UNIVERSIDAD NACIONAL DE AGRICULTURA

DEPARTAMENTO DE PRODUCCION VEGETAL

SINTESES DEL LABORATORIO DE FITOPATOLOGIA
PRACTICA 1- ESTERILIZACIN Y MEDIDAS ASPTICAS
METODOS DE ESTERILIZACION
1- METODOS FISICOS
A- CALOR SECO: Consiste en la exposicin al calor ya sea por medio de Horno a una T165C
por 90 minutos, tambin se esterilizan en el mechero objetos metlicos como pinzas y bisturs,
se introducen en una solucin de OH al 95% y luego se flamea.
B- CALOR HUMEDO: Este mtodo emplea la utilizacin de autoclaves u ollas de presin los
cuales someten a esterilizacin por medio de presin 15 PSI (Libras/Pulg.) a 121C de T.
2- METODOS QUIMICOS
A- ESTERILIZACIN CON TER ETLICO: La materia seca es tratada con ter etlico, el disolvente
es evaporado a una temperatura inferior a 30C. Toda la manipulacin debe hacerse bajo una
cmara de aspiracin ventilada.
B- BAO SULFOCRMICO: Es el mtodo tradicional de limpieza de la cristalera, La mezcla se
compone de: Agua1000 ml, Dicromato de potasio 100 gr, cido sulfrico concentrado 500 ml.
C- GASEOSOS Y NO GASEOSOS: Utilizacin productos clorados, yodados y alcoholes.
3- METODOS MECANICOS: Esterilizacin por filtracin es cuando un constituyente es
termolbil (sensible al calor) en solucin, puede ser esterilizado por pasaje de la solucin a
travs de un filtro en ester de celulosa cuyos poros tienen un dimetro de 0.22 micras. Este
tipo de filtracin se utiliza especialmente cuando se desea preservar las protenas que tienen
la propiedad de desnaturalizarse (termolbil).
4-ESTERILIZACIN POR RADIACIONES ULTRA VIOLETA: Los rayos ultra violeta (UV) son letales
para los organismos, por lo que se pueden utilizar lmparas UV para esterilizar medios, pero
como estos rayos tienen poca penetracin a travs de vidrios o de un espesor grande de
medio, solo son tiles en trabajos especiales.
CAMARAS ASEPTICAS: Las modernas cuentan con aire forzado y filtrado tipo cortina para
evitar la entrada de microorganismos, malos olores y agentes contaminantes con el propsito
de disminuir las contaminaciones de los medios de cultivo y el cultivo de agentes
fitopatgenos en el laboratorio.
PRACTICA 2- MEDIOS DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE HONGOS Y BACTERIAS
MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivos son mezclas de sustancias nutritivas que se
utilizan para el aislamiento, determinacin, desarrollo, reproduccin y diagnstico de aquellos
organismos productores de enfermedades en las plantas, que se comportan como parsitos
facultativos.
CARACTERISTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Nutrientes: en el medio de cultivo, debern
estar presentes elementos nutricionales tales como fuentes de carbono, nitrgenos, macro
elementos (P, K, Mg, Ca), micro elementos (Fe, Zn Mn, Cu, Mo), vitaminas, etc.
Humedad: Deber proporcionarse una humedad relativa favorable a los fitopatgenos que se
desee cultivar, generalmente requieren de 50% o ms. Temperatura: Los valores ptimos de
stas son muy variables para cada especie, pero la mayora de ellos pueden crecer en un rango
de 10 a 25 C. Este es un factor determinante para el desarrollo y reproduccin. pH: Tambin

en este caso, los valores ptimos son muy variables, pero en general los hongos fitopatgenos
se desarrollan y reproducen mejor en pH ligeramente cido, mientras que las bacteria en uno
alcalino. Luz: Este factor afecta en algunos casos la reproduccin de los fitopatgenos, pero en
general no influye. Asepsia: Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a salvo de
cualquier Contaminacin.
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Los medios de cultivo pueden ordenarse de acuerdo a su composicin o a su Consistencia,
quedando de la siguiente manera:
1.- COMPOSICIN
1.1. Medios sintticos: Son aquellos medios de cultivo en los que se conoce exactamente la
composicin de cada uno de sus componentes, por ejemplo: Agar Czapek.
1.2. Medios complejos o semisintticos: En estos la composicin de uno de los componentes
no se conoce de manera exacta, o bien se componen de sustancias naturales y sustancias
sintticas, por ejemplo: harina de maz-agar.
1.3. Medios de cultivos naturales: Se forman a partir de material vegetal natural, por ejemplo:
tejidos vegetales, frutos, vainas, tubrculos, races, etc.
2. CONSISTENCIA
2.1 Medios slidos. Contienen esencialmente agar. (2-3 %) gelatina (10-15 %) albumina etc.,
materiales que al enfriarse quedan completamente slidos. Muy empleados para el
aislamiento y la reproduccin de hongos y bacterias.
2.2 Medios semislidos. Contienen bajas proporciones de agar y gelatina, mezclados o
separados; al enfriarse permanecen en estado coloidal. Se emplean para mantener cultivos
por largo tiempo.
2.3 Medios lquidos: Son preparados sin agar, gelatina u otras sustancias solidificantes, por lo
que permanecen lquidos an al enfriarse, se emplean cuando se necesita incrementar el
inculo de hongos o bacterias.
3. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO: Los ms utilizados en nuestro laboratorio son:

3.1.- PDA (papa-dextrosa-agar) Para el aislamiento de Hongos y Bacterias

3.2.- AN (agar nutritivo) Para el aislamiento Bacterias
3.3.- AA (agua-agar) Para el aislamiento de Hongos
4. Preparacin de un medio de cultivo
4.1 Dosificar: Esta parte consiste en pesar en una balanza los gramos necesarios para
la cantidad de platos Petri a utilizar a razn de 20 ml/plato, en PDA; 39 grs. /Lt, en AN,
28 grs. /Lt, en AA, 20 grs. /Lt
4.2 Mezclar: La preparacin de la mezcla consiste en depositar los gramos totales a
utilizar del medio de cultivo en la mitad del agua destilada a utilizar para efectos de
mezcla y posteriormente ser cocinada en el plato caliente o Hot plate.
4.3 Cocinado: En el plato caliente se calibra la T de 500C y las RPM de 325, el proceso
consiste llevar la solucin a un proceso de ebullicin, por lo que al llegar a la tercera ebullicin
se le practican dos pruebas, una de grumos que consiste en mover la solucin del matraz y
verificar si en sus paredes no se observen grumos y la otra prueba es la de transparencia, la
cual consiste observar la apariencia transparente de la solucin y no con turbidez.
4.4 Autoclavado: Consiste en someter a esterilizacin el medio de cultivo, el cual esteriliza por
medio de una presin 15 PSI (Libras/Pulg.) a 121 C de T .

4.5 Vaciado en los platos Petri: Se realiza en la cmara de flujo laminar, con todas las
medidas de higiene y limpieza.

PRACTICA 3- DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES Y METODOS DE COLECTA

Los sntomas son las manifestaciones visibles de la enfermedad, los signos consisten de las
estructuras del cuerpo del patgeno. Los sntomas se agrupan en tres grandes categoras:
TIPOS DE SINTOMAS
Necrticos: Los principales sntomas son necrosis, pudriciones secas hmedas, tizones,
manchas foliares, antracnosis, cnceres, gomosis, damping off, entre otros.
Hipoplsticos: (Enanismos) Los principales sntomas son clorosis, enanismo, mosaico,
roseteado, albinismo, entre otros.
Hiperplsticos: (Gigantismos) Sntomas comunes son enrollamiento de hojas, agallas,
cnceres, entre otros.
PASOS PARA DIAGNOSTICAR

Hongos

Verifique la presencia de signo (esporas o micelio), generalmente los

hongos son los responsables del 48% de las enfermedades el sntoma
principal que causa es el necrtico sea; necrosis, pudriciones secas
hmedas, tizones, manchas foliares, antracnosis, cnceres, gomosis,
damping off, entre otros

Bacterias

Verifique la presencia de signo (exudados bacteriales), En general, los

diferentes sntomas pueden agruparse en 6 sndromes: manchas
foliares clorticas o en frutos; chancros y marchitamiento de plantas
leosas; marchitamiento en plantas herbceas; hiperplasias y
proliferacin; roas o costras; y podredumbres blandas.

Virus

La presencia de clorosis generalizada (MOSAICOS), Enanismos y

roseteado en las hojas jvenes son los sntomas comunes. Se detectan
mediante pruebas Serolgicas y anlisis moleculares como PCR
(Reaccion de en cadena de la polimerasa).

Nematodos

En el caso de nematodos se aprecia un marchitamiento y

amarillamiento generalizado y en las races la presencia de agallas
caractersticos del genero Meloidogyne sp.

CONSERVACION DE MUESTRAS
Muestras secas: En ste caso debe colocarse entre hojas de papel filtro o papel peridico.
Muestras frescas: Utilice Cmara hmeda solo en caso de Hongos y dems microorganismos
refrigerar a 4C.
Muestras en lquido: Para la conservacin de muestras en medio lquido puede usarse: Alcohol
etlico al 60% O Formol al 4% y para efectos pedaggicos la solucin de Henoff.

PRACTICA 4- AISLAMIENTO, MONTAJE, OBSERVACION Y REPRODUCCION DE HONGOS

FITOPATOGENOS CON FINES DE DIAGNOSTICO.
Montaje de Hongos para efectos de observacin: Este proceso se realiza para efectos de
observacin de las estructuras (esporas, hifas, conidios y micelio), consiste en cosechar las
esporas presentes en hojas y fruto, con la ayuda de tape transparente el cual se ubica en el
porta objetos al que posteriormente se le agrega una gota de agua y se cubre con el
cubreobjetos luego se observa en el microscopio en el objetivo de 4x, 10x y 20x.
AISLAMIENTO DE HONGOS
Realice cortes del material vegetal enfermo, en trocitos de ms o menos 5 mm. Los cortes debern
hacerse cerca de los mrgenes de las lesiones de forma tal que contengan tejido sano y enfermo
Despus sumrjalos en un plato petri conteniendo NaClO (hipoclorito de Sodio) al 0.5-1 % durante
1 minuto aproximadamente.
El tejido vegetal se esteriliza superficialmente de la siguiente manera: 1 minutos en agua esteril,
Finalmente transfiera de 4 trocitos de tejido desinfectado a un plato petri conteniendo medio de
cultivo PDA, colocndolos en forma equidistante. Y por ltimo sellar y rotular. Por lo que entre 2448 Horas se puede observar su crecimiento.
PRACTICA 5-AISLAMIENTO, OBSERVACIN Y DIAGNOSTICO
DE BACTERIAS FITOPATOGENAS
En esta prctica solo se hacen tres actividades: Estriado Bacterial en medio de cultivo AN
(Agar Nutriente), Test de Flujo y Microcorrida

Microcorrida: Se utiliza en el caso de manchas foliares. Un pequeo corte de la zona de avance

de la mancha foliar es colocado en un portaobjeto se le agrega una gota de agua y es observado
bajo microscopio. El flujo bacteriano se observa como una pequea nube descargndose desde
el tejido vegetal.
Test de Flujo: Se utiliza en el caso de bacterias vasculares. Un trozo del tallo supuestamente
atacado por alguna bacteria vascular es cortado y se coloca suspendido en un vaso de agua. En
este caso las bacterias fluyen (se descargan) hacia al agua. Se observa a simple vista.
Preparacin de estriados: Como las bacterias se encuentran por millones en el tejido infectado, se
cortan pedazos del mismo de aproximadamente 1 cm, se desinfectan durante 2 minutos en
hipoclorito de sodio al 0.5% o clorox y luego se lavan con agua destilada estril por 1-2 minutos.
Posteriormente, en un tubo de ensayo con 5 cc de agua estril se colocan trocitos de tejido infectado
y se dejan por varios minutos (15 - 20) hasta que las bacterias se difundan en el agua, es decir que
se produzca el exudado bacteriano. Para acelerar este proceso se puede agitar el tubo de ensayo.
Luego con una asa estril o una pipeta pasteur se transfiere una gota de esa solucin inicial al medio
de cultivo puro que se encuentra en el plato petri y seguidamente se distribuye la gota sobre la
superficie del medio, haciendo estras en forma de zigzag de lado a lado del plato petri. Finalmente,

los platos petri se incuban a temperatura ambiente, ms o menos 26C en incubadora a 27-30C y
se espera el aparecimiento de las colonias entre 48 y 72 horas despus.

PRACTICA 6- IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS

En esta prctica se hacen las pruebas quimicas que son: catalasa, KOH 3% y tincion de gram,
para identificar si son bacterias C
Tincin de Gram. Se refiere al hecho de que algunas clulas despus de ser tratadas con un
colorante conservan un color prpura (Gram positivas), mientras que otras se tornan de color
rojo (Gram negativas). La prueba de crecimiento en condiciones anaerbicas es utilizada para
la identificacin del gnero Erwinia.

A. Procedimiento para tincin de Gram rpido

1. Frotar con una asa una colonia de bacterias sobre un porta objeto. Acercar la parte inferior de
este a la flama para secar y fijar las bacterias.
2. Colocar con el cristal violeta y mantener el porta objeto en esta solucin (A) por 1 minuto.
3. Lavar con agua corriente durante algunos segundos, absorber el exceso de agua con papel
secante.
4. Aadir la preparacin con solucin (B) (lugol) por 1 minuto.
5. Lavar con agua.
6. Decolorar con alcohol etlico 95% o acetona (solucin C) por algunos segundo (20seg.).
7. Lavar con agua abundante.
8. Colorear con safranina (solucin D) durante 10 a 15 segundos.
9. Lavar con agua, dejar secar y observar la lmina al microscopio con el objetivo de 100X
utilizando aceite de inmersin.
Las gram (-) se observan color Rojo y las gram (+) color purpura.
Prueba de KOH. Se basa en la resistencia de la pared celular de las bacterias gram
positivas al tratamiento con una solucin de hidrxido de potasio (KOH) al 3%. Para
realizar esta prueba se coloca una gota de KOH y una pequea masa bacterial y se mezcla.
Si despus de 10 segundos se aprecia una masa viscosa es indicativo de una Gram negativa,
si no se observa la viscosidad es una bacteria Gram positiva (Bustamante, 1993).
Prueba de catalasa. La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias
aerbicas y facultativas anaerbicas. El perxido de hidrgeno es uno de los productos
finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el
microorganismo. La catalasa convierte el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno
de acuerdo a la siguiente reaccin:

Catalasa
2H2O2

2H2O2+O2

PRACTICA 7- AISLAMIENTO Y OBSERVACIN DE NEMATODOS FITOPARASITOS

CON FINES DE DIAGNOSTICO

METODOS DE EXTRACCION DE NEMATODOS

EMBUDO DE BAERMANN
TCNICA TAMIZADO CENTRIFUGADO
FIJACION DE NEMATODOS EN PLACAS
Nematodo de Vida Libre: No posee estilete y tiene mayor movilidad
Nematodo Fitoparasito: Tiene estilete y su movilidad es ms lenta
Hembra: es ms grande que el macho, por lo tanto tiene ms rganos y su vista es ms oscura
al ser vista al microscopio.
Macho: Es transparente al observarse en el microscopio y es pequeo en comparacin al
tamao de la hembra
ANEXOS FOTOS DE ESPORAS Y BACTERIAS VISTAS AL MICROSCOPIO