i

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE LA MIXTECA

DETERMINACIN DE ANTOCIANINAS, FENOLES TOTALES Y
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN LICORES Y FRUTO DE MORA

TESIS
PARA OBTENER EL TTULO DE:
INGENIERO EN ALIMENTOS

PRESENTA:
DIANA ELIZABETH LEYVA DANIEL

DIRECTORES:
M. en C. CARLOS GUILLERMO HERNNDEZ
DRA. ROSA ISELA GUZMN GERNIMO

HUAJUAPAN DE LEN, OAXACA, MXICO. SEPTIEMBRE DE 2009

i











El proyecto se realiz en los laboratorios de Investigaciones Qumico Biolgicas
del Instituto de Agroindustrias de la Universidad Tecnolgica de la Mixteca (UTM),
en los laboratorios de docencia de la carrera de Ingeniera en Alimentos (Qumica
y Taller de procesamiento de alimentos) de la UTM y en los laboratorios de
Ciencias Bsicas y Unidad S.A.R.A (Unidad de Servicios de apoyo en Resolucin
Analtica) de la Universidad Veracruzana.


ii

DEDICATORIAS





De forma muy especial a mis padres por su apoyo y confianza, a mis hermanas Itzel
y Lis por creer en m y a Ciro por su enorme comprensin, paciencia y cario.


iii

AGRADECIMIENTOS

A mis padres por el esfuerzo que han hecho para que se realicen mis sueos, por ser
siempre la fuente de confianza y formar realmente un ncleo en mi vida.
A mis hermanitas porque juntas lo hemos logrado, y a toda mi familia, que han sido parte del
proceso.
A la Dra. Rosa Isela Guzmn Gernimo por confiar en m, apoyarme en todo momento,
revisar este documento y ayudarme a darle sentido. Al M. en C. Carlos Guillermo, por el
apoyo proporcionado e inters en el proyecto.
A mis compaeritos y amigos de generacin, Ana Gabriel, Pavis, Lucy, Sahadi y Fi, por
hacer que este camino tan largo fuese ms divertido. A Irma, Mayra, Gina y Balbi por enorme
apoyo y amistad. A mis grandes amigas Alma Vzquez y Feli.
Al Dr. Iigo Verdalet Guzmn por su hospitalidad durante mi estancia en los laboratorios de
la Universidad Veracruzana y al Dr. Erick Silva Hernndez por su apoyo en la parte
estadstica de esta tesis, a la Unidad S.A.R.A y todo el personal que hicieron que mi estancia
fuera muy agradable.
A la Dra. Nora Elia Aquino Bolaos por sus consejos y amistad brindados. A todos los
amigos que hice en Xalapa, a Eva, Araceli, Laura, Tania, Nadia, Marco
A mi Ciro, por ser la persona ms paciente, tierna y amorosa, gracias por estar a mi lado y
creer en m, sabes que las cosas que hago llevan tu esencia.
Mil gracias a mi Universidad y a todas las personas que laboran en ella, porque durante este
proceso de aprendizaje han sido los mejores.
Gracias a todos mis profesores de la carrera, por todos los conocimientos compartidos. En
especial a la MC. Paula Guadarrama, MC. Jess Godofredo Lpez Luna, a la Dra. Norma F.
Santos Snchez, al Dr. Ral Salas Coronado y al MC. Vania S. Robles porque fueron un
verdadero ejemplo de entrega y dedicacin a la investigacin.

iv

RESUMEN




Los vinos son una fuente de fenoles, sustancias que ofrecen una accin protectora al
organismo contra enfermedades crnico-degenerativas. Adems de los vinos, existen
bebidas alcohlicas elaboradas a partir de frutos que poseen una alta concentracin de
fenoles como es el licor de mora que es un producto tpico elaborado en la regin de Xico,
Veracruz a partir del fruto maduro de zarzamora que crece de forma silvestre en dicha
regin. Sin embargo, no se tiene un estudio acerca de las propiedades fisicoqumicas y sus
efectos benficos para el consumidor. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue evaluar
en diferentes marcas de licores el contenido de antocianinas monomricas y %color
polimrico, fenoles totales y actividad antioxidante

, as como sus propiedades

fisicoqumicas. El intervalo de contenido de antocianinas monomricas en los licores flucta
de 3.560.19 a 76.951.20 mg de cianidina 3-glucsido/L; el contenido de fenoles totales se
encuentra en un intervalo de 477.120.04 a 884.980.03 mg EAG/100 mL y la actividad
antioxidante de 110.510.88 a 304.472.65 mM equivalentes de Trolox/mL de licor.
Encontrndose mediante un anlisis de MANOVA que con excepcin de 2 muestras, s
existen diferencias estadsticamente significativas (p<0.05) entre los licores evaluados, lo
cual puede atribuirse a sus diferentes condiciones de procesamiento y almacenamiento.
Mediante una correlacin cannica se obtuvo que a menor pH y mayor porcentaje de
azcares reductores, existe un mayor contenido de antocianinas monomricas, es decir bajo
estas condiciones se favorece la presencia de estos compuestos bioactivos que ayudan a la
prevencin de enfermedades crnico-degenerativas.


v

NDICE GENERAL
Pgina
Lista de Figuras viii
Lista de tablas x
1. INTRODUCCIN
2. ANLISIS DE FUNDAMENTOS
2.1 Estrs oxidativo en la salud humana 3
2.1.1 Especies oxidantes. Especies reactivas del oxigeno
y radicales libres

4
2.2 Alimentos funcionales 4
2.3 Licor de mora 5
2.4 Las bayas como fuente de fenoles 6
2.4.1 Antocianinas 9
2.4.1.1 Estabilidad de las antocianinas 11
2.4.1.2 Polimerizacin de las antocianinas 13
2.4.2 Actividad antioxidante en los compuestos fenlicos 14
2.5 Mtodos para evaluar la actividad antioxidante 16
2.5.1 Determinacin de fenoles totales 18
2.6 Cuantificacin de antocianinas 19
2.6.1 Extraccin de antocianinas 19
2.6.2 Cuantificacin de antocianinas monomricas y color
polimrico

20
3. HIPTESIS


vi

4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General 22
4.2 Objetivos Especficos

22
5. METODOLOGA
5.1 Procedimiento general de trabajo 23
5.2 Equipos y reactivos 24
5.3 Obtencin de las muestras 26
5.4 Determinacin de propiedades fisicoqumicas a los licores
de mora

27
5.5 Establecimiento de los parmetros de color en los licores
de mora

28
5.6 Determinacin de antocianinas monomricas 29
5.6.1 Preparacin del extracto metanlico 29
5.6.2 Mtodo de pH diferencial 29
5.7 Determinacin de color polimrico en el licor de mora 30
5.8 Determinacin de Fenoles totales (FT) 31
5.9 Actividad antioxidante en los licores y fruto de mora 32
5.9.1 Preparacin de la curva de calibracin 32
5.9.2 Preparacin del radical DPPH

33
5.9.3 Mtodo de DPPH

33
5.9.4 Clculo de la actividad antioxidante 34
5.10 Anlisis estadstico de los resultados

34
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Fruto de zarzamora 35
6.2 Propiedades fisicoqumicas en los licores 37
6.3 Cambios en los parmetros de color en los licores 38
6.4 Antocianinas monomricas, %color polimrico y densidad de
color en los licores de mora

41

vii

6.5 Fenoles totales y actividad antioxidante 45
6.6 Anlisis estadstico de las mediciones efectuadas a los
licores de mora

47
6.6.1 Anlisis Multivariado de la Varianza (MANOVA) 47
6.6.2 Correlacin cannica 48
6.7 Determinaciones durante el tiempo de almacenamiento del
licor control

52
6.7.1 Determinaciones fisicoqumicas al inicio del
almacenamiento del licor control

52
6.7.2 Determinaciones colorimtricas durante el tiempo de
almacenamiento del licor control

53
6.7.3 Variaciones en el contenido de antocianinas
monomricas, %color polimrico y actividad
antioxidante durante el tiempo de almacenamiento


54
7. CONCLUSIONES
8. PERSPECTIVAS
REFERENCIAS 60
ANEXOS 64
APNDICE A 67
APNDICE B 68
APNDICE C 69
APNDICE D 69

viii

LISTA DE FIGURAS

Pgina
Figura 1. Estructura qumica del esqueleto bsico de los
flavonoides
7
Figura 2. Estructura qumica de algunos flavonoides 8
Figura 3. Estructura ms comn de la antocianina glucosilada 10
Figura 4. Estructura de antocianinas a diferentes pHs 12
Figura 5. Reaccin de las antocianinas con bisulfito para formar
antocianinas-sulfnicas incoloras

21
Figura 6. Esquema de trabajo para el fruto y el licor de mora 23
Figura 7. Variaciones en los tonos de color de los parmetros L*, a*
y b*

28
Figura 8. Fruto maduro de zarzamora 35
Figura 9. Representacin de los parmetros colorimtricos en el
sistema CIEL* a* b*

39
Figura 10. Tonos de color del ngulo de matiz 40
Figura 11. Correlacin de Pearson entre el %color polimrico (%CP)
y el contenido de antocianinas monomricas (AM)

42
Figura 12. Correlacin de Pearson entre el %color polimrico (%CP)
y el pH

43
Figura 13. Correlacin de Pearson entre el pH y el parmetro L* 44
Figura 14. Correlacin de Pearson entre el ngulo de matiz y (a)
antocianinas monomricas y (b) % Color polimrico

44
Figura 15. Contenido de fenoles totales en los licores de mora 45
Figura 16. Actividad antioxidante en los licores de mora 47
Figura 17. Raz 1 obtenida de la correlacin cannica 49

ix

Figura 18. Raz 2 obtenida de la correlacin cannica 50
Figura 19. Raz 1 de la Correlacin cannica para la actividad
antioxidante

51
Figura 20. Correlacin de Pearson entre el %CP y el parmetro a* 56
Figura 21. Correlacin de Pearson entre las Antocianinas
monomricas (AM) y la Actividad antioxidante (AA)

56


x

LISTA DE TABLAS
Pgina
Tabla 1. Vinos y licores de bayas 9
Tabla 2. Contenido de antocianinas en diferentes especies de bayas
(mg/100 g peso freso)

11
Tabla 3. Cambios en la distribucin de antocianinas y actividad
antioxidante en vinos de mora negra (mulberry) durante el
aejamiento


15
Tabla 4. Clasificacin de los mtodos para evaluar la actividad
antioxidante de acuerdo a las reacciones involucradas

16
Tabla 5. Mtodos de extraccin de antocianinas 20
Tabla 6. Equipos y materiales empleados 24
Tabla 7. Reactivos empleados 25
Tabla 8. Marcas comerciales de los licores evaluados 27
Tabla 9. Curva de calibracin de fenoles totales 32
Tabla 10. Curva estndar de trolox 33
Tabla 11. Contenido de antocianinas en diferentes bayas 36
Tabla 12. Propiedades fisicoqumicas de los licores 37
Tabla 13. Propiedades colorimtricas 39
Tabla 14. Contenido de antocianinas monomricas y %color polimrico 41
Tabla 15. Contenido de fenoles en licores de bayas 46
Tabla 16. Valores de p de la prueba multivariada de Wilks para los licores
de mora

48
Tabla 17. Parmetros determinados al inicio del almacenamiento 52
Tabla 18. Parmetros de color en el licor control durante el almacenamiento 53
Tabla 19. Antocianinas, %Color polimrico, Fenoles y actividad
Antioxidante durante el almacenamiento

54
1

1. INTRODUCCIN

Las zarzamoras (Rubus spp) son un cultivo importante tanto en Mxico como en Estados
Unidos y son comercialmente producidos en una amplia gama de regiones (Reyes-Carmona
et al., 2005). En Mxico se produce en Michoacn, Morelos, Mxico, Puebla, Jalisco, Hidalgo
y Veracruz.
En la regin de Xico, Veracruz las zarzamoras (Rubus spp) se emplean para la elaboracin
de diversos productos tales como tortilla, atole y para la preparacin de forma artesanal de
un licor, conocido como licor de mora, a partir del fruto maduro que crece de forma silvestre
en dicha regin. Este licor se elabora mediante una fermentacin a temperatura ambiente,
seguida por una maceracin, una clarificacin para eliminar los residuos slidos y
posteriormente se deja reposar. Esta bebida posiblemente tenga potenciales benficos para
la salud humana, probablemente por la presencia de antocianinas las cuales se reportan con
propiedades antiinflamatorias, antivirales, antimicrobianas y actividad antioxidante (Benzie y
Strain, 1996; Cheng y Breen, 1991), aun cuando no se tienen reportes de la composicin
nutrimental ni del potencial antioxidante de dicha bebida.
La actividad antioxidante ha sido relacionada con el contenido de antocianinas y fenoles
totales de moras de diversos genotipos de Vaccinium L., Rubus L., y Ribes L. (Halliwell et al.,
1987; Hakkinen et al., 1999). Las zarzamoras, que pertenecen al gnero Rubus spp, son
fuente significativa de fenoles en la dieta humana (Sellappan et al., 2002; Zheng y Wang,
2003), las cuales tienen un gran potencial antioxidante.
2

Moure et al. (2001), reportan que el grado de polimerizacin de los compuestos fenlicos
tiene un marcado efecto sobre la actividad antioxidante. As, los compuestos polimricos son
ms potentes como antioxidantes que los monomricos.
Durante el aejamiento de los vinos ocurren numerosas reacciones de polimerizacin que
tienen lugar entre las antocianinas y otros fenoles, principalmente flavonoles, estas
reacciones favorecen la estabilidad del color del vino, causando una disminucin de la
absorbancia a 520 nm y un aumento a 420 nm. En vinos tintos jvenes, casi la totalidad del
color est dado por antocianinas monomricas, pero despus de un ao, al menos el 50%
del color percibido est dado por antocianinas polimricas, estos pigmentos son menos
afectados por el pH, la temperatura y el SO
2
por lo que dan estabilidad al color del vino
(Casassa y Catania, 2006).
En un estudio realizado en vinos elaborados con moras (mulberries) se encontr que la
actividad antioxidante se ve influenciada por el porcentaje de antocianinas polimricas que
se forman durante el aejamiento, teniendo al ao un porcentaje de 30.44%, por el contrario
el contenido de antocianinas monomricas se ve disminuida con el tiempo de
almacenamiento (Tsai et al., 2004).
El objetivo de este estudio fue determinar el contenido de antocianinas monomricas,
polimricas y su relacin con la actividad antioxidante en licores de mora, as como evaluar
parmetros fisicoqumicos en los licores y fruto de mora.
Al considerar que en Mxico no existe una normatividad que regule este tipo de bebidas y
dado el creciente inters de los consumidores por productos nutracuticos y alimentos
funcionales; si se cuantifica el contenido de estos compuestos bioactivos tanto en el fruto
como en el licor de mora, se puede brindar informacin objetiva a la poblacin, sobre los
efectos positivos para la salud, que conlleva el consumo del licor de mora.
3

2. ANLISIS DE FUNDAMENTOS

En este captulo se describen brevemente los principales grupos de compuestos fenlicos
presentes en las frutas rojas y bayas. Se trata adems, aspectos relevantes de las
antocianinas como su estabilidad y actividad antioxidante, as como el empleo de las moras
silvestres para la elaboracin de un licor de forma artesanal con posibles beneficios
potenciales para la salud humana.

2.1 Estrs oxidativo en la salud humana
El oxgeno es esencial para los organismos vivos. Sin embargo, la generacin de especies
reactivas del oxgeno (ROS) y radicales libres (RL) es inevitable en el metabolismo aerbico.
Estas especies oxidantes provocan daos acumulativos en molculas fundamentales para el
funcionamiento del organismo, tales como protenas, lpidos y ADN.

Pese a esto, el organismo tiene sus propios mecanismos de defensa para hacer frente a la
accin de las especies oxidantes. En determinadas situaciones las defensas antioxidantes
pueden verse desbordadas por la excesiva generacin de ROS. Este desequilibrio entre
especies oxidantes y antioxidantes se conoce como estrs oxidativo, el cual est asociado a
numerosas enfermedades y al proceso normal de envejecimiento (Lee et al., 2004).

La dieta juega un papel importante en la prevencin de enfermedades relacionadas con el
estrs oxidativo, fundamentalmente a travs del aporte de compuestos bioactivos de origen
4

vegetal. Entre ellos, las vitaminas hidrosolubles y liposolubles, carotenoides y una gran
variedad de compuestos fenlicos, cuya actividad antioxidante y potenciales efectos
beneficiosos estn siendo ampliamente investigados en los ltimos aos (Prior, 2003). Es
as, como las industrias alimentarias estn diseando alimentos funcionales que
proporcionen un aporte adicional de estos antioxidantes naturales.

2.1.1 Especies oxidantes. Especies reactivas del oxgeno y radicales libres

Una especie oxidante es aquella capaz de aceptar electrones de modo que va a generar un
desequilibrio electrnico en las molculas vecinas. El trmino antioxidante hace referencia a
cualquier sustancia que, estando presente a una concentracin ms baja comparada con la
de un sustrato oxidable, es capaz de retrasar o prevenir la oxidacin de dicho sustrato. Los
radicales libres se definen como especies qumicas que poseen uno o ms electrones
desapareados, lo cual las hace altamente inestables y reactivas. Para estabilizarse
reaccionarn rpidamente con molculas adyacentes mediante reacciones de xido-
reduccin. El trmino especies reactivas del oxgeno es un trmino colectivo que incluye
radicales libres y ciertas especies no radicales que son oxidantes y/o se convierten
fcilmente en radicales libres, como por ejemplo HClO, HBrO, O
3
, ONOO
-
, o H
2
O
2
(Halliwell y
Whiteman, 2004).

2.2 Alimentos funcionales

En los ltimos aos se ha incrementado el inters por parte de las industrias alimentarias y
los consumidores por el concepto de alimento funcional. As, como consumidores cada vez
ms interesados en alimentos ms saludables y una industria alimentaria que ha
comprendido la potencialidad del mercado de los alimentos funcionales, se ha iniciado a
5

nivel mundial una intensa actividad investigadora en el rea de estos nuevos alimentos. El
trmino alimento funcional hace referencia a alimentos o ingredientes que mejoran el estado
general de salud y/o reducen el riesgo de enfermedad (Rafter, 2002).
Se trata adems de productos alimenticios que deben consumirse dentro de la dieta habitual
para conseguir efectos beneficiosos que van ms all de los requerimientos nutricionales
tradicionales (Roberfroid, 2002).

2.3 Licor de mora
En la regin de Xico, Veracruz las moras (Rubus spp) crecen de forma silvestre con
caractersticas similares a las zarzamoras que son frutos carnosos y formados por
numerosos frutillos esfricos apiados cada uno con huesillo, de color rojizo al principio, pero
al final negro cuando maduran completamente (TecnoAgro, ao 8, nm.36). Estos frutos se
emplean para la elaboracin de diversos productos, tales como tortillas, atole y un licor,
conocido como licor de mora, para este ltimo se emplea para su procesamiento el fruto
silvestre en estado maduro y se manufactura de forma artesanal.
El proceso de elaboracin del licor de mora comprende las siguientes etapas:
Una fermentacin a temperatura ambiente, con un tiempo aproximado de 3 das en
garrafas de vidrio en un cuarto oscuro.
Una maceracin que permite terminar el proceso de fermentacin.
La clarificacin que elimina los slidos suspendidos en el licor.
Reposo, se deja aejar el licor por un tiempo mnimo de un ao para que tenga las
caractersticas de cuerpo y sabor. Surez (comunicacin personal, 1 de marzo de
2008).

6

Si bien no existe una normatividad mexicana para estos licores, destinadas para el consumo
humano y poseedoras de cualidades organolpticas particulares, la Comunidad Europea en
su Reglamento (CEE) n 1576/89, define a los licores como una bebida espirituosa, con un
grado alcohlico mnimo de 15 % vol., producida por destilacin de productos fermentados
de modo natural y/o maceracin y con un contenido mnimo de azcar, expresado como
azcar invertido de:
- 70 gramos por litro en el caso de los licores de cereza cuyo alcohol etlico sea
exclusivamente aguardiente de cerezas;
- 80 gramos por litro en el caso de los licores de genciana o similares elaborados con
genciana o plantas similares como nica sustancia aromatizante;
- 100 g por litro en todos los dems casos.

Cabe destacar que el uso de las moras silvestres para la elaboracin del licor son muy
apreciadas por los pobladores y esto se debe a las caractersticas de acidez, sabor y color
que le confieren, adems empricamente han notado que estas propiedades diferencian a
esta bebida de la elaborada a partir de moras cultivadas. Sin embargo, la informacin acerca
de las caractersticas qumicas y fisicoqumicas de licores es escasa.

2.4 Las bayas como fuente de fenoles
Qumicamente, los fenoles pueden ser definidos como sustancias que poseen un anillo
aromtico teniendo uno o ms sustituyentes hidroxilo, incluyendo sus derivados funcionales
(Shahidi y Naczk, 1995).
Los flavonoides constituyen el grupo de compuestos polifenlicos ms diversos y
ampliamente distribuidos en las plantas. Su esqueleto bsico de difenilpropano (C
6
-C
3
-C
6
)
7

consta de dos grupos fenilo (A y B) unidos por un puente de tres carbonos que forma un
anillo heterocclico oxigenado (anillo C) (Figura 1).
O
A C
B
8
7
6
5
4
3
2
1'
2'
3'
4'
5'
6'
+

Figura 1. Estructura qumica del esqueleto bsico de los flavonoides (Shahidi y Naczk, 1995)

La presencia o ausencia de un grupo hidroxilo unido a la posicin 3 determina la subdivisin
en las dos clases principales de flavonoides:
a) Los 3-hidroxiflavonoides (flavanoles, flavonoles, flavanonoles, flavan-3,4-
dioles o leucoantocianidinas, antocianidinas, proantocianidinas o taninos
condensados) y
b) Los flavonoides no hidroxilados en la posicin 3 (flavonas, isoflavonas,
flavanonas) (Garca, 2005).

A continuacin se muestran los principales flavonoides presentes en los alimentos vegetales
(Figura 2).
8

O
OH
O
+
OH
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
O H
Flavanol
Flavona
Antocianina
Isoflavonas
Catequina

Figura 2. Estructura qumica de algunos flavonoides (Shahidi y Naczk, 1995)

Los fenoles presentes en los vinos protegen al organismo contra enfermedades
cardiovasculares y enfermedades degenerativas (Hertog et al. 1993). Adems estos
compuestos contribuyen a las caractersticas sensoriales de los vinos tales como el color,
sabor, astringencia, dureza del mismo y de la interaccin con protenas, polisacridos y otros
compuestos fenlicos (Shahidi y Naczk, 1995).

La mayora de los compuestos fenlicos permanecen en los productos elaborados a base de
moras y otros frutos (Heinonen et al., 1998), como por ejemplo zumos, mermeladas, jaleas,
gelatinas, licores, etc. (Garca, 2005). A continuacin se muestra el contenido de azcares,
porcentaje de alcohol y fenoles totales en diversos vinos y licores elaborados a partir de
algunas bayas (Tabla 1).

9

Tabla 1. Vinos y licores de bayas
Fuente Azcar
g/L
Alcohol
Vol %
Fenoles totales
mg EAG/L
Vinos
1. Grosella negra 15 13 1270
2. Grosella roja 30-50 12 495
Licores
1. Cerezas 180 21 1080
2. Fresa 130 15 525
3. Arndanos 300 21 500
Heinonen et al., 1998

2.4.1 Antocianinas
La palabra antocianina deriva del griego anthos (flor) y kyanos (azul oscuro). Las
antocianinas son las responsables de los colores rojos, azulados o violetas de la mayora de
las frutas y flores. Es el pigmento ms importante, despus de la clorofila, que es visible al
ojo humano.

Las antocianinas son derivados del catin 2-fenilbenzopirilio y debido a la poca solubilidad de
stas en agua, no se encuentran de manera libre en la naturaleza, sino en su forma
glucosilada siendo una de las ms abundantes la cianidina-3-glucsido (Walford, 1980)
(Figura 3).
10

O
O
+
OR
O H
OH
OH
H
OH O H
OH
O
CH
2
OH
Cianidina 3-glucsido, R=H
Cianidina 3,5-diglucsido, R=glucosa
8
7
6
5
10
4
3
9
2
1'
6'
5'
4'
3'
2'
1''
2''
3''
4''
5''
6''
A C
B

Figura 3. Estructura ms comn de la antocianina glucosilada (Walford, 1980)

La funcin ms importante de las antocianinas es la percepcin visible para la atraccin de
animales para propsitos de polinizacin y dispersin de semillas. Adems se encargan de la
filtracin de la luz o pueden acumularse como resultado de estrs. Dentro de las vacuolas,
las antocianinas, pueden estar localizadas en organelos esfricos conocidos como
antocianoplastos, que se forman mientras la sntesis de pigmentos est en operacin (Lewis
y Walker, 1995).

Las especies del gnero Rubus se han descrito como fuentes naturales de antocianinas,
como son la cianidina-3-glucsido y en algunos casos glucsidos de pelargonidina (Deighton
et al., 2000), diversos estudios reportan que su contenido va de 10 a 600 mg/100 g de peso
fresco (Tabla 2).






11

Tabla 2. Contenido de antocianinas en diferentes especies de bayas (mg/100 g peso fresco)
Bayas Gnero Antocianinas

Zarzamora


Rubus spp

131-256
1
Grosella negra

Ribes nigrum, L. 80-810
2
Mora azul

Vaccinium
(diferentes subgneros)
60-480
2
Arndano

Vaccinium oxycoccus, L. 20-360
2

Arndano
americano

Vaccinium myrtillus, L. 300-600
2
Arndano rojo Vaccinium vitisidaea, L 35-170
2

Frambuesa

Rubus ideaeus, L. 20-220
2
Fresa Fragaria ananassa 10-80
2

1
Siriwoharn et al., 2004

2
Rein, 2005



2.4.1.1 Estabilidad de las antocianinas
Las antocianinas son compuestos lbiles y su estabilidad es muy variable en funcin de su
estructura y la composicin de la matriz en la que se encuentran (Wrolstad, 2000, Delgado-
Vargas y Paredes-Lpez, 2003).
Su estabilidad se ve afectada por el pH, temperaturas de almacenamiento, presencia de
enzimas, luz, oxgeno, estructura y concentracin de las antocianinas, y la presencia de otros
compuestos tales como otros flavonoides, protenas y minerales.
Uno de los principales factores del medio que afecta la estabilidad del color de las
antocianinas es el pH. Dependiendo del pH las antocianinas pueden existir en cuatro
especies diferentes: base quinoidal, catin flavilio, pseudobase carbinol y chalcona. En
soluciones muy cidas (pH < 0.5) el catin flavilio rojo es la nica estructura. Con
incrementos de pH la concentracin del catin decrece al mismo tiempo que la hidratacin
12

da lugar a la base de carbinol incolora. Entre pH 4 y 5.5 habr poco color, debido a que las
dos formas coloreadas estarn en bajas concentraciones y el equilibrio se desplazar a las
formas incoloras. Por lo tanto, la forma chalcona es la ms susceptible a la degradacin, y la
forma inica flavilio es la ms estable (Chandra et al., 1992; Wesche-Ebeling y Montgomery.,
1990) (Figura 4).

O
+
R1
OH
R2
OH
O H
OH
O H
O
O
OH
R1
OH
R2
O
OH
O H
OH
OH
OH
R1
OH
OH
O
R1
O H
OH
R2
OH
H
+
Catin flavilio (forma oxonium)
(rojo) pH=1
Base quinoidal (azul)
pH=7
Pseudobase carbinol (incoloro)
pH=4.5
Chalcona (incoloro)
pH=4.5
+
2
H O
-

Figura 4. Estructura de antocianinas a diferentes pHs (Giustin y Wrolstad, 2001)


13

2.4.1.2 Polimerizacin de las antocianinas

Las antocianinas son pigmentos lbiles que experimentan reacciones de degradacin. Su
estabilidad, como ya se mencion es altamente variable y depende de su estructura y de la
composicin de la matriz en la cual existe (Wrolstad, 2000; Delgado-Vargas y Paredes
Lpez, 2002). Al incrementar las sustituciones glucosdicas y en particular, acilaciones de
azcares residuales con cido cinmico, incrementar la estabilidad del pigmento. La
polifenoloxidasa, peroxidasa y las enzimas glicosiladas pueden tener un efecto devastador
sobre las antocianinas. Estas enzimas puede ser nativas de los tejidos de las plantas o
provenientes de la contaminacin con mohos. Otra posible fuente es parte de las actividades
comerciales de las enzimas utilizadas como auxiliares del procesamiento. Las enzimas
glicosiladas actan directamente sobre las antocianinas, pero la accin de las
polifenoloxidasas y peroxidasa son indirectas. Las antocianinas condensarn con otros
compuestos fenlicos para formar pigmentos de color polimrico. Esta reaccin puede ser
acelerada con la presencia de acetaldehdo.

Los pigmentos de antocianinas polimricas no mostrarn un cambio pronunciado reversible
del color con los cambios de pH que es caracterstico de las antocianinas monomricas
(Wrolstad et al., 2005).
Durante el aejamiento de los vinos ocurren numerosas reacciones de polimerizacin que
favorecen la estabilidad del color del vino, y tienen lugar entre las antocianinas y otros
fenoles, principalmente flavonoles, causando una disminucin de la absorbancia a 520 nm y
un aumento a 420 nm. En vinos tintos jvenes, casi la totalidad del color est dado por
antocianinas monomricas, pero despus de un ao, al menos el 50% del color percibido
14

est dado por antocianinas polimricas, estos pigmentos son menos afectados por el pH, la
temperatura y el SO
2
por que le dan estabilidad al color del vino (Casassa y Catania, 2006).

2.4.2 Actividad antioxidante en los compuestos fenlicos

Los antioxidantes naturales son principalmente compuestos fenlicos que pueden estar
presentes en todas las partes de la planta (Shahidi y Naczk, 1995). Los compuestos
fenlicos pueden actuar como antioxidantes mediante dos mecanismos principales:

a) Como captadores de radicales libres. Los compuestos fenlicos pueden actuar
como donantes de hidrgeno o electrones en reacciones de terminacin que rompen
el ciclo de generacin de nuevos radicales libres, deteniendo las reacciones en
cadena en las que estn implicados los radicales libres. El radical fenoxilo generado
es menos reactivo dado que se estabiliza por resonancia con los electrones p del
anillo aromtico.

b) Como quelantes de metales. Esta accin requiere la presencia de grupos hidroxilos
cercanos en el anillo aromtico. De este modo, los o-dihidroxifenoles son
secuestradores efectivos de iones metlicos e inhiben la generacin de radicales
libres por la reaccin de Fenton (Garca, 2005).

Sin embargo, existen otros factores que afectan la actividad antioxidante de los compuestos
fenlicos. As, el nmero y posicin de grupos hidroxilo, la presencia de azcares unidos y el
grado de polimerizacin determinarn propiedades de los compuestos fenlicos tales como
la solubilidad y la tendencia a ceder electrones o tomos de hidrgeno.
15

El grado de polimerizacin de los compuestos fenlicos tiene un marcado efecto sobre la
actividad antioxidante. As, los compuestos polimricos son ms potentes como
antioxidantes que los monmeros (Garca, 2005).
En un estudio realizado en vinos elaborados con moras negras (mulberries) se encontr que
la actividad antioxidante se ve influenciada por el porcentaje de antocianinas polimricas que
se forman durante el aejamiento, teniendo al ao un porcentaje de 30.44%, por el contrario
el contenido de antocianinas monomricas se ve disminuida con el tiempo de
almacenamiento (Tabla 3) (Tsai et al., 2004).

Tabla 3. Cambios en la distribucin de antocianinas y actividad antioxidante en vinos de
mora negra (mulberry) durante el aejamiento

Parmetro Tiempo de almacenamiento (meses)
1 3 12

% Antocianinas monomricas 83.37 76.28 48.63
% Antocianinas polimricas 16.63 23.49 30.44
Actividad antioxidante DPPH (%) 70.71 73.55 78.22
Tsai et al., 2004

Debido a la gran diversidad de compuestos fenlicos dispersos en los tejidos vegetales, as
como sus diferentes estructuras qumicas, han trado consigo la necesidad de desarrollar un
gran nmero de tcnicas analticas para su identificacin y cuantificacin (Martnez-Valverde
et al., 2000).
A continuacin se presentan las metodologas empleadas para la extraccin y cuantificacin
de antocianinas, ndice de degradacin de pigmentos, la estimacin de fenoles totales y la
actividad antioxidante.
16

2.5 Mtodos para evaluar la actividad antioxidante

La actividad antioxidante de los frutos y bebidas puede evaluarse in vitro e in vivo por medio
de experimentos sencillos. Con base a las reacciones qumicas involucradas, pueden
dividirse en dos categoras: ensayos basados en la transferencia de un tomo de hidrgeno
y ensayos basados en la transferencia de electrones. Los mtodos de transferencia de un
tomo de hidrgeno estn basados en reacciones donde el antioxidante y el sustrato
compiten por el radical libre sinttico, una molcula oxidable y un antioxidante. Los mtodos
basados en la transferencia de un electrn involucran una reaccin de oxidacin con el
antioxidante que es un indicador del punto final de la misma (Tabla 4).

Tabla 4. Clasificacin de los mtodos para evaluar la actividad antioxidante de acuerdo a las
reacciones involucradas
Mecanismo Mtodo


Transferencia de hidrgeno
a. TRAP (del ingls total radical
trapping antioxidant parameter)
b. ORAC (del ingls Oxygen Radical
Absorbance Capacity)
c. Inhibicin de la oxidacin de las
LDL (Low-density lipoprotein)



Transferencia de un electrn
a. TEAC (del ingls Trolox
equivalent antioxidant capacity)
b. ABTS (cido 2,2azinobis (6-
sulfonato-3-etilbenzotiazolina))
c. FRAP (del ingls ferric-reducing
antioxidant power)
d. DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo)
Huang et al., 2005
17

Las condiciones para el empleo de los mtodos de transferencia de electrn como el ABTS y
DPPH, pueden variar de alguna u otra forma, (por ejemplo, el pH los solventes y la longitud
de onda a la que se mide), dando diferentes resultados. Sin embargo, son muy tiles para
evaluar la actividad antioxidante de sustancias y alimentos que los contienen. Estos mtodos
pueden servir para evaluar si un proceso de elaboracin de un alimento influye sobre la
actividad antioxidante, adems puede ser un indicativo del potencial antioxidante para su
consumo (Villao et al., 2007).
El mtodo que se emple en este trabajo es el propuesto por Brand-Williams et al. (1995),
mtodo de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), que nos permite evaluar la actividad de
sustancias frente al radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) en una solucin
metanlica que tiene un color violeta intenso que se pierde progresivamente cuando se
aade la muestra que contiene antioxidantes. La decoloracin del radical se determina a 517
nm y la cuantificacin se realiza por lo general empleando soluciones patrn de Trolox.
Este mtodo es probablemente ms eficiente que el mtodo ABTS en reaccin con
donadores de tomos de hidrgeno. Sin embargo, el DPPH no reacciona con flavonoides
que no contenga grupos OH en el anillo B al igual que con los cidos aromticos que slo
contiene un grupo OH (Roginsky y Lissi, 2005). Pese a sus limitaciones, es un mtodo
adecuado para medir la actividad antioxidante en alimentos y extractos vegetales, mientras
que no es adecuado para la determinacin de la capacidad antioxidante del plasma o suero,
ya que las protenas precipitan con el metanol del medio de reaccin (Snchez-Moreno,
2002).




18

2.5.1 Determinacin de Fenoles Totales

Entre los mtodos usados comnmente para determinar fenoles en alimentos destacan:

a) Ensayo de la vainillina. Empleado para la determinacin de compuestos flavan-3-ol,
dihidrochalconas y procianidinas que tienen una unin simple en la posicin 2,3 y
poseen grupos hidroxilos en la posicin meta del anillo B (Martnez-Valverde et al.,
2000).

b) Ensayo de Folin- Ciocalteu (FC). Ha llegado a ser unos de los mtodos ms
empleados en alimentos que consiste en que los compuestos fenlicos de la muestra
se oxidan por el reactivo Foln-Ciocalteu el cual est formado por mezcla de cido
fosfotngstico (H
3
HW
12
O
40
) y cido fosfomolbdico (H
3
PMo
12
O
40
) que se reduce, por
accin de los fenoles, en una mezcla de xidos azules de tungsteno (W
8
O
23
) y de
molibdeno (Mo
8
O
23
). La oxidacin de los fenoles presentes en la muestra causa la
aparicin de una coloracin azul que presenta un mximo de absorcin a 730 nm, y
se cuantifica por espectrofotometra con base a una curva patrn de cido glico o
catequinas.

c) Ensayos ultravioleta. Se han realizado diversos estudios para llevar a cabo tcnicas
rpidas de cuantificacin de compuestos fenlicos mediante ensayos ultravioleta.
Debido a que cada grupo de compuestos fenlicos se caracteriza por tener una o
varias absorbancias mximas a distintas longitudes de onda dentro del espectro
ultravioleta. As, los fenoles simples tienen una absorbancia mxima entre 220 y 280
nm, mientras que los compuestos fenlicos relacionados presentan una amplia
19

variacin en la longitud de onda a la cual presentan una absorbancia mxima
(Martnez-Valverde et al., 2000).

En la literatura se encuentran diversos ejemplos de la aplicacin del mtodo de FC con
respecto a productos alimenticios como es el caso del vino rojo y blanco, ts y jugos
(Roginsky y Lissi, 2005), adems que es un mtodo simple, preciso y sensible, debido a lo
anterior en el presente trabajo se emple este mtodo expresando los resultados como
equivalentes de cido glico.

El nmero de fenoles naturales se ha estimado en casi ms de un milln, porque aparecen
generalmente como glicsidos, y las diferentes especies de azcares y sus diferentes formas
de enlaces generan una gran variedad.

2.6 Cuantificacin de antocianinas
2.6.1 Extraccin de antocianinas

Las antocianinas son molculas polares y consecuentemente son ms solubles en solventes
polares que en no polares. A valores de pH donde las molculas de antocianinas estn no
ionizadas, pueden ser solubles en ter

y no son estables en soluciones neutras y alcalinas;
por tanto, los mtodos convencionales empleados para la extraccin de antocianinas implica
el uso de solventes cidos (Tabla 5).





20

Tabla 5. Mtodos de extraccin de antocianinas
Mtodo Caractersticas
0.001 % HCl en metanol Este es el mtodo ms efectivo, pero el
HCl es corrosivo y el metanol tiene
efectos txicos en la salud humana.

0.001 % HCl en etanol 80% tan efectivo como el metanol.

0.001 % HCl en agua 27 % tan efectivo como el metanol.

Metanol acidificado con cido ctrico Este es el ms eficiente de los cidos
orgnicos.

Agua acidificada con cido actico En eficiencia es seguido por el cido
ctrico, tartrico y clorhdrico.

Agua con 1000 ppm de SO
2
La extraccin es mejor que la obtenida
por el uso de la extraccin tradicional
los cuales implica sistemas de etanol:
cido actico: agua.
Delgado-Vargas et al., 2000

Como se observa en la tabla 5 los mtodos de extraccin han ido en busca de mejores
rendimientos pero se han comprometido en cuestiones de seguridad (Delgado-Vargas et al.,
2000).
De acuerdo a lo anterior la extraccin de las antocianinas del fruto para el presente trabajo
se realiz con HCl al 1 % en metanol.

2.6.2 Cuantificacin de antocianinas monomricas y color polimrico

Considerando al pH como uno de los principales factores del medio que afecta la estabilidad
del color de las antocianinas, los espectros de UV-VIS a diferentes valores de pH tambin
varan y nos ayudan a determinar s las antocianinas estn o no polimerizadas (Giusti y
21

Wrolstad, 2001). La concentracin de antocianinas entonces se determina con la
absorbancia a un pH diferencial. Estas molculas dan dos bandas de absorcin en la regin
UV (260-280 nm) y la regin visible (490-550 nm). Los resultados se expresan como
pigmentos de antocianinas monomricas, generalmente expresados como cianidina-3-
glucsido.
El mtodo de pH-diferencial propuesto por Giustin y Wrolstad (2001) permite la estimacin
alternativa del contenido de antocianinas totales, incluso en la presencia de pigmentos
polimerizados y otras interferencias mediante el uso de sistemas tampn, el empleo de una
agente blanqueador, bisulfito, y la medicin por espectroscopia de UV-Visible. Este ltimo
consiste en el uso de un agente blanqueador que decolorar a las antocianinas sin afectar a
los compuestos interferentes (Figura 5). Se obtiene una medida de la absorbancia mxima
en la regin visible, seguida por la decoloracin. Los agentes blanqueadores ms empleados
son sulfito de sodio y perxido de hidrgeno (Giustin y Wrolstad, 2001).
O H
OH
O
R1
OH
R2
O-glucosa
O H
OH
R1
OH
R2
SO
3
H
O
O
HSO
3
OH
CH
2
OH
O H
OH
O
+
-
cido fuerte
Catin flavilium: rojo
Adicin de bisulfito: incoloro

Figura 5. Reaccin de las antocianinas con bisulfito para formar antocianinas-sulfnicas
incoloras (Wrolstad et al., 2005)

22

3. HIPTESIS
La actividad antioxidante de los licores de mora est relacionada con el contenido de
antocianinas.

4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Determinar el contenido de antocianinas monomricas, polimricas y su relacin con la
actividad antioxidante en licores de mora y fruto de mora, as como evaluar parmetros
fisicoqumicos en los licores.
4.2 Objetivos especficos
- Determinar el grado alcohlico, pH, acidez titulable y azcares reductores en los
licores de mora.
- Establecer el color en los licores mediante colorimetra.
- Cuantificar el contenido de antocianinas monomricas en los licores y fruto de mora.
- Determinar el color polimrico en los licores de mora.
- Cuantificar el contenido de fenoles totales y actividad antioxidante presentes en los
licores y el fruto de mora.
- Analizar estadsticamente mediante la variacin y la correlacin de los parmetros
evaluados en los licores.
23

5. METODOLOGA

5.1 Procedimiento general de trabajo
En la Figura 6 se esquematiza el trabajo experimental de investigacin que se realiz al fruto
y licor de mora.













Figura 6. Esquema de trabajo para el fruto y licor de mora
LICORES
Antocianinas
Fenoles totales
Actividad
antioxidante
Adquisicin
Propiedades
fisicoqumicas
Obtencin del licor
control
Anlisis preliminar
Determinaciones a los
licores seleccionados
FRUTO
Seleccin
Liofilizacin
Antocianinas Fenoles totales Actividad antioxidante

24

5.2 Equipos y reactivos
En la tabla 6 y 7 se muestra la lista de equipos y reactivos empleados para la realizacin del
trabajo de tesis.
Tabla 6. Equipos y materiales empleados
Equipo y materiales Modelo Marca
Balanza analtica BL 210S Sartorius
Celdas para UV Macro plastibrand
Espectrofotmetro UV/Vis Lambda 35 Perkin Elmer
Estufa de conveccin de
aire
Ribosa
Micropipetas 20-1000 L 2100 Eppendorf
Mufla 1415M Thermolyne 1400 FB
Papel filtro Whatman No. 42
Papel filtro Whatman No. 1
Sonicador 8510 Branson
Liofilizador FreeZone 4.5 L Labconco
Colormetro IB900-MX Rival


25

Tabla 7. Reactivos empleados
Reactivos Pureza (%) Marca
2,2-Difenil-1-picril-hidrazil (radical libre) 97 Aldrich
cido- 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2- carboxlico
(trolox)
Sigma
cido clorhdrico Sigma
Acetato de sodio cristales A.C.S 99.8 Qumica Meyer
cido Glico Sigma
Carbonato de sodio anhidro A.C.S 99.87 Qumica Meyer
Cloruro de potasio A.C.S 99.87 Qumica Meyer
Folin-Ciocalteu 2N Qumica Meyer
Hidrxido de sodio 97.3 Fermont
Metabisulfito de potasio A.C.S 99 Qumica Meyer
Metanol, grado reactivo 99.8 Sigma Aldrich
Reactivo de Fehling I para azcares Fluka
Reactivo de Fehling II para azcares Fluka






26

5.3 Obtencin de las muestras
a) Fruto. Los frutos en estado maduro se obtuvieron del mercado local de Xico, en la
temporada de mayo-junio 2008. Se obtuvieron dos lotes de aproximadamente 500 g cada
uno de ellos, se transportaron en hieleras y se liofilizaron para su anlisis.

b) Licor de mora. Se aplic una encuesta a los productores de licor de mora de la regin
con la finalidad de tener conocimiento de quines empleaban moras silvestres (Rubus
spp) para la elaboracin de los licores, como resultado de la misma slo 9 productores
declararon emplear el fruto silvestre.
A estos 9 productores se les adquiri una muestra de licor de aproximadamente 1 L cada
una de ellas, las cules se emplearon para realizar un estudio preliminar que permitiera
conocer algunas de las caractersticas fisicoqumicas y propiedades de estos licores que
se expenden a los consumidores, adems que proporcionarn informacin de la relacin
entre las antocianinas y la actividad antioxidante. Las muestras fueron transportadas y
almacenadas a temperatura ambiente hasta antes de su anlisis, una vez abierta la
botella se mantuvo en refrigeracin, todas las determinaciones se efectuaron por
triplicado.

c) Licor control. La muestra que se emple como licor control fue proporcionada por la
productora Lourdes Colorado, quien facilit 1 L de licor recin preparado, el cual se
reparti y almacen en 4 frascos color mbar perfectamente sellados que se mantuvieron
a temperatura ambiente, y cada uno de ellos fue abierto cada mes para realizar los
mismos anlisis que se le efectuaron a los licores de mora seleccionados.

27

Las diferentes marcas de licores que se evaluaron as como algunos datos que los
caracterizan se muestran a continuacin, cabe mencionar que la informacin de aejamiento
(aos) que se muestra en la tabla se obtuvo mediante la comunicacin directa con los
productores (Tabla 8), por lo que no es un dato plenamente confiable, adems que se
desconocen las condiciones de almacenamiento y manejo del producto.

Tabla 8. Marcas comerciales de los licores evaluados
Marca Aejamiento (aos) Tipo de envase Clave
Ta Carmela 5 Plstico L1
Licores Xico 5 a 6 Vidrio L2
Toritos y licores la "Xiqueada" 2 Plstico L3
Las tres cascadas 1 Plstico L4
Vinos y licores artesanales Qually 4 Vidrio L5
Millueli, Licor de Morita 4 Vidrio L6
Lourdes Colorado 2 Plstico L7
Sin marca 1 Plstico L8
Lourdes Colorado 3 Plstico L9

5.4 Determinacin de propiedades fisicoqumicas a los licores de mora
A cada uno de los licores recolectados se les realiz por triplicado las siguientes
determinaciones analticas, cuyas tcnicas se muestran en los Anexos de la A a la D:
- Grado alcohlico, mediante la NOM-142-SSA1-1995
- Acidez titulable, mediante la tcnica descrita por la AOAC (mtodo 962.12)
- pH, mediante la tcnica de la AOAC (mtodo 960.10)
- Azcares reductores, mediante la NMX-V-006-1983


28

5.5 Establecimiento de los parmetros de color en los licores de mora
Se determin los parmetros de color mediante el sistema CIEL*a*b* (International
Commission on Illumination, Viena) que ha sido empleado por las industrias de alimentos de
los EUA para medir color en los productos alimenticios. Por lo que el color se determin en
trmino de los valores L*, a* y b*, empleando un colormetro triestmulo Hunter-Lab, el valor
de iluminante empleado fue de D
65
y un ngulo de observacin de 10. En donde el
parmetro colorimtrico L* indica la brillantez o luminosidad y sus valores van del 0 al 100,
valores positivos del parmetro a* estn en la direccin de los rojos y valores negativos en la
direccin de los verdes; el parmetro colorimtrico b* define el componente amarillo-azul,
valores positivos son el vector de los amarillos y negativos de los azules (ver Figura 7).






Figura 7. Variaciones en los tonos de color de los parmetros L*, a* y b*

Estos valores sirven para obtener el tono o ngulo de matiz y pureza o croma del color
(Calvo y Durn, 1997). El ngulo de matiz que se calcula como se muestra en la frmula (1)
y se deriva de las coordenadas de a* y b* que es representado en un plano cartesiano de
360, donde 0=rojos, 90=amarillos, 180=verdes y 270=azules. El croma es una medida de
la intensidad o saturacin del color y se determina con la frmula (2) que se muestra abajo.
L=100
L=0
Luminosidad (L*)
Rojo-verde (a*)
Amarillo-azul (b*)
29

Tono (h) = Tan
-1
(a/b) .. (1)
Croma (C*) = (a
2
+ b
2
)
1/2
.. (2)

La determinacin consisti en colocar 20 mL de licor de mora en un vaso de precipitado de
25 mL, dejndolo reposar 5 min para estabilizar la bebida y posteriormente se realizaron las
mediciones.

5.6 Determinacin de antocianinas monomricas
5.6.1 Preparacin del extracto metanlico
Se pes 0.5 g de la muestra liofilizada al que se le adicionaron 30 mL de metanol acidificado
con HCl al 1% para su extraccin con ultrasonido por 10 minutos, posteriormente se
centrifug a 4000 rpm por 15 min a una temperatura de 0 C, se adicion 10 mL de metanol
acidificado y se le aplic 10 minutos de ultrasonido, seguido de una centrifugacin bajo las
mismas condiciones. Finalmente se complet a un volumen total de 50 mL, las muestras se
colocaron en recipientes de vidrio mbar y se refrigeraron.

5.6.2 Mtodo de pH diferencial
A los extractos del fruto y a la muestra directa del licor de mora se les determin el contenido
de antocianinas monomricas por el mtodo de pH diferencial. Se prepararon dos diluciones
diferentes de las muestras, una con el buffer de cloruro de potasio, pH 1.0, y otra con el
buffer de acetato de sodio, pH 4.5, llevndolas a un volumen final de 3 mL, se esper 15
30

minutos a que las diluciones se equilibraran y se realiz un barrido en el espectrofotmetro
de 700 a 400 nm, esperando una absorbancia de las muestras entre 0.2 y 1.2.
Para calcular la concentracin de pigmentos monomricos se emple la siguiente ecuacin,
la cual se expres como cianidina-3-glucsido.
Antocianinas monomricos (mg/100 g)

=
APMFD100
1

Donde: A= Absorbancia, PM= peso molecular de la antocianina, FD= Factor de dilucin, =
Absortividad molar.
El valor final de la absorbancia se obtuvo como sigue:
A = A
vis max
A
700 nm

pH 1.0
A
vis max
A
700 nm

pH 4.5

En donde A
vis-max
es la mayor absorbancia obtenida a pH 1 y pH 4.5, mientras que A
700 nm
es
la lectura a 700 nm tanto para pH 1 como pH 4.5.

La concentracin final de antocianinas (mg/100g) se calcul con base al volumen de extracto
y peso de la muestra empleado (PM: 449.2 g/mol y : 26900 g/mol cm ). Las determinaciones
se realizaron por triplicado.

5.7 Determinacin de color polimrico en el licor de mora
Se prepar una solucin de bisulfito, diluyendo 1 g del reactivo en 5 mL de agua destilada a
continuacin se diluy la muestra con un buffer de cloruro de potasio 0.025 M a un pH de 1.0
para obtener la adecuada dilucin, teniendo sta una absorbancia entre 0.2 y 1.2.
Conociendo el factor de dilucin a emplear, se diluy la muestra con agua destilada y se
31

transfiri a dos celdas 2.8 mL de muestra diluida, y a la primera se le adicion 0.2 mL de la
solucin de metabisulfito y a la segunda (muestra control) se le agreg 0.2 mL de agua
destilada, se realiz un barrido en el espectrofotmetro de UV/VIS de 420 nm, a 700 nm
contra un blanco de agua destilada.
La densidad de la muestra control (tratada con agua destilada) se obtuvo como sigue:
Densidad del color = A
420nm
A
700nm
+A
vis max
A
700nm
FD
Para calcular el color polimrico de la muestra blanqueada con bisulfito se emplea la
siguiente frmula:
Color polimrico = A
420nm
A
700nm
+A
vis max
A
700nm
FD
En ambos casos, FD es el factor de dilucin empleado en las determinaciones.
Finalmente para calcular el porcentaje de color polimrico se emplea la siguiente frmula:
% Color polimrico = color polimrico/ densidad color 100

5.8 Determinacin de Fenoles Totales (FT)
La tcnica empleada fue la de Folin Ciocalteu, y para la cual se construy una curva de
calibracin de cido glico (Tabla 9), usando una solucin patrn de 35 g EAG/mL.

32

Tabla 9. Curva de calibracin de fenoles totales








A la dilucin adecuada de estndar o muestra correspondiente (fruto o licor de mora), por
triplicado, se le adicion 1 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu 1N y se agit vigorosamente,
despus de 5 minutos se le agreg 2 mL de solucin de carbonato de sodio al 20 % se agit
y se dej reposar por 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se midi la
absorbancia a 730 nm. La concentracin de fenoles en las muestras se calcularon en base a
la curva de calibracin y se expres como mg equivalentes de cido glico/ 100 g fruto
fresco en el caso del fruto y mg equivalentes de cido glico/ 100 mL para el licor.

5.9 Actividad Antioxidante en los licores y fruto de mora
5.9.1 Preparacin de la curva de calibracin
Se realizaron las diluciones correspondientes. Se prepar una solucin patrn, disolviendo 2
mg de trolox en 10 mL de metanol al 80 %. En la Tabla 10 se muestra las soluciones que se
emplearon para la curva estndar.

Concentracin

Solucin patrn
(mL)
Agua destilada
(mL)
35 3 0
30 2.571 0.429
25 2.143 0.857
20 1.714 1.286
15 1.286 1.714
10 0.857 2.143
33

Tabla 10. Curva estndar de trolox
Concentracin
(m)
Solucin patrn
(mL)
Metanol 80 %
(mL)
800 3 0
700 2.625 0.375
600 2.25 0.75
500 1.875 0.125
400 1.5 1.5
300 1.125 1.875
100 0.375 2.625

5.9.2 Preparacin del radical DPPH
Se pes 3.9 mg de DPPH en un matraz aforado previamente tarado y se disolvi en 100 mL
de metanol al 80 %. La solucin se coloc en un sonicador para asegurar una buena
disolucin. El matraz se cubri con papel aluminio como proteccin contra la luz.

5.9.3 Mtodo de DPPH
Los extractos del fruto o el licor previamente diluidos, 0.1 mL, se les adicion 2.9 mL de la
solucin de DPPH, se agit vigorosamente y se mantuvo en oscuridad por 2 horas a
temperatura ambiente, se realiz una lectura a los 30 minutos en un espectrofotmetro de
UV/VIS a 517 nm. El blanco contuvo metanol en lugar de la solucin antioxidante.


34

5.9.4 Clculo de la actividad antioxidante
Se restaron las absorbancias del blanco y de la muestra (X) y se calcularon los mM
equivalentes Trolox/mL muestra con la siguiente frmula:
mM Eq. Trolox/mL muestra =
X
(m mL muestra 1000)

donde:
m : pendiente de la ecuacin de la curva de calibracin

5.10 Anlisis estadstico de los resultados
Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) para establecer si existan diferencias
significativas entre las medias de los valores resultantes de los anlisis determinados a los
diferentes licores, tambin se realiz una comparacin de Tukey ambas con un intervalo de
confianza del 95%. Se realizaron pruebas de correlacin de Pearson, con un nivel de de
confianza de 0.05, entre todas las variables de este estudio, mediante el programa XLSTAT
2008.
Mediante un anlisis de multivariante de la varianza (MANOVA) se evalu la composicin
fisicoqumica y color en licores de mora, as como el contenido de antocianinas
monomricas, color polimrico y capacidad antioxidante, para determinar si existan
diferencias globales entre los licores. Se emple un anlisis cannico para identificar las
asociaciones de los parmetros fisicoqumicos y color con el contenido de fenoles,
antocianinas monomricas y color; empleando el paquete estadstico Statistica 8.0.

35

6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 Fruto de zarzamora
El fruto silvestre que se emple para el anlisis est formado por diversos frutillos carnosos
que van de tonos rojos a prpura; y tal como se muestra en la Figura 8 son empleados por
los productores para elaborar sus licores.

Figura 8. Fruto maduro de zarzamora
En cuanto al contenido de antocianinas monomricas en el fruto de zarzamora se encontr,
un valor de 183.630.33 mg cianidina 3-glucsido/100 g de peso fresco, este valor es
superior a lo reportado para fresas por Rein (2005) y adems se encuentra dentro de los
intervalos de antocianinas reportados para arndanos, frambuesas y mora azul, como se
puede observar en la Tabla 11.
36

Tabla 11. Contenido de antocianinas en diferentes bayas
Baya Antocianinas (mg/100 g)
Mora azul
1
60-480
Frambuesa
1
20-220
Arndano
1
20-360
Fresa
1
10-80
Zarzamora

183.63

1
Rein, 2005

El contenido de fenoles totales fue de 477.126.91 mg equivalentes de cido glico/100 g de
peso fresco. Este valor es superior a las variedades de Chester y Hull Thornless de
zarzamora en estado maduro reportado por Wang y Lin (2000), con valores de 2264.5 y
2485.9 mg cido glico/100 g de peso fresco, respectivamente. Los mismos autores
reportan para el cultivo Bliss de otoo de frambuesa roja en estado maduro un contenido de
fenoles totales de 2456.1 y para el cultivo Norheaster de fresa un contenido de 1504.0, por
lo que podemos considerar que el fruto silvestre de zarzamora evaluado aporta un contenido
importante de fenoles, comparado con las bayas mencionadas.

Por otro lado, la actividad antioxidante que se determin en el fruto fue de 3.750.1 mM
equivalentes de Trolox/ g de peso fresco, este valor es superior al reportado por Kuskoski et
al. (2005) en pulpa de mora el cul fue de 4.30.2 M equivalentes de Trolox/ g de peso
fresco. Los mismos autores reportan para la uva y para la acerola un contenido 7.00.3 y
53.25.3 M equivalentes de Trolox/ g de peso fresco, respectivamente. Siendo superior la
aportacin de actividad antioxidante del fruto silvestre de zarzamora.

37

6.2 Propiedades fsicoqumicas en los licores

Debido a que existe escasa bibliografa respecto a determinaciones fisicoqumicas en licores
de frutas, se consider conveniente realizar comparaciones con vinos, bebidas que de igual
forma que los licores de mora tienen un contenido importante de antocianinas monomricas.
En la Tabla 12 se muestran los datos correspondientes a las propiedades fisicoqumicas de
los licores en cuanto al contenido de azcares reductores totales, grado alcohlico, acidez
titulable y pH, representado el promedio ( desviacin estndar).

Tabla 12. Propiedades fisicoqumicas de los licores

Muestra
1
Azcares reductores (g/L) % Alc. Vol. Acidez
2
pH
L1 229.40.00
f
200.00 6.690.06
g
3.400.01
c
L2 172.40.00
i
200.00 12.310.07
cd
3.160.01
d
L3 335.60.00
b
100.00 13.370.06
c
2.840.01
e
L4 337.80.00
a
100.00 6.690.06
g
2.460.00
f
L5 233.60.00
e
200.00 8.610.06
f
3.150.01
d
L6 255.10.00
c
200.00 11.980.06
d
3.190.01
d
L7 221.20.00
h
120.00 14.830.06
a
3.180.00
d
L8 242.70.00
d
180.00 9.140.10
e
3.750.00
a
L9 227.30.00
g
200.00 14.030.21
b
3.470.04
b

CE 100 15 - -

1
Letras diferentes en las columnas indican diferencia significativa (Tukey HSD, p<0.05) entre los licores

2
Expresado como g de c. Ctrico/100 mL

En cuanto al contenido de azcares reductores totales expresado en g/L, se observa que los
valores obtenidos se encuentran en el intervalo de 172.4 a 337.8 g/L; estos valores en los
licores se encuentran dentro de lo establecido por la Comunidad Europea (CE) en la
reglamentacin para licores de frutas, que es de mnimo 100 g/L.
El grado alcohlico expresado como porcentaje de alcohol volumen de los licores de mora se
encuentra dentro de un intervalo de 12 a 20% de alcohol Vol. (a 20 C), con excepcin de los
38

licores L3, L4 y L7, con valores menores, por tanto la mayora de ellos se encuentran dentro
del 15% Alc. Vol. establecido por la reglamentacin de la Comunidad Europea para el grado
alcohlico.
En lo que respecta al pH, se encuentra en el intervalo de 2.46 a 3.75, la comunidad Europea
no hace referencia a este parmetro y como dato comparativo se tiene que los licores de
mora se encuentran dentro de los valores reportados para vinos tintos portugueses por
Dallas y Laureano (1994) quienes encontraron un pH de 3.52 para sus vinos.
La acidez titulable de los licores se encuentra en el intervalo de 6.690.06 a 14.830.06 g
cido ctrico/100 mL, estos valores comparado con lo que reporta Wrolstad et al. (1990) de
1.03 g cido ctrico/100 mL para vinos jvenes de zarzamora es inferior al obtenido en el
presente estudio, estas diferencias pueden deberse al estado de madurez de la zarzamora
empleado, asimismo la acidez pueden tener un efecto en su la calidad organolptica y en la
regulacin del pH de los licores. Adems, el pH y la acidez no presentan una relacin
inversa, como comnmente sucede, lo que puede deberse a que aparte del cido ctrico
(como se expresan los resultados), se encuentran otros cidos que contribuyen en la
regulacin del pH en los licores como el cido mlico.

6.3 Cambios en los parmetros de color en los licores

El color es un factor determinante y de los aspectos ms apreciados en la calidad de los
vinos tintos, adems que tiene un marcado efecto en la aceptacin de los consumidores
quienes relacionan la calidad de los alimentos con la apariencia, por lo que fue importante
determinar los parmetros que nos describen los cambios de color en los licores de mora.
39

En la Tabla 13 se muestran los parmetros colorimtricos determinados en los 9 licores de
mora.
Tabla 13. Propiedades colorimtricas
Muestra
1
L* a* b* C* h
L1 1.780.07
ab
4.260.1g5
a
1.400.11
a
4.490.12
a
18.261.76
cd
L2 0.690.07
cde
2.540.19
cd
0.710.05
cd
2.640.17
c
15.713.24
d
L3 0.560.06
de
1.490.04
f
0.280.02
e
1.520.04
e
10.490.34
f
L4 0.180.04
e
0.360.06
h
-0.280.04
f
0.460.07
f
51.730.84
a
L5 0.440.06
de
1.120.02
g
0.480.07
de
1.210.05
e
23.062.66
c
L6 0.870.04
cd
2.100.05
e
0.560.06
cd
2.180.06
d
14.891.08
ef
L7 1.260.05
bc
2.360.02
de
0.780.08
bc
2.470.05
cd
18.381.71
cd
L8 1.760.60
ab
2.810.08
bc
1.030.16
b
2.990.13
b
20.092.23
cd
L9 2.110.11
a
2.820.10
b
1.600.05
a
3.240.05
b
29.460.41
b
1
Letras diferentes en las columnas indican diferencia significativa (Tukey HSD, p<0.05) entre los licores

En la Figura 9 a manera de ejemplo se ubican los parmetros colorimtricos L*, a* y b* en el
plano del sistema CIEL* a* b* del licor L1.

Figura 9. Representacin de los parmetros colorimtricos en el sistema CIEL* a* b*
L1
L1
L=100
L=0
40

Referente al parmetro a*, en los licores de mora, los valores se encuentran entre 0.360.06
y 4.260.15 los cuales tienden hacia los tonos rojos. Mediante el anlisis estadstico de
Tukey, se encontr que existe diferencia significativa entre los licores evaluados, adems
estos valores son bajos comparados a los reportados por Maletic et al. (2009) para vinos
tintos croatas en donde el parmetro a* se encuentran en el intervalo de 53.02 a 40.41. Lo
anterior puede deberse a la variedad del fruto y al tipo de proceso y almacenamiento de los
vinos croatas.
En el caso del parmetro colorimtrico b*, los licores de mora se encuentran dentro del
intervalo de -0.280.04 y 1.600.05. Al analizarse estadsticamente los resultados se
encontr que el anlisis de varianza indica diferencia significativa para p<0.05.
En lo que respecta al ngulo de matiz (h) los valores se encontraron en un intervalo de
10.500.34 y 29.490.41, como el incremento del ngulo va de 0 a 60, los tonos se
encuentran entre los prpuras y rojizos, como se puede observar en la Figura 10, a esta
tonalidad posiblemente contribuyeron las antocianinas y los pigmentos polimerizados, como
reporta Rommel et al. (1992) en su estudio realizado a vinos y jugos de zarzamora.




Figura 10. Tonos de color del ngulo de matiz

90 0 45 135 180 225 270 315
41

6.4 Antocianinas monomricas, %color polimrico y densidad de color en los licores
de mora
Los datos correspondientes al contenido de antocianinas monomricas, densidad de color y
color polimrico se muestran en la Tabla 14, observndose que existe diferencia significativa
en los tres parmetros evaluados a los 9 licores. El contenido de antocianinas monomricas
totales expresado como mg de cianidina 3-glucsido/L de licor, en los diferentes licores se
encuentra dentro de un intervalo de 3.560.19 a 76.951.20 mg cianidina 3-glucsido /L;
esta amplitud de antocianinas puede deberse, en gran parte, al proceso de elaboracin, el
estado de madurez del fruto y al tiempo de almacenamiento.

Tabla 14. Contenido de antocianinas monomricas y %color polimrico
Muestra
1
Antocianinas
monomricas (mg/L)
% color
polimrico
Densidad de
color
L1 10.500.87
d
75.490.03
c
6.460.20
a
L2 14.660.94
c
75.790.02
c
5.840.09
b
L3 16.211.00
c
72.300.01
c
5.740.08
b
L4 76.951.20
a
44.160.01
d
5.660.14
b
L5 5.440.65
e
83.220.02
b
3.690.09
e
L6 3.560.19
f
88.560.02
ab
4.990.11
c
L7 3.950.04
ef
84.190.02
b
4.360.05
d
L8 19.840.51
b
85.650.02
ab
3.910.13
e
L9 6.100.51
e
90.180.02
a
4.570.13
d
1
Letras diferentes en las columnas indican diferencia significativa (Tukey HSD, p<0.05) entre los licores

De forma similar en un estudio realizando por Avalos et al. (2003) observaron la misma
amplitud en el contenido de antocianinas en diversos vinos tintos reportando un contenido de
antocianinas monomricas en el intervalo de 27. 43.0 a 116.81.7 mg cianidina 3-
glucsido/L.
42

Referente a la densidad de color (suma de las absorbancias a 508 nm y 420 nm) los valores
obtenidos se encuentran en un intervalo de 3.910.13 y 6.460.20, el anlisis de Tukey
indic los licores L2, L3 y L4 no presentan diferencia significativa con respecto a este
parmetro.
En el caso del porcentaje de color polimrico, indicativo del grado de polimerizacin de las
antocianinas, se encuentra en un amplio intervalo de 44.160.01 a 90.180.02%. El
contenido de antocianinas y el %color polimrico presentaron una asociacin negativa, como
indica la correlacin de Pearson realizada, con valor de 0.92, como puede apreciarse en la
Figura 11, lo que indica que al disminuir el contenido de antocianinas monomricas
incrementa el %color polimrico.


Figura 11. Correlacin de Pearson entre el %color polimrico (%CP) y el contenido de
antocianinas monomricas (AM)

Asimismo se obtuvo una asociacin entre el %color polimrico y el pH de los licores de mora
de 0.81, como se observa en la Figura 12, esto puede deberse a que a valores de pH altos
(mayores a 4) la forma estable de las antocianinas (forma oxonium) se ve desfavorecida. Un
comportamiento parecido en vinos fue reportado por Sims y Morris (1984) quienes
A
M
%CP
r=0.92
43

obtuvieron una correlacin de 0.87 para la relacin de cambios de pH y oscurecimiento que
est relacionado con la formacin de compuestos polimricos.


Figura 12. Correlacin de Pearson entre el %color polimrico (%CP) y el pH

Aunado a lo anterior, se observ que existe una relacin significativa entre el pH y la
luminosidad (L*) de 0.84, como puede apreciarse en la Figura 13, y como el pH est
asociado con el %color polimrico y este a su vez con el contenido de antocianinas, se
puede suponer que un incremento o decremento en el contenido de antocianinas y %color
polimrico tiene influencia en la luminosidad. Lo anterior tiene una implicacin en el control
de calidad de los licores, dado que el pH y la luminosidad pueden ser parmetros que
ayuden a controlar la calidad de los licores durante su proceso de elaboracin.
%
C
P
pH
r=0.81
44


Figura 13. Correlacin de Pearson entre pH y el parmetro L*

De igual forma en la Figura 14 (a) se observa que existe una asociacin significativa de 0.97
entre el ngulo de matiz y el contenido de antocianinas monomricas, mientras que existe
una correlacin negativa de 0.88 entre el ngulo de matiz y el porcentaje de color polimrico
como se observa en la Figura 14(b).


Figura 14. Correlacin de Pearson entre el ngulo de matiz y (a) antocianinas monomricas
y (b) % Color polimrico

Las asociaciones anteriores coinciden con lo reportado por Hong y Wrolstad (1990) para jugo
de frutas. Lo anterior tiene una importancia prctica porque el ngulo de matiz es un
L
*
pH
h
Antocianinas monomricas
h
%Color polimrico
r=0.84
r=0.97 r=-0.88
(a) (b)
45

parmetro que se puede emplear para medir de forma indirecta el contenido de antocianinas
y de %color polimrico.

En el Anexo A se muestran el resto de las relaciones lineales determinadas mediante la
correlacin de Pearson existente entre diferentes parmetros determinados a los 9 licores de
mora.

6.5 Fenoles totales y actividad antioxidante

Como se aprecia en el grfico de la Figura 15, el contenido de fenoles totales expresados
como equivalentes de cido glico (EAG) por cada litro de licor, se encuentra en un intervalo
de 477.125.52 a 884.9816.11 mg EAG/L.


Figura 15. Contenido de fenoles totales en los licores de mora

0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9
m
g

d
e

c
i
d
o

g

l
i
c
o
/
L

Licores
g
f
de
b
e
d
c
a
d
Letras diferentes en las barras indican diferencia significativa (Tukey HSD, p<0.05) entre los licores

46

Los licores con mayor contenido de fenoles fueron L3 y L2, adems el anlisis de Tukey
indic que no existe diferencia significativa entre los licores L4, L6, L7 y L9. Cabe destacar
que el contenido de fenoles de los licores de mora son superiores a los reportados por
Heinonen et al. (1998) para licores de fresas y arndanos que se observa en la Tabla 15.
Con estos datos se aprecia que el licor de mora da un aporte importante de fenoles si se
compara con los licores de bayas reportados.

Tabla 15. Contenido de fenoles en licores de bayas
Licores Fenoles (mg EAG/L)
Fresas
1
525
Arndanos
1
500
Cerezas
1
1080
Mora
2
447-885

1
Heinonen et al., 1998

La actividad antioxidante expresada como mM equivalentes de trolox por cada mL de licor se
muestra en la Figura 16, observndose que los rangos oscilan entre valores de 110.510.18
y 304.472.65 mM equivalentes de trolox/mL. Destacndose que el licor L2 tiene la mayor
actividad antioxidante, seguido por el licor L3, adems ambos licores tienen el mayor
contenido de fenoles. Sin embargo el licor con el mayor contenido de fenoles no tiene la
mayor capacidad antioxidante, lo cual sugiere que existen otros metabolitos que estn
aportando actividad antioxidante en los licores, como la vitamina C.
47


Figura 16. Actividad antioxidante en los licores de mora

6.6 Anlisis estadstico de las mediciones efectuadas a los licores de mora
A continuacin se presentan el Anlisis Multivariable de la Varianza (MANOVA) empleando
una prueba multivariada de Wilks y la Correlacin cannica que ayudaran a explicar
estadsticamente las asociaciones existentes entre las variables determinadas en los licores
de mora.

6.6.1 Anlisis Multivariado de la Varianza (MANOVA)
La importancia del empleo de este anlisis multivariado radica en que ayuda a comparar las
variables globales determinadas en este estudio, proporcionando la existencia o no de
diferencia significativa entre los licores de mora de los distintos productores, incluyendo de
esta forma todas las variables de anlisis.
Como se observa en la Tabla 16, mediante esta prueba se obtuvo, , los valores de
significancia para el anlisis, encontrando que existe diferencia significativa entre ellos, es
0
50
100
150
200
250
300
350
L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9
m
M

E
q
.

T
r
o
l
o
x
/
m
L
Licores
Letras diferentes en las barras indican diferencia significativa (Tukey HSD, p<0.05) entre los licores

a
g
f
f
e
d
d
b
c
48

decir las caractersticas de los licores cambian dependiendo del productor, sin embargo el
licor L4 no muestra diferencia significativa con respecto a la muestra L8.

Tabla 16. Valores de p de la prueba multivariada de Wilks para los licores de mora
Los valores en negrita son significativamente diferentes de 0 con un nivel de significacin alfa=0.05

Las diferencias significativas obtenidas al evaluar los datos encontrados para los licores,
mediante la prueba multivariada de Wilks se pueden atribuir a que el proceso de elaboracin
de los licores es de forma artesanal, por lo que difcilmente se controla la materia prima
empleada, las variables del proceso y las condiciones de almacenamiento.
Los resultados de esta prueba no permiten declarar las variables de mayor influencia sobre
el contenido de antocianinas monomricas, %color polimrico y actividad antioxidante, por lo
que fue necesario realizar un anlisis estadstico que permitiera encontrar la asociacin entre
las variables globales.

6.6.2 Correlacin cannica

La correlacin cannica es un mtodo de anlisis estadstico que permite encontrar la
asociacin entre dos grupos de variables.
Muestra L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9
L1
L2 0.0025
L3 0.0018 0.0010
L4 0.0001 0.0006 0.0070
L5 0.0198 0.0002 0.0017 0.0010
L6 0.0025 0.0011 0.0011 0.0012 0.0083
L7 0.0230 0.0027 0.0015 0.0004 0.0008 0.0067
L8 0.0098 0.0029 0.0023 0.1326 0.0370 0.0076 0.0030
L9 0.0383 0.0015 0.0016 0.0014 0.0028 0.0056 0.0252 0.0097
49

Para este anlisis se estableci como primer bloque de variables al pH, azcares totales,
acidez, grado alcohlico y color (determinaciones fisicoqumicas), y como segundo bloque al
contenido de fenoles, antocianinas monomricas, color polimrico, densidad de color y
capacidad antioxidante.
Con el empleo de este anlisis multivariado, se obtuvieron dos races principales con
significancia de p<0.05, el signo que aparece de lado izquierdo de cada parmetro indica la
forma en que se relaciona con los otros parmetros, es as que el signo negativo (-) indica
decremento en el valor y el signo positivo (+) un incremento en el valor; a continuacin se
muestra la raz 1, y las variables fisicoqumicas que influyen sobre el contenido de
antocianinas monomricas y %color polimrico (Figura 17).







Figura 17. Raz 1 obtenida de la correlacin cannica

En la primera raz se observa que existe una alta correlacin (R
2
= 0.99) entre algunos
parmetros fisicoqumicos, colorimtricos y el contenido antocianinas monomricas, y %color
polimrico. As, la correlacin cannica tambin indic que al disminuir el valor del pH existe
un mayor contenido de antocianinas monomricas, lo cual puede deberse a que se favorece
la forma estable de las antocianinas, la forma oxonium, la cual adems da las coloraciones
caractersticas de las antocianinas monomricas (Giustin y Wrolstad, 2001).
R
2
=0.995
-pH
+ Azcares
-b*
+ h
-% Color polimrico
+Antocianinas monomricas
50

En cuanto al contenido de azcares, el %color polimrico disminuye al incrementar el
contenido de stos, lo anterior concuerda con el estudio realizado por Wrolstad et al., (1990)
en fresas congeladas donde se encontr que el oscurecimiento y el desarrollo de color
polimrico se reduce significativamente por la adicin de azcar, evitando la degradacin de
las antocianinas monomricas a intermediarios inestables de cidos fenlicos y compuestos
aldehdicos (Fleschhut et al., 2006).
Asimismo en la Figura 18 se aprecia una relacin directa entre las antocianinas
monomricas y al ngulo de matiz (h), este hecho puede ser de utilidad prctica debido a
que la medicin del ngulo de matiz podra emplearse como un indicador de la presencia de
antocianinas monomricas en los licores.
Como puede apreciarse en la Figura 18, que muestra la raz 2 de la correlacin cannica, los
factores que influyen sobre la densidad de color son la acidez y los parmetros
colorimtricos a*, b* y C. Lo anterior sugiere que al incrementar la presencia de cidos
orgnicos principalmente ctrico y mlico, los cuales se encuentran en una mayor proporcin
en las zarzamoras, tiene una repercusin no slo desde el punto de vista sensorial (Hulme,
1971), sino adems pueden llegar a regular el pH y afectar la coloracin final del licor, dado
que la densidad de color es la suma de las absorbancias a 420 y 508 nm, que son las
longitudes de onda a las que absorben las antocianinas monomricas y polimricas.






Figura 18. Raz 2 obtenida de la correlacin cannica
R
2
=0.980
+ Acidez
+Densidad de color
-a*
-b*
-C*
51

Los resultados de ambas races, se tienen elementos para pensar que con el conocimiento
de estos datos, se pueden establecer los parmetros a evaluar en los licores de mora para
preservar aquellas caractersticas importantes, no slo desde el punto de vista funcional sino
de calidad sensorial para el consumidor. Por ejemplo para en el caso especfico del pH y
azcares reductores pueden ser variables controlables en el proceso de elaboracin del licor,
permitiendo encontrar las mejores condiciones que favorezcan el mayor contenido de
antocianinas monomricas.
Con la finalidad de establecer los parmetros que tienen relacin con la actividad
antioxidante, se realiz otra correlacin cannica, en este caso entre el contenido de fenoles,
%color polimrico y antocianinas monomricas (primer bloque) y la actividad antioxidante
(segundo bloque), teniendo como nica raz la que se muestra en la Figura 19, resultando
que a menor contenido de fenoles y mayor contenido de color polimrico la actividad
antioxidante se ve disminuida (p<0.05). Esta asociacin indica que la actividad antioxidante
en los licores de mora analizados, est directamente relacionada con el contenido
antocianinas monomricas y de fenoles, lo que sugiere que deberan buscarse las
condiciones de procesamiento y almacenamiento que ayuden a preservar estos compuestos
en los licores.




Figura 19. Raz 1 de la Correlacin cannica para la actividad antioxidante

R
2
=0.792
- Fenoles totales
- Actividad
antioxidante
+ % Color polimrico
- Antocianinas monomricas
52

6.7 Determinaciones durante el tiempo de almacenamiento del licor control
A continuacin se muestran los resultados obtenidos en el licor control durante los 4 meses
de almacenamiento, as como el anlisis estadstico realizado a los mismos, que consisti en
realizar comparaciones de Tukey y correlaciones de Pearson.

6.7.1 Determinaciones fisicoqumicas al inicio del almacenamiento del licor control

Los valores de pH, porcentaje de alcohol y acidez determinados al licor control al inicio del
almacenamiento, se muestran en la Tabla 17, donde se puede observar que el porcentaje de
alcohol del licor control se encuentra por arriba del 15% estipulado por la Comunidad
Europea, sin embargo en el contenido de azcares reductores es menor a lo reglamentado
(mnimo de 100 g/L) para licores de frutas por el mismo organismo.

Tabla 17. Parmetros determinados al inicio del almacenamiento
Parmetro Valor
Azcares reductores (g/L) 83.800.40
Acidez (g c. Ctrico/100 mL) 15.090.20
Alcohol volumen (%) 18.000.00
pH 3.550.05

Cabe hacer mencin que este licor fue proporcionado por el mismo productor de los licores
L7 y L9, y los datos encontrados en cuanto a azcares reductores y alcohol volumen (%) son
considerablemente diferentes con respecto al que nos proporcionaron como licor control. La
diferencia en estos datos remarca la variacin que se puede obtener entre lote y lote de
estos licores por tratarse de un proceso artesanal.
53

6.7.2 Determinaciones colorimtricas durante el tiempo de almacenamiento del licor
control

Como se pueden observar en la Tabla 18, los parmetros de color que incrementan
significativamente durante el tiempo de almacenamiento son L*, a* y C*, estos parmetros
describen la brillantez, la coloracin hacia los tonos rojos y la saturacin de este color en el
licor control, respectivamente.
El parmetro colorimtrico a* muestra un incremento significativo con el transcurso del
tiempo, es decir se desplaza hacia los tonos rojos, lo cual pueda deberse de igual forma a la
polimerizacin de las antocianinas, que estn ayudando a estabilizar el color.

Tabla 18. Parmetros de color en el licor control durante el almacenamiento
Parmetro
1
Tiempo de almacenamiento (meses)
1 2 3 4
L* 0.460.04
d
1.460.09
c
5.670.20
b
6.150.11
a
A* 1.850.03
d
7.040.14
c
10.580.15
b
16.090.12
a
B* 0.420.08
b
-11.540.23
d
5.100.17
a
-2.910.06
c
C* 1.900.03
d
13.520.26
b
11.740.09
c
16.350.12
a
H 12.940.7
d
58.630.10
b
25.761.01
c
10.250.22
a
Dc 5.570.07
b
5.560.06
b
5.810.07
a
5.390.11
b
1
Letras diferentes en las columnas indican diferencia significativa (Tukey HSD, p<0.05) entre los licores




54

6.7.3 Variaciones en el contenido de antocianinas monomricas, %color polimrico y
actividad antioxidante durante el tiempo de almacenamiento

En la Tabla 19 se muestran los resultados obtenidos en el licor control durante el
almacenamiento con respecto al contenido de antocianinas monomricas, %color polimrico
y la actividad antioxidante.

Con respecto al contenido de antocianinas monomricas se observa de forma general una
disminucin significativa de 20.550.35 a 14.030.14 mg cianidina 3-glucsido/L licor, esta
prdida puede atribuirse al procesamiento del licor de mora y adems a las condiciones de
almacenamiento de la misma; la anterior disminucin en el contenido de antocianinas
monomricas concuerda con el estudio realizado en vinos de mora negra por Tsai et al.
(2004), quienes de igual forma experimentan una disminucin de este parmetro.


Tabla 19. Antocianinas, %color polimrico, Fenoles y Actividad antioxidante durante el
almacenamiento

Parmetro
1
Tiempo de almacenamiento (meses)
1 2 3 4
Antocianinas monomricas (mg/L) 20.550.35
a
15.780.51
b
11.410.55
d
14.030.14
c
Color polimrico (%) 56.90.01
c
62.60.02
b
63.80.02
b
72.00.02
a
Fenoles totales (mg EAG/L) 1422.3214.4
c
1315.2114.3
d
1518.9125.7
b
1733.2627.4
a
Actividad Antioxidante
2
* 94.193.43
a
62.701.11
b
50.000.20
c
63.151.15
b
1
Letras diferentes en las filas indican diferencia significativa (Tukey HSD,p<0.05) entre los licores
2
Expresado como mM Eq. Trolox/mL Licor

55

En cuanto el porcentaje de color polimrico el valor aument significativamente de 56.90.01
a 72.00.02%, lo que sugiere que durante el almacenamiento se dieron reacciones de
polimerizacin de las antocianinas, de ah que se haya tenido una disminucin de las
antocianinas monomricas.
El contenido de fenoles totales experiment una disminucin del primer al segundo mes de
1422.3214.4 a 1315.2114.3 mg EAG/L licor, sin embargo en el tercer y cuarto mes hubo
un incremento significativo de 1518.9125.7 a 1733.2627.4 mg EAG/L licor
respectivamente. El incremento en el contenido de fenoles en los meses 3 y 4 posiblemente
se debe a que durante el almacenamiento del licor control hubo liberacin de otros fenoles
que se encontraban impedidos.
La actividad antioxidante en los primeros tres meses fue disminuyendo de 94.193.43 hasta
50.000.20 mM Equivalentes Trolox/mL licor, sin embargo en el cuarto mes hubo un
incremento significativo teniendo una actividad antioxidante final de 63.151.15 mM
Equivalentes Trolox/mL licor el cual no presenta diferencia significativa con el mes 2, lo que
sugiere que la actividad antioxidante empieza a estabilizarse.
En el Apndice B se muestran las correlaciones de Pearson, donde de forma general se
observa que los factores que se ven afectados con el tiempo de almacenamiento de forma
significativa, en el licor control son el porcentaje de color polimrico y el valor del parmetro
a*, las asociaciones se describen a continuacin.
Como puede observarse en la Figura 20, dentro de las correlaciones ms relevantes
tenemos, que en las determinaciones fisicoqumicas existe una asociacin positiva
significativa de 0.98 entre el parmetro a* y el porcentaje de color polimrico, lo que indica
que al incrementar el valor de a*, tomando valores hacia los prpuras, incrementa el
56

porcentaje de color polimrico, sugiriendo que el color de los licores en gran medida est
dado por la aportacin del color polimrico.

Figura 20. Correlacin de Pearson entre el %CP y el parmetro a*

En la Figura 21 se aprecia la correlacin positiva de 0.97 entre la actividad antioxidante y el
contenido de antocianinas monomricas, lo anterior sugiere que las antocianinas
monomricas juegan un papel importante en la actividad antioxidante de los licores, por lo
que se debe procurar su preservacin durante el procesamiento y almacenamiento de los
licores.

Figura 21. Correlacin de Pearson entre las Antocianinas monomricas (AM) y la Actividad
antioxidante (AA)
%
C
P
a*
A
A
AM
r=0.98
r=0.97
57

7. CONCLUSIONES


1. El fruto maduro de zarzamora (Rubus spp) de la regin de Xico Veracruz tiene un
contenido de antocianinas monomricas de 183.630.33 mg de cianidina 3-
glucsido/100 g de fruto fresco, un contenido fenoles totales de 477.126.91 mg
equivalentes de cido glico/100 g de peso fresco y su actividad antioxidante
expresada como mM equivalentes de trolox/g peso fresco fue de 3.750.1.

2. El contenido de azcares reductores en los licores se encontr en un intervalo de
172.4 a 337.8 g/L, el contenido de alcohol se encontr en un rango de 12 a 20% Alc.
Vol., en lo que respecta a la acidez el intervalo fue de 6.69 a 14.83 g cido ctrico/100
mL y el intervalo del pH se encontr entre 2.46 y 3.75.

3. En lo que respecta al color de los licores el parmetro L* se encontr en el intervalo de
0.180.04 a 2.110.11, el parmetro a* entre 0.360.06 y 4.260.14, el parmetro b*
fue de -0.280.04 y 1.600.05, la saturacin, C*, se encontr entre 0.460.07 y
4.190.12 y el ngulo de matiz entre 10.490.34 y 51.730.84.

4. El intervalo de antocianinas monomricas de los licores de mora se encuentra entre
3.560.19 y 76.951.20 mg de cianidina 3-glucsido/L.




58


5. El contenido de fenoles totales en los 9 licores se encuentra en un intervalo de
477.120.04 y 884.980.03 mg EAG/100 mL y la actividad antioxidante de 110.510.88
a 304.472.65 mM equivalentes de Trolox/mL de licor. Un mayor contenido de fenoles
totales y antocianinas monomricas incrementa la actividad antioxidante en los licores
de mora.

6. Los parmetros fisicoqumicos de mayor influencia en el contenido de antocianinas
monomricas y el porcentaje de color polimrico son el pH, los azcares reductores y la
acidez, adems de los parmetros colorimtricos b* y ngulo de matiz (h), como indic la
correlacin cannica.

7. El anlisis de MANOVA indic que los 9 licores de mora evaluados fueron diferentes en
tanto a las caractersticas fisicoqumicas, antocianinas monomricas, %color polimrico,
densidad de color, fenoles totales y actividad antioxidante determinadas en cada una de
ellas, sin embargo los licores 4 y 8 no presentan diferencia significativa entre estas
variables.

8. Durante el almacenamiento del licor control de mora por cuatro meses, se observ un
incremento significativo en el %color polimrico as como un decremento en el contenido
de antocianinas monomricas, quienes juegan un papel importante en la actividad
antioxidante del licor control.

59

8. PERSPECTIVAS

Encontrar los valores de azcares reductores y pH, en el proceso de elaboracin del licor de
mora, que favorezca la estabilidad de las antocianinas monomricas y por tanto de la
actividad antioxidante.

Identificar las antocianinas monomricas y polimricas presentes en el licor de mora y
evaluar la actividad biolgica de estas fracciones.


60

REFERENCIAS
AOAC. Official Method of Analysis Association of Official Analytical Chemists. (1997). 15
th
.
William Horwits, Washington, D. C. EUA.

Avalos K., Sgroppo S. y Avanza J. (2003) Actividad Antioxidante y Contenido en Fenoles
Totales en Vinos de Origen Nacional. Facena, 19: 11-19.

Benzie, I. F.F y Strain, J.J. (1996). The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure
of Antioxidant Power: The FRAP Assay. Analytical Biochemistry. 239: 70-76.

Brand-Williams, W.; Cuvelier, M.E., y Berset, C. (1995). Use of Free a Radical Method to
Evaluate Antioxidant Activity. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie/Food
Science and Technology, 28: 25-30.

Calvo, C. y Durn, L. (1997). ptica y color. Temas en Tecnologa de Alimentos. Vol. 1. Editor J.
M. Aguilera. Instituto Politcnico Nacional. Mxico, D. F.

Casassa, F. y Catania, C. (2006). Pirantocianos, nuevos pigmentos en los vinos tintos: aspectos
cientficos e implicancias tecnolgicas. Revista de Enologa Vol.3.

Chandra, A.; Nair, M., y Lezzoni, A. (1992). Evaluation and Characterization of Anthocyanin
Pigments in Tart Cherries (Prunus cerasus L.). Journal of Agriculture and Food
Chemistry, 40: 867-898.

Cheng, G. W. y Breen, P. J. (1991). Activity of Phenylalanine Ammonialyase (PAL) and
Concentrations of Anthocyanins and Phenolics in Developing Strawberry Fruit. Journal of
American Society for Horticulture Science. 116: 865-869.

Dallas C. y Laureano O. (1994). Effects of pH, Sulphur Dioxide, Alcohol Content, Temperature
and Storage Time on Colour Composition of Young Portuguese red Table Wine. Journal
Science of Food Chemistry, 65: 477-485.

Delgado-Vargas, F. y Paredes-Lpez, O. (2003). Natural Colorants for Food and Nutraceutical
Uses. CRC Press, Boca Raton, Florida.

Delgado-Vargas, F.; Jimnez R. y Paredes-Lpez, O. (2000). Natural Pigments: Carotenoids,
Anthocyanins and Betalains- Characteristics, Processing and Stability. Critical Reviews
and Nutrition, 40: 173-289.

Deighton N.; Brennan R. y Davies H. (2000). Antioxidant Properties of Domesticated and Wild
Rubus species. Journal of the Science of Food and Agriculture. 80: 1307-1313.

Fleschhut J., Kratzer F., Rechkemmer G., Kulling S. (2006). Stability and Biotransformation of
Various Dietary Anthocyanins in vitro. European Journal of Nutrition, 45:7-18.

Folin, C., y Ciocalteau, V. (1927). Tyrosine and Tryptophan Determination in Proteins. Journal of
Biological Chemistry, 73: 627-650.

61

Garca A. (2005). Evaluacin in vitro e in vivo de la funcionalidad de un producto rico en
antioxidantes. Tesis doctoral Europea. Facultad de Veterinaria y Ciencia y Tecnologa de
los Alimentos, Universidad de Murcia, Espaa

Giusti, M.M. y Wrolstad, R. E. Unit. F1.2.1-13. Anthocyanins. (2001). Characterization and
Measurement With UV-Visible Spectroscopy. In: Current Protocols in Food Analytic
Chemistry, Wrolstad, R. E., John Wiley y Sons: New York.

Hakkinen, S., Heinonen, M., Karenlampi, S., Mykkanen, H., Ruuskanen, J., & Torronen, R.
(1999). Screening of selected flavonoids and phenolic acid in 19 berries. Food Research
International. 32: 345-353.

Halliwell, B., Gutteridge, J. M., & Aruoma, O.I. (1987). The deoxyribose method: a simple test
tube assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals.
Analytical Biochemistry. 165: 215.219.

Halliwell B. y Whiteman M. (2004). Measuring Reactive Species and Oxidative Damage in vivo
and in Cell Culture: How Should you do it and What do the Results Mean? British Journal
of Pharmacology. 142:231-255

Heinonen M. I.; Lehtonen J. P., y Hopia A. I. (1998). Antioxidant Activity of Berry and Fruit
Wines and Liquors. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 46: 25-31.

Hertog, M. G. L.; Feskens, E. J. M.; Hollman, P. C. H.; Katan, M. B., y Kromhout, D. (1993).
Dietary Antioxidant Flavonoids and Risk of Coronary Heart Disease: the Zutphen Elderly
Study. Lancet, 342: 1007-1011.

Hong, V. y Wrolstad, R.E. (1990). Characterization of Anthocyanin-Contaning Colorants and
Fruit Juices by HPLC/photodiode Array Detection. Journal of Agriculture of Food
Chemistry, 38(3): 698-708.

Huang, D., Ou B. y Prior R. L. (2005).The Chemistry Behind Capacity Assays. Journal of
Agriculture and Food Chemistry, 53: 1841-1856.

Hulme, A.C., (1971). The Biochemistry of Fruits and Their Products, vol II, Academic press, New
York.

Kuskoski E.M., Asuero A.G., Troncoso A. M., Macini_Filho J. (2005). Aplicacin de Diversos
Mtodos Qumicos para Determinar Actividad Antioxidante en Pulpa de Frutos. Cincia e
Tecnologia de Alimentos, Champinas, 25(4): 726-732.

Lee J; Koo N; Min DB. (2004). Reactive Oxygen Species, Aging, and, Antioxidative
Nutraceuticals. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 3:21-33.

Lewis, C., y Walker, J. (1995). Effect of Polysaccharides on the Colour of Anthocyanins. Food
Chemistry, 54: 325-319.

Maletic E., Kontic J. K., Preiner D. P., Jeromel A., Pat C-D y Dietrich H. (2009). Anthocyanin
Profile and Antioxidant Capacity of some Autochthonous Croatian Red Wines. Journal of
Food, Agriculture and Environment 1(7): 48-51.

62

Martnez-Valverde I., Periago M.J., Ros G. (2000). Significado Nutricional de los Compuestos
Fenlicos de la Dieta. Archivos Latinoamericanos de Nutricin, 50: 5-18.

Moure, A., Cruz J., Franco D., Domnguez J., Sineiro J., Domnguez H., Nuez M., Paraj C.
(2001). Review. Natural Antioxidants from residual sources. Food Chemistry, 72: 145-
171.

Norma oficial Mexicana, NOM-142-SSA1-1995, Bienes y servicios. Bebidas Alcohlicas.
Especificaciones Sanitarias. Etiquetado sanitario y comercial.

Norma Mexicana, NMX-V-006-1983. Bebidas Alcohlicas-Azcares Reductores Directos y
Totales-Mtodo de prueba.

Prior RL. (2003). Fruits and Vegetables in the Prevention of Cellular Oxidative Damage.
American Journal Clinical Nutrition. 78:570S-578S.

Rafter JJ. (2002). Scientific Basis of Biomarkers and Benefits of Functional Foods for Reduction
of Disease Risk: Cancer. British Journal of Nutrition, 88:219S-224S.

Rein M. Copigmentation Reactions and Color Stability of Berry Anthocyanins. (2005). University
of Helsinki. Department of Applied Chemistry and Microbiology. Food Chemistry Division.
Tesis.

Reyes-Carmona J.; Youseff G.G.; Martnez-Peniche R.A., y Lila A. M. (2005). Antioxidant
Capacity of Fruits Extracts of Blackberry (Rubus sp.) Produced in Different Climatic
Regions. Journal of Food Science, 70: 497-503.

Reglamento (CEE) n 1576/89 del Parlamento Europeo del Consejo de 29 de mayo de 1989.

Roberfroid MB. (2002). Global View on Functional Foods: European Perspectives. British
Journal of Nutrition 88:133S- 138S.

Roginsky V. y Lissi A. E. (2005). Review of Methods to Determine Chain-Breaking Antioxidant
Activity in Food. Food chemistry, 92: 235-254.

Rommel A., Wrolstad R.E. y Heatherbell D.A. (1992). Balckberry Juice and Wine: Effect of
Processing and Storage Effects on Anthocyanin Composition, Color and Appearance.
Journal of Food Science, 57: 385-391.

Snchez-Moreno C. (2002). Methods Used to Evaluate the Free Radical Scavenging Activity in
Foods and Biological Systems. Food Science and Technology, 8:121-137.

Sellappan S., Akoh CC., Krewer G. (2002). Phenolic Compounds and Antioxidant Capacity of
Georgia-grown Blueberries and Blackberries. Journal of Agriculture of Food Chemistry,
50: 2432-2438.

Siriwoharn T., Wrolstad RE.,Finn CE., Pereira CB. (2004). Influence of Cultivar, Maturity, and
Sampling on Blackberry (Rubus L. Hybrids) Anthocyanins, Polyphenolics, and
Antioxidant Properties. Journal of Agriculture Food Chemistry, 52:8021-8030.

63

Shahidi F., y Naczk M. (1995). Food Phenolics: Sources, Chemistry, Effects and Applications.
Technomic Publishing., Inc. P. 247-260.

Sims C., Morris J. (1984). Effects of pH, Sulfuric Dioxide, Storage Time, and Temperature on the
Color and Stability of the Red Muscadine Grape Wine. American Journal of Enology and
Viticulture. 35-39.

Surez, C. (Comunicacin personal). Xico, Veracruz. 1 de marzo de 2008.

TecnoAgro. Avances Tecnolgicos y Agrcolas. Ao 8, Nm. 36.

Tsai J.; Huang, H. y Huang, T. (2004). Relationship Between Anthocyanin Patterns and
Antioxidant Capacity in Mulberry Wine During Storage. Journal of Food Quality. 27: 497-
505.

Villao D., Fernndez-Pachn M.S., Moy M.L., Troncoso A.M., Garca-Parrilla M.C. (2007).
Radical Scavening Ability of Polyphenolic Compounds Towards DPPH Free Radical.
Science Direct. Talanta, 71: 230-235

Walford J. (1980). Developments in Food Colors. Applied Science Publishers (Ed). London. 116-
142.

Wang S. y Lin H. (2000). Antioxidant Activity in Fruits and Leaves of Blackberry, Raspberry, and
Strawberry Varies with Cultivar and Developmental Stage. Journal of Agriculture of Food
Chemistry, 48: 140-146.

Wesche-Ebeling P. y Montgomery M.W. (1990). Strawberry Polyphenol Oxidase: its Role in
Anthocyanin Degradation. Journal of Food Science, 55: 731-734, 745.

Wrolstad R.E., Skrede G., Lea P. y Enersen G. (1990). Influence of Sugar on Anthocyanin
Pigment Stability in Frozen Strawberries. Journal of Food Science, 4 (55): 1064-1072.

Wrolstad, R. E. (2000). Anthocyanins. In F. J. Francis, & G. J. Lauro (Eds.), Natural Food
Colorants (pp. 237252). New York: Marcel Dekker. Cap.11.

Wrolstad R. E, Durst, R.W. y Lee J. (2005). Tracking Color and Pigment Changes in
Anthocyanin Products. Trends in Food Science and Technology, 16: 423-428.

Zheng W, Wang SY. (2003). Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in Blueberries,
Chankeberries and Lingoberries. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51:502-
509.
64

ANEXO A

DETERMINACIN DEL % ALCOHOL EN VOLUMEN
(NOM-142-SSA1-1995)
Verter y medir en un matraz volumtrico 250 mL de la muestra a 200.5 C, transferirlos
cuantitativamente con 100 mL de agua destilada al matraz de destilacin que contiene barras
de agitacin y adicionarle 2.5 mL NaOH 5 N. Calentar el matraz de destilacin y recibir el
destilado en el mismo matraz donde se midi la muestra, el matraz de recepcin contiene 20
mL de agua destilada. Cuando la cantidad de destilado contenida en el matraz de recepcin se
acerque a la marca (unos 0.5 cm abajo del aforo), suspender la destilacin y retirar el matraz de
recepcin, y llevar el destilado a 20 C, aforar con agua destilada, homogeneizar y transferir el
destilado a la probeta. En una probeta de 250 mL se verte el destilado hasta unos 10 cm abajo
del nivel total. Introducir el alcoholmetro cuidadosamente. El alcoholmetro debe flotar
libremente, reportar como %Alc. Vol. a 20 C.

ANEXO B
DETERMINACIN DE pH EN EL LICOR
(Mtodo 960.10)
Dejar que el electrodo del potencimetro se atempere antes de usar de acuerdo a las
instrucciones de manufactura. Comprobar con soluciones recin preparadas, saturadas,
solucin acuosa de K bitartrato. Ajustar el potencimetro para leer a 3.55 s 20, 3.665 a 25 o
3.55 a 30.
65

Dejar libre limpio al electrodo enjuagando con agua e introducirlo a la muestra. Colocar el
electrodo en la muestra fresca, determinar la temperatura, y leer el pH a un valor cercano al
0.01 unidades.

ANEXO C
DETERMINACIN DE ACIDEZ TITULABLE EN EL LICOR
(Mtodo 962.12)
Adicionar 1 mL de fenolftalena (solucin indicador) a 200 mL agua caliente, hervir agua en un
matraz Erlenmeyer de 500 mL. Neutralizar para distinguir el cambio a rosa. Adicionar 5.0 mL de
muestra y titular con 0.1 N de NaOH estandarizado hasta el punto final, usar una buena
iluminacin y un fondo blanco.
g cido ctrico/100 mL licor = mL NaOH N 0.993 100/5

ANEXO D
DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES
(NMX-V-006-1985)
Determinacin de la solucin Soxhlet
Colocar 10 mL de la slucin soxhlet (formada por partes iguales del reactivo de Fehling A y B de
Fehling) adicionarle 40 mL de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 250 mL, adicionar
perlas de ebullicin y calentar a ebullicin por un minuto. Por otra parte preparar una solucin
de glucosa al 0.5% y colocarla en una bureta. Adicionar la solucin de glucosa al la solucin del
66

matraz hasta obtener una coloracin azul suave y posteriormente adicionar 5 gotas de azul de
metileno como indicador y seguir adicionando hasta obtener una coloracin rojo ladrillo.

Determinacin de azcares reductores totales
Colocar 50 mL de muestra en un matraz Erlenmeyer de 100 mL y se le adiciona 10 mL gota a
gota de HCl concentrado. Calentar en un bao de agua a 60 C durante 10 minutos, enfriar a
temperatura ambiente y neutralizar con NaOH 5N. Aforar a 100 mL y homegeneizar y valorar
con la solucin de glucosa al 0.5%.

67

APNDICE A
Matriz de correlacin de Pearson para los licores de mora
Los valores en negrita son significativamente diferentes de 0 con un nivel de significacin alfa=0.05
1
Antocianinas monomricas
2
% color polimrico
3
Actividad Antioxidante
4
Azcares reductores
5
Densidad de color

Variables Fenoles AM
1
%CP
2
AA
3
AR
4
% Alc. Vol. Acidez pH DC
5
L* a* b* C* h
Fenoles 1 0.035 -0.064 0.679 0.205 -0.290 0.456 -0.104 0.273 -0.099 -0.065 -0.168 -0.086 -0.117
AM
1
0.035 1 -0.916 0.381 0.592 -0.543 -0.538 -0.649 0.302 -0.434 -0.525 -0.641 -0.512 0.972
%CP
2
-0.064 -0.916 1 -0.547 -0.626 0.628 0.529 0.810 -0.526 0.596 0.522 0.712 0.525 -0.882
AA
3
0.679 0.381 -0.547 1 0.272 -0.299 -0.200 -0.399 0.649 -0.459 -0.116 -0.451 -0.160 0.202
AR
4
0.205 0.592 -0.626 0.272 1 -0.746 -0.213 -0.648 0.202 -0.447 -0.603 -0.660 -0.604 0.590
% Alc. Vol. -0.290 -0.543 0.628 -0.299 -0.746 1 -0.114 0.679 -0.170 0.447 0.578 0.618 0.580 -0.530
Acidez 0.456 -0.538 0.529 -0.200 -0.213 -0.114 1 0.125 -0.214 0.179 0.035 0.219 0.040 -0.496
pH -0.104 -0.649 0.810 -0.399 -0.648 0.679 0.125 1 -0.410 0.836 0.766 0.867 0.775 -0.702
DC
5
0.273 0.302 -0.526 0.649 0.202 -0.170 -0.214 -0.410 1 -0.140 0.236 -0.101 0.211 0.222
L* -0.099 -0.434 0.596 -0.459 -0.447 0.447 0.179 0.836 -0.140 1 0.827 0.940 0.858 -0.461
a* -0.065 -0.525 0.522 -0.116 -0.603 0.578 0.035 0.766 0.236 0.827 1 0.906 0.998 -0.601
b* -0.168 -0.641 0.712 -0.451 -0.660 0.618 0.219 0.867 -0.101 0.940 0.906 1 0.926 -0.656
C* -0.086 -0.512 0.525 -0.160 -0.604 0.580 0.040 0.775 0.211 0.858 0.998 0.926 1 -0.581
h -0.117 0.972 -0.882 0.202 0.590 -0.530 -0.496 -0.702 0.222 -0.461 -0.601 -0.656 -0.581 1
68

APNDICE B
Matriz de correlacin de Pearson para el Licor control

Variables Mes AM mg/L Fenoles L* a* b* C* h DC % CP AA
Mes 1 -0.803 0.824 0.950 0.997 0.122 0.855 0.533 -0.215 0.965 -0.727
AM mg/L -0.803 1 -0.418 -0.860 -0.774 -0.224 -0.775 -0.210 -0.355 -0.657 0.974
Fenoles 0.824 -0.418 1 0.820 0.814 0.392 0.450 0.292 -0.380 0.808 -0.249
L* 0.950 -0.860 0.820 1 0.922 0.410 0.703 0.242 0.050 0.837 -0.741
a* 0.997 -0.774 0.814 0.922 1 0.048 0.879 0.598 -0.281 0.982 -0.710
b* 0.122 -0.224 0.392 0.410 0.048 1 -0.346 -0.752 0.560 -0.094 -0.025
C* 0.855 -0.775 0.450 0.703 0.879 -0.346 1 0.780 -0.257 0.882 -0.822
h 0.533 -0.210 0.292 0.242 0.598 -0.752 0.780 1 -0.753 0.720 -0.307
DC -0.215 -0.355 -0.380 0.050 -0.281 0.560 -0.257 -0.753 1 -0.455 -0.338
% Color polimrico (CP) 0.965 -0.657 0.808 0.837 0.982 -0.094 0.882 0.720 -0.455 1 -0.608
Actividad antioxidante(AA) -0.727 0.974 -0.249 -0.741 -0.710 -0.025 -0.822 -0.307 -0.338 -0.608 1
Los valores en negrita son diferentes de 0 con un nivel de significacin alfa

69

APNDICE C
CURVA DE CALIBRACIN PARA POLIFNEOLES TOTALES



APNDICE D
CURVA DE CALIBRIACIN PARA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE


0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 5 10 15 20 25 30 35
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
7
3
0

n
m
)
mg EAG/100 mL
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a


5
1
7

n
m
M ET/mL
Y= 0.000694X + 0.127
R
2
= 0.996
Y= 0.052X -0.005
R
2
= 0.999