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cánceres
Artículo
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Recibido: 14 julio 2020; Aceptado: 22 de septiembre de 2020; Publicado: 29 septiembre 2020 ---
Resumen sencillo:Los factores ambientales, como la exposición a los rayos UV y la altitud de residencia, pueden
contribuir al desarrollo del melanoma cutáneo. Por la presente informamos que la altitud de residencia se asocia
significativamente con el perfil molecular de la CM y la supervivencia específica del melanoma. El hecho de que los
diferentes miARN y el perfil transcriptómico varíen con las diferentes áreas geográficas y la altitud de residencia
podría respaldar posibles mecanismos reguladores inducidos por condiciones ambientales, como un entorno
hipóxico y/o una mayor exposición a la radiación UV.
Resumen:La incidencia de melanoma cutáneo (CM) está aumentando en todo el mundo y es la principal
causa de muerte por enfermedades de la piel en el mundo occidental. Los factores de riesgo personales
relacionados con la radiación ultravioleta ambiental (RUV) son factores etiológicos bien conocidos que
contribuyen a su desarrollo. Sin embargo, la UVR puede contribuir al desarrollo de CM en diferentes
patrones y en diversos grados. El presente estudio tuvo como objetivo investigar si la altitud de
residencia puede contribuir al desarrollo de tipos específicos de MC y/o influir en su progresión. Con
este objetivo, 306 tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) de MC primaria
diagnosticada en diferentes áreas geográficas se sometieron a B-RAF proto-oncogene serine/threonine
kinase (BRAF) y N-RAS proto-oncogene GTPase (NRAS ) detección del estado mutacional y perfilado de
ARNm y miARN mediante qPCR.CD2,PDL1, oCD274) y pigmentación (MITF,TYRP1, yTRPM1). Además,
cuatro microRNAs, a sabermiR-150-5p, miR-155-5p,miR-204-5p, ymiR-211-5p, se incluyeron en el perfil.
Nuestros resultados destacan diferencias en el perfil de expresión génica de CM primario con respecto
al área geográfica y la altitud de residencia. La supervivencia específica del melanoma estuvo
influenciada por la expresión génica de ARNm y miARN y varió con la altitud de residencia de los
pacientes. En detalle,TYRP1y miR-204-5pfueron altamente expresados en pacientes que viven en
altitudes más altas, a diferencia demiR-150-5p, miR-155-5p, ymiR-211-5p. Dado que los miARN están
altamente regulados por especies reactivas de oxígeno, es posible
que diferentes mecanismos reguladores caracterizan a los CM a diferentes altitudes debido a los diferentes
entornos e intensidades de UVR.
1. Introducción
La incidencia de melanoma cutáneo (CM) está aumentando en todo el mundo y sigue siendo la principal causa
de muerte por enfermedades de la piel en el mundo occidental.1]. Los factores de riesgo personales, incluidos los
antecedentes familiares, los lunares múltiples, la piel clara, los ojos azules, el cabello rojo y las pecas, junto con la
exposición ambiental a los rayos UV, son factores etiológicos bien conocidos que contribuyen al desarrollo de la MC.2,
3]. Sin embargo, la MC no es una enfermedad homogénea; existen diferentes tipos de CM y la radiación UV (UVR)
puede contribuir al desarrollo del melanoma de diferentes maneras y en diversos grados [2]. La misma UVR que llega
a la superficie terrestre puede variar según distintas variables. Los factores bien conocidos que influyen en las
emisiones de UVR son la capa de ozono, la hora del día, el período del año y la latitud, con un aumento de las
emisiones de UVR más cerca del ecuador. La altitud es otro factor que contribuye, con un incremento de emisión de
10-12 % por cada 1000 m de elevación [4].
La CM ha sido clasificada molecularmente tanto a nivel genómico como transcriptómico.5]. A nivel
genómico se han identificado tres subtipos: elBRAFsubtipo, el más común, caracterizado por mutaciones de
residuos de aminoácidos V600 y el subtipo RAS identificado por la presencia deRASmutaciones de puntos
calientes (NORTE-,K-,H-RAS). Las mutaciones más frecuentes de RAS implican laN-RAS, especialmente el residuo
de aminoácido Q61. Normalmente,BRAFySNAlas mutaciones son mutuamente excluyentes [6]. El tercer grupo
fue definido porNF1mutaciones, que regulan a la baja la función RAS a través de la actividad GTPasa. Se ha
identificado un cuarto grupo por la falta de mutaciones de punto caliente en los genes mencionados
anteriormente; por lo tanto, ha sido nombradoTipo salvaje triple[5]. A nivel transcriptómico, se reconocieron
tres grupos de CM: el grupo "inmune", que incluye CM con alta expresión de genes asociados con células
inmunes, moléculas de señalización inmune y receptores. El subtipo “queratina”, que es el principal grupo
representativo en los melanomas primarios, se caracteriza por una alta expresión de genes asociados con las
queratinas, la pigmentación, el epitelio y el desarrollo neuronal. Por el contrario, el último grupo denominado
“MITF-low” se caracteriza por una baja expresión de genes implicados en la pigmentación, epiteliales y varios
MITFdianas genéticas [5]. Entre todos, el subtipo de grupo "queratina" parece ser el peor en términos de
pronóstico, mientras que el grupo "inmune" se ha relacionado con una mejor supervivencia [5].
Además, a nivel molecular, se ha demostrado que los microARN están relacionados con variables clínicas,
incluido el resultado de la CM.7–11].
El objetivo del presente estudio fue investigar si las variables ambientales, como la altitud de
residencia, podrían contribuir al desarrollo de tipos específicos de melanomas cutáneos, podrían
promoverlo y si se pueden vincular con la progresión y/o supervivencia de la MC.
Con este fin, seleccionamos casos primarios de MC de regiones geográficas vecinas que diferían con
respecto a las altitudes residenciales. En particular, seleccionamos casos de CM de pacientes que viven tanto al
nivel del mar (Trieste) como en áreas montañosas (Tirol del Norte y del Sur) y caracterizamos estos casos a nivel
molecular. Con respecto a los pacientes que viven al nivel del mar, reclutamos residentes de la provincia de
Trieste con diagnóstico de melanoma cutáneo tanto del Hospital Universitario de Trieste como del Instituto
Nacional del Cáncer de Aviano. Los residentes de la provincia de Bolzano (Bozen), Innsbruck e Innsbruck-Land
componían el grupo de pacientes de la zona montañosa. La clasificación transcriptómica del grupo inmune se
logró mediante la cuantificación deCD2yPDL1ARNm, mientras que para la queratina y los grupos bajos de MITF,
se analizó el nivel de expresión de tres genes de pigmentación, a saberMITF, TYRP1, yTRPM1por su diferente
expresión en los grupos “keratina” y “MITF-low” [5]. Además, también se investigaron cuatro microARN por su
posible asociación con las características clínicas, el pronóstico y la supervivencia.7,8,11–15], y análisis
transcriptómicos. En detalle, miR-150-5p se vinculó con
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los linfocitos infiltrados en tumores (TILS) y con el protooncogén MYB, que desempeña un papel en la
regulación de la hematopoyesis y la tumorigénesis.8,11,15]. miR-155-5p, como un microARN multifuncional
típico, parece modular la respuesta inmune y, por otro lado, interactúa con miR-16 en la regulación de TYRP1 [
dieciséis]. En consecuencia, miR-150-5p y miR-155-5p están fisiológicamente involucrados en procesos
inmunológicos. Se informó que ambos eran biomarcadores potenciales y dianas para las inmunoterapias. Los
otros dos microARN, miR-204-5p y miR-211-5p, pertenecen a la misma familia de miARN (familia miR204/211) y
actúan como supresores de tumores. Ya se han relacionado con las características del cáncer y la progresión
del tumor [7,12–14]. Además, miR-211-5p actúa como un interruptor metabólico, sensibilizando a los
melanocitos a la falta de oxígeno, un mecanismo perdido en las células de melanoma.17].
2. Resultados
Se aplicó la Clasificación Internacional de Enfermedades de Oncología (CIE-O) para definir los sitios anatómicos y
los subtipos histopatológicos de MC. En nuestra cohorte, solo los subtipos nodular, de extensión superficial y acral
estaban numéricamente bien representados; por lo tanto, el melanoma amelanótico, lentigo maligno, desmoplásico,
tipo nevus azul de células fusiformes y de células epitelioides se fusionaron en un grupo llamado "otros".
La cohorte se subdividió en 3 áreas geográficas diferentes de residencia, a saber, el área de Tirol del Sur
(BZ), la provincia de Trieste (TS) y la ciudad de Innsbruck y el distrito de Innsbruck-Land (I/IL). Los pacientes
diagnosticados en el Instituto Nacional del Cáncer de Aviano (CRO- Italia) fueron asignados al grupo de
residentes de Trieste (TS).
En general, se incluyeron en el estudio 306 pacientes con diagnóstico de MC: 107 (35%) casos
fueron reclutados del Hospital Central de Bozen (Italia); 94 (31%) del Hospital Universitario de Trieste
(Italia), 74 (24%) pacientes de la Universidad Médica de Innsbruck (MUI-Austria), y 31 (10%) del Instituto
Nacional del Cáncer de Aviano (CRO-Italia ).
Los detalles de los pacientes se informan en la Tabla1. Mujeres y hombres estuvieron igualmente representados
(prueba Chi-cuadrado,pags=0.9), y no hubo diferencia en la distribución de género con respecto a la altitud de residencia (
pags=0,5), estadio tumoral (pags=0,7), presencia de ganglios linfáticos (pags=0.5), espesor de Breslow (pags=0,1), ulceración (
pags=0.3) e histotipo (pags=0,5). Con respecto a la edad, las mujeres eran significativamente mayores que los hombres como
se muestra en la Figura S1 (pags=0,03).
BZ TS I/IL Total
Variable y su descripción norte=107 norte=125 norte=74 norte=306
(35%) (41%) (24%) (100%)
Características geográficas
Media en metros 884 53 699 279
Altitud de residencia pags<0.0001†
(rango) (214–2153) (0–253) (564-1513) (0–2153)
Características demográficas
Tabla 1.continuación
Características patológicas
25 de 107 29 de 125 18 de 74 72 de 306
Localización§ Cabeza y cuello y caraa
(23,4%) (23,2%) (24,3%) (23,5%)
La edad promedio de los pacientes fue de 69 años (rango de 16 a 101 años) y el grosor de Breslow promedio fue
4,6 mm (rango 1,8-30 mm). Entre las tres cohortes, no hubo diferencias significativas entre las características del
tumor, incluso si el tumor en estadio II estaba más representado en nuestro conjunto de datos (pags=0.003) y el
melanoma nodular fue el histotipo más frecuente en el grupo de TS y BZ (pags<0.0001 Tabla1).
Los portaobjetos de muestra se analizaron para mutaciones en BRAF V600E y NRAS Q61R mediante
inmunohistoquímica. Las muestras con tinción positiva o dudosa se sometieron a análisis ddPCR. Dieciocho
especímenes fueron excluidos de la caracterización de la mutación por falta de material. Las 288 muestras
resultantes de las 306 se analizaron en busca de mutaciones en BRAF y NRAS: 96 (33,3 %) pacientes tenían
mutación en BRAF (V600E o V600K), mientras que 62 (21,5 %) pacientes tenían mutaciones en el gen NRAS
(Q61R, Q61K, Q61L, o Q61H). Una muestra con doble positividad en la IHC se excluyó de análisis posteriores.
Todos los resultados se reportan en la Tabla2.
Las asociaciones del estado mutacional con las características de CM de los pacientes se enumeran en la Tabla3. De aquí en
adelante, solo se informan los resultados estadísticamente significativos. Las mutaciones BRAF fueron más frecuentes en hombres (
pags=0.04), en CM ubicado en el baúl (pags=0,02) y en pacientes más jóvenes (pags=0,0001). En el momento del diagnóstico de CM, los
pacientes con mutaciones BRAF V600 eran más jóvenes que los pacientes con mutación de tipo salvaje y NRAS Q61, (pags=0.0005 y
pags=0,0001, respectivamente). En detalle, la edad en el momento del diagnóstico difirió significativamente con respecto a la carga de
la mutación: la edad media de los pacientes con mutación BRAF fue de 62 años, que fue menor que la de los pacientes de tipo salvaje
(edad media 71 años) y los pacientes con mutación NRAS (edad media 73 años) (pags=0,0001) (Tabla3).
En nuestra cohorte, la tasa de CM con mutación BRAF en pacientes con afectación positiva del LN en el momento del
diagnóstico fue significativamente diferente en comparación con los pacientes que no tenían afectación del LN (pags=0,02). El
porcentaje de pacientes con ganglios linfáticos positivos fue mayor en pacientes con mutación BRAF (norte=25 de 96, 26%)
que en los de tipo salvaje (norte=16 de 164, 12,9%). Por el contrario, entre los MC LN negativos, el 81,5% de los pacientes (
norte=101 de 124) eran de tipo salvaje y el 74% (norte=71 de 96) tenían mutación BRAF. En el modelo de regresión logística
primaria (norte=288), la edad (años), el sexo, el área geográfica, la altitud de residencia, el sitio anatómico del MC, la
profundidad de Breslow, la presencia de ulceración y la afectación de los ganglios linfáticos fueron covariables investigadas
para afectar el estado mutacional. Sitio anatómico (pags=0,011) y afectación de los ganglios linfáticos (pags=0.049) tuvo una
influencia estadísticamente significativa en la tasa de mutación BRAF y NRAS detectada (regresión generalpags=0,04-
estimación posterior mediante la prueba de bondad de ajuste de Pearson χ2pags=0.3). Se repitió el mismo análisis para las
mutaciones BRAF y NRAS por separado. Carga de mutación BRAF (pags=0,001- estimación posterior mediante la prueba de
bondad de ajuste de Pearson χ2pags=0,4) dependía significativamente de la edad en el momento del diagnóstico (pags=0.001)
y en significado limítrofe en el sitio anatómico donde se desarrolló CM (pags=0,05). Para las mutaciones de NRAS, los
resultados de la regresión no fueron estadísticamente significativos (pags=0,5).
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Tabla 3.Estado mutacional y características del melanoma cutáneo de los pacientes. Subrayadapagsdestaca resultados estadísticamente significativos (pags<0,05).
BRAF mutado NRAS mutado Sin mutar Total pagsValor pagsValor pagsValor
Características pagsValor Mutación BRAF NRASMut vs. BRAFMut vs.
norte=96 norte=67 norte=124 norte=287
(33,5%) (23,3%) (43,2%) (100%) vs. No mutado Sin mutar mutación NRAS
Características ambientales
33 de 96 30 de 67 43 de 124 106 de 287
Áreas geográficas BZ
(34,4%) (44,8%) (34,7%) (37%)
45 de 96 24 de 67 46 de 124 115 de 287
TS 0.2‡ 0.2‡ 0.3‡ 0.4‡
(46,9%) (35,8%) (37,1%) (40%)
18 de 96 13 de 67 35 de 124 66 de 287
I/IL
(18,8%) (19,4%) (28,2%) (23%)
Significar 449.4 593 509 660
Altitud de residencia 0.1† 0.4†† 0.3†† 0.1††
(rango) (13-1718) (46–2153) (10–2131) (10–2153)
19 de 95 13 de 67 34 de 124 66 de 286
300 < metro < 750 0.4‡ 0.4‡ 0.3‡ 0.6‡
(20%) (19,4%) (27,4%) (23%)
24 de 95 22 de 67 30 de 124 76 de 286
≥750 metros
(25,3%) (32,8%) (24,2%) (26,6%)
Características demográficas
Años 62 73 71 71
Edad Media 0.0001 † 0.0005 †† 0.5†† 0.0001 ††
(rango) (16–95) (32–101) (21–101) (16–101)
Características patológicas
20 de 96 11 de 67 38 de 124 69 de 287
Localización§ Cabeza y cuello y caraa
(20,8%) (16,4%) (30,6%) (24%)
43 de 96 21 de 67 33 de 124 97 de 287
Troncob
(44,8%) (31,3%) (26,6%) (33,8%)
8 de 96 13 de 67 19 de 124 40 de 287
miembro superiorC 0.02 ‡ 0.02 ‡ 0.1‡ 0.08‡
(8,3%) (19,4%) (15,3%) (14%)
25 de 96 22 de 67 29 de 124 76 de 287
Miembro inferiord
(26%) (32,8%) (23,4%) (26,5%)
0 de 96 0 de 67 5 de 124 5 de 287
Otros sitiosmi
(0%) (0%) (4%) (1,7%)
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Tabla 3.continuación
BRAF mutado NRAS mutado Sin mutar Total pagsValor pagsValor pagsValor
Características pagsValor Mutación BRAF NRASMut vs. BRAFMut vs.
norte=96 norte=67 norte=124 norte=287
(33,5%) (23,3%) (43,2%) (100%) vs. No mutado Sin mutar mutación NRAS
17 de 96 2 de 67 8 de 124 27 de 287
Escenario IB
(17,7%) (3%) (6,5%) (9,4%)
51 de 96 43 de 67 88 de 124 182 de 287
II
(53,1%) (64,2%) (71%) (63,4%)
23 de 96 15 de 67 15 de 124 53 de 287
tercero 0.005 ‡ 0.005 ‡ 0.2‡ 0.04 ‡
(24%) (22,4%) (12,1%) (18,5%)
5 de 96 3 de 67 7 de 124 15 de 287
IV
(5,2%) (4,5%) (5,6%) (5,2%)
0 de 96 4 de 67 6 de 124 10 de 287
desconocido
(0%) (6%) (4,8%) (3,5%)
25 de 96 14 de 67 16 de 124 55 de 287
Ganglios linfáticos Positivo
(26%) (20,9%) (12,9%) (19,2%)
0 de 96 3 de 67 7 de 124 10 de 287
desconocido
(0%) (4,5%) (5,6%) (3,5%)
3.2 3.6 3.5 4
espesor de Breslow Mediana en mm (rango) 0.1† 0.3†† 0.2†† 0.07††
(1.8−15) (1.9−30) (1.8−22) (1.8−30)
45 de 96 31 de 67 57 de 124 133 de 287
Estado de ulceración sí
(47%) (46,3%) (46%) (46,3%)
2 de 96 4 de 67 10 de 124 16 de 287
desconocido
(2%) (6%) (8%) (5,6%)
28 de 96 16 de 67 31 de 124 75 de 287
Histotipo¶ NOSF
(29,2%) (23,9%) (25%) (26,1%)
14 de 96 12 de 67 13 de 124 39 de 287
esparcimiento superficialh
(14,6%) (17,9%) (10,5%) (13,6%)
0.1‡ 0.08‡ 0.2‡ 0.7‡
0 de 96 1 de 67 6 de 124 7 de 287
acrali
(0%) (1,5%) (4,8%) (2,4%)
0 de 96 1 de 67 0 de 124 1 de 287
Desconocido
(0%) (1,5%) (0%) (0,3%)
†Prueba ANOVA ordinaria de una vía (los casos desconocidos fueron excluidos del análisis).††sin emparejart-test (los casos desconocidos fueron excluidos del análisis).‡Prueba de chi-cuadrado (los casos
desconocidos fueron excluidos del análisis). Subrayadapagsdestaca resultados estadísticamente significativos por análisis univariante (pags<0,05).§Se utilizó el código ICD-O para definir la localización anatómica
del tumor:a. C44.0; C44.1; C44.2; C44.3; C44.4;b. C44.5;C. C44.6;d. C44.7 ymi. C51.0.¶Se utilizó el código SNOMED para definir los histotipos tumorales:F. no especificado,gramo. M87213;
h. M87433;i. M87443;yo. M87453;metro. M87723;norte. M87733;o. M87803;pags. M87303;q. M87423;r. M87713.
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Los resultados moleculares se compararon con las características ambientales, a saber, el área de residencia de
los pacientes, que se subdividió en tres grupos, como se describió anteriormente, y la altitud de residencia. Las
altitudes de residencia de los pacientes fueron significativamente diferentes entre las áreas geográficas (pags<0,0001),
con una altitud media de 53 m para Trieste (TS), 884 m para Tirol del Sur (BZ) y 699 m para Innsbruck e Innsbruck-Land
(I/IL) (Tabla1). El estadio al momento del diagnóstico fue diferente entre áreas geográficas (pags=0.003, Tabla1),
porque I/IL proporcionó un número menor de casos debido a la ausencia de consentimiento informado de los
pacientes. Al comparar los estadios entre TS y BZ, no se encontraron diferencias en la distribución de estadios de CM (
pags=0.3).
TYRP1la expresión fue mayor en los pacientes que vivían en Tirol del Sur que en los que vivían en TS e I/IL
(Figura1a,pags=0.02 ypags=0,002, respectivamente). Mayores niveles de expresión demiR-150-5pymiR-155-5p
se registraron en pacientes que vivían en TS en comparación con los que vivían en BZ e I/IL (pags<0.0001 para
ambos, Figura1antes de Cristo). Por otra parte,miR-204-5p(Figura1d) se expresó menos en los pacientes
residentes en TS que en los residentes en BZ (pags<0.0001) y I/IL (pags=0,002). la expresión demiR-211-5pfue
similar entre los pacientes que vivían en Trieste y Tirol del Sur, pero difería entre los residentes de TS e I/IL (
pags<0.0001, figura1e) y entre residentes de BZ e I/IL (pags<0.0001) (Figura1mi).
Figura 1.Gráficos de caja que representan los niveles de expresión de ARNm y miARN (proporción de ciclos
de umbral) que fueron diferentes entre las áreas geográficas: (a) La proteína relacionada con la tirosinasa
1 (TYRP1) se expresó más en la cohorte de Tirol del Sur/Bozen (BZ), que en la provincia de Trieste TS y en la
ciudad de Innsbruck y el distrito de Innsbruck-Land (I/IL) (pags=0.02 ypags=0,002); (b) miR-150-5p y (C)
miR-155-5p se expresaron más en muestras TS que en BZ e I/IL (cada comparación mostró pags<0,0001); (
d) la expresión de miR-204-5p es menor en pacientes con ST en comparación con los que viven en BZ e I/IL
(pags<0.0001,pags=0,002, en orden); (mi) la expresión de miR-211-5p fue menor en I/IL que en los grupos
TS y BZ (ambospags<0,0001). La caja se extiende desde los percentiles 25 al 75, la línea media indica la
mediana y los bigotes son los percentiles 5 y 95 (prueba de Mann-Whitney).
Figura 2.Gráficos de caja que representan los niveles de expresión de ARNm y miARN (proporción de ciclos de
umbral) que fueron diferentes según la altitud de residencia: la expresión de (a) miR-150-5p (pags<0.0001), (b)
miR-155-5p (0.001), (d) miR-211-5p (pags=0,006) disminuyó a medida que aumentó la altitud, mientras que (C)
miR-204-5p (pags<0,0001). (mi) Aumento de la expresión de TYRP1 a partir de 300 m de altitud (pags=0,03). La
caja se extiende desde los percentiles 25 al 75, la línea del medio indica la mediana y los bigotes son los
percentiles 5 y 95 (pagsvalores en el gráfico se refieren a la prueba de correlación de Spearman). Los límites de
altitud son≤300 m, entre 300 y 750 m, y≥750 metros
Los niveles de expresión de ARNm y microARN se relacionaron con el sexo y la edad de los pacientes en el momento del
diagnóstico. De aquí en adelante, solo se informan los resultados estadísticamente significativos.
Basado en un corte propuesto a los 75 años para pacientes de edad avanzada [18], los datos se agruparon en consecuencia. Se
encontraron diferencias en la estadificación y agrupaciones de CM (prueba de Chi-cuadradopags=0,01), es decir, los pacientes en
estadio II eran mayores que los pacientes en estadio I y III (prueba de Mann-Whitney,pags=0.002 ypags=0,02, respectivamente).
Además, los pacientes con ganglios linfáticos positivos eran ligeramente más jóvenes que aquellos con ganglios negativos (test de
Mann-Whitney,pags=0,04).
la expresión deCD2,TRPM1, ymiR-204-5pdisminuyó en pacientes con edad igual o mayor a 75 años, como se
muestra en la Figura S2 (pags=0.002,pags=0.001 ypags=0,04).
Los niveles de expresión de los ARNm y miARN analizados se relacionaron con las características de la CM, como
los sitios anatómicos, el grosor de Breslow, la presencia de ulceración y el histotipo.
Los sitios anatómicos se definieron de acuerdo con la Clasificación Internacional de Enfermedades para Oncología (CIE-O) y se
dividieron en cabeza, cuello y cara, tronco, miembros superiores y miembros inferiores.TRPM1el nivel de expresión fue menor en los
melanomas desarrollados en las extremidades inferiores que en los de la extremidad superior (pags=0.008), como se muestra en la
Figura S3. Es más,miR-150-5pmostró una expresión significativamente mayor en CM en las extremidades superiores en comparación
con las de las extremidades inferiores (pags=0.02) (Figura S3).
En nuestra cohorte,CD2,PDL1,miR-150-5p,miR-155-5p, ymiR-204-5pLa expresión se relacionó significativamente
con la etapa CM, es decir, su expresión disminuye a medida que avanza la etapa (pags<0.0001,pags=0.002, pags=
0.0001,pags=0.01, ypags=0,02, respectivamente; Figura3a–e).
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Figura 3.Gráficos de puntos de dispersión que representan los niveles de expresión de ARNm y miARN (proporción de ciclos de
umbral) que fueron diferentes según el estadio del melanoma cutáneo (CM): (a) CD2, (b) CD274, (C) miR-150-5p, (d) y miR-155-5p, y (
mi) miR-204-5p disminuyó a medida que avanzaba la etapa (pags<0.0001,pags=0.002,pags=0.0001, pags=0.01 ypags=0,02). Las
líneas medias se refieren al valor de la mediana (pagslos valores en el gráfico se refieren a la prueba de correlación de rangos de
Spearman usando el estadio CM como la variable de rango).
Los parámetros de estadificación del AJCC, como la positividad de los ganglios linfáticos, el grosor del tumor y la
ulceración, se correlacionaron significativamente con los niveles de expresión de algunos ARNm y miARN analizados
en este estudio. En particular,CD2yPDL1la expresión génica fue menor en las muestras con ganglios linfáticos
positivos (pags=0.0001 ypags=0,01, respectivamente; Figura S4). Se obtuvieron resultados similares paramiR-150-5py
miR-155-5p(Figura S4) (pags=0.0004 ypags=0,001, respectivamente).
Agrupación de muestras según T categorías de CM [19] mostró que los niveles de expresión deCD2 yTRPM1disminuyó a
medida que aumentó el grosor del CM (pags=0.0001 ypags=0,0006, respectivamente; Figura4a,b). Se encontraron resultados
similares paramiR-150-5pymiR-204-5p, que se correlacionaron inversamente con el espesor de CM (pags=0.0001 ypags=
0,0004, respectivamente; Figura4discos compactos).
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Figura 4.Los gráficos de puntos de dispersión que representan los niveles de expresión de ARNm y miARN (proporción de ciclos de
umbral) fueron diferentes según el grosor de CM: (a) CD2 y (b) La expresión de TRPM1 disminuyó a medida que aumentó el grosor
del tumor (pags=0.0001 ypags=0,0006); similar, (C) miR-150-5p y (d) y miR-204-5p se correlacionaron negativamente con el grosor
del tumor (pags=0.0001 ypags=0,0004). Las líneas medias se refieren al valor de la mediana (pagslos valores en el gráfico se
refieren a la prueba de correlación de rangos de Spearman usando la profundidad de Breslow como una variable continua).
En cuanto a la ulceración, los niveles de expresión deTRPM1,MITF, ymiR-204-5pen nuestra cohorte fueron mayores en
las MC no ulceradas que en las ulceradas (pags=0.006,pags=0.03, ypags=0,001, respectivamente).
Los niveles de expresión de los ARNm y miARN analizados se relacionaron con el estado mutacional de
CM. Respectivamente,CD2los niveles de expresión fueron significativamente más altos en CM de tipo salvaje
que enSNA-CM mutado (pags=0,01). Considerando ambosBRAFySNAmutaciones, la expresión de miR-150-5p
fue mayor enBRAF-CM mutado que enSNA-CM mutado (pags=0.0001) (Figura S5).
La supervivencia específica del melanoma (MSS) fue significativamente diferente entre los pacientes diagnosticados en
las diferentes áreas geográficas (pags=0.0009), que puede estar relacionado con la diferente distribución de las etapas de CM
reportadas anteriormente (Tabla1). Al estratificar los datos de supervivencia por etapas de CM, MSS fue significativamente
diferente para la etapa II (pags=0,04) y estadio IV (pags=0,01), por lo que se observó un MSS más corto para los residentes de
Tirol del Sur (BZ) y parcialmente de Innsbruck e Innsbruck-Land (I/IL) (solo para la etapa II de CM).
La altitud residencial se dividió en tres grupos de la siguiente manera: (1) altitud de residencia≤300 msnm, (2),
altitud de residencia entre 300 y 750 m, y (3) altitud de residencia superior a 750 m snm. Considerando los tres
grupos, la supervivencia de los pacientes varió significativamente con la altitud residencial (pags=0,0009), con un MSS
más corto para pacientes que viven por encima de los 300 m (Figura5A). En orden
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para excluir posibles sesgos, los MC en estadio IV se excluyeron del análisis de supervivencia. Los resultados confirmaron que
la altitud de residencia influye en el MSS (pags=0.006, figura5B). Dado que los pacientes que vivían en Innsbruck e Innsbruck-
Land tenían una distribución por etapas diferente, los análisis de supervivencia se limitaron a los pacientes que vivían en las
regiones de Trieste (TS) y Bozen (BZ), donde no se registraron diferencias con respecto a la distribución por etapas. Se
obtuvieron resultados similares considerando y excluyendo los MC en estadio IV, es decir, la supervivencia fue más corta para
los pacientes que vivían por encima de los 750 m snm (pags=0.002 ypags=0.02, respectivamente) como se muestra en la
Figura5CD.
Figura 5.Curvas de supervivencia de Kaplan Meier para la supervivencia específica del melanoma ajustada por edad en el
momento del diagnóstico (MSS) para la altitud de los rangos de residencia (menos de 300 m, entre 300 y 750 m y más de
750 m); (A) toda la cohorte,pags=0,0009; (B) toda la cohorte sin CM en estadio IV,pags=0,006; (C) en casos de TS/BZ, pags=
0.002 y (D) en casos de TS/BZ sin estadio IV CM,pags=0.02. Los gráficos de la función de supervivencia se ajustaron a la
edad media de los pacientes (57,6 años). MSS: supervivencia específica del melanoma (pagsvalores en el gráfico se
refieren a la prueba de rango logarítmico).
También se encontraron resultados similares para la supervivencia general (Figura S7), pero el análisis multivariado no
arrojó la altitud de residencia como una variable asociada a la supervivencia general como se muestra en la Tabla S4.
La influencia de mRNA y miRNA en la supervivencia de los pacientes se investigó dicotomizando los niveles de
expresión de mRNA y miRNA según su valor medio. En toda la cohorte, la supervivencia específica del melanoma (MSS)
estuvo influenciada porCD2,PDL1(CD274), yMITF(pags=0.01, pags=0.003,pags=0.03, respectivamente, Figura6C.A). Los
niveles de expresión más altos de estas transcripciones se asociaron con MSS más prolongados, lo que muestra un
efecto protector sobre la supervivencia. Un resultado similar se encontró para miR-150-5p,miR-155-5p, ymiR-211-5p,
con niveles de expresión más altos asociados con una supervivencia más larga (en análisis univariado) como se
muestra en la Figura6d, e, f (pags=0.0001,pags=0.004, ypags=0,02, respectivamente). Sin embargo, el análisis de
regresión de Cox multivariante no confirmó la dependencia de MSS de los niveles de expresión de esos transcritos y
miRNAs (Tabla4). La regresión también arrojó un efecto de TYRP1 en el MSS de los pacientes; en el análisis univariado,
el efecto adverso de ese gen se limitó solo a pacientes en estadio II (pags=0,04). En el análisis de supervivencia libre de
recaídas (RFS), solo el CD2 pareció influir en la supervivencia de los pacientes, como se muestra en la Figura S8.
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Figura 6.Curvas de supervivencia de Kaplan Meier para supervivencia específica de melanoma (MSS) para CD2,pags=0.01 (
a); CD274, pags=0.003 (b); MITF,pags=0.03 (C); miR-150-5p,pags=0.0001 (d); miR-155-5p,pags=0.004 (mi); y miR-211-5p,
pags=0.02 (F). La expresión del gen y del miRNA se dicotomizó en expresión baja y expresión alta para el valor medio de
cada transcrito (pagsvalores en el gráfico se refieren a la prueba de rango logarítmico).
Tabla 4.continuación
1:Subrayadapagsdestaca la importancia estadística;2: En cursiva se reportan los valores de la regresión de Cox por
exclusión de pacientes de Innsbruck y sus tierras.
3. Discusión
Nuestro estudio aporta nuevos conocimientos a la comprensión de la complejidad de los factores intrínsecos y
ambientales implicados en el desarrollo y la progresión del melanoma. En particular, observamos que la altitud de
residencia se correlaciona significativamente con el perfil molecular de CM y la supervivencia específica del melanoma.
Los niveles de expresión demiR-150-5p,miR-155-5p, ymiR-211-5pfueron significativamente mayores en los pacientes
que vivían en Trieste (TS), que es una ciudad situada junto al mar, en comparación con las áreas geográficas de Tirol
del Sur (BZ) e Innsbruck/IL (I/IL), que se caracterizan por una mayor altitud de residencia (en nuestro conjunto de
datos, la altitud media de la región de Tirol del Sur es de 884 m snm y de I/IL es de 700 m snm). La tendencia opuesta
se encontró paramiR-204-5pyTYRP1, que se expresaron significativamente en CM de pacientes que viven en Tirol del
Sur. Los resultados del estudio también se confirmaron cuando los niveles de expresión se correlacionaron con la
altitud (asl). Realmente,miR-150-5p, miR-155-5p, ymiR-211-5pla expresión disminuye a medida que aumenta la altitud;
Por el contrario,miR-204-5pyTYRP1fueron significativamente más altos en pacientes que vivían en altitudes de 750 m
snm o superiores. Una posible explicación de nuestro hallazgo podría estar relacionada con un aumento de la RUV y
un ambiente hipóxico en altitudes más altas [20]. Relativa a laTYRP1gen, es bien conocido que el factor de
transcripción Usf-1 activa el promotor de la tirosinasa por exposición UV [21]. Además, se ha demostrado que los
perfiles de miARN varían en la piel expuesta al sol.22] y que el estrés oxidativo [23] puede inducir o suprimir la
expresión de miARN. Por lo tanto, una mayor altitud con un ambiente hipóxico y una mayor intensidad de UV pueden
explicar las diferencias detectadas en la expresión de miARN en nuestra cohorte. Aunque se encontró una afinidad
muy alta por mirDIP (http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/) entre miR-155-5p y HIF1A, el factor 1 inducible por hipoxia, así
como entre miR-204-5p y HIF1AN, el inhibidor de la subunidad alfa del factor 1 inducible por hipoxia, los datos
experimentales sobre la expresión de HIF1A en nuestra cohorte no respaldaron esta hipótesis (ver tablas S5 y S6).
Micro RNA-155-5p, que se expresó en gran medida en pacientes que vivían en altitudes más bajas y al nivel del mar,
no contribuyó directamente a una disminución de la actividad transcripcional a través de la unión al ARNm de HIF1A,
en desacuerdo con otros.24]. Los experimentos in vivo también demostraron la relación entre la exposición a los rayos
UV y la regulación a la baja de miR-155-5pen el desarrollo del carcinoma de células escamosas (SCC) [25,26]. Además,
estudios in vitro han demostrado quemiR-150-5pestá regulado a la baja por la hipoxia en las líneas celulares
pancreáticas.27]. Sin embargo, los miARN mencionados anteriormente se han descrito como biomarcadores
favorables en melanomas cutáneos o como miARN supresores de tumores.9,14,28,29]. El hecho de que se hayan
detectado diferentes miRNAs en diferentes áreas geográficas caracterizadas por diferentes altitudes apoya la
hipótesis de posibles mecanismos reguladores inducidos por condiciones ambientales, como un ambiente hipóxico y/
o una mayor exposición a la radiación UV. Sin embargo, hasta ahora, no se ha encontrado ninguna evidencia en
nuestros datos que respalde esta hipótesis. Reconocemos de todos modos que la hipoxia hipobárica en altitudes que
van desde 564 a 2153 m snm de los pacientes que viven en Bozen, Innsbruck y sus tierras puede ser insignificante.
La altitud de residencia de 750 m snm o más afectó negativamente la supervivencia específica del melanoma de
los pacientes; sin embargo, aunque estadísticamente significativo, el factor de riesgo revelado por la regresión de Cox
fue 1. Si bien este resultado puede estar sesgado por una distribución desigual de los estadios de MC entre los
diferentes grupos geográficos, se mantuvo estadísticamente significativo al considerar solo los casos del Sur
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Tirol (BZ) y Trieste (TS), que se distribuyeron por igual. De acuerdo con este hallazgo, tres miARN supresores analizados en
este estudio (a saber,miR-150-5p, miR-155-5p, ymiR-211-5p) se expresaron más en los residentes a nivel de baja altitud.
Aunque la cantidad de UVR aumenta con la altitud, parece poco probable que haya una causalidad directa entre la altitud de
residencia y la mortalidad por CM. Aunque las poblaciones que viven a gran altura están expuestas a la hipoxia hipobárica
crónica y al estrés permanente debido a la exposición hipóxica, parece que la mortalidad por cáncer se reduce en las
poblaciones que viven a mayor altitud en un amplio espectro de tipos de cáncer.30]. Más bien, otros problemas logísticos y
sociales/culturales pueden desempeñar un papel, como las dificultades que encuentran los pacientes que viven en áreas
rurales para llegar a los hospitales para recibir tratamiento o el escaso conocimiento sobre los síntomas. Curiosamente, un
estudio austriaco reveló que se ha informado que las tasas de incidencia de CM aumentan con la altitud, pero las tasas de
mortalidad disminuyen.31]. Anteriormente, se informó una mayor prevalencia de melanoma a mayor altitud de residencia,
pero no se documentó ninguna influencia sobre la mortalidad específica del melanoma.32]. La regresión de Cox ha
demostrado en nuestra cohorte que el diagnóstico de melanoma en estadio IV era la principal variable que afectaba a la
supervivencia de los pacientes.
Todos los miARN analizados en nuestro estudio han demostrado estar significativamente asociados a factores
pronósticos favorables. En particular,miR-150-5pymiR-155-5pse encontró que estaban inversamente asociados con la
profundidad de Breslow, el estadio y la afectación de los ganglios linfáticos. Además, parecen influir positivamente en
la supervivencia específica del melanoma. De acuerdo con nosotros, Tembe y colegas asociadosmiR-150-5pcon
sobrevidas más largas e inversamente asociado al estadio del melanoma (principalmente III y IV) [33]. Nuestros
hallazgos parecen estar confirmados por la sobreexpresión más reciente demiR-150-5p, que se encontró que inhibía
la proliferación, migración e invasión de células de melanoma [15]. Los posibles mecanismos que explican su actividad
favorable en el melanoma son la inhibición del factor de transcripción MYB.15] y su asociación con la glucólisis
aeróbica a través de la represión SIX1 [28]. Con respecto amiR-155-5p,esto ya se identificó entre los miARN regulados
al alza, lo que predice un buen pronóstico después de la escisión quirúrgica [11]. Este miARN parece unirse e inhibir
traduccionalmenteTYRP1ARNm [dieciséis]. De hecho, dos pares de miARN que compiten, a saber miR-16actuando
como estabilizador ymiR-155-5pcomo inhibidor, interacción en elTYRP1estabilidad [34].
Los otros dos miRNAs estudiados aquí, a sabermiR-204-5pymiR-211-5p,pertenecen a la misma familia (familia
microARN mir204/211) y están codificados por elTRPM3yTRPM1gen, respectivamente. En nuestra cohorte,miR-204-5p
se asoció inversamente con la ulceración, el estadio y la profundidad del melanoma. Resultados similares fueron
destacados por Galasso y colaboradores en la asociación de miR-204-5pcon importantes parámetros clínicos, como la
profundidad de Breslow [7]. Nuestros resultados muestran quemiR-211-5pinfluyó favorablemente en la supervivencia
específica del melanoma, pero no influyó en la supervivencia global. En desacuerdo con nosotros, Lu y sus colegas
encontraron una influencia negativa demiR-211-5psobre la supervivencia global de los pacientes [10], incluso si el
desarrollo de la mayoría de los melanomas se ha asociado específicamente con el agotamiento demiR-211niveles de
transcripción, apoyando así su efecto positivo [17]. De acuerdo con nuestros resultados, Santoni y colaboradores
informaron que lamiR-211expresión está relacionada con funciones supresoras de tumores [29]. Además, se ha
demostrado una conexión directa entremiR-211-5p yMITF, ya que actúa como un factor de transcripción paraTRPM1,
que dentro de su sexto intrón codifica para miR211-5p[17]. Como consecuencia,MITFSe ha demostrado que suprime la
metástasis del melanoma a través de su activación transcripcional demiR-211mediante elTRPM1promotor. En nuestra
cohorte, al igual quemiR-211-5p, MITFLa expresión también se asoció con una supervivencia específica del melanoma
más larga, hallazgos que son respaldados por Mazar y colegas.17]. Curiosamente,TRPM1no se relacionó directamente
con la supervivencia de los pacientes sino con variables patológicas favorables, como la profundidad de Breslow y la
ausencia de ulceración, lo que está en consonancia con otros autores que definieronTRPM1pérdida como un excelente
marcador de la agresividad del melanoma.29,35,36]. Moléculas de respuesta inmune, a saberCD2yPD-L1, fueron
elegidos en nuestro estudio para definir los melanomas de tipo inmunitario, que se han asociado con una mejor
supervivencia de los pacientes [5]. En consecuencia, en nuestras muestras,CD2yPD-L1se asociaron ambas a variables
de buen pronóstico, como estadios de MC más bajos, MC más delgados, así como a una mayor supervivencia
específica de MC. Como consecuencia,CD2ya ha sido propuesto como predictor independiente de recurrencia de la
enfermedad y supervivencia global entre pacientes con melanoma cutáneo primario.37]. El hecho de que los CM
tengan una mayor expresión dePD-L1yCD2
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es muy probable que se deba a una respuesta inmunitaria anticancerígena, como suelen indicar los linfocitos que
infiltran el tumor.37,38].
Nuestros datos sugieren que el estado mutacional de BRAF-V600 y NRAS-Q61 no varió entre regiones geográficas y
altitudes de residencia. El análisis de regresión confirmó que la carga mutacional era una variable independiente que no
estaba influenciada por la altitud de residencia sino por algunas características clínicas de la MC.39–41] y la demografía de los
pacientes. Contrariamente a estudios previos [42,43], en nuestra cohorte, las mutaciones BRAFV600 se detectaron con mayor
frecuencia en hombres. Es probable que este resultado se deba a nuestros criterios de selección, ya que los MC de pacientes
masculinos se analizaron desde el tronco, que ya se ha informado como un sitio anatómico preferencial asociado con la
mutación BRAF.44]. La edad de los pacientes mostró una clara influencia en la tasa de mutación de BRAF documentada en este
estudio, con pacientes más jóvenes que prevalecieron en el grupo con mutación de BRAF en comparación con los con
mutación de NRAS y los de tipo salvaje BRAF/NRAS. De hecho, los melanomas con mutación BRAF se caracterizan por una
edad temprana en el momento del diagnóstico, ausencia de daño solar crónico de la piel y aparición de melanoma en el
tronco.45], que reflejan fielmente las características de nuestros pacientes con mutación BRAF. Las mutaciones de NRAS se
registraron con frecuencia en los MC ubicados en las extremidades inferiores (7,7%,norte=22 de 287) en nuestro conjunto de
datos, de acuerdo con otros [44,46]. El tronco se considera comúnmente un sitio de exposición solar intermitente, mientras
que las extremidades inferiores son un área de piel dañada por el sol crónica (CSD). Por lo tanto, nuestros datos confirman
que el tipo de exposición a los rayos UV es un factor determinante que influye en la carga mutacional de BRAF V600 y NRAS
Q61.44,46].
La tasa de detección general de BRAF en nuestra cohorte fue del 33 % (norte=96 de 288), que parece estar en línea con
la literatura actual [47].SNAfrecuencias de mutación representaron el 21% (norte=62 de 288) en nuestro estudio, que también
está en línea con los datos informados [48]. En particular, los melanomas con mutación NRAS en nuestro estudio se
relacionaron con una menorCD2niveles de expresión. Este último hallazgo podría estar relacionado con RAS oncogénico, que
puede alterar la inmunidad antitumoral, lo que resulta en una disminución de la inmunogenicidad de las células
transformadas por RAS.49].
4. Materiales y Métodos
Este fue un estudio retrospectivo de base poblacional. El estudio fue parte del proyecto MEMS
(www.mems-interreg.eu) financiado por el programa Interreg VA Italia-Austria 2014−2020 de la
Unión Europea. Los centros participantes incluyeron los Hospitales Universitarios de Trieste (Italia)
e Innsbruck (Austria), el Hospital Central de Bolzano (Italia) y el Instituto Nacional del Cáncer de
Aviano (CRO-Italia). El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado
por los siguientes Comités de Ética: Comité de Ética de la Agencia de Salud de la provincia de Bozen
(número de protocolo 0081449, 07/01/2019), Comité de Ética de Friuli -Región Venezia Giulia
(protocolo número 20817, 02.07.2018), y el Comité de Ética de la Universidad Médica de Innsbruck
(protocolo número 1177/2017 y 1182/2018).
Los casos de MC primaria diagnosticados entre el 01/01/2006 y el 31/12/2015 incluidos en este estudio se
recuperaron de las bases de datos histopatológicas de los centros participantes correspondientes.
Los criterios de inclusión fueron los siguientes: (i) Diagnóstico inequívoco de melanoma cutáneo primario con un
espesor tumoral≥1,8 mm (este grosor se eligió para proporcionar portaobjetos de tejido para análisis moleculares sin
consumir todo el bloque de tejido); (ii) ubicación en la cabeza/cuello, tronco/extremidades y sitios acrales: se eligieron
el tronco y la cabeza (cuello y cara) para los hombres, y las extremidades superiores e inferiores para las mujeres.
Estos sitios fueron elegidos porque en su mayoría están relacionados con el género. Los casos se emparejaron entre
los grupos de participantes por género, sitio anatómico, rango de edad y grosor del tumor; y (iii) disponibilidad del
bloque fijo y en parafina. La cohorte incluyó también pacientes con criterios (i), (ii) y (iii) de cualquier sitio anatómico en
pacientes de edad≥90 años o <30 años como valores extremos de la
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muestra. En pacientes con más de un CM primario, solo se incluyó el primer CM, mientras que los melanomas
posteriores se excluyeron del estudio.
Todos los CM se revisaron y agruparon en etapas de acuerdo con la clasificación AJCC TNM 8.ª edición [19
]. Además, para todos los casos, registramos el grosor de Breslow, la presencia/ausencia de ulceración y el sitio
anatómico. En cuanto a la demografía de los pacientes, se registró el sexo, la edad al diagnóstico y la altitud del
área geográfica de residencia. Además, se recogieron datos de seguimiento desde la fecha de diagnóstico de
la MC primaria hasta el 31/12/2018 o fallecimiento.
El conjunto de datos también se analizó para determinar la altitud de residencia.
4.2. inmunohistoquímica
Cuatro o 2-µSe cortaron secciones de m de espesor de cada bloque de tejido para la tinción inmunohistoquímica
utilizando un ensayo completamente automatizado basado en el sistema BenchMark ULTRA (Ventana-Roche
Diagnostics, Tucson, AZ 85755, EE. UU.). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: el clon VE1 (Ventana Medical System,
Tucson, AZ 85755, EE. UU.) a una dilución de 1:100 para la detección de la mutación BRAF V600E; el N-Ras Q61R
monoclonal antihumano de conejo, clon SP174 (Ventana Medical System-Abcam, Tucson, AZ 85755, EE. UU.) a una
dilución de 1:100 para el análisis de NRAS Q61R. Las secciones se secaron a 60◦C durante 30 min y después del
desparafinado, los portaobjetos se pretrataron con Cell Conditioning 1 (Ventana Medical System, Tucson, AZ 85755,
EE. UU.) durante 64 min para el desenmascaramiento del antígeno y se sometieron a la inhibición de la peroxidasa. La
decoración primaria de anticuerpos se llevó a cabo a 37◦C durante 16 min para BRAFV600E y 32 min para NRASQ61R.
La detección cromogénica se realizó con cromógeno de diaminobencidina (DAB) para BRAFV600E, mientras que para
NRASQ61R se utilizó el kit de detección de rojo de fosfatasa alcalina universal UltraView (Ventana Medical System,
Tucson, AZ 85755, EE. UU.). La contratinción se realizó con hematoxilina II durante 5 min. Después del lavado, los
portaobjetos se montaron como de costumbre.
Con respecto a los análisis de inmunohistoquímica, las secciones de tejido se calificaron como positivas cuando al menos el 10 %
de las células de melanoma se tiñeron positivamente.
Los criterios para la tinción BRAF y NRAS inequívocamente positiva incluyeron una tinción citoplasmática
fuerte y media. La tinción difusa citoplásmica débil y la ausencia de tinción se puntuaron como negativas. Las
secciones de tejido con tinción equívoca se verificaron mediante PCR de gotitas digitales (ddPCR) para
confirmar la presencia o ausencia de mutaciones BRAF/NRAS.
Con respecto al análisis de la expresión del gen del ARNm diana, el ADNc se sintetizó usando cebadores
aleatorios y transcriptasa inversa M-MLV de 250 U (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA 02451, EE. UU.; Cat. No.
28025013) como se describió anteriormente [50]. En cuanto a la PCR cuantitativa en tiempo real, se agregaron 60 ng
de ADNc a JumpStartTM 2X Taq ReadyMixTM (Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO 63103, EE. UU.; Gato. No. D7440), junto
con 210 nM de sonda TaqMan (IDT, Coralville, IA 52241, EE. UU.), 320 nM de cebadores directos e inversos (IDT,
Coralville, IA 52241, EE. UU.), Rox100 y se completó hasta un volumen final de 21µL con agua estéril. Los cebadores y
las sondas Taqman se diseñaron utilizando la herramienta en línea Primer3Plus (consulte la Tabla S1) [51] y su
especificidad se comprobó a través de la herramienta Genome Browser BLAT [52]. Cada reacción se llevó a cabo por
duplicado. El análisis de PCR en tiempo real se realizó en un Mastercycler®
ep Realplex (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) como se indica en la Tabla S1. Para la cuantificación relativa, el
método “delta-delta Ct” [53] donde, como limpieza, se empleó la media geométrica de al menos 2 genes de los
4 analizados en el presente estudio (consulte los Materiales complementarios para obtener detalles y la Tabla
S3 para conocer las eficiencias). Las muestras con baja concentración de ARN total y las muestras procesadas
con fijador de Bouin fueron excluidas del análisis de expresión.
Las muestras se agruparon en subtipos transcriptómicos en función de su nivel de expresión alto o bajo, como se
describe en la clasificación TCGA [5] (consulte los Materiales complementarios para obtener detalles y la Figura S6 para ver los
resultados).
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5. Conclusiones
El proyecto MEMS fue un estudio retrospectivo donde se analizaron los melanomas cutáneos primarios a
nivel molecular y se relacionaron estas características con características patológicas y ambientales. La cohorte
heterogénea estaba compuesta por pacientes que habían estado viviendo en diferentes áreas geográficas y en
diferentes altitudes de residencia.
En conclusión, nuestros hallazgos destacan que existen diferencias en los perfiles de expresión de ciertos mRNA
y miRNA con respecto a la altitud de residencia. A saber,TYRP1ymiR-204-5pfueron altamente expresados en pacientes
que viven en altitudes más altas, a diferencia demiR-150-5p, miR-155-5p, ymiR-211-5p. Dado que los miARN están
altamente regulados por especies reactivas de oxígeno, es posible que diferentes mecanismos reguladores
caractericen a los CM en diferentes altitudes debido al diferente entorno y la intensidad de la UVR.
De acuerdo con nuestros resultados, se registra una supervivencia específica de melanoma más corta en pacientes que
viven en altitudes más altas, lo que probablemente se deba a problemas sociales/culturales más que a un efecto causal de la
residencia en altitudes más altas. Este hallazgo podría estar asociado a nuestros resultados moleculares; de hecho, la
expresión del onco-supresormiR-150-5p,miR-155-5p, ymiR-211-5pse asociaron negativamente con la altitud de residencia.
Es cierto que nuestra investigación sobre el efecto de la exposición a URV no ha tenido en cuenta los períodos
de residencia de los pacientes y sus actividades recreativas y laborales: esta es una limitación importante
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del presente estudio. Por lo tanto, los resultados de nuestro estudio sobre la supervivencia y la altitud de residencia deben ser
confirmados por estudios adicionales.
Contribuciones de autor:Conceptualización, SB; metodología, DB, JZ y SB; análisis formal, EDM, FR, JZ, WJ, EJ y
SB; investigación, DB.; recursos, VC, KE, GM, CN, GW, BZ, FZ e IZ; curación de datos, EDM, DB, CC, GM, CN, KE,
GW, BZ, JZ, EJ, WJ, MS, FR, VC, GS, FZ, IZ y SB; redacción—preparación del borrador original, EDM y SB;
redacción: revisión y edición, DB, VC, CC, FR, WJ, GW, BZ, JZ, EJ, MS, GM, CN, KE, FZ, GS, IZ; supervisión, VC, KE,
CN y MS; administración de proyecto,
SB; adquisición de fondos, SB, KE, CN y MS Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada
del manuscrito.
Fondos:Este estudio fue apoyado por el proyecto MEMS bajo el acuerdo de subvención ITAT1018 como parte del programa
de la UE Interreg VA Italia-Austria 2014−2020.
Expresiones de gratitud:Los autores desean agradecer a Simon Schwendinger por su ayuda experta con la PCR de
gotas digitales, y a Birgit Moser, Nadja Kühner y Cristina Bottin y Ermanno Nardon por su excelente asistencia técnica.
Los autores desean agradecer al programa Interreg VA Italia-Austria 2014−2020 que apoyó el proyecto MEMS en
virtud del acuerdo de subvención ITAT1018.
Referencias
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