Obtencin y uso de las enzimas en la industria

Dra. Ana Blandino Garrido

Actualizacin en conocimientos de Biologa Molecular y Biotecnologa

ndice:

Por qu se utilizan las enzimas en los procesos industriales? Caractersticas de las enzimas Produccin de enzimas Aplicaciones industriales de las enzimas Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas

I. Por qu se utilizan las enzimas en los procesos industriales?

Inconvenientes de los procesos qumicos: Desarrollo de reacciones no especficas Necesidad de altas temperaturas y/o presiones para que transcurra la reaccin Los procesos que se realizan en condiciones extremas y los peligrosos necesitan la inversin de un capital muy elevado, y el empleo de equipos especialmente diseados y de sistemas de control. Los subproductos no deseados pueden ser difciles de separar del producto de inters El consumo de reactivos qumicos y de energa, y la generacin de subproductos nocivos tiene un impacto medioambiental negativo

I. Por qu se utilizan las enzimas en los procesos industriales?

Ventajas de los procesos enzimticos: Se llevan a cabo en condiciones suaves Son altamente especficos Implican velocidades de reaccin muy elevadas Son llevados a cabo por numerosas enzimas Las enzimas industriales se obtienen a partir de sistemas biolgicos lo que contribuye al desarrollo sostenible Slo se requiere una pequea cantidad de enzima Hay una gran disponibilidad y variedad de equipamiento a utilizar Son fciles de controlar Se reduce el impacto ambiental El desarrollo de la ingeniera gentica y de protenas

ndice:

Por qu se utilizan las enzimas en los procesos industriales?

Caractersticas de las enzimas

Produccin de enzimas Aplicaciones industriales de las enzimas Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas

II. Caractersticas de las enzimas

1. Las reaccciones qumicas tienen lugar en condiciones suaves
Maltosa + Agua

2 Glucosa

pH =7, 25C

2. Son altamente especficas 3. Las reacciones son muy rpidas

CO2 + Agua

HCO3- + H+

4. Numerosas enzimas para diferentes tareas

II. Caractersticas de las enzimas

Clase 1. Oxidoreductasas Enzimas industriales Peroxidasa Catalasa Glucosa oxidasa Lacasa Fructosil-transferasa Glucosil-transferasa Amilasas Celulasas Lipasas Pectinasas Proteasas Pululanasa Pectato liasa Alfa-acetolactato-descarboxilasa Glucosa isomerasa No se usan en la actualidad

2. Transferasa 3. Hidrolasas

4. Liasas 5. Isomerasas 6. Ligasas

II. Caractersticas de las enzimas

Clase 1. Oxidoreductasas Enzimas industriales Transferencia de tomos de hidrgeno u oxgeno, o de electrones, desde un sustrato a otro.

2. Transferasas

Transferencia de grupos de tomos (radicales) desde un sustrato a otro.

II. Caractersticas de las enzimas

Clase 3. Hidrolasas Enzimas industriales Catalizan reacciones entre un sustrato y agua, y unen agua a ciertas molculas.

4. Liasas

Catalizan la adicin de grupos a dobles enlaces, o la formacin de dobles enlaces mediante eliminacin de grupos .

II. Caractersticas de las enzimas

Clase 5. Isomerasas Enzimas industriales Catalizan la transferencia de grupos de una posicin a otra dentro de la misma molcula.

6. Ligasas

Unen molculas entre s mediante enlace covalente.

ndice:

Por qu se utilizan las enzimas en los procesos industriales? Caractersticas de las enzimas

Produccin de enzimas
Aplicaciones industriales de las enzimas Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas

III. Produccin de enzimas

Las enzimas se obtienen de microorganismos. La fermentacin se realiza en un reactor. Las enzimas son concentradas y/o purificadas. Se procede al aislamiento, clonacin y secuenciacin del gen que codifica la enzima. Se realiza la inmovilizacin enzimtica

III. Produccin de enzimas Tecnologa de cultivo sumergido

Consiste en el crecimiento del microorganismo en vasos de reaccin cerrados que contienen un caldo rico en nutrientes (el medio de fermentacin) y una elevada concentracin de oxgeno (condiciones aerbicas).

III. Produccin de enzimas El medio de fermentacin:

Se emplean medios complejos. Las fuentes de carbono: Glucosa, sacarosa, lactosa, almidn, dextrinas Glicerol y manitol Hexadecano, octadecano y otros Granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. Las fuentes de nitrgeno: Hidrolizados de protenas Extracto de carne, de levadura o de malta Cornsteep

III. Produccin de enzimas Tecnologa de cultivo sumergido: el biorreactor

Mantener las clulas uniformemente distribuidas. Mantener constante la T. Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes. Suministrar O2 a una velocidad tal que satisfaga el consumo.

III. Produccin de enzimas Tecnologa de cultivo sumergido: el biorreactor

Eje provisto de turbinas accionado por un motor. El aire es distribuido por una corona que posee pequeos orificios espaciados. Las placas deflectoras rompen el movimiento circular del fluido. Encamisado por el que circula agua. De acero inoxidable y pulidos. El aire se inyecta estril.

III. Produccin de enzimas Tecnologa de cultivo sumergido: el biorreactor

El aire inyectado promueve la agitacin. Dos cilindros concntricos Circulacin de lquido ascendente en el compartimiento interno y descendente en el externo

III. Produccin de enzimas Tecnologa de fermentacin en estado slido

FERMENTACIN EN ESTADO SLIDO (SSF) FERMENTACIN EN CULTIVO SUMERGIDO (SmF)

soportes slidos hmedos

fase lquida

slidos inertes

sustratos naturales

III. Produccin de enzimas Tecnologa de fermentacin en estado slido

Fibras y paja de trigo Maz Arroz Bagazo de caa de azcar y de remolacha Residuos de banana, patata,t, coco, manzana y ctricos Harinas de trigo y maz Cscaras de caf y de arroz Alpechn Malta agotada, etc. ORUJO DE UVA

III. Produccin de enzimas

Secado Molienda Tamizado Esterilizacin Orujo de uva (Palomino Fino) Orujo de uva acondicionado

III. Produccin de enzimas

Esttica Humedad inicial: 60% (p/p) 30C pH natural

Fermentacin

Aspergillus awamori

III. Produccin de enzimas

Condiciones estndar: 10 g slido/ 50 mL agua destilada Agitacin: 200 rpm, 30C y 30 minutos Centrifugacin a 10000 rpm 20 minutos

Extractos

Celulasa Xilanasa Pectinasa

III. Produccin de enzimas Tecnologa de fermentacin en estado slido

FERMENTACIN EN ESTADO SLIDO (SSF) FERMENTACIN EN CULTIVO SUMERGIDO (SmF)

Mayores rendimientos Recuperacin de productos ms fcil No se producen espumas Volumen del reactor menor Menor riesgo de contaminacin Residuos agrcolas como sustratos Menor impacto ambiental

Mayor homogeneidad Tecnologa ms desarrollada

III. Produccin de enzimas Fermentacin en estado slido: el biorreactor

El sustrato es extendido sobre cada bandeja. Cmara a T constante Circulacin de aire humidificado

III. Produccin de enzimas Fermentacin en estado slido: el biorreactor

Columna con el slido retenido. Circulacin de aire humidificado en sentido ascendente Encamisado de agua

III. Produccin de enzimas Fermentacin en estado slido: el biorreactor

El mezclado se consigue rotando el vaso o mediante un sistema de agitacin de palas. Slo puede llenarse un 30% de su capacidad.

III. Produccin de enzimas

Recuperacin de la enzima (downstream processing):
1. Separacin de los slidos Floculacin Flotacin Filtracin Centrifugacin M. qumicos M. biolgicos M. fsicos Precipitacin Cromatografa

Desintegracin de los microorganismos 2. Aislamiento

3. Concentracin y envasado Liofilizacin Encapsulacin

III. Produccin de enzimas

Recuperacin de la enzima (downstream processing):

ndice:

Por qu se utilizan las enzimas en los procesos industriales? Caractersticas de las enzimas Produccin de enzimas

Aplicaciones industriales de las enzimas

Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Mercado mundial (millones de dlares) de las enzimas de inters industrial

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria de detergentes (aos 60)

proteasas lipasas amilasas

Protenas actan de aglutinante, impidiendo que los sistemas detersivos eliminen los otros componentes de la suciedad. Degradan molculas de grasa (1988) Eliminan residuos de comida con almidn Eliminacin de microfibrillas que parcialmente las fibras de algodn. separan

celulasas

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria textil
Desencolado -Productos qumicos fuertes -Amilasas

-Prelavado con agua caliente (80-95C) -Ajuste a pH 5,5-7,5 y 60-80C -Adicin de amilasa

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria textil
Biostoning -Una pequea cantidad de celulasa puede sustituir varios kilos de piedra pmez - Se producen menos dao a las telas, desgaste de las lavadoras y polvo de piedra en el ambiente.

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria textil
Biopolishing

-Tratamiento con celulasas para eliminar la pelusilla que sobresale en las fibras naturales

Lavado despus del blanqueado

-Una pequea dosificacin de catalasa es capaz de degradar el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno.

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria del cuero
Remojo -La piel se hidrata para facilitar la penetracin y absorcin de los productos curtientes. -Degradando la protena entre las fibras mediante proteasas se facilita la absorcin de agua y puede reducirse el tiempo de remojo. -Las proteasas y lipasas aceleran las reacciones de los productos qumicos depilatorios. -Rompen las grasas y la materia proteca facilitando la penetracin de los reactivos y la eliminacin del pelo. -Tratamiento con proteasas y tripsina para hacer flexible el cuero eliminando componentes protecos.

Depilado

Rendido

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria del papel
Proceso Kraft

-Se trata de formar una suspensin de fibras de madera -La madera astillada se cuece en una mezcla de sosa custica y sulfuro de sodio. -Se produce una pasta de color marrn oscuro Blanqueado de pastas Kraft -El cloro y sus derivados son los blanqueantes ms baratos y verstiles para las pastas qumicas -Tratando las pastas Kraft con xilanasas se abre al estructura de la hemicelulosa que tiene enlazada la lignina, lo que facilita la liberacin de esta ltima antes del blanqueamiento.

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria del almidn y del azcar

1. Licuefaccin:
Suspensin 30-35% (w/v)
-amilasa

Maltodextrinas

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria del almidn y del azcar

2. Sacarificacin:
maltodextrinas Maltosa + glucosa -amilasa glucoamilasa Glucosa Maltosa + glucosa

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria del almidn y del azcar

3. Isomerizacin:
Glucosa Glucosa isomerasa 42% fructosa + 54% glucosa

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industrias de molinera y panadera
Mejora de la manipulacin y propiedades de la masa de panadera -amilasa Pobre produccin gas Pan inferior calidad Corteza menos color Miga cerrada -amilasa Baja retencin agua Masa pegajosa Corteza oscura Miga abierta

Proteasas Produccin galletas y crackers fuerza gluten

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industrias de productos lcteos
Elaboracin de quesos renina

leche leche Tratamientos de la leche leche leche lactasa catalasa

Precip. casena

lipasas proteasas

maduracin

Glucosa + Galactosa leche + H2O + O2

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industrias de zumos de frutos
Elaboracin de zumos pulpa zumo zumo pectinasas pectinasas amilasas celulasas filtracin transparencia color

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria bodeguera
Elaboracin de vinos

Liberacin antocianos mosto).

de taninos y (tanque del

Aceleracin de los procesos de clarificacin (tras el prensado) Maduracin del vino (tras la fermentacn)

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria cervecera
Malteado Se pone al grano en condiciones de H y T adecuadas, lo que induce la sntesis de enzimas hidrolticas que degradan el almidn. Se seca el grano a altas T, con lo que se detiene el proceso de germinacin Maceracin Se aade agua caliente al grano molido que, tras ser batido, produce una infusin azucarada o wort. Las amilasas convierten al almidn en azcares fermentables y dextrinas. Las proteasas que degradan a las protenas en alfa amino nitrgeno

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria cervecera
Aromatizacin Se aade al mosto dulce la flor de lpulo y se hierve todo, obtenindose el mosto aromatizado. Seguidamente se realiza una clarificacin, enfriamiento y aireacin del mosto aromatizado. Fermentacin Gran parte de la maltosa, glucosa y maltotriosas (carbohidratos fermentables) se convierten en alcohol y dixido de carbono. Otros metabolitos de las levaduras contribuyen al aroma y al bouquet caracterstico de la cerveza. La fermentacin se realiza a temperaturas inferiores a 15C.

IV. Aplicaciones industriales de las enzimas

Industria cervecera
Enzimas industriales Sustitucin de la malta por cebada no malteada: cebada + amilasas + proteasas. Mejora de la filtracin: Degradacin de los betaglucanos mediante betaglucanasa aadida durante la maceracin o la fermentacin.

Reduccin del tiempo de maduracin: Alfa-acetolato neutro) diacetilo (sabor desagradable) descarboxilasa acetona (sabor al inicio de la

Se aade alfa-acetolactato fermentacin

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Por qu se utilizan las enzimas en los procesos industriales? Caractersticas de las enzimas Produccin de enzimas Aplicaciones industriales de las enzimas

Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas

V. Inmovilizacin de enzimas
enzima inmovilizada? Unida fsicamente a un soporte slido, pero permite que el sustrato sea transformado en producto

Normalmente las enzimas se estabilizan Facilidad para parar rpidamente la reaccin El producto no se contamina con la enzima Mltiples o repetitivos usos en discontinuo Posibilidad de trabajar en continuo

V. Inmovilizacin de enzimas

V. Inmovilizacin de enzimas

V. Inmovilizacin de enzimas
enzima inmovilizada? Unida fsicamente a un soporte slido, pero permite que el sustrato sea transformado en producto

Alteracin de la conformacin de la enzima con respecto a su estado nativo Prdida de la actividad de la enzima durante la inmovilizacin El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa

V. Inmovilizacin de enzimas

Mtodos de inmovilizacin

Retencin fsica

Unin qumica

Atrapamiento

Encapsulacin

Unin a soportes

Reticulado

V. Inmovilizacin de enzimas
Retencin fsica

Atrapamiento: retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por polmeros.

Encapsulacin: las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima.

V. Inmovilizacin de enzimas
Retencin fsica

Cloruro clcico

Alginato sdico

Enzima

Bomba peristltica

V. Inmovilizacin de enzimas
Unin qumica

Unin a soportes: la enzima se une a un soporte slido mediante adsorcin o enlace covalente

Reticulado: consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima.

V. Inmovilizacin de enzimas
Unin qumica

Adsorcin: la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones inicas, fuerza de Van der Waals y por puentes de hidrgeno

Unin covalente: Se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con grupos nuclefilos de las protenas.

V. Inmovilizacin de enzimas
Unin covalente Diazonacin: SOPORTE--N=N--ENZIMA. Formacin de enlace amida: SOPORTE--CO-NH--ENZIMA Alquilacin y arilacin: SOPORTE--CH2-NH--ENZIMA SOPORTE--CH2-S--ENZIMA Formacin de una base de Schiff: SOPORTE--CH=N--ENZIMA Reaccin de amidacin: SOPORTE--CNH-NH--ENZIMA Intercambio tilo-disulfuro:SOPORTE--S-S--ENZIMA Unin al soporte mediante reactivos bifuncionales: SOPORTE-O(CH2)2N=CH(CH2)3CH=N-ENZIMA

Obtencin y uso de las enzimas en la industria

Dra. Ana Blandino Garrido
Actualizacin en conocimientos de Biologa Molecular y Biotecnologa