Caballero George3

INTRODUCCIN
El gnero Trichoderma/Hypocrea (Figura 1-a) es muy conocido por su importancia

biotecnolgica en la produccin de combustible biolgico a partir de la degradacin de
celulosa y como controles biolgicos (antibiticos y fungicidas). Adems son excelentes
colonizadores de sus hbitats, lo cual refleja su eficiencia como degradadores de
sustratos y productores de una compleja defensa qumica. Los hongos de ste gnero
se han identificados como simbiontes oportunistas de las plantas terrestres, donde se
ha probado que aumentan la resistencia sistmica de la planta (1). Se encontr que el
extracto de acetato de etilo del hongo Hypocrea jecorina inhibi 50%6 (3) la unin del
ligando [
3
H] BQ123 al receptor de endotelina ETA (receptor que regula la presin
arterial) (2). El objetivo de esta investigacin es de estudiar la composicin qumica del
extracto de acetato de etilo del hongo H. jecorina, con el fin de identificar las sustancias
responsables de su actividad biolgica.

S. Justavino
1
, J. Pit
1
, L. Rodrguez
1
, C Caballero-George
1,*
,
1
Instituto de Investigaciones Cientficas y Servicios de Alta Tecnologa, Edif. 219, Ciudad del Saber, Clayton,
Panam, Repblica de Panam
*Investigador visitante, Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales, Roosvelt Ave., Balboa, Ancn, Panam

1.Schuster A, Schmoll M. 2010 Appl Microbiol Biotechnol 87: 787-799.
2.Caballero-George C, Bolaos J, Ochoa E, Carballo JL, Cruz JA y Arnold AE. (2010).
Current Trends in Biotechnology and Pharmacy 4 (4): 880-898.
3.Harper JK et al. 2010 Phytochemistry 56(5): 463-468.
4. Wei H et al. 2007 The Journal of Antibiotics 60: 586590.
5.Brady S et al. 2001 J Am Chem Soc 123 (40): 99009901.
6.Isaka M et al. 2000 Tetrahedron Letters 41(10): 1657-1660.
7.Raymond E et al. 1991 J Chem Soc Chem Commun 15: 1009 - 1010.
8.Hung-Chen C et al. 1995 Phytochemistry 39 (3) : 613-616.
Se observ que la agitacin no favoreci la produccin de metabolitos, cuando se
compararon los pesos de los extractos obtenidos de los cultivos estticos y de
aquellos que se incubaron en el agitador (Tabla 1). En la fraccin 20-31 (Esquema 1),
se encontr 0.8 mg de un compuesto con Rf: 0.64. El compuesto fue analizado por
inyeccin directa al MS y mostr un in a m/z 390.23 [M+H]
+
(Figura 2).
En general la agitacin de los medios lquidos es utilizada para estimular la
produccin de sustancias bioactivas en los cultivos lquidos de este tipo de hongos
(2), sin embargo nuestros resultados sugieren que para el hongo H. jecorina no se
necesitan estas condiciones.
Una anlisis bibliogrfico (Antimarine , University of Canterbury) para la masa
390.23 [M+H]
+
sugiere seis alternativas para el compuesto aislado (Tabla 2).
La identidad de este compuesto ser confirmada mediante Resonancia Magntica
Nuclear (
1
H y
13
C RMN). La evaluacin de la actividad biolgica y los dems
compuestos presentes se llevar a cabo tan pronto se adquiera mayor cantidad del
extracto crudo.

Aislamiento e identificacin de H. jecorina: El hongo H. jecorina fue aislado de la
esponja Haliclona caerulea (Figura 1-b ), colectada mediante buceo autnomo en el
Parque Marino Isla Bastimentos (Bocas del Toro), siguiendo el protocolo de aislamiento
descrito por Caballero-George et al., (2). Para identificar el hongo se obtuvo su ADN
genmico utilizando el mtodo de dodecilsulfato sdico previamente descrito (2) y fue
identificado comparando la secuencia de consenso de la regin ITS-LSU contra la
base de datos del NCBI GenBank usando BLAST para estimar su ubicacin
taxonmica, ensamblada en una unidad taxonmica operacional basada en un 95% de
similitud entre las secuencias usando el Sequencher 4.8.
Preparacin de los extractos: Cuatro cultivos lquidos del hongo en estudio se
prepararon inoculando 10 pellets (2 mm x 8 mm) en 200 ml del medio EM (10 g l
-1

extracto de malta, 38 g l
-1
sal de mar). Tres de estos cultivos se incubaron en una mesa
de laboratorio a 22C por 21 das (Figura 3-b) y solo uno se coloc en un agitador
orbital a 28C por 15 das y 200 rpm (Figura 3-a). A los 15 das de incubacin el
micelio y el medio se licuaron (Licuadora, Waring, USA) por 1 min. Luego se agreg
acetato de etilo (2 x 200 ml) a la mezcla. Las fracciones orgnicas se combinaron y el
solvente fue removido a presin reducida a < 40C.
Cromatografa y espectroscopa: El extracto de acetato de etilo de H. jecorina (162.8
mg) se someti a una columna abierta de Silica Gel 70-230 mesh (Sigma-Aldrich) y fue
eluda con diferentes proporciones de n-hexano, CH2Cl2, EtOAc y MeOH segn el
esquema de la Figura 2. Las fracciones fueron monitoreadas mediante placas de
cromatografa en capa fina usando EtOAc:HOAc:HCOOH:H2O (60:1.6:2.2:16) como
fase mvil y 1% vainillina/ 5% cido sulfrico como revelador. El anlisis de masas
(MS) se hizo en un sistema JMS-LCmate (MS-BU30) LSMS (JEOL Ltd., Tokyo,
Japn) equipado con una interface de ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI).
El anlisis se realiz en el modo positivo ( Figura 2).
Cultivo lquido Peso del extracto
EtOAc (mg)
M2030-1-EM (1 esttico)

60.8
M2030-1-EM (2 esttico)

23.2
M2030-1-EM (3 esttico) 63.2
M2030-1-EM (1 agitacin)

6.2
Tabla 1. Peso de los extractos de EtOAc
obtenidos de los cultivos lquidos del hongo
H. jecorina.
Compuesto Hongo Actividad biolgica Referencia
cido ambico Pestalotiopsis sp. Antifngica 3
4-
deoxiprenilterfenillina
Aspergillus candidus Citotxico en clulas
de carcinoma humano
KB3-1
4
Guanacastepeno F Hongo endfito desconocida 5
Cordianhidrido A Cordyceps sp desconocida 6
Hipoxixilerona Hypolylon fragiforme Inhibidor de la
topoisomerasa I
7
2,2,5,5-Tetrametoxi-
3,4,3,4-bi-
metilenedioxi-
6,6dimetilbifenil
Antrodia cinnamomea desconocida 8

Los autores agradecen a la SENACYT (proyecto COL08-014), la Fundacin
Internacional para la Ciencia (IFS) y a la Organizacin para la Prohibicin de Armas
Qumicas, The Hague, Netherlands (OPCW) por el financiamiento de esta
investigacin. Agradecemos especialmente al INDICASAT-AIP, al Instituto Smithsonian
de Investigaciones Tropicales por contribuir en esta investigacin a travs del
Programa de Buceo Cientfico, el laboratorio de Biologa Molecular, el Departamento
de Compras y la estacin de Bocas del Toro y a la Autoridad Nacional del Ambiente por
los permisos correspondientes. Nuestro ms profundo agradecimiento a la Dra.
Arnold en la Universidad de Arizona, por la excelente colaboracin en la identificacin
taxonmica del hongo y al Dr. Jos Luis Carballo por identificar la esponja.
Tabla 2. Anlisis de referencias para el compuesto con masa 390.23 [M+H]
+
utilizando la
base de datos de Antimarine
Figura 1. Hongo Hypocrea jecorina
aislado en medio de extracto de malta
(a) de la esponja Haliclona caerulea
colectada en Bocas del Toro,
Republica de Panam (b)
HONGOS DE ESPONJAS:
ANLISIS QUMICO DE HYPOCREA JECORINA Y
SUS PROPIEDADES BIOLGICAS
METODOLOGA
RESULTADOS
DISCUSIN
AGRADACIMIENTOS
REFERENCIA
Figura 3. Cultivo lquido del
hongo Hypocrea jecorina
preparado en 100 ml a 28C y 175
rpm (a), y a 22C sin agitacin (b).

N-Hexano/ N-Hexano :
CH2Cl2
7 : 3
CH2 Cl2 :EtOAc
7:3
CH2 Cl2 : EtOAc
3:7
N-Hexano:CH2 Cl2
5:5
CH2 Cl2 : EtOAc
5 : 5
Et OAc : Me OH
85:15
EtOAc
Me OH
Fr 1-2
Fr 4-5
Fr 6, Fr 7-19
Fr 20-31
Fr 32-49
Fr 50-65
Fr 66-90, Fr 91-95
Et OAc : Me OH
75: 25
Fr 96-115
Et OAc : Me OH
60:40
Et OAc : Me OH
25:75
Fr 166-215
Fr 216-220
Et OAc : Me OH
15:85
Fr 116-165
Fr 231-310
Fr 3
N- Hexano: CH2Cl2 (3:7)/
CH2Cl2
Fr 221-230
Et OAc : Me OH
5:95
Figura 2. El compuesto de la fraccin 20-
31 fue analizado por inyeccin directa al
MS.

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