant la capacité d'inhiber la croissance de ces pathogènes, sans
affecter les qualités organoleptiques des aliments.
Les agents antimicrobiens ont un spectre d’action très large puisqu’ils inhibent aussi
bien la croissance des bactéries que celles des moisissures et des levures. Leur activité
antimicrobienne est principalement en fonction de leur composition chimique. Ils agissent en
empêchant la multiplication des bactéries et la synthèse de leurs toxines. Pour les levures,
elles agissent sur la biomasse (production de pseudomycelium) alors qu’elles inhibent la
germination des spores, l’élongation du mycélium, la sporulation et la production de toxines
chez les moisissures.
6
Actuellement, la fréquence des infections microbiennes a connu une augmentation
considérable, ceci en raison de l’usage intensif des agents antibactériens et antifongiques
d’origine chimique. D’un autre côté, le chitosane et certains métabolites microbiens
commencent à avoir beaucoup d’intérêt comme source potentielle de molécules naturelles
bioactives, de ce fait, elles font l’objet d’une panoplie d’études pour leur éventuelle utilisation
comme alternative dans le traitement des maladies infectieuses et pour l’augmentation de la
durée de conservation des aliments sans nuire à la santé du consommateur.
C’est dans cette optique que s’inscrit notre travail, il a pour objectif d’évaluer l’activité
antibactérienne et antifongique de l’acide lactique et le chitosane testés individuellement et en
combinaison (association). Dans la première partie nous apportons les données de la
littérature sur l’altération microbienne des aliments, les agents antimicrobiens et le mécanisme
d’action de ces agents antimicrobiens naturels : acide lactique et chitosane.
La seconde partie est consacrée à la réalisation expérimentale, elle consiste dans un

premier temps en l’obtention du chitosane à partir de la chitine issue des crevettes et de
l’acide lactique prêt à utiliser, trois méthodes ont été par la suite utilisées (méthode des
disques, des puits et la méthode des spots) en vue de déterminer l’activité antimicrobienne des
agents antimicrobiens utilisés (acide lactique - chitosane) seuls et combinés par appréciation
des zones d’inhibition obtenues par chaque agent seul et combiné et pour chaque souche
microbienne utilisée.
7
Partie bibliographique
Chapitre I : Altération
microbienne des aliments
I.1. Historique
L’espèce humaine a diminué sa dépendance à l’égard de la chasse et de la pêche dès qu’est
apparue l’agriculture. Il est alors devenu impératif de trouver un moyen de conserver le
surplus d’aliments. Dès 3000 ans av. J-C., le sel a été utilisé pour conserver la viande. La
fumaison du poisson, la production de vin et l’utilisation de fromages et de lait caillé furent
également introduites à cette époque. Malgré les efforts déployés pour empêcher que les
aliments se détériorent, ce n’est qu’au 19em siècle que l’altération microbienne fut étudiée. Ce
fut Louis Pasteur, qui ouvrit l’ère moderne de la microbiologie alimentaire. En 1857, il
démontra que c’était des microorganismes qui gâtaient le lait. D’autres travaux de Pasteur
démontrèrent que la chaleur était un élément qui permettait de contrôler les microorganismes
présents dans le vin et la bière (BECILA, 2009).
I.2. Définition
Une altération microbienne résulte d’une contamination “naturelle” suivie soit de la
mort, de la survie ou de la prolifération des germes.
La charge microbienne “normale” de la plupart de nos aliments est de l’ordre de
4
10 /g. Il y a mort quand les microorganismes ne trouvent pas dans l’aliment les conditions
nécessaires à leur croissance (nutriments, conditions d’entreposage, traitements
antimicrobiens..). La survie des microorganismes est liée à des conditions n’engendrant pas la
mort mais ne permettant pas la multiplication (composition, froid ...). Il y a prolifération
quand les microorganismes trouvent les conditions nécessaires à leur croissance. Dans ce cas
généralement défavorable il y a altération de la qualité marchande si les germes sont
saprophytes et altération de la qualité sanitaire si les germes sont “pathogènes”. Dans la
nature, les proliférations microbiennes par succession de flores ont pour finalité de minéraliser
complètement le produit (dans le cas de microorganismes hétérotrophes). La notion de charge
microbienne en relation avec la qualité du produit, en fonction de la nature du produit et de la
nature du germe présent(JEAN, 2007). .
II. Origine et nature de la flore microbienne des aliments :

Les microorganismes sont présents dans les écosystèmes naturels comme l’air, le sol et
l’eau. Ils sont également présents sur l’homme lui-même et sur tous les êtres vivants animaux
et végétaux (GUIRAUD et al.,1998).
De ce fait, tous les produits alimentaires transformés ou non peuvent être contaminés par des
microorganismes.
La contamination des denrées alimentaires peut avoir un effet plus ou moins grave sur la
qualité du produit et sur la santé du consommateur. Elle peut être à l’origine d’une altération
du produit, lui faisant perdre ses caractéristiques organoleptiques et/ ou commerciales et
parfois la cause d’intoxications ou toxi-infections graves.
Les aliments sont d’origine végétale ou animale. La flore normalement associée aux plantes et
aux animaux est donc potentiellement présente (GUIRAUD et al.,1998). De plus, un apport
microbien exogène est souvent inévitable (environnement, contact, manipulations, etc...).
III. Les différents types d’altération
8
Il existe en effet différents types d’altération (JOFFIN et JOFFIN, 2003) :

 Altération physique Ex : Chocs, blessures, changements d’état, variation de la teneur
en eau,changement de couleur.
 Altération chimique et biochimique Ex : Oxydation (rancissement) Par les enzymes
(Brunissement enzymatique, lyses, destruction des vitamines et de certains nutriments)
 Altération microbienne Est sans doute la forme la plus connue et la plus risquée. Ex :
Fermentation
IV. L’évolution de la flore microbienne dans l’aliment :

Le comportement de la flore microbienne (GUIRAUD et al., 1998) va dépendre de plusieurs
typesde facteurs :
- Le niveau de contamination initiale ;
- Les propriétés et exigences des micro-organismes ;
- La nature des aliments ;
- Les conditions de l’environnement ;
- Les traitements technologiques.
Les propriétés intrinsèques des aliments et les facteurs extrinsèques appliqués aux aliments
influenceront les mécanismes d’altération microbiennes, chimiques, biochimiques et
physiques des aliments qui résulteront en une perte de la qualité. Parlant de la qualité on
distingue :
 La qualité marchande
Concerne essentiellement les caractéristiques organoleptiques(GUIRAUDet al., 1998) et
setraduit par un attrait ou une répugnance par les consommateurs. Ces incidences
économiquessont déterminantes pour l’industrie alimentaire.
Les microorganismes les plus souvent rencontrés appartiennent aux genres
Pseudomonas,Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, Aspergillus, Rhizopus, Clostridium
sporogones etFlavobacterium (ROUSSARY, 2010)
 Qualité hygiénique
L’innocuité d’un aliment correspond à une qualité seuil et la norme zéro défaut doit être
atteinte pour certaines variétés d’aliments, en particulier à partir du moment où la présence du
microorganisme dans le produit risque d’avoir une incidence défavorable et parfois très grave
sur la santé du consommateur (ROUSSARY, 2010)
 Qualité physico-chimique
La nature de l’aliment et son environnement vont conditionner les possibilités de survie et de
développement de divers constituants de la flore. Les conditionstrouvées par un germes
peuvent être favorables ou non (GUIRAUD et al., 1998).
Lorsqu’un germe ne trouve pas dans un aliment les conditions favorables à son
développement, il meurt (Guiraud et al., 1998). Lorsque celles-ci existent, le développement
intervient. Il peut être très rapide.
9
Ce développement se manifeste par une augmentation de la biomasse microbienne qui se

traduit par un accroissement du nombre de germes et par les manifestations du métabolisme
microbien : Dégradations et libération de métabolites (GUIRAUD et al.,1998).
 A partir des glucides de l’aliment (et dérivés)

- polymères (amidon, cellulose) hydrolyse : texture modifiée ;
- dimères et monomères (saccharose, maltose, lactose, glucose, fructose, etc.)
:fermentations ;
- formation d’acides et de composés carbonylés par exemple : incidence sur le goût et
l’arôme.
 A partir des protides de l’aliment (et dérivés)

- polymères (protéines) : hydrolyse : texture modifiée ;
- polymères (protéines) : hydrolyse : texture modifiée
- acides aminés : décarboxylation, désamination, désulfuration etc. : modifications du
goût,de l’odeur, formation de catabolites toxiques.
 A partir des lipides de l’aliment (et dérivés)

- oxydation et lipolyse (goût).
Les aliments vivent, vieillissent et meurent selon des cycles biologiques naturels .On a
inventé des termes (DLC et DLUO) pour indiquer les durées de conservations des produits
(BECILA, 2009) :
a) Durée de vie et dégradation alimentaire ;
b) La dégradation microbienne.
a) Durée de vie et dégradation alimentaire

Le terme vie est assez souvent employé pour désigner la période pendant laquelle des denrées
conservent les propriétés compatibles avec l'usage qui leur est destiné.
Ainsi en parlant de vie commerciale d'une denrée il est indiqué par là qu'à partir d'une certaine
date elle n'offrira plus toutes les qualités requises pour être vendue. Parfois cette date d'ultime
utilisation est indiquée sur le conditionnement. On peut parler aussi de durée d'utilisation
(BECILA, 2009). Il s'agit de :
- DLC : Date Limite de Consommation : elle signifie qu'à partir du jour figurant sur son
conditionnement l'aliment est inconsommable, qu'il ne peut plus être consommé car le niveau
du risque pour le consommateur n'est plus négligeable ; Le danger est de nature microbienne.
- DLUO : Date Limite d'Utilisation Optimale : elle indique que l'aliment est altéré et ne
présente plus forcément les caractères organoleptiques (couleur, texture, consistance, odeur,
goût, saveur…) qui en composent la qualité recherchée.
Pour autant le produit n'est pas dangereux et peut être consommé sans crainte.
Certains produits s'améliorent avec le temps. Il en est ainsi de certaines salaisons, conserves,
fromages: c'est une question de goût. D'autres peuvent s'altérer.
10
b) Dégradation microbienne
Les microorganismes ne se contentent pas de décolorer la nourriture, de la dégrader ou de
larendre très désagréable à sentir et à manger ; ils peuvent également représenter de
sérieuxdangers pour la sante publique (BECILA, 2009).
Les micro-organismes présents dans un produit alimentaire proviennent soit des matériaux
crus, des ingrédients utilisés, sinon d’une contamination (DEBRAIN, 2006).
Les moyens par lesquels ces micro-organismes contaminent les aliments sont variés et
dépendent à la fois des organismes présents et du produit alimentaire qui leur sert de support.
La capacité de ces microorganismes à se développer et à causer des dommages dépend des
propriétés intrinsèques de la nourriture et de facteurs extrinsèques appliqués à la
nourriture.Les dégradations visibles d’origine microbienne peuvent prendre différentes formes
parmilesquelles la décoloration, la dépigmentation, l’épaississement de la surface, un aspect
trouble ou la décomposition (DEBRAIN, 2006).
V. Les facteurs d’altération des aliments :

On peut classer les facteurs d’altération des aliments selon leur caractère intrinsèque ou
extrinsèque (BECILA, 2009).La classification des facteurs d’altération des aliments est
illustrée dans le Tableau I:
Tableau I: Classification des facteurs d’altération des aliments (BECILA, 2009).
Facteurs intrinsèques Facteurs extrinsèques

- pH - température
- humidité, activité ou disponibilité de l'eau - humidité relative
- potentiel d'oxydo- réduction - gaz présents (CO2, O2)
- structure physique de l'aliment - types et quantités de microorganismes
- présence d'agents antimicrobiens naturels ajoutés
V.1.Facteurs intrinsèques
V.1.1. Le pH
Le pH est un facteur très important. A un pH faible, le développement des levures et des

moisissures est favorisé. A un pH neutre ou alcalin, ce sont les bactéries qui prédominent au
cours du processus de pourrissement ou de putréfaction
Pour un microorganisme donné, la vitesse de croissance en fonction du pH passe par un
optimum. Ce sont souvent des activités enzymatiques sensibles au pH qui sont les facteurs
limitants de la croissance microbienne.
11
Figure 1: La vitesse de croissance de quelques microorganismes en fonction du pH

(LOUIS, 2007).
Ainsi, c’est indirectement la conformation que prennent les protéines dans un milieu à un pH
donné qui est responsable de l’expression de l’activité de ces molécules. Si à un pH donné, la
conformation est telle que la macromolécule n’ait plus aucune activité, la croissance s’arrêtera
si l’activité de cette macromolécule est indispensable à la vie du microorganisme.
Par rapport au pH il est habituel de considérer deux groupes d’aliments : ceux dont le pH est
inférieur à 4,5 et ceux dont le pH est supérieur à 4,5.
Dans la première catégorie les microorganismes dangereux ne se multiplient généralement pas
et Clostridium botulinumn n’élabore pas sa toxine.
Dans les aliments dont le pH est compris entre 4,5 et 9,5, de nombreuses altérations sont
susceptibles de se produire et la plupart des bactéries pathogènes cultivent dans ces
conditions. Le pH de l’aliment favorisera d’autant mieux la prolifération qu’il sera voisin du
pH optimum de croissance (LOUIS, 2007).
V.1.2. L'activité de l'eau
La disponibilité de l'eau a un effet sur la capacité des microorganismes à se multiplier. Plus

l'eau est disponible en grande quantité, plus il sera facile de coloniser un aliment (BAZINET
et CASTAIGNE, 2014).C'est pourquoi on limite cette eau disponible en séchant les aliments
par le séchage, la lyophilisation et la déshydratation. Il y aussi une autre façon de réduire l'eau
disponible tout en ne diminuant pas la quantité totale d'eau. Il s'agit d'ajouter des solutés
comme du sel ou du sucre que l'on appelle des agents humectants. De cette façon, l'eau se lie à
ces solutés et n'est donc plus disponible pour les microorganismes. C'est entre autres pour
cette raison qu'on ajoute de grandes quantités de sucres aux confitures et beaucoup de sel aux
marinades et poissons (BAZINET et CASTAIGNE, 2014).
Le développement des microorganismes dépend, comme le montre la Figure 2, de l’activité de
l’eau dans l’aliment.
12
Figure 2: Développement des microorganismes en fonction d’activité d’eau (LOUIS,

2007).
Le très fort pourcentage de mortalité microbienne observé au cours de la déshydratation, du

salage, de l’addition de sucres ou de la congélation est dû, en grande partie, à la diminution
d’activité de l’eau (LOUIS, 2007).
V.1.3. Le potentiel d'oxydo-réduction
Un faible potentiel d'oxydo-réduction favorise le développement de microorganismes. Par

exemple, les produits carnés, comme les bouillons, contiennent beaucoup de molécules qui
sont directement disponibles pour les microorganismes, puisque leur potentiel d'oxydo-
réduction est faible (LOUIS, 2007).
V.1.4. Composition chimique de l’aliment
Pour proliférer, les microorganismes doivent trouver dans l’aliment des substances nutritives.
Rappelons que les microorganismes dangereux sont pour la plupart hétérotrophes chimio-
organotrophes et doivent donc trouver leur énergie dans les composants de l’aliment. Ils
doivent aussi y trouver de l’eau, une source d’azote, des minéraux et pour certains des
vitamines et des facteurs de croissance (GILLESPIE et al.,2011).
Plus la diversité de composition d’un aliment est grande (produits animaux tels que les
viandes et dérivés, le lait ...) et plus sa susceptibilité à servir de milieu de culture est grande.
(LOUIS, 2007)
V.1.5. La structure physique :
13
Cette caractéristique a un grand rôle à jouer dans la multiplication des microorganismes. Le

broyage ou le hachage des aliments augmente la surface de la nourriture et brise les cellules.
De cette façon, les germes contaminants peuvent se retrouver partout dans les aliments et
rendre le produit insalubre. Si on compare un steak à une boulette de boeuf haché, la dernière
est beaucoup plus susceptible d'être contaminée rapidement. De plus, la présence de pelures
pour les fruits et légumes agit un peu comme une barrière contre les microorganismes(KENNY et
ROLLINS,2007)
V.1.6. La présence d'agents antimicrobiens naturels
On trouve des agents antimicrobiens naturels dans plusieurs aliments. Ceux-ci inhibent la
croissance de certains microorganismes. Par exemple, les épices contiennent souvent ce genre
d'agent. La sauge et le romarin sont les deux épices les plus antimicrobiennes. Dans la
cannelle, la moutarde et l'origan, il y a d'autres inhibiteurs chimiques. L'ail contient de
l'allicine et le clou de girofle de l'eugénol (c'est la molécule organique donnant l'odeur
caractéristique du clou de girofle). Ces deux produits sont aussi des antimicrobiens. La
coumarine, une enzyme présente dans les fruits et légumes, agit aussi comme un
antimicrobien(DION,2000).
Le lait frais contient des lacténines et des facteurs anti-coliformes à activité limitée dans le
temps. L’œuf contient du lysozyme actif sur des germes à Gram positif. Les airelles
contiennent de l’acide benzoïque actif sur les levures et moisissures ; des composés comme le
thymol (thym) ou l’aldéhyde cinnamique (cannelle) ont des activités
antimicrobiennes.(LOUIS, 2007)
Cependant, le fait d'avoir ces inhibiteurs en eux ne protège pas les aliments de l'attaque de
tous les microorganismes. Les antimicrobiens naturels protègent contre des microorganismes
précis, mais d'autres pourront tout de même survivre dans le milieu (DION,2000).
V.2. Les facteurs extrinsèques
V.2.1. La température et l'humidité relative du milieu

Ce sont les deux facteurs les plus importants lorsque l'on parle de l'avarie d'un aliment. Une
humidité relative élevée est favorable aux microorganismes, même si la température est basse.
Si les réfrigérateurs n'ont pas de dégivrage, le milieu devient très humide et permet alors la
multiplication des germes microbiens. De plus, si on place un aliment très sec dans un milieu
humide, l'aliment aura tendance à absorber très rapidement l'humidité et à offrir aux
microorganismes un environnement favorable à leur croissance (BRUNETON, 1999).
L’humidité relative du lieu d’entreposage influe à la fois sur l’activité de l’eau de l’aliment
(équilibre dynamique) et sur la croissance des microorganismes à la surface de cet aliment.
Par exemple quand un aliment a une activité d’eau de 0,6 il faut éviter que les conditions
d’humidité relative de l’atmosphère environnante ne conduisent à une augmentation de
l’activité d’eau en surface jusqu’à une valeur compatible avec une croissance microbienne
(BORGES, 2014).
14
V.2.2. La présence de gaz

Si on emballe des aliments dans une pellicule plastique, cela favorise la diffusion de
l'oxygène. Ceci permet donc la croissance de contaminants microbiens superficiels. Pour ce
qui est du gaz carbonique (CO2), sa présence nuit à plusieurs microorganismes. Un excès de
ce gaz permet d'abaisser le pH et ainsi de limiter la croissance des agents microbiens. Par
contre, d'autres organismes vont très bien croître, même en présence de gaz carbonique
(BORGES, 2014).
Par exemple une augmentation de la teneur en anhydride carbonique (jusqu’à 10 %) et une

diminution de la teneur en oxygène permettent une meilleure conservation des fruits et
légumes en retardant le développement de certains microorganismes et plus particulièrement
des moisissures (LOUIS, 2007).
V.2.3. Les produits antimicrobiens au cours de la fabrication del’aliment
Il s’agit de substances qui sont soit bactériostatiques soit bactéricides (éthanol, acides
organiques comme les acides lactique, acétique, citrique, tartrique, malique, etc.).
L’addition de composés antimicrobiens aux produits alimentaires (additifs) ou l’utilisation
d’agents antimicrobiens divers dans l’environnement de production des aliments (agents de
désinfection, de nettoyage, etc.) est réglementée(LESAGE, 2013).
VI. Les conséquences
VI.1. Incidences sanitaires de la présence de micro-organismes

La prolifération non contrôlée de micro-organismes dans un aliment peut poser des
problèmes au niveau industriel, mais aussi au niveau sanitaire. Les risques encourus varient en
fonction de nombreux paramètres(ROUSSARY, 2010) :
 Nature du micro-organisme ;
 Niveau de contamination (dose infectante) ;
 Nature de l’aliment ;
 L’état physiologique du consommateur.
VI.2. Maladies alimentaires

Des germes dangereux dits pathogènes (GUIRAUDet al.,1998) se développent dans
les aliments entraînant deux types de maladies alimentaires :
 Les toxi-infections ou intoxinations ;
 Les maladies à infection alimentaire.
Les infections alimentaires sont des maladies d'origine alimentaire qui surviennent lors
de l'ingestion d'aliments ou de boissons contaminés par des microorganismes pathogènes
(bactéries, virus, parasites). Ceux-ci prolifèrent dans l'organisme, s'y multiplient et produisent
15
des troubles.il s'agit d'une infection, en général de nature infectieuse ou toxique (LESAGE,
2013).
VI.3. Les maladies microbiennes transmises par les aliments

Les aliments peuvent être les vecteurs ou de véritables milieux de culture de
microorganismes. Ils sontalors potentiellement capables de provoquer diverses affections chez
le consommateur dont la gravitédépend d’abord de la nature et du nombre de
microorganismes et/ou de la toxicité de leurs produitsd’excrétion.
Chaque système aliment / microorganisme / consommateurest particulier. Néanmoins il est
possible de schématiser (Figure 3) les principales interactions susceptibles de se produire de la
façon suivante (LOUIS, 2007) :
Figure 3: Les principales interactions aliment / microorganisme / consommateur

(LESAGE, 2013).
VI.3.1. Les maladies infectieuses

Parmi les maladies infectieusesd’origine alimentaire, les plus fréquemment rencontrées
résultent del’ingestion des microorganismes appartenant aux genres Salmonella, Shigella,
Listeria, Brucella,Mycobacterium, Escherichia, Campylobacter, Clostridium, Yersinia,
Vibrioet de l’ingestion de virus (BOUZA,2009)
Ces microorganismes se comportent vis-à- vis de l’organisme comme des parasites et se
multiplient enutilisant des composants de l’organisme comme nutriments. Ils sont invasifs,
souvent toxinogènes, et provoquent alors des lésions au niveau du tractus digestif mais aussi
au niveau d’autres tissus(septicémie).
Il existe des microorganismes qui libèrent leur toxine dans l’organisme hôte tels que
Clostridiumperfringens (toxines A, B, C, D ou E), Shigella, Escherichia coli
entérotoxinogènes (toxines thermostable et thermolabile)(VAILLANTet al., 2011)
La présence d’aucun de ces microorganismes n’est acceptable dans les aliments en raison du
risque qu’ilsfont courir au consommateur. En conséquence leur recherche se fait par la
méthode présence / absence (ou tout ou rien) et lanormeest “absence dans..”(LOUIS, 2007).
16
VI.3.2. Les toxi-infections

Les toxi-infectionssont produites par de très nombreux germes et correspondent à
l’ingestion d’unproduit alimentaire dans lequel la prolifération des microorganismes atteint
106 à 107 par gramme. Laformation de métabolites toxiques à partir de protides est fréquente
(RAMSAY,2011)
Figure 4: La formation de métabolites toxiques à partir de protides (RAMSAY,2011)
Une intoxication de type histaminique est caractérisée par des nausées, des vomissements, une
diarrhée, des bouffées de chaleur et des œdèmes.
La prolifération des microorganismes reste le plus souvent localisée au niveau du tractus
digestif et setraduit par des syndromes variables selon les microorganismes : crampes
abdominales, une diarrhée, desvomissements, la présence de sang dans les selles, de la fièvre,
des céphalées (PANISSET et al.,2003)
Parmi les germes à l’origine de TIA on peut citer de nombreuses espèces de Salmonella,
Clostridiumperfringens, Bacillus cereus, Vibrioparahaemolyticus, Streptococcus faecalis, de
nombreusesentérobactéries, etc.
Les risques encourus par le consommateur ne deviennent significatifs qu’à partir d’un niveau
decontamination relativement élevé (106/g par exemple) ce qui implique que la norme qualité
hygiéniquedes produits alimentaires contaminés par ces microorganismes est voisine d’une
centaine de germes /g ou/ ml. Elle dépend évidemment du type de consommateur, de la nature
et des conditions de fabrication et de conservationde l’aliment et de l’espèce microbienne.
Une numération est alors réalisée pour évaluer laqualité hygiénique du produit(LOUIS, 2007).
VI.3.3. Les intoxinations
Les intoxinationsrésultent de l’ingestion d’une toxine préformée dans l’aliment. Il

s’agitessentiellement des intoxinations botuliniques, staphylococciques et à Bacillus cereus.
17
Lesmicroorganismes synthétisent ces toxines de nature protéique au cours de la phase

exponentielle decroissance (C. botulinum) ou en fin de cette phase (S. aureus) (LESAGE,
2013).
Dans le cas de l’intoxination botulinique, le risque pour la santé du consommateur étant

extrêmementgrand, aucune norme ne peut permettre de contrôler l’inocuité du produit.
Dans ce cas, il faut doncadopter des conditions de fabrication - conservation qui garantissent
de façon absolue la qualité sanitairedu produit.
Chaque système microorganisme - aliment - consommateur permet donc de définir la qualité
hygiénique et une normalisation évidente en résulte. Plus le risque est grand et plus le niveau
de tolérance dans l’aliment sera faible (ROUSSARY, 2010).
VI.4. Principales flores et germes de contaminations des aliments

Les aliments sont rarement stériles en profondeur et jamais en surface, souvent contaminés
defaçon primaire, ils le sont systématiquement de façon secondaire lors des diverses
manipulations auxquelles ils sont soumis (BECILA, 2009).
Certains contaminants (bactéries, champignons, levures) ne présentent aucun inconvénient,
nipour le produit ni pour ceux qui le consommeront.
En revanche, d'autres sont susceptibles de nuire gravement à la santé humaine (flore
pathogène) ou de mettre en péril la vie commerciale de la denrée (flore d'altération)
(BECILA, 2009).
VI.4.1. Flore d’altération

Les germes d’altération sont responsables de modifications d’aspect, de texture, de
consistance ou de flaveur de la denrée alimentaire ainsi que d’une diminution de la durée de
conservation (BECILA, 2009).
Parmi ces germes, nous retiendrons particulièrement les Entérobactéries, les levures et
Moisissures et Pseudomonas car ils sont en plus des indicateurs spécifiques
d’aspectsdéfectueux du processus de fabrication (JEQUEL, 2013)
VI.4.2. Flore pathogène

Le terme pathogène signifie naissance de la douleur c.-à-d qui entraîne unemaladie.Les
germes pathogènes ou les bactéries pathogènes sont responsables de maladies. Le
pouvoirpathogène ou pathogénicité d'une bactérie est donc sa capacité à provoquer des
troubles chez un hôte. Il dépend de son pouvoir invasif (capacité à se rependre dans les tissus
et à y établir des foyers infectieux), et de son pouvoir toxinogènes (capacité à produire des
toxines)(BOUZA,2009).On distingue deux catégories de bactéries pathogènes :
 Strictes ou spécifiques : Ces bactéries provoquent des troubles quel que soit le
patient, saufdans le cas des porteurs sains.
 Opportunistes : Ces bactéries provoquent des troubles lorsque les défenses
immunitaires del'hôte sont affaiblies (BECILA, 2009).
18
Chapitre II : Les agents antimicrobiens
Chapitre II. Les agents antimicrobiens
I. Définition des agents antimicrobiens
On désigne par agent antimicrobien tout agent chimique, physique ou biologique inhibant
la croissance et/ou la survie des micro-organismes (ASADA et al., 1998). Ces substances ayant
une affinité pour les cellules des parasites et le pouvoir de les tuer plus forts que les dommages
qu'elles causent à l'organisme; ce qui rendra possible la destruction des parasites sans
perturbation sérieuse de l'organisme (PERRY et al., 2002).
En d’autres termes, agent antimicrobien est toute substance utilisée pour détruire les
microorganismes ou empêcher leur croissance, y compris les antibiotiques et autres agents
antibactériens, antiviraux, antifongiques et antiparasitaires (CE, 2001).
II. Types d’agents antimicrobiens
Les agents antimicrobiens agissent par différent mécanismes et peuvent être utilisés de
diverses manières, selon les objectifs recherchés et selon leur spécificité d’action (EUZEBY,
2005).
Les Agents antimicrobiens peuvent êtres des substances naturelles (chitosane, acide
lactique…), semi-synthétiques ou synthétiques (alcools, aldéhydes…) qui, aux concentrations
observées in vivo, possède une activité antimicrobienne (c’est-à-dire qu’elle tue ou inhibe la
croissance des micro-organismes).
On distingue trois types d’agents antimicrobiens selon leur nature : agents naturels, agents
synthétiques (chimiques) et agents biologiques (GUIRAUD, 2003).
II.1. Les agents naturels
II.1.1. Le chitosane
Le chitosane est un produit naturel obtenu par désacétylation de la chitine à partir de la
carapace des crustacés (crabes, crevettes) par des processus chimiques ou microbiologiques. Il
peut aussi être produit par certaines moisissures (Aspergillus niger, Mucor rouxii, Penicillium
notatum). Ce polymére est utilisé comme agent antimicrobien et antifongique (BENABBOU,
2009) et antitumoral (TOKORO et al., 1988; JEON et KIM,2002)
II.1.2. Acide lactique

L’acide lactique est un intermédiaire métabolique retrouvé dans de nombreux organismes
vivants, et représente l’un des acides organiques les plus importants (GIVRY, 2006). Ces acides
organiques sont des agents classiques de préservation des aliments (BRUL et al., 1999) et sont
reconnus comme des additifs alimentaires et des agents antimicrobiens.
19
II.1.3. Les huiles essentielles :
Elles ont reçu le nom d' « huiles essentielles » en raison de leur aspect huileux et du
parfum, souvent agréable, qu'elles dégagent. Elle sont dites pures et naturelles lorsqu’elles ne
contiennent aucun corps gras, et qu’elles sont uniquement constituées de molécules aromatiques
volatiles (BACHELOT et al., 2006).
L’huile essentielle peut avoir des propriétés différentes suivant la partie de la plante dont
elle est extraite, par exemple, l’huile essentielle de coriandre, issue des fruits mûrs et secs, est
tonique, euphorisante et anti-infectieuse. Tandis que tirée de la feuille, elle se révèle sédative et
anti-inflammatoire (GIRARD, 2010).
Selon GIRARD (2010), dans la mesure où les huiles essentielles sont lipophiles, elles
passent facilement les parois cellulaires et cytoplasmiques en provoquant des dommages
irréversibles pour ces parois. C’est ce qui leur confère une grande cytotoxicité. Elles augmentent
notamment la perméabilité de ces parois ce qui leur confère le pouvoir antiseptique, antibactérien,
antiviral, antifongique, et le pouvoir antiparasitaire.
II.2.Les agents synthétiques (agentschimiques)
Sont des antiseptiques et désinfectants dont le choix dépendra de l’usage que l’on veut en
faire, de leur activité, de leur toxicité et de leur stabilité, parmi ces agents chimiques on
distingue :
II.2.1. Les alcools
Les alcools sont les désinfectants et les antiseptiques les plus largement utilisés, ils sont
bactéricides et fongicides mais non sporicides ; certains virus contenant des lipides sont
également détruits, les deux alcools germicides les plus populaires sont l’éthanol et l’isopropanol,
habituellement utilisés à une concentration variant de 70 à 80%.
Ils agissent en dénaturant les protéines et peut-être en dissolvant les lipides membranaires
(PRESCOTT et al., 2007).
II.2.2. Les phénols
Les composés phénoliques jouissent de propriétés bactériostatiques ou bactéricides

marquées grâce à leur fonction phénol mais ils sont peu actifs sur les spores bactériennes
(LECLERC, 1995). Ces substances agissent par dénaturation des protéines et par altération des
membranes cellulaires (PRESCOTT et al., 2007).
20
II.2.3.Les aldéhydes
Ce sont de puissants agents antimicrobiens, les deux aldéhydes les plus couramment
utilisés, le formaldéhyde et le glutaraldéhyde qui sont des molécules très actives qui se combinent
aux acides nucléiques et aux protéines, ils les inactivent par pontage et alkylation, ils sont
sporicides et peuvent être employés comme stérilisants chimiques (PRESCOTT et al., 2007).
Parlant des agents synthétiques on peut citer également des additifs alimentaires qui sont
des conservateurs chimiques (E200 à E 297), qui sont utilisés dans le but de prolonger la durée de
conservation des aliments (NAFTI, 2011).ceux ci ont divers origines : animale, végétal et
microbien.
Les conservateurs chimiques n'ont pas la capacité de rendre sain un produit qui ne l'était
pas avant son traitement, ni d’améliorer la qualité d'un mauvais produit ; ils peuvent seulement
conserver au produit ses caractéristiques initiales plus longtemps qu'à l'ordinaire.
On cite : peroxyde d'hydrogène, sels de sodium, potassium ou calcium…etc (NAFTI,

2011).
II.3. Agents biologiques :
L’activité spontanée ou induite de microorganismes peut stabiliser un milieu ou éviter tout

danger d’ordre sanitaire. Ces propriétés peuvent résulter de la production de métabolites comme
des acides ou des composés à activité antimicrobienne, comme des nitrites à partir de nitrates, les
antibiotiques, mais aussi de la destruction de substrats qui pourraient servir à des germes
pathogènes,... etc.
Certains microorganismes sont des prédateurs pour d’autres microorganismes

(protozoaire, bactériophages,) (GUIRAUD, 2003).
II.4. Autres agents
La plupart des agents physiques antimicrobiens sont efficace sur l’ensemble des
microorganismes (GUIRAUD, 2003). Les agents les plus fréquemment utilisés sont :
II.4.1. La chaleur
La chaleur est l’un des moyens le plus courant de destruction des microorganismes, il faut
distinguer deux grands types d’applications : la chaleur humide (vapeur saturée) et la chaleur
sèche (circulation d’air) (PRESCOTT et al., 2007).
21
Selon l’intensité de la chaleur et la durée d’exposition (température /temps) ; plusieurs

techniques sont utilisées, stérilisation, pasteurisation et leurs variantes. On trouve également la
déshydratation qui est une technique physique de conservation des aliments qui consiste à
éliminer, partiellement ou totalement, l'eau contenue dans l'aliment (EMILIE, 2012).
II.4.2. Le froid
Le froid entraine le ralentissement de la croissance et des transformations microbiennes.
La réfrigération qui utilise une température proche de 0°C à 4°C empêche la

multiplication de nombreux germes mais pas celle des germes psychrophiles.
La congélation à -18°C et la surgélation (-40°C et même -80°C) permettent une

stabilisation totale vis-à-vis des microorganismes et entrainent une mortalité plus au moins
importante selon la nature des germes et la vitesse de refroidissement (GUIRAUD, 2003).
II.4.3. Les radiations
Certaines radiations électromagnétiques détruisent les microorganismes, leur efficacité est

liée a la puissance énergétique qui est fonction de la longueur d’onde : plus celle-ci est faible et
plus la radiation est énergétique et donc efficace.
Des effets directs se manifestent à partir des longueurs d’onde inferieures à 300 nm. Une
irradiation ionisante est liée à la formation d’ions par perte d’électrons, ceci entraine des
dénaturations et donc un effet létal pour les microorganismes (GUIRAUD, 2003).
III. Association d’agents antimicrobiens
D’après PIBIRI (2005), les effets antimicrobiens des combinaisons d’agents antimicrobiens,
sont définis selon quatre interactions possibles :
 Indifférence : l’activité d’un agent antimicrobien n’est pas affectée par d’autres agents
antimicrobiens.
 Addition : l’effet de l’association est égal à la somme des effets de chaque agent
antimicrobien étudiée isolément, à la même concentration que dans l’association.
 Synergie : l’effet est significativement supérieur à la somme de chaque agent
antimicrobien étudiée isolément, à la même concentration.
 Antagonisme : l’association diminue l’activité de l’un ou l’autre des agents
antimicrobiens. Elle est inférieure à la somme des effets de chaque agent antimicrobien
pris séparément.
22
IV. Mode d’action des agents antimicrobiens

Les agents antimicrobiens agissent par différents mécanismes et peuvent être utilisés
de diverses manières, selon les objectifs recherchés et leur spécificité d'action qui peut être
germicide ou germistatique.
IV.1. Action germicide
Cette action caractérise les agents ayant une action létale sur les microorganismes. En
fonction de la catégorie de microorganismes ciblés, les agents antimicrobiens exercent une
action bactéricide (agent antibactérien), algicide (agent anti-algues), fongicide (agent anti-
champignons), virucide (agent anti-virus) ou antiparasitaire (agent anti-
protozoaires)(BOUSSEBOUA, 2006).
IV.2. Action germistatique (bactériostatique et fongistatique)

Dans ce cas, les agents inhibent la croissance du microorganisme sans le tuer(bactérie
ou champignon) (BOUSSEBOUA, 2006). Les substances bactériostatiques inhibent
temporairement le développement microbien, les microorganismes recommenceront à
sedévelopper dès que la concentration de la substance aura diminué ou dès que l'application
du procédé physique sera interrompue (GUIRAUD, 1998)
V. Les facteurs influençant l’activité antimicrobienne
La destruction des microorganismes ou l’inhibition de leur développement n’est pas

simple car l’efficacité d’un agent antimicrobien dépend d’au moins six facteurs :
V.1.Taille de la population microbienne
Plus la population microbienne est initialement importante, plus il faudra de temps

pour la réduire fortement et aller jusqu'à la destruction.
V.2. Composition de la population
L’efficacité d’un agent varie fortement avec le type de microorganismes traité car tous
n’ont pas la même sensibilité exemple ; les spores bactériennes sont en général plus
résistantes à la plus part des traitements que les formes végétatives, des cellules jeunes sont en
général plus sensibles que des cellules issues d’une culture plus vieilles. Au sein d’un même
microorganisme, certaines espèces sont plus résistantes que d’autres comme la bactérie
Mycobacterium tuberculosis (responsable de la tuberculose).
23
V.3. Concentration ou intensité de l’agent antimicrobien
Souvent plus un agent chimique est concentré ou plus un agent physique est intense,
plus les microorganismes sont détruits rapidement. En général, l’efficacité d’un agent
chimique augmente de façon exponentielle avec une augmentation de la concentration. Ceci
est vrai dans une certaine gamme de concentration mais passer une certaine valeur, une
grande augmentation de la concentration entraine une faible augmentation de l’efficacité, dans
certains cas, un agent sera plus efficace a faible concentration : en effet, l’éthanol est plus
efficace à 70% qu’à 95%.
V.4. La durée d’exposition
Plus le traitement est long, plus le nombre de microorganismes tués sera grand. Pour
réussir une stérilisation il faut un temps de traitement suffisant.
V.5. La température
Un accroissement de la température auquel une substance chimique agit augmente

souvent son activité.
V.6.L’environnement local
Les microorganismes que l’on souhaite détruire ou dont on veut inhiber la croissance
ne sont pas isolés .Ceci est effectué dans un environnement qui va soit offrir une protection (la
matière organique peut protéger les microorganismes contre la chaleur et les désinfectants
chimiques de ce fait il est préférable de nettoyer les objets avant de les désinfecter ou de les
stériliser), soit favoriser leurs destruction (la chaleur tue plus facilement à pH acide de cette
façon les boissons type jus de fruits seront plus facilement pasteurisés que les boissons
neutres comme le lait) (KECHKAR, 2008).
VI. Détermination de la sensibilité/résistance des souches microbiennes aux agents

antimicrobiens
Il existe diverses méthodes spécifiques pour la détermination de la sensibilité (absence

de croissance) ou de la résistance (croissance) des souches microbiennes aux agents
antimicrobiens, on cite alors :
- Méthode de diffusion en milieux solide (méthode des disques)

- Méthode des puits de diffusion
- Méthode en double couche (MH solide) = méthode des spots
- Méthode en milieux liquides (MH liquide)
24
VI.1. méthode de diffusion en milieux solide (méthode de Vincent)
La méthode de Vincent est une méthode inspirée de l’antibiogramme qui permet de

déterminer l’activité inhibitrice des agents antimicrobiens sur la croissance des micro-
organismes, par la mesure du diamètre d’inhibition autour d’un disque imprégné agent
antimicrobien (BEKHECHI et al., 2008).
Une suspension de chaque germe est préparée dans une eau physiologique stérile et
ajustée à 106 bactéries/ml, chaque suspension est étalée sur une boite de Pétri de 6 cm de
diamètre. Des disques de papier buvard stériles de 6 mm de diamètre sont ensuite déposés sur
les géloses (un disque par boîte). Ils sont imprégnés de l’agent antimicrobien a testé. La
lecture des diamètres d’inhibition se fait après 24 heures d’incubation à l’étuve à 37 ˚C pour
les bactéries et 48 heures à l’étuve à 22°C pour les levures.
VI.2.Méthode des puits de diffusion
Cette méthode, telle que décrite par BERGHE et VLIETINCK (1991), consiste à
inoculer, par inondation avec une dilution adéquate de bactéries, un milieu coulé dans une
boîte de pétri sur une épaisseur de 8 mm, ensuite à réaliser des puits de 6 mm de diamètre de
manière concentrique et qui seront remplis de l’agent antimicrobien à tester.
Après une pré-diffusion de 45 mn à température ambiante sous la hotte stérile, les

souches sont incubées à 37°C pendant 24 heures pour les bactéries et 22°C pendant 48 heures
pour les levures, au terme desquelles les diamètres des zones d'inhibition sont mesurés à l'aide
d'un pied à coulisse (KUETE et al., 2004).
VI.3. Méthode de spots
En milieu solide, l'agent antimicrobien est incorporé dans la deuxième couche d’un
milieu gélosé coulé dans les boîtes de Pétri après avoir coulé la première couche. Les souches
à étudier sont déposé à la surface de la gélose sous forme de spots. Après incubation, la CMI
de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu contenant la
plus faible concentration de l’agent antimicrobien (EUZEBY, 2006).
VI.4. Méthode en milieux liquides
En milieu liquide, l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode
de macro-dilution) ou de cupules (méthode de micro-dilution) contenant l'agent
antimicrobien. Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la
plus faible concentration de l’agent antimicrobien où aucune croissance n'est visible
(OUSSOU et al., 2004).
25
VII. Détermination de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) des agents

antimicrobiens
La CMI est la plus petite concentration de l’agent antimicrobien qui inhibe toute
culture visible d’une souche bactérienne après 18 à 24 heures de culture à 37°C. Cette valeur
caractérise l’effet bactériostatique de l’agent antimicrobien (ARCHAMBAUD, 2009).
VIII. Détermination de la concentration minimale fongicide (CMF)

La CMF est définie comme la plus faible concentration de l'antifongique qui tue
99,9% de la concentration cellulaire finale. Pour la détermination de la concentration
minimale fongicide, nous avons utilisé la méthode décrite par CANTON et al., (2003).
Après la détermination de la CMI, les boites contenant les concentrations en
substance antifongique strictement supérieures à la CMI serviront pour la détermination de la
CMF. (KHOBZAOUI,2014)
Pour ce faire, gratter les puits de chaque puits vont être transférés dans d’autres
boites de Pétri contenant du milieu MH ou bien sabouraud . Les boites sont incubées dans une
étuve à 30°C pendant 24h.
Cette technique nous permet de vérifier si les cellules sont viables et cultivables. La
boite correspondant à la CMF renferme un nombre de colonie inférieure à 3 (MAJOROS et
al.,2005).
IX. Aromatogramme avec courbe de concordance
Il faut réaliser, d’abord, un aromatogramme. Après une incubation de 24h, les disques
apparaissent entourés d'une zone d'inhibition dont le diamètre permet de mesurer la CMI. Le
système disque-milieu de culture est étalonné au préalable avec un grand nombre de souches
de références de CMI connues, déterminées par les méthodes de référence; on trace ainsi la
droite de régression ou "courbe de concordance", donnant la correspondance entre les CMI et
les diamètres des zones d'inhibition pour les disques et le milieu de culture considérés. Après,
on mesure les diamètres des zones d'inhibition, puis on les reporte sur le graphique pour
déduire les CMI (KAMAGATE et al., 2001).
26
Chapitre III : le mécanisme d’action des
agents antimicrobiens naturels :
Acide lactique- chitosane
Chapitre III. Mode d’action des agents antimicrobiens naturels
I. Généralités :
Les agents antimicrobiens naturels sont des substances naturelles utilisées pour
détruire les micro-organismes ou empêcher leur croissance, y compris les antibiotiques et
autres agents antibactériens naturels (acide lactique et chitosane…), antiviraux, antifongiques
et antiparasitaires (CE, 2001).
Les agents antimicrobiens agissent par différents mécanismes et peuvent être utilisés
de diverses manières, selon les objectifs recherchés et selon leur spécificité d’action
(EUZEBY, 2005).
Par définition l’antibiotique a été restreint à toute substance d’origine naturelle
produite par un microorganisme (habituellement une bactérie ou une moisissure) capable
d’inhiber la croissance ou de détruire d’autres microorganismes. Depuis, de nombreuses
molécules antibiotiques ont été synthétisées ou modifiées en laboratoire. Quelle qu’en soit
l’origine, deux caractéristiques importantes sont nécessaires pour qu’une substance soit
qualifiée d’antibiotique (YALA et al., 2001):
- être efficace à faible dose.
- avoir une toxicité spécifiquement dirigée envers un groupe de microorganismes (donc, être
non toxique pour les cellules de l’hôte). (YALAet al., 2001).
Les antibiotiques peuvent être classés selon l'origine, la nature chimique, le
mécanisme d'action et le spectre d'action (YALA et al., 2001). La classification des
antibiotiques selon leurs mécanismes d’action est cependant la plus répandue.
II. Acide lactique
Depuis une dizaine d’années, un intérêt considérable s’est développé autour de l’utilisation
de cultures lactiques qui ont des effets bénéfiques pour la santé, pour des applications
alimentaires, pharmaceutiques ou encore en alimentation animale (SCHAAFSMA, 1996).
II.1. Définition
L’acide lactique est un intermédiaire métabolique retrouvé dans de nombreux

organismes vivants allant des procaryotes anaérobies à l’homme, et représente l’un des acides
organiques les plus importants (GIVRY, 2006).
L’acide lactique est un acide organique naturel, non toxique, trouvant diverses
applications dans les industries chimique, alimentaire et pharmaceutique. Il est notamment
27
utilisé dans la production de polymères biodégradables (BOUDJELAL e tal., 2001; DJIDEL,

2007).
II.2. Origine de l’acide lactique
L’acide lactique est le principal produit de la fermentation par les bactéries

lactiques.c’est un produit majoritaire issu de la fermentation,mais d’autres acides organiques
principalement acétique, formique, propionique, ou encore, caproique et benzoique sont
également produits (KUWAKIet al.,2002)
I.2.1. Les bactéries lactiques :

Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes organotrophes formant un groupe
hétérogène constitué de cocci et de bacilli (BADISet al., 2005). Ce sont des bactéries à Gram
positif dont la teneur en guanine et cytosine (G+C) est inférieure à 50%. Elles sont capables de
croître à des températures comprises entre 10°C et 45°C et à des pH allant de 4.0 à 4.5. Ces
bactéries sont généralement immobiles et se caractérisent par la production d’acide lactique
comme produit majeur du métabolisme. Leur division se déroule sur un seul plan à l’exception
des genres : Pediococcus, Aerococcus, et Tetragenococcus. (SALMINEN et al., 2004; KÖNIG
et FRÖHLICH, 2009 ; PRINGSULAKAet al., 2011).
En plus de l’acide lactique et des autres acides organiques qui empêchent le
développement des microorganismes indésirables par diminution du pH du milieu, les bactéries
lactiques produisent d’autres métabolites ayant des propriétés antimicrobiennes tels que le
peroxyde d’hydrogène, le diacétyl, la reutérine, le dioxyde de carbone et les bactériocines
(DORTU et THONART, 2009), qui influencent sur la texture, le goût et la qualité microbiologique
des aliments (SINGHet al., 2006).
Les bactéries lactiques colonisent les habitats riches en nutriments, tels les plantes,
lesfruits, les produits laitiers, les eaux et les eaux usées, les jus, ainsi que les cavités buccales,
vaginales et intestinales de l’homme, sans pour autant lui provoquer des maladies, à l’exception
de quelques cas causés par les streptococci et certains lactobacilli (KÖNIG et FRÖHLICH, 2009).
Les bactéries lactiques sont, de loin, la catégorie de microorganismes la plus utiliséedans
la production de produits alimentaires contribuant ainsi à la texture et au goût desproduits
fermentés. Par ailleurs, la production par ces bactéries de métabolites tels que lespeptides
antimicrobiens et l’acide lactique, permet d’inhiber la prolifération des microorganismes
pathogènes et d’assurer ainsi une bonne conservation des aliments (POT,2008).
28
II.3. La structure de l’acide lactique
L’acide lactique, de son vrai nom acide 2-hydroxypropanoïque (CH3-CHOH-COOH),

est un acide carboxylique (fonction -COOH), porteur sur le carbone numéro 2 d’une fonction
alcool (-OH)(SODERGARD et STOLT ,2002). Il existe deux formes optiques d’acide
lactique le D- et le L-acide lactique, Se sont des énantiomères (du grec enantios: opposé)
(SODERGARD et STOLT,2002).
Figure 5: Formes optiques de l’acide lactique (SODERGARD et STOLT ,2002).
II.4. Les caractéristiques de l’acide lactique
L’acide lactique ou l’additif E270 est un liquide a l’aspect sirupeux et jaunâtre,

odorant, n’est pas volatile, possède un goût acide moyen et est catalogué comme G.R.A.S, il
possède un potentiel chimique important, c’est pourquoi il est largement utilisé en industrie
(ATKINSON et MAVITUNA, 1991).
II.5. Les propriétés de l’acide lactique
II.5.1.Les propriétés physicochimiques
L’acide lactique (E270) se présente sous une forme liquide soluble dans l’eau, l’alcool,
l’éther et insoluble dans le chloroforme. Ses sels de sodium (E325), de potassium (E326) et de
calcium (E327) se présentent quant à eux sous forme de poudre et sont également solubles
dans l’eau, il est de saveur nettement acide à goût légèrement lacté.
Les deux isomères actifs de cet acide sont les formes L (+) et les formes D (-). Dans
l’organisme, la forme L (+) est la plus rapidement métabolisée que la forme D (-), aussi il est
souvent attribué à l’acide L (+) des qualités nutritionnelles supérieures (CHENE, 2002; COEI,
2004; DJIDEL, 2007).
29
Figure 6: Les deux isomères de l’acide lactique (REZGUI et al., 2008)
II.5.2.Les propriétés antimicrobiennes :
L’acide lactique agit comme agent bactériostatique notamment sur des bactéries
pathogènes (Salmonelles, Listeria, etc.).
L’ajout d’acide provoque une diminution du pH externe qui va entraîner une baisse du
pH interne des micro-organismes et ainsi inhiber leur développement. Mais, tous les
microorganismes n’ont pas la même sensibilité au pH. Chaque micro-organisme est
caractérisé par un seuil de pH en dessous duquel il ne se développe pas.
Quelques exemples de pH minimum de micro-organismes sont indiqués dans le

tableau II (CHENE, 2002).
Tableau II: pH minimum de croissance de quelques germes (CHENE, 2002).
Micro-organismes pH minimum
Pseudomonas sp. 5,6
Campylobacterjejuni 4,9
Salmonella sp. 4
Escherichia coli 4,4
Enterococcusfaecalis 4,4
Bacillus stearothermophilus 5,2
Clostridium perfringens 5
Lactobacillus 3,8
Listeria sp. 4,3
Levures en général 2,4
Moisissures en général 2
30
II.6. Mécanisme d’action de l’acide lactique :
Le mécanisme d’action de l’acide lactique dépend du pH et de la constante acide de

dissociation (pKa), qui détermine la forme dissociée ou non dissociée à un pH donné. Lorsque
le pH est inférieur ou égal à son pKa, l’acide est sous sa forme non dissociée (GEREZ et
al.,2010 ;BLAGOJEVet al., 2012).La forme non dissociée de ces molécules lipophile, leur
permettent de diffuser à travers la membrane plasmique et de pénétrer la cellule, dans laquelle
le pH plus basique, favorise la dissociation de ces acides.Lesprotons accumulés dans le
cytosol diminueront le pH de ce dernier et permettent ainsi d’inhiber les principales activités
métaboliques de la glycolyse (MOLLAPOUR et PIPER, 2008; BLAGOJEVet al., 2012).
II.7. Domaines d’utilisation de l’acide lactique
L’acide lactique est utilisé dans divers domaines comme l’industrie alimentaire,
cosmétique et pharmaceutique, etc. (Tableau III)
Tableau III. Domaines d’utilisation de l’acide lactique
Domaines Les utilisations

Domaine -comme régulateur de l’acidité, produire des agents émulsifiants (boulangerie), comme
alimentaire acidulant, agent de saveur et de texture (yaourts, légumes (olives), alcool (biere),
charcuteries(jambon), pains au levain …etc) (HAHN-HAGERDA, 2000).
-utiliser pour améliore la conservation comme pour les bonbons, les produits de
boulangeries, la mayonnaise….etc
- Il est aussi utilisé afin d’ajuster le pH des bains permettant le durcissement du

cellophane, pour le conditionnement des aliments .
Domaine industrie du -utilisé dans les étapes de finition du textile

non textile
alimentaire cosmétique -l’éthyl lactate est la substance active dans les solutions anti-acné et est
employé comme agent hydratant
pharmaceutique -le sel d’acide lactique, réalisé avec le calcium, est employé dans la
thérapie des insuffisances en calcium et comme agent contre les caries
Industrie du comme acidulant pour le chaulage et le tannage
cuir
31
Industrie -désinfectant et détergent dans la désinfection des carcasses, de la

chimique volaille et des poissons, aussi en tant que détergents dans les
constructions (TIMBUNTAM et al., 2006 ).
- Ils sont également employés lors de la production de produits

chimiques de base comme l’ester de lactate, l’acétaldéhyde, l’acide
acrylique, l’acide propanoique,… dans les industries chimiques ou
pour être polymérisés en acide polylactique biodégradable
(HOFVENDAHL et HAHN-HAGERDAL, 2000).
III. Chitosane
La chitine et le chitosane ont été découvert en 18eme siècle, mais ce n’est que dans les
années 1970 que leur mise en valeur avait commencé (MUZZARELLI 1985 ; ROBERTS
1992). Ces deux polymères sont obtenus par les transformations successives des exosquelettes
(carapaces) de crustacés provenant des déchets de l’industrie agro-alimentaire. Cependant, la
proportion de chitine dans ces déchets peut varier de 15 à 30% en masse sèche pour certaines
carcasses de crabes et de 30 à 40% pour les crevettes grises (MATHUR et NARANG, 1990).
Décalcifiées, les cuticules sont constituées de 55 à 85% de chitine (KURITA, 2006).
III.1. La Source du chitosane
La faible teneur de la chitine dans les autres corps tels que les insectes et les
champignons laissent à suggérer que les crustacés sont les principales sources fournissant de
cette matière première (la chitine) (BLACKWELL, 1973 ;MUZZARELLI, 1985). Elle est le
polysaccaride le plus abondant sur terre après la cellulose son hydrolyse en milieu fortement
alcalin conduit à l’obtention de son dérivé principal qui est le chitosane caractérisé par son
degré d’acétylation (DA) ou selon certains auteurs par son degré désacétylation (DD).
Le chitosane est une substance peu répondu dans la nature. Il est présent uniquement dans
les parois cellulaires de certains micro-organismes fongique (champignons zygomycètes) et dans
mycélium, il n’est signalé que dans les exosquelettes de certains insectes (par exemple la paroi
abdominale des reines de termites).Ce qui explique qu’il n’y a pas de sources primaire
exploitable. Sa production sera systématiquement assurée à partir de la transformation de le
chitine en chitosane.
32
Les publications récentes dans le domaine montrant les teneurs de la chitine de

nombreux crustacés et champignons sont illustrées dans le Tableau IV
Tableau IV : Sources potentielles de chitine (MATHUR et NARANG, 1990)
III.2. La structure chimique de la chitine et de chitosane
La chitine est un polysaccharide constitué d’unités de poly N-acétyl-D- glucosamine liées

par des liaisons de type β(1→4) tandis que le chitosane est constitué de poly D-glucosamine liée
par des liaisons β(1→4) (BLACHWELLI, 1973 ; ROBERTS, 1992). Les structures chimiques de
la chitine et du chitosane sont caractérisées par la présence de groupement amine et de
groupement acétamide et la présence de nombreuses fonctions hydroxyle qui confèrent un fort
caractère hydrophile notamment au chitosane. Ces deux biopolyméres sont également caractérisés
par la longueur de leurs chaines moléculaires ou leurs masses moléculaires.
Figure 7 : Structures chimique de la chitine et du chitosane
33
III.3. Procédés d’obtention de chitine et de chitosane
Les étapes d’obtention de la chitine et de chitosane sont représentées dans la Figure 8.
Figure 8: Le procédé d’obtention de la chitine et de chitosane (ONSOYEN et

SKAUGRUD, 1990).
Une fois que les carapaces sont lavées, imputées de leurs pattes puis séchées et
broyées, la masse obtenue pourra être utilisée pour l’obtention de chitosane en respectant les
étapes suivantes :
- Déminéralisation : c’est une étape qui consiste à éliminer la matière minérale liée à la
chitine. Elle se fait par hydrolyse acide utilisant l’acide chlorhydrique.
- Déprotéinisation : c’est une étape qui consiste à éliminer les protéines liées à la
chitine. Elle se fait par hydrolyse basique utilisant la soude ou la potasse.
- Décoloration ou blanchissement : c’est une étape qui comporte à éliminer les
pigments qui sont liés à la chitine utilisant des agents oxydants.En jouant sur la durée
du traitement alcalin et sur la température, il est possible donc d’obtenir différents
chitosane. Cela est montré dans la figure 9.
34
Ces trois étapes de traitement des carapaces débarrassent la chitine de ces impuretés et en
fin la masse obtenue peut être utilisée comme matière première pour l’obtention de chitosane. Une
fois que la désacetylation des groupements amines a atteint plus de 70%, on peut dire qu’on a
obtenu le chitosane qui pourraêtre soluble. En conséquence, nous appellerons chitosane tout
échantillon ayant un degré d’acétylation résiduel (DA)˂ 30% (SENG, 1988).
La présence des groupes amines et hydroxyles dans l’unité du chitosane permettent

des modifications chimiques du chitosane qui incluent : l’acylation, l’alkylation, la formation
de base de Schiff, l’alkylation réductrice, la carboxyméthylation, la carboxyalkylation
(KRAJEWSKA, 2005).
III.4. Les caractéristiques du chitosane
III.4.1. La cristallinité :
La cristallinité de la chitine et du chitosane est un paramètre important. Elle contrôle

un certain nombre de propriétés comme l’accessibilité aux sites internes dans la chaine
macromoléculaire, les propriétés de gonflement dans l’eau et les propriétés diffusionnelles
(KURITA, 2006 ; RINAUDO, 2006). Les chaines de polymères peuvent être agencées de
différentes maniéres suivant l’origine du matériau.(MUZZARELI, 1985).
Le chitosane est caractérisé également par son degré de désacétylation, sa viscosité et son
poids moléculaire.
III.4.2. Le degré de Désacétylation (DD)
C’est le pourcentage molaire de l’élimination des groupements N-acétyle. Ce

paramètre (DD) influe sur toutes les propriétés physico-chimiques (masse moléculaire en
poids, viscosité, solubilité, …) du chitosane et apparaît donc comme le plus important. La
détermination du DD est l’une des analyses de routine lors de l’extraction de la chitine et la
préparation du chitosane. Plusieurs méthodes sont proposées à savoir, le titrage po-
tentiométrique (ou volumétrique), la spectrométrie infrarouge (IR), la spectrophotométrie
ultraviolet visible (UV-VIS), l’analyse élémentaire, et la résonance magnétique nucléaire
(RMN) (ONESIPPE, 2005).
35
III.4.3. La viscosité
La viscosité du chitosane dépend de son degré d’acétylation, plus il est désacétylé,

plus il y a de groupements amine libres, plus le chitosane est soluble, et plus sa viscosité est
importante; de sa concentration, de la température, et le pH.
III.4.4. Le poids moléculaire
Le poids moléculaire du chitosane peut être déterminé par HPLC. Toute fois, le
viscosimètre demeure une méthode simple et rapide pour connaître le poids moléculaire en
utilisant la formule de Marc-Houwink et Sakurada (ZEMMOURI, 2008). .
III.5. Les propriétés du chitosane
Le chitosane possède divers propriété importantes parmi lesquelles on cite :
III.5.1. Propriétés physico-chimiques et biologiques du chitosane
Le chitosane se présente sous la forme d’un solide amorphe. C’est l’un des rares
polyelectrolytes naturels cationiques existant dans la nature. En solution dans un acide dilué,
le chitosane se comporte comme un polycationique de forte densité de charge, en raison de la
protonation des groupements –NH2. Le chitosane est biocompatible et biodégradable par les
microorganismes possédant des enzymes qu’on appelle chitosanase. Il ne présente aucun
comportement antigénique, mais possède un caractère antithrombogènique et hémostatique. Il
montre des propriétés cicatrisantes remarquables. Le chitosane a également des propriétés
inhibitrices sur la croissance de nombreux parasites et infections. Il a de plus des propriétés
immunologiques, antitumorales, antibactériennes et antifongiques (ZEMMOURI, 2008). .
III.5.2. Activité antimicrobienne du chitosane
Le chitosane ainsi que ses dérivés ont suscité l'intérêt de plusieurs chercheurs pour
leurs propriétés biologiques et antimicrobienne intéressantes.
Son potentiel d'application dans les industries agro-alimentaires comme additif
stabilisateur de couleur, émulsifiant, antioxydant et gélifiant (AGULLOET AL., 2003).
Plus récemment, la possibilité d'utiliser le chitosane pour ses propriétés antimicrobienne et
antifongique a été démontrée (LIUet al., 2001; AGULLOet al., 2003; LIUet al., 2004;
RINAUDO, 2006).
L'activité antimicrobienne du chitosane dépend de plusieurs facteurs tels le poids
moléculaire, le degré de désacétylation, le pH et la température (RABEA et al., 2003). Des
36
exemples d'activité antimicrobienne du chitosane ainsi que les concentrations minimales

inhibitrices contre différents microorganismes sont présentés dans Tableau V.
Tableau V: Activité antimicrobienne du chitosane (LIU et al., 2001)
III.6. Le mécanisme d’action du chitosane
Le mécanisme d'action antimicrobien du chitosane n'est pas encore bien connu mais
différentes hypothèses ont été proposées (SUDARSHAN et al., 1992; CHENE et al., 1998;
RABEA et al., 2003):
- Les charges positives du chitosane peuvent interagir avec la charge négative
desmembranes de la cellule microbienne, ce qui induit la libération du matériel protéique et
lesautres constituants intracellulaires.
- À de faibles concentrations le chitosane polycationique se lie probablement à la
surface des cellules chargées négativement causant ainsi leur agglomération, par contre à des
concentrations élevées, le grand nombre de charges positives va donner une charge positive
nette à la surface des bactéries pour les garder en suspension.
- Le chitosane interagit avec la membrane des cellules pour altérer sa
perméabilitéentravant ainsi l'entrée de certains nutriments.
37
III.7. Les applications du chitosane

Compte tenu de sa structure chimique, et en mettant à profit ses diverses propriétés
spécifiques, le chitosane trouve des applications importantes dans plusieurs domaines.Les
domaines d’application de la chitine et le chitosane sont indiqués dans le Tableau VI.
Tableau VI: Les domaines d’application de la chitine et le chitosane (KEDDOU, 2008)
Domaine Applications
Agriculture Protection des plantes, augmentation des rendements de récolte
(réduction de la croissance des mycètes phytopathologique) ; enduit de
graine et d’engrais ; traitement du sol.
La technologie Activités biologique (antifongique, antimicrobien, anti-infectieux) ;
biomédicale agent anti-tumoral ; effet hémostatique ; augmentation de la coagulation
du sang ; favorisation de la croissance du tissu ; stimulation de la
prolifération des cellules, peau artificielle ; effets
hypocholestérolémiants.
La Immobilisation des cellules et des enzymes ; matériaux stimulants de
biotechnologie cellules, matrice pour l’affinité ou les membranes.
La chimie Purification d’eau (chélation des métaux) ; technologie de l’eau

industrielle (floculation, absorption) ; traitement des boues ; membranes d’osmose
inverse, membranes de filtration ; séparation des gaz ; production de fils
d’emballage biodégradables ; la catalyse.
Cosmétique Crème pour le Corps, et les mains ; shampooing ; crèmes hydratantes.
L’indusrie Régime alimentaire et fibre diététique ; activité hypocholestérolémie

alimentaire (liaison cholestérol, acides gras et mono glycérides) ; la conservation des
nourritures de la détérioration microbienne ; la bio-conservation pour la
production de produits alimentaires à valeurs additionnée ;
rétablissement des déchets de la transformation des produits
alimentaires ; clarification et désacidification des jus de fruits et des
boissons ; agent émulsionnant ; stabilisant de couleur ; additifs
alimentaires des animaux.
Pharmaceutique Commandés de micro capsules (formant des gels et des capsules avec
des polymères anionique) ; transporteur des médicaments à libération
contrôlée ; produits dermatologique (traitement de l’acné).
Autres Textile (propriétés anti-bactériennes) ; pulpe et papier ; résistance au

mouillage) ; œnologie (clarification, désacidification) ; dentisterie
(implants dentaires) ; photographie (papier).
38
La partie expérimentale
Matériel & méthode
Matériel & méthodes
A. Matériel et méthodes
Le présent travail a été effectué au sein du laboratoire de Microbiologie du département des

sciences agronomiques, faculté des sciences biologiques et des sciences agronomiques de
l’Université Mouloud Mammeri de TIZI OUZOU.
II.1. Matériel :
II.1.1. L’acide lactique
L’acide lactique utilisé est commercialisé par la société de chimie cosmétique et de

parapharmacie, ses caractéristiques, présentées sur la fiche technique sont comme suit :
 Odeur : agréable
 Aspect, liquide visqueux miscible avec l’eau et solvants organiques.
 Couleur : transparent a jaune.
 Assay : 79,5 – 80,5%
 Date de fabrication: Déc. 2013
 Date de péremption : Déc. 2015
II.1.2. Le chitosane
Le chitosane testé durant notre étude est obtenu à partir de la chitine issue de la
carapace des crevettes préalablement préparée par l’équipe du Dr KADOUCHE Slimane du
département de chimie, faculté des sciences, Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou,
selon le protocole d’obtention de la chitine et de chitosane.
II.1.2.1.Le protocole d’obtention du chitosane
Le chitosane peut être préparé suivant des protocoles différents selon les auteurs :
Selon la méthode de KOLODZIEJSKA, WOJTASZ - PAJAK, (2000) le chitosane a

été obtenu par désacétylation de la chitine extraite par une solution de soude, selon le mode
opératoire suivant : La chitine a été traitée avec une solution de soude à 50%, dont la
proportion masse/volume est 1/10, la solution est agitée pendant 60 minutes à 140°C.
39
Selon la méthode de MIRZADEH et al., (2002) le chitosane a été préparé par diverses
étapes :
La chitine est traitée avec une solution de soude à 50%, avec une proportion d’un gramme
pour 50ml, la solution est agitée pendant 3 heures à 90°C. Au terme de la réaction, la solution
est filtrée sur un tamis, le chitosane retenu est lavé en continu, afin d’éliminer la soude
résiduelle, et ce jusqu’à ce que le pH de l’eau de lavage atteigne la neutralité. Le chitosane
est rincé avec l’eau distillée puis sécher à l’étuve à 80°C.
Nous avons obtenu le chitosane en suivant le protocole expérimental suivant selon
notre objectif de recherche:
La chitine est traitée avec une solution de soude à 40% préparer avec une proportion
de 572g de Na OH pour 1000ml d’eau distillé (solution : 250ml de NaOH +5g de chitine), la
solution est agitée sous une plaque chauffante réglée à 120°C pendant des périodes
différentes sur quatre échantillons (Tableau VII), les échantillons obtenus ont la
caractéristique d’être différent par leur degré de désacétylation.
Les chitosanes retenus sont lavés en continu, afin d’éliminer la soude résiduelle, et ce
jusqu’à ce que le pH de l’eau de lavage atteigne la neutralité. Les chitosanes sont rincés avec
l’eau distillée puis sécher à l’étuve à 40°C pendant 24h.
Tableau VII: Les échantillons du chitosane selon le temps de traitement avec NaOH.
Echantillons Le temps de traitement avec la NaOH
Echantillon 1 Une heure et 30 minutes
Echantillon 2 Deux heures
Echantillon 3 Deux heures et 30 minutes
Echantillon 4 Trois heures
Ces échantillons seront ensuite testés sur des microorganismes dans le but de savoir
lequel d’entre eux possède l’effet antimicrobien le plus important.
II.1.4. Les microorganismes
Quatre souches microbiennes de référence ont été sélectionnées pour tester l’activité
antimicrobienne des deux substances, il s’agit de Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis, Eschérichia coli, Aspergillus niger. Ces souches sont choisies
en fonction de leur pathogénécité et leur résistance aux antibiotiques et leur implication dans
40

les intoxications alimentaires. Toutes ont été aimablement fournies par le laboratoire de
microbiologie de la société pharmaceutique (Aldaph-Novonordisk) sise à la zone industrielle
Oued-Aissi de Tizi Ouzou. . Quant à la levure Candida albicans, elle a été procurée au CHU
Nedir Mohamed.
II.2. Méthodes
II.2.1. Vérification des souches de référence
Afin de vérifier la pureté de la souche utilisée nous avions effectué des examens
microscopiques et macroscopiques en faisant un état frais, une coloration de Gram à partir de
chaque boite.
II.2.1.1. Examen macroscopique (Observation macroscopique à l’œil nu)

Cette observation repose sur des critères morphologiques tels que l’aspect des colonies.
II.2.1.2. Examen microscopique
a. Etat frais
L’observation microscopique de l’état frais permet d’observer la morphologie, le

regroupement et la mobilité des cellules vivantes.
 Mode opératoire
- Déposer sur une lame une goutte d’eau physiologique stérile

- Prélever une fraction de culture et l’incorporer à la goutte d’eau.
- Recouvrir d’une lamelle sans enfermer de bulles d’air et sans faire déborder la suspension.
- Observer à l’objectif (G10x40)
 Critère d’acceptation
Observation de la mobilité : une bactérie est mobile si à l’état frais on observe un

déplacement dans le sens inverse du courant de la suspension.
Observation de forme de la bactérie : il existe 02 formes différentes de bactéries cocci

ou bacille.
b. Coloration de Gram
En plus de la morphologie et du mode de regroupement des cellules bactériennes, la

coloration de Gram, permet de différencier entre les deux types de bactéries (Gram+ et
41
Gram-) selon la capacité des différentes structures de la paroi bactérienne à retenir ou non la
coloration violette du violet de gentiane.
La technique de la coloration de Gram est réalisée selon les étapes suivantes :
 préparation des frottis

- Déposer sur une lame une goutte d’eau physiologique stérile
- Prélever stérilement une fraction de culture et l’incorporer à la goutte d’eau pour
obtenir une suspension homogène.
- Sécher et fixer le frottis à la chaleur au-dessus de la flamme du bec bunsen.
 Coloration
- Recouvrir la lame de violet de Gentiane. Laisser agir 01 minute et rincer à la pissette
d’eau déminéralisée.
- Recouvrir la lame d’une solution de lugol. Laisser agir 1 minute et rincer à la pissette
d’eau déminéralisée.
- Décolorer la lame à l’aide d’Ethanol à 95° pendant 5 à 10 secondes et rincer aussitôt à
la pissette d’eau déminéralisée.
- Recouvrir la lame de la fuschine diluée à 1/10. Laisser agir 30 secondes et rincer à la
pissette d’eau déminéralisée.
- Sécher la lame et observer à l’immersion, objectif x100.
- La coloration permet de séparer les bactéries en 02 groupes :
- Une coloration en « rose » indique des bactéries « Gram négatives ».
- Une coloration en « violet » indique des bactéries « Gram positives ».
L’Observation microscopique du champignon Aspergillus niger repose sur l’analyse

des paramètres microscopiques tels que l’aspect du mycélium, des spores, etc. (GUIRAUD et
al., 2004).
II.2.2. Préparation de la suspension microbienne et des solutions des agents

antimicrobiens
II.2.2.1. Préparation de la solution du chitosane
La solution du chitosane est obtenue en pesant 2g du chitosane stérile (utilisant la

balance de précision) qui est ensuite introduit dans 1 litre d’acide acétique, qui constitue le
volume nécessaire pour que le chitosane atteigne la saturation maximal en terme de solubilité
dépendante du degré de désacétylation (POIRIER, 2000), au-delà de ce volume d’acide
acétique pour 2g du chitosane, la solution commence a devenir visqueuse.
Notre solution du chitosane a été préparée a partir d’un volume de 10ml de l’acide
acétique et une quantité de 0,02g de chitosane stérile avec une agitation modérée, la solution
est ensuite autoclavée.
42
II.2.2.2. Préparation des solutions d’acide lactique
Préparer des dilutions de l’acide lactique à différentes concentrations dans de l’eau

distillée stérile: 2%, 4% et 6% puis autoclaver pour éviter toute contamination.
II.2.2.3. Préparation de la suspension bactérienne et de levure
Pour la réalisation de cette étape, nous avons suivi la méthode de standardisation

suivante :
D’abord, les souches conservées à 4°C sont repiquées sur le milieu MH, puis incubées
à 37 °C pendant 24h pour les bactéries et sur le milieu Sabouraud à 22°C pendant 48h pour
les levures et moisissures.
Une à deux colonies bien isolées sont prélevées dans 1ml de l’eau physiologique,
après agitation au vortex la standardisation de la suspension à 107 UFC / ml est mesurée à
l’aide d’un densitomètre.
Nous admettons qu’une densité de 0,5 à 0 ,6 qui correspond à 107 UFC / ml.
II.2.2.4. Préparation de la suspension de spores

Les spores des jeunes cultures (cultures de 3 jours) sont récupérées par un grattage
soigneusement effectué en surface du milieu de culture (boites de Pétri préalablement incubées),
et mise en suspension des spores dans un volume de 5 ml d’eau physiologique stérile, la
suspension ainsi obtenue, est considérée comme suspension mère, elle était utilisée pour préparer
les différentes dilutions dans des tubes à essai contenant 9 ml d’eau physiologique stérile.
Après une bonne agitation du tube, pour avoir une répartition homogène des spores
dans l’eau physiologique, nous avions procédé au comptage des spores à l’aide d’une cellule
THOMAS et le microscope photonique. L’évaluation de la densité optique (DO) de la
suspension fongique a été également effectuée à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur
d’onde de 630 nm dans le but de standardiser la suspension de spores à 107 spores/ml. Une
DO de 0,04 correspond à une concentration de 107 spores/ml (NABET, 2009).
a. Principe de dénombrement avec la cellule THOMAS

La cellule THOMAS est une lame spéciale quadrillée (Figure 9) qui permet le
comptage de différents types de cellules. Elle a été utilisée dans notre travail pour déterminer
la concentration en spores d’une solution (nombre de spores par ml). La lamelle est placée à
une certaine distance du quadrillage délimitant un volume de 10-3 ml.
43
Figure 9: Schéma d’une cellule de THOMAS
A l’aide d’une pipette Pasteur, quelques gouttes de la solution de spores ont été
prélevées puis déposées sur la cellule THOMAS. Ensuite une lamelle est placée par-dessus et
un comptage est effectué par observation (G10x40). Des dilutions sont réalisées pour obtenir
une suspension de l’ordre de 107 spores /ml.
II.2.3. Méthodes utilisées pour détecter l’effet antimicrobien de chitosane, de l’acide

lactique et de leur combinaison
La sensibilité des six souches microbiennes au chitosane, à l’acide lactique et à leur

combinaison a été évaluée par :
 la méthode de l’antibiogramme standard par diffusion sur gélose Mueller Hinton

(méthode des disques) ;
 la méthode des puits ;
 la méthode des spots.
II.2.3.1. La méthode de l’antibiogramme
Selon les recommandations du Comité Français de l’Antibiogramme de la Société

Française de Microbiologie (CA-SFM, 2009), les disques d’antibiotique sont remplacés par
des disques imprégnés avec l’un des deux agents ou de leur combinaison.
Selon la méthode décrite par FALLEH et ses collaborateurs (2008), la gélose Muller
Hinton, coulée dans des boites de Pétri de 6 cm de diamètre, est ensemencée par
écouvillonnage, avec la souche test à partir d’une suspension à 107 UFC/ml.
Des disques de 6 mm de diamètre, obtenus par découpage du papier wattman N0 4, ont

été préalablement stérilisés et déposés au centre de chaque boite de Pétri. Les disques sont
imprégnés individuellement de 5μl d’agent antimicrobien pur. Un témoin négatif est aussi
réalisé afin d’écarter son effet.
44
Les boites sont laissées 15mn à température ambiante avant d’être incubées à 37°C
pendant 24h pour les quatre souches bactériennes et à 22°C pendant 48h pour les levures et
moisissures. Le diamètre des zones d’inhibition est mesuré et les résultats sont exprimés en
(mm).
II.2.3.2. La méthode des puits
Elle consiste à déposer à l’intérieur d’un puits creusé dans une gélose inoculée dans la
masse (Figure 10) par une souche bactérienne cible : E. coli, P. aeruginosa, B. subtilis, S.
aureus, une quantité de substance antimicrobienne (acide lactique, chitosane seuls ou
combinés) à évaluer puis voir s’il y’aura formation ou non de la zone d’inhibition.
Après la dilution de l’acide lactique dans l’eau distillé stérile, nous avions préparé des
gammes de concentration différentes à commencer du pur à celui de : 6% ; 4% et 2%.
Dans chaque boite Pétri nous avions déposé 500μl de la culture bactérienne de 17à 18
heures, une pré-culture d’une durée nécessaire pour atteindre la phase de croissance
exponentielle. Puis, nous avions mélangé avec le milieu de culture (Mueller Hinton) pour les
bactéries et milieu Sabouraud pour les levures et les moisissures. Après la solidification de la
gélose, nous avions formé les puits et déposée à l’intérieur 60μl de l’agent antimicrobien
(acide lactique) à différentes concentrations pour chaque bactérie.
Après dépôt, toutes les séries de boites ont été incubées à l’étuve réglée à 37°C pour
les bactéries et à 22-30°C pour les levures et moisissures.
Boite Pétri
Souche a testé
Milieu de culture
Puits inclut l’agent antimicrobien
Zone d’inhibition (D)
Croissance microbienne
Figure 10: Représentation schématique de la méthode des puits (ZAIKA, 1988)
45
II.2.3.3. La méthode des spots
Dans la boite de Pétri, verser 15ml de la gélose (MH pour les bactéries et Sabouraud
pour les levures et moisissures), après solidification rajouter la deuxième couche qui contient
3ml du milieu mélangés à différents volumes de l’agent antimicrobien. Après solidification,
des spots de 5μl ont été déposé à l’aide d’une micropipette selon le germe a tester. (JEAN-
LUC, 2014).
II.2.4. Détermination de la concentration minimale inhibitrice
La concentration minimale inhibitrice (CMI) correspond à la plus petite concentration

de la substance antimicrobienne pour laquelle aucune croissance microbienne n’est observée
après 24h pour les bactéries et après 48h pour les levures et moisissures (KHOBZAOUI, 2014).
Nous avions procédé à la détermination de la CMI par la méthode de dilution en

milieu solide décrite dans la pharmacopée européenne (OIE, 2008).
Le principe de la méthode consiste à diluer directement l’agent antimicrobien à tester

dans le milieu de culture gélosée solide et à inoculer ce milieu avec les microorganismes par
la suite.
En diluant différentes concentrations de l’agent antimicrobien, on peut définir la

valeur la plus faible à laquelle on n’observe pas de croissance de microorganisme et donc une
inhibition de la croissance.
 Protocole expérimental
A. Préparation de la gamme de dilution des agents antimicrobiens
- Liquéfier les milieux (MH) et (SAB) à 95°C au bain marie.

- Préparer des dilutions de 2%, 4% et 6% de l’acide lactique et des différents volumes
de chitosane et on procède pour chaque microorganisme comme suit :
- préparer une série de boites pétri contenant 15ml de gélose, laisser solidifier puis
ajouter la deuxième couche contenant 3ml du milieu MH ou SABOURAUD et des
volumes différents de l’agent antimicrobien utilisé ; chitosane ou acide lactique puis
homogénéiser ;
- Laisser les boîtes de Pétri sur la paillasse pour la solidification du milieu.
B-Inoculation des souches microbiennes
A partir de chaque suspension microbienne à 107UFC/ml, à l’aide d’une micropipette,
déposer en spot chacune des six souches microbiennes (WIEGAND, HILPERT and
HANCOCK, 2008).
46
La première série de boites est inoculée avec quatre souches bactériennes puis
incubées à 37°C pendant 24h, tandis que la seconde série de boites est inoculée avec les deux
souches de levures et moisissures puis incubée à 22°C pendant 48h.
II.2. 5. Détermination des concentrations minimales bactéricides (CMB)

La CMB est définie comme la concentration la plus faible de l'agent antimicrobien qui
détruit 99,9% de la concentration cellulaire finale. Après la détermination de la CMI, les
boites contenant les concentrations en substance d’agent antimicrobien strictement supérieures à
la CMI vont servir pour la détermination de la CMB. (KHOBZAOUI, 2014).
Pour ce faire, les boites qui ne présentent pas de croissance vont être transférés faisant
un grattage dans d’autres boites de Pétri contenant de la gélose (MH ou bien Sabouraud).
Les boites sont incubées dans une étuve à 37°C pendant 24h pour les bactéries et 22-
30°C pendant 48hpour les levures et moisissures. Cette technique nous permet de vérifier si
les cellules sont viables et cultivables. La boite de la CMB renferme un nombre de colonies
inférieures à 3 (PRESCOTT et al., 1995).
47
Résultats & discussion
Les observations microscopique et macroscopique ont permis de confirmer l’identité

des souches microbiennes utilisées, ainsi que leur pureté.
I. La sélection des échantillons du chitosane
Après avoir effectué un teste d’activité antimicrobienne de façon comparative sur les
échantillons de chitosane, nous avions observé que l’échantillon n°3 obtenu avec un traitement de
deux heurs 30 minutes dans la solution de NaOH, possède un effet antimicrobien important par
rapport aux autres échantillons. En effet, il en ressort que l’effet inhibiteur du chitosane sur la
croissance de E.coli augmentait en fonction du degré de désacétylation (concentration optimale).
Cette différence observée dans l’activité antimicrobienne pourrait s’expliquer par le degré de
désacétylation qui diminue au fur et à mesure que le temps de traitement avec NaOH augmente.
Nos observations sont similaires à celles de LIU et al. (2001) et de PARK et al.(2004)
qui ont rapporté que le chitosane ayant un degré de désacétylation de 75% (concentration
optimale) présente une meilleure activité antimicrobienne contre des bactéries Gram-positives
et des bactéries Gram-négatives comparativement aux chitosanes avec un degré de
désacétylation de 90% et 50%.
La majorité des études rapportées dans la littérature sur l'activité antimicrobienne du

chitosane porte sur l'effet du poids moléculaire du chitosane ou sur l'effet de son degré de
désacétylation. Cependant, peu d'études ont été consacrées à l’effet de la combinaison entre
différents degrés de désacétylation et différents poids moléculaires du chitosane sur des
Microorganismes pathogènes alimentaires.
II. Evaluation de l’activité antimicrobienne
L’effet antimicrobien du chitosane, de l’acide lactique, ainsi que leur combinaison sur
six souches microbiennes : E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. subtillis, C. albicans et A.
niger a été évalué en utilisant la méthode de l’antibiogramme standard par la méthode de
diffusion sur gélose Mueller Hinton (méthode des disques).
Cette technique présente l’avantage d’être d’une grande souplesse et de s’appliquer sur
un grand nombre d’espèces microbiennes.
L’action antimicrobienne se traduit par l’apparition d’une zone d’inhibition autour du

disque de papier imprégné de l’agent antimicrobien étudié (chitosane et acide lactique dans
notre cas). La lecture des résultats a été élaborée par la mesure des diamètres des zones
d’inhibition autour des disques (diamètre du disque inclus).
49
Selon les intervalles des zones d’inhibition établis par DE BILLERBECK (2007),
l’activité antimicrobienne des extraits ou des composés purs est classée selon le diamètre de la
zone d’inhibition (Ø) comme suit :
 Souche résistante (6 mm qui est le diamètre du puit creusé) ;

 Souche intermédiaire (Ø < 13 mm) ;
 Souche sensible (Ø > 13 mm).
Malheureusement, les premiers tests effectués par cette technique n’ont pas produits
des résultats satisfaisants, pour cela nous avions eu recours à une autre méthode qui est la
méthode des puits.
Après avoir introduit 60 μl de chaque dilution d’acide lactique dans chaque puits pour
chaque microorganisme, une inhibition de croissance microbienne résultant de l’action de
l’agent antimicrobien se traduit lors de l’incubation par la formation d’un halo (zone
d’inhibition) dont le diamètre varie selon la concentration et la diffusion de l’agent
antimicrobien. La diffusion du composé dans la gélose est dépendante de la diffusibilité du
composé, de la durée de migration, de la distance de migration et de la concentration du
composé (COOPER, 1955).
Les diamètres des zones d’inhibition obtenus avec les souches bactériennes utilisées
dans ce test sont illustrés dans le Tableau VIII et Figure 11.
Tableau VIII: Effet de l’acide lactique sur les souches bactériennes (méthode des puits).
Acide lactique
Pur 6% 4% 2%
E. coli 32 mm 17mm 14mm 7mm
Les bactéries
Bacillus subtillis 28mm 15mm 10mm 9mm

Staphylocoque 30mm 16mm 12mm 9mm
aureus
Pseudomonas 32mm 18mm 13mm 10mm
aeruginosa
Acide lactique pur
50
E. coli
B. subtillis
S. aureus
P. aeruginosa
Figure11 : les zones d’inhibition des souches bactériennes traité avec de l’acide lactique
utilisant la méthode des puits
L’inconvénient majeur rencontré avec cette technique est que nous avions obtenus des
résultats négatifs en utilisant le chitosane, c-à-d qu’aucune zone d’inhibition n’a été observée
après incubation (développement d’un tapis bactérien sur toute la surface du milieu de
culture) dans les boites contenant le chitosane suivant le même processus et les mêmes
quantités que l’acide lactique. Pour cette raison, nous avions eu recours à une autre technique
qui est la méthode des spots.
51
III. Effet de l’acide lactique sur les souches microbiennes (méthode des spots)
Après incubation, l’application des volumes de l’acide lactique dans 3ml du milieu
(deuxième couche) a révélé que les effets inhibiteurs de l’acide lactique sur la croissance
microbienne observé sont variables selon la souche considérée. Comme le montrent les
Figures 12, 13 et 14, il y a une inhibition totale de E. coli et P. aeruginosa à partir de 50μl de
solution d’acide lactique. Dans le cas de S. aureus, B. subtillis, C. albicans est obtenue à partir de
100μl. Par contre pour A. niger nous avions obtenu des résultats contradictoires, c-à-d. il y a
croissance partout en utilisant des volumes différents (Figure 15).
Les résultats de l’effet antimicrobien de l’acide lactique sur les souches testées
obtenus par la méthode des spots sont résumés dans le Tableau IX :
Tableau IX: effets de l’acide lactique sur les souches microbiennes testées
(Méthode des spots).
Les concentrations (les volumes)

pur 10 μl 20 μl 30 μl 40 μl 50 μl 100 μl
E.coli Pas de croissance croissance croissance croissance Pas de Pas de

Les souches microbiennes
croissance croissance croissance

B.subtilis Pas de croissance croissance croissance croissance Croissance Pas de
croissance croissance
S.aureus Pas de croissance croissance croissance croissance Croissance Pas de
croissance croissance
P.aeruginosa Pas de croissance croissance croissance croissance Pas de Pas de
pure 50 μl 100 μl 150 μl 200 μl 250 μl 300 μl
C.albicans Pas de croissance Pas Pas Pas Pas de Pas de
croissance croissance croissance croissance croissance croissance
A. niger croissance croissance croissance croissance Croissance Croissance Croissance
Les résultats expérimentaux présentés dans le tableau IX montrent l’effet

antimicrobien très significatif de l’acide lactique sur toutes les souches sauf A. niger ;
Ceci confirme la sensibilité de toutes ces souches à l’acide lactique sauf A. niger qui
montre une résistance à l’acide lactique (l’acidité favorise le développement des champignons).
L’action antimicrobienne de l’acide lactique correspond à l’un des mécanismes d’action des
52
bactéries lactiques sécrétant un métabolite à effet inhibiteur de la flore microbienne (ROUSE

et al., 2008).
Selon les travaux rapportés dans la littérature scientifique, ces résultats s’expliquent
par la différence dans la nature des souches microbiennes utilisées. Certains genres et espèces
semblent plus actifs que d’autres, l’inhibition des levures généralement est difficile par
rapport à l’inhibition des moisissures, de même, la germination des conidies est la phase de
croissance la plus sensible à l’inhibition et la différence de sensibilité observée entre les
espèces des moisissures peut être liée à leur capacité à changer le métabolisme cellulaire en
réponse à des conditions de stress (GEREZ et al., 2009; DELAVENNE et al., 2013; GUPTA
et SRIVASTAVA, 2014).
Les acides organiques (métabolites microbiens) comme l’acide lactique sont connus
pour leur grande activité antimicrobienne, ils franchissent la membrane bactérienne et
peuvent ainsi perturber le fonctionnement de certains enzymes microbiennes.
E.coli
Témoin négatif 40μl 50μl
P. aeruginosa
Figure 12 : Effet de l’acide lactique sur E.coli et P. aeruginosa
B. subtillis
53
S.aureus
Figure13 : Effet de l’acide lactique sur B. subtillis et S. aureus
C. albicans
Témoin négatif 100μl 150 μl
Figure 14 : Effet de l’acide lactique sur C. albicans
A. niger
Témoin négatif Acide lactique 6% Acide lactique pur
Figure15 : Effet de l’acide lactique sur A. niger
De nombreux produits alimentaires se conservent grâce à un pH faible, soit parce

qu’ils contiennent naturellement une teneur élevée en acides organiques (par exemples :
produits fermentés comme les yaourts, choucroutes…), soit parce que des acides leurs sont
volontairement ajoutés (confiseries, boissons…). Dans ces produits, l’acidité participe à la
conservation, mais est également recherchée pour la saveur qu’elle apporte. A l’inverse, dans
certains produits (plats cuisinés, panification), c’est l’effet conservateur sans la saveur acide
qui est recherché.
En effet, selon CHENE (2002) les acides ont un double effet antimicrobien : un effet
via l’acidification qu’ils engendrent, et un effet spécifique à l’acide utilisé. :
54
L’effet acidifiant se manifeste lors de l’ajout d’acide, ceci provoque une diminution du
pH externe qui va entraîner une baisse du pH interne des micro-organismes et ainsi inhiber
leur développement. Mais, tous les microorganismes n’ont pas la même sensibilité au pH, tout
d’abord, le pH interne varie d’un micro-organisme à l’autre (6,5 pour les acidophiles à 9 pour
certains alcalophiles), ensuite, certains comme les bactéries fermentaires par exemple
supportent de plus grandes variations de pH interne que d’autres. Enfin, une variation du pH
externe d’une unité peut engendrer des variations de 0,1 à 1 unité de pH interne selon le
micro-organisme, c’est pourquoi, chaque micro-organisme est caractérisé par un seuil de pH
en dessous duquel il ne se développe pas.
L’effet spécifique correspond à la nature de l’acide : les acides forts (acide

chlorhydrique par exemple) jouent un rôle uniquement sur le pH externe de la cellule. Par
contre, les acides faibles étant lipophiles, sont capables de traverser la membrane et ainsi
d’agir directement sur le pH cytoplasmique. Les acides organiques étant pour la plupart des
acides faibles, ils vont donc agir plus efficacement pour inhiber les microorganismes.
Les acides sont caractérisés par une valeur dite de pKa qui correspond au pH auquel il
y a équilibre entre les formes dissociées (COO-) et non dissociées (COOH) : au plus le pH est
inférieur au pKA, au plus l’acide est sous forme non dissociée. Or, c’est cette forme non
dissociée qui a un effet spécifique (en plus de l’effet acidifiant) sur les micro-organismes.
D’après METZNER et al.(2004), au niveau de la bactérie cible, les premières

structures touchées par l’acidification du milieu extracellulaire sont évidemment les
macromolécules de surface(flagelle, pili, récepteur chimique, protéines periplasmiques,
paroi,…etc).Ainsi, les bactéries cibles ont peu de possibilités de protéger ces structures : soit
elles modifient la structure des sites de fixation des composés acides au niveau de leurs
membranes, soit elles évitent la perte de mobilité suite au stress acide en modulant ou en
utilisant une voie métabolique alternative. De même DILWORTH et al. (1999) ont souligné
que si les bactéries cibles n’arrivent pas à modifier la structure des sites ou trouver une
alternative pour éviter la perte de mobilité due au stress acide, les protons vont entrer dans la
cellule par le changement de gradient de concentration autour de la paroi bactérienne. Selon
FOSTER (1999), la baisse du pH intracellulaire provoquée par cet afflux de protons entraine
des perturbations de flux métabolique et des dommages au niveau des macromolécules de
surface. Cette baisse de pH intérieur va aussi favoriser l’oxydation des lipides modifiant ainsi
leur état d’ionisation et de ce fait, leurs propriétés d’interaction avec les autres constituants
cellulaires. Le même phénomène a été observé pour les protéines pour lesquelles une
diminution du pH va entrainer une augmentation des charges positives, donc une modification
de leur état d’ionisation qui va d’un coté, modifier leur configuration spatiale et altérer leur
fonctionnalité, et d’un autre coté, perturber la transcription des gènes. L’ADN lui-même sera
affecté par cette baisse de pH qui va altérer les bases puriques et pyrimidiques et ainsi le
fragmenter (COTTER et al., 2003)
55
DJENANE (2011) a rapporté que l’acide lactique peut franchir la membrane cellulaire
des bactéries, en se dissociant à l’intérieur de cytoplasme. Les molécules chimiques issues
lors de cette dissociation peuvent interférer avec les fonctions vitales de la cellule bactérienne
(EKLUND, 1989). En outre, cette dissociation provoque une augmentation du nombre de
protons à l’intérieur de la cellule bactérienne jusqu’au moment où la concentration des
protons excède la capacité tampon du cytoplasme. Ces derniers seront transportés vers
l’extérieur à travers une pompe de protons, diminuant ainsi les réserves énergétiques de la
cellule. Quand ces réserves sont épuisées, la pompe de protons cesse de fonctionner, et le pH
interne diminue lentement, provoquant ainsi l’altération des protéines et la déstabilisation des
autres composés structurels et fonctionnels de la cellule bactérienne, interférant ainsi dans les
fonctions vitales de cette dernière (PIARD et DESMAZEAUD, 1991).
IV. Effet du chitosane sur les souches microbiennes (méthode des spots)
Suivant la technique des spots comme celle utilisée pour l’effet de l’acide lactique sur
les souches microbiennes, un effet inhibiteur du chitosane sur la croissance microbienne a été
observé, selon la souche considéer. Les résultats obtenus sont indiqués dans le Tableau X.
Tableau X : Effets du chitosane sur les souches bactériennes et fongique.
Les concentrations (les volumes)

200 μl 400 μl 600 μl 800 μl 1000 μl 1500 μl 2000 μl
E. coli Croissance croissance croissance croissance Pas de Pas de Pas de
B. Croissance croissance croissance Pas de Pas de Pas de Pas de
microbiennes
Les souches
subtilis croissance croissance croissance croissance

S.aureus Croissance croissance croissance Pas de Pas de Pas de Pas de
croissance croissance croissance croissance
P.aerugin Croissance croissance croissance Pas de Pas de Pas de Pas de
osa croissance croissance croissance croissance
C. Croissance croissance croissance Croissance croissance Pas Pas de
albicans croissance croissance
A.niger Croissance croissance croissance Retardement Retardement Retardement Retardement
de croissance de croissance de croissance de croissance
(+) (++) (+++)
Les résultats du Tableau X montrent que l’effet antimicrobien très significatif du

chitosane sur toutes les souches, sauf pour A. niger où nous remarquons seulement un
retardement de croissance (Figure 19).Nous constatons donc une inhibition totale de la
croissance de E.coli à partir de 1000μl (Figure 16), de B. subtilis, S. aureus et P.aeruginosa
au-delà de 800μl (Figure 17). Pour C.albicans l’inhibition totale est observée à partir de
1500μl (Figure 18).
56
E.coli

Figure 16 : effet de chitosane sur E.coli
B. subtillis
P.aeruginosa
S. aureus

Figure 17 : effet de chitosane sur B. subtillis, P. aeruginosa et S. aureus
57
C.albicans

Figure 18 : Effet de chitosane sur C. albicans
A. niger

Figure 19 : Effet de chitosane sur A. niger
L’activité antibactérienne intense observée est liée probablement à la présence du

chitosane soluble dans l’acide acétique sous forme d'oligomères de chitooligosaccharides
(COS). Du fait de leurs courtes chaînes et de leurs groupes amines libres, la viscosité des COS
est plus faible et leur solubilité augmente à pH neutre. Nous pouvons considérer les COS
jusqu'à un degré de polymérisation d'environ 30. Ces COS suscitent depuis peu un grand
intérêt pour la santé humaine, principalement dans la nutrition et l'alimentation.
Des études ont démontré leur habilité à augmenter la qualité des aliments (stabilisation
pour des produits longue-durée) ainsi qu'à améliorer la santé des consommateurs. De récentes
études ont montré les effets bénéfiques des COS notamment par leurs propriétés
antimicrobiennes, anticancéreuses, antioxydantes ou encore par leurs effets immunostimulants
(JEAN et KIM, 2001, BACON et al., 2000).
Parmi les autres éléments qui influencent l’activité du chitosane, nous pouvons citer :
 L’action du chitosane est, à son maximum, à des pH faibles (6 et 6,5), puisque c’est
dans cette zone où les groupements NH2 sont protonés (le chitosane n’est soluble que dans
des acides dilués). Cependant, à des pH plus faibles (entre 1 et 4) l’activité du chitosane
58
diminue. Ceci est dû à la compétition entre les protons et les groupes ammonium (CHUNG et
al., 2003) vis-à-vis des cellules microbiennes.
 La masse moléculaire : un chitosane avec une masse moléculaire élevée semble plus
efficace contre les bactéries à Gram négatif, qu’avec les bactéries à Gram positif (NA et al.,
2002). De plus, au sein du même type de bactérie, cette influence peut varier. Par exemple,
avec Escherichia coli, bactérie Gram négatif, l’activité augmente avec la masse moléculaire
jusqu’à un certain niveau, puis elle diminue car avec l’augmentation de la masse moléculaire,
il y a plus d’interactions intramoléculaires entre les groupes ammonium et les groupes
hydroxyle du chitosane ce qui les rendent indisponibles. (LIU, 2001 ; XIE et al., 2002)
 La présence de Ca2+ et les métaux comme Zn2+, et Mg2+ diminue l’activité
antimicrobienne du chitosane, car ce dernier complexe ces métaux (CHUNG et al., 2003).
C’est d’ailleurs, ce caractère qui est mis à profit dans le traitement des eaux usées.
Néanmoins, nos résultats concordent avec ceux rapportés dans la littérature ; traitant
de l’activité antibactérienne du chitosane. Ainsi, HELANDER et al. (2001) ont signalé que
l’utilisation du chitosane à forte concentration a un effet bactéricide sur des bactéries à Gram
négatif comme l’Escherichia coli se montrant plus sensible. De même LAFLAMME et al
(1999) qui montrent que l’utilisation du chitosane à partir d’une concentration de 1 g/l réduit
considérablement la croissance des souches fongiques.
TORR et al. (2005), quant à eux, ils ont montré que le chitosane a un effet
antifongique contre Leptographium procerum et Sphaeropsis sapinea à partir d’une
concentration de 0,3 % (m/V).
ROLLER et al. (1999) ont étudié l’action du glutamate du chitosane sur la croissance
d’Aspergillus flavus, de Cladosporium cladosporioides, de Mucor racemosus, de Penccillium
aurantiogriseum et de Saccharomyces cerevisiae, dans le jus de pomme. Ils ont démontré une
action inhibitrice contre toutes ces souches à une concentration de chitosane de 5 g/l.
BLAISE OUATTARA et al. (2000) ont montré que des films obtenus à partir d’une
solution du chitosane présentent un effet inhibiteur sur les bactéries lactiques Lactobacillus
sakei.
En outre, l’enrobage des fruits par le chitosane a également permis l’inhibition de la
croissance la bactérie à Gram positif Candida lambica (DEVLIEGHERE et al 2004).
Le chitosane agit sur les bactéries à Gram positif et sur les bactéries à Gram négatif,
cependant, son action sur ces dernières est moins importante que celle qui est sur les bactéries
à Gram positif (NO et al., 2002 ; COMA et al., 2003).
59
V. Effet combiné du chitosane et l’acide lactique sur les souches microbiennes
Les résultats de l’effet antimicrobien du mélange d’acide lactique et du chitosane sur

les souches testées E.coli, P.aeruginosa, B. subtilis, S. aureus, C. albicans et A. niger sont
résumés dans le Tableau XI et Figures 21 et 22.
Tableau XI: Effet antimicrobien du mélange d’acide lactique et le chitosane sur les souches
microbiennes testées
E.coli
Acide lactique
50 μl 40 μl 30 μl 20 μl 10 μl 5 μl
1000 μl inhibition inhibition totale inhibition inhibition inhibition inhibition
totale totale totale totale totale
800 μl inhibition inhibition inhibition inhibition inhibition inhibition
totale totale totale totale totale totale
chitosane




P. aeruginosa
Acide lactique
50 μl 40 μl 30 μl 20 μl 10 μl 5 μl
chitosane




60
B. subtilis, S. aureus
Acide lactique
100 μl 80 μl 50 μl 30 μl 20 μl 10 μl

chitosane




C. albicans
Acide lactique
100μl 80μl 60 μl 40 μl 30μl 20 μl
1500 μl inhibition inhibition inhibition inhibition croissance Croissance
totale totale totale totale

chitosane
800μl inhibition inhibition inhibition inhibition croissance Croissance


400 μl Croissance croissance croissance croissance croissance Croissance
250 μl Croissance croissance croissance croissance croissance Croissance
Les résultats du tableau XI montrent que lors de la combinaison des deux agents
chitosane et acide lactique sur les souches testées, nous constatons un effet antimicrobien bien
distinct.
En effet, les bactéries se sont montrées sensibles à des volumes inferieurs à la CMI des
agents antimicrobiens, même à des volumes minimales atteignant les 50% à 75%, l’effet
inhibiteur de la combinaison des deux agents est toujours remarquable. Donc, l’effet antibactérien
de la combinaison de l’acide lactique et de chitosane est très significatif sur les bactéries en le
comparant à l’effet de chitosane et l’acide lactique utilisé séparément (Figure 20)
61
E. coli P. aeruginosa S. aureus
Figure 20 : Effet combiné de l’acide lactique et de chitosane sur les souches bactériennes
Cependant, l’effet antifongique de la combinaison de l’acide lactique et de chitosane

sur C. albicans et A. niger se traduit par une résistance remarquable.
La souche C. albicans à montrer une sensibilité importante à des volumes inferieurs à

la CMI des agents antimicrobiens. Mais au-delà de combinaison de 30μl d’acide lactique et
400μl de chitosane la souche montre une résistance à l’effet combiné de deux agents
traduisant par une croissance importante (Figure 21)
Témoin négatif 100μl d’acide lactique 20μl d’acide lactique

&1000μl chitosane &250μl de chitosane
Figure 21 : Effet combiné de l’acide lactique et le chitosane sur C. albicans
L’effet antifongique de la combinaison sur C. albicans est plus important que l’effet
antimicrobien de l’acide lactique et du chitosane utilisés seul, ce qui signifient que les fungi
sont plus sensibles pour le mélange que l’acide lactique et chitosane appliqué seul.
Toutefois, l’effet antifongique du même mélange d’agents antimicrobiens sur A. niger

n’a pas pu être effectué à cause de la souche qui présente une résistance importante vis-à-vis
de l’acide lactique et un retardement de croissance de la souche en présence de chitosane, par
ailleurs nous n’avions pas pu avoir la CMI d’A. niger.
62
Cet effet antibactérien et antifongique de la combinaison de l’acide lactique et du

chitosane obtenu est en accord avec les résultats rapportés par des études similaires comme
celle de FOSTER (1999).Ce dernier a observé que la baisse du pH intracellulaire provoquée
par un afflux de protons entraine des perturbations de flux métabolique et des dommages au
niveau des macromolécules de surface. Cette baisse de pH intérieur va aussi favoriser
l’oxydation des lipides modifiant ainsi leur état d’ionisation et de ce fait, leurs propriétés
d’interaction avec les autres constituants cellulaires, idem pour les protéines dont les charges
positives augmentent, L’ADN lui-même sera affecté par cette baisse de pH qui va altérer les
bases puriques et pyrimidiques et ainsi le fragmenter (COTTER et al., 2003)
KADOUCHE (2013), a affirmé que de façon générale la sensibilité des bactéries à

l’effet antibactérien du chitosane semble augmenter avec une diminution du pH de l’aliment.
A pH faible le chitosane sera soluble et porte de nombreuses charges positives, il y aura donc
la formation de liaisons électrostatiques entre les charges positives du chitosane par la
transformation des motifs NH2 en motifs NH3+ en milieu acide et les phospholipides de la
membrane cellulaire des microorganismes qui ont une charge négative, perturbant ainsi les
échanges entre la cellule microbienne et le milieu extérieur. Cela pourra faciliter l’entrée de
l’acide lactique après la déformation morphologique de la membrane créant des pores, cela
pourra donc entrainer une perturbation et un changement du pH dans le cytoplasme de la
cellule microbienne.
Le chitosane et l’acide lactique peuvent former des liaisons avec les protéines et les
électrolytes présents dans le cytoplasme et avec l’ADN des cellules microbiennes et donc
provoquer l’inhibition de la synthèse d’ARNm.
A pH plus élevé (˃ 6,5), le chitosane perd ses charges positives, le doublet électronique
de l’azote libre (YEN et al., 2009). Ces doublets libres et la présence de nombreux atomes
d’oxygène dans le chitosane lui permettent de se comporter comme un excellent complexant,
en particulier des métaux lourds. Par exemple, il est utilisé pour la purification des eaux, utilisé
aussi pour la récupération de métaux dans les effluents industriels.
L’efficacité de la combinaison du chitosane et de l’acide lactique pourrait apparaitre

comme une alternative intéressante pour l’industrie alimentaire lorsque les doses inhibitrices
sont réduites.
63
Selon FLAEIRO(2011), lors de la combinaison des substances antimicrobiennes, trois

effets sont à distinguer : addition, antagonisme et synergie. Pour des objectifs de quantification,
le concept de concentration inhibitrice fractionnelle (CIF) est fréquemment utilisé.
VI. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI)
Les CMIs ont été déterminées uniquement pour le chitosane et l’acide lactique
séparément, puisque c’est à l’état individuel que chacun d’eux a montré un effet
antimicrobien important qu’a l’état combiné.
Les résultats de la détermination des CMI montrent une variabilité dans la sensibilité
des souches au chitosane et à l’acide lactique. Les valeurs des CMI varient d’un
microorganisme à un autre (Tableau XII).
Plus les CMI sont faibles plus l’activité antibactérienne des agents testés est meilleure.
La meilleure CMI est obtenue par l’acide lactique testé sur les souches E. coli, P.aeruginosa
et C. albicans (CMI = 50 μl).
Tableau XII : Les valeurs de la CMI pour l’acide lactique et le chitosane

Les microorganismes CMI pour acide lactique CMI pour le chitosane
Escherichia coli 50 μl 1000 μl
Pseudomonas aeruginosa 50 μl 800 μl
Bacillus subtilis 100 μl 800 μl
Staphylococcus aureus 100 μl 800 μl
Candida albicans 100 μl 1500 μl
Aspergillus niger Pas de résultat Pas de résultat
VII. Les concentrations minimales bactéricides (CMB)
Les concentrations minimales bactéricides ont été effectuer a partir les résultats des
CMI de l’acide lactique et le chitosane sur les souches microbiennes, la CMB est appliqué en
gratant les spots des boites qui présente une inhibition total du microorganisme (CMI) puis
étaler dans d’autres boites de pétri pour chaque germe contenant le milieu MH pour les
bacteries et mileiu sabouraud pour la levure.
Les résulats montrant la croissance des bactéries traitées avec l’acide lactique et le
chitosane sont présentés dans les Figure 22 et 23.
64
CMB E.coli CMB B. subtilis CMB P. aeruginosa
CMB S. aureus CMB C.albicans
Figure 22 : le test de la CMB pour les bactéries et la levure traité avec l’acide lactique
CMB E.coli CMB B. subtilis CMB P. aeruginosa
CMB S. aureus CMB C.albicans
Figure23 : Le test de la CMB pour les bactéries et la levure traité avec le chitosane
Les résultats ainsi obtenus montrent que les deux agents ont un effet bacteriostatique
et un effet fongicide.
65
Conclusion
Conclusion générale
La présente étude avait pour objectif d’évaluer l’activité antimicrobienne de l’acide
lactique et du chitosane utilisé individuellement ou en combinaison en vue de leur utilisation
éventuelle dans le domaine alimentaire.
Les résultats obtenus nous amènent à conclure que l’acide lactique et le chitosane sont
relativement plus efficaces sur les bactéries : E. coli, B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa et
C. albicans que sur la moisissure A. niger.
Toutefois, l’effet antimicrobien de l’acide lactique, il s’est avéré plus important à des
quantités faibles pour chaque bactérie et pour C. albicans, par contre l’effet antimicrobien du
chitosane est observé à des quantités relativement élevées. L’effet inhibiteur engendré sur A.
niger n’est cependant pas négligeable.
La combinaison de ces deux agents (acide lactique – chitosane) a montré également

des résultats très intéressants laissant suggérer une possible utilisation de ces agents dans la
conservation des produits alimentaire.
Il serait intéressant de continuer cette étude en utilisant une matrice alimentaire pour
évaluer l’efficacité de ces agents antimicrobiens et déterminer leurs interactions avec les
composants alimentaires. Aussi serait- il intéressant de déterminer l’impact de ces agents sur
la flore intestinale afin de prévenir sa perturbation chez le consommateur. Il serait également
judicieux de déterminer l’impact des ces substances sur les propriétés sensorielles des
aliments traités.
66
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République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement Supérieur et de la recherche scientifique

Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou

Faculté des Sciences biologiques et des Sciences Agronomiques

Mémoire de fin d’études

En vue de l’obtention du diplôme de MASTER en biologie

Option : Biochimie appliquée

Etude de l’effet combiné de l’acide lactique

Melle : MALKI NASSIMA

Melle : BENYACOUB HAYET

Examinateur 1 : Mme Abdoune-Ouali

Promotion 2014 /2015

Au terme de ce travail, nous voulons d’abord adresser à notre

Nos remerciements s’adressent aussi à Dr KADDOUCHE Slimane qui

Que toutes les personnes ayant contribué de près ou de loin à la

On tient à remercier aussi Mr KADDOUCHE Slimane qui nous a aidés

A mon cher mari RABAH d'être toujours à mes côtés pour me

A mes frères Amayes et Massinissa pour leur disponibilité,

A ma sœur Karima d'être coopératif et d'assumer à ma place

A ma belle-famille pour leur soutien, gentillesse et sympathie.

A toute ma familles tantes et oncles et a tous mes cousins et

A ma meilleur amie Lynda sans oublier mon binôme Hayet

Figure 1: La vitesse de croissance de quelques microorganismes en fonction du pH

Figure 2: Développement des microorganismes en fonction d’activité d’eau

Figure 3: Les principales interactions aliment / microorganisme / consommateur

Figure 4: La formation de métabolites toxiques à partir de protides

Figure 5: Formes optiques de l’acide lactique (SODERGARD et STOLT ,2002).

Figure 6: Les deux isomères de l’acide lactique (REZGUI et al., 2008)

Figure7 : Structures chimique de la chitine et du chitosane

Figure 8: Le procédé d’obtention de la chitine et de chitosane ( ONSOYEN ET SKAUGRUD, 1990)

Figure 9: Schéma d’une cellule de THOMAS

Figure10: Représentation schématique de la méthode des puits (ZAIKA, 1988)

Figure11 : Les zones d’inhibition des souches bactériennes

Figure 12 : Effet de l’acide lactique sur E.coli et P. aeruginosa

Figure13 : Effet de l’acide lactique sur B. subtillis et S. aureus

Figure 14 : Effet de l’acide lactique sur C. albicans

Figure15 : Effet de l’acide lactique sur A. niger

Figure 16 : effet de chitosane sur E.coli

Figure 17 : Effet de chitosane sur B. subtillis, P. aeruginosa et S. aureus

Figure 18 : Effet de chitosane sur C. albicans

Figure 19 :Effet de chitosane sur A. niger

Figure 21 : Effet combiné e l’acide lactique et le chitosane sur C. albicans

Tableau I : Classification des facteurs d’altération des aliments

Tableau II: pH minimum de croissance de quelques germes (Chene, 2002).

Tableau III : Les domaines d’application de l’acide lactique

Tableau IV: Sources potentielles de chitine (Mathur et Narang, 1990)

Tableau V: Activité antimicrobienne du chitosane de quelque microorganismes (Liu et al., 2001)

Tableau VI: Les domaines d’application de la chitine et le chitosane (KEDDOU, 2008)

Tableau X: Effets du chitosane sur les souches bactériennes et fongiques

CDC Centre américain de contrôle des maladies

Chapitre I : Altération microbienne des aliments

Chapitre II : Les agents antimicrobiens

I. Définition des agents antimicrobiens................................................................................ 19

I. Généralités sur les agents antimicrobiens naturels ........................................................... 27

II.2.2. Préparation de la suspension microbienne et des solutions des agents antimicrobiens..... 42

Conclusion générale ................................................................................................................... 66

Cette étude vise d’une part, à évaluer l’activité antimicrobienne de chitosane,

Chitine, chitosane, acide lactique, activité antimicrobienne, combinaison.

.‫ ﻣﺰج‬،‫ وﻧﺸﺎط ﻣﻀﺎد ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‬،‫ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ و اﻟﻔﻄﺮﯾﺎت‬،‫ ﺣﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ‬،‫ اﻟﻜﯿﺘﻮزان‬،‫اﻟﻜﯿﺘﯿﻦ‬