BIOQUÍMICA I SEMANA 3 PRÁCTICA 3 Y PRÁCTICA 4

P-3: Determinación del Punto isoeléctrico de las proteínas.

Es el pH en el cual el número de cargas positivas se igual al número de cargas
negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la
carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoácidos los grupos ionizables
corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos.
El grupo amino tiene carácter básico y el grupo carboxilo es ácido, por lo que los
aminoácidos son compuestos anfóteros, pudiendo ceder o captar protones del medio.
Del valor del pH depende la ionización de los grupos amino y carboxilo. A pH ácido el grupo
amino se carga positivamente y a pH básico el grupo carboxílico se encuentra cargado
negativamente. El valor del pH en el que el aminoácido se encuentra cargado tanto positiva
como negativamente se denomina punto isoeléctrico (y su valor de pH es el PI), y las
moléculas así cargadas se llaman zwitteriones.
Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en
agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que
adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que
se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de
cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir
en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y
glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían
protonados (-NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada
negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO -)
y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga
neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas
por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su
solubilidad y facilitar su agregación.
Todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se
encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier
ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir
en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Las proteínas tienen un pH característico, en donde su carga neta es cero. A este pH se le
denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en equilibrio
las cargas positivas y negativas por lo que las proteínas presentan su máxima posibilidad
para ser precipitadas al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.
El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrogeno en el cual la proteína es
eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total
de cargas negativas contenidas en la proteína.
Cada proteína tiene un determinado punto Isoeléctrico (PI).
Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH
menores, igual o mayores al PI, la proteína sufre variaciones en la constitución de sus
grupos químicos, produciéndose en consecuencia variaciones en su estructura terciaria o
cuaternaria y por lo tanto en su función biológica.
A parte de otras propiedades que presentan las proteínas cuando se encuentran en una
solución que tiene pH igual al PI, algunas proteínas son difícilmente solubles y precipitan.

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Aprovechando este comportamiento, se puede determinar el PI de una proteína
observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra
en varias soluciones que tienen pH conocidos.
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y
vitaminas A, D y K), minerales (Ca, K, Na, P y metales en pequeñas cantidades), proteínas
(incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos
elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas.
Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y
no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno
(característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas
globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de
la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de
proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En
la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los
aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica
(caseinato cálcico). R
Representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en
composición de la leche líquida.
En la presente práctica se determinará el PI de una proteína relacionando la solubilidad
mínima con el pH de la solución en que ella se produce, con el fin de contribuir a establecer
la importancia de conocer las propiedades de las proteínas.

II. Reactivos: Ac. Acético 1N, Sol. de caseína en acetato de Na 0.1 N, Sol. de
Fenoftaleína, NaOH 10%
III. Procedimiento:
- Marcar una serie de tubos de ensayo del 1 al 9.
- En el tubo 1 medir 3.2 ml. de ácido acético 1 N y 6.8 ml. de agua destilada.
- Medir 5 ml. de agua destilada en cada uno de los otros 8 tubos.
- Sacar 5 ml. de solución del tubo 1 y agregarlos al tubo 2.
- Sacar 5 ml. del tubo 2 y transferir al tubo 3, etc. continuando del mismo modo hasta
Completar la serie.
- En el tubo 9 una vez efectuada la mezcla se sacan 5 ml. de solución que se eliminan.
- Agregar rápidamente 1ml de solución de caseína en acetato de Na 0.1 N a c/t. Mezclar
al instante por inversión.
- Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los
diferentes tubos.
- Anotar en el cuadro que sigue:
- Observar después de 30 minutos. Anotar en el cuadro el pH de cada tubo. (Ver nota
al final).
- Calentar ligeramente c/u de los tubos y apreciar el efecto sobre la solubilidad. Anotar.
- Agregar una gota de Fenoftaleína. Mezclar.
- Agregar NaOH al 10% gota a gota, agitando, hasta la aparición color rosado y observar
el efecto sobre la solubilidad.Anotar:
NÚMERO DE TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH de c/t
Enturbiamiento al mezclar
Enturbiamiento o ppdo. A 30’
Solubil. después de calentar
Solubil. después de agregar
Solubil. después de agregar NaOH
10 %

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 Emplear los símbolos siguientes: O = no cambia + = Opalescencia x = Ppdo.
Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación lo cual se produzca en el
tubo que tiene un pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína.
Interpretar los resultados e indicar el PI aproximado de la proteína.
NOTA : El pH de las soluciones de los diferentes tubos debe traerse calculado a la
Reunión de Laboratorio y se obtiene por aplicación de la Ecuación de Henderson -
Hasselbach:
Sal
pH = pK + Log. -------------
Acido

pK Ac. Acético = 4.7

La concentración de sal es 1 ml. de acetato 0.1 N en cada caso.
La cc. de ácido es 1.6 ml. de ácido N en el tubo 1 (1.6 ml.1N = 16 ml 0.1 N).
En el tubo 2, la concentración de ácido es 8 ml. De 0.1N etc.
Así en el tubo 3, por ejemplo:
1
pH = pK + Log. --------- = 4.7 - 0.6 = 4.1
4

Punto isoeléctrico de las proteínas https://www.youtube.com/watch?v=AU_NqILOpO0

http://biotech01.vlabs.ac.in/bio-
chemistry/Isoelectric_Precipitation_of_Proteins_Casein_from_Milk/experiment.html
Precipitación isoeléctrica de proteínas: caseína de la leche

Resultados:

P- 4: Determinación de la vitamina C en alimentos.

La vitamina c, llamada también ácido ascórbico, se encuentra principalmente en las
frutas cítricas verduras, papas, leche. La estructura puede considerarse derivada de un
glúcido, la L – glucosa, que tiene 6 átomos fácilmente transformándose en ácido
dehidroascorbico.
Por acción del calor y de oxidantes enérgicos ambos ácidos diceto-L- gulónico que no
tiene actividad vitamínica. Esta oxidación es catalizada por trazas de metales, por
ejemplo, cobre.
La determinación cuantitativa se basa en la propiedad tiene el ácido L- ascórbico de
reducir al 2-6 diclorofenolindofenol, que es un indicador sedox, oxidado es azul a un pH
superior a 5.7 y rosado a un pH inferior y al ser reducido se decolora ( leucoderivado)
Dicha vitamina participa en la síntesis de colágeno, así como también en el catabolismo
del colesterol para la formación de ácidos biliares a través del catabolismo del colesterol
con la formación de 7 dehidrocolesterol en el paso inicial.
La determinación se lleva a afecto mediante la titulación de la vitamina C, con una
solucion del indicador, en presencia de ácidos meta fosfórico. Estos ácidos inhiben la

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oxidación aeróbica del ácido ascórbico, precipitan las proteínas e inactivan las enzimas
que pueden inferir en la reacción. Debido al medio ácido en que se realiza la titulación,
el viraje que hay que considerar es de rosado e incoloro.
Beneficios:
1.Ayuda a reparar y mantener el cartílago, los huesos y los dientes.
2.Como antioxidante ayuda a prevenir enfermedades degenerativas como el Alzheimer
y la arterioesclerosis, al igual que la prevención de la mutación celular que causa el
cáncer.
3.Es indispensable a la hora de sanar heridas y formar tejido que ayuda a cicatrizar.
4.Previene las enfermedades cardiacas ya que el ácido ascórbico disminuye el
colesterol lo que evita que la grasa se adhiera a los vasos sanguíneos, reduciendo la
posibilidad de sufrir infartos. De igual manera, ayuda a la absorción de hierro.
5.Consumir vitamina C no reduce el riesgo de resfriarte, pero los resfriados puedes ser
más cortos o con síntomas muy leves. Por otro lado al combinar la vitamina C con Zinc
se forma una dupla que previene los resfriados comunes y disminuye los síntomas y
duración de los mismos, ya que los dos contienen altos niveles inmunológicos y
antioxidantes.

I.Objetivos:
- Determinación cualitativa de vitamina C en zumo de frutas .
- Determinar cuantitativamente el contenido de ácido ascórbico en un extracto de
un alimento de origen vegetal, mediante titulación con 2,6- diclorofenolindofenol.

II.Reactivos
- Solución de 2,6- diclorofenolindofenol al 0,5% (disolver en agua caliente)
- Solución acética – meta fosfórica: ácido acético al 8% (p/v) y ácido meta fosfórico
al 2% (p/v)
- Ac. Oxálico al 10%. - Soporte: cromato plástica de silicagel G.
- Activación 100°C x 30minutos - Solvente: 1-butal/Ac. Acético/agua 4:15 v/v.
- Revelador: Ac. Fosfomolibdico 3,5% en etanol.

III. Procedimiento
Determinación Cualitativa
- Tomar 10ml dejugo y agregar 10ml de ácido oxálico al 1%
- Filtrar y aplicar a la cromato placa sin emplear calor en es secado
- Colocar el solvente por 30 minutos.
- Revelar y aplicar.

Determinación cuantitativa
Fundamento: El 2,6 diclorofenol indofenol es reducido por el ácido ascórbico a una
forma incolora en medio ácido. La forma oxidada del reactivo es rojo en medio ácido y
reducida incolora.
- Elegir los alimentos en los cuales se va a analizar el contenido de vitamina C (
frutas cítricas, papa, tomate manzana, pera)
- Extraer el jugo del material a analizar y hacer una dilución al 1/20 en solución
Acética meta fosfórica.
- Colocar 2ml de esta dilución en un matraz Erlenmeyer y titular agregando solución
de 2,6-diclorofenolindofenol con una piedra de 2ml hasta coloración rosada débil,
persistente durante 5 segundos.
- Titular un blanco en las mismas condiciones.
- Marcar una serie de tubos de ensayo del 1 al 9.

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 IV. Expresión de Resultados
- Expresar los resultados en mg de ácido ascórbico por 100ml de jugo o 100g de
alimento. Cada ml de2,6- diclorofenol indofenol equivale a 0,12mg de ácido
ascórbico.

Vitamina C https://www.youtube.com/watch?v=xFkJhuLqZvk

Determinación yodométrica
Fundamentación:
Se basa en la oxidación del AA con I -3 (triyoduro) en presencia de almidón (indicador).
El yodo forma un complejo azul con el almidón, al reaccionar el I2 con el AA se observa
una disminución en la intensidad del color en la disolución. Cuando el yodo se disuelve
en una disolución de yoduro de potasio, se forman iones polinucleares I3 - que se
introducen en la hélice de amilosa formando un complejo coloreado(azul-negro). Al
reaccionar el complejo yodo-amilosa con ácido ascórbico, la disolución indicadora pierde
el color. Esto se debe a que ácido ascórbico (1) es oxidado por un oxidante suave como
la disolución de yodo para dar lugar a ácido dehidroascórbico (2) y a iones yoduro.

Cuanto menor es la intensidad del color, significa que mayor será el contenido de vitamina
C. Se preparan distintos patrones de vitamina C en un intervalo de concentración a los
que se le añade la misma cantidad de I3 - y almidón. La muestra a analizar se prepara de
igual forma que los patrones y se compara la intensidad del color con la de los patrones,
determinando su concentración de forma aproximada.
Jugo de vegetales: Lima, papaya, mandarina, tomate, naranja y cocona
Reactivos: Almidón (maicena), solución yodada

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Material:
Vaso de precipitación, tubos de ensayo, gradillas, pipetas automáticas
Obtener jugos de cada producto vegetal en vasos
En tubos de ensayos colocar solución de almidón y solución yodada
Verter ml de jugos en los tubos respectivamente

NÚMERO DE TUBOS 1 2 3 4 5 6
Sol.almidón+ sol. yodada 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL
Lima Gotas
Papaya Gotas
Mandarina Gotas
Tomate Gotas
Naranja Gotas
Cocona Gotas
Desaparece color
(marcar)

https://www.youtube.com/watch?v=EWKNHhoEHaY

Resultado:

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
PUNTO ISOELÉCTRICO
https://produccioncientificaluz.org/index.php/investigacion/article/view/27740
https://www.news-medical.net/life-sciences/Overview-of-the-Isoelectric-Point-
(Spanish).aspx
https://dagus.unison.mx/smoreno/4%20Amino%C3%A1cidos%20y%20Prote%C3%ADna
s.pdf
VITAMINA C
https://ods.od.nih.gov/pdf/factsheets/VitaminC-DatosEnEspanol.pdf
file:///C:/Users/Windows10/Downloads/Vitamina%20C%20en%20la%20salud%20y%20en
%20la%20enfermedad.html