Université de Lille

Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques

École Doctorale Biologie-Santé

THÈSE
Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE LILLE
En Sciences Biologiques (Pharmacie)

IMPACT DE LA PHOSPHORYLATION DE FXR PAR LA PKA SUR SON

ACTIVITÉ TRANSCRIPTIONNELLE ET SUR LA RÉGULATION DE LA
NÉOGLUCOGENÈSE HÉPATIQUE

Soutenue publiquement le 11 décembre 2018

Maheul PLOTON

Devant le jury composé de :

Monsieur le Docteur Philippe LEFEBVRE Directeur de thèse

Madame le Docteur Sabine COLNOT Rapporteur
Monsieur le Docteur David VOLLE Rapporteur
Monsieur le Professeur Bart STAELS Examinateur

CHU Lille - Institut Pasteur de Lille - Université de Lille - INSERM U1011 - EGID

1
2
 Sommaire
SOMMAIRE .......................................................................................................................................................... 3

RESUME ............................................................................................................................................................... 7

SUMMARY ........................................................................................................................................................... 8

ABRÉVIATIONS .................................................................................................................................................. 9

LISTE DES FIGURES ET DES TABLEAUX ................................................................................................. 14

LISTE DES FIGURES: ........................................................................................................................................... 14

LISTE DES TABLEAUX : ...................................................................................................................................... 16

CHAPITRE 1 : CONTEXTE BIBLIOGRAPHIQUE ..................................................................................... 17

PARTIE 1 : LES RECEPTEURS NUCLEAIRES. .......................................................................................... 17

1) FACTEURS DE TRANSCRIPTION ET REGULATION DE L’EXPRESSION GENIQUE:................................................ 17

a) Facteurs de transcription et éléments de réponse : ................................................................................. 17
b) Fixation des FTs au niveau du génome :................................................................................................. 17
c) Régulation de la transcription des gènes, « enhancers » et boucle chromatinienne : ............................. 20
d) FTs, « enhancers », « super-enhancers » et identité cellulaire :........................................................... 21
2) LES RECEPTEURS NUCLEAIRES : .................................................................................................................... 23
a) Les éléments de réponse des RNs : .......................................................................................................... 23
b) Classification des RNs : .......................................................................................................................... 25
c) La structure des RNs: .............................................................................................................................. 29
i) Le domaine A/B ou NTD : .................................................................................................................................... 30
ii) Le domaine C ou DBD (DNA-Binding Domain):................................................................................................ 31
iii) Le domaine D ou région charnière : .................................................................................................................... 33
iv) Le domaine E ou LBD (Ligand Binding Domain) : ............................................................................................ 34
v) Le domaine F : ..................................................................................................................................................... 35
vi) Coopération interdomaine : ................................................................................................................................. 36
d) Les ligands des RNs: ............................................................................................................................... 37
i) Classification des RNs selon leurs types de ligand : ............................................................................................. 39
e) Mécanismes de régulation de l’activité transcriptionnelle par les RNs : ................................................ 43
i) Action génomique des RNs: .................................................................................................................................. 44
(1) Les complexes corégulateurs : ....................................................................................................................... 45
(1-a) Action des coactivateurs et des corépresseurs : ..................................................................................... 45
(1-b) Recrutement des complexes corégulateurs par les RNs: ....................................................................... 47
(2) Interactions des RNs avec les autres facteurs de transcription : ..................................................................... 48
(2-a) Ouverture de la chromatine par un facteur pionnier : ............................................................................ 48
(2-b) Coopération augmentant la trans-activation du gène cible des deux partenaires :................................. 49
(2-c) Répression de l’action d’un des deux partenaires :................................................................................ 50
(3) Les modifications post-traductionnelles : ...................................................................................................... 52

3
 ii) Action non génomique des RNs :......................................................................................................................... 53
f) Conclusion, les différents niveaux de régulation des RNs : ..................................................................... 54

PARTIE 2 : LE FOIE. ........................................................................................................................................ 56

1) ANATOMIE ET VASCULARISATION: ............................................................................................................... 56

2) LES DIFFERENTES CELLULES CONSTITUANT LE FOIE: .................................................................................... 57
3) LES DIFFERENTES UNITES ANATOMIQUES OU FONCTIONNELLES DU FOIE : .................................................... 59
a) Unité anatomique, le lobule hépatique : ................................................................................................. 60
b) Unité fonctionnelle, le lobule portal : ..................................................................................................... 60
c) Unité fonctionnelle, l’acinus hépatique :................................................................................................. 60
4) LES DIFFERENTES FONCTIONS HEPATIQUES : ................................................................................................. 62
a) Un rôle d’épurateur : .............................................................................................................................. 62
b) Un rôle dans le système immunitaire : .................................................................................................... 62
c) Un rôle de stockage et de production :.................................................................................................... 63
5 ) ACTION CENTRALE DU FOIE DANS LE MAINTIEN DE L’HOMEOSTASIE ENERGETIQUE DE L’ORGANISME : ....... 63
a) Les différentes étapes de l’évolution du statut nutritionnel et action hépatique associée :..................... 64
b) Rôle central du foie dans la réponse aux besoins énergétiques de l’organisme : ................................... 67
i) Rôle dans le métabolisme des lipides : .................................................................................................................. 68
ii) Rôle dans le métabolisme du cholestérol : ........................................................................................................... 71
(1) Catabolisme du cholestérol et acides biliaires: .............................................................................................. 71
(1-a ) Synthèse de novo des acides biliaires primaires: .................................................................................. 72
(1-b) Activation de la synthèse des ABs : ...................................................................................................... 74
(1-c ) Le cycle des acides biliaires dans l’organisme : ................................................................................... 77
(1-d) Taille, composition du mélange d’ABs et index d’hydrophobicité. ...................................................... 85
iii) Rôle dans le métabolisme du glucose : ............................................................................................................... 85
(1) Orientation de la réponse hépatique, stockage vs production du glucose : .................................................... 85
(1-a) La réponse rapide par la variation des flux métaboliques :.................................................................... 87
(1-b) La réponse à long terme par régulation transcriptionnelle: ................................................................... 91
(2) Néoglucogenèse rénale et intestinale : ........................................................................................................... 95
(2-a) Néoglucogenèse rénale : ........................................................................................................................ 95
(2-b) Néoglucogenèse intestinale : ................................................................................................................. 96

PARTIE 3 : LE RECEPTEUR NUCLEAIRE FXR. ....................................................................................... 97

1) LES RECEPTEURS ACTIVES PAR LES ACIDES BILIAIRES : ................................................................................. 97

2) CAS PARTICULIER DU RN FXR : ................................................................................................................... 99
a) Structure et expression de FXR: .............................................................................................................. 99
i) Structure et expression tissulaire de FXR : ........................................................................................................... 99
ii) Régulation de l’expression de FXR: .................................................................................................................. 103
(1) Régulation directe de l’expression de FXR : ............................................................................................... 103
(1-a) Par des microARNs : ........................................................................................................................... 103
(1-b) Par des facteurs de transcription :........................................................................................................ 103
(1-c) Par des récepteurs nucléaires : ............................................................................................................. 104
(2) Régulation de l’expression de FXR via le statut nutritionnel : .................................................................... 104

4
 (3) Régulation de l’expression de FXR dans un contexte inflammatoire : ........................................................ 105
b) Mode d’action de FXR : ........................................................................................................................ 105
i) Mode de fixation de FXR à l’ADN : ................................................................................................................... 105
ii) Ligands (ou agonistes) naturels et synthétiques de FXR: ................................................................................... 107
(1) Ligands naturels (ou endogènes) : ............................................................................................................... 107
(2) Ligands synthétiques : ................................................................................................................................. 110
(3) Modulateurs sélectifs de FXR (SBARMs) :................................................................................................. 112
(4) Antagonistes naturels et synthétiques : ........................................................................................................ 113
c) FXR et métabolisme hépatique: ............................................................................................................. 113
i) FXR et métabolisme des ABs : ........................................................................................................................... 114
ii) FXR, transport des ABs et détoxification : ........................................................................................................ 114
(1) FXR et transport des ABs au niveau intestinal : .......................................................................................... 114
(2) FXR, transport des ABs au niveau hépatique et détoxification: .................................................................. 114
iii) FXR et régulation de la synthèse des ABs : ...................................................................................................... 117
iv) FXR, inflammation, régénération hépatique et cancer : .................................................................................... 120
(1) Rôle de FXR dans la régulation de l’inflammation : ................................................................................... 120
(2) Rôle de FXR dans la prolifération et la régénération hépatique : ................................................................ 121
(3) FXR et Cancers hépatiques : ........................................................................................................................ 123
v) Rôle de FXR dans le métabolisme des acides aminés : ...................................................................................... 126
vi) Rôle de FXR dans le métabolisme des lipides : ................................................................................................ 127
vii) Rôle de FXR dans le métabolisme du glucose : ............................................................................................... 129
viii) Régulation de l’action de FXR par MPTs : ..................................................................................................... 134

CHAPITRE 2 : RESULTATS. ......................................................................................................................... 141

OBJECTIFS DE L’ETUDE : ........................................................................................................................... 141

RESULTATS:.................................................................................................................................................... 144

1) L’activation de FXR potentialise la production de glucose induite par la voie glucagon/AMPc : ....... 144
2) La voie glucagon/AMPc interfère avec la régulation par FXR des expressions de ses gènes cibles: ... 151
3) La phosphorylation de FXR par la PKA sur ses sérines en position 325 et 357 régule son activité
transcriptionnelle: ..................................................................................................................................... 158
4) La phosphorylation de FXR par la PKA sur ses sérines en position 325 et 357 est nécessaire à la
potentialisation de l’HGP par le GW4064 : .............................................................................................. 163
5) La potentialisation de la transcription des gènes de la néoglucogenèse induite par FXR est associée aux
actions de CREB et de la PKA. .................................................................................................................. 164
6) Le glucagon réprime l’induction de la transcription de Shp/Nr0b2 par FXR via FOXA2 : ................. 168

CONCLUSION ET PERSPECTIVES: ........................................................................................................... 178

MATERIELS ET METHODES. ..................................................................................................................... 192

1) ANTICORPS: ................................................................................................................................................ 192

2) CULTURE CELLULAIRE: ............................................................................................................................... 192
3) HEPATOCYTES PRIMAIRES DE SOURIS: ........................................................................................................ 193
4) PRODUCTION DE GLUCOSE: ......................................................................................................................... 194

5
 5) PLASMIDES : ............................................................................................................................................... 194
6) CLONAGE ADENOVIRAL ET PRODUCTION VIRALE: ....................................................................................... 195
7) EXTRACTION PROTEIQUE : .......................................................................................................................... 196
8) WESTERN BLOT ET IMMUNOPRECIPITATION : .............................................................................................. 196
a) Co-immunoprécipitation: ...................................................................................................................... 196
b) Western blot (WB) : ............................................................................................................................... 196
c) Simple Western immunoassays (WES): ................................................................................................. 196
9) PRODUCTION DE LA PROTEINE RECOMBINANTE FXR ET PURIFICATION : .................................................... 197
10) PHOSPHORYLATION IN VITRO : .................................................................................................................. 197
11) TRANSFECTION TRANSITOIRE :.................................................................................................................. 198
a) Essai « gène rapporteur » : ................................................................................................................... 198
b) Transfection de siRNAs : ....................................................................................................................... 198
12) EXTRACTION D’ARN, SYNTHESE DE L’ADNC ET PCR EN TEMPS REEL : .................................................. 199
13) ANALYSE DE PUCES D’EXPRESSION : ......................................................................................................... 199
14) IMMUNOPRECIPITATION DE LA CHROMATINE : .......................................................................................... 199
15) MODELES ANIMAUX ET EXPERIMENTATIONS : .......................................................................................... 200
16) ANALYSES STATISTIQUES : ....................................................................................................................... 200
17) INFORMATIONS COMPLEMENTAIRES : ....................................................................................................... 201

ANNEXE ............................................................................................................................................................ 206

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................ 252

6
 Résumé
L’homéostasie glucidique est, durant un jeûne normal, maintenue grâce à un réseau de
régulation complexe contrôlé principalement par le glucagon, produit par le pancréas.
S’opposant aux effets de l’insuline, celui-ci orchestre notamment l'utilisation, le stockage et la
synthèse du glucose par le foie, principal organe de production du glucose au cours du jeûne.
Cette dernière s’effectue d’abord suite à la dégradation du glycogène ou glycogénolyse puis
par la synthèse de novo de glucose ou néoglucogenèse. La néoglucogenèse hépatique est
contrôlée par la modulation de l’activité et/ou de l’expression de différentes enzymes-clefs
selon des mécanismes allostériques ou transcriptionnels.
De multiples facteurs de transcription sont impliqués dans la régulation, au niveau
transcriptionnel, de la néoglucogenèse hépatique. Le récepteur nucléaire des acides biliaires
FXR est exprimé dans le foie et dans plusieurs organes impliqués dans le maintien de
l’homéostasie glucidique. FXR participe à la régulation de nombreuses fonctions hépatiques
essentielles, en contrôlant notamment les métabolismes des acides biliaires et lipidique. Le
rôle exact de FXR sur la néoglucogenèse reste toujours débattu. L’objectif de cette thèse a
donc été d’étudier le rôle de FXR dans le contrôle de la néoglucogenèse hépatique dans des
conditions expérimentales reflétant certains aspects du jeûne. Nous avons démontré que FXR,
en présence de glucagon, régulait positivement la néoglucogenèse selon deux mécanismes.
Le premier mécanisme implique la phosphorylation de FXR par la PKA, une kinase
activée par le glucagon. Cette modification post-traductionnelle de FXR permet une induction
synergique de l’expression des enzymes-clefs de la néoglucogenèse par FXR et le facteur de
transcription CREB. L’identification de ce mécanisme constitue la majeure partie des travaux
présentés dans cette thèse. Ceux-ci ont été intégrés à des travaux menés précédemment dans le
laboratoire qui nous ont permis d’identifier un mécanisme additionnel de régulation de la
gluconéogenèse. L’interaction directe de FXR avec le facteur de transcription FOXA2, lui-
même activé par le glucagon, inhibe la capacité de FXR à induire l’expression de SHP, un
récepteur nucléaire inhibiteur de la néoglucogenèse.
Ce travail a donc permis d’identifier pour la première fois que la néoglucogenèse
hépatique est régulée positivement par FXR dans le cadre de la voie de signalisation du
glucagon. Pour cela, FXR intègre le signal « glucagon » par deux mécanismes distincts: via
une modification post-traductionnelle, sa phosphorylation par la PKA sur les sérines S325 et
S357 et via une interaction protéine-protéine avec FOXA2.

7
 Summary
Glucose homeostasis is maintained during normal fasting through a complex
regulatory network controlled mainly by glucagon, a pancreatic hormone. Opposing the
effects of insulin, it orchestrates the glucose use, storage and synthesis by the liver, the main
organ that produces glucose during fasting. The latter is carried out first by the degradation of
glycogen or glycogenolysis and then by de novo glucose synthesis or gluconeogenesis.
Hepatic gluconeogenesis is controlled by modulation of various key enzymes activity and/or
expression according to allosteric or transcriptional mechanisms.
Multiple transcription factors are involved in the transcriptional regulation of hepatic
gluconeogenesis. The nuclear bile acid receptor FXR is expressed in the liver and in several
organs involved in glucose homeostasis. FXR regulates many essential liver functions,
including controlling bile acid and lipid metabolism. The exact role of FXR on
gluconeogenesis is still debated. The objective of this work was therefore to study the role of
FXR in the control of hepatic gluconeogenesis under experimental conditions reflecting
certain aspects of fasting. We demonstrated that FXR, in the presence of glucagon, positively
regulated gluconeogenesis according to two mechanisms.
The first mechanism involves phosphorylation of FXR by PKA, a glucagon-activated
kinase. This FXR post-translational modification allows synergistic induction of key
gluconeogenic enzymes expression by FXR and the CREB transcription factor. This
mechanism identification constitutes the major part of the work presented in this thesis. These
were integrated with work previously conducted in the laboratory that allowed us to identify
an additional mechanism for regulating gluconeogenesis. The FXR direct interaction with the
transcription factor FOXA2, itself activated by glucagon, inhibits the ability of FXR to induce
the expression of SHP, a gluconeogenesis inhibitory nuclear receptor.
This work has therefore identified for the first time that hepatic gluconeogenesis is
positively regulated by FXR in the glucagon signalling pathway. For this, FXR integrates the
"glucagon" signal by two distinct mechanisms: via post-translational modification, its
phosphorylation by PKA on S325 and S357 serines and via protein-protein interaction with
FOXA2.

8
 Abréviations
AAV8: Adeno-Associated Virus serotype C/EBP: CCAATT/Enhancer-Binding
8 Protein
ABCB4/G4/G8: ATP-binding Cassette CA: Cholic Acid
Sub-family B or G, Member 4/8 CAR: Constitutive Androstane Receptor
ABs: Acides Biliaires CBP: CREB Binding protein
ACC: Acetyl-CoA Carboxylase CBR: CoBinding Region
AD ou AF: Activation Domain ou CCK: cholecystokinine
Activation Function CDCA: ChenoDeoxyCholic Acid
ADN: Acide désoxyribonucléique CDX2: Caudal related homeobox 2
AKT: Protein Kinase B CES1: Carboxyl Esterase 1
AMPc: Adénosine MonoPhosphate ChIP: Chromatin ImmunoPrecipitation
cyclique ChIP-reChIP: sequential chromatin
AMPK: AMP-activated Protein Kinase immunoprecipitation
ANIT: alpha-naphthylisothiocyanate ChIP-Seq: Chromatin
ANOVA2: Two-way Analysis of Variance ImmunoPrecipitation Sequencing
ApoCII / CIII: Apolipoprotein CII / CIII ChREBP: Carbohydrate Response Element
AR: Androgen Receptor Binding Protein
ARN: Acide ribonucléique CK2: Casein Kinase 2
ARNT/HIF1beta: Hypoxia-Inducible CoRNR: Corepressor Nuclear Receptor
Factor 1-Beta box
ARs: Adrenergic Receptors CPT-1: Carnitine PalmitoylTransférase 1
ASBT: Apical Sodium-dependent Bile salt CRE: cAMP response element
Transporter CREB: cAMP response element binding
ASCT2: Alanine-Serine-Cysteine protein
transporter 2 CRMs: Cis-Regulatory Modules
ATP: Adénosine TriPhosphate CRTC2: CREB-Regulated Transcription
BAAT: Bile acid n-acetyltransferase Coactivator 2
BACS: Bile acid-coenzyme A synthase CTCF: CCCTC-binding Factor
BSEP: Bile salt export protein CTE: C-Terminal Extension region
BSHs: Bile Salt Hydrolases CYP27A1: stérol 27-hydroxylase

9
CYP3A11: Cytochrome P450, Family 3, FIC1: Familial Intrahepatic Cholestasis
subfamily A, polypeptide 11 Type 1
CYP3A4: Cytochrome P450 Family 3 FOXA: Forkhead box A
subfamily A Member 4 FOXM1b: Forkhead box protein M1
CYP7A1: Cholestérol 7-Alpha isoform B
hydroxylase FOXO1: Forkhead O box 1
CYP7B1: oxystérol 7-alpha hydroxylase FTs: Facteurs de transcription
CYP8B1: stérol 12-alpha hydroxylase FXR: Farnesoid X Receptor
DAX-1: Dosage-sensitive sex reversal FXRE: FXR response element
Adrenal hypoplasia critical region on GMCA: Glyco-beta-MuriCholique Acide
chromosome X gene 1 G6P: Glucose-6-Phosphate
DBD: DNA Binding Domain G6PC: Glucose-6-Phosphatase
DCA: DeoxyCholic Acid GCGR: Glucagon receptor
DIO: Diet-Induced Obesity GFP: Green Fluorescent Protein
DR(n): élément de réponse direct séparé GIP: Gastric Inhibitor Peptide
par "n" nucléotides GK: GlucoKinase
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent GLP-1: Glucagon Like Peptide 1
Assay GLUT2: Glucose Transporter 2
ER(n): élément de réponse en miroir Glyco-AB: acide biliaire conjugué à une
séparé par "n" nucléotides glycine
ER: Estrogen Receptor GP: production de glucose
ERK1/2: Extracellular signal-Regulated GPCRs: récepteurs couplés aux protéines
Kinase 1/2 G
eRNAs: ARNs des enhancers GR: Glucocorticoid Receptor
ERR: Estrogen Related Receptor GRE: GR response element
F-1,6-BP: Fructose 1,6-BiPhosphate GSK3: Glycogène Synthase Kinase 3
F-2,6-BP: Fructose 2,6-BiPhosphate GSTs: Glutathione S-Transferases
F6P: Fructose-6-Phosphate GYP: Glycogène Phosphorylase
FAS: Fatty Acid Synthase GYS: Glycogène Synthase
FBP1: Fructose 1,6-BiPhosphatase H3K27ac: acétylation de l'histone H3 sur
FGF15/19/21: Fibroblast Growth Factor sa lysine 27
15/19/21 H3K4me1: monométhylation de l'histone
FGFR 1/2/4: Fibroblast Growth Factor H3 sur sa lysine 4
Receptor 1, 2 ou 4 HAT: Histone Acetyl-Transférase

10
HCA: HyoCholic Acid MDR: MultiDrug Resistance protein
HDAC: Histone Dé-Acétylase MFA-1: Merck FXR agonist 1
HDCA: HyoDeoxyCholic Acid miRNAs: microARNs
HDL: High Density Lipoprotein MPHs: Mouse Primary Hepatocytes
HFD: High Fat Diet MPTs: Modifications Post-
HGP: production hépatique de glucose Traductionnelles
HNF1a: Hepatocyte Nuclear Factor 1- MR: Mineralcorticoid Receptor
alpha MRP: Multidrug-Resistance associated
HNF-3/6: Hepatic Nuclear Factor 3 ou 6 Protein
HNF4a: Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha NAFLD: Non-Alcoholic Fatty Liver
HRE: Hormonal Response Element Disease
IBABP: Intestinal Bile-Acid Binding NDRG2: N-myc Dowstream-Regulated
Protein Gene 2
IGFBP1: Insulin Like Growth Factor negFXRE: negative FXR response element
Binding Protein1 NF--b: Nuclear Factor Kappa b
IL-1: InterLeukin 1 nHRE: negative hormonal response
IP : Immuno-Précipitation element
IR(n): élément de réponse inversé séparé NK: Cellule Natural Killer
par "n" nucléotides NTCP: Na+ Taurocholic acid
IR: Insulin Receptor Cotransporting Polypeptide
JNK: Jun N-terminal Kinase NTD: N-Terminal Domain
KNG1: Kininogen 1 OATP: Organic Anion Transporting
LBD: Ligand Binding Domain Polypeptide
LBP: Ligand Binding Pocket OCA: ObetiCholic Acid
LCA: LithoCholic Acid OGT: O-linked β-N-acetylGlucosamine
L-PK: Liver Pyruvate Kinase Transférase
LRH-1: Liver Receptor Homolog 1 OST: Organic Solute Transporter
LXR: Liver X Receptor p300: Histone acetyltransferase p300
MAFB: MusculoAponeurotic PC1/3: ProConvertase 1/3
Fibrosarcoma oncogene family B PCK1: phosphoenolpyruvate
MAFG: V-Maf Avian musculoaponeurotic carboxykinase
Fibrosarcoma oncogen homolog G PCx: Pyruvate Carboxylase
MCA: Muricholic Acid PDKs: pyruvate déshydrogénases
MDCA: MuriDeoxyCholic Acid PEP: PhosphoEnolPyruvate

11
PFK1: PhosphoFructoKinase 1 SIK2: Salt Inducible Kinase 2
PFK2/FBPase 2: PhosphoFructoKinase-2 / siRNA: small interfering RNA
Fructose-BisPhosphatase-2 SIRT1: Sirtuin 1
PGC1a: Peroxisome proliferator-activated SMRT: Silencing Mediator of Retinoic
receptor Gamma Coactivator 1 alpha acid and Thyroid hormone receptor
PI3K: PhosphatIdylinositol 3 Kinase SOCS3: Suppressor Of Cytokine Signaling
PKA: Protein Kinase A 3
PKAc: sous-unité catalytique de la PKA SREBP1c: Sterol Regulatory Element-
PKAR: sous-unité régulatrice de la PKA Binding Protein 1 isoform c
PKC: Protein Kinase C STAT5: Signal Transducer and Activator
PKG: Protein Kinase G of Transcription 5
PPAR //: Peroxisome Proliferator- SULT2A1/9: SulfoTransferase family 2A
Activated Receptor alpha / beta / gamma member 1/9
PR: Progesterone Receptor SULTs: SulfoTransférases
PRMT1: Protein arginine SUMO1/2: Small Ubiquitin-related
MethylTransferase 1 Modifier 1/2
PXR: Pregnane X Receptor tASBT: truncated Apical Sodium-
RAR: Retinoic Acid Receptor dependent Bile salt Transporter
RE: Response Element TAT: Tyrosine AminoTransferase
RIME: Rapid Immunoprecipitation Mass Tauro-AB: acide biliaire conjugué à une
Spectrometry of Endogenous proteins taurine
RNs: Récepteurs Nucléaires TGR5: Takeda G-protein Receptor 5
ROR: RAR-related Orphan Receptor TGs: TriGlycérides
RT-qPCR: Reverse Transcription - TNF: Tumor Necrosis Factor alpha
quantitative Polymerase Chain Reaction TR: Thyroid hormone Receptor
RXR: Retinoid X Receptor TRMs: Trans-Regulatory Modules
S1PR2: Sphingosine -1 Phosphate TSS: Transcription Start Site
Receptor 2 TTNPB: 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-
SBARMs: Selective Bile Acid Receptor 5,5,8,8-Tetramethyl-2-Naphthalenyl)-1-
Modulators Propenyl] Benzoic acid
SEM: Standard Error of the Mean UAS: Upstream Activating Sequence
SF-1: Steroidogenic Factor 1 UDCA: UrsoDeoxyCholic Acid
SHP: Small Heterodimer Partner UGT1A3: UDP GlucuronosylTransferase
shRNA: short hairpin RNA family 1 member A3

12
UGT2B4: UDP GlucuronosylTransferase WAT: White Adipose Tissue
family 2 member B4 WB : Western-Blot
UGT2B7: UDP GlucuronosylTransferase WD: Western Diet
family 2 member B7 3'-UTR: 3 prime Untranslated Transcribed
UGTs: UDP-GlucuronosylTransférases Region.
URR: Upstream Regulatory Region
VDR: Vitamin D Receptor
VLDL: Very Low Density Lipoprotein
VRK1: Vaccinia Related Kinase 1

13
 Liste des figures et des tableaux
Liste des figures:
Figure 1: Les différents types de facteurs de transcription. ................................................................... 19
Figure 2: Régulation transcriptionnelle d’un gène et boucle chromatinienne. ...................................... 21
Figure 3: Les différents arrangements des HREs. ................................................................................. 24
Figure 4: Architecture des HREs et positionnement des RNs. .............................................................. 25
Figure 5 : Arbre phylogénétique de la superfamille des RNs................................................................ 28
Figure 6 : La structure en domaines des RNs. ....................................................................................... 30
Figure 7 : Le domaine de liaison à l’ADN des récepteurs nucléaires. .................................................. 32
Figure 8 : Le domaine de fixation du ligand des récepteurs nucléaires................................................. 35
Figure 9 : Classes fonctionnelles des RNs selon les caractéristiques de leurs ligands. ......................... 43
Figure 10: Coactivateurs et corépresseurs des RNs et leurs fonctions. ................................................. 47
Figure 11 : Libération de l’accès du RN à son HRE suite à l’ouverture de la chromatine par un FT
pionnier.................................................................................................................................................. 49
Figure 12 : Mécanisme permettant à un RN et un FT de coopérer dans la trans-activation d’un gène
cible commun. ....................................................................................................................................... 50
Figure 13 : Les différents mécanismes de trans-repression. ................................................................. 51
Figure 14 : Les différents niveaux de régulation de l’activité d’un RN. ............................................... 55
Figure 15 : Anatomie du foie et vascularisation. ................................................................................... 56
Figure 16 : Disposition des hépatocytes au niveau du foie. .................................................................. 58
Figure 17 : Localisation des différents types cellulaires constituant le foie. ......................................... 59
Figure 18 : Organisation structurelle et fonctionnelle du foie. .............................................................. 59
Figure 19 : Lobule hépatique................................................................................................................. 60
Figure 20: Utilisation du glucose en fonction du temps dans les cinq étapes de la progression du statut
nutritionnel de l’organisme ................................................................................................................... 65
Figure 21 : Actions hépatiques dans la réponse aux besoins énergétiques de l’organisme. .................. 67
Figure 22 : Métabolisme des lipides et actions hépatiques. .................................................................. 69
Figure 23: Production de TGs par la lipogenèse hépatique de novo. .................................................... 70
Figure 24: Les voies de synthèses des ABs. .......................................................................................... 73
Figure 25: Régulation de l’activation de la synthèse des ABs selon le statut nutritionnel. ................... 76
Figure 26: Vue d’ensemble du système de transport des ABs. ............................................................. 78
Figure 27: Production des ABs secondaires par la flore bactérienne au niveau du colon. .................... 82
Figure 28: Evolution, chez l’homme, des concentrations plasmatiques en glucose, en insuline et en
glucagon après un repas. ....................................................................................................................... 86
Figure 29 : Régulation du stockage et de la production hépatique de glucose. ..................................... 91

14
Figure 30: Régulation transcriptionnelle de la néoglucogenèse. ........................................................... 94
Figure 31 : Structures et transcrits du gène FXR murin. .................................................................. 101
Figure 32 : Structure chimique générale des ABs et différences de structure entre le CDCA et
l’UDCA. .............................................................................................................................................. 109
Figure 33 : Structure et profil de solubilité des ABs les plus communs.............................................. 110
Figure 34 : Structure chimique des principaux ligands de FXR.......................................................... 112
Figure 35 : Actions de FXR sur le transport des ABs et sur leurs détoxifications. ............................. 116
Figure 36 : Mécanismes de répression de l’expression génique de CYP7A1 dépendante de FXR. .... 119
Figure 37: Actions anti-tumorales de FXR. ........................................................................................ 125
Figure 38: Objectifs de la thèse. .......................................................................................................... 143
Figure 39 : FXR contribue à l’HGP. ................................................................................................... 144
Figure 40 : Optimisation des conditions de mesure de l’HGP dans les MPHs. .................................. 146
Figure 41 : FXR induit la production hépatique de glucose. ............................................................... 148
Figure 42 : Effets de la répression de l’expression de FXR par siRNA sur l’HGP. ............................ 149
Figure 43 : FXR induit l’HGP indépendamment de l’action de FOXO1. ........................................... 150
Figure 44 : Profils d’expression génique des MPHs après traitements, seul ou combiné, par le
GW4064 (2 µM) et le glucagon (100 nM). ......................................................................................... 152
Figure 45: Validation par RT-qPCR des niveaux d’expression génique et par Wes des niveaux
d’expression protéique des gènes d’intérêts identifiés (MPHs). ......................................................... 154
Figure 46: Validation par RT-qPCR des niveaux d’expression génique des gènes d’intérêts identifiés
(MPHs). ............................................................................................................................................... 155
Figure 47: Validation de l’implication de FXR dans les effets de potentialisation ou de répression
observés (MPHs). ................................................................................................................................ 156
Figure 48: Validation de l’implication de la PKA dans les effets de potentialisation ou de répression
observés (MPHs). ................................................................................................................................ 157
Figure 49: Identification in vitro de la phosphorylation directe de FXR par la PKA.......................... 159
Figure 50: Captures d’écran des spectres de masses des phospho-peptides de FXR ciblés par la PKA.
............................................................................................................................................................. 160
Figure 51 : La protéine kinase A régule l’activité transcriptionnelle de FXR..................................... 162
Figure 52 : Le maintien de la capacité de FXR à être phosphorylé par la PKA est nécessaire à la
potentialisation de l’HGP par le GW4064........................................................................................... 163
Figure 53: Les activations simultanées de la PKA et de FXR co-activent la transcription du gène Fbp1
de manière dépendante à la phosphorylation de FXR et à l’expression de Creb1 .............................. 166
Figure 54: Les activations simultanées de la PKA et de FXR co-activent la transcription du gène Pck1
de manière dépendante à la phosphorylation de FXR et à l’expression de Creb1. ............................. 167
Figure 55 : Confirmation dans les HepG2 des effets observés dans les MPHs. .................................. 170
Figure 56: Confirmation, dans les foies murins, de l’interaction physique entre FXR et FOXA2. .... 172

15
Figure 57: Confirmation des effets observés dans les MPHs au niveau de la lignée hépatocytaire
murine AML12. ................................................................................................................................... 173
Figure 58 : La déplétion de l’expression de FOXA2 diminue la production de glucose des MPHs. .. 175
Figure 59 : Impact de la régulation de SHP/NR0B2 via FOXA2 sur l’HGP (MPHs). ....................... 177
Figure 60: Régulation de la néoglucogenèse et de l’HGP par FXR. ................................................... 178
Figure 61: Localisation des sites de phosphorylation de FXR par la PKA. ........................................ 181
Figure 62 : Implication de FXR et de la PKA dans la potentialisation, par le GW4064, de l’induction
de Pgc1a par la voie glucagon/AMPc. ................................................................................................ 190

Différents éléments utilisés dans la réalisation de ces figures sont issus de la base de données d’images « Servier
medical art » (https://smart.servier.com/).

Liste des tableaux :

Tableau 1 : Corrélation entre la classification des RNs basée sur la phylogénétique et celle basée sur
les propriétés de dimérisation et de fixation à l’ADN. .......................................................................... 29
Tableau 2 : Les différents récepteurs des ABs ...................................................................................... 99
Tableau 3 : Expression de FXR dans les différents tissus chez la souris et l’homme. ........................ 100
Tableau 4 : Répartition tissulaire des différentes isoformes de FXR. ................................................. 102
Tableau 5: Bilan des études montrant une action négative de FXR sur la néoglucogenèse ou l’HGP.
............................................................................................................................................................. 130
Tableau 6: Bilan des études montrant une action positive de FXR sur la néoglucogenèse ou l’HGP. 131
Tableau 7: Actions sur FXR des différentes MPTs identifiées comme le ciblant (hors phosphorylation
par les kinases). ................................................................................................................................... 136
Tableau 8 : Actions sur FXR des différentes kinases identifiées comme le phosphorylant directement.
............................................................................................................................................................. 138

16
 CHAPITRE 1 : Contexte Bibliographique

Partie 1 : les récépteurs nucléaires.

1) Facteurs de transcription et régulation de l’expression génique:
a) Facteurs de transcription et éléments de réponse :

L’organisme a besoin au cours de son développement, puis par la suite afin de

maintenir sa structure et répondre correctement aux variations de son environnement, de
réguler finement et de manière spécifique selon les tissus, les expressions des gènes qui le
compose. Pour cela, le génome contient des séquences d’ADN régulatrices appelées éléments
de réponse. L’accès à ces derniers est régulé par un mécanisme de décondensation de la
chromatine au niveau de zones du génome actives formant des modules de cis-régulation
nommés CRMs (cis-regulatory modules) (Lenhard et al., 2012)(Spitz & Furlong,
2012)(Wingender et al., 2015).
Par définition les facteurs de transcription (FTs) regroupent toutes les protéines
possédant au moins un domaine de fixation à l’ADN (DBD, DNA binding domain) associé à
un élément de réponse, et un domaine d’activation de la transcription (AD, activation
domain). Ils sont classés selon la structure de leur DBD suivant dix grandes classes
(Wingender et al., 2018).

b) Fixation des FTs au niveau du génome :

Les progrès technologiques, notamment la mise au point des techniques d’immuno-

précipitation de la chromatine, des puces à ADN et du séquençage à haut débit, ont permis
d’avoir une image globale des sites de fixation d’un FT donné sur l’ensemble du génome.
Il est devenu assez vite évident que l’association simple entre un FT et son élément de
réponse n’était pas suffisante à expliquer la complexité du mécanisme permettant aux FTs de
se fixer de manière spécifique sur le génome. En effet, les sites potentiels de fixation pour un
FT donné, déterminés par bioinformatique au niveau de l’ensemble du génome, sont bien plus
nombreux que les sites de fixation réels détectés par ChIP-seq (Chromatin
ImmunoPrecipitation Sequencing). Ainsi, les FTs lient en fait beaucoup moins de régions que

17
prévu en grande partie à cause de l'effet restrictif imposé par la nature de la chromatine
(Slattery et al., 2014).
En effet, l'ADN nucléaire est associé aux nucléosomes, qui sont constitués de deux
copies des protéines histones H2A, H2B, H3 et H4, ou de leurs variantes. L'assemblage de ces
nucléosomes permet l'empaquetage de l'ADN dans le noyau, mais joue également un rôle
régulateur majeur. Les histones font l'objet de modifications post-traductionnelles (MPTs) qui
peuvent réguler le compactage de la chromatine et affecter ainsi l’accès des différents FTs à
l’ADN (Rivera & Ren, 2013). Avec plus de cent MPTs d’histones référencées et la possibilité
de ces dernières de se combiner, ce mécanisme dit « épigénétique » joue donc un rôle majeur
dans la régulation fine de l’accès des différents FTs à leurs éléments de réponse (Rothbart &
Strahl, 2014). La compréhension des rôles associés à ces différentes MPTs a permis de les
utiliser par la suite comme des marqueurs permettant d’identifier l’organisation de la
chromatine (Huang et al., 2015)(Jenuwein & Allis, 2001)(Rivera & Ren, 2013).
Ainsi, des études menées sur l’accessibilité à l’ADN et la fixation des FTs ont mis en
évidence que dans la plupart des cas, la fixation d’un FT est corrélée à une chromatine
« ouverte » (Slattery et al., 2014). Cela a été observé, par exemple, pour la fixation de la
plupart des 119 FTs analysée par le projet ENCODE dans la lignée cellulaire
d’hépatocarcinome humain HepG2 (Thurman et al., 2012). Néanmoins, ce n’est pas toujours
le cas et certains FTs sont capable de se fixer sur des zones de chromatine plus condensées
(Sherwood et al., 2014).
Au final, une classification des FTs en trois groupes a donc été proposée (Figure 1)
(Ehsani et al., 2016) :

- Les FTs pionniers : ils se caractérisent par leur capacité à se lier à leurs
éléments de réponse dans des régions condensées de la chromatine. Par la
suite, ces FTs sont capables de promouvoir l'accessibilité à l'ADN.

- Les FTs colons : ils se lient principalement aux sites correspondant à leurs
motifs de liaison à l'ADN mais seulement lorsque ceux-ci sont dans des
zones d’ADN accessibles.

- Les FTs migrants : Ils ont les mêmes caractéristiques que les FTs colons
mais ils ne se lient qu'avec un sous-ensemble de leurs sites cibles. Leur

18
 sélectivité est probablement associée à la mise en place d'interactions avec
d'autres cofacteurs.

Bien que les FTs colons et migrants ne soient pas capables, comme les facteurs
pionniers, de décondenser la chromatine, la fixation d’un de ces FTs peut faciliter celle d’un
autre. En effet, la fixation du premier FT va empêcher la compaction de la chromatine par sa
seule présence (Mirny, 2010). De plus, les études à l’échelle du génome ont montré que la
fixation d’un FT au niveau de l’ADN favorisait le recrutement d’un sous-groupe de FTs.
Ainsi, l’assemblage des FTs recrutés au niveau des mêmes CRMs forment des modules de
trans-régulation nommés TRMs (trans-regulatory modules). Ces associations sont spécifiques
aux différents tissus. Néanmoins, elles ne sont pas statiques et peuvent être partiellement
modulées, par exemple, suite à l’activation d’un FT ou à un changement dans le statut
nutritionnel de l’organisme (Dubois-Chevalier et al., 2017)(Gerstein et al., 2012)(Goldstein et
al., 2017).

Figure 1: Les différents types de facteurs de transcription.

P: Facteurs pionniers (Pioneer factor), S: Facteurs colons (Settler factor),
M : Facteurs migrants (Migrant factor) (d’après (Slattery et al., 2014)).

19
c) Régulation de la transcription des gènes, « enhancers » et boucle
chromatinienne :

L’étude combinée de la fixation des FTs à l’échelle du génome et des différentes

MPTs des histones reflétant les niveaux d’activations des zones associées, ont montré que
contrairement à ce qui était attendu, un grand nombre de sites de fixation actifs se situaient
dans des zones éloignées des promoteurs (ENCODE, 2012)(Neph et al., 2012). Par exemple,
une étude de ce type réalisée dans différents tissus ou types cellulaires humains, montre que
45,7% des sites actifs de fixation des FTs sont situés dans les régions intergéniques, 37,7%
dans les introns et seulement 8,9% au niveau des promoteurs (à proximité du TSS
(Transcription Start Site)) (Neph et al., 2012). Ces études élargissent et confirment les
premiers travaux qui ont identifié et décrit les « enhancers » comme des zones d’ADN
régulatrices éloignées des TSS et capables de réguler les expressions des gènes à distance
(Benoist & Chambon, 1981)(Gruss et al., 1981). De plus, les régions correspondant à un
enhancer actif présentent, la plupart du temps, un profil de MPTs des histones composant les
nucléosomes adjacents assez caractéristique : notamment, la monométhylation de l’histone H3
sur sa lysine 4 (H3K4me1) ou l’acétylation de l’histone H3 sur sa lysine 27 (H3K27ac). Ce
qui a permis par la suite d’identifier un grand nombre d’enhancers potentiels au niveau du
génome (Gray et al., 2015)(Zhu et al., 2013).
La régulation de la transcription par les enhancers s’effectue via la formation de
boucles chromatiniennes (Figure 2) (Carter et al., 2002)(Tolhuis et al., 2002). Le facteur
CTCF (CCCTC-binding factor) et le complexe protéique formant la cohésine sont essentiels à
la mise en place de ces structures (Cho et al., 2005). CTCF est un facteur « insulateur », c'est-
à-dire qu’il permet d’isoler une zone du génome des autres afin d’éviter toutes interactions ou
interférences. Il est ainsi décrit comme se fixant à la frontière entre la chromatine active et
celle inactive (Handoko et al., 2011). La formation d’une boucle chromatinienne permet aux
différents éléments (les FTs et autres cofacteurs) fixés au niveau du promoteur et des
enhancers d’interagir entre eux et de réguler finement la transcription du gène associé (Spitz
& Furlong, 2012).

20
 Figure 2: Régulation transcriptionnelle d’un gène et boucle chromatinienne.
Mediator : complexe protéique médiateur constitué de TFs et de cofacteurs.
(D’après (Rivera & Ren, 2013))

Un recrutement de l’ARN polymérase II et une transcription bi-directionnelle par

celle-ci a été identifiée au niveau des zones intergéniques correspondant aux « enhancers »
(Kim et al., 2010). Les ARNs non codants ainsi formés on été nommés eRNAs (pour ARNs
des enhancers). Cette transcription ne semble pas systématique, néanmoins l’expression de
ces eRNAs est fortement corrélée à une augmentation de l’expression des gènes cibles
associés (Cheng et al., 2015)(Mikhaylichenko et al., 2018). Ces eRNAs sont également
impliqués dans la formation des boucles chromatiniennes notamment en interagissant avec la
cohésine (Kagey et al., 2010)(Tsai et al., 2018).

d) FTs, « enhancers », « super-enhancers » et identité cellulaire :

Les « enhancers » et les FTs qui les fixent ont notamment été décrits comme jouant un
rôle majeur dans la différentiation cellulaire et le maintien de cette identité. Au cours de la
différentiation cellulaire, les facteurs pionniers interviennent au niveau de la chromatine
participant à la création d’un certain nombre de zones d’ADN décondensées. Ces enhancers,

21
ainsi formés, vont à leurs tours être fixés par des FTs colons ou migrants formant un ensemble
de zones régulatrices spécifiques au type cellulaire (Zaret & Carroll, 2011).
Ces « enhancers » sont plus ou moins actifs, ce qui est reflété notamment par les
différentes MPTs des histones situés à leurs proximités. Ainsi, un classement en trois
catégories a été proposé (Heinz et al., 2015)(Shlyueva et al., 2014):

- Les « enhancers » en équilibre (poised) : ils sont caractérisés par la fixation

de FTs, notamment ceux spécifiques au type cellulaire, associée à une
ouverture de la chromatine. Néanmoins, ils ne sont pas encore actifs et
nécessitent un recrutement ultérieur de FTs ou de cofacteurs, induit par un
signal extérieur, pour le devenir. Ces enhancers présentent des marques
épigénétiques associées à la fois à la répression et à l’activation de
l’expression génique. Ce type d’enhancers apparaît au cours de la
différenciation, leurs mises en place permettent de passer à l’étape suivante
de ce processus.

- Les « enhancers » en attente (primed) : ils ont les mêmes caractéristiques

que la catégorie précédente mais sont retrouvés dans les cellules
différenciées. Ils sont donc associés aux gènes permettant au type cellulaire
d’assurer sa fonction en réponse aux différents stimuli.

- Les « enhancers » actifs (active) : ils sont caractérisés par une chromatine
plus largement ouverte et un recrutement plus important de FTs que les
enhancers précédents. De plus, ces enhancers ne présentent que des
marqueurs épigénétiques correspondant à l’induction de l’expression
génique. Ces « enhancers » sont donc issus des catégories précédentes suite
à l’activation par différents stimuli des FTs les constituants. Néanmoins, ils
peuvent également apparaître à partir de zones inactives.

Enfin, les enhancers sont capables se s’associer en une structure plus large. Ils forment
ainsi une région du génome comprenant de multiples enhancers collectivement liés par un
réseau de protéines, notamment de FTs. Ces zones du génome nommées « super-enhancers »
permettent de réguler un ensemble de gènes de manière coordonnées (Whyte et al., 2013). Les
super-enhancers sont très souvent localisés près de gènes permettant de contrôler et définir

22
l'identité cellulaire. Les « super-enhancers » sont identifiables par le fait qu’ils présentent, à
un niveau très élevé, les caractéristiques des enhancers, c’est à dire à la fois un haut niveau de
fixation par les FTs et une forte modification de la chromatine. Ils sont, de plus, associés à des
gènes plus fortement exprimés (Hnisz et al., 2015)(Pott & Lieb, 2015).

2) Les récepteurs nucléaires :

Les récepteurs nucléaires (RNs) constituent un sous-ensemble de facteurs de
transcription spécifiques. Ils forment une superfamille qui de manière évolutive dérive d’un
ancêtre commun, un récepteur unique apparu chez les métazoaires (Escriva et al., 2004).
Chez l’homme, 48 RNs ont été à ce jour identifiés, 49 chez la souris et 47 chez le rat.
Leurs implications dans de nombreux aspects de la physiologie humaine et leurs dérégulations
dans différents contextes pathologiques ont été démontrés (Weikum et al., 2018). Les RNs
possèdent une architecture commune. Comme les autres FTs, les RNs régulent leurs gènes
cibles suite à leurs liaisons sur des zones spécifiques de l’ADN appelées élément de réponse
hormonal (HRE). A cela s’ajoute pour la plupart d’entre eux, la capacité à être activé
directement par de petites molécules lipophyles capables de traverser la membrane des
cellules, appelées ligands (Tableau 1). Cette particularité fait des RNs une des cibles
privilégiées de la recherche pharmacologique puisqu’il est possible de cibler leurs actions et
que classiquement les drogues les plus efficaces présentent les mêmes caractéristiques que les
ligands (Sladek, 2011)(Xu, 2015). Néanmoins, certains RNs dit « orphelins » n’ont pas de
ligands connus. Ils correspondent soit à des RNs dont le ligand existe mais n’a pas encore été
découvert, lorsque c’est le cas le RN est dit « adopté » soit à des RNs qui seraient capables
d’agir au travers d’un autre mécanisme (MPTs, action de cofacteurs …)(Gallastegui et al.,
2015).

a) Les éléments de réponse des RNs :

Comme tous facteurs de transcription, l’action des RNs nécéssite la reconnaissance de

leurs éléments de réponse au niveau de l’ADN. La plupart des RNs agissent sous forme de
dimère, soit les deux RNs le constituant sont les mêmes, il s’agit alors d’homodimère, soit les
deux RNs sont différents, il s‘agit alors d’hétérodimère. Chacun des deux RNs formant le
dimère se fixe à l’ADN sur une séquence appelée « demi-site », celui-ci est constitué d’une
séquence de seulement six paires de bases. Deux types de séquences consensus ont été
identifiées : « AGAACA » et « AGGTCA ». Les deux demi-sites sont situés de manière très

23
proche au niveau de l’ADN ce qui permet aux deux RNs du dimére qui les fixent d’interagir
physiquement. (Helsen et al., 2012). La dimérisation permet d’augmenter la spécificité de
fixation des différents RNs. Celle-ci est générée grâce aux différents arrangements des
positions relatives des demi-sites les uns par rapport aux autres, ainsi que par la distance (en
paires de bases) les séparant. Cette architecture va définir le HRE. Ceux-ci sont classifiés
selon l’orientation et la longueur de l’espace entre les demi-sites. Les trois architectures
suivantes ont été identifiées, « n » représentant un nombre (et une séquence) variable de
paires de bases séparant les deux demi-sites (Figure 3) (Pawlak et al., 2012) :
 Les éléments de réponse inversés (IR(n) – Inverted repeat) sont composés de
deux demi-sites orientés face à face.
 Les éléments de réponse en miroir (ER(n) – Everted repeat), les demi-sites
sont orientés de manière opposée l’un par rapport l’autre.
 Enfin, les éléments de réponse directs (DR(n) – Direct repeat) associent deux
demi-sites dirigés dans le même sens.

Figure 3: Les différents arrangements des HREs.

IR : Inverted Repeat, ER : Everted Repeat, DR : Direct Repeat, n: nombre variable de paires de bases
(d’après (Pawlak et al., 2012)).

L’architecture des HREs a un rôle important puisqu’elle va orienter le sens de fixation

du RN sur l’ADN. Ce qui entraine que selon le HRE, les zones d’interactions nécessaires à la
dimérisation de deux RNs seront différentes (Gronemeyer et al., 2004)(Weikum et al., 2018).
Certains RNs se fixent à l’ADN sous forme de monomère. L’HRE est dans ce cas constitué

24
d’un seul demi-site associé à des séquences d’ADN caractéristiques situées à ses deux
extrémités permettant d’augmenter sa spécificité (Figure 4) (Pawlak et al., 2012).

Figure 4: Architecture des HREs et positionnement des RNs.

IR : Inverted Repeat, ER : Everted Repeat, DR : Direct Repeat (d’après (Aranda & Pascual, 2001)).

 Les éléments de réponse négatifs (nHRE):

Les éléments de réponse négatifs (nHRE) correspondent à des sites de fixation pour un
RN donné qui va entrainer, après l’activation de ce dernier, une régulation du gène cible
opposée à celle obtenue lors de la fixation du même RN sur son HRE. Un nHRE résulte d’une
modification du HRE correspondant qui peut avoir lieu, au niveau de sa séquence, de
l’orientation les uns par rapport aux autres des ces deux demi-sites ou de la taille de la
séquence (n) les séparant. Il peut également résulter de la fixation sous forme de monomère
sur un seul demi-site, d’un RN agissant habituellement sous forme d’hétérodimère (Santos et
al., 2011).

b) Classification des RNs :

Différentes classifications des RNs ont été proposées:

La classification reposant sur les propriétés de dimérisation et de fixation à l’ADN

décrites précédemment est fréquemment utilisée. Dans celle-ci, la superfamille des RNs est

25
divisée en quatre classes. La répartition des différents RNs dans ces quatre grands groupes est
détaillée dans le Tableau 1.

 Les RNs de la classe I se fixent sous forme d’homodimère sur des demi-sites
présentant une organisation inversée séparée par un espace constant de 3
paires de bases (IR3). Cette classe regroupe les RNs de type stéroïdiens (ER,
PR, AR, GR et MR) qui sont les seuls à se fixer sur des séquences consensus
de type « AGAACA ». Les RNs des autres classes reconnaissent tous des
séquences consensus de type « AGGTCA ». Le RN stéroïdien ER (Estrogen
Receptor) est une exception dans la classe I puisqu’il se lie de manière
préférentielle à un demi-site « AGGTCA » tout en conservant l’architecture
IR3 (Aagaard et al., 2011)(Rastinejad et al., 2013).
 Les RNs de la classe II forment toujours un hétérodimère avec le RN RXR
(Retinoid X Receptor). Ils se fixent sur un demi-site « AGGTCA », RXR
occupant l’autre demi-site. Les HREs correspondant peuvent être de type
ER(n) ou IR(n) mais ils sont le plus souvent orientés dans le même sens avec
un espacement allant de 1 à 5 paires de bases (DR1-5). C’est cet espace entre
les deux demi-sites qui définit quel RN peut s’hétérodimèriser avec RXR. En
effet, l’association d’un RN avec RXR nécessite une interaction étendue
entre les deux protéines afin que la fixation des deux partenaires avec l’ADN
soit stable. Or, l’ajout d’une seule paire de base entre les deux demi-sites
entraine un éloignement entre RXR et son partenaire de 3 à 4 angströms et
une rotation entre les deux RNs de 35 degrés. C’est pourquoi, l’espace entre
les deux demi-sites permet de sélectionner quel RN pourra s’hétérodimèriser
avec RXR (Rastinejad, 2001). Les hétérodimères formés avec RXR peuvent
être divisés en deux groupes. Le premier correspond aux hétérodimères dit
permissifs. Ceux-ci peuvent être activés par le ligand de RXR sans qu’il soit
nécessaire que le RN partenaire le soit. A l’inverse, le second groupe
comprend les RNs non permissifs. Dans ce cas, le ligand de RXR seul ne
peut induire la transcription du gène cible. La liaison du partenaire
d’hétérodimèrisation avec son ligand est nécessaire. Dans ce cas l’activation
de RXR par son ligand ne sert qu’à augmenter par synergie l’action de
l’hétérodimère (Aagaard et al., 2011)(Pawlak et al., 2012)(Rastinejad et al.,
2013).

26
  Les RNs de la classe III, correspondent aux RNs formant des homodimères
sur des demi-sites de type « AGGTCA » orientés dans le même sens et
séparés par un nombre variable de paires de bases (DR(n)) (Aagaard et al.,
2011)(Rastinejad et al., 2013).
 Enfin les RNs de la classe IV, regroupent les RNs se fixant
préférentiellement à l’ADN sur un demi-site « AGGTCA » sous forme de
monomères (Aagaard et al., 2011)(Rastinejad et al., 2013).

La limite de cette classification est que depuis qu’elle a été établie, un certain nombre
d’études ont démontré que le même RN pouvait se lier à l’ADN sur plusieurs types de motifs
ou selon différentes formes de dimèrisation. Ces RNs peuvent donc être rangés dans plusieurs
des classes précédemment définies (Pawlak et al., 2012).

En 1999 (NR Nomenclature Committee, 1999), une nomenclature internationale a été

mise en place afin d’uniformiser le mode de classement ainsi que la dénomination des
différents RNs. Il s’agissait de résoudre également le problème croissant de l’existence de
plusieurs noms pour un même RN. Cette nomenclature se base sur une classification à partir
de critères phylogénétiques qui ont permis de construire l’arbre retraçant l'évolution des deux
domaines les mieux conservés des RNs. Il s’agit des domaines DBDs (DNA Binding Domain)
et LBDs (Ligand Biding Domain) que nous décrirons dans la suite de ce chapitre (Figure 5).

27
 Figure 5 : Arbre phylogénétique de la superfamille des RNs (d’après (Vanden Heuvel, 2009)).

Cette classification divise la superfamille en six groupes de tailles inégales, numérotés

de NR 1 à 6. Ceux-ci sont partagés en sous-groupes identifiés par une lettre puis subdivisés
par un numéro. Une corrélation existe entre la classification basée sur les propriétés de
dimérisation et de fixation à l’ADN et la position de chacun des RNs dans l’arbre
phylogénétique (Tableau 1). Un septième groupe incluant les RNs DAX-1 (Dosage-sensitive
sex reversal Adrenal hypoplasia critical region on chromosome X gene 1 / NR0B1) et SHP
(Small Heterodimer Partner / NR0B2) a été ajouté. Ces derniers ont comme particularité de ne
pas avoir de domaine de fixation à l’ADN mais sont fortement corrélés aux autres RNs de part
la séquence de leurs LBDs (Germain et al., 2006).

28
 Nomenclature Groupe Nom courant Ligand
NR1A1 TR" II I RNs stéroidiens
Hormones thyroïdes
NR1A2 TR$ II II RXR-Hétérodimères
NR1B1 RAR" II III RNs Homodimériques
NR1B2 RAR$ Acides rétinoïques II IV RNs Monomériques
NR1B3 RAR( II
NR1C1 PPAR" II
Acides gras et
NR1C2 PPAR$ /* II
prostaglandines
NR1C3 PPAR( II
NR1D1 REVERB" IV
Hème
NR1D2 Groupe 1 REVERB$ IV
NR1F1 ROR" IV
Cholestérol et dérivés,
NR1F2 ROR$ IV
acides rétinoïques
NR1F3 ROR( IV
NR1H2 LXR$ II
Oxystérols
NR1H3 LXR" II
NR1H4 FXR Acides Biliaires II
NR1I1 VDR Vitamine D II
NR1I2 PXR Xénobiotiques II
NR1I3 CAR Androstane II
NR2A1 HNF4" III
Acides gras
NR2A3 HNF4$ III
NR2B1 RXR" III
Rétinoïdes, acide
NR2B1 RXR$ III
docosahexaénoïque
NR2B3 RXR( III
NR2C1 TR2 Orphelin III
Groupe 2
NR2C2 TR4 Orphelin
NR2E1 TLX Orphelin
NR2E3 PNR Orphelin
NR2F1 Coup-TFI Orphelin III
NR2F2 Coup-TFII Orphelin III
NR2F6 EAR2 Orphelin
NR3A1 ER" I
Œstrogène
NR3A2 ER$ I
NR3B1 ERR" Orphelin IV
NR3B2 ERR$ Orphelin IV
NR3B3 Groupe 3 ERR( Orphelin IV
NR3C1 GR Corticostéroïdes I
NR3C2 MR Aldostérone I
NR3C3 PR Progestérone I
NR3C4 AR Testostérone I
NR4A1 NUR77 Orphelin IV
NR4A2 Groupe 4 NOR1 Orphelin IV
NR4A3 NURR1 Orphelin IV
NR5A1 SF1 Orphelin IV
Groupe 5
NR5A2 LRH1 Orphelin
NR6A1 Groupe 6 GCNF Orphelin III
NR0B1 DAX1 Orphelin
Groupe 7
NR0B2 SHP Orphelin

Tableau 1 : Corrélation entre la classification des RNs basée sur la phylogénétique et celle basée sur les
propriétés de dimérisation et de fixation à l’ADN. Les RNs identifiés chez l’homme sont présentés (d’après
(Holzer et al., 2017)).

c) La structure des RNs:

Comme tous les facteurs de transcription, les RNs possèdent une structure composée
de différents domaines associés à des fonctions autonomes bien définies.
Six domaines répertoriés de A à F à partir de la partie N-terminale de la protéine
peuvent constituer un RN (Figure 6). Les domaines les moins conservés sont les régions A/B
(ou NTD « N-terminal domain »), D ou région charnière (« Hinge region ») et F qui n’est pas
présent au niveau de tous les RNs (Pawlak et al., 2012). Les domaines C (« DNA Binding
Domain » - DBD) et E (« Ligand Binding Domain » - LBD) sont fortement conservés au sein

29
de la superfamille. Ce sont ces deux domaines qui ont servi à l’élaboration de l’arbre
phylogénétique dont est issue la nomenclature internationale décrite précédemment (Pawlak
et al., 2012)(Weikum et al., 2018).

Figure 6 : La structure en domaines des RNs.

Panel A : Schéma représentant la structure primaire d’un RN. Panel B : Schéma représentant la structure tertiaire
d’un RN. AF : Activation function (sous-domaine d’activation), DBD : DNA Binding Domain (domaine de
fixation à l’ADN), LBD : Ligand Binding Domain (domaine de fixation au ligand), LBP : Ligand Binding Pocket
(cavité du ligand). (d’après (Zou et al., 2015) et (Glass, 2006)).

i) Le domaine A/B ou NTD :

Le domaine A/B n’est pas conservé que ce soit en taille ou en séquence entre les
différents RNs mais aussi entre les sous-groupes et les isoformes d’un RN donné. De part sa
diversité, il est fortement impliqué dans les actions spécifiques à chaque RN. Il interagit avec
de nombreuses protéines associées à la machinerie transcriptionnelle, notamment les
différents cofacteurs ou d’autres facteurs de transcription. Cette partie du RN contient le sous-
domaine d’activation indépendant au ligand (AF-1) qui est fortement impliqué dans
l’établissement de ces différentes interactions. De part sa flexibilité, ce domaine intervient
dans les changements de conformation du RN, lui permettant de répondre différemment selon
le contexte cellulaire ou au niveau du promoteur de ses différents gènes cibles (Aagaard et al.,
2011)(Helsen & Claessens, 2014)(Pawlak et al., 2012).

30
 ii) Le domaine C ou DBD (DNA-Binding Domain):

En termes de séquence ce domaine est le plus conservé et a servi initialement à

identifier puis établir la classification phylogénétique de l’ensemble des RNs (à l’exception
des RNs du groupe NR0). Sa fonction principale est de reconnaître et de se fixer aux
différents HREs.
La structure minimale du DBD est composée d’une soixantaine d’aminoacides
contenant les domaines en « doigts de zinc » de type « Cys2/Cys2 », c'est-à-dire que chaque
ion zinc est inclus dans un espace formé par quatre cystéines, arrangement caractéristique de
la superfamille des RNs (Khorasanizadeh & Rastinejad, 2001). D’autres types de FTs
possèdent bien des domaines en « doigts de zinc » mais selon d’autres arrangements, de type
« Cys2/His2 » par exemple (Pan et al., 2010). Tous les DBDs des RNs sont constitués de
deux sous-domaines incluant, une structure en hélice, un doigt de zinc et une « boite »
constituée d’une séquence d’acides aminés interagissant directement avec l’ADN. Ces deux
sous-domaines permettent la reconnaissance de petites séquences d’ADN. Ils sont codés par
deux exons distincts et ont différentes fonctions. Le premier sous-domaine permet la
discrimination entre les motifs de type « AGAACA » et « AGGTCA » du HRE et la fixation
sur ces derniers. Plus précisément, ce sont les résidus formant la boite P (P box – Boite
proximale) qui permettent cette discrimination. Le deuxième sous-domaine a pour rôle de
stabiliser le DBD et d’établir une interaction faible et non spécifique avec l’ADN. Celui-ci,
contient une autre séquence d’aminoacides nommée boite D (D box – Boite distale) qui
constitue une zone propice à l’établissement des interactions entre les partenaires de
dimérisation (Figure 7). Elle est fortement impliquée dans la formation des homodimères et
contribue dans une moindre mesure à la stabilisation des hétérodimères (Aranda & Pascual,
2001)(Pawlak et al., 2012)(Weikum et al., 2018).
Des études sur des formes tronquées de RNs ont montré que la structure en deux sous-
domaines des DBDs ne permettait pas à elle seule d’expliquer la spécificité et la fixation à
l’ADN de forte affinité des formes pleines (Helsen et al., 2012). En fait, de nombreux RNs
possèdent une structure additionnelle, placée à proximité immédiate et du coté C-terminale du
second sous-domaine. Elle est moins structurée et moins conservée que la structure centrale
en doigts de zinc du DBD. Cette structure d’environ 25 aminoacides appelée CTE (C-terminal
extension region) est, en fait, en termes de séquence située au niveau de la région charnière
mais de part sa fonction est associée au DBD. Bien que les séquences des différentes CTEs
identifiées ne soit pas conservées entre les différents RNs, ces structures diverses partagent

31
une fonction commune. Leur rôle est d’étendre les interactions protéines-ADN au-delà des
contacts de bases engagés par le DBD. Pour cela, la structure CTE forme une troisième hélice
qui interagit directement avec la séquence d’ADN qui suit le deuxième demi-site de fixation.
Elle permet donc de stabiliser la fixation du RN à l’ADN (Figure 7) (Aranda & Pascual,
2001)(Claessens & Gewirth, 2004)(Pawlak et al., 2012).

Figure 7 : Le domaine de liaison à l’ADN des récepteurs nucléaires. A : Schéma représentant la structure
générale du DBD et les motifs importants. Celui-ci est constitué de deux sous-domaines (encadré en noir)
directement responsables de la reconnaissance de l’HRE comprenant chacun, une hélice, un doigt de zinc
(encadré en bleu) et une séquence protéique « boite » (encadrée en pointillée) (d’après (Aranda & Pascual,
2001)). CTE : C-terminal extension. B : Schéma représentant la structure secondaire du DBD de GR et les
principaux motifs. Les atomes de zinc sont représentés par des sphères (d’après (Weikum et al., 2018)).

La fonction de la CTE a été plus particulièrement étudiée pour les RNs

s’hétérodimérisant avec RXR (Classe II) et pour ceux se fixant à l’ADN sous forme de
monomère (Classe IV) :

32
  Dans le cas des RNs de la classe II : la région CTE est impliquée dans la
reconnaissance, par l’hétérodimère formé par un RN et RXR, de son HRE de
type DR. En effet, la région CTE du premier RN s’intercale au niveau de la
séquence correspondant à l’intervalle entre les deux demi-sites reconnus par
l’hétérodimère. Selon la taille de cet espace et donc le type de DR(n),
l’hétérodimère pourra ou non se fixer. Une autre fonction de cette CTE, est
de fournir une zone d’interaction supplémentaire du RN associé à RXR avec
le second doigt de zinc de ce dernier. Ce qui permet d’augmenter la stabilité
de l’hétérodimère (Claessens et al., 2004)(Chandra et al., 2008)(Rastinejad et
al., 1995)(Rastinejad et al., 2013).
 En ce qui concerne les RNs de la classe IV : la région CTE permet au RN lié
à l’ADN sous forme de monomère, de reconnaître la séquence
immédiatement située après le demi-site fixé par le DBD. Cette
reconnaissance permet d’augmenter la spécificité vis-à-vis de ces HREs
constitués d’un seul demi-site. De plus, la CTE permet l’établissement
d’interactions additionnelles du RN avec l’ADN, la plupart du temps non
spécifiques, ce qui stabilise la fixation du monomère sur son HRE (Gearhart
et al., 2003)(Helsen et al., 2012)(Little et al., 2006).

iii) Le domaine D ou région charnière :

Tout comme le domaine A/B, cette région est très variable entre les différents RNs que
ce soit en termes de longueur ou de séquence. Elle peut également varier selon les isoformes
d’un même RN. Comme son nom l’indique, une des fonctions de cette région est de servir de
lien flexible qui permet au DBD et au LBD d’un RN d’adopter une orientation relative
facilitant la fixation au HRE ou la dimérisation avec un autre RN. Ainsi, le DBD peut
présenter une rotation par rapport au LBD allant jusqu’à 180 degrés (Rochel et al., 2011).
Cette flexibilité peut également permettre aux sous-domaines AF-1 et AF-2 (Activating
domain 2, sous-domaine d’activation dépendant du ligand) pourtant situés à l’opposé de la
séquence du RN d’interagir et de coopérer de manière synergique (Zwart et al., 2010).
Néanmoins, le rôle de la région charnière ne se limite pas a conférer de la flexibilité au
RN. Elle est impliquée dans l’interaction du RN avec certaines protéines régulatrices
(Aagaard et al., 2011). Cette région contient également des motifs de séquences

33
d’aminoacides impliqués dans la régulation du trafic des protéines entre le cytoplasme et le
noyau (Weikum et al., 2018). C’est donc principalement à son niveau que la distribution
subcellulaire des RNs va être régulée, bien que ce type de séquence a également été identifié
au niveau de la région DBD (Pawlak et al., 2012)

iv) Le domaine E ou LBD (Ligand Binding Domain) :

Le LBD est un domaine de signalisation allostérique complexe qui non seulement se

lie aux ligands, mais interagit aussi directement avec les protéines corégulatrices. Il est
également impliqué dans le processus de dimérisation. Ce domaine n’est que modérément
conservé entre les différents RNs en termes de séquence. Néanmoins sa structure tertiaire
globale est commune à tous les RNs.
Le LBD est constitué de 11 à 13 hélices α et de deux à quatre feuillets β. Ces éléments
se replient et forment une cavité hydrophobique située à la base du récepteur. C’est dans cette
« cavité » nommée « ligand-binding pocket » (LBP) que le ligand du RN se positionne
(Figure 8). Si la structure tertiaire globale des LBDs est conservée entre les différents RNs, ce
n’est pas le cas de celle correspondant à la LBP (Huang et al., 2010). C’est cette variabilité
entre les différents RNs qui permet à cette superfamille d’être régulée par une grande variété
de ligands.
Selon les RNs, les LBPs vont être de tailles et de formes différentes. Les aminoacides
qui la composent vont permettre la mise en place de zones de contact et d’interaction (liaison
hydrogène / force de van der waals) spécifiques à l’association ligand-RN. Ce qui permet à la
cavité de reconnaitre les caractéristiques de surface et de forme de son ligand (Rastinejad et
al., 2013). Une particularité importante de la LBP est sa plasticité, c'est-à-dire sa capacité à
s’adapter à son ligand. Celle-ci est plus ou moins prononcée selon le RN (Jin & Li,
2010)(Togashi et al., 2005)
Une autre structure très conservée du LBD est le sous-domaine AF-2. Ce dernier est
constitué par l’agencement des hélices 3, 4 et 12 qui forme une structure tridimensionelle
hydrophobe « en creux » (hydrophobic groove) (Figure 8). C’est à ce niveau qu’a lieu les
interactions avec les différents cofacteurs intervenant dans la régulation de la transcription.
Pour cela, les coactivateurs contiennent plusieurs motifs riches en leucine nommés
« LXXLL ». Les corépresseurs, de manière similaire, contiennent des motifs de type
« LXXXLXXX[I/L] » nommés boites CoRNR (Corepressor Nuclear Receptor box). C’est la
forme adoptée par le sous-domaine AF-2 qui va favoriser l’interaction avec l’un ou l’autre

34
type de motif. C’est principalement la fixation ou l’absence du ligand au niveau de la LBP qui
au travers du changement de conformation du LBD va modifier, de manière allostérique, la
forme du sous-domaine AF-2. Notamment suite à la modification de l’orientation de l’hélice
12 qui est particulièrement mobile (Figure 8) (Kojetin & Burris, 2013)(Rastinejad et al.,
2013)(Weikum et al., 2018).

Figure 8 : Le domaine de fixation du ligand des récepteurs nucléaires. Schéma représentant la structure
tertiaire du LBD commune aux différents RNs. La cavité du ligand est indiquée par le cercle rouge. Le sous-
domaine AF-2 formé par les hélices 3,4 et 12, zone d’interaction avec les cofacteurs, est indiqué par les traits
noirs et l’hélice 12 est encadrée en bleu. H : hélice α, β : feuillet β , AF-2 : Activating domain 2 / sous-domaine
d’activation dépendant du ligand, LBP : Ligand binding pocket / cavité du ligand (d’après (Weikum et al.,
2018)).

v) Le domaine F :

Ce domaine n’existe pas chez tous les RNs. Il est défini comme étant composé des
acides aminés suivant l’hélice 12. En termes de séquence ce domaine est extrêmement
variable. Sa longueur varie de 8 à 95 acides aminés selon les RNs pour lesquels il a été
identifié. Sa fonction principale est d’interagir avec des coactivateurs. Différentes expériences
de délétions totales ou de mutations partielles ont montré que ce domaine pouvait également

35
être impliqué, selon les RNs, dans la trans-activation (Kim et al., 2003)(Sladek et al., 1999),
la dimérisation (Schwartz et al., 2002)(Skafar & Koide, 2006) ou l’interaction avec les
cofacteurs (Ruse et al., 2002)(Wärnmark et al., 2001). Néanmoins, ce domaine ne semble pas
nécessaire à la fixation du ligand et à l’activation du RN (Patel & Skafar, 2015)(Pawlak et al.,
2012).

vi) Coopération interdomaine :

Comme décrit précédemment les premières études cristallographiques portant sur le

LBD ont mis en évidence la capacité de ce domaine à changer sa conformation suite à la
fixation du ligand. Plusieurs études ont montré que les différents domaines d’un RN étaient
capables d’agir sur les autres par ce mécanisme de transmission allostérique du signal
(Deegan et al., 2011)(Meijsing et al., 2009)(Putcha & Fernandez, 2009). Par exemple, il a été
démontré que le type d’élément de réponse sur lequel se fixait le RN pouvait modifier son
activité transcriptionnelle et réciproquement que la fixation du ligand était capable de
modifier la capacité du RN à se fixer à l’ADN (Thomas-Chollier et al., 2013)(Zhang et al.,
2011). Les différents domaines d’un RN sont donc capables d’interagir entre eux, c’est ce qui
a été appelé « coopération interdomaine ».
C’est pourquoi, depuis 2008 des études plus globales se portant sur les structures
quaternaires, c'est-à-dire le RN entier, associé à l’ADN, aux peptides correspondant à la zone
d’interface des corégulateurs et le cas échéant à son partenaire de dimérisation, ont été
réalisées. Dans l’ensemble, elles confirment les résultats obtenus à partir des architectures de
DBD ou LBD seules. Elles ont aussi révélé que les niveaux d’interconnexion, des différents
domaines entre eux, mais également avec ceux du partenaire de dimérisation, étaient bien plus
complexes que ce qui était jusqu’ici envisagé. Notamment, de nouvelles zones d’interaction
entre le DBD et le LBD ont été identifiées. De plus, les deux partenaires de dimérisation
forment un ensemble avec des zones de contact bien plus nombreuses que ce qui était
supposé. (Billas & Moras, 2013)(de Vera et al., 2017).
Ainsi, il a été défini que la structure quaternaire d’un dimère de RNs peut être
caractérisée selon les cinq critères suivants (Rastinejad et al., 2015) :
- Au moins une des interactions LBD-DBD est dépendante du type d’HRE.
- L’interaction entre les deux DBDs des RNs partenaires est toujours dépendante et
très sensible à l’espace entre les deux demi-sites du HRE.

36
 - L’interface entre les LBDs des deux partenaires s’effectue via une interaction
impliquant les hélices 10 et 11 des deux RNs.
- Les interactions entre les DBDs et les LBDs sont déterminées par celles mises en
place avec les différents cofacteurs associés aux deux RNs du dimère.
- Malgré les séquences très conservées des DBDs et la structure similaire des LBDs, la
structure quaternaire formée par deux RNs et un HRE est unique. Ainsi, le même complexe
sur un HRE distinct présentera une structure quaternaire différente.
Ces différentes analyses ont montré que les domaines des RNs ne peuvent pas être
perçus uniquement comme des unités fonctionnelles indépendantes. Des signaux variés
peuvent ainsi être transmis au travers de toute l’architecture du complexe. Ces observations
ouvrent un champ nouveau d’investigations. Toutes modifications de la structure quaternaire
du complexe associé au RN, suite à la fixation de différents ligands, de corégulateurs ou de
composés entrainant une MPT du RN peuvent potentiellement affecter l’activité du récepteur
et ainsi réguler spécifiquement les expressions des différents gènes cibles de celui-ci (Helsen
& Claessens, 2014)(Huang et al., 2010)(Rastinejad et al., 2015).

d) Les ligands des RNs:

Les ligands naturels des RNs sont des molécules de structures très variées. De
nombreux ligands synthétiques ont été développés afin de cibler pharmacologiquement
l’action des RNs (Burris et al., 2013)(Xu, 2015). Comme toutes drogues (naturelles ou non),
les ligands peuvent être classés suivant quatre catégories selon leurs effets sur l’activité du
récepteur ciblé (Lambert, 2004). On distingue donc:

- Les agonistes : ces composés en se fixant sur leurs récepteurs vont induire une
réponse fonctionnelle maximale. L’agoniste dépend du système dans lequel il est
ainsi caractérisé par rapport aux autres composés. Dans le cadre des RNs,
l’agoniste correspond au ligand qui en se fixant à la LBP et en induisant un
changement de conformation va mener à son activation.

- Les antagonistes : il s’agit de molécules qui vont bloquer l’action de l’agoniste. Ils
peuvent être classés selon deux sous-types :
o Les antagonistes compétitifs : ces molécules vont se fixer au récepteur sur
le même site que l’agoniste. Ils entrent donc en compétition avec celui-ci,

37
 diminuant ainsi son action. Leurs actions sont réversibles car il est possible
d’annuler leurs effets en augmentant la dose d’agoniste, ce qui entraine le
déplacement de la molécule d’antagoniste fixée au récepteur.
o Les antagonistes non compétitifs : dans ce cas, ces molécules vont se fixer
sur le récepteur sur un site différent de l’agoniste. Elles agissent en
entrainant un changement de conformation du récepteur réduisant son
affinité pour l’agoniste. L’effet n’est plus réversible car l’ajout d’agoniste
ne modifiera pas la fixation de l’antagoniste sur le récepteur, les deux
molécules n’étant pas en compétition pour le même site. Le GW9662
réprime l’activité des PPARs suivant ce type de mécanisme (Leesnitzer et
al., 2002).
Ce type de composés est intéressant au niveau pharmacologique car il permet
de bloquer l’action du RN ciblé (Hashimoto & Miyachi, 2005).

- Les agonistes inverses : dans ce cas, le récepteur présente une activité constitutive
en absence d’un apport exogène d’agoniste. L’agoniste inverse inhibe cette activité
en se fixant sur le récepteur. Ce type de molécule se distingue de l’antagoniste par
le fait qu’il possède une activité propre sur son récepteur sans qu’il soit nécessaire
que ce dernier soit activé, au préalable par l’expérimentateur, par un agoniste
exogène. Dans le cadre des RNs, les agonistes inverses ont essentiellement été
développés afin de réprimer l’activité de RNs constitutivement actifs. Tels que les
RNs ERRs (Estrogen Related Receptor) (Kim et al., 2013)(Singh et al., 2015) ou
CAR (Constitutive Androstane Receptor) (Kanno et al., 2013).

- Les agonistes / antagonistes partiels : ces molécules correspondent à celles ne

produisant pas un effet maximal dans le système de référence. Au niveau des RNs,
cette notion recoupe celle des modulateurs sélectifs : en effet, le développement
d’agonistes synthétiques a mis en évidence que d’une part, le traitement par deux
molécules différentes ciblant le même RN, de tissus ou de types cellulaires
identiques ou d’autre part, celui par un même ligand dans des tissus ou des type
cellulaires différents, entrainait des réponses induites qui n’étaient pas strictement
les mêmes (Burris et al., 2013). Ces molécules ont donc des actions partielles. Les
mécanismes permettant d’expliquer ces réponses gènes et tissus spécifiques n’ont
toujours pas été complètement identifiés.

38
De manière général, un ligand est caractérisé par deux facteurs (Lambert, 2004):
- Sa « puissance » : celle-ci est déterminée à l’aide d’une expérience de dose
réponse et est représentée par son EC-50. Cette valeur correspond à la
concentration de ligand qui permet d’induire 50% de la réponse maximale. Ce
facteur reflète l’efficacité de la molécule sur son récepteur.
- Son « affinité » : ce facteur est déterminé en analysant l’équilibre de dissociation et
est représenté par son K-D. Cette valeur correspond à la concentration permettant
au ligand de se fixer à 50% de ses récepteurs.

i) Classification des RNs selon leurs types de ligand :

Au regard des rôles biologiques majeurs impliquant les RNs, de nombreuses études se
sont efforcées de découvrir les ligands naturels ou synthétiques pouvant moduler l’action des
RNs orphelins. De même, de nombreux efforts ont porté sur la création de ligands
synthétiques afin d’obtenir des composés meilleurs, en efficacité et/ou en spécificité, que les
ligands naturels déjà identifiés.
Dans ce contexte, les découvertes successives de nouvelles molécules et les études des
interactions s’établissant entre un RN et son ligand, ont mis en évidence que les RNs étaient
capables d’être activés par différents types de composés. Il est apparu que la vision
« historique » du RN associé à un ligand précis possédant une forte efficacité et une grande
spécificité est l’exception et non la règle au sein de la superfamille. En effet, les efficacités
des ligands pour leurs RNs peuvent être plus ou moins prononcées, de même que les
spécificités des ligands varient selon les RNs. Ces derniers peuvent par exemple être activés
par plusieurs molécules proches, souvent issues de la même voie métabolique ou encore être
capables de fixer plusieurs types de ligands, on parle alors de ligands alternatifs. Différentes
études ont montré que les caractéristiques du ligand associé à un RN pouvaient être corrélées
à celles de sa LBP, notamment sa taille et sa plasticité (Benoit et al., 2004)(Gallastegui et al.,
2015).
Une classification des RNs selon ces caractéristiques a ainsi été proposée. De manière
intéressante, celle-ci reflète leurs actions physiologiques (Benoit et al., 2004)(Holzer et al.,
2017)(Figure 9) :

39
 o Les RNs « hormonaux » :

Ces RNs sont activés par des molécules possédant une fonction dédiée à la
signalisation cellulaire. Il s’agit de médiateurs libérés par les tissus endocriniens permettant la
transmission d’un signal sur une longue distance via la circulation. Ce type de RNs
correspond aux RNs activés par les hormones stéroïdiennes (ER, PR, AR, GR et MR) mais
aussi aux RNs TR α et β activés par les hormones thyroïdiennes. Ces RNs sont également
associés à des molécules ayant un effet paracrine, c'est-à-dire qu’elles transmettent un signal
sur une distance courte à partir des cellules qui les produisent. Par exemple, les acides
rétinoïques qui activent les RNs RAR (Retinoic Acid Receptor). Ces molécules de
signalisation endocrines ou paracrines se fixent à leurs RNs avec une forte affinité (à des
concentrations de l’ordre du nanomolaire) avec une forte spécificité, puisque seulement un ou
très peu de ligands peuvent se fixer à ce type de RN. Ces RNs possèdent une LBP de taille
réduite (400 à 600 angströms3) et le ligand occupe plus de 60% de son volume total.
L’ajustement entre la cavité du ligand et celui-ci est donc très précis et est très peu modifiable,
ce qui explique la grande affinité et le haut degré de spécificité de la relation RN-ligand
(Benoit et al., 2004)(Bledsoe et al., 2002)(Brzozowski et al., 1997)(Holzer et al.,
2017)(Renaud et al., 1995).

o Les RNs « senseurs métaboliques » :

Les ligands régulant ce type de RN, ne sont pas des molécules uniquement produites
pour transmettre et moduler un signal. Ce sont des molécules synthétisées par différentes
voies métaboliques et dérivées des nutriments, tels que des acides gras (PPAR / Peroxisome
Proliferator-Activated Receptor) ou le cholestérol (LXR / Liver X Receptor, FXR / Farnesoid
X Receptor et PXR / Pregnane X Receptor). Ces RNs sont capables d’être activés par
différentes molécules issues de la même voie et vont donc être sensibles aux modulations de
celle-ci. Ces RNs ont une LBP plus volumineuse (de 1000 à 1600 angströms3). L’ajustement
avec le ligand est moins précis, celui-ci n’occupe que 20% du volume de ces LBPs. Celles-ci
ont une plus grande plasticité ce qui permet à différentes molécules de s’y positionner. Ces
RNs se lient donc à leurs ligands avec une affinité (à des concentrations de l’ordre du
micromolaire) et une spécificité moindre, que les RNs « hormonaux ».

40
 C’est ce qui leurs permet de fixer un plus grand nombres de molécules (Benoit et al.,
2004)(Downes et al., 2003)(Holzer et al., 2017)(Nolte et al., 1998)(Svensson et al.,
2003)(Watkins et al., 2001). Par exemple, c’est le cas de FXR qui est activé par plusieurs
formes d’acides biliaires (de Aguiar Vallim et al., 2013).

o Les RNs « structuraux » :

Les ligands associés à cette catégorie ont été découverts suite à l’étude de la structure
de RNs classés jusqu’alors comme orphelins. Notamment, HNF4 (Hepatocyte Nuclear Factor
4) (Dhe-Paganon et al., 2002)(Wisely et al., 2002) et ROR (RAR-related Orphan Receptor)
(Kallen et al., 2002). De manière étonnante il s’est avéré, qu’après cristallisation de ces RNs,
leurs LBPs n’étaient pas vides mais contenaient des molécules fixées très fortement. En effet,
ces dernières sont capables de rester liées malgré le processus de cristallisation et il est
nécessaire de dénaturer quasiment totalement la structure protéique des RNs pour les libérer.
Ceci suggère que ce type de ligand pourrait être lié de manière irréversible au RN et ne serait
pas échangeable. Le ligand aurait donc dans ce cas un rôle structurel puisqu’il est nécessaire à
l’établissement et au maintien de la bonne conformation du RN (Benoit et al., 2004) (Holzer
et al., 2017).
Ce type de ligand regroupe des composés assez divers, comme l’acide linoléique (un
acide gras) dans le cas de HNF4 (Yuan et al., 2009), un sulfate de cholestérol pour RORα
(Kallen et al., 2002), ou la molécule d’hème pour Rev-Erb (Raghuram et al., 2007).
Néanmoins, il n’est toujours pas démontré que le ligand en question soit effectivement présent
lorsque le RN est dans son environnement natif (au sein de la cellule). La possibilité que
celui-ci, soit remplacé au niveau de la LBP, par une molécule présentant une plus forte
affinité n’est pas non plus à exclure. Ce qui pourrait avoir pour effet d’augmenter ou de
diminuer l’activité du RN (Holzer et al., 2017). De plus, dans le cas de l’hème, la
modification directe du ligand lui-même, son niveau d’oxydoréduction influencé par le type
de gaz avec lequel il interagit, pourrait modifier la conformation du LBD de Rev-Erb et ainsi
moduler son activité (Thummel, 2005).

o Les RNs « atypiques » :

Les RNs concernés correspondent à ceux ne pouvant pas être classés selon les critères
précédents. Il s’agit des RNs appartenant aux groupes 4 et 5 (NR4 et NR5).

41
 L’étude de la structure des RNs de la sous-famille 4 a révélé que le site de la LBP était
constitué d’une structure d’aminoacides hydrophobes, ce qui semble interdire toutes
interactions avec un ligand. De plus, leurs zones d’interactions AF-2 apparaissent comme
bloquées dans une conformation active, ce qui confirmerait leurs profils de RNs
constitutivement actifs. Cette sous-famille de RNs a donc longtemps été considérée comme le
modèle de RNs « vraiment » orphelins (Gallastegui et al., 2015)(Wang et al., 2003).
Néanmoins, des acides gras insaturés seraient capables de réprimer leurs activités (Benoit et
al., 2004). Ceux-ci se fixeraient au niveau de la région classiquement associée à la LBP et ce
de manière réversible. A l’heure actuelle, le mécanisme d’action n’a pu être identifié. Deux
hypothèses peuvent expliquer la répression de l’activité de ces RNs : soit les acides gras
entrent en compétition avec un ligand endogène structurel du RN, ce qui veut dire que la
structure hydrophobe bloquant apparemment la LBP pourrait être déplacée, soit la fixation des
acides gras permet le recrutement de cofacteurs inhibant l’activité du RN (de Vera et al.,
2016). Enfin, certaines molécules ont été identifiées comme pouvant induire l’activité des
NR4As. Mais dans ce cas, en se fixant sur un site alternatif à la LBP au niveau du LBD
(Hammond et al., 2015)(Hammond et al., 2018).
A l’inverse, les premières études de la structure des RNs de la sous-famille 5 (LRH-1 /
Liver Receptor Homolog 1 et SF-1 / Steroidogenic Factor 1) ont laissé penser que ceux-ci,
malgré le fait ils possédent une LBP assez large (500 à 1200 angströms3), présentaient une
configuration constitutivement active en absence d’un ligand ou de peptides corégulateurs
(Gallastegui et al., 2015)(Sablin et al., 2003)(Sablin et al., 2009). Néanmoins, la poursuite de
l’étude des structures des ces RNs, chez l’homme et la souris, a finalement permis d’identifier
la capacité des NR5As a fixer des molécules de type phosphoinositides (ou dérivés
phosphorylés des phosphatidylinositols, PIPn). Ces dernières, classiquement connues comme
messagers secondaires cytoplasmiques sont également présentes dans le noyau cellulaire. Les
ligands phosphoinositides divergent chimiquement des ligands des autres RNs. En effet, ils
sont formés d’une fraction longue et étendue hydrophobe et d’un groupement hydrophile
proéminent. Ce dernier ne peut absolument pas s’associer au cœur hydrophobique de la LBP.
Les molécules de type PIPn forment donc une classe atypique de ligand. Il a été montré que la
partie hydrophobe des PIPn se fixait au niveau de la LBP des RNs NR5As tandis que la partie
hydrophile restait hors de la LBP et formait à la surface du RN une zone potentielle
d’interaction avec des cofacteurs (Blind et al., 2014)(Ingraham & Redinbo, 2005)(Sablin et
al., 2015).

42
 Figure 9 : Classes fonctionnelles des RNs selon les caractéristiques de leurs ligands.
LBP : Ligand binding pocket, (d’après (Holzer et al., 2017)).

En conclusion, si la structure globale des RNs est bien conservée, cette superfamille
peut être régulée par des ligands très différents. Ce qui explique leurs implications dans de
nombreux aspects de la physiologie humaine mais reflète également la complexité des
mécanismes au travers desquels ces FTs particuliers agissent sur l’organisme.

e) Mécanismes de régulation de l’activité transcriptionnelle par les RNs :

Au-delà de la spécificité offerte par sa fixation sur un HRE et le cas échéant par
l’action dépendante du ligand, l’activité d’un RN donné doit être régulée plus finement afin de
répondre au mieux aux besoins de l’organisme.
Comme pour tous facteurs de transcription, l’action des RNs est le plus souvent
génomique, c'est-à-dire qu’elle permet de modifier l’expression de différents gènes. Mais elle
peut également être non génomique, en activant une voie de signalisation par exemple.
L’activité du RN est aussi le plus souvent dépendante de l’action de son ligand, mais peut
dans certain cas être indépendante de celui-ci. Dans ce cas, l’activité du RN peut être
influencée par celles des autres FTs avec lesquels il interagit au niveau des TRMs.

43
 i) Action génomique des RNs:

L’action génomique d’un RN est classiquement décrite comme la régulation des

expressions d’un ensemble de gènes cibles, associée à la fixation du RN au niveau de ses
HREs et à son activation par un ligand spécifique. Pour cela, suite à leurs activations, les RNs
stéroïdiens (de la classe I), qui sont sous leurs formes inactives cytoplasmiques, vont entrer
dans le noyau cellulaire. La plupart des autres RNs sont constitutivement localisés au niveau
nucléaire et fixés sur leurs HREs (Weikum et al., 2018).
Les progrès technologiques décrits précédemment ont permis de déterminer pour un
certain nombre d’entre eux leurs sites de fixation au niveau du génome. Leur répartition
globale est semblable à celle observée pour les autres FTs. Les RNs sont donc fixés à la fois à
proximité des TSS (promoteurs) mais également au niveau des enhancers. Ce qui implique la
capacité des RNs a réguler leurs différents gènes cibles également au travers de boucles
chromatiniennes (Cotnoir-White et al., 2011)(Gadaleta & Magnani, 2014)(Kininis & Kraus,
2008).
Comme attendu l’activation des RNs de type 1 est associée à l’apparition de sites de
fixation au niveau génomique (Chong et al., 2010)(Sacta et al., 2016). Néanmoins, il apparait
que la grande majorité de ces sites correspondent à des régions de l’ADN déjà décondensées.
Ces zones pré-initiées permettraient une réponse du RN spécifique au tissu (John et al.,
2011)(Stavreva et al., 2015).
Pour les autres types de RNs, l’activation par le ligand ne modifie pas la répartition
des sites de fixation, ni n’en ajoute de nouveaux. Par contre, elle peut entrainer une
augmentation de la hauteur des pics mesurés au niveau des sites associés aux gènes activés.
Ce qui reflète soit une stabilisation soit une augmentation du recrutement du RN sur ces
derniers. Cette distribution figée peut être le reflet de zones préexistantes d’ADNs
décondensées. Dans ce cas, le RN se serait positionné au préalable, par exemple au cours de la
différenciation cellulaire, et serait prêt à répondre aux stimuli associés à sa fonction au sein de
l’organe. C’est ce qui a par exemple été montré pour PPAR au cours de l’adipogénèse
(Nielsen et al., 2008). Néanmoins, cela peut également être le reflet de l’action du RN non
induit ou celui de son activation basale par son ligand endogène (Thomas et al., 2010).
Les RNs sont donc dans la majorité des cas des FTs colons ou migrants associés à des
enhancers « en attente » ou « en équilibre ». Ils nécessitent donc une ouverture de leurs zones
de fixation par des FTs pionniers. Ce qui peut expliquer leurs répartitions spécifiques aux
tissus à l’échelle génomique (Gadaleta & Magnani, 2014)(Thomas et al., 2010)(Zhan et al.,

44
2014). L’action des RNs au niveau des enhancers est à ce jour peu détaillée. CTCF a été décrit
comme nécessaire à l’activation de PPARγ (Dubois-Chevalier et al., 2014). ER a été associé à
la présence de la cohésine et de CTCF au niveau d’enhancers (Li et al., 2013)(McEwan et al.,
2012)(Ross-Innes et al., 2011) et FXR a été décrit comme agissant via des boucles
chromatiniennes au niveau du promoteur des gènes Shp et Gr (Li et al., 2010)(Renga et al.,
2013). Enfin, les RNs ER (Hah et al., 2013), PPAR (Step et al., 2014) et Rev-Erbs (Lam et
al., 2013) ont été décrits comme régulant la transcription de eRNAs au niveau des enhancers.
Au final, suite à leurs activations au niveau de leurs sites de fixation « pré-initiés », les
RNs vont à leurs tours agir localement sur la chromatine qui les entoure par le biais du
recrutement de diverses protéines corégulatrices. Au niveau du promoteur, cette action va
également permettre aux RNs de réguler la transcription des ARNs messagers en agissant
indirectement sur la machinerie trancriptionnelle.

(1) Les complexes corégulateurs :

(1-a) Action des coactivateurs et des corépresseurs :

La question de déterminer comment les RNs recrutent le complexe général de la

transcription s’est très vite posée. Le fait que les RNs n’interagissent pas directement avec la
machinerie transcriptionnelle a rapidement été démontré. La nécessité de protéines permettant
de lier le RN à celle-ci a mis en lumière l’action majeure des protéines corégulatrices dans le
contrôle de la transcription par les RNs (Millard et al., 2013). Néanmoins, la majorité des
complexes régulateurs formés par ces protéines, ne se contente pas de jouer simplement ce
rôle de liaison ou d’assemblage. Ceux-ci sont également nécessaires à la modification de
l’environnement chromatinien régulant ainsi l’accès de la machinerie transcriptionnelle à
l’ADN et sont impliqués dans la régulation fine du niveau de la transcription (Rosenfeld et al.,
2006). Selon la définition la plus large est corégulateur toute protéine qui participe à
l’établissement d’un complexe recruté au niveau du génome par un FT. A ce jour plus de 350
corégulateurs ont été identifiés (http://www.NURSA.org). Chacun d’entre eux peut être
recruté par différents FTs et chaque FT peut recruter différents complexes corégulateurs. Ces
complexes ne sont donc pas exclusifs aux RNs mais interagissent avec l’ensemble des FTs
(Lonard & O'Malley, 2012).
Le complexe corégulateur peut soit permettre une activation de la transcription, il est
alors nommé coactivateur, soit réprimer celle-ci, il est alors appelé corépresseur. L’action

45
d’une protéine corégulatrice peut être dépendante du contexte et il n’est pas donc pas toujours
possible de lui attribuer une activité précise (Millard et al., 2013).
L’activation et la répression des expressions des gènes sont principalement régulées
par des modifications de la structure de la chromatine. Pour cela, les corégulateurs possédent
des domaines enzymatiques, ce qui leurs permet d’influencer le statut épigénétique des
régions régulatrices. Ils modulent ainsi leurs accessibilités et donc leurs activités par MPTs.
Dans tous les cas, les enzymes responsables de ces modifications peuvent être recrutées au
niveau de la chromatine, soit directement par le FT soit indirectement par d’autres
corégulateurs (Green & Han, 2011).
L’activité enzymatique des complexes coactivateurs est principalement dédiée à
l’acétylation des histones via leurs actions histone-acétyltransférases (HATs). Des résidus
spécifiques de type lysine sont ciblés créant une charge neutre diminuant l’interaction entre
les histones et la chromatine. Ceci décondense la chromatine et permet la fixation des
différents facteurs nécessaires à la transcription. De manière générale, les histones proches
des promoteurs ou des « enhancers » correspondants aux régions transcrites sont hyper
acétylés. Les complexes coactivateurs ont également une activité méthyltransférase (Bannister
& Kouzarides, 2011) (Figure 10).
De même, les complexes corépresseurs agissent grâce à leurs activités enzymatiques
qui incluent la déacetylation des histones, de part leurs activités histone-déacétylases
(HDACs), et des processus spécifiques de méthylations sur des sites différents de ceux
modifiés par les complexes coactivateurs. Ces MPTs vont aboutir à une structure plus
compacte de la chromatine, créant ainsi un environnement qui ne permet pas la transcription
de gènes (Bannister & Kouzarides, 2011) (Figure 10).
Les coactivateurs agissent également au travers d’un système de remodelage de la
chromatine vraisemblablement en modifiant l’interface histone-ADN. Cette activité permet de
déplacer voir d’éjecter des histones. Ce changement dynamique de la structure de la
chromatine permet de libérer de l’espace permettant la fixation d’autres FTs ou l’assemblage
du complexe de pré-initiation de la machinerie transcriptionnelle (Clapier et al., 2017).

46
 Figure 10: Coactivateurs et corépresseurs des RNs et leurs fonctions.
(D’après http://www.saitama-med.ac.jp/genome/eng/Div01_GSF/doc/fig01.html#).

La majorité des enzymes associées aux protéines corégulatrices ne présentent pas de

spécificité pour un substrat particulier. Celle-ci ne provient pas de la sous-unité enzymatique
mais des autres domaines présents sur la proteine corégulatrice ou de ceux présents sur les
autres proteines constituant le complexe régulateur. En effet, les protéines corégulatrices
peuvent s’associer dans de nombreux complexes, ce qui contribue à un niveau de régulation
sophistiqué permettant une modulation des expressions géniques, fine, spécifique au tissu et
temporel. La mise en place de ces différents complexes est également dépendante des niveaux
d’expressions et de la compétition entre leurs différents constituants, ainsi que des différentes
MPTs pouvant les cibler (Green & Han, 2011)(Millard et al., 2013).

(1-b) Recrutement des complexes corégulateurs par les RNs:

L’une des caractéristiques des RNs par rapport aux autres FTs est leurs capacités à
recruter différents complexes régulateurs suite à leurs activations par leurs ligands. Dans la
plupart des cas, le changement de conformation induit par le ligand entraine une libération du

47
complexe répresseur et un recrutement du complexe activateur. Le recrutement par le RN de
ces complexes régulateurs est continuellement renouvelé au niveau des zones actives. En fait,
des échanges continus entre les complexes activateurs et répresseurs ont lieu (Perissi &
Rosenfeld, 2005). Ce cycle de recrutement des complexes répresseurs et activateurs peut être
suivi au travers de l’apparition de profils d’hyper-acétylation, liés à l’action HAT des
complexes activateurs, par rapport aux zones non actives peu ou pas acétylées, pour lesquels
l’action HDAC des complexes répresseurs est prépondérante (Wang et al., 2009). Ce cycle est
essentiel à l’activation de la transcription, la présence au préalable voir le recrutement de
complexes répresseurs étant nécessaire à son apparition. Ce système permettrait à la cellule de
valider à chacun des cycles, la nécessité ou non de maintenir l’activation de la transcription en
vérifiant avant chaque cycle l’évolution des différents signaux métaboliques (Carlberg &
Seuter, 2010)(Perissi et al., 2010).
Enfin, il a également été mis en évidence que le recrutement des différents
corégulateurs est en fait ordonné et apparait de manière séquentielle. La fonction du
corégulateur et notamment son activité enzymatique définit sa place dans la séquence. Deux
protéines différentes mais présentant la même fonction pouvant se subtiliser l’une à l’autre
(Perissi & Rosenfeld, 2005)(Shang et al., 2000).

(2) Interactions des RNs avec les autres facteurs de transcription :

Comme les autres FTs, l’action des RNs est intégrée au niveau des TRMs. Ils vont
donc participer à la régulation fine des CRMs correspondant et pour cela ils sont capables de
mettre en place différents types d’interactions avec les autres FTs.

(2-a) Ouverture de la chromatine par un facteur pionnier :

Comme décrit précédemment, le facteur pionnier de part son action va permettre la

décondensation de la chromatine. Il va ensuite participer au maintien de la chromatine dans
une forme ouverte. Ceci permet au RN d’avoir accès à son HRE. Celui-ci peut alors se fixer à
l’ADN, ce qui favorise ainsi la régulation du gène correspondant (Figure 11).

48
Figure 11 : Libération de l’accès du RN à son HRE suite à l’ouverture de la chromatine par un FT
pionnier. TF : Facteur de transcription, NR : Récepteur nucléaire, RE : Elément de réponse (d’après (Aagaard
et al., 2011)).

(2-b) Coopération augmentant la trans-activation du gène cible des deux

partenaires :

Deux mécanismes sont possibles :

Le RN et le FT sont fixés sur leurs éléments de réponse respectifs. Soit ces deux sites
sont proches soit le repliement de l’ADN permet de créer une boucle permettant l’interaction
entre le RN et le FT. Cette situation permet au RN et au FT de créer une surface d’interaction
plus grande avec le complexe coactivateur. Ce qui entraine un recrutement plus efficace de ce
dernier (Figure 12 panel A).
Le RN et le FT se fixent soit sur un élément de réponse identique soit sur deux
éléments de réponse se chevauchant. Ils vont alors se relayer au niveau du site d’initiation de
la transcription, chacun recrutant son propre complexe coactivateur. (Figure 12 panel B).

49
Figure 12 : Mécanisme permettant à un RN et un FT de coopérer dans la trans-activation d’un gène cible
commun. (A) Coopération entre un RN et un FT dans le recrutement du complexe activateur. (B) Coopération
entre un RN et un FT sur un élément de réponse identique ou deux éléments de réponse se chevauchant.
Coactivator complex : complexe coactivateur, TF : facteur de transcription, NR : récepteur nucléaire, RE :
élément de réponse. (d’après (Aagaard et al., 2011)).

(2-c) Répression de l’action d’un des deux partenaires :

L’interaction entre un RN et un FT peut entrainer la répression de l’action de l’un par

l’autre. Dans tous les cas, cela nécessite l’activation au préalable du RN par son ligand. Ce
type d’action appelé trans-répression peut résulter de différents mécanismes (Figure 13):

 « Quenching » :

Le RN et le FT entrent en compétition au niveau de la fixation du même ou de deux

éléments de réponse proches. Ce qui bloque l’activation des gènes cibles de l’un des deux
partenaires en l’empêchant d’interagir avec la machinerie transcriptionnelle.

50
  « Tethering » :

Ce mécanisme correspond à une interaction directe entre les deux partenaires. L’un se
fixant sur l’autre, tout en recrutant un complexe répresseur au niveau du site de fixation du
partenaire lié à l’ADN.
 « Squelching » :

Dans ce cas, le RN et le FT entrent en compétition pour la fixation du même complexe

coactivateur. Celle des deux protéines qui est fixée à son élément de réponse ne peut plus
activer pleinement la transcription de son gène cible.

Figure 13 : Les différents mécanismes de trans-repression.

A : facteur de transcription, R : récepteur nucléaire, CoA : coactivateur,
(d’après, (Vlaeminck-Guillem et al., 2003)).

Ces différents mécanismes soulignent l’importance des interactions entre les RNs et
les autres facteurs de transcription.
Ainsi les facteurs pionniers permettent la mise en place de CRMs spécifiques aux
tissus. En effet, leurs expressions différentielles, au cours du développement d’un type
cellulaire à l’autre, va ouvrir la chromatine dans des zones particulières du génome. Ceci va

51
libérer l’accès à un sous-ensemble d’HREs qui seront par la suite fixés par leurs RNs
respectifs. La mise en place au niveau du génome de ces CRMs spécifiques aux tissus permet
par la suite la régulation par un RN donné d’un sous-ensemble de ses gènes cibles suite à son
activation par son ligand. Mais aussi indépendamment de ce dernier, suite à l’action des
différentes voies de signalisation ciblant ses FTs partenaires au sein de ces CRMs (Aagaard et
al., 2011)(Gerstein et al., 2012)(Goldstein et al., 2017)(Santos et al., 2011).

(3) Les modifications post-traductionnelles :

La modulation fine de l’action des RNs, selon le contexte physiologique ou au cours

du développement, peut également résulter de l’activation de voies de signalisation. Celles-ci
font intervenir différents messagers secondaires intracellulaires et impliquent l’action
d’enzymes permettant de modifier post-traductionnellement différentes protéines. Ces
enzymes peuvent moduler l’action des RNs en agissant sur les différents cofacteurs ou les
facteurs de transcription qui leurs sont associés, mais également en ciblant directement ceux-
ci. Elles peuvent agir de manière simultanée permettant à la cellule d’intégrer l’ensemble des
signaux associés. Ces MPTs regroupent les processus d’ubiquitination, de SUMOylation,
d’O-GlcNAcylation, d’acétylation, de méthylation, et de phosphorylation. Tous les aspects
permettant aux RNs de réguler la transcription de leurs gènes cibles peuvent être affectés par
MPTs. En effet, celles-ci peuvent entrainer des modifications de l’efficacité de la liaison à
l’ADN, de l’affinité du RN pour son ligand, de la capacité a former des hétérodimères ou des
interactions avec les différents cofacteurs. Elles peuvent également jouer sur la stabilité de la
protéine ou sur sa localisation intracellulaire. La position du résidu ciblé par la MPT sur le RN
et notamment le domaine auquel il appartient, ne permet pas de déterminer par quel
mécanisme la MPT va modifier l’action du RN. Comme décrit précédemment, une telle
modification peut avoir un impact sur l’ensemble du RN suite à la transmission allostérique
du signal d’un domaine à l’autre (Anbalagan et al., 2012)(Berrabah et al., 2011)
Parmi les différentes MPTs pouvant moduler l’activité des RNs, leurs
phosphorylations par les kinases semblent jouer un rôle majeur. En effet, la phosphorylation,
c'est-à-dire l’ajout d’un groupement phosphate sur un résidu de type sérine, thréonine ou
tyrosine de la protéine cible, est la MPT la plus souvent mise en jeu suite à l’activation de
récepteurs extracellulaires par des hormones ou des facteurs de croissance. Elle entraine une
réponse rapide et réversible permettant notamment à la cellule de s’adapter aux différentes
variations métaboliques. Il existe 27 familles de kinases, ce qui en fait une des plus larges et

52
importantes superfamille de protéines. Environ 2000 kinases sont à ce jour identifiées. Un
grand nombre de ces dernières sont impliquées dans la réponse aux variations métaboliques.
Comme les autres MPTs, la phosphorylation d’un RN peut affecter tout les aspects régulant
son activité. A cela s’ajoute l’action potentielle de la kinase sur les différents cofacteurs et
facteurs de transcription associés (Berrabah et al., 2011)(Bulynko & O'Malley, 2011)(Shao &
Lazar, 1999).

ii) Action non génomique des RNs :

De nombreuses études ont montré que des ligands de RNs pouvaient entrainer une
action très rapide, de l’ordre de quelques secondes, ce qui exclut une action faisant suite à la
modulation de l’expression de gènes cibles qui a besoin de quelques heures pour se mettre en
place. Ce type de réponse a été définie comme « non-génomique » (Unsworth et al., 2018).
Elle sont associée à une modulation par le ligand de l’activité de canaux ioniques cellulaires
(Ordóñez-Morán et al., 2008)(Valverde et al., 1999), de kinases (Adlanmerini et al.,
2014)(Han et al., 2005)(Mitre-Aguilar et al., 2015), de phosphatases ou d’autres activités
enzymatiques (Ordóñez-Morán & Muñoz, 2009)(Razandi et al., 1999).
Deux hypothèses principales ont été proposées afin d’expliquer ces effets non
génomiques.
La première consiste en la présence de récepteurs membranaires indéterminés qui
seraient activés par le ligand. Ce type de réponse ne nécessite donc ni la présence du RN ni
son activation par le ligand.
La deuxième hypothèse, implique la présence d’une sous-population de RNs associée
à la membrane plasmique ou au moins présente dans le cytoplasme. Si les RNs de la classe I
sont connus pour être maintenus au niveau cytoplasmique de part leurs interactions avec des
protéines chaperonnes, les autres classes de RNs sont plutôt décrites comme exclusivement
nucléaires. Néanmoins, cela n’exclut pas un échange permanent entre le cytoplasme et le
noyau et qu’une faible proportion difficilement détectable de ces RNs soit présente et
biologiquement active au niveau du cytoplasme. De plus, comme décrit précédemment, un
grand nombre de RNs possèdent des motifs de séquences protéiques associés au trafic
cytoplasme-noyau (Ordóñez-Morán & Muñoz, 2009)
Au final, quelqu’en soit le mécanisme, cette action non génomique des ligands des
RNs apporte un niveau de régulation supplémentaire a prendre en compte lorsque l’action
d’un RN donné est étudiée (Ordóñez-Morán & Muñoz, 2009)(Pawlak et al., 2012).

53
f) Conclusion, les différents niveaux de régulation des RNs :

Classiquement, les RNs sont définis comme régulant l’activité transcriptionnelle de

gènes cibles, suite à leurs fixations sur leurs HREs caractéristiques associées à leurs
activations par leurs ligands spécifiques. Ils forment en réalité une superfamille bien plus
complexe. En effet, selon les RNs, plusieurs types de HREs peuvent être reconnus et
différents ligands plus ou moins spécifiques peuvent l’activer. De plus, si l’action du RN est
impactée spécifiquement par tous stimuli extérieurs (rythme circadien, évolution du statut
nutritionnel …) capables d’agir sur l’apport exogène ou la production endogène de son ligand
(et de la proportion de ceux-ci si ce RN peut être activés par plusieurs composés), tous les
autres mécanismes permettant la régulation des activités des autres familles de FTs
s’appliquent également aux RNs.
Ainsi, l’activité de chaque RN est finement régulée selon le type cellulaire (tissu), de
part son niveau d’expression, de celui relatif de ses différentes isoformes, de ceux de ses
cofacteurs et de la mise en place, au préalable, des différents CRMs auxquels il a accès. A ce
niveau le RN pourra mettre en place des interactions préférentielles avec d’autres FTs au sein
des TRMs correspondants.
Les RNs sont également capables d’intégrer les différents signaux extracellulaires
suivant les mêmes mécanismes que les autres FTs. Ainsi, ceux-ci peuvent agir directement sur
l’expression du RN (et de ses isoformes) ou sur celles de toutes autres protéines interagissant
avec lui. Ces stimuli extérieurs agissent également en activant des récepteurs de surface qui,
via des messagers secondaires intracellulaires, vont induire différentes enzymes. Ces
dernières peuvent potentiellement modifier post-traductionnellement toutes les protéines
permettant la régulation fine des gènes cibles du RN, y compris le RN lui-même. Au final,
tous ces changements vont être intégrés au sein des différents CRMs/TRMs correspondant au
type cellulaire.
Comme les autres FTs, les RNs sont donc capables d’intégrer finement, de manière
spécifique aux tissus, les différents signaux intra et extra cellulaires via les différentes
interactions avec leurs partenaires d’hétérodimérisation, leurs cofacteurs, d’autres facteurs de
transcription ou suite à des MPTs les ciblant ou ciblant leurs différents partenaires. Dans un
contexte pathologique, l’action d’un RN peut donc être perturbée, à tous ces niveaux. Pour
comprendre le mécanisme d’action d’un RN donné et une dérégulation éventuelle, il est donc
nécessaire de s’intéresser au-delà des variations de la concentration en ligand(s) endogène(s),
à tous autres éléments pouvant impacter ce RN. (Figure 14).

54
Figure 14 : Les différents niveaux de régulation de l’activité d’un RN. CoA. : coactivateurs ; CoR. :
corépresseurs ; Mess. : messagers secondaires ; MPTs : modifications post-traductionnelles ; PH : partenaire
d’hétérodimérisation. RS : récepteurs de surface.

55
Partie 2 : le Foie.
1) Anatomie et vascularisation:
Le foie est l’organe le plus volumineux du corps humain. Il est situé dans la partie
supérieure droite de la cavité abdominale. Classiquement le foie est divisé en quatre lobes,
chacun étant subdivisé en un ou plusieurs segments. Huit segments sont décrits chacun étant
l’objet d’une vascularisation propre (Figure 15) (Bismuth, 2013).

Figure 15 : Anatomie du foie et vascularisation.

(D’après (Walter et al., 2008)).

Le foie reçoit 25% du flux sanguin au repos. Il est perfusé à la fois par le système
artériel via l’artère hépatique et par le système veineux qui atteint le foie par la veine porte.
L’apport en sang veineux contribue pour 67 à 80% du flux sanguin hépatique total, le reste
provient de l’artère hépatique. Ainsi, la moitié de l’oxygène utilisé par le foie provient de la
voie veineuse même si les autres organes ont, au préalable, prélevés 30 à 50% de l’oxygène
initialement disponible (Bohlen, 2003). Cette voie transporte également les différents
nutriments absorbés au niveau de l’intestin jusqu’au foie (Tso & McGill, 2003). Le sang issu
de la voie artérielle provient directement de l’aorte et est donc saturé en oxygène. Il fournit
l’autre moitié de l’oxygène au niveau hépatique (Bohlen, 2003).

56
2) Les différentes cellules constituant le foie:
Le foie est composé de différents types cellulaires : les hépatocytes (60 à 65% des
cellules hépatiques), les cellules endothéliales sinusoïdales (15 à 20 %), les cellules de
Kupffer (8 à 12 %), les cellules stellaires ou de Ito (3 à 8 %), les cholangiocytes (cellules
épithéliales constituant le canal biliaire, 3 à 5%) et les cellules dendritiques hépatiques (moins
de 1 %) (Nakai H, 2011). Ces cellules ont des fonctions bien identifiées, certaines sont
impliquées dans la structuration anatomique de l’organe, toutes sont localisées à un endroit
bien précis de cet agencement.
Les cellules endothéliales sinusoïdales forment les sinusoïdes (Figure 16 et 17). C’est
à ce niveau que le sang artériel et portal se mélangent, fournissant l’oxygène et les nutriments
aux différentes cellules constituant le foie (Bohlen, 2003).
Les hépatocytes sont des cellules hautement spécialisées. Elles remplissent la plupart
des fonctions métaboliques hépatiques. Ce sont des cellules dites polarisées, c'est-à-dire que
leurs membranes plasmiques selon leurs positions, nommées basales ou apicales, présentent
des fonctions différentes. Les hépatocytes sont disposés en cordons cellulaires entre lesquels
sont localisés les sinusoïdes (Tso & McGill, 2003) (Figure 16). Un espace de l’ordre de 10 à
15 µm est situé entre la base des cellules endothéliales sinusoïdales et les hépatocytes. Il est
appelé espace périsinusoïdale ou espace de Disse. La partie basale des hépatocytes est au
contact de ce dernier. C’est à ce niveau que les échanges entre le foie et le sang ont lieu. En
effet, les cellules endothéliales sinusoïdales forment une sorte de tamis qui laisse passer des
composés issus du sang, notamment ceux liés à l’albumine (Figure 17) (Tso & McGill, 2003).
Les membranes plasmiques apicales de deux hépatocytes adjacents forment les
canalicules biliaires dans lesquels les acides biliaires (ABs) produits par les hépatocytes sont
sécrétés. Celles-ci sont séparées de l’espace périsinusoïdale par des jonctions serrées
imperméables qui permettent une séparation stricte entre la bile et le sang (Figure 16) (Tso &
McGill, 2003). Les ABs sont drainés des canalicules jusque dans les canaux biliaires. Ceux-ci
sont formés de cellules spécialisées appelées cholangiocytes. Les canaux biliaires se
regroupent par la suite pour former les canaux hépatiques droit et gauche. Ces derniers se
rejoignent hors du foie en une voie commune, elle-même reliée à la vésicule biliaire où la bile
est stockée. Enfin, il est à noter que le flux biliaire et le flux sanguin hépatique se font de
manière opposée (Figure 16) (Barrett et al., 2016)
Les cellules de Kupffer se trouvent dans les sinusoïdes (Figure 17), ce sont des
macrophages résidents qui ont pour rôle de phagocyter les particules potentiellement néfastes

57
issues de l’intestin avant qu’elles n’entrent dans la circulation générale (Figure 17) (Tso &
McGill, 2003).
Les cellules stellaires se situent au niveau de l’espace de Disse. Elles emmagasinent
les vitamines liposolubles A et D et sont capables de se différencier en cellules
myofibroblastiques ce qui leurs confèrent une grande capacité fibrogénique. Elles ont donc un
rôle dans le remodelage de la matrice extracellulaire hépatique notamment lorsque le foie est
endommagé (Figure 17) (Tso & McGill, 2003).

Figure 16 : Disposition des hépatocytes au niveau du foie.

Les hépatocytes forment les sinusoïdes et les canalicules biliaires. Les flux sanguin et biliaire, s’effectuant de
manière opposée, sont indiqués par les flèches blanches (D’après (Barrett et al., 2016)).

58
 Figure 17 : Localisation des différents types cellulaires constituant le foie.
(D’après (Tso & McGill, 2003)).

3) Les différentes unités anatomiques ou fonctionnelles du foie :

Il existe plusieurs descriptions de l’organisation structurelle et fonctionnelle du foie.
Trois unités sont classiquement utilisées : le lobule hépatique, le lobule portal et l’acinus
hépatique (Figure 18) (Fontana, 2014).

Figure 18 : Organisation structurelle et fonctionnelle du foie. (D’après (Fontana, 2014)).

59
a) Unité anatomique, le lobule hépatique :

Cette unité décrit l’organisation structurelle des cellules hépatiques. Il se présente

comme une structure hexagonale centrée sur une veine centrolobulaire. Chaque lobule est
bordé par une couche mince de tissu de connexion contenant du collagène. A chaque angle de
l’hexagone, se trouve une triade portale constituée de vaisseaux de la veine porte, de l’artère
hépatique et d’un canal biliaire. Le lobule hépatique lui-même est composé de rangées
d’hépatocytes orientées de manière radiale et séparées par les sinusoïdes hépatiques (Fontana,
2014)(Gordillo et al., 2015) (Figure 19).

Figure 19 : Lobule hépatique.

(D’après (Fontana, 2014)).

b) Unité fonctionnelle, le lobule portal :

Ce lobule forme un triangle, centré sur une triade portale et dont chaque extrémité
correspond à une veine centrale. Ce lobule représente une unité fonctionnelle hépatique
associée au processus de sécrétion de la bile et à son drainage jusqu’à la voie biliaire
périphérique (Fontana, 2014)(Figure 18)

c) Unité fonctionnelle, l’acinus hépatique :

Initialement décrit par A. M. Rappaport (RAPPAPORT, 1958), l’acinus correspond à

la plus petite unité hépatique fonctionnelle. Il est constitué d’une ellipse à cheval sur deux
lobules hépatiques dont l’axe le plus long relie deux veines centrales et l’axe le plus court
deux triades hépatiques.

60
 Dans les années 80 (Jungermann, 1988), il a été démontré que bien qu’il est impossible de
les différencier sur des caractères histologiques, la position des hépatocytes au sein de
l’acinus va conditionner leurs activités métaboliques et par conséquent leurs fonctions. Cette
caractéristique a mené les auteurs à définir le concept de la « zonation » hépatique (Figure
18) :
- La zone I : Elle est composée des six à huit hépatocytes, dits périportaux, les plus proches
des triades hépatiques. Cette zone correspond à la partie de l’acinus recevant en premier le
flux sanguin et ces différentes composantes : l’oxygène, les nutriments et les différentes
hormones. C’est donc dans cette zone, la mieux pourvue en oxygène et en nutriments,
qu’ont lieu les processus nécessitant le plus d’énergie. Le métabolisme oxydatif y est donc
prédominant.
- La zone II : cette zone intermédiaire est constituée de six à dix hépatocytes.
- La zone III : elle est la plus éloignée des triades hépatiques. Elle correspond aux deux ou
trois hépatocytes, dits périvéineux, les plus proches de la veine centrale. A ce niveau le
niveau d’oxygène est le plus faible. Les processus réductifs y sont donc prédominants.
Cette répartition offre de nombreux avantages pour l’organisme. Elle permet de regrouper
des voies métaboliques utilisant les mêmes substrats afin d’optimiser leurs utilisations. A
l’inverse, la zonation hépatique permet de séparer physiquement des voies métaboliques
opposées, comme par exemple la lipogenèse qui produit les triglycérides (TGs) et la beta-
oxydation qui les utilisent pour produire des corps cétoniques (Hijmans et al., 2014). Ceci
permet d’éviter les interférences entre ces voies métaboliques. Tous les processus hépatiques
ne sont pas strictement compartimentés et s’effectuent donc tout le long de l’acinus. C’est le
cas notamment des synthèses de nombreuses protéines plasmatiques comme la transferrine ou
la transthyrétine (Colnot S, 2011)(Kietzmann, 2017). La zonation hépatique est dynamique,
les zones I ou III peuvent s’étendre au niveau de la zone intermédiaire selon les besoins de
l’organisme, principalement en réponses aux variations des concentrations en nutriments,
drogues, hormones ou autres facteurs transmissibles par le sang (Kietzmann, 2017). Une étude
récente a montré que la moitié des gènes hépatiques était exprimée de manière non aléatoire
tout le long de l’acinus. Notamment un certain nombre de gènes ont été identifiés comme
principalement exprimés dans la zone II. Ceci semble indiquer que cette zone a un rôle bien
plus important que celui de « tampon » initialement envisagé (Halpern et al., 2017).
Si le gradient des composants du flux sanguin, notamment celui en oxygène, constitue
un des facteurs régulant la mise en place de la zonation hépatique au cours du développement
et son maintien par la suite, celle-ci dépend également des actions de différentes voies

61
métaboliques et de facteurs de transcription. Ceci ne sera pas appronfondi dans ce chapitre,
d’excellentes revues détaillent ces processus : (Colnot S, 2011)(Kietzmann, 2017)(Torre et
al., 2010).
Plusieurs maladies hépatiques ont été décrites soit comme associées à une zone
hépatique soit comme modifiant la zonation hépatique. La compréhension de ce type de
perturbations constitue un champ d’investigation très intéressant, ce qui est depuis peu facilité
par les progrès technologiques permettant les analyses au niveau de la cellule (single cell)
(Soto-Gutierrez et al., 2017).

4) Les différentes fonctions hépatiques :

a) Un rôle d’épurateur :

Le foie est l’organe central de détoxification permettant à l’organisme d’éliminer des

substances endogènes ou exogènes (dites xénobiotiques). Alors que les substances hydro-
solubles peuvent être directement éliminées par les reins, les substances lipophiles doivent au
préalable être transformées par le foie.
Classiquement ce processus de transformation est divisé en trois grandes phases et a
lieu au niveau des hépatocytes: la phase I permet l’hydroxylation du composé à éliminer, la
phase II la conjugaison de ce dernier avec une protéine. Ces deux étapes permettent de
transformer le composé souvent très hydrophobe en une molécule hydro-soluble plus facile à
éliminer. La phase III consiste en l’excrétion active de ce dernier, à l’aide de transporteurs
transmembranaires, soit dans le flux sanguin afin d’être éliminé au niveau rénal, soit dans la
bile pour être éliminé via les fèces, après sécrétion de la bile au niveau de l’intestin (Modica
et al., 2009)(Sendensky A & Dufour JF, 2011).

b) Un rôle dans le système immunitaire :

Comme décrit précédemment, les deux tiers de l’afflux sanguin hépatique provient de
la veine porte après être passé au niveau de nombreux organes dont l’intestin. Le sang est
donc porteur de nombreux antigènes issus notamment des nutriments. Le foie contient de
nombreuses cellules du système immunitaire inné, les cellules de Kupffer, les cellules
dendritiques et les cellules NK (natural killer). Le foie constitue donc une des premières
lignes de défense immunitaire, après l’intestin, contre les différents pathogènes et toxines. Il

62
permet également de mettre en place un seuil de tolérance contre les antigènes issus de
l’alimentation (Sendensky A & Dufour JF, 2011)(Tso & McGill, 2003).

c) Un rôle de stockage et de production :

Le foie stocke de nombreux composés, par exemple le fer ou des vitamines. Les
composés stockés par le foie sont ensuite libérés dans la circulation selon les besoins de
l’organisme. Le foie est également un organe où a lieu la synthèse d’un grand nombre de
protéines utiles à l’ensemble de l’organisme. Ainsi, la majorité des protéines circulant au
niveau sanguin est produite et sécrétée par le foie : il s’agit notamment des différentes
protéines « cargos » plasmatiques telles que l’albumine, la transferrine, les lipoprotéines mais
aussi des protéines reliées au système immunitaire telles que le complément, ainsi que la
plupart des facteurs impliqués dans la régulation de la coagulation (Sendensky A & Dufour
JF, 2011).
Du fait de ses capacités de stockage et de synthèse, le foie a un rôle clef dans la
régulation du métabolisme énergétique de l’organisme. Il adapte son action selon le statut
nutritionnel de celui-ci et est la plaque tournante connectant différents tissus tels que le
muscle squelettique et le tissu adipeux.

5 ) Action centrale du foie dans le maintien de l’homéostasie

énergétique de l’organisme :
L’organisme dépend de l’alimentation pour son approvisionnement en source
d’énergie. Comme la prise de nourriture est discontinue et entrecoupée de périodes plus ou
moins longues de jeûne, l’organisme a besoin de stocker l’apport en nutriments excédentaire
(glucose, acide gras et aminoacides) afin de pouvoir l’utiliser par la suite. Cette réserve
d’énergie est conservée sous forme de glycogène pour le glucose, sous forme de protéines
pour les acides aminés, dans le foie et les muscles squelettiques, et sous forme de TGs pour
les acides gras, dans le foie et le tissu adipeux blanc (WAT, White adipose tissue). Au cours
du jeûne, le foie est le principal producteur de sources d’énergies. Pour cela, il synthétise du
glucose et des corps cétoniques (beta-hydroxybutarate, acétoacétate et acétone). Il exporte
dans la circulation sanguine ces composés afin qu’ils soient utilisés par les autres organes. Le
tissu adipeux blanc et les muscles vont également mobiliser leurs réserves et libérer dans la
circulation différents composés. Le foie va jouer un rôle central en les captant et en les
utilisant afin de produire le glucose et les corps cétoniques.

63
a) Les différentes étapes de l’évolution du statut nutritionnel et action
hépatique associée :

Au début des années 1970, les travaux de George Cahill et de son équipe (Cahill,
1970), ont modélisé l’évolution du statut nutritionnel. Ce modèle divise cette progression en
cinq étapes et décrit notamment comment l’organisme maintient sa glycémie plasmatique au
niveau de la circulation périphérique (Cahill, 2006)(Stipanuk, 2012) (Figure 20). En effet,
celle-ci est très finement régulée sur une journée avec un maximum de 9 mmol/L juste après
un repas et un minimum de 3 mmol/L lors d’un jeûne prolongé, la concentration moyenne se
situant entre 5,5 et 6 mmol/L. Le maintien de la concentration en glucose au niveau de la
circulation périphérique dans cet intervalle est essentiel pour deux raisons majeures : la
demande constante en glucose du cerveau, qui utilise presque exclusivement ce métabolite
comme seule source d’énergie (Nuttall et al., 2008), et le fait que le glucose lui-même devient
à trop haute concentration toxique pour les tissus, notamment en induisant des dommages
oxydatifs (Ighodaro, 2018). Le foie joue un rôle essentiel dans chacune de ces étapes (Figure
20) :

64
 Figure 20: Utilisation du glucose en fonction du temps dans les cinq étapes de la progression du statut
nutritionnel de l’organisme (D’après (Stipanuk, 2012)).

La phase I correspond à la phase postprandiale, tous les tissus utilisent le glucose issu
de l’alimentation comme source d’énergie. Lors de cette phase, le foie est exposé, via l’afflux
sanguin de la veine porte, à une forte concentration de glucose (jusqu’à 15 mmol/L). Durant
les 2 à 3 heures suivant le repas, le foie capte jusqu’à 20 grammes de glucose, ce qui permet
de réduire la concentration, au niveau de la circulation périphérique et donc pour les autres
organes, à 9 mmol/L. De même, le foie capte et stocke le cholestérol et une partie des acides
gras circulants issus de l’alimentation. Ceci permet de réduire leurs concentrations dans la
circulation périphérique à des niveaux non toxiques pour les autres organes. Au cours de cette
phase le foie a donc un rôle essentiel de protection (Cahill, 2006)(Stipanuk, 2012).
Les phases II et III coïncident avec la phase interprandiale c'est-à-dire un jeûne dont la
durée maximale correspond au temps de sommeil. Durant cette période, l’organisme utilise le

65
glucose qu’il synthétise et maintient grâce à cette production la concentration plasmatique de
ce métabolite. Ce glucose circulant est principalement produit par deux voies : La
glycogénolyse qui correspond à la libération du glucose stocké sous forme de glycogène et la
néoglucogenèse qui correspond à une synthèse de novo du glucose à partir de précurseurs non
glucidique tels que les acides aminés, le glycérol, le lactate, le pyruvate et autres métabolites
intermédiaires du cycle de Krebs (Sharabi et al., 2015). La production de glucose de
l’organisme (GP) a lieu principalement dans deux organes le foie (glycogénolyse et
néoglucogenèse) et les reins (néoglucogenèse uniquement). Elle peut également se faire au
niveau de l’intestin via la néoglucogenèse. A ce stade, le foie contribue pour 75 à 80% de la
GP dont 45 à 50% via le glycogénolyse et 25 à 30% via la néoglucogenèse. Le rein produit les
20 à 25% restants. (Alsahli & Gerich, 2017). Bien que la plupart des organes continuent
d’utiliser le glucose, ceux-ci commencent à basculer vers l’utilisation d’autres sources
d’énergies notamment les corps cétoniques synthétisés au niveau du foie. Ceci permet de
préserver le glucose produit par l’organisme au profit du cerveau (Cahill, 2006)(Stipanuk,
2012). Chez l’homme, après un jeûne d’une nuit, la contribution de la glycogénolyse et de la
néoglucogenèse est à peu près similaire. Cependant, à ce stade, le stock de glycogène s’épuise
et si le jeûne doit se prolonger, la production de glucose va décliner et la néoglucogenèse dont
le niveau reste stable, devient le processus prédominant voir exclusif (Sharabi et al., 2015).
L’organisme entre alors dans les phases IV et V correspondant au jeûne prolongé. A ce
stade, la néoglucogenèse est la seule source de glucose de l’organisme (au-delà de 24 heures
de jeûne, le stock de glycogène est épuisé). Au niveau des reins la néoglucogenèse va
augmenter. Chez l’homme, il a été démontré qu’elle était 2,5 fois plus importante après un
jeûne de 60 heures comparée à un jeûne de 12 heures (Gerich et al., 2001). A ce stade, la
néoglucogenèse intestinale va également être activée. Le glucose produit est quasiment
exclusivement utilisé par le cerveau (également par d’autres tissus qui ne sont capables de
produire de l’énergie que via la glycolyse, comme les globules rouges). Les autres tissus
basculent vers l’utilisation exclusive des corps cétoniques comme source d’énergie. Ceux-ci
procurent 2 à 6% des besoins énergétiques de l'organisme après un jeûne d'une nuit et 30 à 40
% de ceux-ci après un jeûne de trois jours (Laffel, 1999). Le cerveau commence également à
les utiliser comme source d’énergie alternative. Ceci permet de limiter la consommation
cérébrale en glucose et permet à l’organisme de limiter l’utilisation des acides aminés servant
à la néoglucogenèse, qui à ce stade proviennent uniquement de la protéolyse nette des muscles
squelettiques (Cahill, 2006)(Stipanuk, 2012).

66
b) Rôle central du foie dans la réponse aux besoins énergétiques de
l’organisme :

Comme décrit précédemment, le foie a un rôle majeur dans le maintien de

l’homéostasie énergétique de l’organisme. Lorsque celui-ci n’est plus approvisionné en source
d’énergie (au cours du jeûne) ou que ses besoins augmentent (lors d’un exercice physique), le
foie est l’organe central permettant de fournir aux autres organes le glucose et les corps
cétoniques qui constituent leurs principales sources d’énergie. Pour cela, le foie va mobiliser
ses propres réserves. Son glycogène et ses protéines vont servir à produire le glucose par
glycogénolyse et néoglucogenèse. Ses TGs vont être dégradés, suite à l’action de la voie
nommée lipolyse, en glycérol et en acides gras. Ces derniers sont alors oxydés au cours du
processus de beta-oxydation, produisant au final des corps cétoniques. Le foie est également
le site de prise en charge des molécules libérées par les autres organes de stockage de
l’organisme. Ainsi, les acides gras et le glycérol libérés par le tissu adipeux blanc à partir de
ses TGs dans la circulation, de même que le lactate et l’alanine issus de la dégradation du
glycogène au niveau du muscle, sont captés par le foie. Celui-ci va alors utiliser les acides
gras dans la production de corps cétoniques et le lactate, l’alanine et le glycérol comme
substrats de la néoglucogenèse (Figure 21) (Cahill, 2006)(Rui, 2014)(Stipanuk, 2012)

Figure 21 : Actions hépatiques dans la réponse aux besoins énergétiques de l’organisme.

(D’après Bryant Miles (http://fliphtml5.com/liks/njxj/basic)).

67
 i) Rôle dans le métabolisme des lipides :

Le foie est impliqué dans la prise en charge des lipides au cours de la phase
postprandiale. Son action va permettre de protéger les tissus périphériques et de stocker une
partie des lipides fournis par l’alimentation. De plus, au cours de cette phase, lorsque la
capacité de stockage hépatique en glycogène est atteinte, le glucose excédentaire va servir de
précurseur à la synthèse de novo de TGs afin d’être conservé sous cette forme. Le foie va par
la suite exporter ces lipides vers le tissu adipeux blanc pour qu’ils soient stockés sur un plus
long terme (Figure 22).
Le métabolisme des lipides commence avec l’absorption intestinale des acides gras
provenant de l’alimentation. Afin de pouvoir traverser les membranes des cellules de l’intestin
les lipides vont être émulsifiés par les ABs et hydrolysés par des lipases. Les ABs proviennent
de la vésicule biliaire, les lipases du pancréas et sont libérés simultanément dans la lumière
intestinale. Les lipases sont également produites in situ par la flore bactérienne de l’intestin.
Au niveau des cellules intestinales, les lipides sont re-synthétisés en TGs et conditionnés afin
d’être transportés au niveau de l’organisme dans des lipoprotéines, les chylomicrons
(Bechmann et al., 2012). Ceux-ci, du fait de leur taille, ne peuvent pas rejoindre les capillaires
sanguins et sont sécrétés dans le système lymphatique. Contrairement aux autres nutriments,
les lipides n’atteignent donc pas directement le foie après absorption mais le contournent. Les
chylomicrons rejoignent ensuite la circulation sanguine, au niveau du canal thoracique, deux
heures après l’ingestion des aliments (Timlin & Parks, 2005). Les chylomicrons sont alors
maturés par un échange d’apolipoprotéines avec les HDLs (High Density Lipoprotein), un
autre type de lipoprotéines produites par le foie. Cet échange va permettre aux chylomicrons
d’être captés par les cellules du tissu adipeux blanc et, de manière moins importante, par les
cellules musculaires. Leurs lipides vont alors être récupérés par ces deux types cellulaires et
stockés sous forme de TGs. Les résidus de ces chylomicrons retournent dans le flux sanguin
et sont ensuite captés par le foie. Ils sont alors dégradés par les hépatocytes où le glycérol, les
TGs restants et le cholestérol qu’ils contenaient sont métabolisés (Feingold & Grunfeld C,
2018). Ainsi, lors de la phase postprandiale, le foie absorbe l’excès d’acides gras circulant qui
n’a pas été capté au niveau des tissus adipeux blanc et musculaire suite au premier passage
des chylomicrons. Le foie va stocker temporairement ces TGs au sein de gouttelettes
lipidiques, puis va progressivement les sécréter dans la circulation sanguine au sein de
lipoprotéines, les VLDLs (Very Low Density Lipoprotein) (Heath et al., 2007). Les TGs des
VLDLs sont alors captés et stockés à plus long terme de nouveau principalement par le tissu

68
adipeux blanc mais aussi par les muscles. Tous ces mécanismes permettent d’éviter que la
concentration sanguine en lipides circulant ne soit trop élevée, ce qui serait toxique pour les
différents organes périphériques. De nouveau, le foie joue un rôle essentiel en protégeant le
reste de l’organisme. Il a également une action importante de stockage des lipides sous forme
de TGs, même si le tissu adipeux est de loin l’organe principal de réserve de ces derniers au
niveau de l’organisme (Gibbons et al., 2000).

Figure 22 : Métabolisme des lipides et actions hépatiques.

AB : Acides biliaires, Ag : Acides gras alimentaires, Ch : Chylomicrons, HDL : Lipoprotéines à forte densité,
LPL : Lipoprotéine lipase, MC : Chylomicrons matures, RM : Chylomicrons résiduels, TGs : Triglycérides.
(D’après, (Bechmann et al., 2012))

Le foie est également un site majeur de production de TGs par lipogenèse de novo.
Cette voie métabolique est principalement active lors de la phase postprandiale (Milić et al.,
2014). Lors de celle-ci, elle permet au foie de stocker les acides gras issus des chylomicrons

69
résiduels, mais aussi de prendre en charge le glucose excédentaire provenant de
l’alimentation. En effet, la dégradation du glucose, par le processus de la glycolyse, va
produire majoritairement du pyruvate. Ce métabolite fournit la source de carbone nécessaire à
la synthèse de novo de lipides sous forme de TGs. Le pyruvate est métabolisé par le cycle de
Krebs, ce qui va produire au final de l’acétyl-CoA. La synthèse des triglycérides est ensuite
catalysée par deux enzymes clefs : l’acetyl-CoA carboxylase (ACC) et l’acide gras synthase
(Fatty acid synthase, FAS) (Figure 23). L’induction génique de ces deux enzymes ne peut
avoir lieu qu’en présence de l’insuline et nécessite que le processus de la glycolyse soit actif
au sein des cellules hépatiques. Les TGs ainsi néo-synthétisés pourront également être
sécrétés par la suite dans la circulation sanguine sous forme de VLDLs. Ce mécanisme
connecte ainsi les métabolismes glucidique et lipidique. (Postic et al., 2004)(Sanders &
Griffin, 2016)

Figure 23: Production de TGs par la lipogenèse hépatique de novo.

(D’après, (Postic et al., 2004))

Lors de la phase de jeûne, le foie va dégrader les acides gras issus de ses propres
réserves (stockés sous forme de TGs) et ceux libérés par le tissu adipeux blanc dans la
circulation afin de produire et sécréter les corps cétoniques, fournissant ainsi le reste de
l’organisme en source d’énergie. La beta-oxydation est la principale voie métabolique de
dégradation des acides gras et constitue donc la première étape de ce processus. Elle a lieu au
niveau des mitochondries. Elle permet également de fournir de l’énergie aux hépatocytes au
cours du jeûne. L’enzyme clef et limitante du processus de beta-oxydation est la carnitine
palmitoyltransférase 1 (CPT-1). La régulation de l'activité de cette enzyme est donc un point

70
majeur de contrôle de la beta-oxydation et de la production des corps cétoniques (Bartlett &
Eaton, 2004)(Nguyen et al., 2008).

ii) Rôle dans le métabolisme du cholestérol :

Du fait de son action au sein des membranes lipidiques des cellules, le cholestérol est
une molécule indispensable à l’organisme. Il régule à ce niveau la répartition des protéines
membranaires et la fluidité des membranes. Un peu plus de la moitié du cholestérol de
l’organisme provient de la biosynthèse de novo. Le cholestérol est présent dans tous les tissus,
sous forme libre dans les membranes et estérifiée pour son stockage. Il est aussi associé aux
lipoprotéines grâce auxquelles il est transporté. Le foie est, avec l’intestin, l’organe
synthétisant le plus de cholestérol (respectivement 10 et 15% de la quantité produite
quotidiennement). Le foie régule le stock de cholestérol de l’organisme. Il capte le cholestérol
exogène provenant des chylomicrons résiduels et celui endogène issu des HDLs produits par
les autres organes qui l’élimine sous cette forme dans la circulation. Au niveau du foie le
cholestérol néosynthétisé ou ainsi absorbé va soit retourner vers les autres tissus en étant
incorporé aux VLDLs, soit être éliminé principalement suite à son utilisation dans la
production des ABs, mais aussi via sa sécrétion directe dans la bile (Berg et al.,
2002)(Feingold & Grunfeld C, 2018)

(1) Catabolisme du cholestérol et acides biliaires:

Les ABs sont des molécules présentant une structure amphipathique. Cette caractéristique
leur permet de former des micelles et leur confère ainsi un rôle de détergent. Les ABs sont
nécessaires à la solubilisation, la digestion, l’absorption des nutriments lipidiques et des
vitamines liposolubles au niveau de l’intestin. Ils permettent la solubilisation du cholestérol
dans la bile et empêche sa cristallisation au niveau de la vésicule biliaire. Les ABs sont
d’ailleurs un constituant essentiel de la bile. Par cette voie, ils contribuent à l’élimination de
lipides, de métabolites toxiques et de xenobiotiques suite à leurs transports des hépatocytes à
la vésicule biliaire via les canalicules et les canaux biliaires (Chiang, 2013)
La conversion du cholestérol en ABs et son excrétion via les fèces constituent la voie
principale de son élimination au niveau de l’organisme. Elle représente 90 % de son
catabolisme. Les 5% restant correspondent à la métabolisation du cholestérol en hormones
stéroïdiennes dans les tissus endocriniens, en oxystérols dans les poumons, le cerveau, le foie
et les macrophages et en vitamine D3 au niveau de la peau, du foie et des reins. La conversion

71
du cholestérol en ABs est donc primordiale dans le maintien de son homéostasie (Russell,
2009). Enfin, les ABs, de par leurs actions de signalisation au niveau des différents tissus,
sont impliqués dans la régulation des métabolismes des acides aminés, des lipides et du
glucose. Les ABs ont donc un rôle physiologique important (de Aguiar Vallim et al., 2013).

(1-a ) Synthèse de novo des acides biliaires primaires:

La synthèse des ABs est réalisée selon deux voies. Elle est la résultante d’une cascade
de réactions nécessitant 17 enzymes localisées dans différents compartiments cellulaires
(cytosol, réticulum endoplasmique, mitochondrie et peroxysome). Leurs actions permettent
l’hydroxylation multiple de la molécule initiale de cholestérol. Le foie est le seul organe à
exprimer l’intégralité de ces enzymes. Les ABs ainsi produits au niveau hépatique sont dits
primaires (Russell, 2003).

 La voie classique (ou neutre) :

Elle génère plus de 90% de la quantité totale d’ABs. Elle est initiée par la cholestérol 7-
alpha hydroxylase (CYP7A1). Cette enzyme est la seule de la voie à être limitante. Une autre
étape importante est catalysée par la stérol 12-alpha hydroxylase (CYP8B1). Cette enzyme
permet de synthétiser l’acide cholique (CA), sans son action le produit final est l’acide
chenodeoxycholique (CDCA). C’est donc à cette étape qu’est contrôlé le ratio entre ces deux
ABs. Chez l’homme, la voie classique aboutit à une production à peu près égale de CA et de
CDCA. Chez la souris, le CDCA peut être modifié en trois autres ABs primaires : les acides
alpha-muricholique (MCA), beta-muricholique (MCA) et ursodeoxycholique (UDCA)
(Chiang & Ferrell, 2018)(Li & Chiang, 2014)(Figure 24).

 La voie alternative (ou acide) :

Elle est initiée essentiellement par l’enzyme stérol 27-hydroxylase (CYP27A1) qui
transforme le cholestérol en un oxystérol, le 27-hydroxycholestérol. Cette enzyme est
exprimée majoritairement dans le foie mais aussi au niveau des macrophages et d’autres
tissus. Ainsi, le 27-hydroxycholestérol est l’oxystérol le plus fortement présent au niveau
plasmatique chez l’homme et la souris. Celui-ci ainsi que d’autres oxystérols, notamment le
24-hydroxycholestérol produit au niveau du cerveau et le 25-hydroxycholestérol produit au

72
niveau hépatique, peuvent entrer dans la voie alternative de synthèse des ABs. Pour cela, ils
sont d’abord transformés par l’oxystérol 7-alpha hydroxylase (CYP7B1). Cette enzyme est
exprimée de manière ubiquitaire bien que majoritairement dans le foie, les reins et le cerveau.
Elle peut donc prendre en charge les oxystérols circulants au niveau de différents organes et,
après transport de son produit au niveau hépatique via la circulation sanguine, contribuer à la
production en ABs du foie. A partir de cette étape, la voie alternative rejoint la voie classique
et va au final produire les mêmes ABs primaires (Chiang & Ferrell, 2018)(Li & Chiang, 2014)
(Figure 24). Ainsi, si le foie est le seul organe à synthétiser les ABs, principalement par la
voie classique, les autres tissus, en produisant des métabolites intermédiaires utilisés par la
voie alternative, peuvent participer de manière non négligeable à cette production. Ainsi, la
voie alternative contribue, chez l’homme de 3 à 18% et chez les rongeurs de 50%, de la
production quotidienne en ABs de l’organisme. De plus, Chez le nouveau-né, elle est la seule
voie de synthèse, CYP7A1 n’étant pas exprimé avant le sevrage et peut redevenir
quantitativement importante chez l’adulte en cas de maladie du foie (Chiang & Ferrell, 2018).

Figure 24: Les voies de synthèses des ABs.

En rouge, la voie classique.
En bleu, ABs produits chez la souris mais pas chez l’homme.
En pointillés, éléments circulant captés par le foie.
hChol. : Hydroxycholestérol. (D’après, (Molinaro et al., 2018).

73
 La grande majorité des ABs est ensuite conjuguée à un aminoacide (ajout d’un amide
au niveau du groupe carboxyle terminal). Chez les mammifères, les ABs sont conjugués soit à
la glycine soit à la taurine. Ce processus est catalysé en deux étapes par les enzymes, BACS
(Bile acid-coenzyme A synthase) et BAAT (Bile acid n-acetyltransferase) (Falany et al.,
1994)(Pellicoro et al., 2007). Le ratio entre les deux formes dépend de la disponibilité de la
taurine pour laquelle l’enzyme BAAT a une meilleure affinité. Chez l’homme, dans un
contexte non pathologique, le ratio est de 3 Glyco-AB pour 1 Tauro-AB. De nouveau, des
différences existent avec la souris, dans cette espèce les ABs sont presque exclusivement
tauro-conjugués. La conjugaison des ABs permet d’augmenter leurs solubilités, les ABs
conjugués à la taurine étant les plus polaires. Elle est favorise leurs sécrétions dans les
canicules biliaires et prévient leurs retours par diffusion passive dans les hépatocytes. Elle
rend de plus les ABs moins toxique pour la cellule et permet par la suite la formation de
micelles à une concentration moindre par rapport aux ABs non conjugués (Reshetnyak, 2013).
Les ABs peuvent également être sulfatés ou glucuronidés. Ce qui constitue deux autres
formes de conjugaison. La sulfatation est réalisée par l’enzyme SULT2A1 (Sulfotransferase
Family 2A Member 1) chez l’homme et SULT2A9 (Sulfotransferase Family 2A Member 9)
chez la souris (Chatterjee et al., 2005). La glucuronidation est effectuée par plusieurs enzymes
UDP-glucuronosyltransférases (UGTs), tels qu’UGT2B4 (UDP Glucuronosyltransferase
Family 2 Member B4), UGT2B7 (UDP Glucuronosyltransferase Family 2 Member B7) et
UGT1A3 (UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A3), selon le site de l’AB sur
lequel le composé glucuronide est ajouté (King et al., 2000). Chez l’homme, les ABs sulfatés
sont peu abondants mais constituent une des composantes du mélange en ABs de l’organisme.
Les ABs glucuronidés sont quantitativement une voie mineure (Hofmann, 2007). Ces deux
processus ont pour fonctions de réduire la toxicité des ABs et de favoriser leurs éliminations
par les urines et les fèces. La sulfatation est d’ailleurs la voie majeure permettant de détoxifier
les ABs extrêmement hydrophobiques (Reshetnyak, 2013).

(1-b) Activation de la synthèse des ABs :

Du fait de leurs toxicités et du fort coût énergétique de leurs productions, l’organisme

doit très finement réguler la synthèse des ABs. Ce contrôle s’effectue principalement au
niveau de la transcription du gène codant pour CYP7A1, l’enzyme limitante de la voie de
synthèse principale. L’ARNm codant pour ce gène a d’ailleurs une durée de vie très courte

74
d’environ 30 minutes, ce qui traduit bien la nécessité de réguler finement le niveau
d’expression de cette enzyme (Baker et al., 2000).
L’activation de la transcription de CYP7A1 est régulée différemment chez l’homme et
les rongeurs. Néanmoins pour les deux espèces l’activation de ce gène est dépendante de la
coopération sur son promoteur des RNs LRH-1 et HNF4a (Kir et al., 2012), ce dernier
induisant la transcription suite au recrutement du coactivateur PGC1a (Peroxisome
proliferator-activated receptor Gamma Coactivator 1 alpha) (Crestani et al., 1998).
Chez les rongeurs, la voie de synthèse des ABs est activée par l’augmentation de la
concentration intracellulaire des hépatocytes en son métabolite précurseur, le cholestérol (Peet
et al., 1998), ce qui n’est pas le cas chez l’homme (Agellon et al., 2002)(Chiang et al., 2001).
Ceci résulte de la présence d’un élément de réponse pour LXR (Liver X Receptor alpha /
Nr1h3) au niveau du promoteur de CYP7A1 qui n’est pas conservé chez l’homme. Ainsi, la
dégradation du cholestérol en oxystérols, ligands endogènes de LXR, ne va activer la
transcription de CYP7A1 que chez les rongeurs (Figure 25) (Chiang, 2009).
Le statut nutritionnel est également capable de réguler l’expression de CYP7A1, bien
que de nouveau, ceci s’effectue différemment chez l’homme et les rongeurs. Après un repas,
lors de la phase postprandiale, l’augmentation de la concentration plasmatique en insuline va
réguler l’expression de CYP7A1 au travers du facteur de transcription FOXO1 (Forkhead O
box 1). Chez les rongeurs FOXO1 est capable de se fixer sur le promoteur de CYP7A1 et
d’induire sa transcription (Li et al., 2006). L’inactivation de ce dernier en présence d’insuline
suite à sa phosphorylation par l’AKT (Protein Kinase B) va donc diminuer l’expression de
CYP7A1. A l’inverse, chez l’homme ce site n’existe pas et FOXO1 réprime l’expression de
CYP7A1 en interférant avec le recrutement de PGC1a au niveau d’HNF4a (Li et al., 2006).
Dans ce cas, l’inactivation de FOXO1 en présence d’insuline va permettre d’induire
l’expression de CYP7A1 et donc celle de la synthèse des ABs (Figure 25).
Lors de la phase de jeûne, l’augmentation de la concentration plasmatique en glucagon
peut également impacter l’activation du gène CYP7A1, toujours de manière spécifique à
l’espèce. Le glucagon va agir, au niveau des hépatocytes, en induisant l’adénylate cyclase qui
va produire de l’AMPc (Adénosine MonoPhosphate cyclique) augmentant la concentration
intracellulaire de ce dernier. Ceci entraine au final l’activation de la PKA (Protein Kinase A).
Chez les rongeurs, l’augmentation de l’AMPc intracellulaire est corrélée à celle de
l’expression génique de CYP7A1 (De Fabiani et al., 2003)(Shin et al., 2003). A l’inverse,
chez l’homme, cette expression va diminuer suite à la phosphorylation d’HNF4a par la PKA,
ce qui a pour effet d’inactiver son activité transcriptionnelle (Figure 25) (Kovár et al., 2010).

75
 Figure 25: Régulation de l’activation de la synthèse des ABs selon le statut nutritionnel.
Panel A : Chez les rongeurs.
Panel B : Chez l’homme.
IR : récepteur à l’insuline (Insulin Receptor).
GCGR : récepteur au glucagon (G-protein Coupled Glucagon Receptor).

Ces différences, associées aux espèces, des mécanismes de régulation de l’expression

génique de CYP7A1 se reflètent au niveau des organismes sur les profils de productions
circadiennes en ABs.
Chez l’homme, le pic de synthèse a lieu juste après la phase postprandiale, environ 2
heures après la réabsorption hépatique des ABs provenant de l’intestin, lorsque l’organisme à
de nombreuses sources d’énergie à disposition. A l’inverse, lors de la phase de jeûne, cette
synthèse est progressivement diminuée afin de préserver les métabolites énergétiques (en

76
faveur de la néoglucogenèse notamment). De plus, la production des ABs n’est pas
synchronisée avec celle du cholestérol pourtant substrat initial de la voie (Gälman et al.,
2005)(Song & Chiang, 2006). Chez les rongeurs, la stratégie est totalement différente, le pic
de synthèse des ABs a lieu au cours du jeûne, au moment où leur niveau circulant est le plus
bas. Cette production augmente simultanément aux processus de néoglucogenèse et de
biosynthèse du cholestérol. Ces trois voies de synthèse atteignent d’ailleurs leurs niveaux
d’activités le plus élevé juste avant le réveil des animaux (Ačimovič et al., 2011)(Eggink et
al., 2017)(Zhang et al., 2011).

(1-c ) Le cycle des acides biliaires dans l’organisme :

Les ABs sécrétés dans la lumière intestinale vont être en grande partie réabsorbés et
retourner au niveau du foie, via la veine porte, où ils seront recyclés. Cette circulation appelée
entéro-hépatique a lieu quatre à douze fois par jour. Elle permet à l’organisme de recycler
95% des ABs initialement sécrétés. Des ABs vont également atteindre la circulation
périphérique où ils vont être captés par les reins afin d’éviter leurs pertes dans les urines. Ces
ABs vont retourner dans la circulation et atteindre au final le foie. Cette circulation des ABs
dans tout l’organisme (entéro-hépatique et périphérique) nécessite l’action coordonnée de
différents transporteurs actifs. Ceux-ci sont associés soit à l’excrétion soit à la captation des
ABs au niveau des différents tissus (Figure 26). Elle permet également aux ABs de jouer leurs
rôles de signalisation (Chiang & Ferrell, 2018).

77
 Figure 26: Vue d’ensemble du système de transport des ABs.
Transporteurs des ABs : Cf. légende sur la figure. SULTs : cellules exprimant les sulfotransférases.
UGTs : cellules exprimant les UDP glucuronosyltransférases. Flèches rouge : cycle entéro-hépatique.
Flèches pointillées : circulation périphérique des ABs.
Encadré en noir : concentrations physiologiques en ABs mesurées dans les différents compartiments (d’après,
(Thomas et al., 2008) et (Fickert & Wagner, 2017)).

78
 L’essentiel des constituants de la bile est sécrété des hépatocytes au niveau de leur
membrane apicale, vers les canalicules biliaires via des « pompes » ATP-dépendante de la
superfamille des transporteurs ABC. Il s’agit notamment des transporteurs actifs de la famille
des MDR (MultiDrug Resistance protein) ou de celle des MRP (Multidrug-Resistance
associated Protein) (Reshetnyak, 2013). La plus grande partie des ABs, ceux tauro ou glyco-
conjugués, sont ainsi exportés activement suite à l’action du transporteur BSEP (Bile Salt
Export Protein / ABCB11) (Mita et al., 2006)(Noe et al., 2005). Chez la souris, les
transporteurs MDR1a et MDR1b sont vraisemblablement également capables d’excréter les
ABs. Il est possible que l’action de ces deux transporteurs murins soit associée à leur capacité
à prendre en charge les ABs fortement hydroxylés, notamment les MCAs qui ne sont pas
synthétisés chez l’homme (Wang et al., 2009). L’action de l’homologue humain MDR1 n’a
pas été démontrée jusqu’ici. La fraction mineure des ABs, ceux sulfatés ou glucuronidés, ainsi
que la bilirubine, un des composant de la bile, sont eux sécrétés des hépatocytes via le
transporteur MRP2 (Akita et al., 2001)(Čvorović & Passamonti, 2017). L’export des autres
composantes de la bile est réalisé par d’autres transporteurs de la famille MDR. ABCB4
(ATP-binding Cassette Sub-family B Member 4, aussi nommé MDR3 chez l’homme et
MDR2 chez la souris) permet la sécrétion des phospholipides. L’efflux du cholestérol
nécessite quant à elle l’action du complexe formé par ABCG5/ABCG8 (ATP-binding
Cassette Sub-family G Member 5/8) ainsi que d’ABCB4 (Kosters et al., 2003). Tous ces
constituants sont nécessaires à la formation de la bile. Dans celle-ci, la majorité des ABs est
associée aux phospholipides sous forme de micelles. Ceci permet la solubilisation du
cholestérol, empêche sa cristallisation et réduit la toxicité des ABs notamment en réduisant
leur effet détergent (Jansen et al., 2012)(Reshetnyak, 2013).
Des transporteurs des ABs sont également présents au niveau des membranes basales
des hépatocytes en contact avec le flux sanguin périphérique (Khan et al., 2009). Le rôle de
ces transporteurs a été notamment mis en évidence dans des conditions pathologiques de
choléstase dans lesquelles l’expression de leurs ARN messagers est fortement induite. Ils
pourraient agir notamment comme un système permettant de diminuer l’accumulation d’ABs
dans les hépatocytes lorsque les transporteurs permettant l’efflux vers les canalicules biliaires
sont saturés ou déficients (Boyer et al., 2006)(Schaap et al., 2009). Au niveau des membranes
basales des hépatocytes, le transport des ABs est principalement effectué par le complexe
formé par les protéines OST et OST (Organic Solute Transporter). Ce dernier agit en
facilitant la diffusion et en favorisant l’absorption des solutés en fonction du gradient
électrochimique. Il permet la sécrétion de la majorité des ABs ainsi que d’autres substrats tels

79
que les stéroïdes (Dawson et al., 2010). Les transporteurs de la superfamille MRP (MRP3 et
4) sont également impliqués, ainsi que potentiellement les transporteurs de la famille des
OATPs (Organic Anion Transporting Polypeptide). Ces derniers sont fréquemment retrouvés
dans les cellules en contact avec les ABs. Néanmoins, cette famille de transporteurs présente
des substrats assez variés incluant les ABs conjugués et non-conjugués, mais aussi les
stéroïdes ou la bilirubine (Reshetnyak, 2013).
Ces transporteurs pourraient avoir un rôle physiologique et ne pas servir uniquement
de « soupape de sécurité ». MRP3 et MRP4 sont faiblement exprimés en condition saine
(Jansen et al., 2012), ce qui est également le cas des ARN messagers de OSTα et OSTβ
(Dawson et al., 2010). A l’inverse, MRP3 (Belinsky et al., 2005)(Donner & Keppler, 2001)
n’est détecté qu’en condition cholestatique. MRP4, qui a une forte affinité pour les acides
choliques conjugués et les ABs sulfatés, semble lui être uniquement exprimé en cas de forte
concentration hépatocytaire en ABs (Denk et al., 2004).

La bile contenant les ABs va passer des canalicules aux canaux biliaires pour être
stockée au niveau de la vésicule biliaire. Les cellules formant les canaux, les cholangiocytes,
ainsi que les cellules épithéliales constituant la vésicule ont un rôle actif sur la composition
finale de la bile. Ainsi, une petite fraction des ABs va être réabsorbée au niveau de ces
cellules. Ceux-ci peuvent retourner, par cette voie, au niveau du foie. Ces ABs pourraient
avoir un rôle de signalisation, notamment dans la régulation de la production de la bile par les
hépatocytes (Meier & Stieger, 2002).
Au niveau des canaux biliaires, des ABs vont passer de la bile aux cholangiocytes. La
faible proportion d’ABs non micellaires entre de manière passive dans ces cellules. Les ABs
conjugués sont eux activement réabsorbés via le transporteur sodium dépendant ASBT
(Apical Sodium-dependent Bile salt Transporter), c'est-à-dire que l’énergie nécessaire à
l’import des ABs est fournie par l’export de sodium. Le transporteur MRP3, situé à
l’interface entre la membrane des cholangiocytes et la partie vascularisée des canaux biliaires,
permet le transport de ces ABs absorbés dans la circulation sanguine périphérique (Soroka et
al., 2001). D’autres transporteurs sont exprimés à ce niveau. Il s’agit de la forme tronquée
d’ASBT (t-ASBT), néanmoins sa fonctionnalité n’a pas encore été démontrée (Lazaridis et
al., 2000) et d’OATP3, ce dernier n’a été détecté que chez la souris (Tabibian et al.,
2013)(Figure 26).
Au niveau de la vésicule biliaire, ses cellules épithéliales expriment, à l’interface avec
la bile, le transporteur MRP2 et, à l’interface avec la partie vascularisée, le transporteur

80
MRP3. Ceux-ci permettent un flux des ABs de la bile à la circulation sanguine périphérique
(Rost et al., 2001). Chez l’homme, l’expression des transporteurs ASBT et OATP-A a
également été mise en évidence au niveau des cellules épithéliales de la vésicule biliaire
(Figure 26) (Chignard et al., 2001).

Après un repas, la présence de graisse alimentaire au niveau de la partie haute de

l’intestin grêle (duodénum) va stimuler la sécrétion de la cholecystokinine (CCK) par les
cellules intestinales dans la circulation sanguine. Ceci a pour effet de promouvoir la libération
massive, par la vésicule biliaire, de la bile et de ses ABs au niveau du duodénum (Chandra &
Liddle, 2007). Les ABs vont ainsi jouer leur rôle dans l’absorption des nutriments
lipophiliques. Pour rappel, 95% de ces ABs sécrétés vont être réabsorbés par l’intestin suivant
différents mécanismes tout le long du système digestif.
Tout d’abord, une quantité très faible, constituée d’ABs non conjugués ou conjugués à
la glycine, va être récupérée par diffusion passive tout le long de l’intestin (Dawson &
Karpen, 2015). La grande majorité des ABs conjugués va être réabsorbée activement au
niveau de l’ileum, dernière partie de l’intestin grêle. A ce niveau, le transporteur exprimé par
les cellules intestinales (les iléocytes) est ASBT (Xiao & Pan, 2017). Au sein des ces cellules,
les ABs sont associés à la protéine IBABP (Intestinal bile-acid binding protein). Ceci diminue
la toxicité cellulaire des ABs et leurs permet de traverser les cellules plus facilement (Zwicker
& Agellon, 2013). Au niveau des iléocytes, une partie des ABs peut être sulfatée par
SULT2A1 (Dawson & Karpen, 2015) ou glucuronidée par des UGTs (Perreault et al., 2013).
Ces cellules expriment également le transporteur MRP2 (Akita et al., 2001). Celui-ci permet
le retour dans l’intestin, des ABs sulfatés et d’une partie de ceux glucuronidés afin
d’augmenter leurs éliminations par les fèces (Perreault et al., 2018) (Figure 26).
Une petite fraction des ABs, environ 10%, échappe à la réabsorption au niveau de
l’ileum terminal et atteint le colon. C’est à ce niveau que les ABs vont interagir avec la flore
bactérienne. Ils vont notamment, grâce à leur propriété détergente, contribuer à la suppression
significative de différents sous-types bactériens (Ridlon et al., 2014). Les bactéries
« résistantes » vont quant à elles métaboliser les ABs et ainsi affecter la taille, la composition
et l’hydrophobicité du mélange de ces derniers. Pour cela, ces bactéries vont produire des
ABs secondaires à partir des ABs primaires. La première transformation opérée par la flore
bactérienne consiste à déconjuguer les ABs. Elle est effectuée par des enzymes BSHs (Bile
Salt Hydrolases) qui sont exprimées par un grand nombre d’espèces de la flore intestinale
(Dong & Lee, 2018). Cette étape est indispensable, toutes les autres modifications des ABs ne

81
peuvent avoir lieu sans cette déconjugaison préalable (Dawson & Karpen, 2015). La réaction
la plus importante, du processus de production des ABs secondaires, consiste en la 7
alpha/beta déhydroxylation des ABs primaires (Ridlon et al., 2010). Les ABs ainsi produits
sont : chez l’homme, l’acide deoxycholique (DCA) dérivé du CA, l’acide lithocholique
(LCA) et l’acide ursodeoxycholique (UDCA) issus du CDCA. Chez la souris, sont également
produit, l’acide hyocholique (HCA), et murideoxycholique (MDCA) à partir du MCA et
l’acide oméga-muricholique (MCA) et hyodeoxycholique (HDCA) dérivés du MCA
(Figure 27) (Chávez-Talavera et al., 2017).

Figure 27: Production des ABs secondaires par la flore bactérienne au niveau du colon.
En rouge : réactions enzymatiques réalisées par la flore bactérienne.
En fond blanc: ABs primaires initiaux chez l’homme et la souris.
En fond noir : ABs primaires initiaux uniquement chez la souris
En fond bleu : ABs secondaires produits chez l’homme et la souris.
En fond bleu : ABs secondaires produits uniquement chez la souris.
(d’après (Molinaro et al., 2018))

Ces ABs secondaires sont soit réabsorbés passivement par les cellules du colon (les
colonocytes), soit éliminés dans les fèces (Chávez-Talavera et al., 2017). Les colonocytes
expriment également des UGTs, ces cellules sont donc capables de glucuronider les ABs. Par
contre, elles n’expriment apparemment pas SULT2A1. Le transporteur MRP2 est présent au
niveau des colonocytes, ce qui leurs permet d’excréter les ABs glucuronidés dans la lumière
intestinale afin qu’ils soient éliminés par les fèces (Dawson & Karpen, 2015).

82
 Les ABs absorbés par les cellules intestinales vont retourner dans la circulation au
niveau de la veine porte. Pour cela, ils sont activement sécrétés par l’intermédiaire de trois
transporteurs. Le premier est constitué du complexe OST / OST. Ce transporteur est
présent tout le long de l’intestin avec une expression très forte au niveau de l’ileum (Dawson
et al., 2010). Le second transporteur MRP3 est exprimé dans les iléocytes et les colonocytes.
Sa fonction est toujours associée à la sécrétion dans la circulation sanguine des ABs sulfatés
et glucuronidés (Scheffer et al., 2002)(van de Wetering et al., 2009). Enfin, le troisième
transporteur est la forme tronquée d’ASBT, il est exprimé uniquement dans les iléocytes
(Lazaridis et al., 2000)(Figure 26).
Ces ABs présents dans la circulation sanguine sont principalement liés à l’albumine
(80%) mais aussi aux lipoprotéines (20%) (Chávez-Talavera et al., 2017). Ils atteignent le foie
où ils sont activement retirés de la circulation, par les hépatocytes au niveau de l’espace
périsinusoïdale, afin d’être recyclés et d’être de nouveau disponibles stockés dans la vésicule
biliaire (Trauner & Boyer, 2003).
Cette captation des ABs de la veine porte par les hépatocytes est effectuée par
différents transporteurs. Le plus important est le transporteur sodium dépendant, NTCP (Na+
taurocholic acid cotransporting polypeptide) (Trauner & Boyer, 2003). Celui-ci n’est exprimé
qu’au niveau des hépatocytes et uniquement sur leur membrane basale (Stieger, 2011). Sa
spécificité est restreinte aux ABs conjugués, ce qui constitue la majorité des ABs sécrétés par
l’intestin. Il présente la même affinité pour les ABs tauro et glyco-conjugués (Meier et al.,
1997). Les autres transporteurs présents à l’interface veine porte / hépatocytes, font partie de
la superfamille OATP. Ils permettent la récupération sodium-indépendante des ABs
(Reshetnyak, 2013). Chez la souris et le rat, il s’agit principalement d’OATP1 (Hagenbuch et
al., 2000). OATP2 est également exprimé mais serait plutôt fonctionnel dans des conditions
cholestatiques, de même que OATP4. Physiologiquement l’action de ce dernier est d’ailleurs
plutôt associée au recyclage de l’hormone CCK (Trauner & Boyer, 2003). Chez l’homme, le
transport sodium-indépendant des ABs est effectué majoritairement par OATP-C, son affinité
pour les ABs n’est d’ailleurs que légèrement plus faible que celle de NTCP (Kullak-Ublick et
al., 2001). Le transporteur OATP8 pourrait être également impliqué. Néanmoins sa fonction
première est de recycler l’hormone CCK (Ismair et al., 2001)(Figure 26).
Au niveau des hépatocytes, les ABs (primaires et secondaires) non conjugués vont
l’être à nouveau (Wang et al., 2009). Les ABs secondaires vont être métabolisés (Marschall et
al., 2001)(Odermatt et al., 2011). Chez la souris et le rat, à l’inverse de chez l’homme,
l’action hépatique va jusqu’à retransformer complètement l’AB secondaire en l’AB primaire

83
correspondant (Kunne et al., 2013). Ces ABs vont alors être secrétés avec les ABs synthétisés
de novo dans les canalicules biliaires et retourner dans la vésicule biliaire dans l’attente d’un
nouveau cycle (Dawson & Karpen, 2015). L’AB secondaire LCA, le plus toxique pour les
cellules, va lui au préalable, être sulfaté avant d’être sécrété dans la bile (Wang et al., 2009).

Une petite quantité (moins de 10%) des ABs échappe à la captation par le foie. Ces
ABs constituent, associés à ceux sécrétés activement à ce niveau par le système biliaire ou
potentiellement par les hépatocytes, le mélange présent dans la circulation périphérique. Sa
concentration est relativement faible (2-8 µM) comparée à celle des ABs de la veine porte
(20-50 µM) (Fickert & Wagner, 2017). Cette fraction d’ABs va atteindre les tissus
périphériques où elle va avoir une action de signalisation. De nouveau, ces ABs sont
essentiellement transportés associés à l’albumine au niveau du flux sanguin.
Ces ABs présents dans la circulation périphérique vont au final retourner au niveau du
foie. Ils vont également être activement récupérés par les reins. Dans cet organe, les ABs vont
tout d’abord être filtrés du plasma au niveau des glomérules, une partie du rein dédiée à cette
fonction. Les ABs vont ainsi passer dans l’urine qui circule dans un canal formé par les
cellules tubulaires rénales (Zollner et al., 2006). Ces cellules ont pour fonction de récupérer,
avant élimination, tous les composants précieux pour l’organisme comme le glucose et
notamment les ABs. En effet, dans des conditions saines aucune trace d’ABs n’est présente
dans les urines. Ce n’est que dans des conditions cholestatiques que l’excrétion des ABs par
les reins via les urines devient une voie alternative d’élimination (principalement des ABs
sulfatés et glucuronidés) (Lee et al., 2001). Cette récupération des ABs au niveau des tubules
rénaux et leurs excrétions dans la circulation sanguine périphérique s’effectue, de nouveau,
activement à l’aide de transporteurs. Au niveau de l’interface urine / cellules tubulaires, le
transporteur principal est ASBT (Brandoni et al., 2012). Le transporteur MRP2 et des
transporteurs de la famille OATP sont également présents (Brandoni et al., 2012). MRP2
aurait plutôt, dans des conditions saines, une fonction d’excrétion dans l’urine d’anions
organiques, alors qu’en conditions cholestatiques, il serait responsable de l’élimination par
voie urinaire des ABs sulfatés et glucuronidés (Trauner & Boyer, 2003). Au niveau de
l’interface cellules tubulaires / circulation sanguine, les transporteurs permettant la sécrétion
des ABs sont principalement le complexe OST / OST (Ballatori et al., 2005), ainsi que le
transporteur MRP3 (Figure 26) (Zollner et al., 2006).

84
 (1-d) Taille, composition du mélange d’ABs et index d’hydrophobicité.

La taille du mélange en ABs est définie comme la somme des ABs circulant au niveau
du cycle entéro-hépatique, incluant les ABs hépatiques (1 à 2 %), intestinaux (75 à 80%) et de
la vésicule biliaire (15 à 20%). La faible proportion (1%) présent dans la circulation
périphérique ou dans les urines n’est pas prise en compte.
La composition du mélange en ABs va être différente selon l’organe (foie, vésicule
biliaire ou intestin) ou le composant étudié (sérum ou fèces). Au niveau hépatique, la
composition du mélange en ABs est constituée :
o Chez l’homme : de CA (40%), de CDCA (40%) et de DCA (20%).
o Chez la souris : de CA (60%) et de MCA / MCA (40%).
L’index d’hydrophobicité du mélange d’ABs dépend du ratio entre les ABs fortement
hydroxylés (CA et MCA) et ceux l’étant moins (comme le CDCA). Chez la souris, cet index
est plus faible que chez l’humain suite à la conversion du CDCA en MCA (Chiang, 2017).

iii) Rôle dans le métabolisme du glucose :

(1) Orientation de la réponse hépatique, stockage vs production du glucose :

Le métabolisme glucidique hépatique est principalement contrôlé par le ratio de deux

hormones aux effets opposés : l’insuline et le glucagon. Il est également régulé par les
catécholamines (Sharabi et al., 2015). Ces réponses hormonales s’effectuent par
l’intermédiaire de messagers secondaires et de l’activation de différentes kinases. Au cours
des différentes phases du statut nutritionnel, des modifications fines de la concentration
plasmatique en glucose vont se répercuter sur celles en insuline et en glucagon (Stipanuk,
2012) (Figure 28).

85
 Figure 28: Evolution, chez l’homme, des concentrations plasmatiques en glucose, en insuline et en
glucagon après un repas. (d’après (Owen et al., 1980)(Stipanuk, 2012))

Après un repas, l’augmentation de la concentration plasmatique en glucose est

détectée au niveau du pancréas. Les cellules β-pancréatiques vont alors secréter de l’insuline
ce qui va avoir pour effet immédiat de réprimer celle du glucagon au niveau des cellules α-
pancréatiques situées à proximité (Peavy, 2003). Au niveau du foie, l’insuline va se fixer à
son récepteur (Insulin Receptor / IR) et activer, via la phosphatidylinositol 3 Kinase (PI3K), la
protéine kinase B (AKT). Au final, l’utilisation du glucose par la glycolyse et son stockage
sous forme de glycogène vont être favorisés (Jitrapakdee, 2012).
À l’inverse, lors du jeûne ou d’un exercice physique, la diminution de la concentration
plasmatique en glucose est détectée par les cellules α-pancréatiques ainsi que par celles de la
médullosurrénale. Celles-ci vont sécréter respectivement, le glucagon et les catécholamines
(Stipanuk, 2012). Ces hormones vont promouvoir la production hépatique de glucose (HGP).
Le glucagon et les catécholamines agissent, au niveau des hépatocytes, en se fixant sur leurs
récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) respectifs. Il s’agit de GCGR pour le glucagon
(G-protein Coupled Glucagon Receptor / GCGR) et des différents récepteurs adrénergiques
pour les catécholamines. Ces GPCRs activent une enzyme fixée à la membrane cellulaire,
l’adénylate cyclase. Celle-ci va convertir l’adénosine triphosphate (ATP) de la cellule en un

86
messager secondaire, l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). L’augmentation de la
concentration intra-cellulaire de celui-ci va alors entrainer l’activation de la protéine kinase A
(PKA) (Jiang & Zhang, 2003). Cette kinase est exprimée de manière ubiquitaire dans tout
l’organisme. La forme inactive de la PKA est une holoenzyme constituée de deux sous-unités
régulatrices (PKAR) liées à deux sous-unités catalytiques (PKAC). L’AMPc se fixe sur les
sous-unités régulatrices induisant un changement de conformation du complexe. Ceci permet
la libération des deux sous-unités catalytiques qui correspondent à la forme active de la PKA.
Chez l’homme et la souris, la sous-unité catalytique est exprimée, au niveau hépatique, selon
deux isoformes, α et β codées par deux gènes différents, PRKACA et PRKACB. Ces deux
isoformes présentent 93% d’homologie et leurs sites actifs sont identiques. Elles
reconnaissent et phosphorylent donc les mêmes motifs (Søberg et al., 2013). Au final, l’action
de la PKA sur ses différentes cibles va mener à une augmentation de l’HGP via les processus
de glycogénolyse et de néoglucogenèse (Jitrapakdee, 2012).

Les différentes réponses hormonales que nous venons de décrire, agissent via des
mécanismes moléculaires qui orientent la réponse hépatique vers un stockage ou vers une
production du glucose. Ceux-ci peuvent se diviser en deux catégories associés à (Lin &
Accili, 2011) :
- Une réponse rapide qui a lieu dans les trente premières minutes. Elle est induite par un
changement dans les flux métaboliques (Figure 29).
- Une réponse à plus long terme régulée via l’action de FTs menant à la modification du
niveau d’expression d’enzymes clefs (Figure 30).

(1-a) La réponse rapide par la variation des flux métaboliques :

 Autorégulation par la concentration plasmatique en glucose :

Les hépatocytes sont capables d’ajuster leur production de glucose en réponse

à un changement rapide de la glycémie plasmatique. Ils peuvent également moduler la
proportion de glucose produite via la glycogénolyse lorsque la voie de la néoglucogenèse est
artificiellement stimulée ou réprimée. Ceci permet de ne produire que la quantité de glucose
nécessaire à l’organisme (Moore et al., 2003). Ce mécanisme dit d’autorégulation du
métabolisme glucidique est notamment lié à la capacité du foie à mesurer précisément la
glycémie plasmatique. Deux éléments jouent un rôle majeur dans ce processus :

87
- L’expression au niveau des hépatocytes du récepteur membranaire GLUT2 (Glucose
Transporter 2). Celui-ci possède une forte capacité à transporter le glucose dans les
cellules et n’est donc physiologiquement jamais saturé.
- L’expression de la glucokinase (GK), une hexokinase particulière uniquement exprimée
au niveau du foie et du pancréas. Cette enzyme a comme particularité de ne pas être
inhibée par son produit le glucose-6-phosphate (G6P).

Ces deux protéines permettent un transport et une phosphorylation du glucose en G6P

proportionnels à la glycémie plasmatique. Ceci permet aux hépatocytes de détecter et de
réagir finement aux variations de la concentration plasmatique en glucose (Tappy et al.,
2000).

 Régulation hormonale via les flux de métabolites :

 Synthèse du glycogène / glycogénolyse :

La production de glucose par glycogénolyse est régulée principalement par l’action

rapide de l’insuline et du glucagon. Elle n’est apparemment pas modulée à plus long terme
suite à des régulations transcriptionnelles d’éléments composant cette voie. L’insuline permet
l’activation de la glycogène synthase (GYS) qui est responsable de la production du
glycogène. Celle-ci s’effectue suite à la phosphorylation de la glycogène synthase kinase 3
(GSK3) par l’AKT. Cette MPT va inactiver GSK3, ce qui va lever l’inhibition de GYS (Rui,
2014). Le glucagon permet l’activation de la glycogène phosphorylase (GYP). Cette enzyme
catalyse l’étape limitante de la glycogénolyse. Elle est activée directement par l’action de la
PKA (Jiang & Zhang, 2003). Enfin, la concentration intracellulaire en G6P va réguler de
manière allostérique ces deux voies. En effet, le G6P est à la fois un inhibiteur de GYP et un
activateur de GYS (Figure 29) (Agius, 2008).

 Glycolyse / néoglucogenèse :

La néoglucogenèse hépatique est régulée par l’activité de dix enzymes (Figure 29).
Sept de ces enzymes catalysent simplement les réactions inverses de la glycolyse. Les trois
enzymes restantes sont impliquées dans trois étapes clefs qui sont la conversion du glucose-6-
phosphate (G6P) en Glucose par la glucose-6-phosphatase (G6PC), du fructose 1,6-

88
biphosphate (F-1,6-BP) en fructose-6-phosphate (F6P) par la Fructose 1,6-biphosphatase
(FBP1) et la conversion du pyruvate en phosphoenolpyruvate (PEP) par la
phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1). Ces enzymes permettent de contourner les trois
réactions irréversibles de la glycolyse (Figure 29) (Anyamaneeratch et al., 2015).

o Glucokinase (GK) / Glucose-6-phosphatase :

Dès son entrée dans le foie, le glucose est immédiatement phosphorylé par la GK en
G6P. Sous cette forme, le glucose ne peut plus retourner dans la circulation sanguine et est
donc maintenu dans les hépatocytes (Sharabi et al., 2015). L’enzyme néoglucogénique
correspondante, la G6PC, va permettre la déphosphorylation du G6P et le retour du glucose
dans la circulation. Le G6P constitue donc un carrefour entre d’une part la glycolyse et le
stockage du glucose sous forme de glycogène et d’autre part la glycogénolyse et la
néoglucogenèse (Roseman et al., 2018). Les enzymes GK et G6PC sont activées
respectivement par l’insuline et le glucagon (Figure 29) (Postic et al., 2004).

o Phosphofructokinase 1 (PFK1) /
Fructose-1,6-biphosphatase (FBP1) :

Le cycle fructose-6-phosphate (F6P) / fructose-1,6-biphosphate (F-1,6-BP) est

déterminant dans l’orientation du flux métabolique soit vers la glycolyse soit vers la
néoglucogenèse. La conversion du F6P en F-1,6-BP catalysée par la phosphofructokinase 1
(PFK1), constitue la première étape de l’engagement dans la voie de la glycolyse. A l’inverse,
l’action de la FBP1 va entrainer un basculement vers la voie de la néoglucogenèse (Sharabi et
al., 2015). Ces deux enzymes sont contrôlées de manière allostérique par la concentration
intra-cellulaire en fructose-2,6-biphosphate (F-2,6-BP). Lorsque le niveau de ce métabolite est
élevé, il entraine une forte activation de la PFK1 aux dépens de l’activité de la FBP1
(Anyamaneeratch et al., 2015). La production de ce métabolite est régulée par une unique
enzyme bifonctionnelle, la phosphofructokinase-2 / fructose-bisphosphatase-2 (PFK2/FBPase
2). Celle-ci possède deux types d’activités, une kinase et une phosphatase. Il en résulte
qu’elle peut synthétiser ou dégrader le F-2,6-BP (Pilkis et al., 1995). Cette enzyme est régulée
par le glucagon qui va favoriser son activité phosphatase suite à sa phosphorylation par la
PKA. Ceci entraine une déplétion rapide du stock de F-2,6-BP et lève ainsi la répression de la
FBP1 permettant un engagement dans la voie de la néoglucogenèse. L’insuline, en inhibant

89
l’activité phosphatase de la PFK2/FBPase 2, va avoir l’effet inverse et favoriser l’action de
l’enzyme PFK1 menant à un engagement des cellules dans la voie de la glycolyse (Figure 29)
(Sharabi et al., 2015).

o Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1) /

Cycle du pyruvate :

La PCK1 catalyse la conversion de l’oxaloacetate en phosphoenolpyruvate.

Son action associée à celle de la pyruvate carboxylase (PCx) permet l’utilisation de l’alanine,
du lactate et des acides aminés comme précurseurs de la synthèse de novo de glucose (Nuttall
et al., 2008). L’activité de la PCK1 est régulée uniquement par la disponibilité de son substrat.
Elle est donc dépendante de celles des autres enzymes permettant la production
d’oxaloacetate. Il s’agit principalement de la PCx qui va convertir le pyruvate en oxaloacetate.
Cette enzyme est activée de manière allostérique par l’acetyl-CoA qui provient des acides
gras libérés au cours du jeûne par le tissu adipeux blanc (Jitrapakdee, 2012). L’activité de
PCK1 est également dépendante de celles des pyruvate-déhydrogénases (PDKs, surtout les
formes 2 et 4). Ces enzymes entrainent une augmentation du stock de pyruvate en réduisant sa
transformation en acetyl CoA. Elles sont activées au cours du jeûne suite à la levée de leur
inhibition par l’insuline (Lin & Accili, 2011). Enfin, l’activation de FBP1 entraine une
diminution de son substrat, le F-1,6-BP, un activateur allostérique de la pyruvate kinase
hépatique (L-PK). De même, la captation, au cours du jeûne, de l’alanine en provenance du
muscle va inhiber de manière allostérique la L-PK. L’inhibition de cette enzyme va orienter le
flux métabolique vers la synthèse de glucose, en empêchant la dégradation du
phosphoenolpyruvate produit par la PCK1 en pyruvate (Figure 29) (Sharabi et al., 2015).

90
 Figure 29 : Régulation du stockage et de la production hépatique de glucose.
Cercles rouges actions du glucagon.
Cercles bleus : actions de l’insuline.
En vert : substrats de départ de la néoglucogenèse.
En rouge : enzymes clefs de la néoglucogenèse.
(D’après, (Sharabi et al., 2015) ).

(1-b) La réponse à long terme par régulation transcriptionnelle:

La régulation transcriptionnelle de la néoglucogenèse s’effectue principalement au niveau

des expressions de ses enzymes clefs. Notamment, de nombreux facteurs de transcription et
cofacteurs ont été identifiés comme contrôlant les expressions géniques de G6PC et de PCK1.
Les régulations des gènes PCx et FBP1 sont moins décrites. Les actions de l’insuline, du
glucagon mais aussi des glucocorticoïdes vont réguler les activités de ces différents FTs
(Figure 30).

 FOXO1 (Forkhead O box 1) :

FOXO1 a été identifié comme étant un FT ciblé par l’insuline, permettant la répression
de la néoglucogenèse. En effet, FOXO1 est modifié par la voie PI3K/AKT après activation de

91
cette dernière suite à la fixation de l’insuline sur son récepteur. AKT en phosphorylant
FOXO1 entraine son exclusion du noyau cellulaire et sa dégradation (Oh et al., 2013). À
l’inverse, au cours du jeûne, FOXO1 n’est pas phosphorylé et peut donc entrer dans le noyau.
Dans ces conditions, FOXO1 est méthylé par la PRMT1 (Protein arginine MethylTransferase
1), ce qui favorise également sa localisation nucléaire. Cette translocation de FOXO1 dans le
noyau, lui permet d’activer la transcription de ses gènes cibles, G6PC et PCK1 (Choi et al.,
2012) (Figure 30).

 CREB (cAMP response element binding protein) :

CREB est l’un des premiers FT identifié comme se fixant à l’élément de réponse à
l’AMPc (CRE) (initialement pour le gène de la somatostatine) (Gonzalez & Montminy,
1989). La présence de CRE a été mise en évidence sur les promoteurs des enzymes clefs de la
néoglucogenèse, G6PC, FBP1, PCK1 et PCx. Il a été confirmé que CREB était capable
d’induire directement ces gènes (Jitrapakdee, 2012). Suite à l’action du glucagon, la
phosphorylation de CREB, par la PKA, au niveau de sa sérine en position 133 va entrainer
son activation (Gonzalez & Montminy, 1989). CREB est alors capable de recruter deux
coactivateurs CBP (CREB Binding protein) et p300 (Histone acetyltransferase p300) et
d’activer la transcription, notamment celles des enzymes clefs de la néoglucogenèse
(Altarejos & Montminy, 2011)(Mayr & Montminy, 2001). Néanmoins, cette action de CREB
seul ne permet pas d’atteindre une induction maximale de ses gènes cibles. Pour cela, le
coactivateur CRTC2 (CREB-regulated transcription coactivator 2) doit également être recruté
(Koo et al., 2005)(Le Lay et al., 2009). Au cours du jeûne, l’action du glucagon entraine
l’inhibition de la salt inducible kinase 2 (SIK2) suite à sa phosphorylation par la PKA.
CRTC2 est la cible de SIK2 qui, en le phosphorylant, le maintien dans le cytoplasme de la
cellule. Suite à l’inactivation de SIK2, CRTC2 peut entrer dans le noyau et interagir avec
CREB, notamment au niveau des promoteurs de G6PC et PCK1 (Wang et al., 2012) (Figure
30).
 GR (Glucocorticoid receptor) :

Les glucocorticoïdes sont des hormones stéroïdiennes qui sont synthétisées et libérées
au niveau du cortex surrénal de manière circadienne ou en réponse au stress. Ces hormones
agissent sur quasiment tous les tissus de l’organisme et permettent le maintien de son
homéostasie notamment en réponse aux changements métaboliques journaliers (Oakley &

92
Cidlowski, 2013). La capacité des glucocorticoïdes à stimuler la néoglucogenèse hépatique a
été très tôt démontrée. Ces hormones sont, en effet, capables d’activer fortement la
transcription des gènes G6PC et PCK1 (Anyamaneeratch et al., 2015). Les glucocorticoïdes
sont des ligands de GR. Une fois activé, celui-ci va se déplacer dans le noyau où il va se fixer
à ses éléments de réponse (GRE) (Winkler et al., 2012). Ceux-ci ont été identifiés au niveau
des promoteurs des gènes G6PC (Vander Kooi et al., 2005) et PCK1 (Cassuto et al., 2005)
(Figure 30).

 PGC1a (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator

1 alpha):

CREB active également indirectement la néoglucogenèse en induisant l’expression de

PGC1a (Herzig et al., 2001)(Wu et al., 2016). L’expression hépatique de ce dernier est ainsi
fortement augmentée au cours du jeûne (Li & Lin, 2015)(Yoon et al., 2001). PGC1a
intervient dans la production hépatique de glucose en activant la biogénèse mitochondrial et le
métabolisme oxydatif (Puigserver & Spiegelman, 2003). Il est également capable de jouer un
rôle de coactivateur pour un grand nombre de récepteurs nucléaires tels que PPAR et FXR
(Oh et al., 2013). Au niveau des promoteurs de G6PC et PCK1, PGC1a interagit avec HNF4a
(Boustead et al., 2003), GR (Knutti et al., 2000) et FOXO1 (Puigserver et al., 2003). L’action
de PGC1a intervient après l’induction initiale de la néoglucogenèse hépatique. Son action
permet de maintenir la production de glucose lorsque le jeûne se prolonge (Oh et al., 2013)
(Figure 30).

 SHP (Small Heterodimer Partner / NR0B2):

L’implication de SHP dans la régulation de la néoglucogenèse hépatique a d’abord été

mise en évidence de part sa capacité à inhiber l’action de GR sur le gène PCK1. SHP, en
interférant avec le recrutement de PGC1a, coactivateur de GR, est ainsi capable de réprimer
l’action des glucocorticoïdes sur la néoglucogenèse (Borgius et al., 2002). CREB est une
autre cible importante de SHP. Ainsi, celui-ci est capable d’inhiber l’induction des gènes de la
néoglucogenèse par l’AMPc en se fixant sur CREB. Par cette action SHP interfère également
au niveau du recrutement par CREB de son coactivateur CRTC2 (Lee et al., 2010). Par la
suite, SHP a été décrit comme réprimant les expressions géniques de G6PC et PCK1 en
interférant avec les actions de nombreux autres protéines, HNF4a et FOXO1 (Yamagata et al.,

93
2004), HNF-6 (Hepatic Nuclear Factor-6) (Lee et al., 2008), C/EBP (CCAATT/Enhancer-
Binding Protein ) (Benet et al., 2015)(Park et al., 2007) et STAT5 (Signal Transducer and
Activator of transcription 5) (Kim et al., 2012) (Figure 30).

Figure 30: Régulation transcriptionnelle de la néoglucogenèse.

GCGR : récepteur du glucagon / IR : récepteur de l’insuline.
PEPCK : PCK1 / G6Pase : G6PC.
(D’après, (Oh et al., 2013))

 Les FTs de type FOXA (Forkhead Box A ou HNF-3) :

Les gènes de la famille FOXA sont associés, d’un point de vue évolutif, à la protection de
l’organisme contre l’hypoglycémie (Friedman & Kaestner, 2006). Ainsi, au niveau hépatique,
les gènes cibles de cette famille sont impliqués tout particulièrement dans la réponse au jeûne.
Le FT FOXA2 (Forkhead Box A2) induit, dans ces conditions, les expressions des gènes
G6PC, PCK1, TAT (tyrosine aminotransferase) et IGFBP1 (Insulin like growth factor binding
protein 1) (Zhang et al., 2005). L’action hépatique de FOXA2 est induite par le glucagon suite
à son acétylation (von Meyenn et al., 2013) et est bloquée par l’insuline suite à sa

94
phosphorylation par l’AKT (Wolfrum & Stoffel, 2006)(Wolfrum et al., 2003). De plus, il a
été montré que SHP était capable d’inhiber la fixation à l’ADN des FTs FOXA en
interagissant avec leurs domaines de type « forkhead ». Par ce mécanisme SHP réprime
l’action de FOXA2 au niveau des promoteurs de G6PC et PCK1 (Kim et al., 2004).

(2) Néoglucogenèse rénale et intestinale :

Bien que l’action du foie soit primordiale dans le maintien de l’homéostasie

glucidique, il n’est pas le seul organe à participer à la production endogène de glucose (Gerich
et al., 2001). Ainsi, en cas de déficience hépatique, la production de glucose de l’organisme
est maintenue suite à l’augmentation du niveau de la néoglucogenèse rénale (Alsahli &
Gerich, 2017). De même lorsque le foie est entièrement retiré lors de la transplantation d’un
nouvel organe, aucune hypoglycémie n’est observée au niveau de l’organisme, les reins étant
capables de prendre le relai (Joseph et al., 2000). Plus récemment, il a été montré que
l’intestin grêle était également capable d’effectuer la néoglucogenèse. (Mithieux & Gautier-
Stein, 2014)(Triplitt, 2012). L’action de ces deux organes, au cours du jeûne, dans la
production de glucose globale n’est donc pas négligeable. Leurs actions coordonnées à celle
du foie permet donc à l’organisme de répondre au mieux à ses besoins (Kaneko et al., 2018).

(2-a) Néoglucogenèse rénale :

Le rein est impliqué dans le maintien de l’énergie glucidique selon différents

mécanismes. Cet organe peut, au niveau de ces glomérules, filtrer le glucose plasmatique afin
d’éviter que celui-ci soit perdu dans les urines. Cette partie du rein, la médulla, n’exprime pas
les enzymes de la néoglucogenèse et n’est donc pas capable de sécréter du glucose dans la
circulation (Gerich et al., 2001). A l’inverse, au niveau de son cortex, le rein est capable de
produire et libérer du glucose via la glycogénolyse et la néoglucogenèse. Le lactate, la
glutamine, l’alanine et le glycérol peuvent être utilisés par le rein pour produire du glucose,
bien que son substrat préférentiel soit la glutamine (Alsahli & Gerich, 2017). Lors du jeûne, le
muscle produit une grande quantité de glutamine, ce qui lui permet d’éliminer l’azote produit
en excès suite au catabolisme des acides aminés. Cette glutamine est captée par le rein et va
être catabolisée en ammoniaque excrété via les urines, et en source de carbone utilisé dans la
production de glucose (Triplitt, 2012).

95
 (2-b) Néoglucogenèse intestinale :

L’intestin, et tout particulièrement l’intestin grêle, a un rôle majeur dans la captation et la

distribution du glucose issu de l’alimentation. Pour répondre à ses propres besoins
énergétiques, l’intestin grêle utilise soit le glucose de l’alimentation lors de la phase
postprandiale soit celui provenant de la circulation lors de la phase de jeûne. Récemment, il a
été montré que cet organe était également capable d’utiliser la glutamine avec la même
efficacité que le glucose (Mithieux & Gautier-Stein, 2014). De plus, les entérocytes, les
cellules les plus représentées au niveau de l’intestin grêle, expriment à la fois G6PC (Rajas et
al., 1999) et PCK1 (Rajas et al., 2000). La répression de ces deux gènes est d’ailleurs
contrôlée par l’insuline de manière similaire à ce qui est observé au niveau hépatique
(Mithieux et al., 2004). Les entérocytes sont donc capables d’utiliser la glutamine pour
produire du glucose par néoglucogenèse, via l’action de PCK1, et de le libérer dans la
circulation ainsi que celui provenant de l’alimentation ou de leur stock en glycogène, via
l’action de G6PC. La néoglucogenèse intestinale a pu être mesurée chez l’homme, au cours
d’opérations de transplantation, dans un contexte où le foie est entièrement retiré (Penhoat et
al., 2014). Tout comme dans le cas de la néoglucogenèse rénale, il semblerait que la
production intestinale de glucose est principalement activée lors de jeûnes très prolongés. En
effet, les expressions de G6PC et PCK1 n’augmentent dans les entérocytes qu’après 24 à 48
heures sans alimentation (Mithieux, 2009).
La néoglucogenèse intestinale semble avoir une autre fonction. Elle pourrait être
impliquée au niveau de la régulation de la sensation de faim. Un régime riche en protéines et
pauvre en glucides réduit celle-ci, ainsi que la quantité de la prise alimentaire du repas
suivant. Or, ce type de régime induit les expressions géniques de G6PC et PCK1 dans les
entérocytes au cours de la phase postprandiale. La sécrétion de glucose par l’intestin grêle au
niveau de la veine porte en résultant est assez importante pour être mesurée (Mithieux et al.,
2005). Or, dans la circulation portale, le système nerveux est capable de détecter cette
augmentation de la glycémie et de transmettre l’information au cerveau. Ceci entraine la
diminution de la sensation de faim et de la prise alimentaire au repas suivant (Mithieux,
2014). Néanmoins, même lorsque la production de glucose intestinale augmente, la glycémie
au niveau du système sanguin périphérique reste stable. En effet, le foie compense en
augmentant la captation du glucose au niveau portale et le stockage de celui-ci sous forme de
glycogène (Mithieux & Gautier-Stein, 2014).

96
Partie 3 : le récepteur nucléaire FXR.

1) Les récepteurs activés par les acides biliaires :

Comme décrit précédemment, au-delà de leur simple action émulsifiante, les différents
acides biliaires ont un rôle important de signalisation au niveau de l’organisme. Les ABs sont
en effet les ligands endogènes de deux récepteurs extra-membranaires, TGR5 (Takeda G-
protein Receptor 5) et S1PR2 (Sphingosine -1 Phosphate Receptor 2), et de trois RNs, FXR
(NR1H4), PXR (NR1I2) et VDR (Vitamin D Receptor / NR1I1). Le niveau ou l’absence
d’expressions de ces récepteurs au niveau des tissus, ainsi que leurs différences d’affinités
vis-à-vis des différents types d’ABs vont permettre à ceux-ci de réguler finement la réponse
métabolique (Martinot et al., 2017)(Tableau 2).
TGR5 est principalement activé par les ABs libres ou conjugués avec une haute
affinité pour les ABs de type secondaires. S’il est présent de manière ubiquitaire dans
l’organisme, l’expression de TGR5 est principalement observée dans les tissus impliqués dans
le métabolisme des ABs. Ainsi, TGR5 est présent tout le long de l’intestin avec une
expression plus forte au niveau de l’ileum et du colon. Il est exprimé également au niveau des
cellules épithéliales de la vésicule biliaire. Par contre son niveau d’expression est faible au
niveau du foie. En effet, bien que fortement exprimé dans les cellules de Kupffer, les cellules
endothéliales sinusoïdales et les cholangiocytes, TGR5 n’est pas présent au niveau des
hépatocytes, type cellulaire majoritaire au niveau du foie (Martinot et al., 2017). TGR5 est un
GPCR, il agit donc via le relais de signaux intracellulaires, notamment l’activation de la
production de l’AMPc par l’adénylate cyclase entrainant celle de la kinase PKA. Celle-ci va
phosphoryler différents substrats parmi lesquels des FTs dont elle va modifier les activités
transcriptionnelles et donc la régulation de leurs gènes cibles (Kawamata et al., 2003). Les
conséquences de cette activation sont assez larges et spécifiques au type cellulaire, comme
décrit dans les revues suivantes (Chiang, 2017)(Li & Chiang, 2014)(van Nierop et al., 2017).
S1PR2 est un GPCR activé uniquement par les ABs conjugués pour lesquels il
présente une faible affinité (Studer et al., 2012). Il a été détecté dans les hépatocytes et sa
stimulation in vitro entraine l’activation des voies de signalisation impliquant les kinases
AKT et ERK1/2 (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) (Nagahashi et al., 2015). A ce

97
jour, il reste à confirmer par des études in vivo que les ABs constituent bien les ligands
endogènes de S1PR2 et à découvrir la fonction physiologique de ce récepteur (Chiang, 2017).
PXR est principalement exprimé dans le foie et l’intestin. Il est activé par une forme
très toxique des ABs secondaires, le LCA et son dérivé le 3-keto-LCA (Staudinger et al.,
2001). Les gènes cibles de PXR sont essentiellement impliqués dans le métabolisme, le
transport et l’excrétion de nombreux composés incluant les xénobiotiques et les ABs les plus
toxiques (Modica et al., 2009). PXR a donc un rôle majeur de protection des tissus contre
l’accumulation de molécules cytotoxiques (de Aguiar Vallim et al., 2013).
Il a été démontré que le LCA et son métabolite le 3-keto-LCA étaient également
capables d’activer VDR. Néanmoins, la 1,25-dihydroxyvitamine D3, qui constitue la forme
physiologiquement active de la vitamine D, constitue le ligand endogène le plus affin de ce
RN. (Makishima et al., 2002). Cependant, cette molécule est liposoluble et dépend donc des
ABs pour être absorbée au niveau de l’intestin, ces différents ligands de VDR sont donc
associés physiologiquement. VDR est principalement exprimé au niveau intestinal et rénal (de
Aguiar Vallim et al., 2013). Tout comme PXR, il serait impliqué dans la protection des
cellules intestinales contre les ABs toxiques (Nagpal et al., 2005). Il aurait également des
propriétés anti-inflammatoires ce qui est avantageux notamment dans un contexte
cholestatique (Ogura et al., 2009). VDR a aussi été détecté de manière très faible dans les
hépatocytes (Han et al., 2010) où il jouerait également un rôle de détoxification (Li & Chiang,
2014). Néanmoins l’action principale de VDR, suite à son activation par la 1,25-
dihydroxyvitamine D3, consiste à réguler les métabolismes du calcium et du phosphore au
niveau de l’organisme (Bikle, 2014).

98
 Sous-types activant Expressions tissulaire et cellulaire
Cible des ABs
le récepteur (principaux sites)

Intestin, vésicule biliaire, rein, tissu adipeux,

LCA>DCA>CDCA>CA
TGR5 (Les ABs tauros-conjugués
pancréas, muscle squelettique, rate,
macrophages, cerveau
sont plus actifs)

S1PR2 TCA,TDCA,TUDCA,GCA,GDCA Hépatocytes, Cholangiocytes (foie)

LCA, 3-keto-LCA
PXR (non activé par CDCA, DCA et Intestin, foie
CA / activé par de nombreux composés
xénobiotiques)

LCA, 3-keto-LCA Entérocytes ileaux (intestin), rein,

VDR (Ligand préférentiel : macrophages
1,25-dihydroxyvitamine D3)

CDCA>DCA>LCA>>CA
Hépatocytes (foie), iléon (intestin), rein,
FXR (Les formes conjuguées étant
glande surrénale
plus actives / non activé par
UDCA et MCA)

Tableau 2 : Les différents récepteurs des ABs (d’après (de Aguiar Vallim et al., 2013)).

2) Cas particulier du RN FXR :

a) Structure et expression de FXR:

i) Structure et expression tissulaire de FXR :

Deux gènes ont été identifiés et classés sous la dénomination FXR.

Le premier, FXR beta (NR1H5) est un pseudo-gène chez l’homme. Néanmoins, des
études ont montré que celui-ci était exprimé et fonctionnel chez les rongeurs ou le chien (Otte
et al., 2003). La fonction physiologique de FXR demeure incertaine, il serait activé par le
lanosterol. Par contre, ce RN est totalement insensible aux ABs (Han, 2018)(Modica et al.,
2010).
Le second, FXR alpha (NR1H4) correspond au RN régulé par les ABs, que nous avons
nommé FXR depuis le début de ce chapitre. Ce gène est conservé au cours de l’évolution (du
poisson à l’homme), ce qui suggère que son action est importante au niveau de l’organisme
(Maglich et al., 2003). FXR est principalement exprimé dans les organes en contact avec les
ABs : le foie, l’intestin, le rein et la vésicule biliaire. Il est aussi fortement présent dans les

99
glandes surrénales ainsi que de manière bien plus faible au niveau de plusieurs organes
périphériques (Tableau 3). Plus précisément, FXR est détecté dans tous les types cellulaires
constituant le foie avec une expression majoritairement concentrée au niveau des hépatocytes.
De même, si l’expression de FXR apparait tout le long de l’intestin, celle-ci est plus élevée au
niveau de l’iléum (Tableau 3)(Chignard et al., 2005)(Gofflot et al., 2007)(Han, 2018)(Inagaki
et al., 2006).

Tissus Souris Homme

Cerveau o o
Cœur o n
Cellule vasculaire aortique x o
Muscle cardiaque x o
Estomac o x
Foie o o
Hépatocyte o o
Cholangiocyte o o
Cellule de Kupffer o x
Cellule stellaire o x
Cellule sinusoïdale o x
Glandes surrénales o o
Intestin grêle o o
Duodénum o o
Jéjunum o o
Iléum o o
Colon o o
Lymphocyte x o
Monocyte x o
Muscle squelettique n n
Pancréas o o
Poumon o n
Rate n x
Rein o o
Testicule o x
Tissu adipeux o x
Vésicule biliaire (cellules épithéliales) x o

Tableau 3 : Expression de FXR dans les différents tissus chez la souris et l’homme.
o : détecté, n : non détecté, x : non testé.
(D’après, (Chignard et al, 2005) (Ding et al, 2016) (Gofflot et al, 2007) (Gonzalez-Sanchez et al, 2017)
(Haeusler et al, 2016) (Hawrylycz et al, 2012) (Inagaki et al, 2006) (Huber et al, 2002) (Lefebvre et al, 2009) (Li
et al, 2007) (Li et al, 2013) (Popescu et al, 2010) (Vaquero et al, 2013) (Volle et al, 2007) (Zhang et al, 2003)).

100
 Le gène codant pour FXR est constitué de 11 exons et 10 introns et peut être exprimé
suivant quatre transcrits correspondant aux isoformes FXR1, FXR2, FXR3, FXR4.
L’expression de ces différents sous-types résulte de l’activité différentielle de deux
promoteurs distincts : au niveau de l’exon 1 pour les isoformes 1 et 2 et de l’exon 3 pour les
isoformes 3 et 4, ainsi que d’un épissage alternatif au niveau de l’exon 5 qui permet
l’expression (isoformes 1 et 3) ou non (isoformes 2 et 4) de la séquence protéique « MYTG »
au niveau de la région charnière du RN (Figure 31) (Huber et al., 2002).

Figure 31 : Structures et transcrits du gène FXR murin.

ATG : début de la séquence protéique (codon d’initiation de la traduction), AF : domaine d’activation, DBD :
domaine de fixation à l’ADN, Hinge : région charnière, LBD : domaine de fixation au ligand.
(d’après, (Modica et al., 2010)).

Les expressions de ces différentes isoformes n’ont pas systématiquement été

déterminées pour tous les tissus dans lesquels FXR a été détecté. Néanmoins, quelques
données existent chez l’homme et la souris. L’expression de ces quatre isoformes ainsi que
leurs proportions relatives diffèrent selon les organes analysés. La répartition tissulaire de ces
dernières peut également être différente selon les espèces (Tableau 4).

101
 Tissu / Intestin Glande Tissu
Foie Rein Cœur Estomac Poumon
isoforme surrénales adipeux
Intestin grêle Colon
FXR1 H, S H, S H, S S S S
FXR2 H, S H, S H, S S S S
FXR3 S H, S H H, S S
FXR4 S H, S H H, S S

Tableau 4 : Répartition tissulaire des différentes isoformes de FXR.

Chez l’homme (H) et la souris (S)
(d’après (Huber et al., 2002)(Lee et al., 2006)(Vaquero et al., 2013)(Zhang et al., 2003)).

Quelques études ont porté sur le rôle joué par les isoformes de FXR.
Les différences de structures des domaines A/B des isoformes 1-2 et 3-4 peuvent
modifier leurs capacités à interagir avec divers cofacteurs (Howarth et al., 2010). L’insertion
de la séquence « MYTG » serait capable d’impacter, quant à elle, la liaison de FXR à l’ADN
(Anisfeld et al., 2003)(Chen et al., 2013)(Song et al., 2013)(Zhang et al., 2003). De manière
globale, ces différences de structure permettraient à chacune des isoformes de réguler
préférentiellement un sous-ensemble de gènes cibles. Ainsi, les niveaux des expressions
relatives des isoformes dans les différents tissus pourraient orienter ou favoriser l’action de
FXR vers les réponses associées à ses sous-ensembles (Boesjes et al., 2014)(Correia et al.,
2015). De plus, les affinités des différents ABs connus comme activant FXR pourraient varier
selon les isoformes (Vaquero et al., 2013).
Ces différences relatives aux isoformes constituent un des mécanismes pouvant
expliquer l’effet de modulation sélective de FXR par ses ligands, nommé SBARMs (Selective
Bile Acid Receptor Modulators). Cet effet a été défini suite aux obervations montrant que les
réponses associées à l’activation de FXR par ses différents ligands (naturels ou synthétiques)
dans les mêmes conditions ou par le même ligand dans différents tissus étaient distinctes et
ciblaient spécifiquement des sous-ensembles de gènes cibles (Downes et al., 2003).
La modification des niveaux d’expression des différentes isoformes de FXR peut aussi
participer à la mise en place de la réponse physiologique. En effet il a été montré, chez la
souris, que les proportions relatives des isoformes varient au niveau hépatique avec le statut
nutritionnel. Néanmoins, selon les articles, les résultats diffèrent : une étude décrit que, au
cours du jeûne, l’isoforme 2 serait favorisée par rapport à la 1 (Correia et al., 2015), une autre
que les sous-types 3-4 le seraient par rapport au 1-2 (Zhang et al., 2004).
Au final, le rôle exact joué par les différentes isoformes de FXR est assez peu détaillé
et nécessiterait des investigations supplémentaires. Néanmoins, ce type d’étude est assez

102
complexe, d’autant plus qu’il a été démontré que l’action d’un isoforme sur un même gène
cible, pouvait être différente selon l’espèce (Song et al., 2013).

ii) Régulation de l’expression de FXR:

Quelques études ont décrit une modulation de l’expression (génique ou protéique) de

FXR.

(1) Régulation directe de l’expression de FXR :

(1-a) Par des microARNs :

Des microARNs (miRNAs) ont été identifiés comme réprimant l’expression de FXR.
Les miRNAs sont une famille de petits ARNs non codants (d’une vingtaine de nucléotides)
qui ont la particularité de s’hybrider sur la région 3'-UTR (three prime Untranslated
Transcribed Region) de leurs ARNs messagers cibles. Ils vont ainsi entrainer la dégradation
ou la répression de la traduction de ces derniers.
Chez l’homme, miR-192 (Krattinger et al., 2016) et miR-421 (Zhang et al., 2012)
répriment l’expression de FXR dans des lignées cellulaires d’hépatocarcinomes. De manière
intéressante, le niveau circulant de miR-192 est élevé dans de nombreuses maladies
hépatiques.
miR-194 est décrit comme fortement induit dans les foies de souris obèses (ob/ob).
Son inhibition permet de protéger les souris de l’obésité induite par un régime riche en
graisses (HFD / High Fat Diet). Cet effet est associé à la diminution de l’expression hépatique
de FXR. De plus, il a été montré, dans la lignée HepG2, que miR-194 était capable de
s’hybrider sur le 3’UTR de l’ARNm codant pour FXR et de réprimer ainsi son expression.
(Nie et al., 2017).

(1-b) Par des facteurs de transcription :

HNF1a (Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha) est capable d’induire l’expression

génique de FXR. Il a été montré, au niveau de foies murins, que HNF1a se fixe sur le
promoteur de FXR. De plus, l’expression protéique hépatique de FXR est réduite dans un
modèle de souris déficientes pour HNF1a (Purushotham et al., 2012)(Shih et al., 2001).
CDX2 (Caudal related homeobox 2) active la transcription du gène Fxr au niveau de
l’intestin murin. Cette protéine apparaît durant l’embryogenèse et détermine et maintien le

103
phénotype des cellules intestinales. De plus, les ABs sont capables d’induire l’expression de
CDX2 et donc indirectement celle de FXR (Modica et al., 2014).
Enfin, au niveau hépatique, il a été montré que suite à une gastrectomie partielle
effectuée sur des rats diabétiques, les effets de réversion de la pathologie observés étaient en
partie associés à la réexpression de FXR, au niveau des animaux opérés, dépendante de celle
de MAFB (Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene Family B)(Xu et al., 2018).

(1-c) Par des récepteurs nucléaires :

Chez la souris, les RNs HNF4a (NR2A1) et PPAR (NR1C3) sont également capables
d’induire la transcription du gène Fxr au niveau hépatique. Cette régulation s’effectue via la
fixation de ces deux RNs au niveau des deux promoteurs de FXR. De plus, l’activation de
PPAR par un ligand synthétique induit l’expression génique de FXR. Cet effet est augmenté
par le recrutement du cofacteur PGC1a au niveau des promoteurs de FXR. De manière
intéressante, cette action combinée de HNF4a, PPAR et PGC1a est décrite comme étant
initiée par une modification du statut nutritionnel de l’organisme. En effet, l’augmentation de
FXR est associée à celles de HNF4a, PPAR et PGC1a au cours du jeûne (Zhang et al., 2004).

(2) Régulation de l’expression de FXR via le statut nutritionnel :

Différents paramètres associés aux variations du statut nutritionnel de l’organisme

(concentrations en nutriments, en hormones ou le régime alimentaire) peuvent affecter
l’expression hépatique de FXR.
Dans des hépatocytes primaires de rats, l’expression de FXR est induite par le glucose
de manière dépendante à la dose et à la durée du traitement. Cet effet est réprimé par l’ajout
l’insuline (Duran-Sandoval et al., 2004).
Dans un modèle de souris diabétique (db/db), l’expression de FXR est augmentée
(Zhang et al., 2006). A l’inverse chez le rat, l’expression de FXR est réprimée suite à
l’induction d’un diabète par la streptozotocine. Cet effet est également aboli par un traitement
simultané à l’insuline (Duran-Sandoval et al., 2004). Cette divergence de régulation entre les
deux espèces demeure toujours inexpliquée. Néanmoins, cela confirme que l’expression de
FXR peut être dérégulée dans un contexte pathologique.
Une étude effectuée chez le lapin, a montré que le maintien du niveau d’expression
hépatique de FXR nécessitait la présence d’ABs qu’ils soient ligands de FXR ou non. Dans
cette étude, lorsque le flux des ABs du cycle entérohépatique est appauvri par drainage au

104
niveau de la bile, les expressions de FXR ainsi que celles de ses gènes cibles sont diminuées.
Le rétablissement du niveau d’ABs par ajout soit de DCA, ligand endogène de FXR, soit de
l’UDCA qui ne l’active pas, par injection intra-duodénale, permet la restauration du niveau
d’expression protéique de FXR. Par contre, l’ajout de CA dans le régime des animaux ne
modifie pas le niveau d’expression hépatique de FXR mais uniquement ceux de ses gènes
cibles suite à son activation (Xu et al., 2002).
Enfin, des rats soumis à un régime athérogéne (riche en lipides, cholestérol et
comprenant 0,5% de CA) présentent une expression hépatique de FXR considérablement
réduite par rapport à un régime classique (Côté et al., 2013). Alors que des rats soumis à un
régime HFD présentent une augmentation de l’expression hépatique de FXR (Ghoneim et al.,
2015). Ces études ne décrivent pas par quels mécanismes l’expression de FXR est modulée.
Elles indiquent néanmoins que le régime auquel est soumis l’organisme peut impacter
directement l’action de FXR via la régulation de son expression.

(3) Régulation de l’expression de FXR dans un contexte inflammatoire :

Suite à une infection ou à différentes lésions, une réponse inflammatoire aiguë se met
en place au niveau de l’organisme. Celle-ci est associée à la sécrétion de cytokines et entraine
une modification du métabolisme hépatique. Il a été montré, chez la souris, que le niveau
d’expression hépatique de FXR était diminué lorsqu’une réponse inflammatoire aiguë était
induite suite à l’injection de lipopolysaccharide (LPS). Ceci s’effectue notamment au travers
des actions des cytokines TNF (Tumor Necrosis factor alpha) et IL-1 (Interleukin 1) sur le
foie. Dans ces conditions, la fixation de FXR à ses éléments de réponse est également affectée
(Kim et al., 2003). De même, lorsque la voie du facteur de transcription NF--b (Nuclear
Factor Kappa b) est activée par l’injection de LPS, une diminution de l’expression de
l’ARNm codant pour FXR est observée. Néanmoins l’action directe de NF--b n’a pas été
démontrée (Wang et al., 2008).
Enfin, l’expression de FXR peut également être modifiée dans un contexte tumoral ou
suite à des modifications post-traductionnelles le ciblant. Ces deux derniers points seront
développés plus en détails par la suite.

b) Mode d’action de FXR :

i) Mode de fixation de FXR à l’ADN :

105
 FXR fait partie de la catégorie des RNs de classe II de type permissif. C'est-à-dire que
FXR se fixe préférentiellement sur ses HREs sous forme d’hétérodimère avec RXR, ce
complexe pouvant être activé par la fixation des ligands respectifs des deux partenaires. Cette
configuration est la plus représentée, elle est classiquement nommée FXRE (élément de
réponse de FXR). Néanmoins, FXR est également capable de se fixer à l’ADN sous forme de
monomère. Ce type de liaison est fréquemment associé à la répression de l’expression du gène
correspondant. Dans ce cas, les éléments de réponse sont considérés comme « négatifs » et
nommés negFXRE (Claudel et al., 2002)(Claudel et al., 2003)(Lu et al., 2005).
Initialement, plusieurs études ont identifiées différents HREs de FXR. Ils sont tous
basés sur l’association de demi-sites de type « AGGTCA » suivant différentes architectures :

- Des éléments de réponse inversés, IR(n): la forme IR-1 est la plus fréquente. Elle est, de
plus, celle présentant la plus forte affinité pour l’hétérodimère FXR-RXR in vitro (Laffitte
et al., 2000). Des études au cas par cas ont mis en évidence la capacité de l’hétérodimère
FXR-RXR à se fixer, pour un gène donné, sur d’autres motifs de type IR, tel que IR-0
(Song et al., 2001), IR-2 ((Li et al., 2008)(Zhang et al., 2008)) et IR-8 (Prieur et al.,
2003).
- Des éléments de réponse directs, DR(n): les formes DR-2, DR-3, DR-4, et DR-5 ont été
identifiées comme HRE de FXR (Laffitte et al., 2000).
- Un élément de réponse en miroir, ER(n) : la forme ER-8 a été décrite comme fixée par
FXR (Kast et al., 2002)(Renga et al., 2011), bien que cette dernière ne semble pas lui être
très spécifique. En effet, elle est décrite comme également reconnue par l’hétérodimère
PXR-RXR (Gnerre et al., 2004)(Kast et al., 2002) mais aussi par le complexe CAR-RXR
(Kast et al., 2002).

Par la suite, les progrès technologiques ont permis d’analyser, à l’échelle du génome, les
séquences correspondantes à chacun des sites de fixation de FXR. Ce type de recherche a été
répétée pour différents tissus ou types cellulaires. Ces études ont confirmé que l’élément de
réponse de type IR-1 constituait bien la majorité des sites de fixation associés à FXR (Chong
et al., 2010)(Lee et al., 2012)(Thomas et al., 2010)(Zhan et al., 2014). Par exemple, 76% des
éléments de réponse de FXR sont de type IR-1 dans le foie de souris sur 1656 sites identifiés
(Chong et al., 2010).
Ces études ont également permis d’établir un profil global de la répartition des sites de
fixation de FXR sur le génome : une minorité se situe à proximité des promoteurs (à une

106
distance du TSS inférieure ou égale à 10 kb), la plupart sont localisés au niveau d’introns ou
de régions intergéniques. Par exemple 10, 32 et 40% des sites sont détectés respectivement au
niveau des promoteurs, des introns et des régions intergéniques dans l’étude de (Chong et al.,
2010). Comme pour les autres FTs, l’action génomique de FXR n’a donc pas lieu uniquement
au niveau des promoteurs mais est fortement associée à sa fixation au niveau des enhancers.
De plus, il a pu être mis en évidence chez la souris que si cette répartition globale des
sites de fixation de FXR est bien identique entre les tissus hépatiques et intestinaux, leurs
localisations et donc les gènes cibles associés sont très différentes entre les deux organes.
Ainsi sur l’ensemble des sites « FXR » identifiés seulement 12% sont communs aux deux
tissus. Chaque organe présente donc un profil de fixation spécifique vraisemblablement
associé aux gènes cibles de FXR « en attente » nécessaire au bon fonctionnement du tissu
correspondant. De plus, même dans les cas des gènes cibles communs au foie et à l’intestin, il
s’avère que les niveaux d’intensité des pics de fixation peuvent être différents et, dans le cas
de gènes présentant plusieurs sites de fixation, leurs présences et/ou répartitions peut
également être modifiées selon l’organe. Enfin, au niveau intestinal un autre motif que IR-1
apparaît comme assez représenté. Il s’agit d’une architecture en miroir de type ER-2 qui
jusqu’ici n’avait pas été décrite comme reconnue par FXR (Thomas et al., 2010).
Une autre étude a identifié les sites de fixation de FXR dans les hépatocytes primaires
humains et le foie murin afin de les comparer. Ces travaux montrent que les voies
métaboliques régulées par les différents gènes associés aux sites de fixation de FXR étaient
similaires quelque soit l’espèce, ce qui semble indiquer que chez l’homme et la souris les
fonctions hépatiques de FXR sont similaires (Zhan et al., 2014).
Enfin, ces différentes études (Chong et al., 2010)(Lee et al., 2012)(Thomas et al.,
2010)(Zhan et al., 2014), en identifiant de nouveaux gènes cibles potentiels ou véritables de
FXR, ont mis en évidence que celui-ci est vraisemblablement impliqué dans bien plus de
voies métaboliques qu’initialement envisagé (Dubois-Chevalier et al., 2017).

ii) Ligands (ou agonistes) naturels et synthétiques de FXR:

(1) Ligands naturels (ou endogènes) :

107
 FXR tient son nom de l’observation initiale qu’il pouvait être activé in vitro par le
farnesol (un intermédiaire de la voie du mevalonate). Néanmoins, cette activation a lieu à des
concentrations supra-physiologiques ce qui l’exclut comme ligand naturel (Forman et al.,
1995). Par la suite, il a été démontré que certains ABs étaient capables d’activer FXR à des
concentrations correspondant à celles qui pouvaient être physiologiquement mesurées dans
l’organisme (Makishima et al., 1999)(Parks et al., 1999)(Wang et al., 1999). Ces ABs
constituent donc les ligands naturels de FXR. Ils sont issus de la même voie métabolique,
celle de leurs synthèses à partir du cholestérol associées à leurs transformations par la flore
bactérienne intestinale. FXR est donc classé comme un RN de type « senseur métabolique ».
La structure chimique générale des ABs consiste en un noyau stéroïdien couplé à une
chaine latérale dont l’extrémité est acide. Ce sont des molécules amphipathiques présentant
une forme commune caractérisée par un coté concave hydrophile (face α) et un coté convexe
hydrophobique (face β) (Figure 32).
Les études de la structure tridimensionnelle de FXR en présence de ligand ont montré
que sa LBP interagissait avec les deux faces α et β des ABs.
Ainsi, la forme en courbe commune aux faces β des différents ABs est spécifiquement
reconnue et permet d’exclure toute liaison de FXR avec des molécules proches comme les
stéroïdes ou d’autres métabolites du cholestérol qui ne possédent pas cette conformation
(Makishima et al., 1999)(Parks et al., 1999)(Wang et al., 1999). La forme de la face β est
également impliquée dans la discrimination des différents sous-types d’ABs capables de se
lier à FXR. Ainsi la comparaison des structures du CDCA, ligand naturel ayant la plus forte
affinité pour FXR, et de l’UDCA qui est inactif sur ce dernier, a mis en évidence que les deux
molécules étaient identiques sauf au niveau de l’orientation d’un groupement OH. Cette
unique différence modifie la forme de la face  de l’UDCA par rapport à celle du CDCA
(Figure 32). C’est ce changement de conformation qui permet d’une part au CDCA d’interagir
avec la LBP de FXR et qui d’autre part exclut l’UDCA des sous-types d’ABs ligands de FXR
(Mi et al., 2003).

108
 Figure 32 : Structure chimique générale des ABs et différences de structure entre le CDCA et l’UDCA.
En pointillés orange : Différence de positionnement du groupement OH entre le CDCA et l’UDCA.
Hydrophobic face : face hydrophobique (β), Hydrophilic face : face hydrophilique (α), Altered hydrophobic
face : face hydrophobique altérée (d’après (Sepe et al., 2015)).

Les groupes hydroxyles de la face α des ABs ligands de FXR, vont mettre en place des
interactions avec la LBP de ce dernier. Le nombre et la position des groupes hydroxyles sur
les différents atomes de carbone de cette face est caractéristique de chaque sous-type d’ABs
(Figure 32). Ceux-ci se lient donc à FXR selon une conformation spécifique associée aux
différents positionnements (ou à l’absence) des groupements hydroxyles de leurs faces α. Ces
agencements spécifiques vont également moduler l’affinité pour FXR des différents sous-
types d’ABs (Mi et al., 2003).
Ces différences associées aux groupes hydroxyles de la face  vont aussi affecter
l’indice d’hydropathie (correspondant au ratio solubilité / hydrophobicité) des ABs. Ainsi, les
sous-types portant trois groupements OH (trihydroxylés) sont plus solubles dans l’eau que
ceux n’en portant que deux (dihydroxylés) (Figure 33).
Enfin, la chaine latérale acide des ABs permet leurs conjugaisons avec les molécules
de taurine ou de glycine. Ce processus module également l’indice d’hydropathie. En effet, les
ABs tauro-conjugués sont plus hydrophiles que ceux associés à la glycine (Figure 33) (Mi et
al., 2003)(Sepe et al., 2015)(Sepe et al., 2018). Les études de la structure tridimensionnelle de
FXR en présence de ligand ont également montré que cette chaine latérale est toujours
orientée vers l’extérieur de la LBP. C’est pourquoi, le processus de conjugaison n’interfère
pas avec la liaison entre FXR et son AB ligand (Makishima et al., 1999)(Parks et al.,
1999)(Wang et al., 1999).

109
 Figure 33 : Structure et profil de solubilité des ABs les plus communs.
Free BAs : acides biliaires non conjugués, Glyco-conjugated BAs : acides biliaires glyco-conjugués, Tauro-
conjugated BAs : acides biliaires tauro-conjugués, Hydrophobicity : hydrophobicité (d’après (Modica et al.,
2010)).

(2) Ligands synthétiques :

De nombreuses études ont cherché à identifier des ligands synthétiques de FXR

permettant d’associer un fort potentiel d’activation à une grande spécificité.
Deux différentes stratégies ont été mises en place (Sepe et al., 2015)(Sepe et al.,
2018) :
La première approche consiste à modifier la structure initiale des ABs, notamment du
plus actif d’entre eux, le CDCA. L’objectif est d’augmenter la sélectivité, l’efficacité mais
aussi la stabilité du ligand endogène. Les différents ligands synthétiques issus de cette
stratégie sont dits stéroïdiens ou dérivés semi-synthétiques des ABs.
La molécule de ce type la plus documentée est l’OCA (ou 6-ECDCA ou obeticholic
acid ou Ocaliva ou INT-747). Cette molécule correspond à l’introduction d’un groupement
éthyl au niveau du carbone 6 du CDCA, ce qui augmente sa capacité à induire FXR par
rapport à la molécule native (Pellicciari et al., 2002). Ce ligand synthétique est le seul

110
actuellement à avoir passé toutes les étapes des études cliniques et à avoir été mis sur le
marché. Néanmoins, son suivi préclinique a mis en évidence des effets secondaires assez
sévères. Le plus commun consiste en des démangeaisons (prurit), ce qui pourrait être associé
à une activation parallèle de TGR5 par l’OCA. De plus, une augmentation non négligeable de
lésions hépatiques a été observée ce qui nécessite un suivi constant des patients sous
traitement (Sepe et al., 2015)(Sepe et al., 2018).
La deuxième approche consiste à identifier des molécules chimiquement différentes
des ABs mais capables d’activer au moins faiblement FXR. Ces molécules servent alors de
base à la production de composés dérivés qui sont alors testés afin de déterminer la forme plus
à même d’induire FXR. A la différence des précédents, ceux-ci ne sont pas dérivés de la
structure d’un AB et sont donc définis comme non stéroïdiens.
Ainsi la molécule TTNPB, un composé de type rétinoïde capable d’activer très
faiblement FXR, a servi de structure de base à la synthèse de nombreux dérivés. Parmi ceux-
ci le composé GW4064 a été identifié comme un activateur sélectif et très puissant de FXR, à
la fois in vitro et in vivo (Maloney et al., 2000). À ce jour, il est considéré comme le composé
de référence. Néanmoins, cette molécule possède deux défauts majeurs qui l’ont exclu d’un
possible développement clinique. Tout d’abord, le GW4064, de part sa structure chimique de
type stilbéne, est photosensible. Or ceci est associé à une potentielle toxicité cellulaire. De
plus, le GW4064 est très faiblement bio-disponible, son absorption au niveau intestinal étant
de moins de 10% (Sepe et al., 2015)(Sepe et al., 2018).
Suite à une analyse portant sur une bibliothèque de produits naturels, il a été déterminé
qu’une structure de type benzopyrane pouvait activer FXR. Des dérivés de celle-ci ont donc
été analysés, ce qui a permis de valider un nouveau ligand synthétique nommé fexaramine
(Downes et al., 2003). Ce composé a la particularité, lorsqu’il est administré par voie orale,
d’être très faiblement absorbé par l’intestin et de ne pas passer par la suite dans la circulation
sanguine. La fexaramine est donc un activateur sélectif de FXR au niveau intestinal (Sepe et
al., 2015)(Sepe et al., 2018).
De même, l’identification de la molécule azepino[4,5b]indole comme composé de
base a permis de développer le WAY362450 (Flatt et al., 2009). Ce composé présente
l’intérêt d’être bio-disponible. Il peut donc agir dans tout l’organisme après son ingestion par
voie orale (Sepe et al., 2015)(Sepe et al., 2018).
Ces quatre ligands synthétiques (Figure 34) représentent les principaux composés
couramment utilisés en recherche pour étudier l’action de FXR. Ils ont également servi, par la
suite, de base à la synthèse d’autres molécules dont plusieurs sont actuellement en cours de

111
développement préclinique ou clinique (phase I à III). L’objectif des ces différents dérivés est
d’une part de résoudre les limites imposées par le composé initial, comme par exemple pour
le GW4064 la faible bio-disponibilité, et d’autre part de développer des composés de type
SBARMs permettant de cibler des actions spécifiques de FXR (Sepe et al., 2018).

Figure 34 : Structure chimique des principaux ligands de FXR (d’après, (Sepe et al., 2015)).

(3) Modulateurs sélectifs de FXR (SBARMs) :

Une étude effectuée sur des hépatocytes primaires humains, a permis de déterminer les
profils d’expression génique associés à l’activation de FXR par trois de ses ligands : le
CDCA, le GW4064 et la fexaramine. Chacun des ces composés présentent un profil
différents. Ceci suggère que chaque ligand agit comme un modulateur sélectif de FXR selon
le concept de SBARMs. Néanmoins, comme les hépatocytes primaires maintiennent leurs
capacités à produire les ABs, la modulation de la synthèse de ces ligands endogènes par les
divers traitements peut également expliquer les différences observées (Downes et al., 2003).
De même l’activation de FXR par différents sous-types d’ABs entraine des réponses
différentes suggérant que les variations de la composition du mélange en ABs pourraient
moduler la réponse de FXR au niveau de l’organisme, chacun de ces ligands naturels de FXR
agissant comme un SBARM (Vaquero et al., 2013). Potentiellement, cette sélectivité des
différents ligands pourrait donc être utilisée afin de diriger l’action de FXR sur un sous-
ensemble de gènes cibles d’intérêts, afin d’éviter, par exemple, des effets secondaires
délétères (Modica et al., 2010).

112
 (4) Antagonistes naturels et synthétiques :

Si la majorité des recherches a été orientée vers la découverte et l’optimisation

d’agonistes de FXR, quelques études ont identifié des composés naturels réprimant son
action. Ces molécules antagonistes ont ensuite servi de bases pour mettre au point des
composés synthétiques présentant une action ou une spécificité plus importante. Ceux-ci sont
de type stéroïdien lorsque leur base provient d’un AB ou non-stéroïdien dans le cas contraire
(Sepe et al., 2018).
Chez la souris, les acides muricholiques (MCA) alpha et beta conjugués à la taurine
ont ainsi été identifiés comme des antagonistes naturels. Ces ABs n’agissent sur FXR que si
ils sont tauro-conjugués. Leur chaine latérale doit donc jouer un rôle important dans cette
fonction (Di Leva et al., 2013). Différentes modifications du MCA ont permis de générer un
antagoniste synthétique stéroïdien de FXR plus puissant, le glyco-beta-muricholique acide
(GMCA)(Gonzalez et al., 2016).
Au niveau des antagonistes non stéroïdiens, la plupart des recherches se sont
concentrées sur des composés de base à structure aromatique. Quelques molécules ont
également été identifiées à partir d’extraits naturels (Lefebvre et al., 2009)(Sepe et al.,
2015)(Sepe et al., 2018). Par exemple, la molécule de guggulstérone issue d’une plante
utilisée dans la médecine traditionnelle chinoise (Wu et al., 2002).

c) FXR et métabolisme hépatique:

La capacité des ABs à réguler leurs propres synthèses est connue depuis de nombreuses
années. La découverte que ces derniers étaient des ligands endogènes de FXR a permis de
mettre en évidence le rôle majeur de ce RN dans la régulation du métabolisme des ABs. FXR
est d’ailleurs essentiellement exprimé au niveau du foie et de l’intestin, les deux principaux
organes régulant le cycle entéro-hépatique des ABs. Néanmoins, le rôle de FXR ne se limite
pas à son action sur ce métabolisme. Au niveau hépatique, FXR est impliqué dans la
régulation de l’inflammation, de la prolifération cellulaire (notamment la régénération
hépatique) ainsi que dans le contrôle des métabolismes des trois classes de nutriments
(aminoacides, lipides et glucose).

113
 i) FXR et métabolisme des ABs :

FXR est un acteur majeur du cycle entéro-hépatique des ABs, notamment au niveau
des deux organes principaux de ce cycle : l’intestin et le foie. Au niveau hépatique, FXR agit
à différents niveaux : en régulant les expressions de transporteurs des ABs, d’enzymes
responsables de leurs synthèses ou capables de les modifier ultérieurement.

ii) FXR, transport des ABs et détoxification :

A chacune des étapes du cycle entéro-hépatique, FXR va intervenir dans la régulation

de l’expression des principaux transporteurs. Son action consiste à maximiser le recyclage des
ABs dont la production nécessite un fort coup énergétique, et de prévenir une accumulation
toxique des ces derniers dans les organes.

(1) FXR et transport des ABs au niveau intestinal :

Les ABs secrétés par la vésicule biliaire, notamment après un repas, vont être
activement réabsorbés par le transporteur ASBT exprimé sur les membranes apicales des
entérocytes. L’entrée des ABs dans ces cellules va activer FXR qui induit à son tour
l’expression d’IBABP (Grober et al., 1999). Ce dernier va prendre en charge les ABs, les
transporter de la face apicale au coté basolatéral de la cellule tout en réduisant leurs toxicités.
FXR augmente également l’expression des deux composantes du complexe OSTα / OSTβ
(Lee et al., 2006), ce qui favorise l’export des ABs au niveau de la veine porte. Enfin, FXR
induit l’expression de SHP qui agit comme répresseur de la transcription en interagissant avec
plusieurs RNs. De nombreuses actions de FXR s’effectuent via SHP. Au niveau des
entérocytes, SHP réprime l’expression d’ASBT (Chen et al., 2003)(Neimark et al., 2004),
diminuant ainsi la réabsorption, par les entérocytes, des ABs de la lumière intestinale. Ceci
permet également de prévenir leurs accumulations au niveau cellulaire (Figure 35) (Li &
Chiang, 2014).

(2) FXR, transport des ABs au niveau hépatique et détoxification:

Les ABs ainsi réabsorbés vont circuler via la veine porte jusqu’au foie où le
transporteur NTCP, exprimé au niveau des hépatocytes, prend en charge leurs captations. De
nouveau, l’activation de FXR va permettre d’augmenter le flux des ABs au travers des

114
cellules afin d’éviter que leurs concentrations intracellulaires ne dépassent le seuil de toxicité.
Pour cela, FXR induit les expressions d’ABCB4 (MDR3 chez l’homme, Mdr2 chez la souris)
(Liu et al., 2003), de BSEP (ABCB11) (Ananthanarayanan et al., 2001) et de MRP2
(ABCC2) (Kast et al., 2002), ce qui augmente l’efflux des ABs vers les canalicules biliaires.
FXR induit également les expressions de ABCG5/ABCG8 (Li et al., 2011), complexe
favorisant l’excrétion du cholestérol dans ces canalicules. De manière générale, il apparait que
FXR coordonne la sécrétion de différentes composantes de la bile (ABs, cholestérol et
phospholipides), ce qui permet de prévenir la formation de calculs biliaires et tous dommages
aux niveaux des canalicules et canaux biliaires (Moschetta et al., 2004)(Wittenburg et al.,
2003). De plus, FXR augmente l’expression du complexe OST / OST (Lee et al., 2006) et
également chez l’homme de OATP1B3 (Jung et al., 2002), ce qui permet, si nécessaire, la
sécrétion des ABs vers la circulation périphérique (Figure 35).
FXR régule les expressions d’un certain nombre d’enzymes impliquées dans le
métabolisme hépatique de détoxification. Classiquement, ce processus d’élimination des
substances néfastes à l’organisme est divisé en trois grandes phases : la phase I permet
l’hydroxylation du composé à détoxifier, la phase II la conjugaison de ce dernier avec une
protéine. Ces deux étapes permettent de transformer un composé souvent très hydrophile en
une molécule soluble plus facile à éliminer. La phase III consiste en un transport actif du
composé afin qu’il soit évacué par les urines ou les fèces (Modica et al., 2009). Ainsi, FXR
induit l’expression de l’enzyme CYP3A4 (Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member
4) , Cyp3a11 chez la souris (Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 11)
(Gnerre et al., 2004), qui catalyse la première réaction de la phase I. Les expressions des
enzymes de type UGTs (UGT2B4) (Barbier et al., 2003), SULTs (Sulfotransférases,
principalement SULT2A1) (Song et al., 2001) et GSTs (Glutathione S-transferases) (Lee et
al., 2010) de la phase II, sont également régulées par FXR. Les protéines UGTs et SULTs
agissent sur les ABs les plus toxiques en leurs conjuguant respectivement des composés
glucuronides et sulfates. Ceci permet de les orienter vers une élimination via les urines ou les
fèces. L’activation de FXR va induire également les expressions des enzymes impliquées dans
la conjugaison des ABs à la taurine ou la glycine (BACS et BAAT) (Pircher et al., 2003).
Ceci a pour effet de favoriser leurs sécrétions dans les canalicules biliaires et de diminuer
leurs toxicités en augmentant leurs solubilités. De plus, la régulation des expressions des
transporteurs décrite précédemment peut également être considérée comme une induction de
la phase III de la détoxification hépatique (Modica et al., 2009) (Figure 35).

115
 Enfin, il a été démontré chez la souris que l’activation de FXR induisait la
transcription du RN PXR (Jung et al., 2006). Ce dernier joue un rôle majeur dans la réponse
de l’organisme aux composés toxiques. Parmis les gènes cibles de PXR, se trouvent les
enzymes et les transporteurs décrits précédemment. Néanmoins, si FXR est activé par des
concentrations en ABs de l’ordre du nanomolaire, PXR ne l’est qu’à des concentrations de
l’ordre du micromolaire ce qui est associé à des situations pathologiques (Matic et al., 2007).
L’induction de PXR par FXR interviendrait donc plutôt dans des conditions où le processus
de prise en charge physiologique des ABs est saturé (Lee et al., 2010).
Enfin, l’activation de FXR va entrainer, via SHP, la répression du transporteur NTCP
(Denson et al., 2001). Ceci permet de diminuer l’entrée des ABs, présents au niveau de la
veine porte, dans les hépatocytes (Figure 35).

Figure 35 : Actions de FXR sur le transport des ABs et sur leurs détoxifications.
Flèches bleues : gènes activés.
Traits rouges : gènes inhibés.

L’action globale de FXR, au niveau de l’intestin et du foie est donc similaire. En

réprimant d’un coté les transporteurs permettant leurs entrées dans la cellule et en activant
d’un autre coté ceux permettant leurs sécrétions, l’activation de FXR augmente le flux des

116
ABs. Ceci permet d’écourter leurs temps de présence au niveau intracellulaire. À cela s’ajoute
l’induction par FXR de la prise en charge des ABs dans les entérocytes et de leurs
détoxifications dans les hépatocytes. L’ensemble de ces actions contribue à protéger les
cellules des effets délétères des ABs (Mazuy et al., 2014)(Martinot et al., 2017).

iii) FXR et régulation de la synthèse des ABs :

Comme c’est le cas pour un grand nombre de voies métaboliques, les ABs en tant que
produits finaux sont les principaux inhibiteurs de leurs propres synthèses. Pour cela, ils
agissent principalement via la répression de l’expression de CYP7A1. Cette action des ABs
est quasiment identique chez l’homme et les rongeurs et est essentiellement contrôlée par
FXR (Chiang, 2013).

Ce RN va agir à deux niveaux :

Au niveau hépatique, l’activation de FXR suite à la réabsorption des ABs va induire la

transcription de SHP. Ce dernier va ensuite réprimer celle de CYP7A1 au niveau de son
promoteur. D’une part SHP va interagir avec LRH-1 et inhiber son activité de trans-
activation, d’autre part, SHP va entrer en compétition avec PGC1a dans l’établissement
d’interactions avec HNF4a ce qui va également réduire la transcription du gène CYP7A1
(Figure 36)(Goodwin et al., 2000)(Lu et al., 2000).
Au niveau de l’intestin, plus précisément les entérocytes, les ABs réabsorbés vont
activer FXR, ce dernier va induire directement la transcription de FGF19 (Fibroblast Growth
Factor 19) chez l’homme et de Fgf15 chez le rongeur. Le site de fixation de FXR est conservé
sur les promoteurs de ces deux gènes (Holt et al., 2003)(Inagaki et al., 2005). Ces deux
facteurs de croissance sont atypiques puisqu’ils vont agir comme des hormones. Initialement,
ils ont été nommés différemment car ils ne présentent que 50% d’homologie au niveau de
leurs séquences protéiques. Néanmoins, il a été depuis démontré qu’ils étaient bien des
protéines orthologues, c'est-à-dire présentant la même fonction dans deux espèces différentes
(Kliewer & Mangelsdorf, 2015). Les facteurs FGF15/19 vont être secrétés au niveau de la
veine porte par les entérocytes. Ils vont atteindre par cette voie le foie où ils vont agir suite à
leurs fixations au complexe formé par le récepteur de surface (de type tyrosine kinase)
FGFR4 (FGF Receptor 4) (Inagaki et al., 2005) et la protéine transmembranaire -Khloto
(Lin et al., 2007). L’activation de ce complexe va entrainer celle d’une voie de signalisation

117
impliquant notamment les kinases ERK et JNK (Jun N-terminal Kinase) qui, au final, aboutit
à la répression de CYP7A1 (Figure 36) (Song et al., 2009). Cette voie de signalisation agit
également au travers de SHP. En effet, la répression de CYP7A1 induite par le FGF15/19
n’est que partielle dans un modèle de souris déficientes en SHP (Shp-/-) (Inagaki et al., 2005).
Néanmoins, le traitement au FGF19 ne modifie ni l’expression de SHP, ni sa capacité à se
fixer au niveau du promoteur de Cyp7a1. L’action de SHP au sein de cette voie consisterait à
recruter différents corépresseurs augmentant ainsi la répression du gène CYP7A1 (Kir et al.,
2012). Au final, l’action de FGF15/19 est largement indépendante de SHP. 15% seulement de
la répression de CYP7A1 par cette voie lui est associé (Inagaki et al., 2005)(Kir et al.,
2012)(Kliewer & Mangelsdorf, 2015)(Mazuy et al., 2014).
De plus, il a été montré, chez la souris et au niveau hépatique, que FXR était capable
d’activer directement l’expression génique de -Khloto et celle protéique en résultant. Ceci
entraine une augmentation de l’expression protéique de FGFR4 suite à sa stabilisation au sein
du complexe formé avec -Khloto. L’activation au préalable de FXR au niveau du foie
permet donc d’augmenter l’action de FGF15 (Fu et al., 2016). Physiologiquement, les actions
des ABs et de FGF15/19 sont inscrites dans une logique temporelle. Chez l’homme, la
concentration en ABs au niveau de la veine porte atteint son maximum 15 à 60 minutes après
un repas (Angelin et al., 1982), celle de FGF19 culmine au bout de trois heures (Lundåsen et
al., 2006). Chez la souris, les inductions des expressions géniques de Fgf15 (intestinal) et -
Khloto (hépatique) ont lieu simultanément et atteignent un pic après six heures de traitement
avec un ligand synthétique (GW4064) de FXR (Fu et al., 2016) (Figure 36).
Chez l’homme, contrairement à la souris, FXR est également capable d’activer
directement, au niveau hépatique, l’expression de FGF19 (Fgf15 n’étant pas exprimé au
niveau des hépatocytes murins). La protéine, ainsi produite, est sécrétée et fonctionnelle
puisqu’elle est capable d’activer le complexe FGFR4/-Khloto dans des conditions où les
hépatocytes ont été isolés. Chez l’homme l’action de FGF19 est donc à la fois de type
endocrine et autocrine, l’action de FGF15 chez la souris n’étant qu’endocrine (Figure 36)
(Song et al., 2009).

118
 Figure 36 : Mécanismes de répression de l’expression génique de CYP7A1 dépendante de FXR.
Flèches bleues : gènes activés.
Flèches noires : actions indirectes.

Les contributions relatives des actions dépendantes de SHP comparées à celles initiées
par FGF15/19 sur la répression de CYP7A1 sont toujours débattues. La voie FGF15/19
permettrait la régulation de la synthèse des ABs par le statut nutritionnel. En effet, chez
l’homme (Lundåsen et al., 2006) et la souris (Han et al., 2015) le niveau d’expression
hépatique de CYP7A1 et les concentrations plasmatiques en FGF15/19, au cours d’un cycle
jour/nuit, sont parfaitement et inversement corrélées. De plus, le maintien de la répression de
CYP7A1 via FGF15 dans les souris Shp-/- semble indiquer qu’au niveau physiologique
l’action initiée par FGF15/19, au niveau de l’intestin, serait la plus importante (Inagaki et al.,
2005). Le mécanisme de répression de CYP7A1 via l’induction hépatique de SHP (mais aussi
l’induction au niveau du foie de FGF19 chez l’homme) serait plutôt un mécanisme de
protection hépatique permettant d’éviter une accumulation toxique des ABs. Ce qui semble
confirmer par le fait que, chez l’homme, l’induction de l’expression hépatique de SHP par les
ABs ou un ligand synthétique de FXR est transitoire alors que celle intestinale de FGF19, par
les mêmes composés, est beaucoup plus soutenue (Chiang, 2009)(Gälman et al., 2005)(Zhang
et al., 2011).

119
 La synthèse des ABs est également régulée par FXR au niveau d’autres enzymes de la
voie : CYP27A1 et CYP7B1 qui initient la voie alternative de synthèse et CYP8B1 qui
contrôle le ratio en CDCA/CA de la voie classique.
Chez l’homme, il a été démontré que l’activation de FXR diminuait l’expression de
CYP27A1 via un mécanisme impliquant la répression de l’activité transcriptionnelle de
HNF4a par SHP (Chen & Chiang, 2003).
Chez la souris, un nouveau gène cible hépatique de FXR a été mis en évidence. Il
s’agit du facteur de transcription MAFG (V-Maf Avian Musculoaponeurotic Fibrosarcoma
Oncogen Homolog G). L’augmentation de l’expression de ce dernier entraine la répression
d’un certains nombres de gènes impliqués dans le métabolisme des ABs, tels que Cyp27a1,
Cyp7b1, Cyp8b1 ou Ntcp. Néanmoins, cette voie FXR-MAFG, n’a aucun effet sur
l’expression de CYP7A1. Elle permettrait donc de réguler à la fois la voie alternative de
synthèse mais aussi le ratio CDCA/CA et donc la composition et le niveau d’hydrophobicité
du mélange en ABs de l’organisme, sans en modifier la taille (c'est-à-dire la quantité) (de
Aguiar Vallim et al., 2015).
Enfin, chez la souris l’expression de Cyp8b1 est réprimée par la voie intestinale FXR-
FGF15 et la voie hépatique FXR-SHP au travers des mêmes mécanismes que précédemment
décrits pour CYP7A1. Néanmoins, l’action des voies FXR-FGF15 et FXR-SHP seraient, dans
ce cas, relativement de la même importance (Kong et al., 2012). Au niveau physiologique, le
rôle hépatique de FXR serait donc plutôt de maintenir le niveau d’hydrophobicité du pool
d’ABs en agissant sur le ratio CDCA/CA au travers de la régulation de CYP8B1 que de
contrôler la quantité d’ABs produite via la régulation de CYP7A1(Chiang, 2013)(Modica et
al., 2010). Néanmoins chez l’homme, il semblerait que l’expression de CYP8B1 ne soit pas
réprimée mais induite par FXR suite à son activation par les ABs. Cette enzyme serait donc
régulée de manière espèce spécifique (Sanyal et al., 2007).

iv) FXR, inflammation, régénération hépatique et cancer :

(1) Rôle de FXR dans la régulation de l’inflammation :

La coordination entre le métabolisme énergétique et le système immunitaire est un

processus essentiel et extrêmement conservé au cours de l’évolution. La mise en place des
défenses immunitaires est un procédé qui nécessite une grande quantité d’énergie. Il n’est
donc pas surprenant que la malnutrition ou une longue période de jeûne diminue son
efficacité. A l’inverse, l’excès de nutriments est connu comme étant associé à une

120
inflammation chronique qui reflète une activation anormale des défenses naturelles de
l’organisme. Le fait que des RNs impliqués dans la réponse aux nutriments puissent moduler
au moins indirectement la réponse immunitaire, n’est donc pas surprenant (Alwarawrah et al.,
2018).
C’est le cas de FXR qui de part son action sur les métabolismes énergétiques (acides
aminés, lipides et glucose qui seront développés par la suite), a une action globale anti-
inflammatoire. De même, en évitant l’accumulation toxique des ABs l’activation de FXR
permet indirectement de réduire l’inflammation associée à ce type de dommage (Shaik et al.,
2015). Ainsi, il a été observé une augmentation des facteurs pro-inflammatoires au niveau du
foie et du colon de souris déficientes en FXR (Fxr-/-) par rapport aux souris contrôles. Ces
animaux présentent également au niveau du foie, une plus grande proportion de macrophages
infiltrés (Kim et al., 2007)(Liu et al., 2012). De même au niveau intestinal, FXR est impliqué
dans la mise en place des défenses antibactériennes et dans le maintien de la barrière
épithéliale qui protège l’organisme de l’intrusion, de germes ou d’antigènes extérieurs. Ainsi,
les souris Fxr-/- présentent une réponse inflammatoire incontrôlée et une barrière épithéliale
détériorée (Gadaleta et al., 2011)(Vavassori et al., 2009). A l’inverse, il a été montré, dans
différents modèles d’inflammations chronique ou aiguë, que l’activation de FXR permettait
de protéger l’organisme (Liu et al., 2018)(Shaik et al., 2015).
L’action anti-inflammatoire de FXR peut être associée à sa capacité à réguler
directement certains de ses gènes cibles. Au niveau hépatique, chez la souris, deux
mécanismes ont été identifiés :
- L’activation de FXR inhibe par un mécanisme de trans-répression, l’activation de gènes
pro-inflammatoires induit par le facteur de transcription NF--b (Nuclear Factor Kappa b)
(Wang et al., 2008).
- Les ligands de FXR (CDCA et GW4064) induisent l’expression de SOCS3 (suppressor of
cytokine signaling 3) réprimant ainsi l’inflammation (Xu et al., 2012).

(2) Rôle de FXR dans la prolifération et la régénération hépatique :

Comme décrit précédemment, une des particularités du foie, en tant qu’organe, est sa
grande capacité à se régénérer suite à sa destruction partielle. Celle-ci peut résulter de
dommages infligés par des composés toxiques ou suite à une hépatectomie partielle.
La régénération hépatique implique différents processus qui permettent une régulation
fine de la prolifération cellulaire et l’arrêt de cette dernière lorsque le foie a atteint sa taille

121
initiale. Ceux-ci sont modulés par trois types de composés : des facteurs de croissance, des
médiateurs de la réponse inflammatoire et des métabolites. Ainsi, après une hépatectomie
partielle, la concentration de nombreux éléments secrétés ou captés par le foie dans le flux
sanguin, respectivement chute ou augmente brutalement. Toutes ces variations peuvent servir
de signaux activant la prolifération hépatocytaire. C’est le cas, par exemple de la chute de la
glycémie ou de l’apparition d’une stéatose hépatique transitoire (Fausto et al., 2012)(Huang &
Rudnick, 2014). De même, la surcharge hépatique en ABs, qui apparaît immédiatement après
une hépatectomie partielle, va induire la prolifération des hépatocytes (Doignon et al., 2011).
Ainsi, il a été montré chez la souris que l’ajout de CA à l’alimentation après une hépatectomie
partielle est associé à une augmentation de la prolifération des hépatocytes accélérant le
processus de régénération. Un régime incluant des résines séquestrantes, c’est à dire bloquant
la réabsorption intestinale des ABs, entraine un effet diamétralement opposé (Naugler, 2014).
Néanmoins, si la partie de foie restante est trop faible, cette surcharge en ABs va se révéler
délétère. Le foie n’étant plus en mesure d’assurer sa propre protection (Huang et al., 2006).
Cette action des ABs sur le processus de régénération hépatique implique FXR. Après
hépatectomie partielle ou suite à un traitement toxique aiguë, les souris Fxr-/- présentent une
forte mortalité et une capacité de réparation des tissus diminuée (Huang et al., 2006). Dans
ces mêmes conditions, l’activation de FXR protège le foie d’une accumulation excessive
d’ABs, ce qui favorise la régénération hépatique (Csanaky et al., 2009). FXR peut également
augmenter la prolifération cellulaire en induisant directement, au cours de la régénération
hépatique, le gène Foxm1b (Forkhead box protein M1 isoform B), un élément clef de la
régulation du cycle cellulaire (Chen et al., 2010)(Huang et al., 2006). Un autre gène cible
hépatique de FXR, FGF21 (Fibroblast Growth Factor 21) (Cyphert et al., 2012) a été identifié
comme possédant une action pro-régénérative et protectrice vis-à-vis de la surcharge en ABs
dans un contexte d’hépatectomie partielle. Néanmoins dans l’article correspondant, son action
est associée à la déficience en PPAR , un autre RN connu comme régulant son expression
(Liu et al., 2015).
De plus, le maintien de l’action globale de FXR au niveau du cycle entéro-hépatique
des ABs est nécessaire au bon fonctionnement du processus de régénération. Ainsi, il a été
montré, dans des modèles murins, que la déplétion de FXR uniquement au niveau hépatique
l(Fxr-/-), mais aussi celle uniquement intestinale i(Fxr-/-), diminuait la capacité du foie à se
régénérer (Borude et al., 2012)(Zhang et al., 2012). Le facteur de croissance FGF15/19, dont
l’expression est induite par FXR au niveau intestinal, de part sa capacité à inhiber CYP7A1, a
un rôle hépato-protecteur évident (Alvarez-Sola et al., 2017)(Massafra et al., 2017). De plus,

122
des études ont montré que la régénération hépatique était retardée dans un modèle de souris
déficientes en FGF15 (Uriarte et al., 2013). Ces souris présentent également une diminution
de l’expression de FOXM1b, ce qui indique que ce facteur contribue à la régulation de ce
gène (Kong et al., 2014). Enfin, FGF15/19 stimule directement la prolifération des
hépatocytes et joue donc un rôle pro-régénératif au niveau du foie (Uriarte et al., 2013).
Néanmoins, il a été montré que la captation des ABs au niveau des entérocytes est diminuée
suite à une hépatectomie partielle (Merlen et al., 2017). Ce qui ne semble pas cohérent avec
l’induction de l’expression de FGF15/19 par FXR dans ces conditions. De plus, le processus
de régénération hépatique n’est absolument pas perturbé dans un modèle de souris déficientes
en FGFR4 (le récepteur de FGF15/19) (Yu et al., 2000). Ceci pourrait s’expliquer par un
mécanisme de compensation qui aurait lieu dans ce modèle de souris. FGF15 maintiendrait
son action en activant d’autres récepteurs, FGFR1 et FGFR2, également exprimés, bien que
très faiblement par rapport à FGFR4, au niveau des hépatocytes (Padrissa-Altés et al., 2015).
Les mécanismes précis par lesquels la sécrétion de FGF15/19 serait induite suite à une
hépatectomie partielle et les voies par lesquelles ce facteur de croissance participerait à la
régénération hépatique restent donc encore à explorer (Alvarez-Sola et al., 2018).
Enfin, Il semblerait que FXR soit également impliqué dans le mécanisme permettant
l’arrêt de la croissance du foie. Une équipe a mis au point un modèle murin dans lequel la
régénération hépatique n’est pas stoppée. Ainsi, suite à l’activation de cette dernière par
hépatectomie partielle ou traitement avec un composé hépato-toxique, les foies de ces souris
poursuivent leurs croissances même après avoir atteint leurs tailles initiales. Or dans ce
modèle, les expressions géniques et protéiques de FXR sont diminuées. Cette perte du
contrôle de la prolifération des hépatocytes est à relier avec le rôle joué par FXR dans
l’apparition d’hépato-carcinomes (Jin et al., 2015).

(3) FXR et Cancers hépatiques :

La dérégulation de l’action de FXR est fortement associée à l’apparition de tumeurs

hépatiques. Notamment, les souris Fxr-/- développent spontanément des cellules cancéreuses
en vieillissant (Kim et al., 2007)(Yang et al., 2007).
Plusieurs études ont ainsi démontré que FXR avait un rôle protecteur vis-à-vis de
l’apparition de tumeurs, et notamment au niveau hépatique (Figure 37).
De part son action sur le contrôle du métabolisme des ABs, FXR protège le foie de
leurs accumulations toxique. Lorsque l’action de FXR est dérégulée, l’élévation chronique en

123
ABs induit des dommages oxydatifs au niveau de l’ADN, de l’inflammation, une résistance à
l’apoptose et une hyper prolifération des hépatocytes (Perez & Briz, 2009). Ainsi, il a été mis
en évidence que l’action protectrice de FXR était associée à SHP et BSEP, deux de ses gènes
cibles directs. Ainsi, les souris Shp-/- présentent également une apparition spontanée
d’hépato-carcinomes en vieillissant (Zhang et al., 2008). Au niveau de biopsies de cellules
tumorales humaines, il est observé une forte répression des expressions de FXR et SHP (Su et
al., 2012). Néanmoins, ces deux RNs ont des actions différentes. Ainsi, la restauration de
l’expression de SHP dans un contexte de souris Fxr-/- n’affecte ni le taux d’apparition, ni la
taille des tumeurs. Elle permet cependant de diminuer la dysplasie hépatocellulaire (des
anomalies du développement des cellules, considérées comme précancéreuses), de réduire le
niveau d’inflammation et d’augmenter l’apoptose des cellules cancéreuses. Les effets associés
à l’induction de l’expression de SHP ne constituent donc qu’une partie de l’action anti-
tumorale médiée par FXR (Li et al., 2013).
Un défaut d’expression de BSEP est associé à une cholestase sévère et à l’apparition
de cancers hépatiques chez l’enfant (Strautnieks et al., 2008). De même son expression est
fortement réprimée dans des biopsies d’hépato-carcinomes humains (Chen et al., 2013).
L’action anti-inflammatoire de FXR est protectrice vis-à-vis de la carcinogénèse. En
effet, le maintien d’une inflammation chronique est associé à un risque accru d’apparition de
tumeurs (Grivennikov & Karin, 2010)(Li et al., 2013).
Des gènes cibles de FXR impliqués spécifiquement dans l’apparition de cancers ont
été identifiés: un des premiers événements entrainant le développement d’hépato-carcinomes,
est la répression de protéines qualifiées de « suppresseurs de tumeurs ». Ainsi, la gankyrine a
été identifiée comme déclenchant la dégradation de ce type de protéines. L’augmentation de
son expression est associée à de nombreux types de cancer (D'Souza et al., 2018)(Peterlik,
2008). Or, FXR se fixe sur le promoteur de la gankyrine et réprime ainsi l’expression de cette
dernière (Jiang et al., 2013)(Valanejad et al., 2017). De même, FXR induit l’expression de
NDRG2 (N-myc Dowstream-Regulated Gene 2) (Deuschle et al., 2012)(Langhi et al., 2013),
une protéine de type « suppresseur de tumeur » bien connue (Lee et al., 2008). FXR induit
également l’expression du micro-ARN miR-122 (He et al., 2015) qui a un rôle important de
suppression de tumeurs au niveau hépatique, en ciblant notamment des gènes impliqués dans
la prolifération, la différenciation, l’apoptose et l’angiogenèse. Son expression est d’ailleurs
fortement réprimée dans les hépato-carcinomes (Huang et al., 2015).

124
 Figure 37: Actions anti-tumorales de FXR.
Flèches bleues : activation par action directe de FXR. Traits bleus : répression par action directe de FXR.
Flèches vertes : activation. Traits rouges : répression, d’après (Gadaleta et al., 2015)(Tsai et al., 2012).

Les acides aminés sont des éléments essentiels à la production de biomasse. C’est
pourquoi, les cellules cancéreuses expriment fortement de nombreux transporteurs de ces
derniers, afin de soutenir leurs croissances rapides. ASCT2 (Alanine-Serine-Cysteine
transporter 2 / SLC1A5) a été identifié comme l’un de ces transporteurs pro-tumoral,
notamment dans des hépato-carcinomes. Son action consiste à maintenir un fort niveau de
captation de la glutamine. ASCT2 n’est d’ailleurs pas exprimé dans les hépatocytes sains, le
transport de la glutamine étant assuré par un autre transporteur (SNAT3/SLC38A3)
(Cormerais et al., 2018)(McGivan & Bungard, 2007). ASCT2 a été identifié comme régulé
par FXR dans la lignée humaine d’hépato-carcinome HepG2. Dans ce cas, FXR induirait la
prolifération tumorale en favorisant le transport de la glutamine. Ceci est donc contradictoire
avec son rôle anti-tumoral précédemment décrit. Néanmoins, FXR n’augmente pas
l’expression d’ASCT2 en présence de CDCA mais seulement via l’augmentation de son
expression, elle-même induite par la glutamine. FXR régule donc ASCT2 de manière
indépendante à son activation par son ligand. Bien qu’étudiée dans un contexte d’hépato-

125
carcinome, cette action de FXR serait peut être plutôt à associer au rôle joué par ce dernier
dans la régulation de la prolifération lors de la régénération hépatique (Bungard & McGivan,
2005).

v) Rôle de FXR dans le métabolisme des acides aminés :

Les études à l’échelle génomique des différents sites de fixation de FXR ont permis de
mettre en évidence sa capacité à potentiellement réguler des voies métaboliques jusqu’ici
insoupçonnées. Ces travaux ont notamment identifiés la présence de sites de fixation de FXR
associés à différents gènes impliqués dans la régulation du métabolisme des acides aminés
(Chong et al., 2010)(Thomas et al., 2010).
Plusieurs études ont donc porté sur l’évaluation du rôle hépatique de FXR dans la
régulation de ce métabolisme. Ces dernières se sont orientées plus précisément sur
l’implication de FXR dans le catabolisme des acides aminés, dans la synthèse et le transport
de la glutamine et dans la production d’urée (uréogenèse). En effet, ces voies métaboliques
sont importantes car elles permettent à l’organisme d’éliminer les aminoacides excédentaires
et surtout leurs produits de dégradation toxiques, l’ammonium et le glutamate. Ceci s’effectue
notamment via la transformation de ces deux composés en une forme non toxique la
glutamine. L’ammonium et le glutamate produits par les tissus périphériques sont évacués
sous cette forme dans la circulation sanguine. Le foie va alors capter cette glutamine par
l’intermédiaire de transporteurs spécialisés. L’ammonium, le glutamate et la glutamine
hépatique servent alors à la production d’urée. Celle-ci va être sécrétée dans la circulation,
prise en charge par les reins et au final éliminée dans les urines. Le foie a un rôle majeur dans
le métabolisme des acides aminés car il est le seul organe à réaliser l’uréogenèse, processus
final permettant l’élimination par l’organisme de ses produits de dégradation (Massafra & van
Mil, 2018).
Une étude en protéomique a ainsi confirmé, in vivo chez la souris, que l’activation de
FXR, au niveau hépatique, par un agoniste (6E-CDCA) était bien associée à une augmentation
des expressions protéiques d’enzymes impliquées dans la dégradation des aminoacides et dans
le cycle de l’urée (Gardmo et al., 2011). Une autre étude confirme l’implication de FXR dans
la régulation de ces voies métaboliques. Ainsi, chez la souris, l’activation in vivo de FXR par
le 6E-CDCA augmente les expressions protéiques hépatiques d’enzymes impliquées dans le
catabolisme des aminoacides et la détoxification de l’ammonium et du glutamate via les
synthèses de glutamine et d’urée. Ces résultats ont été confirmés, par la mesure des

126
expressions géniques, dans des hépatocytes primaires de rats (Massafra et al., 2017). Ces
travaux complètent les données obtenues dans des MPHs démontrant la capacité de FXR à
induire des gènes impliqués dans les métabolismes du glutamate et de la glutamine (enzymes
et transporteurs) (Renga et al., 2011). Enfin par « effet-miroir », les souris Fxr-/- présentent
une hyperammonémie plasmatique associée à une diminution des expressions géniques des
enzymes hépatiques régulant la détoxification de l’ammonium. Ces souris ont également un
taux réduit d’urée sanguin corrélé à une synthèse hépatique de celle-ci diminuée par rapport
aux souris contrôles (Massafra et al., 2017)(Renga et al., 2011).

vi) Rôle de FXR dans le métabolisme des lipides :

L’implication de FXR dans la régulation du métabolisme lipidique hépatique est assez

bien caractérisée. De plus, son rôle évolue selon le statut nutritionnel.
Lors de la phase postprandiale, l’action de FXR consiste à réduire la concentration
sanguine en TGs via son action sur le métabolisme des lipoprotéines. L’activation de FXR va
promouvoir la captation par le foie des TGs plasmatiques suite l’induction de l’expression
génique de l’ApoCII (Apolipoprotein CII) (Kast et al., 2001) et la répression de celle de
l’ApoCIII (Apolipoprotein CIII) (Claudel et al., 2003). Dans ces conditions, FXR réduit
également la production hépatique de VLDLs, en inhibant via SHP l’action d’HNF4a
(Hirokane et al., 2004) ainsi que leurs sécrétions dans la circulation sanguine (Bilz et al.,
2006).
Lors de la phase inter-prandiale, l’action de FXR consiste à diminuer l’accumulation
de TGs (ou stéatose) au niveau hépatique. L’activation de FXR inhibe, via SHP, l’action de
SREBP1c (Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1 isoform c), un FT responsable de
l’activation des gènes de la lipogenèse, notamment ACC et FAS (Watanabe et al., 2004),
réprimant ainsi la synthèse des TGs. FXR réduit également la concentration hépatique en TGs
en augmentant leurs dégradations. Ainsi FXR induit l’expression de l’enzyme CES1
(carboxyl esterase 1) impliquée dans le mécanisme d’hydrolyse des TGs (Xu et al., 2014). De
plus dans ces conditions, l’activation hépatique de FXR est associée à l’augmentation de la -
oxydation, processus dont les TGs sont le substrat initial. Ainsi, dans un modèle murin
d’obésité et de déficience en FXR (ob/ob / Fxr-/-), il est observé une diminution des
expressions hépatiques de PPAR et CPT-1, respectivement décrits comme activeur et
enzyme limitante de la -oxydation (Prawitt et al., 2011). Enfin, l’activation de FXR dans des
hépatocytes (rat et humain) induit l’expression du gène PDK4 (pyruvate dehydrogenase

127
kinase 4). Ceci peut être associé à un basculement de l’utilisation du glucose vers les acides
gras comme source d’énergie (Savkur et al., 2005).
Ces différentes actions de FXR sur le métabolisme lipidique hépatique ont été
confirmées in vivo dans des modèles murins. Ainsi, l’activation de FXR par différents ligands
synthétiques, le GW4064 (Ma et al., 2013), le 6-ECDCA (Lívero et al., 2014) ou le WAY-
362450 (Liu et al., 2014) entraine une diminution de la concentration plasmatique en TGs et
de la stéatose hépatique. A l’inverse, les souris Fxr-/- présentent le phénotype opposé (Sinal et
al., 2000).
Enfin, l’activation de FXR au niveau intestinal peut, au travers de l’induction de
FGF15/19, agir sur le métabolisme lipidique hépatique. Ainsi, FGF19 est décrit comme
inhibant la synthèse hépatique des TGs en réduisant l’expression de SREBP1c (Bhatnagar et
al., 2009)(Miyata et al., 2011). Néanmoins, une étude comparant les paramètres lipidiques des
souris l(Fxr-/-) et i(Fxr-/-) montre que seule la déficience hépatique en FXR entraine
l’apparition d’une stéatose au niveau du foie (Schmitt et al., 2015). Ceci suggère que l’action
de FXR, dans cet organe, est la seule permettant le contrôle du métabolisme lipidique
hépatique. A l’inverse, une étude récente (Liu et al., 2018) montre que l’activation de FXR
par la fexaramine dans un modèle de souris diabétiques (db /db), entraine une diminution de
la stéatose hépatique. Celle-ci résulte principalement de l’activation de la -oxydation via
l’augmentation des expressions géniques hépatiques de Ppar et Cpt-1. En effet, si celle de
Shp est également induite, les autres gènes de la lipogenèse, Srebp1c et Fas, ne le sont pas
significativement. Dans cette étude, la fexaramine est administrée par voie orale (gavage) et
son action dans ces conditions est décrite comme ciblant uniquement le FXR intestinal. Dans
ce cas, le métabolisme lipidique hépatique serait donc bien régulé par l’activation de FXR au
niveau de l’intestin. Néanmoins, une étude récente (Pathak et al., 2018) a montré, qu’au
niveau du microbiome intestinal, la fexaramine favorisait les bactéries produisant le LCA, ce
dernier étant le ligand naturel de TGR5 le plus efficace. Les effets du traitement fexaramine
décrits dans l’article de (Liu et al., 2018) pourraient donc résulter d’une action dépendante de
TGR5 et ne seraient donc pas liés à l’activation de FXR au niveau intestinal. Cependant, dans
les travaux de (Pathak et al., 2018), la fexaramine n’a aucun effet sur les expressions des
gènes hépatiques impliqués dans le métabolisme lipidique.
Des études supplémentaires sont donc nécessaires afin de mieux comprendre les
actions respectives de FXR au niveau du foie et de l’intestin sur le métabolisme lipidique
hépatique.

128
 vii) Rôle de FXR dans le métabolisme du glucose :

Les observations initiales montrant que l’expression hépatique de FXR pouvait être
induite par le glucose et modifiée dans un contexte diabétique (Duran-Sandoval et al.,
2004)(Zhang et al., 2006) ont suggérées que FXR pouvait être impliqué dans le maintien de
l’homéostasie glucidique de l’organisme.
Des études ont donc tenté de confirmer cette hypothèse en activant ou réprimant
l’action de FXR suivant différentes méthodes. Orientées par la modification de l’expression
de FXR dans un contexte diabétique, ces recherches se sont essentiellement focalisées sur
l’action hépatique de FXR et notamment sur sa capacité à réguler la production hépatique de
glucose (HGP) et les expressions de gènes clefs de la néoglucogenèse. En effet, une des
caractéristiques principales du diabète de type II consiste en une augmentation anormale de la
glycémie à jeun associée à une HGP trop élevée (D'Alessio, 2011). L’objectif de ces travaux
était donc de déterminer si FXR était impliqué dans la régulation de l’HGP et/ou de la
néoglucogenèse et si la dérégulation de son action pouvait entrainer leurs activations
anormales en contextes pathologiques.
Bien que confirmant l’implication de FXR dans la régulation du métabolisme
glucidique, ces expériences initiales ont abouti à des résultats contradictoires suggérant que
FXR agissait via des mécanismes complexes restant à identifier. Selon les études, l’action de
FXR va aboutir à la répression (Tableau 5) ou à l’induction (Tableau 6) de la néoglucogenèse
et/ou de l’HGP. Ainsi la glycémie plasmatique à jeun est diminuée suite à l’activation de FXR
par différents agonistes ou suite à sa surexpression dans le foie (Zhang et al., 2006), mais
aussi suite à son inhibition par l’intermédiaire de séquestrants intestinaux des ABs (Prawitt et
al., 2011) ou sa déplétion dans un modèle de souris Fxr-/- (Cariou et al., 2005). Au final, ces
études s’effectuent dans des conditions assez disparates, les données proviennent selon les cas
de lignées cellulaires, d’hépatocytes primaires (de souris, de rats ou humains) ou de foies
totaux (souris ou rat), et sont générées dans des contextes sains (régime normal) ou
pathologiques (modèle diabétique (souris db/db et rat fa/fa), d’obésité (souris ob/ob) et régime
riche (HFD)) (voir tableaux pour références). Il est d’ailleurs à noter que l’étude de l’action de
FXR en conditions pathologiques, est effectuée dans un contexte ou l’HGP est déjà au
préalable perturbée.

129
 Action de FXR : répression de la néoglucogenèse ou de l'HPG
Références Contextes Observations
(De Fabiani Souris mâles C57Bl6/J, âges: 8 semaines. Régime
Répression de Pck1 (Foie total / ARN).
et al., 2003) normal. Nourries ad lib. +/- CA pendant 8 jours.
Souris mâles C57Bl6/J, âges: 8 semaines. Régime
Répressions de Pck1, Fbp1 et G6pc, corrélées avec
normal +/- CA pendant 7 jours. Sacrifice après 12h de
l'augmentation de Shp (Foie total / ARN).
jeûne.
(Yamagata
et al., 2004) Lignée cellulaire hépatocytaire humaine HepG2. Répressions des plasmides rapporteurs sous contrôle
Traitement CDCA, 50 et 100 µM, pendant 24h. des promoteurs PCK1, FBP1 et G6PC. Mécanisme
proposé: les répressions s'effectuent via SHP.

Répressions de Pck1et G6pc chez les souris contrôles.

Aucune modification chez les souris Fxr-/- et Shp-/-
Souris mâles C57Bl6/J (contrôles), Fxr-/- et Shp -/-, (Foie total / ARN)
(Ma et al.,
âges: 8 semaines. Régime normal. Nourries ad lib. La glycémie plasmatique des souris Fxr-/- et Shp-/-
2006)
+/- CA pendant 5 jours. augmente par rapport aux souris contrôles dans les
conditions nourries et après un jeûne d'une nuit (16h).
MPHs en culture (25 mM de glucose). Traitement Induction de Pck1, répression de G6pc, pas de
GW4064, 1 µM pendant 24h. modification de Fbp1 (ARN)
Induction de Pck1, répression de G6pc chez les souris
contrôles. Aucune modification chez les souris Fxr-/-
Souris C57Bl6/J (contrôles) et Fxr-/-. Régime normal. (Foie total / ARN).
Nourries ad lib. Gavées avec 30 mg/kg de GW4064
deux fois par jour pendant 11 jours. Sacrifice après 6h
de jeûne. La glycémie plasmatique des souris contrôles traitées
au GW4064 diminue après 6h de jeûne, pas d'effet chez
les souris Fxr-/-.
Répression de Pck1, répression de G6pc (retour aux
(Zhang et niveaux d'expressions des souris contrôles non
al., 2006) diabétiques). (Foie total / ARN).
Souris diabétiques (modèle db/db). Régime normal.
Nourries ad lib. Gavées avec 30 mg/kg de GW4064 Diminution de la glycémie plasmatique après 16h de
deux fois par jour pendant 5 jours. jeûne par rapport à la condition db/db non traitée mais
encore supérieure à celle des souris contrôles non
diabétiques.
Répression de Pck1, répression de G6pc
Souris diabétiques (modèle db/db), nourries ad lib. (Foie total / ARN).
Régime normal. Transduites par un adénovirus codant
pour un FXR constitutivement actif. Sacrifice après 10 Diminution de la glycémie plasmatique après 6h de
ou 13 jours de transduction et 6h de jeûne. jeûne par rapport à la condition db/db non transduite.
Rats diabétiques (modèle fa/fa) nourris ad lib. Régime Répression de Pck1, répression de G6pc (retour aux
(Cipriani et
normal. Gavés avec 10 mg/kg de 6E-CDCA pendant 7 niveaux d'expressions des rats contrôles non
al., 2010)
jours diabétiques dans les deux cas) (Foie total / ARN).
Souris mâles C57Bl6/J, âges: 15 semaines. Régime
Répression de Pck1, Répression de G6pc (en condition
(Ma et al., riche (HFD). Injections intra-péritonéales avec 50
HFD, par rapport aux souris HFD contrôles) (Foie total
2013) mg/kg de GW4064 deux fois par jour pendant 6
/ ARN).
semaines. Sacrifice après un jeûne d'une nuit (16h).

Tableau 5: Bilan des études montrant une action négative de FXR sur la néoglucogenèse ou l’HGP.

130
 Action de FXR : induction de la néoglucogenèse ou de l'HPG
Références Contextes Observations
Mesure de la glycémie plasmatique: Hypoglycémie
transitoire à 6 et 8h de jeûne par rapport aux souris
contrôles.

Souris femelles C57Bl6/N (contrôles) et Fxr-/-, âges: 8 Diminution de l'HGP basale (après 9h de jeûne) et
semaines, Nourries ad lib. Régime normal. diminution du stock de glycogène hépatique par
(Cariou et rapport aux souris contrôles.
al., 2005) Répressions de Pck1 et G6pc chez les souris Fxr-/-, pas
de modification de Fbp1
(Foie total, après 6h de jeûne / ARN).
Pck1 réprimé dans les MPHs Fxr-/- par rapport aux
MPHs, isolés à partir de souris contrôles ou Fxr-/-, en
MPHs contrôles (en présence ou absence de GW4064).
culture (5 mM de glucose). Traitement GW4064, 5 µM
Pas d'effet du GW4064 ni dans les MPHs contrôles, ni
pendant 24h
dans les MPHs Fxr-/-.
Souris femelles C57Bl6/N (contrôles) et Fxr-/-, âges: 8
(Duran- Après 6 heures de retour à l'accès à la nourriture, la
à 12 semaines. Nourries ad lib. Régime normal. 4
Sandoval et répression de Pck1 est bien plus prononcée chez les
conditions: nourries, mises à jeûner 24h, puis nourries
al., 2005) souris Fxr-/- (Foie total/ ARN).
à nouveau (régime riche HFD) 6 ou 24h.
Lignées cellulaires hépatocytaires de rat (H4IIE et
Induction de Pck1 par les différents agonistes de FXR
MH1C1). Traitements GW4064, CDCA et Fexaramine
doses dépendantes.
(doses-effets) pendant 24h.
(Stayrook et Hépatocytes primaires de rats mises en culture. Inductions doses dépendantes de Pck1 par les différents
al., 2005) Traitement GW4064, CDCA (doses-effets) pendant agonistes de FXR. Augmentation de la production de
24h. glucose dans les mêmes conditions.
Hépatocytes primaires humains mises en culture.
Induction dose dépendante de PCK1.
Traitement GW4064 (doses-effets) pendant 24h.
Augmentation de l'HGP basale et de la néoglucogenèse
(test de tolérance au pyruvate) associées à
Souris déficientes pour le facteur de transcription l'augmentation des expressions géniques de Fxr, Pck1,
(Wang et al.,
ARNT/HIF1beta (Hypoxia-Inducible Factor 1-Beta). Fbp1 et G6pc alors que celles de Pgc1a, Foxo1, Foxa2,
2009)
Régime normal, Nourries ad lib. Hnf4a et Creb impliqués dans la régulation de la
néoglucogenèse ne sont pas modifiées
(Foie total / ARN).
Souris mâles déficientes ou non en FXR dans un
Diminution de la glycémie plasmatique après 6h de
contexte de souris obèses (modèle ob/ob), fond
jeûne dans les souris déficientes en FXR par rapport
génétique C57Bl/6J. Nourries ad lib. Régime normal.
aux souris contrôles.
Sacrifice après un jeûne de 6h.
Souris mâles C57Bl6/J (contrôles) et Fxr-/-, âges: 20 Diminution de la glycémie plasmatique après 6h de
semaines. Régime riche (HFD). Nourries ad lib. jeûne dans les souris Fxr-/- par rapport aux souris
(Prawitt et
pendant 20 semaines. contrôles.
al., 2011)
Souris mâles déficientes ou non en FXR dans un
contexte de souris obèses (modèle ob/ob), fond Diminution de la glycémie plasmatique dès une
génétique C57Bl/6J, âges: 10-13 semaines. Régime semaine de traitement au colesevelam dans
normal. Nourries ad lib. Traitement colesevelam les souris exprimant FXR, pas d'effet chez les souris
(séquestrant des ABs), 3 semaines, 2% ajouté à la déficientes en FXR.
nourriture. Sacrifice après un jeûne de 6h.
Souris mâles C57Bl6/J. Régime normal. Injections
Pck1 et G6pc sont réprimés par l'agoniste de FXR en
(Renga et intra-péritonéales avec 5 mg/kg de 6E-CDCA pendant
conditions nourries. A l'inverse, ils sont induits en
al., 2012) 4 jours. Sacrifice en conditions nourries ou après un
condition de jeûne (Foie total / ARN).
jeûne de 18h.

Tableau 6: Bilan des études montrant une action positive de FXR sur la néoglucogenèse ou l’HGP.

131
 En ce qui concerne l’action répressive de FXR sur la néoglucogenèse, un des
mécanismes proposé est qu’elle s’effectuerait via l’activation de son gène cible SHP
(Yamagata et al., 2004)(Renga et al., 2012). En effet, celui-ci réprime les activités
transcriptionnelles d’HNF4a (Lee et al., 2000) et GR (Borgius et al., 2002). Notamment, SHP
bloque le recrutement de PGC1a par GR au niveau du promoteur de Pck1. Cette action « anti-
néoglucogénique » de SHP a d’ailleurs par la suite été confirmée et complétée par d’autres
études. Il a ainsi été démontré que SHP inhibait l’activation, dépendante de la PKA, de CREB
au niveau des gènes codant pour Pck1 et G6pc (Kim et al., 2008)(Lee et al., 2010).
L’utilisation de modèle de souris l(Fxr-/-) et i(Fxr-/-) a également permis de mettre en
évidence l’importance de l’action intestinale de FXR dans la régulation du métabolisme
glucidique. Suite à une induction de l’obésité par un régime HFD, la diminution de la
glycémie plasmatique à jeun observée dans les souris Fxr-/- par rapport aux souris contrôles
n’est pas reproduite dans un modèle de souris l(Fxr-/-). Ce qui suggère que cet effet est
dépendant de l’expression de FXR dans un (ou des) autre(s) organe(s) que le foie (Prawitt et
al., 2011). Plusieurs études ont donc par la suite tenté d’identifier l’action du FXR intestinal
sur le métabolisme du glucose. De nouveau les résultats sont contradictoires. Si l’inactivation
du FXR intestinal à l’aide de séquestrants des ABs (Smushkin et al., 2013), d’un antagoniste
(Jiang et al., 2015) ou de sa déplétion dans un modèle de souris i(Fxr-/-) (Xie et al., 2017)
entraine une diminution de l’HGP ou de la néoglucogenèse, l’activation de FXR par un
agoniste le ciblant uniquement au niveau de l’intestin (la fexaramine) est également décrite
comme réduisant l’HGP (Fang et al., 2015).
Plusieurs mécanismes ont été proposés afin d’expliquer l’action indirecte du FXR
intestinal sur l’HGP :
- L’induction du gène cible intestinal de FXR, FGF15/19, et l’augmentation de sa sécrétion
dans la veine porte, permettraient de réprimer la néoglucogenèse hépatique via un
mécanisme aboutissant à l’inactivation de CREB (Potthoff et al., 2011).
- L’inactivation du FXR intestinal est associée à la diminution de la synthèse et de la
sécrétion dans la veine porte de céramides par l’intestin. Ceci entrainerait au niveau
hépatique la diminution de la néoglucogenèse associée à une diminution de l’activité
enzymatique de la PCx (Xie et al., 2017).
- Au niveau des cellules L intestinales, FXR est décrit comme un modulateur de la
production et de la sécrétion, dans la veine porte, du GLP-1 (Glucagon like peptide 1). Ce
qui est également le cas de TGR5 qui lui est un inducteur de ces deux processus, toujours
au niveau des cellules L intestinales (Katsuma et al., 2005)(Thomas et al., 2009). Le GLP-

132
 1 est capable de réprimer indirectement le néoglucogenèse hépatique, en potentialisant, au
niveau du pancréas, la sécrétion d’insuline induite par le glucose (Baggio & Drucker,
2007). Néanmoins à ce jour, les résultats concernant le rôle joué par FXR dans ces
mécanismes sont contradictoires. D’une part, FXR suite à son activation par le GW4064,
est décrit comme inhibant l’expression génique du proglucagon qui après maturation par
les proconvertases 1/3 (PC1/3) va produire le GLP-1 (Trabelsi et al., 2015)(Trabelsi et al.,
2017). D’autre part, l’activation de FXR par son agoniste l’OCA ou l’INT767, un ligand
synthétique ciblant à la fois FXR et TGR5, entraine une induction des expressions
géniques de Tgr5 et de Pc1/3. De plus, ces deux traitements induisent la sécrétion de
GLP-1 dans la veine porte, le composé INT767 étant le plus efficace (Pathak et al., 2017).

L’action de FXR sur la régulation de la synthèse du glycogène ou sur la glycogénolyse

a été peu étudiée. Les souris Fxr-/- présentent un stock hépatique en glycogène moins
important (Cariou et al., 2005). L’administration de GW4064 dans le modèle de souris
diabétique db/db induit la synthèse de glycogène augmentant son stockage hépatique par
rapport aux souris contrôles (Zhang et al., 2006). De plus, FGF15/19, gène cible intestinal de
FXR est capable d’induire la synthèse hépatique de glycogène (Kir et al., 2011).
Enfin, une étude a démontré que l’activation hépatique de FXR permettait de diminuer
la glycolyse. En interagissant avec ChREBP (Carbohydrate Response Element Binding
Protein), FXR réprime par un mécanisme de trans-répression un sous-ensemble de gènes,
dont la pyruvate kinase hépatique (L-PK), impliquée dans la réponse des hépatocytes au
glucose (Caron et al., 2013). Ce mécanisme de trans-répression de ChREBP par FXR a
également été confirmé au niveau de la lignée cellulaire humaine GLUTag (cellules L
entéroendocrine) (Trabelsi et al., 2015).
En conclusion, l’action coordonnée de FXR aux niveaux hépatique et intestinal joue
un rôle important dans la régulation du métabolisme glucidique. De nouveau, des études
supplémentaires sont nécessaires afin de discriminer ces différentes actions.

133
 viii) Régulation de l’action de FXR par MPTs :

A l’image de nombreux autres RNs (Berrabah et al., 2011), FXR est capable d’intégrer
des signaux extracellulaires suite à sa modification post-traductionnelle catalysée par
différentes enzymes. Depuis 2008, plusieurs types de MPTs ciblant FXR ont été identifiées
(Tableau 7). Parmi celles-ci, différentes kinases capables de le phosphoryler directement ont
été mises en évidence (Tableau 8). Ces MPTs permettent une régulation fine de l’activité
transcriptionnelle de FXR, en modulant sa stabilité protéique, sa capacité à se lier à l’ADN, à
s’hétérodimériser avec RXR ou à interagir avec différents cofacteurs.

134
 Equivalents
séquence Séquence(s) /
MPTs Références Site(s) / Validation(s) Effets
protéique (Enzyme)
mFXR1
K206 (Espèce ? FXR isoforme ?) / Région
charnière / Identification par analogie de
K206 Augmente la fixation de FXR sur les promoteurs de BSEP et SHP
(Balasubramaniyan séquences avec d'autres RNs / Validation par
Méthylation K207 IQCKSKRLRK et l'induction de ces gènes par FXR suite à son activation par un
et al., 2012) méthylation in vitro, par IP FXR WB pan
(Set7/9) ligand (Huh-7).
methyl lysine et par mutation (K en R / forme
non modifiable)
Site(s) non identifié(s). L'ubiquitinylation de
Dégradation de la protéine FXR par le système ubiquitine
(Kemper et al., FXR est validée in vitro et dans les cellules
protéasome (HepG2). Dégradation inhibée par l'acétylation de
2009) HepG2 (surexprimant un Flag-FXR) par IP
FXR (K157-K217).
Flag WB Ubiquitine.
Site(s) non identifié(s). L'ubiquitinylation de
Dégradation de la protéine FXR par le système ubiquitine
(Hashiguchi et al., FXR est validée dans les cellules COS-1
Ubiquitinylation protéasome (COS-1). Dégradation induite par la phosphorylation
2016) (surexprimant un Flag-FXR) par IP Flag WB
de FXR (S154).
Ubiquitine.
Site(s) non identifié(s). L'ubiquitinylation de
Dégradation de la protéine FXR par le système ubiquitine
(Bilodeau et al., FXR est validée dans les cellules HEK293
protéasome (HEK293). Dégradation induite par la SUMOylation
2017) (surexprimant YFP-FXR) par IP YFP WB
de FXR (K325).
HA-Ubiquitine.
K277 (Humain, FXR isoforme ?) K272
(Mouse, FXR isoforme ?) / LBD /
(Vavassori et al., Nécessaire à la trans-répression induite par l'activation de FXR
Identification par bioinformatique / Validation ? ? / (SUMO)
2009) sur le gène TNF (THP1 et HEK293).
par IP FXR WB SUMO et par mutation (K en
R / forme non modifiable).
La surexpression de SUMO1 diminue la fixation et le recrutement
de FXR, induite par son ligand, sur les promoteurs de BSEP et
SHP. La répression de l'expression de SUMO1 augmente l'activité
K122 (Humain, FXR isoforme 2) / AF1, K275
K122: IKGD transcriptionnelle de FXR sur ces mêmes gènes (HepG2).
(Balasubramaniyan (Humain, FXR isoforme 2) / LBD / Validation
K119 / K277 K275: LKEE In vivo (souris) / contexte pathologique: lors de l'induction de la
et al., 2013) par IP FXR WB SUMO1, par SUMOylation
SUMOylation (SUMO1) cholestase hépatique par ligation des voies biliaires, le
in vitro et par mutation (K en R).
recrutement de SUMO1 est plus important sur les promoteurs de
Bsep et Shp par rapport aux conditions contrôles (pas d'effets sur
les promoteurs d'Ost et Ost).
Le niveau de SUMOylation global de FXR augmente lorsque
celui-ci est activé. La surexpression de SUMO2 entraine une
K325 (motif atypique de SUMOylation /
K325 augmentation de l'activité transcriptionnelle de FXR (HEK293,
(Bilodeau et al., Humain FXR isoforme 1) / LBD / Validation
K323 ALLKGSAVE one-hybrid assay, système Gal4-UAS).
2017) par SUMOylation in vitro et par mutation (K
(SUMO2) La mutation du site de SUMOylation (K en R) entraine une
en R).
diminution du recrutement de coactivateurs induit par l'activation
de FXR (HEK293).

135
 Equivalents
séquence Séquence(s) /
MPTs Références Site(s) / Validation(s) Effets
protéique (Enzyme)
mFXR1
Augmente la stabilité protéique de FXR. Augmente le
recrutement de FXR sur les promoteurs de BSEP et KNG1.
Inactive le complexe corépresseur (SMRT) et augmente l'activité
transcriptionnelle de FXR sur ses gènes cibles BSEP et KNG1
S62 (Humain, FXR isoforme 2) / AF1 / S62
O- (Berrabah et al., (HepG2).
Identification par bioinformatique / Validation S58 QISSSSYYSNL
GlcNAcylation 2014) In vivo (souris) : augmentation du niveau d'O-GlcNAcylation
par mutation (S en A, forme non modifiable). (OGT)
hépatique de FXR en condition nourrie par rapport à celui observé
lors du jeûne, associée à l'augmentation des expressions de gènes
cibles de FXR (Bsep, Mdr1, Ost et Shp) et à une diminution de
la concentration hépatique en acides biliaires.
Lors de l'activation de FXR par son ligand, celui-ci recrute la
p300 au niveau du promoteur de son gène cible SHP, ce qui
Site(s) non identifié(s). L'acétylation de FXR entraine une augmentation de son activité transcriptionnelle
par la p300 est validée in vitro et dans les notamment associée à l'acétylation directe de FXR par la p300. À
(Fang et al., 2008) (p300)
cellules HepG2 (surexprimant un Flag-FXR) l'inverse la diminution de l'expression de p300 diminue l'activité
par IP Flag WB Acétyle lysine. trancriptionnelle de FXR sur ce gène cible mais aussi d'autres
gènes cibles impliqués dans les métabolismes des lipoprotéines et
du glucose (HepG2).
Au niveau du promoteur de SHP, l'acétylation de FXR augmente
K157 (Humain, FXR isoforme 1) / LBD,
sa stabilité protéique mais inhibe sa capacité à s'hétérodimériser
K217 (Humain, FXR isoforme 1) / Région K157:
Acétylation avec RXR, sa fixation à l'ADN et son activité transcriptionnelle
charnière / Identification par spectrométrie de SITKNAV
(Kemper et al., (HepG2). La déacytlase SIRT1 est capable d'interagir
masse / Validation dans les cellules HepG2 K154 / K214 K217:
2009) physiquement avec FXR et de le déacétyler (Foie murin).
(surexprimant un Flag-FXR) par IP Flag WB KNVKQHA
Contexte pathologique: le niveau d'acétylation de FXR est plus
Acétyle lysine et par mutation (K en R, forme (p300)
élevé dans des modèles de souris obèses (ob/ob, ou régime riche
non modifiable),
WD).
La perte de la capacité hépatique à se régénérer observée dans un
(García- Site(s) non identifié(s) / Validation dans les modèle de souris surexprimant SIRT1 est associée à la diminution
Rodríguez et al., foies totaux de souris par IP FXR WB Acétyle du niveau d'acétylation de FXR, à la diminution de son expression
2014) lysine. protéique en résultant et de celles de ses gènes cibles (Bsep et
Shp).

Tableau 7: Actions sur FXR des différentes MPTs identifiées comme le ciblant (hors phosphorylation par les kinases).
AF-1 : domaine d’activation 1,IP : immuno-précipitation, KNG1: Kininogen 1, LBD : domaine de liaison du ligand, OGT: O-linked β-N-acetylglucosamine transférase, SIRT1: Sirtuin 1 ,
SMRT: Silencing Mediator of Retinoic Acid and Thyroid Hormone Receptor, SUMO1/2: Small ubiquitin-related modifier 1/2, WD: Western Diet, WB : western-blot.

136
 Equivalents
séquence
Kinases Références Site(s) / Validation(s) Séquence(s) Effets
protéique
mFXR1

S327 (Humain, FXR isoforme 1) / LBD / La phosphorylation de FXR par la CK2 est nécessaire à sa
Identification par bioinformatique (sérine en SUMOylation sur le site K325 par la SUMO2. La surexpression de
position +2 par rapport au site de CK2 entraine une augmentation de l'activité transcriptionnelle de
(Bilodeau et SUMOylation) / Validation par mutation (S en S327: FXR, de même l'ajout d'un inhibiteur de la CK2 diminue cette
CK2 S325
al., 2017) A, non phosphorylable) et par anticorps anti ALLKGSAVEA dernière. Les deux effets sont abolis lorsque la forme mutante de
CK2 motif consensus (transfection dans les FXR (S327A) est utilisée (HEK293, one-hybrid assay, système
HEK293 d’un fragment de FXR taggé +/- CK2, Gal4-UAS). La surexpression de CK2 entraine une diminution de
IP tag WB CK2 motif consensus) l'expression protéique de FXR (HEK293).

En présence d'inhibiteurs des PKCs, la capacité de FXR à trans-

activer ses gènes cibles (SHP et UGTB4) est inhibée (HepG2).
S135 et S154 (Humain, FXR isoforme 1) /
PKC / (Gineste et al., S135: SGYHYN L'activation de FXR en présence d'un activateur des PKCs
DBD / Validation par phosphorylation in vitro S132 / S151
PKC1 2008) S154: SITKNA augmente son activité transcriptionnelle sur un élément de réponse
et par mutation (S en A) (HEK293 et HepG2).
(IR1) (HEK293). Cet effet est associé à une augmentation du
recrutement du coactivateur PGC1a (HEK293 – transfection).

S154 (Humain, FXR isoforme 1) / DBD /

Identification par analogie de séquences avec
d'autres RNs / Validation par phosphorylation Induit la dégradation de la protéine FXR par le protéasome (COS-
(Hashiguchi et
PKC / in vitro (PKC), par mutation (S en A ou S en D, 1). Le niveau de phosphorylation de FXR sur le S154 est diminué
al., 2016) S151 S154: SITKNAV
VRK1 forme phosphomimétique), in cellulo (+/- lorsque l'expression de VRK1 est réprimée (COS-1) et augmenté
VRK1, effet indirect ?) et in vivo à l'aide d'un après activation de FXR par un agoniste (COS-1 et foies murins).
anticorps ciblant la forme phosphorylée de FXR
sur le site S154 (COS-1 et foies totaux murins).

137
 Equivalents
séquence
Kinases Références Site(s) / Validation(s) Séquence(s) Effets
protéique
mFXR1

L'inhibition de l'activité de la PKC, soit à l'aide d'inhibiteurs ou par

diminution de son expression, entraine une plus grande localisation
de FXR dans le cytoplasme des cellules, ce qui est associé à la
diminution de l'expression de son gène cible BSEP (UPS). La
T442 (Humain, FXR isoforme ?) / LBD / mutation du site potentiel de phosphorylation en une forme non
(Frankenberg
PKC Identification par bioinformatique / Validation ? ? phosphorylable (T en A) présente le même effet alors que le mutant
et al., 2008)
par phosphorylation in vitro. phosphomimétique (T en E) présente le profil opposé. Contexte
pathologique: cholestase héréditaire (mutation entrainant une perte
de fonction du transporteur FIC1), FIC1 permettrait une activation
de la PKC qui favoriserait l'action de FXR suite à sa
phosphorylation et sa translocation dans le noyau cellulaire.

La capacité de FXR à induire ses gènes cibles est inhibée en

présence d'un activateur de l'AMPK (HepG2, AML12 et Caco2 et
S250 (Souris, FXR isoforme 3) / Région in vivo foies totaux et iléons). La phosphorylation de FXR inhibe le
charnière / Identification par spectrométrie de recrutement de coactivateurs et diminue son activité
(Lien et al., S250:
masse / Validation par phosphorylation in vitro, S236 transcriptionnelle sur les promoteurs de ses gènes cibles.
2014) RQVTSTTKF
mutation par (S en A) et anticorps ciblant la Contexte pathologique: Dans un modèle murin de cholestase
forme phosphorylée de FXR sur le site S250. hépatique, l'induction de la phosphorylation de FXR par activation
de l'AMPK perturbe l'homéostasie des ABs et aggrave les lésions
AMPK hépatiques.

L’induction de la cholestase hépatique par l'alpha-

naphthylisothiocyanate (ANIT) est dépendante de l'activation de
(Li et al., Site(s) non identifié(s). Phosphorylation de l'AMPK. Celle-ci entraine une diminution de l'expression hépatique
2016) FXR non validée. de FXR et celles de transporteurs aux ABs associées. Cette étude
confirme le rôle joué par l’AMPK et FXR dans le maintien de
l'homéostasie des ABs.

Tableau 8 : Actions sur FXR des différentes kinases identifiées comme le phosphorylant directement.
AMPK: AMP-activated Protein Kinase, CK2: Casein Kinase 2, DBD : domaine de fixation à l’ADN, FIC1: Familial Intrahepatic Cholestasis Type 1, IP : immuno-précipitation, LBD :
domaine de liaison du ligand, PKC: Protein Kinase C, VRK1: Vaccinia Related Kinase 1, WB : western-blot.

138
 L’action de FXR peut donc être modulée par différentes MPTs. De manière
intéressante, les enzymes catalysant certaines d’entre elles, sont associées à des voies
métaboliques régulées par le contexte énergétique dans lequel se trouve l’organisme. Ces
MPTs sont donc impliquées dans la mise en place d’une réponse adaptée aux évolutions du
statut nutritionnel. Ainsi, plusieurs études ont montré, au niveau hépatique, une régulation
globale des niveaux de ces différentes MPTs associée aux évolutions des disponibilités en
nutriments, au statut nutritionnel ou au cycle jour/nuit. C’est le cas notamment du processus
d’O-GlcNAcylation, dont le niveau global fluctue en réponse aux disponibilités en glucose, en
acide gras et en glutamine (Ruan et al., 2013). De même, le processus d’acétylation est
réprimé lorsque l’organisme est en situation de déficit d’énergie (jeûne long, restriction
calorique ou exercice) (Menzies et al., 2016). De plus, le niveau global d’acétylation des
protéines hépatiques est régulé au cours du rythme circadien en corrélation avec le statut
nutritionnel, celui-ci augmentant lors de la progression du jeûne court (ou phase inter-
prandiale) (Mauvoisin et al., 2017). Le niveau de phosphorylation global pour 41% des
phosphoprotéines hépatiques présentent également une oscillation circadienne (Robles et al.,
2017). Ce qui a été confirmé aux niveaux des facteurs de transcription et des corégulateurs
hépatiques (Wang et al., 2017). La kinase AMPK (AMP-activated Protein Kinase) est activée
en conditions où l’énergie vient à manquer à la cellule, lors d’un jeûne long par exemple. Elle
agit sur un grand nombre de processus métaboliques afin de diminuer la consommation
d’énergie et augmenter sa production (Herzig & Shaw, 2018). Enfin, les niveaux hépatiques
de ces différentes MPTs peuvent être dérégulés dans des conditions pathologiques. Par
exemple, un niveau global d’O-Glc-NAcylation élevé est observé dans des conditions
diabétiques (Banerjee et al., 2016). De même, l’activité de la déacétylase SIRT1 (Sirtuin 1)
est réduite dans cette même pathologie entrainant une augmentation du niveau d’acétylation
de NF--b (Yoshino et al., 2011).
FXR en étant ciblé par ces différentes MPTs participe donc à cette réponse fine de
l’organisme associée aux évolutions du statut nutritionnel. Une activation anormale d’une
voie ciblant FXR par MPT pourrait donc entrainer une action de ce dernier inappropriée
associée à une évolution pathologique. Néanmoins, la plupart des travaux ayant identifiés une
MPT ciblant FXR, n’ont pas étudié la relevance de celle-ci dans un contexte physiologique
et/ou pathologique (Tableaux 7 et 8).
Enfin, les différentes MPTs peuvent interférer entre elles ou agir en coopération. Par
exemple les processus d’O-GlcNAcylation et de phosphorylation sont en compétition pour
des sites communs (Hart et al., 2011). Dans le cas de FXR, il a été montré, dans le foie murin,

139
que l’acétylation de FXR sur le site K217 empêchait sa SUMOylation sur le site K277. Cette
dernière MPT favorise le recrutement de FXR au niveau de gènes de l’inflammation dont il va
diminuer l’expression par trans-repression. Dans un contexte d’obésité, le maintien d’un
niveau d’acétylation de FXR élevé va ainsi inhiber son action hépatique anti-inflammatoire
(Kim et al., 2015). Chez le rat, dans un modèle de rattrapage de croissance qui fait suite à une
longue période de restriction calorique, il est observé au niveau hépatique une élévation des
niveaux de phosphorylation et de SUMOylation de FXR. Ce profil est corrélé à l’apparition
d’une insulino-résistance classiquement associée à ce type de modèle (Hu et al., 2017). Enfin,
toujours au niveau de foie murin, une étude montre que la SUMOylation de FXR sur le site
K325 nécessite la phosphorylation au préalable du site adjacent S327 par la CK2 (Caséine
Kinase 2). L’action coordonnée de ces deux MPTs sur FXR induit sa dégradation par le
système ubiquitine protéasome (Bilodeau et al., 2017).

140
 Chapitre 2 : Résultats.

Objectifs de l’étude :
Comme nous l’avons décrit dans le premier chapitre, de nombreuses études ont mis en
évidence que FXR avait un rôle important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de
l’organisme. Ainsi, FXR est impliqué dans la régulation du métabolisme des principaux
nutriments: des lipides, du glucose et des acides aminés. De manière similaire à ce qui est
décrit concernant son rôle dans la régulation du cycle entéro-hépatique des ABs, FXR est
capable d’agir sur ces différents métabolismes au niveau du foie et de l’intestin. Ces actions
sont coordonnées et la modulation de l’activité ou de l’expression de FXR, dans un de ces
organes, peut modifier la réponse de l’autre tissu. Ainsi l’activation de FXR au niveau
intestinal va au travers de celle de la synthèse de FGF15/19 impacter la réponse hépatique
(Cicione et al., 2012), et notamment les régulation des métabolismes des acides aminés (Kir et
al., 2011), des lipides (Miyata et al., 2011) et du glucose (Potthoff et al., 2011).
De plus, l’action hépatique de FXR sur ces différents métabolismes peut être affectée
par le statut nutritionnel. Comme décrit précédemment, l’expression hépatique de FXR peut
être modulée par le glucose, l’insuline (Duran-Sandoval et al., 2004) et par le régime
alimentaire (Côté et al., 2013)(Ghoneim et al., 2015). De même, les voies métaboliques,
associées à un statut nutritionnel particulier, et les différentes MPTs qu’elles induisent
peuvent impacter l’action hépatique de FXR. Par exemple, l’élévation de la concentration
plasmatique de glucose lors de la phase postprandiale va être associée à l’activation de l’OGT
(O-GlcNacylation) (Ruan et al., 2013), le jeûne court à celle de la p300 (acétylation) (Menzies
et al., 2016) et le jeûne long à l’activation de l’AMPK (phosphorylation) (Herzig & Shaw,
2018). Or, ces trois MPTs ont été identifiées comme capables de cibler et de réguler finement
l’action de FXR (Berrabah et al., 2014)(Kemper et al., 2009)(Lien et al., 2014). Une revue
récente fait le bilan des différentes actions hépatiques de FXR sur le métabolisme des trois
grandes classes de nutriments. L’auteur propose un modèle dans lequel celles-ci sont
replacées dans un contexte nutritionnel (postprandiale, post-absorption, jeûne court, jeûne
long). De manière intéressante, ceci permet d’expliquer certains résultats qui de premier abord
étaient contradictoires (Massafra & van Mil, 2018).

141
 FXR a donc été identifié comme un acteur important du maintien de l’homéostasie
énergétique de l’organisme. C’est pourquoi, sa dérégulation peut potentiellement entraîner des
anomalies et un dysfonctionnement métabolique important. Il est donc nécessaire de
comprendre son fonctionnement dans un contexte physiologique afin par la suite d’identifier
ces éventuelles dérégulations en contexte pathologique (Chávez-Talavera et al., 2017). Les
différentes études menées sur FXR ont montré que celui-ci était une cible thérapeutique
intéressante dans la prise en charge des maladies hépatiques et/ou métaboliques (cholestase,
NAFLD, diabètes) (Neuschwander-Tetri, 2015). Ainsi, de nombreux ligands synthétiques le
ciblant ont été développés et certains sont à ce jour testés en essais pré-cliniques ou cliniques
(Han, 2018). L’objectif de ces différentes études est d’identifier des composés sélectifs
(SBARMs) permettant d’activer FXR spécifiquement dans un tissu ou de cibler un sous-
ensemble de ses gènes cibles (Massafra et al., 2018). Pour atteindre cet objectif, il est donc
important de caractériser les actions séquentielles de FXR dans un cycle jour/nuit et
notamment au cours de la progression du statut nutritionnel et ceci dans les différents organes
où il est exprimé.
Dans le cadre de notre étude, nous avons cherché à identifier et clarifier l’action
hépatique de FXR sur la néoglucogenèse et la production de glucose (HGP). En effet, les
résultats de la littérature sur le sujet sont assez contradictoires. Néanmoins, ces études se sont
placées dans des contextes très différents, notamment au niveau des modèles murins utilisés
(modèles d’obésité ob/ob, diabétique db/db …). De plus, dans la plupart des cas les statuts
nutritionnels ne sont pas strictement contrôlés. Or, comme nous venons de le décrire, celui-ci
peut fortement modifier l’action de FXR. Seulement deux études se placent dans les
conditions ou la néoglucogenèse a physiologiquement lieu, c'est-à-dire lors d’un jeûne court.
Ces deux études, réalisées chez la souris, concluent à une action de FXR augmentant cette
dernière. Ainsi, après six heures de jeûne, la production de glucose hépatique est diminuée
chez les souris Fxr-/- par rapport aux souris contrôles (Cariou et al., 2005). De même, les
gènes des enzymes clefs de la néoglucogenèse, Pck1 et G6pc, sont induits au niveau
hépatique lorsque FXR est activé dans un contexte de jeûne (Renga et al., 2012). De plus,
aucune des études visant à identifier le rôle de FXR dans la régulation de la néoglucogenèse
n’a envisagé que l’action de FXR pouvait être modifiée en présence du glucagon qui est
pourtant, au niveau physiologique, l’hormone principalement responsable de l’induction de ce
processus et de l’HGP (Lin & Accili, 2011). Ceci peut avoir son importance, d’autant plus
qu’une étude récente a mis en évidence que FXR était capable d’interagir physiquement avec
le FT CREB. FXR est impliqué, en contexte de jeûne long, dans la régulation par CREB de

142
gènes de l’autophagie (Seok et al., 2014). Or, lors d’un jeûne court, l’action hormonale du
glucagon va activer CREB via sa phosphorylation directe par la PKA. Dans ces conditions
CREB va induire les expressions géniques des enzymes clefs de la néoglucogenèse entrainant
ainsi une augmentation de l’HGP (Rines et al., 2016).
L’objectif de ma thèse a donc été d’étudier l’action hépatique de FXR sur la
néoglucogenèse et l’HGP dans des conditions mimant celles dans lesquels ce processus a
physiologiquement lieu. Afin d’exclure d’éventuels effets associés à l’activation du FXR
intestinal, nous avons choisi de nous focaliser principalement sur des hépatocytes primaires
murins (MPHs). Ceux-ci ont été isolés à partir de souris C57Bl/6J suivant un régime normal.
De plus, les animaux ont été sacrifiés au début de leurs phases de réveil (ZT 13), ce qui
permet d’isoler les hépatocytes dans un contexte correspondant à un jeûne d’une nuit, c’est-à-
dire au moment où la néoglucogenèse est physiologiquement à son maximum. Nos MPHs ont
été maintenus en culture dans des conditions normoglycémiques (5,5 mM), afin de les placer
dans un contexte où FXR ne devrait pas être ciblé ni par l’OGT ni par l’AMPK. Enfin,
l’action de FXR a été analysée en présence de glucagon afin d’évaluer si cette hormone
pouvait modifier la réponse associée à son activation sur ses gènes cibles ou sur ceux régulés
par CREB (Figure 38).

Figure 38: Objectifs de la thèse.

Flèche verte : active. Trait rouge : réprime. Flèche en pointillés et « ? » : Action à identifier.

143
Résultats:
1) L’activation de FXR potentialise la production de glucose induite par la
voie glucagon/AMPc :

Afin d’évaluer la contribution de FXR dans la production hépatique de glucose (HGP),

des souris C57Bl6/J, exprimant (Fxr+/+) ou déficientes en FXR (Fxr-/-) ont été soumises à
un jeûne afin d’épuiser leurs stocks hépatiques en glycogène. Un test de tolérance à l’injection
intra-péritonéale de pyruvate est alors réalisé. En réponse à l’apport en pyruvate substrat de la
néoglucogenèse, le foie produit du glucose. La sécrétion de celui-ci dans le flux sanguin est
mesurée au cours du temps. De manière similaire à l’hypoglycémie transitoire observée dans
ce modèle de souris Fxr-/- au cours du jeûne (Cariou et al., 2005), la réponse à l’injection de
pyruvate entraine une production de glucose atténuée chez les souris Fxr-/- comparée aux
souris contrôles Fxr+/+. Ceci suggère que FXR contribue positivement à l’induction de
l’HGP en agissant au niveau de la néoglucogenèse (Figure 39).

Figure 39 : FXR contribue à l’HGP. Test de tolérance au pyruvate dans les souris déficientes (Fxr-/-) ou non
(Fxr+/+) en FXR. Après un jeûne, du sodium pyruvate est injecté aux souris. La concentration sanguine en
glucose est mesurée aux temps indiqués (expériences réalisées par Kadiombo BANTUBUNGI). Les résultats
sont présentés comme la moyenne +/- SEM (Standard Error of the Mean) (n=3) et les valeurs sont comparées à
l’aide d’une ANOVA2 (Two-way Analysis of Variance) avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **,
p<0,01, ***, p<0,005. ASC : Aire sous la courbe.

Afin de tester la capacité de FXR à réguler l’HGP, il a été déterminé, dans les MPHs,
quelles étaient les conditions optimales permettant de mesurer cette dernière. En effet, suite à
leurs isolements et à leurs maintiens en culture in vitro, les hépatocytes primaires subissent

144
des changements métaboliques (Cassim et al., 2017). Afin d’évaluer cette « dérive »
potentielle sur notre modèle, nous avons mesuré les expressions de différents gènes juste
après l’isolement et à différents temps de culture. Ces expériences ont été effectuées à une
concentration normale en glucose (5,5 mM) afin d’éviter toutes interférences avec les
activations de l’AMPK ou de la voie hexosamine qui peuvent l’être respectivement dans des
conditions de concentrations faible ou élevée en glucose (Berrabah et al., 2014)(Lien et al.,
2014). Nous avons choisi d’analyser les expressions de :
- Gènes contrôles : l’Albumine comme marqueur du maintien de la différenciation
hépatocytaire et le 18S, un ARN ribosomique constituant la petite sous-unité 40S des
ribosomes classiquement utilisé dans la normalisation des RT-qPCR (Reverse
Transcription - quantitative Polymerase Chain Reaction), qui ne devrait donc pas être
modifié.
- De Fxr, objet de notre étude, et de son gène cible Shp / Nr0b2.
- De gènes décrits comme étant activés au cours du jeûne (Foxa2)(von Meyenn et al., 2013)
et/ou impliqués dans la régulation de la néoglucogenèse (Fbp1, G6pc, Pck1 et Prakaca).
L’isolement des MPHs est effectivement associé à des modifications d’expressions d’un
certain nombre de ces gènes, parfois même seulement après 6 heures de maintien en culture
(Figure 40 panel A). Afin de déterminer si les changements métaboliques résultant de cette
« dérive » affectent la réponse physiologique qui nous intéresse, l’HGP, nous avons mesuré
cette dernière à 24, 48 et 72 heures après isolement. Dans ces expériences, l’HGP est induite à
l’aide du 8-CPT-cAMP, un analogue de l’AMPc et activateur de la PKA. Les effets de
l’activation de FXR par son ligand synthétique, le GW4064, seul ou combiné à celle de la
PKA sur ce paramétre ont également été évalués (Figure 40 panel B). Si les niveaux de bases
de l’HGP diffèrent selon la durée du maintien en culture, les profils des réponses induites par
les différents traitements sont identiques. Le GW4064 n’affecte pas significativement l’HGP,
alors que le 8-CPT-cAMP l’augmente comme attendu et que l’activation simultanée de la
PKA et de FXR, de maniére intéréssante, la potentialise. En conclusion, malgré la « dérive »
faisant suite à l’isolement et la mise en culture des MPHs, ceux-ci sont toujours capables de
produire et de secréter le glucose et la réponse aux différents traitements n’est pas modifée.
Nos résultats montrent que dans notre modèle, l’induction de l’HGP est optimale après 24
heures (jour 2) mais peut être réalisée si nécessaire après 48 heures (jour 3). Par la suite,
toutes les mesures de l’HGP seront effectuées après 24 heures à l’exception des expériences
utilisant des siRNAs (petits ARNs interférents) qui le seront après 48 heures. Ceci est

145
nécessaire car nous avons évalué que, dans notre modèle, les siRNAs n’inhibent leurs cibles
de maniére optimale qu’après ce délai (données non montrées).

Figure 40 : Optimisation des conditions de mesure de l’HGP dans les MPHs. (A) Expressions géniques. Les
ARNs sont extraits et analysés par RT-qPCR. Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3) et
sont exprimés par rapport au niveau d’expression du jour 1 arbitrairement fixé à 100%. Les données sont
comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005.
Isol. : MPHs fraichement isolés juste avant la mise en culture. (B) Production du glucose. Les MPHs sont isolés
et maintenus en culture pendant 6 heures. L’HGP associée aux différents traitements est ensuite mesurée pendant
8 heures (Jour 1, 6+8 heures après isolement), ou 24 heures plus tard (Jour 2, 6+24+8 heures après isolement),

146
ou 48 heures plus tard (Jour 3, 6+24+24+8 heures après isolement). La concentration en glucose mesurée est
normalisée par celle en protéine correspondante. Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3)
et les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **,
p<0,01, ***, p<0,005.

Afin de confirmer que la potentialisation de l’HGP induite par le GW4064 était bien
dépendante de l’expression de FXR. Nous avons appliqué les mêmes traitements à des MPHs
isolés à partir de souris Fxr-/- ou Fxr+/+ (Figure 41 panel A). Les mêmes expériences ont
également été réalisées en ajoutant une condition glucagon, bien que l’utilisation de ce dernier
ait nécessité un temps plus long de traitement afin d’induire l’HGP de maniére significative
(Figure 41 panel B). Ceci afin de valider que l’ensemble de la voie est bien impliquée dans la
réponse observée, notamment l’activation du GCGR. Enfin, nous avons réalisé des
expériences similaires en remplaçant le GW4064 par le CDCA (Figure 41 panel C). Ceci pour
confirmer que nous obtenions les mêmes résultats suite une activation « physiologique » de
FXR par un de ses ligands naturels et d’exclure également un effet qui ne serait que
spécifique au ligand synthétique.
Nos premiers résultats sont confirmés : ni le GW4064, ni le CDCA, n’affectent
significativement l’HGP (Figure 41 panel A, B et C), alors que le 8-CPT-cAMP l’augmente
comme attendu, et ce de manière similaire au glucagon (Figure 41 panel A et B). L’activation
de FXR, par le GW4064 mais aussi par le CDCA, potentialise l’HGP induite par le 8-CPT-
cAMP (Figure 41 panel A et C). Enfin, si l’HGP basale est plus faible au niveau des MPHs
Fxr-/-, le niveau d’induction de celle-ci par le traitement 8-CPT-cAMP seul est sensiblement
le même que celui observé dans les MPHs Fxr+/+ (respectivement 1,7 et 1,5 fois plus que la
condition non traitée) (Figure 41 panel A). Le niveau d’expression de FXR ne modifie donc
pas la réponse induite par l’activation seule de la voie glucagon/AMPc. Par contre, la
potentialisation, associée à l’activation de FXR, de l’HGP induite par le 8-CPT-cAMP n’est
plus observée dans les MPHs Fxr-/- (Figure 41 panel A).

147
Figure 41 : FXR induit la production hépatique de glucose. (A) Mesure de la production de glucose dans les
MPHs issus de souris Fxr+/+ et Fxr-/-. La concentration en glucose mesurée est normalisée par celle en protéine
correspondante. Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3). Les valeurs sont comparées à
l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005, et condition par
condition pour les deux phénotypes à l’aide du même test. $, p<0,05, $$, p<0,01, $$$, p<0,005. A droite, les
expressions protéiques en FXR des MPHs Fxr+/+ et Fxr-/-, analysées par la technique d’immuno-détection
capillaire (Simple Western, WES). (B) Mesure de la production de glucose dans les MPHs (effet du glucagon).
L’HGP a été mesurée après traitements avec 100 µM de 8-CPT-cAMP, 1 nM d’insuline, 100 nM de glucagon
et/ou 2 µM de GW4064. Tout d’abord 16 heures dans un milieu contenant 5,5 mM de glucose puis 8 heures dans
le milieu de production de glucose. (C) Mesure de la production de glucose dans les MPHs (effet du CDCA).
L’HGP a été mesurée après traitements avec 100 µM de 8-CPT-cAMP et/ou 125 µM de CDCA dans les mêmes
conditions que (A). (B) et (C) : la concentration en glucose mesurée est normalisée par celle en protéine
correspondante. Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3) et les valeurs sont comparées à
l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005.

148
 Cette perte de la potentialisation de l’HGP est également retrouvée dans des MPHs
pour lesquels, après isolement, l’expression de FXR été réduite par siRNA (Figure 42).

Figure 42 : Effets de la répression de l’expression de FXR par siRNA sur l’HGP. (A) Mesure de l’HGP
dans les MPHs. Après isolement les MPHs sont transfectés 48 heures avec un siRNA aléatoire (Scr. siRNA) ou
ciblant Fxr (Fxr siRNA). La concentration en glucose mesurée est normalisée par celle en protéine
correspondante. Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3). Les valeurs sont comparées à
l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (B) Efficacité
de la répression de Fxr par siRNA. Expressions protéiques en FXR des MPHs analysées par la technique
d’immuno-détection capillaire (Simple Western, WES). β-ACTIN : β-ACTINE.

La potentialisation de l’HGP par FXR est également observée lorsque

l’hormone physiologiquement responsable de son induction, le glucagon, est utilisée. Elle est
également retrouvée suite à l’activation de FXR par deux ligands aux structures chimiques
différentes, un synthétique (GW4064) et un naturel (CDCA). Enfin, cet effet est bien
dépendant de l’expression de FXR.
Le FT FOXO1 est, avec CREB, fortement impliqué dans la régulation de la
néoglucogenèse hépatique (Oh et al., 2013). Afin de déterminer si FOXO1 intervient dans la
potentialisation de l’induction de l’HGP par FXR, différentes analyses ont été effectuées dans
notre modèle de MPHs (Figure 43 panel A-D). L’expression génique de Foxo1 n’est pas
modifiée lorsque l’expression de FXR est déplétée par siRNA (Figure 43 panel A) ou dans les
MPHs Fxr-/- comparés aux MPHs contrôles (Figure 43 panel B). Foxo1 n’est que
modestement induit par le glucagon (Figure 43 panel A-B). Enfin, la déplétion par siRNA de
l’expression de FOXO1, bien que réduisant la production basale de glucose, n’affecte pas la
potentialisation de la réponse AMPc par l’agoniste FXR (Figure 43 panel C-D). Nous

149
pouvons donc conclure que, dans notre modèle, l’activation de FXR potentialise l’induction
de l’HGP par la voie glucagon/AMPc de manière indépendante à FOXO1.

Figure 43 : FXR induit l’HGP indépendamment de l’action de FOXO1.

Mesure de l’expression génique de Foxo1 par RT-qPCR : (A) Dans les MPHs transfectés 48 heures avec un
siRNA aléatoire (Scr. ou scramble siRNA) ou ciblant Fxr (Fxr siRNA). (B) Dans les MPHs isolés à partir de
foies de souris Fxr+/+ ou Fxr-/-. (A) et (B), les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3) et
sont exprimés par rapport au niveau d’expression basal mesuré dans les conditions non traitées arbitrairement
fixé à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **,
p<0,01, ***, p<0,005.
Effet de la répression de l’expression de FOXO1 sur l’HGP : après isolement les MPHs sont transfectés 48
heures avec un siRNA aléatoire (Scr. siRNA) ou ciblant Foxo1 (Foxo1 siRNA). (C) Efficacité de la répression
de Foxo1 par siRNA. Expressions protéiques en FOXO1 des MPHs analysées par la technique d’immuno-
détection capillaire (Simple Western, WES). (D) Mesure de l’HGP après déplétion de l’expression en FOXO1.
La concentration en glucose mesurée est normalisée par celle en protéine correspondante. Les résultats sont

150
présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3). Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test
post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. β-ACTIN : β-ACTINE.

2) La voie glucagon/AMPc interfère avec la régulation par FXR des

expressions de ses gènes cibles:

Afin de déterminer les éventuelles interactions entre les voies régulées par le glucagon
et par FXR, les profils d’expression génique de MPHs en présence ou non de glucagon, avec
ou sans traitement GW4064 ont été établis à l’aide de puces Affymetrix.
Une proportion significative de gènes (426) induits par le GW4064 devient réfractaire
à cette activation en présence de glucagon (Figure 44 panel A). A l’inverse, 71 transcrits, qui
sont soit faiblement soit non modulés par le GW4064, deviennent sensibles à l’agoniste FXR
en présence de glucagon (Figure 44 panel A et B). Parmis ces 71 transcrits, 45 sont induits in
vivo dans des conditions de jeûne physiologique ou prolongé (Tableau S1 en annexe, analyses
réalisées par Philippe LEFEBVRE ). L’analyse de l’enrichissement des termes à l’aide de la
base de données « Gene Ontology term », a permis de déterminer, pour ces deux sous-
ensembles, que les processus associés au métabolisme du glucose étaient significativement
sur-représentés (Figure 44 panel A).

151
Figure 44 : Profils d’expression génique des MPHs après traitements, seul ou combiné, par le GW4064 (2
µM) et le glucagon (100 nM). (A) Les ARNs sont extraits après 6 heures de traitements et analysés à l’aide du
logiciel « Affymetrix MoGene arrays ». Les graphiques représentant les différents niveaux d’expressions
géniques « heatmap » ont été générés à l’aide du logiciel « Genespring ». Les voies métaboliques associées aux
différents sous-ensembles de gènes ont été identifiées à l’aide du logiciel en ligne « Gene Ontology »
(http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis). Celles-ci sont indiquées avec le pourcentage
d’enrichissement et la valeur de p. Negative regulation of trancription : répression de la transcription, Response
to glucose : réponse au glucose, Carbohydrate metabolic process : voie métabolique du glucose,
Gluconeogenesis : néoglucogenèse. (B) : Agrandissement du panel A. Seul les gènes qui deviennent sensibles à
l’agoniste FXR en présence de glucagon sont présentés. Les symboles officiels de ces gènes sont indiqués à
droite.

Un examen plus approfondi a permis d’identifier dans le sous-ensemble de gènes

devenant plus sensible au GW4064 en présence de glucagon, ceux codant pour les enzymes
clefs de la néoglucogenèse (Fbp1, Pck1 et G6pc) et un gène cible de FXR (Slc51b/Ostβ). De
même, dans le sous-ensemble de gènes devenant réfractaire au GW4064 en présence de

152
glucagon, il est retrouvé des gènes cibles de FXR (Shp/Nr0b2, Abcb11/Bsep et Abcb4/Mdr3).
Les profils d’expression de ces gènes ont été confirmés par RT-qPCR dans les mêmes
conditions (Figure 45 panel A et C) et en remplaçant le GW4064 par le CDCA, ligand naturel
de FXR (Figure 46). De même, lorsque cela a été possible, les profils des expressions
protéiques associés à ces gènes ont été mesurés (Figure 45 panel B et D). De manière
intéressante, ces profils d’expression sont cohérents avec les effets sur l’HGP observés dans
les MPHs. En effet, le traitement simultané par le glucagon et un agoniste FXR entraine une
augmentation de l’expression génique des enzymes clefs de la néoglucogenèse (Fbp1, G6pc
et Pck1) associée à la répression de celle de Shp dont l’action inhibitrice sur la
néoglucogenèse a été décrite in vitro (Park et al., 2007)(Yamagata et al., 2004) et in vivo (Ma
et al., 2006).

153
Figure 45: Validation par RT-qPCR des niveaux d’expression génique et par Wes des niveaux
d’expression protéique des gènes d’intérêts identifiés (MPHs). Les ARNs sont extraits après 6 heures de
traitements, les extraits protéiques après 8 heures (A). Gènes devenant sensibles à l’action du GW4064 (2 µM)
en présence de glucagon (100 nM). (B) Niveaux d’expression protéique correspondant à (A) après traitements
GW4064 (2 µM) et/ou 8-CPT-cAMP (100 µM). (C) Gènes devenant réfractaires à l’action du GW4064 en
présence de glucagon. (D) Niveaux d’expression protéique correspondant à (C). (A) et (C) Les résultats sont
présentés comme la moyenne +/- SEM (n=5) et sont exprimés par rapport au niveau d’expression basal mesuré
dans les conditions non traitées arbitrairement fixé à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2
avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. β-ACTIN : β-ACTINE.

154
Figure 46: Validation par RT-qPCR des niveaux d’expression génique des gènes d’intérêts identifiés
(MPHs). Les ARNs sont extraits après 6 heures de traitements au CDCA (125 µM) et/ou glucagon (100 nM).
Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=5) et sont exprimés par rapport au niveau
d’expression basal mesuré dans les conditions non traitées arbitrairement fixé à 1. Les valeurs sont comparées à
l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005.

Afin de confirmer que les effets observés sur les expressions de ces différents gènes
sont bien dépendantes de FXR, des expériences similaires ont été réalisées lorsque son
expression est déplétée par siRNA (Figure 47 panel D). Les effets de potentialisation ou
d’inhibition de l’induction par le GW4064 des gènes cibles de FXR en présence de glucagon
sont bien abolis en conditions siFxr (Figure 47 panel A et F). De même, la potentialisation de
l’induction des enzymes clefs de la néoglucogenèse par le glucagon en présence de GW4064
n’est plus observée dans ces mêmes conditions (Figure 47 panel B, C et E). L’expression de
FXR est donc nécessaire aux différents effets de potentialisation ou de répression observés.

155
Figure 47: Validation de l’implication de FXR dans les effets de potentialisation ou de répression observés
(MPHs). Après isolement les MPHs sont transfectés 48 heures avec un siRNA aléatoire (SiScr) ou ciblant Fxr
(siFxr). Les ARNs sont extraits après 6 heures de traitements au GW4064 (2 µM) et/ou glucagon (100 nM). En
parallèle de la mesure des expressions des gènes des enzymes de la néoglucogenèse et de celles des gènes cibles
de FXR, celle de la production de glucose est également réalisée (Figure 41). Les résultats sont présentés comme
la moyenne +/- SEM (n=3) et sont exprimés par rapport au niveau d’expression basal mesuré dans les conditions
non traitées arbitrairement fixé à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de
Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005.

De même, afin de confirmer que les effets observés sur les expressions de ces
différents gènes sont bien dépendantes de l’activation de la PKA par la voie glucagon/AMPc,

156
des expériences similaires ont été réalisées lorsque les expressions des sous-unités
catalytiques α et β de cette kinase (codées par les gènes Prkaca et Prkacb) sont déplétées par
siRNAs (Figure 48 panel F). L’expression de la PKA est nécessaire à la potentialisation de
l’induction par le 8-Br-cAMP (un analogue de l’AMPc) de Fbp1, Pck1 et G6pc en présence
de GW4064 (Figure 48 panel A, B et C). À l’inverse, la répression de la capacité du GW4064
à induire Shp/Nr0b2 en présence de 8-Br-cAMP, n’est pas affectée par la déplétion de
l’expression de la PKA (Figure 48 panel D).
De manière intéressante, les effets observés sur les expressions géniques de G6pc,
Fbp1 et Pck1 et ceux associés à la déplétion de FXR ou de la PKA par siRNA se répercutent
au niveau de la réponse biologique des MPHs. En effet, la potentialisation par FXR de
l’induction de l’HGP par le 8-CPT-cAMP est bien abolie en condition siFxr (Figure 42). De
même, dans les conditions siPrkaca&b, l’induction de l’HGP par le 8-CPT-cAMP est
fortement diminuée et sa potentialisation par le GW4064 est elle abolie (Figure 48 panel E).

Figure 48: Validation de l’implication de la PKA dans les effets de potentialisation ou de répression
observés (MPHs). Après isolement les MPHs sont transfectés 48 heures avec un siRNA aléatoire (Scramble
siRNA ou Scr. siRNA) ou un mélange de siRNAs ciblant les deux sous-unités catalytiques de la PKA (codées
par les gènes Prkaca et Prkacb) (Prkaca&b siRNA ou PKAca/cb siRNA). (A-D) Mesure des expressions
géniques. Les ARNs sont extraits après 6 heures de traitements au GW4064 (2 µM) et/ou le 8-Br-cAMP (0,5

157
mM). Les expressions des gènes des enzymes de la néoglucogenèse et celle de Shp/Nr0b2 gène cible de FXR
sont mesurées en parallèle de la production de glucose (E). Les résultats sont présentés comme la moyenne +/-
SEM (n=5) et sont exprimés par rapport au niveau d’expression basal mesuré dans les conditions non traitées
arbitrairement fixé à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni.
*, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (E) Mesure de l’HGP. Même conditions que (A-D). La concentration en
glucose mesurée est normalisée par celle en protéine correspondante. Les résultats sont présentés comme la
moyenne +/- SEM (n=3). Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de
Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (F) Efficacité de la répression de la PKA par siRNA.
Expressions protéiques en PKAca et PKAcb des MPHs analysées respectivement par western blot et par la
technique d’immuno-détection capillaire (Simple Western, WES). β-ACTIN : β-ACTINE.

En conclusion, la potentialisation, par un agoniste FXR, de l’induction par la voie

glucagon/AMPc de l’HGP peut être associée à deux mécanismes. D’une part, les gènes des
enzymes clefs de la néoglucogenèse (Fbp1, Pck1, G6pc) sont plus fortement induits dans ces
conditions de manière dépendante aux expressions de FXR et de la PKA. D’autre part, la
capacité de FXR à induire son gène cible Shp/Nr0b2, un inhibiteur de la néoglucogenèse, est
réprimée mais de manière indépendante à l’expression de la PKA.

3) La phosphorylation de FXR par la PKA sur ses sérines en position 325 et

357 régule son activité transcriptionnelle:

L’action de FXR étant modifiée en présence d’activateurs de la PKA (analogue

de l’AMPc ou glucagon), il est possible qu’il soit directement ciblé par cette kinase. Afin de
vérifier cette hypothèse, les isoformes murines FXRα1 et FXRα3 ont été utilisées, sous forme
de protéines recombinantes, pour un test de phosphorylation in vitro. Ces expériences ont
montrées un transfert de phosphate radioactif, dépendant de la PKA, sur les deux isoformes de
la protéine FXR (Figure 49 panel A). Celui-ci s’effectue à une intensité comparable à celle
observée en utilisant la kinase PKCα, auparavant identifiée comme ciblant FXR (Gineste et
al., 2008)(Figure 49 panel B). Enfin, GSK3β, une kinase également activée au cours du jeûne,
n’est pas capable de phosphoryler FXR (Figure 49 panel C). Nous pouvons donc conclure que
lors du jeûne, FXR peut être phosphorylé directement par la PKA suite à l’activation de la
voie glucagon/AMPc, à l’inverse la GSK3β ne semble pas pouvoir le modifier. La PKA est
capable de phosphoryler les isoformes 1 et 3 de FXR, elle ne cible donc pas des sites situés
spécifiquement au niveau des séquences protéiques qui différencient ces deux isoformes.

158
Figure 49: Identification in vitro de la phosphorylation directe de FXR par la PKA. Les protéines
recombinantes purifiées des isoformes murines 1 et 3 de FXR et un ATP radio-marqué sont utilisés comme
substrats dans des réactions de phosphorylation in vitro. Les actions de kinases recombinantes purifiées PKAca
(A), PKCα (B) et GSK3β (C) sont testées. Les protéines MPB et GyS (glycogène synthase) servent de contrôles
positifs. Les produits de réactions ont été détectés par autoradiographie après séparation sur un gel SDS-PAGE
10%.

De nouvelles expériences de phosphorylation in vitro par la PKA sur la protéine

mFXRα1 ont été réalisées en utilisant un ATP non radio-actif. Les protéines correspondantes
ainsi que celles contrôles (mêmes conditions mais sans ajout de la kinase) ont été analysées
par spectrométrie de masse. Ceci a permis d’identifier les peptides de FXR phosphorylés par
la PKA dans ce contexte in vitro (Figure 50 panel A-E). Les sites mis en évidence
correspondent à trois sérines identifiées par bioinformatique comme faisant partie d’un motif
consensus reconnu par la PKA, ainsi que deux sérines identifiées de novo. Ces sérines sont
situées respectivement en position 132, 151, 357 et 114, 325 sur la séquence protéique du
FXRα1 murin (Figure 50 panel F).

159
Figure 50: Captures d’écran des spectres de masses des phospho-peptides de FXR ciblés par la PKA.
Les spectres de masses des phospho-peptides identifiés à partir de la protéine mFXRα1 en présence de la PKAca
sont les suivants : (A) S+80GISDEYIPTMFSFYK, (B) MAAAS+80AGR, (C) GS+80AVEAMFLR, (D)
AS+80GYHYNALTCEGCK et (E) S+80ITKNAVYK. (Les expériences de spectrométrie de masse et leurs
analyses ont été réalisées par le LSMBO de l’université de Strasbourg) (F) Répartition des sites ciblés par la
PKA identifiés sur la séquence protéique de mFXRα1. * indique les phospho-peptides contenant un motif
consensus de phosphorylation par la PKA. L’analyse bioinformatique a été réalisée à l’aide des logiciels

160
NetPhosK du serveur CBS (Center for Biological Sequence analysis / http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)
et Scansite Motif Scanner (Massachussetts Institute of Technology / https://scansite4.mit.edu/4.0/#home ).

Afin d’évaluer l’impact de l’activation de la PKA sur l’activité transcriptionnelle de

FXR, un test de trans-activation dans lequel FXR est exprimé sous la forme d’une protéine
fusionnée avec le domaine de fixation à l’ADN de la protéine de levure Gal4 (essai simple
hybride) est réalisé (Figure 51 panel A). Ceci permet de visualiser uniquement le niveau
d’activation de la transcription induite par FXR sur un plasmide rapporteur dans lequel
l’élément de réponse du Gal4 (UAS, Upstream Activating Sequence) contrôle l’expression du
gène de la luciférase. Ce système permet d’exclure tout les effets qui pourraient être associés
à une modification de la capacité de FXR : à s’hétérodimériser avec RXR, à se fixer sur
l’ADN ou dépendant de son HRE. Cette expérience montre que la stimulation seule de la
PKA par la forskoline (un activateur de l’adénylate cyclase) n’affecte pas l’activité
transcriptionnelle de FXR. Par contre, la trans-activation induite par le GW4064 est
potentialisée en présence de la forskoline (Figure 51 panel A). Les mêmes profils sont
observés dans un système où FXR est exprimé sous une forme native (mFXRα1) et où le gène
rapporteur est sous contrôle de trois séquences IR-1, l’élément de réponse consensus de FXR
(Figure 51 panel B). Enfin, ce dernier système a été utilisé en exprimant FXR sous des formes
mutantes pour lesquels les sites, précédemment identifiés comme ciblés par la PKA, ne
peuvent plus être phosphorylés. Pour cela, les séquences codant pour les différentes sérines
ont été modifiées afin qu’elles expriment à la place des alanines. Seules les mutations des
sérines S325 et S357 diminuent la potentialisation de l’activité transcriptionnelle de FXR
induite par le GW4064 en présence de forskoline. Cet effet est partiel lorsque un seul de ces
deux sites est muté, alors que la potentialisation est complétement abolie lorsque les deux
sites sont mutés simultanément (Figure 51 panel B). Les autres mutations des sites
précédemment identifiés n’ont aucun effet (Figure 51 panel C). Il est à noter que ces
expériences sont réalisées dans une lignée cellulaire, les HEK293, n’exprimant pas FXR de
manière endogène, seules les actions des formes mutantes sont donc mesurées. De plus, les
mutations réalisées n’affectent ni la stabilité de la protéine FXR (Figure 51 panel D), ni la
réponse au GW4064 seul (Figure 51 panel B). Les effets observés ne sont donc pas le fait de
changements structuraux impactant FXR qui auraient pu être introduits par les différentes
mutations. Nous pouvons conclure que les sérines S325 et S357 sont nécessaires et suffisantes
à la potentialisation de l’activité transcriptionnelle de FXR par la voie glucagon/AMPc et la
PKA.

161
Figure 51 : La protéine kinase A régule l’activité transcriptionnelle de FXR. (A) Potentialisation de
l’activité transcriptionnelle de FXR : « one-hybrid assay » les cellules HEK293 sont transfectées avec les
plasmides indiqués et traitées pendant 6 heures. (B) Les sérines en position 325 et 357 sont nécessaires à la
potentialisation de l’activité transcriptionnelle de FXR par la PKA. Mêmes conditions que (A). (A) et (B), les
résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=6) et sont exprimés par rapport à l’activité luciférase
basale mesurée dans les conditions non traitées arbitrairement fixée à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide
d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (C) Evaluation des
effets des mutants non modifiables des différents sites de phosphorylation identifiés par spectrométrie de masse.
Mêmes conditions que (A) Les valeurs de l’axe Y correspondent aux différentiels des activités luciférase
mesurées entre les conditions FSK+GW4064 et GW4064. Les données sont représentées par rapport à la
condition utilisant le plasmide exprimant la forme non mutée de FXR (mFXRα1) arbitrairement fixée à 1. Les
valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***,
p<0,005. (D) : Stabilité protéique des formes mutantes de FXR. Les expressions protéiques en FXR des cellules
HEK293 transfectées comme décrit précédemment ont été analysées par western blot.

162
4) La phosphorylation de FXR par la PKA sur ses sérines en position 325 et
357 est nécessaire à la potentialisation de l’HGP par le GW4064 :

FXR peut donc être phosphorylé par la PKA ce qui modifie son activité
transcriptionnelle. La contribution de cette phosphorylation dans la potentialisation de l’HGP
induite par la voie glucagon/AMPc par le traitement GW4064 a été évaluée dans des MPHs
isolés à partir de souris Fxr-/-. Pour cela, l’expression de FXR a été restaurée par transfection
transitoire sous sa forme native ou sous sa forme mutée (S325,357A) (Figure 52 panel A). Si
la capacité du GW4064 à potentialiser l’HGP réapparait lorsque le FXR natif est de nouveau
exprimé, cela n’est pas le cas lorsque la forme mutante est restaurée à un niveau similaire
(Figure 52 panel A). Il est à noter que cette observation est corrélée aux profils d’expression
des gènes G6pc, Pck1 et Fbp1, mesurés dans les mêmes conditions (Figure 52 panel B-D).

Figure 52 : Le maintien de la capacité de FXR à être phosphorylé par la PKA est nécessaire à la
potentialisation de l’HGP par le GW4064. (A) Mesure de la production de glucose après restauration d’une
forme native (mFxr1) ou mutante (S325,357A) de FXR dans des MPHs isolés à partir de souris Fxr-/-. Les

163
MPHs sont transfectés 24 heures avec les vecteurs d’expressions (pCMX) indiqués. La concentration en glucose
est mesurée après 8 heures de traitements et est normalisée par celle en protéine correspondante. Les résultats
sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3). Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un
test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. Panel du bas : Les expressions protéiques en
FXR des MPHs transfectés comme décrit précédemment ont été analysées par la technique d’immuno-détection
capillaire (Simple Western, WES). pCMX : Vecteur vide. (B-D) Mesure de l’expression génique des enzymes de
la néoglucogenèse après restauration d’une forme native (mFxr1) ou mutante (S325,357A) de FXR dans des
MPHs isolés à partir de souris Fxr-/-. Les ARNs sont extraits après 6 heures de traitements au GW4064 (2 µM)
et/ou glucagon (100 nM). Les expressions des gènes des enzymes de la néoglucogenèse sont mesurées en
parallèle de la production de glucose (A). Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3) et sont
exprimés par rapport au niveau d’expression basal mesuré dans les conditions non traitées arbitrairement fixé à
1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **,
p<0,01, ***, p<0,005.

5) La potentialisation de la transcription des gènes de la néoglucogenèse

induite par FXR est associée aux actions de CREB et de la PKA.

Le mécanisme grâce auquel FXR et la PKA régulent conjointement la néoglucogenèse

a été étudié pour deux des gènes codant pour des enzymes clefs de ce processus, Fbp1 et
Pck1. Classiquement, l’induction de l’expression génique des enzymes clefs de la
néoglucogenèse est associée à celle du facteur de transcription CREB suite à sa
phosphorylation par la PKA (Oh et al., 2013). Des données de ChIP-seq (Chromatin
ImmunoPrecipitation Sequencing), qui ont permis d’identifier les différents sites de fixation
sur le génome de FXR (Lien et al., 2014)(Thomas et al., 2010) ou de CREB (Everett et al.,
2013) dans des foies murins, nous ont servi à mettre en évidence des sites de fixation de FXR
en amont des régions régulatrices (URRs) des gènes Fpb1 et Pck1 chevauchant avec ceux
correspondant à CREB. Nous avons récupéré les séquences ADN englobant les sites de
fixation de FXR et CREB correspondantes, notées régions de co-fixation (CBRs). Nous avons
ensuite identifié à l’aide du logiciel MatInspector (Genomatix) les éléments de réponse de
FXR (FXRE) et CREB (CRE), ce qui nous a permis de montrer que ceux-ci se chevauchaient
également (Figure 53 panel A et Figure 54 panel A). Les séquences ADN correspondantes à
ces CBRs, ont été clonées dans des plasmides en amont du gène rapporteur codant pour la
luciférase. Des tests de trans-activation ont été réalisés afin d’évaluer leurs fonctionnalités.
Ceux-ci ont montré que la potentialisation par la voie AMPc de l’activité transcriptionnelle de
FXR était maintenue dans ces constructions chimériques lorsqu’elles sont co-transfectées
avec la forme native de FXR (Figure 53 panel B et Figure 54 panels B-C). De plus, les

164
mutations des sérines 325 et 357 de FXR en alanines suppriment cet effet conformément aux
précédentes observations. La régulation des gènes endogènes a été mesurée dans des MPHs
pour lesquels les expressions de Fxr ou Creb1 ont été déplétées par siRNAs (Figure 42 panel
B et Figure 53 panel D). En accord avec nos précédents résultats, l’expression de FXR est
nécessaire à la potentialisation de l’induction par le glucagon des expressions géniques de
Fbp1 (Figure 53 panel C) et Pck1 (Figure 54 panel D) en présence de GW4064. L’expression
de CREB est également nécessaire à la mise en place de cet effet (Figure 53 panel C et Figure
54 panel D). Enfin, la mesure, par ChIP (Chromatin ImmunoPrecipitation)-qPCR, des
fixations de FXR et CREB au niveau des zones de chevauchement de leurs éléments de
réponse respectifs, pour le gène Fbp1 (Figure 53 panels E-F) et pour le gène Pck1 (Figure 54
panels E-F) confirme leurs présences sur les CBRs. Les densités de FXR sur ces zones de
chevauchement sont plus fortes lorsque les MPHs ont été traités simultanément avec le
GW4064 et le glucagon (Figure 53 panel E et Figure 54 panel E). Ceci suggère que c’est
l’augmentation du recrutement de FXR ou sa stabilisation sur ces sites qui serait responsable
des effets de potentialisation de la transcription observés pour ces deux gènes.

165
Figure 53: Les activations simultanées de la PKA et de FXR co-activent la transcription du gène Fbp1 de
manière dépendante à la phosphorylation de FXR et à l’expression de Creb1. (A) Identification d’un site de
co-fixation (CBR) de FXR et CREB à proximité du gène Fbp1. Les nombres indiquent la position de chaque
élément de réponse potentiel de FXR (FXRE) et CREB (CRE) par rapport au TSS (site de démarrage de la
transcription). (B) Activité transcriptionnelle de FXR sur la zone de co-fixation (CBR) identifiée. La réponse de
la séquence régulatrice clonée est mesurée par un test de transfection dans les mêmes conditions que la figure 51.
Panel de droite : Les expressions protéiques en FXR des cellules transfectées ont été analysées par la technique
d’immuno-détection capillaire (Simple Western, WES). (C) Mesure des expressions géniques endogènes : Les
MPHs sont transfectés avec le siRNA indiqué et l’expression génique de Fbp1 est mesurée par RT-qPCR. (D)
Efficacité de la répression de Creb1 par siRNA. Les expressions protéiques en CREB1 des MPHs transfectés
comme décrit précédemment ont été analysées par la technique d’immuno-détection capillaire (Simple Western,
WES). (E-F) Fixation de la protéine FXR (E) ou CREB (F) endogène sur les sites de fixation précédemment
identifiés. La densité de FXR (E) ou CREB (F) sur l’élément de réponse composite est mesurée par ChIP-qPCR.

166
Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=5-6). Les valeurs sont comparées à l’aide d’une
ANOVA2 avec un test post hoc de Tukey *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. FXRE : élément de réponse de
FXR, CRE : élément de réponse de CREB. TSS : transcription start site. β-ACTIN : β-ACTINE.

Figure 54: Les activations simultanées de la PKA et de FXR co-activent la transcription du gène Pck1 de
manière dépendante à la phosphorylation de FXR et à l’expression de Creb1. (A) Identification des sites de
co-fixation (CBRs) de FXR et CREB à proximité du gène Pck1. Les nombres indiquent la position de chaque

167
élément de réponse potentiel de FXR (FXRE) et CREB (CRE) par rapport au TSS (site de démarrage de la
transcription). (B-C) Activité transcriptionnelle de FXR sur les zones de cofixation (CBRs) identifiées. La
réponse des séquences régulatrices clonées est mesurée par un test de transfection dans les mêmes conditions que
la figure 51. (D) Mesure des expressions géniques endogènes : Les MPHs sont transfectés avec le siRNA indiqué
et l’expression génique de Pck1 est mesurée par RT-qPCR. (E-F) Fixation de la protéine FXR (E) ou CREB (F)
endogène sur les sites de fixation précédemment identifiés. La densité de FXR (E) ou CREB (F) sur les éléments
de réponse composites est mesurée par ChIP-qPCR. Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM
(n=5-6). Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Tukey *, p<0,05, **,
p<0,01, ***, p<0,005. FXRE : élément de réponse de FXR, CRE : élément de réponse de CREB. TSS :
transcription start site.

6) Le glucagon réprime l’induction de la transcription de Shp/Nr0b2 par

FXR via FOXA2 :

Comme décrit précédemment, l’induction de l’expression de Shp/Nr0b2 par FXR est

contrecarrée en présence de glucagon ou d’analogues de l’AMPc indépendamment de
l’expression de la PKA (Figure 48 panel D). Un des mécanismes qui pourrait expliquer cette
répression de l’activité transcriptionnelle de FXR est la mise en place d’une interaction
fonctionnelle entre FXR et un facteur induit par la voie glucagon/AMPc.
Dans la suite de cette étude, j’ai intégré différents résultats obtenus par ma collègue
Claire MAZUY dans le cadre de ses travaux de thèse (Mazuy, 2015). Dans ce chapitre
résultats, je ne montrerai que les figures associées aux données que j’ai moi-même générées.
Les figures regroupant les résultats obtenus par ma collègue se trouvent dans l’article que
nous avons publié en tant que co-auteur, placé en annexe. J’indiquerai pour celles-ci la
numérotation correspondant à cet article.
Ma collègue a identifié, à l’échelle génomique et au niveau hépatique, les facteurs de
transcription les plus souvent liés à l’ADN à proximité d’un site de fixation de FXR. Pour
cela, elle a utilisé les données générées par le consortium ENCODE (ENCODE, 2012) qui a
identifié, au niveau du génome de la lignée cellulaire hépatocytaire HepG2, les sites de
fixation de 51 facteurs de transcription. Elle a combiné ceux-ci avec les résultats obtenus
précédemment dans notre laboratoire qui avaient permis d’identifier les sites de fixation de
FXR dans le même modèle (Berrabah et al., 2014). Son analyse a montré que FXR et le
facteur de transcription FOXA2 étaient fréquemment co-localisés (Figure S12 et Figure 4
panel A, article en annexe). Ce résultat a été confirmé chez la souris en utilisant des données
de ChIP-seq permettant la localisation sur le génome de l’ensemble des sites de fixation de
FXR (Thomas et al., 2010) et de FOXA2 (Soccio et al., 2011), à partir d’échantillons issus de

168
foies totaux prélevés après un jeûne court (Figure 4 panel D, article en annexe). Les gènes
associés spatialement à ces sites de co-fixations (CBRs) ont été identifiés et soumis à une
analyse d’enrichissement de termes à l’aide de la base de données Gene Ontology. Il apparaît
que ces gènes sont significativement associés aux processus régulant le métabolisme du
glucose (Figure 4 panel D, article en annexe).
Or, au niveau hépatique, FOXA2 est décrit comme induit par le glucagon et inactivé
par l’insuline (Howell & Stoffel, 2009)(Wolfrum et al., 2003). Ce facteur de transcription
pourrait donc être impliqué dans le mécanisme de répression de l’induction de Shp/Nr0b2 par
FXR en présence de glucagon.
Afin de tester cette hypothèse, nous avons tout d’abord confirmé que les effets
précédemment observés étaient reproductibles dans la lignée HepG2. Ainsi, la potentialisation
de l’activation, induite par la forskoline, des gènes de la néoglucogenèse en présence de
GW4064 est bien observée dans cette lignée humaine, ceci pour les enzymes PCK1 et G6PC,
FBP1 n’étant pas exprimé dans les HepG2 (Figure 55 panel A). La répression de l’induction,
par le GW4064, de SHP/NR0B2 en présence de forskoline est également observée. À
l’inverse, la potentialisation de l’induction, par le GW4064, du gène OSTβ/SLC51B en
présence d’un activateur de la voie glucagon/AMPc ne l’est pas, ce qui suggère, de manière
assez attendue, que tous les résultats obtenus dans un modèle murin ne sont pas transposables
dans un modèle humain (Figure 55 panel A).
Comme FOXA2 est activé par le glucagon et inactivé par l’insuline, nous avons
mesuré, dans notre modèle MPHs, les expressions géniques et protéiques de SHP/NR0B2
dans ces deux conditions en présence ou absence de GW4064. L’objectif est de confirmer que
l’induction de Shp/Nr0b2 par l’agoniste FXR, en présence de glucagon, est bien réprimée par
rapport à celle en présence d’insuline, de manière similaire à ce qui a précédemment été
observé lorsque le GW4064 est utilisé seul. Comme cela est le cas, ceci nous permet d’utiliser
par la suite l’insuline comme un inhibiteur de l’action de FOXA2 (Figure 55 panel B).

169
Figure 55 : Confirmation dans les HepG2 des effets observés dans les MPHs. (A) Mesure de l’expression de
gènes régulant la néoglucogenèse (PCK1 et G6PC) et de gènes cibles de FXR (OSTβ/SLC51B et SHP/NR0B2)
dans la lignée hépatocytaire humaine HepG2. Les ARNs sont extraits après 6 heures de traitements au GW4064
(2 µM) et/ou forskoline (10 µM). Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3) et sont
exprimés par rapport au niveau d’expression basale mesuré dans les conditions non traitées arbitrairement fixé à
1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **,
p<0,01, ***, p<0,005. (B) Expressions protéiques et géniques de SHP/NR0B2 dans les MPHs traités ou non par
le GW4064 en présence d’insuline ou de glucagon. Les ARNs sont extraits après 6 heures de traitements, les
extraits protéiques après 8 heures. Panel du haut : les expressions protéiques en SHP/NR0B2 des MPHs ont été
analysées par la technique d’immuno-détection capillaire (Simple Western, WES). Panel du bas : mesure des
expressions géniques. Les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3) et sont exprimés par
rapport au niveau d’expression basale mesuré dans les conditions non traitées arbitrairement fixé à 1. Les valeurs
sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***,
p<0,005. β-ACTIN : β-ACTINE.

Ma collègue a mesuré, à l’aide de puces Affymetrix, les profils d’expression génique

de MPHs, activés ou non, par le GW4064 en présence d’insuline ou de glucagon. Ceci, dans
deux conditions, une dans laquelle l’expression de FOXA2 a été déplétée à l’aide d’un
shRNA (petit ARN en épingle à cheveux) (shFoxa2) et une autre contrôle utilisant un shRNA
ciblant la β-galactosidase (shLacZ). Ces shRNAs sont transduits dans les MPHs à l’aide d’un
vecteur adénoviral. L’objectif est d’identifier l’impact de l’activation de FOXA2 par le
glucagon sur l’activité transcriptionnelle de FXR induite par le GW4064. Cette expérience a

170
confirmé, les profils d’expression obtenus précédemment (Figure 44) et notamment
l’apparition d’un sous-ensemble de gènes devenant réfractaire à l’action du GW4064 en
présence de glucagon. La déplétion de FOXA2 a permis d’identifier, dans ce sous-groupe,
200 transcrits pour lesquels ce profil réfractaire est dépendant de l’expression de FOXA2
(Figure 4 panel E, article en annexe). C’est notamment le cas du gène Shp/Nr0b2 (Figure 4
panel F, article en annexe). Ceci va dans le sens de notre hypothèse qui suppose que FOXA2
est impliqué dans la répression de l’induction de SHP/NR0B2 par un agoniste FXR lorsque la
voie glucagon/AMPc est simultanément activée.
Ma collègue a étudié le mécanisme de répression de l’activité transcriptionnelle
de FXR par FOXA2, en utilisant Shp/Nr0b2 comme gène modéle. Elle a tout d’abord
confirmé, dans les foies murins, la présence d’un CBR de FXR et FOXA2 au niveau de
l’URR de ce gène, en utilisant les données de la littérature précédemment citées (Figure 5
panel A, article en annexe).
A l’aide de différents modèles (souris Fxr-/- et MPHs murins), Elle a démontré que la
fixation de FOXA2 sur l’ADN était dépendante de celle de FXR (Figure 5 panel B, article en
annexe) et qu’elle était augmentée en présence de glucagon et/ou de GW4064 (Figure 5 panel
C, article en annexe). L’analyse en ChIP-reChIP (sequential chromatin immunoprecipitation)
a confirmé que FXR et FOXA2 se fixaient simultanément au niveau du CBR localisé sur le
promoteur de Shp/Nr0b2 (Figure 5 panel D, article en annexe). De plus, ma collègue a
démontré que FXR et FOXA2 étaient capables d’interagir physiquement in vitro (Figure 5
panel E, article en annexe) ainsi que dans la lignée HepG2 (Figure 5 panel F, article en
annexe). Ce que nous avons confirmé dans les foies murins (Figure 56).

171
Figure 56: Confirmation, dans les foies murins, de l’interaction physique entre FXR et FOXA2. Test de co-
immunoprécipitation de FXR et FOXA2. Les extraits protéiques de foies totaux ont été préparés à partir de
souris mises à jeûner pendant 6 heures (sacrifice à ZT18) (J.) et de souris nourries ad libitum (sacrifice à ZT21)
(N.). Panel de gauche : les expressions protéiques en FXR, FOXA2 et PCK1 ont été mesurées par la technique
d’immuno-détection capillaire (Simple Western, WES). Panel de droite : Les mêmes extraits protéiques ont été
soumis à une immuno-précipitation à l’aide de l’anticorps indiqué (IP) et le matériel immuno-précipité a été
analysé par la suite en western blot à l’aide de l’anticorps indiqué (WB). β-ACTIN : β-ACTINE.

Ma collègue a ensuite confirmé, dans la lignée hépatocytaire murine AML12, les

fixations de FXR et FOXA2 au niveau du CBR associé au gène Shp/Nr0b2, ainsi que leurs
recrutements en présence de GW4064 (Figure 6 panel A, article en annexe). En utilisant les
vecteurs viraux shFoxa2 et shLacZ sur les AML12, elle a démontré que l’induction de
l’expression génique de Shp/Nr0b2 par le GW4064 était augmentée lorsque les cellules
étaient déplétées en FOXA2 (Figure 6 panel B, article en annexe). Ceci est corrélé avec, au
niveau du CBR et en condition shFoxa2, l’augmentation du recrutement de FXR associé au
traitement GW4064 et à la diminution de celui de FOXA2 qui est quasiment aboli (Figure 6
panel C, article en annexe).
Nous avons confirmé que les effets que nous avons observés précédemment dans les
MPHs étaient bien reproductibles dans la lignée AML12. La potentialisation, par le GW4064,
de l’induction des expressions géniques des enzymes clefs de la néoglucogenèse par le 8-Br-
cAMP, est bien retrouvée pour G6pc et Fbp1, Pck1 n’étant pas exprimé dans les AML12
(Figure 57 panel A-B). De même, en ce qui concerne le gène cible de FXR Ost/Slc51b qui
devient plus sensible à l’action du GW4064 en présence du 8-Br-cAMP (Figure 57 panel C).

172
Ces effets de potentialisation dépendent également du maintien des expressions de FXR et de
la PKA, comme le montre les expériences de siRNAs réalisées dans cette lignée (Figure 57
panel A à E)

Figure 57: Confirmation des effets observés dans les MPHs au niveau de la lignée hépatocytaire murine
AML12. Les cellules sont transfectées 48 heures avec un siRNA aléatoire (Scramble ou Scr. siRNA), ciblant
FXR (FXR siRNA), ciblant les deux sous-unités (PKA cat / ou Prkacab siRNA) ou ciblant une seul sous-

173
unité catalytique de la PKA (Prkaca et Prkacb siRNA) (A-C) Mesure des expressions géniques. Les ARNs sont
extraits après 6 heures de traitements GW4064 (2 µM) et/ou 8-Br-cAMP (0,5 mM). Les résultats sont présentés
comme la moyenne +/- SEM (n=3) et sont exprimés par rapport au niveau d’expression basal mesuré dans les
conditions non traitées arbitrairement fixé à 1. Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test
post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (D) Efficacité de la répression de FXR par siRNA.
Expressions protéiques en FXR des AML12 analysées par la technique d’immuno-détection capillaire (Simple
Western, WES). (E) Efficacité de la répression de la PKA par siRNA. Expressions protéiques en PKAca ou
PKAcb des AML12 analysées respectivement par western blot et par la technique d’immuno-détection capillaire
(Simple Western, WES).

Ma collègue a identifié le mécanisme permettant à FOXA2 de réprimer

l’activité transcriptionnelle de FXR. A l’aide d’expériences de transfection transitoire dans les
HepG2 et notamment l’utilisation d’un mutant de FOXA2 qui ne se fixe plus à l’ADN, elle a
démontré que FOXA2 réprimait l’activité transcriptionnelle de FXR par un mécanisme de
« tethering » (Figure 6 panel D à G, article en annexe).

Les données générées par Claire MAZUY ont donc montré que la répression de
l’induction, par FXR, de SHP/NR0B2 lorsque la voie glucagon/AMPc est simultanément
activée, est dépendante de FOXA2. La déplétion de son expression, suite à la perte de cet
effet, devrait donc entrainer une diminution de l’HGP associée à une répression de la
néoglucogénèse via SHP. Afin de tester cette hypothèse, la production de glucose dans des
MPHs dont l’expression de FOXA2 a, au préalable, été déplétée à l’aide de l’adénovirus
shFoxa2, a été mesurée et comparée à celle des conditions contrôles (shLacZ) (Figure 58).
Les résultats confirment notre hypothèse puisque l’HGP induite par le 8-CPT-cAMP est bien
diminuée dans les conditions shFoxa2. Par contre, la potentialisation de celle-ci suite à
l’activation simultanée de FXR est conservée. Ceci suggère que les effets associés à la
phosphorylation de FXR par la PKA ne sont pas affectés par la diminution de l’expression de
FOXA2.

174
Figure 58 : La déplétion de l’expression de FOXA2 diminue la production de glucose des MPHs.
Après isolement les MPHs sont transduits 48 heures avec un adénovirus codant pour un shRNA ciblant la -
galactosidase (shLacZ) ou FOXA2 (shFoxa2). La concentration en glucose est mesurée après 8 heures de
traitements et est normalisée par celle en protéine correspondante. Les résultats sont présentés comme la
moyenne +/- SEM (n=3). Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de
Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005.

Les données obtenues par ma collègue vont également dans ce sens. En effet, les
analyses des expressions géniques qu’elle a réalisées, au niveau de MPHs, dans des
conditions identiques à celles de la figure 58 (hormis un traitement au glucagon se substituant
à celui au 8-CPT-cAMP) ne montrent pas de différences significatives associées à la déplétion
de FOXA2. Ainsi, les effets de potentialisation observés lors de l’activation simultanée de
FXR et de la PKA sur les gènes Ostβ/Slc51b, Fbp1, Pck1 et G6pc ne sont pas modifiés
(Figure 7 panel B à E, article en annexe). De même, l’action de FOXA2 sur son gène cible
Igfbp1 (Insulin-like growth factor-binding protein 1) (Zhang et al., 2005) n’est pas impactée
significativement par l’ajout de l’agoniste FXR (Figure 7 panel A, article en annexe). Ceci
suggère que FOXA2 et la PKA régulent de manière assez spécifique l’activité
transcriptionnelle de FXR sur des sous-ensembles de ses gènes cibles distincts. Néanmoins
nos résultats sont mesurés à des temps de traitements courts (6 à 8 heures), il est possible que
les deux mécanismes interagissent par la suite dans la régulation globale de l’action hépatique
de FXR au cours du jeûne.

175
 Nos données montrent que FOXA2 agit donc sur l’HGP sans modifier
significativement le mécanisme qui permet la potentialisation de son induction et de celle de
l’expression génique des enzymes clefs de la néoglucogenèse impliquant la PKA, FXR et
CREB. La déplétion par shRNA de FOXA2 réprime l’induction de l’HGP par la voie AMPc.
Il est vraisemblable que le maintien de l’induction par FXR de Shp/Nr0b2, gène inhibiteur de
la néoglucogenèse, dans ces conditions participe à cet effet. Afin de confirmer cette
hypothèse, nous avons mesuré la production de glucose de MPHs dans lesquels l’expression
de FOXA2 a été déplétée seule ou simultanément à celle de l’expression de SHP/NR0B2 à
l’aide de siRNAs (Figure 59 panel B). Ces expériences ont confirmé les résultats obtenus
précédemment suite à l’utilisation de l’adénovirus shFoxa2, c'est-à-dire, dans la condition
siFoxa2 comparée à celle contrôle, une diminution de l’HGP induite par le 8-CPT-cAMP sans
modifier la potentialisation de celle-ci par le GW4064. Lorsque le maintien de la capacité de
FXR à induire Shp/Nr0b2, associé à la déplétion de FOXA2, est « annulé » suite à un co-
traitement par un siShp/Nr0b2, les inductions de l’HGP par le 8-CPT-cAMP sont restaurées
au niveau de celles de la condition contrôle, toujours sans modifier sa potentialisation par le
GW4064 (Figure 59 panel A). Le fait de contrecarrer la capacité de FXR à induire de nouveau
Shp/Nr0b2 en condition de déplétion de FOXA2, est donc suffisante à une restauration pleine
de l’HGP. Nous pouvons donc conclure que le mécanisme impliquant FOXA2, FXR et
SHP/NR0B2 participe donc, de manière non négligeable, à l’augmentation de l’HGP induite
par FXR dans notre modèle mimant les conditions de jeûne.

176
Figure 59 : Impact de la régulation de SHP/NR0B2 via FOXA2 sur l’HGP (MPHs). Après isolement les
MPHs sont transfectés 48 heures avec un siRNA aléatoire (siScr. Ou Scr. siRNA) ou un siRNA ciblant FOXA2
seul (siFoxa2 ou Foxa2 siRNA) ou un mélange de siRNAs ciblant FOXA2 et SHP (siFoxa2&siShp/Nr0b2 ou
Foxa2+Shp siRNA). (A) Mesure de la production de glucose. La concentration en glucose est mesurée après 8
heures de traitements et est normalisée par celle en protéine correspondante. Les résultats sont présentés comme
la moyenne +/- SEM (n=3). Les valeurs sont comparées à l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de
Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005. (F) Efficacité des répressions de FOXA2 et SHP/NR0B2 par
siRNAs. Expressions protéiques en FOXA2 ou SHP des MPHs, transfectés dans les mêmes conditions que
décrites précédemment, mesurées à l’aide de la technique d’immuno-détection capillaire (Simple Western,
WES). β-ACTIN : β-ACTINE.

177
 Conclusion et perspectives:
Notre étude met en évidence que dans des conditions mimant celle d’un jeûne court,
FXR induit la néoglucogenèse et la production de glucose hépatique par l’intermédiaire de
deux mécanismes distincts (Figure 60).

Figure 60: Régulation de la néoglucogenèse et de l’HGP par FXR.

BAs : Acides biliaires, cAMP : AMPc, Gluconeogenesis : néoglucogenèse.

Le premier mécanisme est contrôlé par la voie de signalisation initiée par le glucagon
qui implique les actions de l’adénylate cyclase, de l’AMPc, et la phosphorylation de FXR par
la PKA. Nous avons montré, dans un modèle MPHs, que dans un contexte de stimulation de
la voie glucagon/AMPc, l’activation de FXR potentialise, suite à sa phosphorylation par la
PKA et en coopération avec CREB, les inductions des expressions géniques des trois enzymes
clefs de la néoglucogenèse : Pck1, Fbp1 et G6pc. Ceci impacte de manière similaire la
réponse physiologique associée, l’HGP. Nous avons montré que cette potentialisation de la
néoglucogenèse et de l’HGP était dépendante de :
- l’expression de FXR : celle-ci étant abolie en absence de FXR (MPHs Fxr-/-) ou
lorsque l’expression de ce dernier est déplétée (siFxr). À l’inverse, lorsque l’expression de
FXR est restaurée sous sa forme native, au niveau de MPHs Fxr-/-, la potentialisation de
la néoglucogenèse et de l’HGP l’est également.
- l’expression de la PKA et de ses cibles sur FXR, les sérines 325 et 357: l’effet de
potentialisation est aboli ou fortement diminué lorsque l’expression de la PKA est

178
 déplétée (siPrkaca&b) et n’est pas restauré lorsque l’expression de FXR est ré-exprimé,
au niveau de MPHs Fxr-/-, sous sa forme non phosphorylable S325,357A.
- la coopération entre FXR et CREB: nous avons identifié les sites de co-fixation de
FXR et CREB aux niveaux des URRs des gènes Fbp1 et Pck1. Nous avons montré que les
séquences régulatrices de ces CBRs permettaient bien de reproduire les profils
d’expression génique observés lorsqu’elles étaient clonées dans des plasmides
rapporteurs. Au niveau de ces URRs, la fixation de FXR à l’ADN est augmentée lorsque
celui-ci est activé en présence de glucagon. De plus la synergie entre FXR et CREB est
abolie lorsque l’expression de CREB est réduite (siCreb1). Ce dernier est donc bien
nécessaire à la mise en place de la potentialisation de l’HGP par FXR.

Nos résultats suggèrent que la phosphorylation de FXR par la PKA sur les sites 325 et 357
pourrait permettre d’augmenter sa fixation à l’ADN ou la stabiliser. Néanmoins, nous n’avons
pas déterminé par quel mécanisme cela se produit.
Les deux sites de phosphorylation identifiés sont situés, au niveau de la séquence
protéique de FXR (Figure 61 panel A), sur l’hélice 5 du LBD pour le S325 et sur le feuillet 
séparant les hélices 6 et 7 pour le S357. Ils se trouvent à proximité d’aminoacides de la LBP
de FXR, identifiés comme des points de contacts avec certains de ses ligands. Ainsi, les sites
(sur la séquence protéique de mFxr1) M330, I359 et Y363 interagissent avec le CDCA
(Downes et al., 2003), M330, F331, R333, R353 et I359 avec la fexaramine (Downes et al.,
2003), F331, Y363 et R353 avec le 6-ECDCA (Mi et al., 2003) et M330, F331 et L350 avec
le ligand synthétique MFA-1 (Merck FXR agonist 1) (Soisson et al., 2008). De plus , le site
de phosphorylation S357 est proche du site P366 identifié comme impliqué dans la
dimérisation de FXR avec RXR (Zheng et al., 2018).
Au niveau de la structure tridimensionnelle de FXR (Figure 61 panel B), il apparaît
que le S325 positionné au début de l’hélice 5, se situe au niveau de la zone d’interaction avec
les coactivateurs. Ce site ne doit donc pas être fortement accessible lorsque l’agoniste est fixé
à FXR puisque c’est à ce niveau que le coactivateur va être recruté. Le site S357, positionné
entre les hélices 6 et 7, est lui proche de la LBP.
Des structures tridimensionnelles de FXR associé à différents agonistes, ont été
publiées. Celles-ci apportent des informations supplémentaires concernant les sites
d’interaction entre FXR et son ligand et notamment concernant ceux situés à proximité des
deux sites de phosphorylation que nous avons identifiés. Ainsi, les acides aminés M330 et
F331 forment une poche hydrophobe au niveau de l’hélice 5 située dans la LBP de FXR. Le

179
6-ECDCA est produit à partir du CDCA par l’ajout d’un groupement éthyle en position 6. Ce
dernier permet à cet agoniste de remplir complètement cette poche, ce que le CDCA ne fait
pas. Cette interaction supplémentaire est responsable de l’augmentation de l’efficacité
d’activation de FXR par le 6-ECDCA comparée à celle associée au CDCA. (Pellicciari et al.,
2002). La fexaramine est elle, plus efficace que le CDCA car elle induit une meilleure
stabilisation de l’hélice 3. Pour cela, le composé interagit au niveau de plusieurs sites avec
cette dernière, et avec deux autres acides aminés, le R333 situé sur l’hélice 5 et le R353 situé
sur l’hélice 6 (Downes et al., 2003). Enfin, le ligand synthétique MFA-1 est décrit comme
« pris en sandwich » entre deux couches hydrophobes de résidus positionnés sur les hélices
3,5 et 6. Notamment, ce ligand interagit avec les acides aminées M330 et F331 de l’hélice 5 et
L350 de l’hélice 6 (Soisson et al., 2008). Les hélices 5 et 6 sont donc fortement impliquées
dans la reconnaissance par FXR de son ligand et dans la détermination de l’efficacité de la
réponse associée à ce dernier. La phosphorylation de FXR sur les sites S325 et S357 pourrait
donc entrainer l’établissement d’une meilleure interaction avec le ligand en agissant sur la
conformation de ces deux hélices. Ceci pourrait expliquer l’augmentation de l’activité
transcriptionnelle de FXR lorsqu’il est activé simultanément à la PKA.
Des travaux récents (Zheng et al., 2018) ont montré que les hélices 7 et 10 de FXR
étaient impliquées dans la mise en place de sa dimérisation avec RXR. Les sites d’interactions
correspondant au niveau de RXR, ainsi mis en évidence, ne sont pas tous retrouvés lorsque ce
dernier se dimérise avec d’autres RNs (PPAR ou LXR). Le site P366 de FXR, le seul situé
au niveau de son hélice 7, permet d’établir une des ces zones de contact spécifique. Or, celui-
ci n’est pas très éloigné du site S357. Il est donc possible que l’augmentation de l’activité
transcriptionnelle de FXR, associée à sa phosphorylation par la PKA, implique une
modification de la structure de l’hétérodimère qu’il forme avec RXR.

180
Figure 61: Localisation des sites de phosphorylation de FXR par la PKA. Panel A: au niveau de la séquence
protéique (isoforme 1 humain et souris). En jaune : localisation des hélices du LBD. En rouge : les sites de
phosphorylation. En bleu : les sites d’interaction avec un ligand. En vert : le site identifié sur l’hélice 7 comme
interagissant avec RXR lors de l’hétérodimérisation (d’après (Zheng et al., 2018)). Panel B : au niveau de la
structure tridimensionnelle du LBD (LBD du FXR humain en bleu complexé avec la fexaramine en jaune) Les
zones aux niveaux desquels les sites de phosphorylation sont situés sont indiquées par les cercles noirs. La cavité
du ligand est indiquée par le cercle rouge. Le sous-domaine AF-2 formé par les hélices 3,4 et 12, zone
d’interaction avec les cofacteurs, est indiqué par les traits noirs et l’hélice 12 est encadrée en bleu (d’après
(Downes et al., 2003)).  (n): hélice (n), AF-2 : Activating domain 2 / domaine d’activation dépendant du
ligand, LBP : ligand binding pocket / cavité du ligand.

Néanmoins, comme nous l’avons décrit dans le premier chapitre, la phosphorylation

d’un RN sur un domaine peut potentiellement affecter la fonctionnalité des autres suite à la
transmission allostérique du signal. La localisation des sites en elle-même n’est donc pas
forcément indicative du mécanisme par lequel la PKA va permettre l’augmentation de
l’activité transcriptionnelle de FXR. Afin d’identifier ce dernier, d’autres expériences seraient
nécessaires. Idéalement, une étude comparative de la structure tridimensionnelle du FXR natif
par rapport à celle d’un mutant phospho-mimétique (en remplaçant les sérines 325 et 357 par
des acides aspartique ou glutamique) pourrait permettre d’identifier les changements de
conformation induits suite à sa phosphorylation par la PKA. Néanmoins, notre laboratoire ne

181
posséde ni le savoir-faire ni les outils nécessaires à la réalisation d’une telle étude. Ceci ne
peut s’envisager que dans le cadre d’une collaboration.
Afin de tester si la phosphorylation de FXR par la PKA sur les sites 325 et 357
augmente sa fixation à l’ADN ou la stabilise, une des possibilités serait de créer une lignée
exprimant de maniére inductible un FXR natif ou non-phosphorylable fusionné à une protéine
« tag » (histidine, flag, GFP (Green Fluorescent Protein) …). Ceci permettrait de suivre et de
comparer le recrutement et la stabilité de la fixation de ces deux formes de FXR sur l’ADN
lorsque celui-ci est activé en présence de glucagon. Ainsi, lorsque le système est induit, la
mesure du recrutement de FXR à l’aide de ChIP-qPCR ciblant le « tag », sur les CBRs que
nous avons identifiées pour les gènes Fbp1 et Pck1, permettrait d’analyser et de comparer les
recrutements des protéines FXR natives et mutantes. A l’inverse, lorsque l’induction du
système est levée, le suivi à l’aide de la même méthode de la diminution de la fixation de ces
protéines taguées au niveau de ces mêmes zones de l’ADN, permettrait de comparer la
stabilité de leurs fixations.
Bien que le gène G6pc soit toujours régulé de manière identique à Fbp1 et Pck1
(également en condition siCreb1 (données non montrées)), nous n’avons pas réussi à
identifier pour celui-ci les séquences régulatrices au niveau desquels FXR et CREB agiraient
en coopération. Au cours de l’analyse réalisée pour les gènes Fbp1 et Pck1, nous avons
identifié un site de co-fixation de FXR et CREB à proximité du gène G6pc. Néanmoins, celui-
ci est situé en aval et non en amont du gène et sa séquence, à l’inverse de celles identifiées
pour Fbp1 et Pck1, ne présente pas de chevauchements des éléments de réponse FXRE et
CRE (données non montrés). Le clonage de cette séquence dans un plasmide rapporteur ne
permet pas de reproduire les profils d’expression génique associés aux différents traitements
(donnés non montrées). A moins que l’effet de potentialisation par le GW4064, de l’induction
de l’expression génique de G6pc par la voie glucagon/AMPc ne s’effectue par un autre
mécanisme, la CBR permettant cette régulation par FXR en coopération avec CREB reste
donc à identifier. Si les données de ChIP-seq que nous avons utilisées lors de l’analyse des
sites de fixation de CREB et de FXR à l’ADN provenaient de foies de souris mises à jeûne.
La durée de celui-ci est assez variable, 24 heures pour CREB (Everett et al., 2013), 6 heures
(Lien et al., 2014) et un temps non indiqué dans le matériel et méthodes (Thomas et al., 2010)
pour FXR. Il est donc possible qu’il existe un site de co-fixation de FXR et CREB à proximité
du gène G6pc, mais qu’il n’apparaisse pas au niveau de ce jeu de données. Afin de
l’identifier, une analyse des profils d’expression génique et la détermination des sites de
fixation de FXR et CREB au niveau de foies de souris soumises à un jeûne strictement

182
contrôlé seraient nécessaires. De plus, les données ainsi générées permettraient de déterminer
de manière globale les différents gènes et voies associées co-régulés par FXR et CREB au
cours du jeûne.
Nous n’avons pas non plus identifié le mécanisme permettant à FXR et CREB de
coordonner leurs actions. Si les données de la littérature ont démontré que FXR et CREB sont
capables d’interagir physiquement (Seok et al., 2014), ceci a été réalisé dans un contexte de
jeûne long. Dans ces conditions, l’activation de FXR diminue la capacité de CREB à induire
des gènes de l’autophagie via un mécanisme de trans-répression. L’action décrite est donc
opposée à celle que nous observons dans des conditions mimant un jeûne court. Ces résultats
contradictoires pourraient s’expliquer par le fait, qu’au cours d’un jeûne long, FXR est
vraisemblablement phosphorylé par l’AMPK (Lien et al., 2014) alors qu’au cours d’un jeûne
court FXR et CREB sont ciblés par la PKA. Ce qui peut avoir son importance, les deux
kinases s’inhibant mutuellement (Jeon, 2016)(Zhang et al., 2017).
Des expériences complémentaires sont donc nécessaires afin de déterminer comment FXR
et CREB interagissent en présence de glucagon. La réalisation de Co-IP entre FXR et CREB,
dans nos différentes conditions expérimentales, permettraient de confirmer leur capacité à
interagir physiquement. Il serait alors intéressant d’analyser si la phosphorylation des deux
partenaires par la PKA intervient dans la mise en place de cette interaction. Pour cela, des
expériences de GST-pull down entre CREB et un FXR soit natif, soit non-phosphorylable,
soit phospho-mimétique, permettraient de déterminer si cette MPT influe sur la capacité de
FXR à interagir avec CREB. De même, l’utilisation de mutants de CREB similaires, au
niveau de sa sérine 133 ciblée par la PKA (Naqvi et al., 2014), pourrait mettre en évidence le
rôle potentiel de l’activation de CREB par cette kinase sur la mise en place d’une interaction
avec FXR. Ces résultats seraient alors confirmés en contexte cellulaire par Co-IP, à l’aide de
MPHs Fxr-/- dans lesquels FXR serait restauré sous une forme native ou mutante. Enfin, la
réalisation, dans des MPHs en présence de glucagon, d’expériences de RIME (Rapid
Immunoprecipitation Mass Spectrometry of Endogenous Proteins) permettrait d’identifier les
différentes protéines présentes dans les complexes associés à FXR et CREB. Ces données
pourraient être complétées avec celles issues d’expériences similaires dans des MPHs Fxr-/-
dans lesquels la forme native ou non phosphorylable de FXR a été restaurée. Ceci permettrait
d’identifier, les protéines interagissant différemment avec FXR selon qu’il puisse ou non être
phosphorylé par la PKA. L’ajout de données provenant de RIME générés dans des MPHs
traités par un activateur de l’AMPK permettrait d’identifier les protéines constituant les
complexes associés à FXR et CREB dans ces conditions. Il serait alors possible de mettre en

183
évidence des complexes spécifiquement formés selon que FXR soit phosphorylé par la PKA
ou l’AMPK. Ceci afin de mieux comprendre comment FXR et CREB coordonne leurs actions
en conditions de jeûne court et long.
De manière générale, notre étude ajoute la PKA dans la liste des enzymes, régulées par le
statut nutritionnel, capables de modifier post-traductionnellement FXR. Ainsi la PKA rejoint
l’OGT (Berrabah et al., 2014) l’AMPK (Lien et al., 2014), la PKC (Gineste et al., 2008), la
PKC (Frankenberg et al., 2008), SIRT1 et p300 (Kemper et al., 2009). Comme décrit dans le
chapitre 1, les MPTs catalysées par ces enzymes vont vraisemblablement modifier FXR à
différentes étapes du statut nutritionnel. L’O-GlucNAcylation par l’OGT est induite par la
disponibilité en glucose et est donc plutôt associée à la phase postprandiale. La
phosphorylation par la PKA activée par la voie glucagon ainsi que l’acétylation par la p300 le
sont à la phase inter-prandiale. La phosphorylation par l’AMPK est elle activée au cours d’un
jeûne long. Les PKCs, selon les isoformes, vont être activées à différents stades du statut
nutritionnel et agir sur différents processus métaboliques, par exemple, au niveau de la voie
insuline au cours de la phase postprandiale (Farese & Sajan, 2010)(Sajan et al., 2018) ou dans
la régulation de l’autophagie lors d’un jeûne long (Wang et al., 2018). Ceci renforce l’idée
que l’action de FXR va être régulée finement par MPTs afin de fournir une réponse adaptée
aux variations du statut nutritionnel (Massafra & van Mil, 2018).
FXR est donc ciblé par la PKA et l’AMPK qui sont activées respectivement lors d’un
jeûne court et long. Il serait intéressant de déterminer si l’action de FXR ne pourrait pas être
régulée de manière similaire lors de la phase postprandiale. La première étape consisterait à
déterminer si l’activité transcriptionnelle de FXR et/ou son action sur ses différents gènes
cibles sont modifiés en présence d’insuline. Ensuite, si tel est le cas, il faudrait analyser si
l’AKT est capable de phosphoryler directement FXR. L’AKT est présente chez les
mammifères en trois isoformes, AKT1, 2 et 3, codées par des gènes différents. L’AKT1 est la
forme la plus exprimée et ce de manière ubiquitaire. L’AKT3 est principalement détectée
dans le cerveau. Dans notre cas, l’AKT2 est l’isoforme qui serait la plus intéressante à étudier
car elle est principalement exprimée dans les tissus répondant à l’insuline, dont le foie (Hay,
2011). De plus, elle est décrite comme un acteur majeur de la répression de l’HGP par la voie
de l’insuline (Pedersen et al., 2015).
Notre étude s’est focalisée sur l’identification de l’action hépatique de FXR dans des
conditions mimant un jeûne physiologique. Pour cela, nous avons choisi d’isoler les
hépatocytes afin de ne pas prendre en compte les actions éventuelles, au niveau du foie, de
l’activation de FXR dans d’autres organes. La suite logique serait de replacer le mécanisme

184
que nous avons mis en évidence impliquant le glucagon, la PKA et FXR, au niveau de
l’organe intact, ceci afin de le caractériser in vivo et d’identifier son action sur l’ensemble de
l’organisme. Il serait intéressant de produire et valider au moins un anticorps ciblant la forme
phosphorylée de FXR par la PKA, sur un des deux sites identifiés, afin de suivre in vivo
l’apparition et/ou le niveau de cette MPT au cours du cycle jour/nuit. La réalisation du même
type d’expérience dans un modèle pathologique, comme des souris soumises à un régime
HFD ou dans un modèle d’obésité ob/ob, permettrait de déterminer si ce profil d’apparition
est modifié dans ce contexte. Idéalement, l’utilisation de cet anticorps dans une méthode de
détection quantitative comme l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) permettrait
de comparer les niveaux de phosphorylation de FXR par la PKA et de déterminer si ce
paramètre est significativement perturbé en situation pathologique. Afin d’analyser l’impact
global de la régulation hépatique de FXR via sa phosphorylation par la PKA, il serait
intéressant de restaurer, dans des foies de souris Fxr-/-, FXR sous sa forme native (mFxr1)
ou non phosphorylable par la PKA (mFxr1 S325,357A). L’utilisation de vecteurs viraux de
type AAV8 (Adeno-Associated Virus serotype 8) codant sous le contrôle du promoteur TBG
« thyroid hormone-binding globulin » ces différentes formes de FXR permettrait une telle
restauration, de maniére stable et restreinte au foie. Les différents paramètres physiologiques,
comme la glycémie, le profil lipidique ou celui des ABs pourraient ainsi, pour les deux
formes ré-exprimées, être suivis au cours du cycle jour/nuit. La première option serait de
restaurer FXR dans un modèle l(Fxr-/-), afin de visualiser l’action hépatique de FXR dans un
contexte où son expression n’est pas modifiée dans les autres organes. Néanmoins, il est
nécessaire au préalable de vérifier que l’hypoglycémie transitoire, associée à une diminution
de la néoglucogenèse, observée dans un modèle Fxr-/- est bien reproductible dans ce modèle.
En effet, FXR est également exprimé au niveau des reins et de l’intestin et ces deux organes
sont capables de produire du glucose via la néoglucogenèse. L’hypoglycémie transitoire
observée dans le modèle Fxr-/- peut donc résulter de la déplétion de FXR dans l’ensemble des
organes néoglucogéniques (foie, reins et intestin). Il est donc possible que dans le modèle
l(Fxr-/-), les actions rénales et intestinales de FXR permettent de compenser la diminution de
l’HGP hépatique. Dans ce cas, il serait préférable de restaurer les différentes formes de FXR
dans un modèle Fxr-/-.
À une échelle plus globale, il serait intéressant d’identifier au niveau hépatique,
l’ensemble des kinases capables de phosphoryler FXR et les sites associés. Ceci pourrait être
effectué chez la souris au cours d’un cycle jour/nuit et dans un contexte d’accès à la nourriture
contrôlé. La premiére étape serait de réaliser une étude établissant les profils d’activation des

185
différentes kinases à l’aide du système PamGem. La seconde étape serait d’identifer par
spectrométrie de masse les différents phospho-sites de FXR. Ces données pourraient ensuite
être corrélées afin d’associer, au cours du cycle jour/nuit, l’activation d’une kinase à
l’apparition d’un phospho-site de FXR. L’analyse bioinformatique déjà réalisée qui a permis
d’identifier les motifs consensus de phosphorylation potentiels, reconnus par différentes
kinases, sur la séquence protéique de FXR peut également aider à cette analyse. Il faut
néanmoins prendre en compte les limites de cette dernière. Elle peut éventuellement être
source d’erreur. Ainsi dans notre étude, sur les cinq sites identifiés en spectrométrie de masse
seulement trois le sont également par la bioinformatique, alors que nous avons réalisé cette
analyse en utilisant deux logiciels différents. De plus, le site S325 identifié dans notre étude
comme ciblé par la PKA, correspond au niveau de l’analyse bioinformatique à un motif PKG
(protéine kinase G) (données non montrées). Pour finir, un même site de phosphorylation peut
vraisemblablement être reconnu par plusieurs kinases. Les différents articles qui ont identifié
un ou des sites de phosphorylation de FXR ont indiqué la position de ces derniers sur des
séquences protéiques de FXR différentes. Lorsque cela est possible, c'est-à-dire quand la
séquence et/ou l’espèce et l’isoforme de FXR correspondant à la numérotation du site
identifié est indiqué dans l’article, il est possible de reporter celui-ci sans ambigüité, sur une
même séquence de FXR. C’est ce que nous avons fait sur la séquence protéique de mFXR1
(Tableau 8). Cette analyse nous a permis de mettre en évidence que des sites de
phosphorylation de FXR ont déjà été identifiés comme étant associés à deux kinases
différentes. Ainsi FXR a été décrit comme phosphorylé sur sa sérine 151 par la PKC
(Gineste et al., 2008) et par VRK1 (Hashiguchi et al., 2016). De même, un des sites que nous
avons identifié comme ciblé par la PKA, le S325, est également décrit comme phosphorylé
par la CK2 (Bilodeau et al., 2017). Celui-ci est, de plus, comme nous l’avons indiqué
précédemment, associé par l’analyse bioinformatique à un motif consensus reconnu par la
PKG. Il est tout à fait possible que des kinases activées dans des contextes différents
phosphorylent FXR sur un même site. Dans notre étude, d’ailleurs, l’action pleine et entière
de la PKA sur FXR nécessite sa phosphorylation sur un deuxième site, le S357. La
détermination de ce « phospho-code » de FXR sera donc complexe. Afin d’affiner cette
analyse, la réalisation en parallèle de ChIP-seq, dans le but d’identifier les profils de fixation
de FXR à l’ADN et les zones actives du génome, permettrait de comprendre la régulation fine
par FXR, au cours du cycle jour/nuit, de sous-ensemble de gènes cibles et de les associer à
des mécanismes de régulation de son activité via sa phosphorylation.

186
 Nous avons montré que l’activité de FXR est finement régulée suite à l’activation du
récepteur au glucagon (GCGR) et de celle de la PKA. Ceci soulève deux questions majeures.
- Est-ce que cette modulation de FXR a lieu dans d’autres tissus exprimant le récepteur au
glucagon ?
GCGR est présent principalement au niveau du foie et des reins, et à un degré moindre
au niveau du cœur, du pancréas, du cortex cérébral et de l’intestin (Authier & Desbuquois,
2008). L’action du glucagon est de son coté décrite comme augmentant la filtration et la
réabsorption de l’eau au niveau des reins, la glycolyse et l’oxydation du glucose au niveau
cardiaque, la sensation de satiété au niveau de l’hypothalamus et comme diminuant la motilité
intestinale ce qui réprime l’ingestion de nourriture (Charron & Vuguin, 2015). Comme nous
l’avons décrit dans le premier chapitre, FXR est exprimé dans ces différents tissus. Il serait
donc intéressant de vérifier si le mécanisme que nous avons identifié au niveau hépatique ne
peut pas également jouer un rôle dans ces différents organes, notamment au niveau de
l’intestin et du rein qui sont à la fois impliqués dans le cycle entéro-hépatiques des ABs et
capables d’effectuer la néoglucogenèse.
- Est-ce que d’autres récepteurs du même type que GCGR, des GPCRs capables d’induire
la production de l’AMPc et d’activer la PKA, peuvent moduler l’action de FXR selon le
même mécanisme ?
Les récepteurs de type GPCRs forment une famille très large, de plus de 800 membres
chez l’homme. Ils sont regroupés en cinq grandes familles et de nombreuses sous-familles
notamment selon le type de protéines associées (Katritch et al., 2013). Les GPCRs dont
l’action pourrait affecter celle de FXR selon le mécanisme que nous avons identifié
correspondent à ceux associés à une protéine G alpha de type « s ». Cette protéine a pour
fonction d’activer l’adénylate cyclase (Sebastiani et al., 2018). Dans cet ensemble, les GPCRs
d’intérêt seraient plutôt ceux dont l’action est associée à la régulation de l’homéostasie
énergétique (Bouvier, 2014), notamment, le récepteur aux catécholamines (-adrenergic
receptors, -ARs), au GLP-1 (GLP1-R), ou celui au GIP (gastric inhibitor peptide) (GIPR),
tous impliqués dans la régulation du métabolisme du glucose (Sebastiani et al., 2018). Enfin,
le GPCR de ce type qui apparaît comme le plus intéressant est TGR5, activé comme FXR par
les ABs, bien qu’avec une spécificité différente. Comme nous l’avons décrit dans le premier
chapitre, les expressions protéiques de FXR et TGR5 se chevauchent dans de nombreux
tissus, comme le rein, la vésicule biliaire et surtout l’intestin. Notamment, FXR et TGR5 sont
tous deux exprimés dans les cellules L intestinales. Dans ce type cellulaire, TGR5 induit
l’expression génique du proglucagon, ce qui va aboutir à la production de GLP-1 par la suite

187
sécrété dans la veine porte (Katsuma et al., 2005). Alors que FXR est décrit à la fois comme
un répresseur, notamment en inhibant la transcription du proglucagon (Trabelsi et al., 2017),
et un activateur (Pathak et al., 2017) de ce processus. Une des hypothèses proposées pour
expliquer cette apparente contradiction est que l’action médiée par les deux récepteurs aux
ABs n’a pas lieu simultanément. L’action de TGR5 via une transmission cytoplasmique du
signal serait rapide, celle de FXR plus lente car reposant sur la transcription et la traduction de
ses gènes cibles (Chávez-Talavera et al., 2017). Une étude récente montre que FXR est
capable de réguler l’expression génique de Tgr5 (Pathak et al., 2017). FXR pourrait donc,
dans un premier temps réprimer directement la transcription du proglucagon, puis l’induire
indirectement via celle de TGR5. Ces différents résultats suggèrent que l’action de l’un de ces
récepteurs peut influencer celle de l’autre. TGR5 est donc un GPCR de type Gs, qui comme
GCGR, agit en induisant la production de l’AMPc et l’activation de la PKA. Il serait donc
intéressant de déterminer si l’activation de TGR5 dans les cellules L intestinales, par un
agoniste qui lui est spécifique, est capable, au travers de la phosphorylation de FXR par la
PKA, de modifier l’action de ce dernier. Ceci pourrait permettre de mieux comprendre
l’action combinée, au niveau intestinale, de ces deux récepteurs aux ABs.

Le deuxième mécanisme que nous avons identifié implique une interaction directe
entre FOXA2, un FT activé au cours du jeûne (von Meyenn et al., 2013), et FXR. Celle-ci
entraine la répression de l’activation par FXR de la transcription de Shp, gène décrit comme
anti-néoglucogénique, par un mécanisme de « tethering ». Nous avons démontré que cette
interaction avait bien lieu, au niveau hépatique, chez la souris et qu’elle était plus importante
lorsque les animaux sont à jeun. Nous avons également montré que l’HGP au niveau des
MPHs est diminuée lorsque que l’expression de FOXA2 est déplétée. Cette répression de
l’HGP est principalement associée à la restauration de la capacité de FXR à induire Shp,
puisque lorsque les expressions de Foxa2 et Shp sont simultanément déplétées, l’HGP
retrouve son niveau normal. Enfin, nous avons montré que, à court terme (quelques heures), la
potentialisation de l’HGP associée au mécanisme impliquant la PKA, FXR et CREB n’était
pas impactée par la déplétion de FOXA2. Ceci suggère que les deux mécanismes que nous
avons identifiés agissent de manière indépendante.
Néanmoins, les analyses des puces Affymetrix ont montré que Shp n’etait pas le seul
gène dont l’induction par le GW4064 est diminuée en présence de glucagon. Ce profil
correspond à la plus grande partie des gènes identifiés comme différemment régulés par
l’agoniste de FXR dans ce contexte. De plus, ma collègue Claire Mazuy a déterminé que cet

188
effet « réfractaire » au traitement GW4064 était principalement dépendant de l’expression des
cellules en FOXA2. Bien que l’analyse des gènes constituant ce sous-ensemble, à l’aide des
logiciels GREAT et GO Enrichment analysis, ne permette pas de mettre en évidence de voies
de signalisation ou de fonctions biologiques communes associés à celui-ci (données non
montrées), il est à noter que FOXA2, comme FXR, est impliqué dans la régulation des
métabolismes des ABs, des lipides et du cholestérol. Ainsi, au niveau hépatique, FOXA2
contrôle les expressions de gènes de la synthèse des ABs, Cyp7a1 et Cyp8b1 ainsi que celles
de transporteurs tels que Mrp2, Mrp3, Mrp4, Oatp1 et Oatp2 (Bochkis et al., 2008)(Le Lay &
Kaestner, 2010). En ce qui concerne le métabolisme hépatique des lipides, l’action de FOXA2
entraine une diminution la lipogenèse, une augmentation de la -oxydation (Wolfrum et al.,
2004), du transport des acides gras et de la dégradations des TGs (Wolfrum & Stoffel, 2006).
FXR et FOXA2 partagent donc des fonctions communes au niveau du foie. Il serait donc
intéressant de comprendre comment ces deux FTs interagissent au cours du jeûne et à quel
niveau ils coopèrent, notamment dans la régulation des métabolismes des ABs et des lipides.

Jusqu’ici, FXR a été le plus souvent décrit comme un inhibiteur de la néoglucogenèse

hépatique suite à l’induction de son gène cible SHP. Cette action est associée au pic de
réabsorption des ABs au niveau du foie, lors de la phase postprandiale. Nos résultats, ainsi
que ceux récemment publiés par deux équipes, s’inscrivent dans le concept développé par
MASSAFRA et van MIL (Massafra & van Mil, 2018). Ces derniers proposent un modèle
dans lequel FXR a un rôle hépatique de senseur métabolique pour les trois grandes classes de
nutriments (lipides, glucose et acides aminées). En fonction du statut nutritionnel, l’action de
FXR va varier et participer ainsi à la réponse adaptée de l’organisme. Nos données
corroborent ce modèle. En effet, nous avons décrit deux mécanismes, associés au jeûne court,
qui permettent à FXR d’intégrer le signal « glucagon » et d’adapter en conséquence son
action hépatique au niveau du métabolisme glucidique.
Un article publié récemment (Xu et al., 2018) a montré, au niveau de MPHs, que
l’inhibition de l’activité de FXR par un antagoniste (HS218) réprimait les inductions des
gènes de la néoglucogenèse, G6pc et Pck1. Les auteurs ont confirmé que les effets observés
dépendaient bien de l’expression de FXR. Ils ont également montré que chez des souris
diabétiques (modèle db/db ou diabète induit par un régime HFD associé à un traitement à la
streptozotocine), le traitement par le HS218 permettait d’améliorer les paramètres
glycémiques. Les auteurs ont identifié un site de fixation de FXR sur le promoteur de Pgc1a,
gène décrit comme un activateur de la néoglucogenèse. Dans les MPHs, le traitement par

189
l’antagoniste de FXR réprime l’expression génique de Pgc1a. Les auteurs ont donc conclu
que la diminution de la néoglucogenèse hépatique observée lors du traitement avec le HS218
s’effectuait via la répression de Pgc1a, suite à la perte d’activité de FXR. Cet article propose
donc un mécanisme où FXR induit indirectement la néoglucogenèse en activant l’expression
génique de Pgc1a. Si nous concluons au même effet par un mécanisme plus direct, ces
résultats publiés sont en accord avec ce que nous avons observés. En effet, nos données de
puces Affymetrix (Figure 44 panel B) montrent que l’induction de Pgc1a par le glucagon est
potentialisée par le GW4064. De plus, cet effet est dépendant de l’expression de FXR (Figure
62 panel A) ainsi que de celle de la PKA (Figure 62 panel B). Ceci suggère donc un
mécanisme de potentialisation similaire à celui que nous avons identifié pour FBP1 et PCK1.
Néanmoins, si notre analyse des données de ChIP-seq, provenant de la littérature, permet
d’identifier des sites de fixation de FXR et de CREB à proximité du gène Pgc1a, aucun site
de co-fixation n’apparait (données non montrées). Tout comme discuté précédemment pour
G6PC, il est possible qu’un tel site existe mais n’apparaisse pas dans le jeu de données que
nous avons étudié.

Figure 62 : Implication de FXR et de la PKA dans la potentialisation, par le GW4064, de l’induction de

Pgc1a par la voie glucagon/AMPc. Mesure de l’expression génique de Pgc1a. (A) Dans des MPHs isolés à
partir de foies de souris sauvages (Fxr+/+) ou déficientes en FXR (Fxr-/-) (B) Dans des MPHs transfectés 48
heures avec un siRNA aléatoire (siScr.) ou ciblant les deux sous-unités catalytiques de la PKA (siPrkaca&b).
(A) et (B), les résultats sont présentés comme la moyenne +/- SEM (n=3) et sont exprimés par rapport au niveau
d’expression basal mesuré dans les conditions non traitées arbitrairement fixé à 1. Les valeurs sont comparées à
l’aide d’une ANOVA2 avec un test post hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,005, et condition par
condition pour les deux phénotypes ou traitements siRNAs à l’aide du même test. $, p<0,05, $$, p<0,01, $$$,
p<0,005.

190
 Ces dernières années, il a été mis en évidence que la dérégulation de la voie du
glucagon était un des facteurs importants menant à la progression vers le diabète de type 2.
Ceci a été démontré notamment en utilisant des modèles murins déficients pour le récepteur
au glucagon, Gcgr-/- (Unger & Cherrington, 2012). La perturbation de cette voie est
également impliquée dans d’autres pathologies telles que les maladies cardio-vasculaires
(Müller et al., 2017). La modulation de la voie glucagon est donc devenue une cible
importante (Wewer Albrechtsen, 2018) et l’utilisation de composés synthétiques permettant de
cibler son récepteur GCGR ont donc été développés (Unger & Cherrington, 2012). Par
exemple, l’activation de GCGR par un agoniste synthétique permet, chez la souris, de réduire
l’obésité (Pocai et al., 2009). Dans un article récemment publié (Kim et al., 2018), les auteurs
montrent, dans un modèle murin d’obésité induite par l’alimentation (DIO, Diet-Induced
Obesity), que cette action « protectrice » d’un agoniste de GCGR (IUB288) nécessite
l’expression hépatique de FXR. Ainsi, les effets bénéfiques du traitement chronique par
l’IUB288 : la perte de poids, l’augmentation de la -oxydation et de la production de corps
cétoniques, observés chez les souris contrôles soumises au régime DIO sont abolis chez les
souris l(Fxr-/-). Les auteurs, afin d’identifier le mécanisme permettant d’expliquer les
différences observées dans la régulation du processus de -oxydation, ont mesuré l’expression
génique de Pgc1a dans les foies de ces souris. En effet, PGC1a est décrit comme induisant la
-oxydation en jouant un rôle de coactivateur pour PPAR (Vega et al., 2000). Les données
présentées montrent que l’augmentation de l’expression génique de Pgc1a induite par
l’IUB288 chez les souris contrôles est abolie dans le modèle l(Fxr-/-). Cet effet est donc
dépendant de l’expression de FXR, ce qui de nouveau, est en accord avec nos résultats. Les
données de cet article ainsi que les nôtres, suggèrent que FXR, au cours du jeûne, serait
également capable de réguler finement le métabolisme lipidique hépatique en intégrant le
signal « glucagon ». Tout comme nous l’avons décrit concernant son action sur la
néoglucogenèse hépatique et l’HGP, cette intégration du signal par FXR pourrait s’effectuer
via la voie AMPc, entrainant notamment la potentialisation de l’induction de Pgc1a. Elle
pourrait également être réalisée suite à la mise en place de l’interaction avec FOXA2, FT qui
est également décrit comme un régulateur du métabolisme lipidique. Cet article confirme
également, qu’au niveau hépatique, l’expression de FXR est nécessaire à la mise en place de
différents processus induits par la voie glucagon. FXR semble donc être un relais important
permettant au glucagon de réguler ces différentes cibles hépatiques.

191
 Matériels et méthodes.

1) Anticorps:
Les anticorps utilisés dans le cadre du projet sont les suivants :
- -actine : la référence A5441 de chez Sigma-Aldrich pour le Wes.
- CREB1 : la référence ab32515 de chez Abcam pour le Wes.
- FBP1 : la référence sc271241 de chez Santa-Cruz Biotechnology pour le Wes.
- FOXA2 : la référence ab23630 de chez Abcam pour le Western Blot et le Wes.
- FOXO1 : la référence sc374427 de chez Santa-Cruz Biotechnology pour le Wes.
- FXR : la référence PP-A9033A-00 de chez R&D systems pour le Western Blot et le Wes,
la référence sc-13063 de chez Santa-Cruz Biotechnology pour le ChIP et la référence
ab28676 de chez Abcam pour la CoIP.
- HSPa/b : la référence sc7947 de chez Santa-Cruz Biotechnology pour le Western Blot et
le Wes.
- PCK1 : la référence 10004943 de chez Cayman Chemicals pour le Wes.
- PKAca : la référence sc903 de chez Santa-Cruz Biotechnology pour le Western Blot.
- PKAcb : la référence sc904 de chez Santa-Cruz Biotechnology pour le Wes.
- SHP/NR0B2 : la référence ab186674 de chez Abcam pour le Wes.

2) Culture cellulaire:
La lignée cellulaire d’hépatocytes murins immortalisés AML12 provient d’ATCC
(CRL-2254, Molsheim, France). Les cellules sont cultivées à 37°C, 5% CO2 et entretenues en
milieu DMEM/F12 contenant 17,5 mM de glucose (P04-41250, Dutscher) complémenté avec
10% de sérum de veau fœtal (#41G5893P, Invitrogen), 1% pénicilline/streptomycine
(#15140, Gibco-Life Technologies), 5 µg/mL insuline, 5 µg/mL transferrine (T1147, Sigma-
Aldrich), 5 ng/mL sélénium (S9133, Sigma-Aldrich) et 100 nM dexaméthasone (D8893,
Sigma-Aldrich). Avant traitement agoniste FXR, les cellules AML12 sont déprivées sur la
nuit en milieu DMEM/F12 contenant 0.1% BSA (A7030, Sigma-Aldrich). Quand cela est
indiqué, les AML12 sont cultivées avant traitement en “milieu AML12 bas glucose”
[DMEM/F12 (L0091, Dutscher) complémenté avec 15 mM HEPES, pH 7.8, 5,5 mM glucose,

192
1% pénicilline/streptomycine, 2,5 mM glutamine, 5 µg/mL transferrine, 5 ng/mL sélénium et
0.1% BSA].

La lignée cellulaire HEK293A (Human Embryonic Kidney 293 A) provient de chez

Life Technologies (R705-07). Les cellules HEK293A sont entretenues en milieu DMEM
contenant 25 mM glucose, 4 mM Glutamax (#31966, Gibco-Life Technologies) complémenté
avec 10% de sérum de veau fœtal (#10270, Gibco-Life Technologies) et 1% de
pénicilline/streptomycine. Quand cela est indiqué, les cellules HEK293A sont déprivées sur la
nuit en milieu bas glucose (DMEM contenant 5,5 mM glucose et complémenté avec 1% de
sérum de veau fœtal traité au charbon dextran, 1% pénicilline/streptomycine et 2 mM
glutamine).
Toutes les lignées cellulaires sont testées mensuellement pour les contaminations à
mycoplasme.

3) Hépatocytes primaires de souris:

Les souris sont anesthésiées avec 200 µl de pentobarbital dilué au 1/5e dans du sérum
physiologique. L’aiguille d’un microperfuseur G25 est introduite par la veine cave et
l’ensemble veine-microperfuseur clampé avec une pince « Bouledogue ». Les
microperfuseurs sont reliés à une pompe péristaltique et les foies sont perfusés à basse vitesse
(5 mL/min pendant 5 min) avec un milieu de lavage à pH 7,4 contenant de l’HBSS (H9394,
Sigma-Aldrich), 50 mM d’HEPES et 0,5 mM d’EGTA, puis la veine porte est coupée.
Les foies sont ensuite perfusés pendant 5 minutes avec du milieu HEPES-HBSS
complémentés avec 10 mM CaCl2 et 100 U/mL de collagenase type IV (C5138, Sigma-
Aldrich). Les foies sont prélevés et placés dans une boîte de culture contenant du milieu de
lavage. Les cellules sont dispersées à l’aide de 2 grattoirs et filtrées sur tamis de 70 µM
(#352350, BD Falcon). Les hépatocytes sont resuspendues dans du milieu de culture (voir ci-
dessous) et comptées à l’aide du Bleu Trypan après 3 lavages.
Les hépatocytes primaires de souris sont ensemencés en milieu William E contenant 11 mM
de glucose (BE12761F, Lonza) complémenté avec 0,1% BSA, 100 nM dexaméthasone, 1%
glutamine (#25030149, Gibco-Life Technologies) et 1% pénicilline/streptomycine.
Dans le cadre des expériences utilisant les shRNAs, un jour après l’isolement les cellules sont
infectées par addition de la souche adénovirale à une multiplicité d’infection (MOI) de 10
Particules Virales Infectieuses (IVP) par cellules pendant 180 minutes.

193
Les hépatocytes sont cultivées sur la nuit en milieu DMEM contenant 5,5 mM glucose
(#21885, Gibco-Life Technologies), 0,1% BSA, 100 nM dexaméthasone, 1% glutamine et 1%
pénicilline/streptomycine. Les cellules sont alors traitées.

4) Production de glucose:
Les hépatocytes primaires de souris sont incubés sur la nuit (16 heures) en milieu
DMEM contenant 5,5 mM glucose (# 21885, Gibco-Life Technologies) complémenté avec
0,1% BSA, 100 nM dexaméthasone, 1% glutamine et 1% pénicilline/streptomycine. Les
cellules sont ensuite cultivées en milieu DMEM sans glucose (#11966, Gibco-Life
Technologies) complémenté avec 100 nM dexaméthasone, 20 mM sodium DL-lactate
(L1375, Sigma-Aldrich), 2 mM sodium pyruvate (#11360, Gibco-Life Technologies) pendant
8 heures. Les traitements sont effectués durant la phase de production de glucose. La sécrétion
de glucose est mesurée à l’aide du kit “Glucose (GO) assay kit “ (GAGO-20, Sigma-Aldrich).

5) Plasmides :
Les plasmides pGST-FXR, pGL3 IR1x3-tk luc, pCMX-mFXRα1/2/3/4, p(UAS)x3-tk Luc,
pGAL4-FXR et pGAL4-DBD ont été décrits précédemment (Lien et al., 2014).
Les mutations site spécifique du vecteur pCMX-mFXRα1 ont été générées par mutagénése de
(#200524, Quickchange II site-directed mutagenesis kit, Agilent Technologies, Santa Clara,
USA) à l’aide des oligonucléotides:
S325A:
5’-CTTTGCTCAAAGGGGCCGCAGTGGAGGCC-3’ et
5’-GGCCTCCACTGCGGCCCCTTTGAGCAAAG-3’
S357A:
5’-CCTGTTGGAAGAAAGAATTCGAAAGGCTGGTATCTCTGATGAGTATATAAC-3’
et
5’-GTTATATACTCATCAGAGATACCAGCCTTTCGAATTCTTTCTTCCAACAGG-3’.

Les gènes rapporteurs (Fbp1 tk-Luc, Pck1_1 tk-Luc et Pck1_2/3/4 tk-Luc) ont été
créés en clonant les sequences régulatrices correspondantes (URR: Upstream Regulatory
Region) dans le vecteur pGL3 tk-Luc. Les inserts ont été générés à partir d’ADN génomique
de cellules AML12 par PCR en utilisant la Q5 Hot Start DNA polymerase (M0493, NEB,
Ipswich, USA) et les oligonucléotides suivants:

194
Fbp1 tk-Luc (région promotrice murine de Fbp1 en position -20054 à -20471):
5’- AAAAGATCTAATCAAGAAGTTAAAC-3’et
5’-AAAGAATTCCTGTGGCGTAAAGGG-3’
Pck1_1 tk-Luc (région promotrice murine de Pck1 en position -6681 to -6296):
5’-AAAAGATCTGCTTGGGTACATCATG-3’et
5’-AAAGAATTCCCTGCTGGCAAAGCAA-3’
Pck1_2/3/4 tk-Luc (région promotrice murine de Pck1 en position -889 to -89):
5’-AAAGAATTCCCTTCTCGGTCCTTCC-3’et
5’-AAAAGATCTGTGTTCATCTTGGGAT-3’.
Les régions amplifiées ont été insérées à l’aide des sites de coupure générés par les enzymes
de restriction BglII/EcoRI et séquencées.

6) Clonage adenoviral et production virale:

Séquences shRNA (small hairpin RNA):
Les oligonucléotides codant pour le shRNA ciblant FoxA2 murin et la β-galactosidase
(LacZ) ont été modélisés à l’aide de l’outil BLOCK-iT RNAi Designer (Invitrogen):
Cible, FoxA2, sens :
5’-CACCGAGTGTACTCCAGGCCTATTACGAATAATAGGCCTGGAGTACACTC-3’
Cible, FoxA2, anti-sens :
5’-AAAAGAGTGTACTCCAGGCCTATTATTCGTAATAGGCCTGGAGTACACTC-3'
Cible, LacZ, sens :
5’-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3’
Cible, LacZ, anti-sens :
5’-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3’

Clonage et production :
Les oligonucléotides ont été clonés dans le vecteur pENTR/U6 (Invitrogen). Les
adénovirus exprimant le shRNA ciblant FoxA2 ou LacZ ont été générés selon les
recommandations du fournisseur (Invitrogen). Les adénovirus sont produits et amplifiés dans
les cellules HEK293A, purifiés par centrifugation en gradient de chlorure de césium suivie
d’une désalinisation sur colonne PD-10 (#17-0851-01, GE Healthcare). Les productions
d’adénovirus sont titrées à l’aide du kit « Adeno-X Rapid titer Kit » (#632250, Clontech).

195
7) Extraction protéique :
Les extraits protéiques totaux de cellules AML12, HepG2 et MPhs sont réalisés à
partir de 106 cellules. Les HepG2 et les AML12 sont lysées avec 100µl de tampon de lyse (20
mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM
sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF et 1µg/mL
leupeptin). Les MPHs sont lysés avec du tampon RIPA [10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% sodium deoxycholate, 0,1% SDS, 1% Triton X100 et 1x inhibiteurs
de protéases (Protease Inhibitor Cocktail /PIC, Sigma-Aldrich)]. Les lysats cellulaires sont
obtenus après 4 cycles de sonication 30 sec. ON/ 30 sec. OFF (Bioruptor, Diagenode). Les
dosages protéiques sont réalisés à l’aide du kit « Pierce Coomassie-plus assay kit » (#23238,
Thermo Fisher Scientific) et la BSA (Bovine Serum Albumine ; Sérum Albumine Bovine) est
utilisée comme standard.

8) Western blot et immunoprécipitation :

a) Co-immunoprécipitation:

Les extraits de foie (250 µg de protéines) sont préalablement incubés avec des
protéines A-agarose fast Flow ((EMD Millipore, Ref. 16-156) puis avec 10 µg d’anticorps
anti-FXR. Le kit «Magnetic crosslink IP/CoIP kit » (#88805, Thermo Scientific) est utilisé
selon les recommandations du fournisseur. Le matériel immunoprécipité est séparé sur gel
10% SDS-PAGE et analysé par Western-Blot (WB) avec l’anticorps anti-FOXA2 ou FXR
dilué au 1/1000ième.

b) Western blot (WB) :

100 µg de protéines sont séparées sur gel 10% SDS-PAGE et immuno-détectées par
western blot en utilisant des anticorps primaires (décrits précédemment). Les anticorps
primaires sont ensuite détectés en utilisant des anticorps secondaires couplés HRP
(Horseradish Peroxydase, Sigma-Aldrich). Les images sont acquises à l’aide de la G-box
(Syngene, Cambridge UK).

c) Simple Western immunoassays (WES):

Ils sont réalisés à l’aide du système WES selon les recommandations du fournisseur
(ProteinSimple, San Jose, USA). Les concentrations protéiques utilisées sont comprises entre

196
0,25 à 0,8mg/mL (selon la cible étudiée). Les anticorps primaires ont été décrits
précédemment. Les anticorps secondaires proviennent du fournisseur (PS-MK14 et PS-
MK15, ProteinSimple). Les données sont analysées à l’aide du logiciel Compass
(ProteinSimple).

9) Production de la protéine recombinante FXR et purification :

Les ADNs complémentaires codants pour FXR1 et FXR3 murins ont été clonés
dans le vecteur pET-52 3C/LIC (Novagen, Madison, USA). Les protéines recombinantes sont
générées en bactéries BL21(DE3)pLys (#69451, Novagen) et possèdent en partie N-terminal
8 acides aminés Strep-Tag II et en C terminal un His-Tag (10 histidines). Les protéines FXR
sont produites après induction à l’IPTG 1 mM et purifiées sur gel d’affinité « His-Select
nickel » (P6611, Sigma-Aldrich) avec une pureté finale comprise entre 30 et 50%.

10) Phosphorylation In vitro :

PKA : le FXR recombinant (16 pmol), le contrôle négatif (GST) et le contrôle positif
(MBP, Myelin basic protein dephosphorylated, 31314, Active Motif, Carlsbad, Canada) sont
incubés pendant 1 heure à 30°C avec 4 pmol de PKAca purifiée (7743-5, Biovision, Lyon,
France) dans du tampon PKAca (4mM MOPS pH 7,2, 2,5 mM β-glycerophosphate, 1 mM
EGTA, 0,4 mM EDTA, 4 mM MgCl2, 0,05 mM DTT et 40 ng/µL BSA). L’ATP est utilisée à
une concentration finale de 200 µM (#9804S, Cell Signaling Technology, Danvers, USA)
avec 5µCi [32P]γ-ATP (BLU-502A, PerkinElmer, Waltham, USA).
PKC : le même protocole que décrit ci-dessus est utilisé : 4 pmol de PKC purifiée
(P61-18G, SignalChem, Canada) et 16 pmol de FXR sont incubés dans du tampon PKC
(5mM MOPS pH 7,2, 2,5 mM β-glycerophosphate, 1 mM EGTA, 0,4 mM EDTA, 5 mM
MgCl2, 0,05 mM DTT et 50 ng/µL BSA) auquel est ajouté le tampon « PKC lipid activators »
(L51-39, SignalChem, Canada) à une dilution 1x.
GSK3β : le même protocole que décrit ci-dessus est utilisé : 16 pmol de FXR
recombinant ou de contrôle négatif (GST) ou de contrôle positif (Gys, GYS1, H00002997-
P01, Novus Biologicals, Littleton, USA) sont incubés pendant 1 heure à 30°C avec 1000
unités de GSK3β purifiée (P6040S, New Englet Biolabs) en tampon GSK3β (20 mM Tris-
HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT).
Les échantillons sont séparés sur gel 10% SDS-PAGE et les protéines marquées
radioactivement sont détectées à l’aide du Pharos FXplus system (BioRad).

197
11) Transfection transitoire :
a) Essai « gène rapporteur » :

Les cellules HEK293A (2.5x106) sont ensemencées en plaque 6 puits et transfectées

24 heures plus tard avec le complexe 1,5 µg d’ADN plasmidique / 10µl de Jet-PEI. 24 heures
après transfection, les cellules sont trypsinisées et transférées en plaque 96 puits dans du
milieu de culture 5,5 mM glucose (104 cellules/puits). Le jour suivant, les cellules HEK sont
traitées avec du DMSO (véhicule) ou 1 µM de GW4064 ou 10 µM de forskoline ou une
combinaison de ces molécules pendant 6 heures. Le test luciférase est réalisé à l’aide du kit
«Dual Luciferase assay » (Promega) qui permet la détection des activités luciférase de type
«« firefly » sous contrôle des plasmides rapporteurs testés et de celle de type « renilla » cette
dernière étant utilisée comme contrôle interne pour la normalisation lors du calcul de
l’efficacité de transfection. Chaque essai est réalisé en sextuplicat et les résultats sont
exprimés en ratio « firefly/renilla» et normalisé comme indiqué.
Les MPHs (1x 106) sont transfectés en suspension avec un ratio 8 µg de plasmide /
20µl de Lipofectamine 2000 (#11688-019, InVitrogen) et ensemencés en plaque 12 puits (3x
105 cellules/puits) dans du milieu williams E pendant 3 heures puis en milieu DMEM 5,5mM
glucose sur la nuit. Les hépatocytes sont traitées le jour suivant comme indiqué.

b) Transfection de siRNAs :

Les hépatocytes primaires de souris ou les AML12 sont ensemencés en plaque 12

puits (3x 105 cellules/puits) en milieu de prolifération et 50 nM de siRNAs sont transfectés à
l’aide de l’INTERFERin (#409-50, Polyplus Transfection). Le milieu est remplacé 24 heures
plus tard par du milieu 5,5 mM glucose. 48 heures après la transfection, les cellules sont
traitées avec 2 µM de GW4064 ou 0,5 mM de 8-bromo-cAMP ou 100 nM de glucagon ou une
combinaison de ces composés pendant 6 heures (ARNs) ou 8 heures (production de glucose et
expressions protéiques).
Les mélanges de siRNAs ciblant les formes murines de Fxr, Foxa2, Prkaca ou Prkacb
ainsi que le contrôle (L-045705-01, L043601-00, L-047080-00, L-042579-00 et D-001810-10
respectivement) ont été commandés chez GE Healthcare-Dharmacon (Lafayette, USA). Les
mélanges de siRNAs ciblant les formes murines de Creb1, Shp/Nr0b2 et Foxo1 ont été
commandés chez Santa Cruz Biotechnology (sc35111, sc-44870, sc-35383).

198
12) Extraction d’ARN, synthèse de l’ADNc et PCR en temps réel :
L’ARN total est extrait en utilisant l’Extract-All (GeneText, Courtaboeuf, France) ou
le kit « Nucleospin® RNA II kit » (#740955-10, Machery-Nagel) en suivant des instructions
du fournisseur. La quantité et la pureté des ARNs sont déterminées à l’aide du Nanodrop
device (Nanodrop Technologies, Thermo Scientific, Wilmington, USA). Une transcription
inverse est réalisée en utilisant le kit « High-Capacity cDNA archive kit » (#4368813,
Applied Biosystems, Foster City CA, USA) en suivant des recommandations du fournisseur.
L’expression des gènes est analysée en utilisant le SYBR green Brilliant II fast kit (Agilent
Technologies, Les Ulis, France) sur le Mx3500p apparatus (Agilent Technologies). Les
niveaux d’ARNs sont normalisés au 36B4/RPLP0 ou au 18S et les variations d’expression
sont calculées en utilisant la méthode du delta Ct (ΔΔCT).

13) Analyse de puces d’expression :

La qualité des ARNs est déterminée à l’aide du Bionalyzer 2100 (Agilent
Technologies). Les ADNc biotinylés sont préparés, les puces MoGene ST2.0 hybridées
(Affymetrix, Santa Clara, CA), lavées et scannées (GeneChip scanner 30007G) selon les
recommandations du fournisseur (kit « WT GeneChip WT Amplification kit »). Les données
sont analysées comme décrit précédemment (Lefebvre et al., 2010) en utilisant le logiciel
Genespring 14.3. Les données sont disponibles sur le site GEO [Super série GSE113575
incluant les références GSE113526 (correspondant à la Figure 44) et GSE113549
(correspondant à la Figure 4 panel E, article en annexe)].

14) Immunoprécipitation de la chromatine :

Les MPHs sont fixés avec 2 mM de disuccinimidyl glutarate pendant 30 minutes et
lavés avec du PBS 1x froid. Les cellules sont fixées avec 1% de formaldéhyde pendant 10
minutes à température ambiante puis incubées avec 125 mM de glycine pendant 5 minutes.
Après 2 lavages avec du PBS 1x froid, les cellules sont grattées dans 2 mL de PBS 1x et
centrifugées à 3500 rpm pendant 5 minutes. Le culot sec d’hépatocytes est ensuite plongé
dans l’azote liquide et congelé à -80°C. Après décongélation, les cellules sont resuspendues
dans un tampon hypotonique [10 mM HEPES, pH 6,5, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,25%
Triton X-100, 1 mM DTT et 1x PIC (Roche)] et soniquées pendant 20 minutes.
L’isolement de la chromatine est réalisée comme suit : la chromatine est resuspendue dans du
tampon de lyse (50mM Tris-HCl, pH 7,4 , 10 mM EDTA, 1% SDS) et soniquée 20 minutes.

199
Les échantillons sont centrifugés à 13 000 rpm pendant 10 minutes. La chromatine (150 µg)
est diluée 10 fois dans du tampon de dilution (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 , 1% Triton X-100, 2
mM EDTA, 150 mM NaCl) et incubée sur la nuit avec 3 µg d’anticorps sur agitateur rotatif à
4°C. Le jour suivant, 20 µl de billes A/G Sepharose (v/v ; #17-1279-01 et #17-0618-01, GE
Healthcare) et 7 µL d’ARNt de levure/mL d’échantillon (#R5636, Sigma-Aldrich) sont
ajoutés et incubés 3 heures à 4°C. Les billes sont ensuite lavées 3 fois avec du tampon RIPA
1x et une fois avec du tampon TE. L’ADN est élué avec 0,1 M NaHCO3, 1% SDS et incubé
sur la nuit à 65°C puis purifié en utilisant le kit « PCR Clean-up Gel extraction kit »
(#740609.250, Macherey-Nagel).

15) Modèles animaux et expérimentations :

Les souris mâles âgées de 8-10 semaines en provenance de Charles River (Saint
Germain sur l’Arbresle, France) sont stabulées en animalerie exempt d’organisme pathogène
spécifique avec un cycle jour/ nuit de 12h/12h et un accès ad libitum à l’eau et à un régime
standard (UAR A04, Villemoison/Orge, France). Les souris sont euthanasiées par dislocation
cervicale et les tissus sont immédiatement congelés en azote liquide.
Les MPHs sont isolés, à ZT 13, à partir de souris mâles C57BL/6J âgées de 8-10
semaines en provenance de Charles River (Saint Germain sur l’Arbresle, France) ou de souris
mâles homozygotes Fxr-/- ou sauvages de même portée (Fxr+/+) stabulées en cycle jour/nuit
de 12h/12h avec un accès ad libitum à l’eau et à un régime standard.
Test de tolérance au pyruvate : une injection intrapéritonéale de pyruvate de sodium
(P4562, Sigma) (dose = 2g/kg) est réalisée sur des souris mises à jeûne pendant 16 heures (de
17h à 9h). Le taux de glucose sanguin est mesuré à l’aide d’un glucomètre (One touch,
Lifescan) aux temps indiqués à partir du sang de la veine de la queue.
Tous les protocoles expérimentaux sont conformes à l’« ARRIVE guidelines». Ils ont
été approuvés par le comité d’éthique de l’Institut Pasteur de Lille (Agrément
#20152152254461) et réalisés avec l’autorisation de l’union européenne, en accord avec les
directives françaises de l’éthique.

16) Analyses statistiques :

Les données brutes sont analysées avec le logiciel Graph Pad Prism 7.0. Les résultats sont
exprimés en moyenne ± erreur type (SEM : Standard Error of the Mean) et les groupes sont

200
comparés les uns aux autres en utilisant soit un t-test ou une ANOVA2 comme indiqué sur la
légende

17) Informations complémentaires :

Organismes:
Overall n
Name Citation Supplier Strain Sex Age
number
Charles
C57Bl6/J C57Bl6/J male 8-10 weeks 300
River
Sinal CJ Institut
WT littermate
et al. PMID: Pasteur - C57Bl6/J male 8-10 weeks 75
(Fxr+/+)
11030617 Lille
Sinal CJ Institut
Homozygous
et al. PMID: Pasteur - C57Bl6/J male 8-10 weeks 75
(Fxr-/-)
11030617 Lille

Séquences:
Name Sequence Supplier

18S FWD 5'-cattcttggcaaatgctttcg-3' Eurogentec

18S REV 5'-cgccgctagaggtgaaattct-3' Eurogentec

36B4 FWD 5'- catgctcaacatctcccccttctcc -3' Eurogentec

36B4 REV 5'- gggaaggtgtaatccgtctccacag -3' Eurogentec

Abcb11 (Bsep) FWD 5'- gtctgactcagtgattcttcgc -3' Eurogentec

Abcb11 (Bsep) REV 5'- gagcaatgcgcacacacttc -3' Eurogentec

Abcb4 (Mdr3) FWD 5'-gcagcgagaaacggaacag-3' Eurogentec

Abcb4 (Mdr3) REV 5'-ggttgctgatgctgcctagtt-3' Eurogentec

Albumin FWD 5'- gctacggcacagtgcttgct -3' Eurogentec

Albumin REV 5'- tccacgagagttggggttga -3' Eurogentec

Creb1 FWD 5'- tgccactcagccgggtacta -3' Eurogentec

Creb1 REV 5'- acaactccaggggcaatggt -3' Eurogentec

Cyp7a1 FWD 5'- catacctgggctgtgctctg -3' Eurogentec

Cyp7a1 REV 5'- ccaaatgccttcgcagaagtag -3' Eurogentec

Fbp1 FWD 5'- tcctacgctacctgtgttcttg -3' Eurogentec

Fbp1 REV 5'- ggcagtcaatgttggatgag -3' Eurogentec

Fga FWD 5'- ggctcagactctgggaactttag -3' Eurogentec

Fga REV 5'- gaacgatgtgtggtgcttgtg -3' Eurogentec

Foxa2 FWD 5'- tgctgggagccgtgaagatggaa -3' Eurogentec

201
 Foxa2 REV 5'- ttgccggaaccgccgccc -3' Eurogentec

Foxo1 FWD 5'- tctacgagtggatggtgaagag -3' Eurogentec

Foxo1 REV 5'- acttgctgtgaagggacaga -3' Eurogentec

Fxra1-4 FWD 5'- cctgagaacccacagcattt -3' Eurogentec

Fxra1-4 REV 5'- gtgtccatcactgcacatcc -3' Eurogentec

G6pc FWD 5'- ggcaaaatggcaaggagacc -3' Eurogentec

G6pc REV 5'- cttggatggcttgggctagg -3' Eurogentec

Gadd34 FWD 5'- agaggcggctcagattgttc -3' Eurogentec

Gadd34 REV 5'- gaagtgtaccttccgagctt -3' Eurogentec

Igfbp1 FWD 5'- ccgacctcaagaaatggaag -3' Eurogentec

Igfbp1 REV 5'- gggtagacacaccagcagag -3' Eurogentec

L-pk FWD 5'- caacctccccactcagctac -3' Eurogentec

L-pk REV 5'- cccttcacaatttccacctc -3' Eurogentec

Mrp2 FWD 5'- aagcaggtgttcgttgtgtg -3' Eurogentec

Mrp2 REV 5'- aggagccaagtgcataggtaga -3' Eurogentec

Ostb (Slc51b) FWD 5' -ggtccagggccagaaacatc -3' Eurogentec

Ostb (Slc51b) REV 5'- tgccaggatgctccttctca -3' Eurogentec

Pck1 (Pepck) FWD 5'- ttggctggctctcactgacc -3' Eurogentec

Pck1 (Pepck) REV 5'- gttttggggatgggcactgt -3' Eurogentec

Prkaca FWD 5'- ggcgcctcgcttctagctta -3' Eurogentec

Prkaca REV 5'- cttggggttgcagtgagtgg -3' Eurogentec

Prkacb FWD 5'- gctgctggctaccctccatt -3' Eurogentec

Prkacb REV 5'- ggttcccgaatcgctttgtc -3' Eurogentec

Shp (Nr0b2) FWD 5'- aggaacctgccgtccttctg -3' Eurogentec

Shp (Nr0b2) REV 5'- ctcagccacctcgaaggtca -3' Eurogentec

FGA FWD 5'- cagcatggactgcagatagtggtg -3' Eurogentec

FGA REV 5'- ccctttcatcctgcagccaga -3' Eurogentec

G6PC FWD 5'- gctggctctcaactccagca -3' Eurogentec

G6PC REV 5'- caggaggacgagggaggcta -3' Eurogentec

OSTB (SLC51B) FWD 5'- ggtcctcctgggaagaagca -3' Eurogentec

OSTB (SLC51B) REV 5'- ttggcctcatccaaatgcag -3' Eurogentec

202
 PCK1 (PEPCK) FWD 5'- gggcatcctcaggcggct -3' Eurogentec

PCK1 (PEPCK) REV 5'- cgataaccgtcttgctttcgatcc -3' Eurogentec

SHP (NR0B2) FWD 5'- ctggagcctggagcttagcc -3' Eurogentec

SHP (NR0B2) REV 5'- gcaccagggttccaggactt -3' Eurogentec

Fbp1 cloning in tk-luc
5’- aaaagatctaatcaagaagttaaac -3’ Eurogentec
FWD
Fbp1 cloning in tk-luc
5’- aaagaattcctgtggcgtaaaggg -3’ Eurogentec
REV
Pck1_1 cloning in tk-luc
5’- aaaagatctgcttgggtacatcatg -3’ Eurogentec
FWD
Pck1_1 cloning in tk-luc
5’- aaagaattccctgctggcaaagcaa -3’ Eurogentec
REV
Pck1_2/3/4 cloning in tk-
5’- aaaagatctgtgttcatcttgggat -3’ Eurogentec
luc FWD
Pck1_2/3/4 cloning in tk-
5’- aaagaattcccttctcggtccttcc -3’ Eurogentec
luc REV
shRNA Foxa2 sequence
5’-caccgagtgtactccaggcctattacgaataataggcctggagtacactc-3’ Eurogentec
(top strand)
shRNA Foxa2 sequence
5’-aaaagagtgtactccaggcctattattcgtaataggcctggagtacactc-3' Eurogentec
(bottom strand)
shRNA LacZ sequence
5’-caccgctacacaaatcagcgatttcgaaaaatcgctgatttgtgtag-3’ Eurogentec
(top strand)
shRNA LacZ sequence
5’-aaaactacacaaatcagcgatttttcgaaatcgctgatttgtgtagc-3’ Eurogentec
(bottom strand)
FOXA2 RE mutation
5'- gctctgctgggttatccgaacattgcaacactgg -3' Eurogentec
FWD
FOXA2 RE mutation REV 5'- ccagtgttgcaatgttcggataacccagcagagc -3' Eurogentec
Foxa2 S237A-W239A
5'- gggtgcagggtcgcgaaggcgcccttgccgg -3’ Eurogentec
FWD
Foxa2 S237A-W239A
5'- ccggcaagggcgccttcgcgaccctgcaccc -3’ Eurogentec
REV
Fxr S325A FWD 5’-ctttgctcaaaggggccgcagtggaggcc -3’ Eurogentec

Fxr S325A REV 5’-ggcctccactgcggcccctttgagcaaag -3’ Eurogentec

Fxr S357A FWD 5’- cctgttggaagaaagaattcgaaaggctggtatctctgatgagtatataac -3’ Eurogentec

Fxr S357A REV 5’-gttatatactcatcagagataccagcctttcgaattctttcttccaacagg -3’ Eurogentec

ChIP Fbp1 (-20310 / -
5'- aaagagcagctgatgcaacc -3' Eurogentec
20349) FWD
ChIP Fbp1 (-20310 / -
5'- cccaaatgctcaagcggagt -3' Eurogentec
20349) REV
ChIP Pck1_1 (-6535 / -
5'- ctccaggctgcagagagaac -3' Eurogentec
6472) FWD
ChIP Pck1_1 (-6535 / -
5'- cgacagcaggaaaacactgc -3' Eurogentec
6472) REV
ChIP Pck1_2 (-853 / -
5'- gtaacacaccccagctaactca -3' Eurogentec
832) FWD
ChIP Pck1_2 (-853 / -
5'- gtgaggtgtcactcccacgg -3' Eurogentec
852) REV
ChIP Pck1_3 (-594 / -
5'- gtttgcatcagcaacaggca -3' Eurogentec
546) FWD
ChIP Pck1_3 (-594 / -
5'- aggcccctctatcagccata -3' Eurogentec
546) REV
ChIP Pck1_4 (-290 / -
5'- tcaacaggggaaatccggc -3' Eurogentec
231) FWD

203
 ChIP Pck1_4 (-290 / -
5'- agtgggcccctcattgtattt -3' Eurogentec
231) REV
ChIP Shp (FXR) FWD 5'- gcagtcccaggcactggctggttga -3' Eurogentec

ChIP Shp (FXR) REV 5'- gcctggatgccctttatcggatgac -3' Eurogentec

ChIP Ctr neg 1 (FXR)
5'- caatgagtgggctacggggtt -3' Eurogentec
FWD
ChIP Ctr neg 1 (FXR)
5'- agatgagatcccagctcaccctc -3' Eurogentec
REV
ChIP Ctr neg 2 (FXR)
5'- tcaggcatgaaccaccatac -3' Eurogentec
FWD
ChIP Ctr neg 2 (FXR)
5'- aacatccacacgtccagtga -3' Eurogentec
REV

Logiciels:
Software name Manufacturer Version
Compass Protein Simple 3.7.1.0
Genespring Agilent 14.3
Graph Pad Prism 7.0
MatInspector Genomatix

Autres (chimiques, vecteurs, kits …)

Drug name Citation/Reference Supplier
8-Bromo-cAMP 1140 Tocris Bioscience
8-CPT-cAMP BML-CN130 Enzo Life sciences
ATP 9804S Cell Signaling
ATP 5µCi (P-32) gamma BLU-502A Perkin Elmer
CDCA C0940-000 Steraloids
Collagenase type IV C5138 Sigma-Aldrich
Dexamethasone D8893 Sigma-Aldrich
D-Glucose 15023-021 Thermo Scientific
Forskolin F6886 Sigma-Aldrich
Glucagon CRG112A Cell Sciences
GW 4064 2473 Tocris Bioscience
Methionine (S-35) NEG-709A Perkin Elmer
PKC lipid activators L51-39 SignalChem
Protease inhibitor cocktail P8340 Sigma-Aldrich
Recombinant human Insulin I9278 Sigma-Aldrich
Selenium S9133 Sigma-Aldrich
Sodium DL-lactate L1375 Sigma-Aldrich
Sodium Oléate O7501 Sigma-Aldrich
Sodium Palmitate P9767 Sigma-Aldrich
Sodium pyruvate 11360 Life technologies
Transferrin T1147 Sigma-Aldrich
GSK3b protein P6040S NEB
GYS1 protein H00002997-P01 Novus Biologicals
MPB protein 31314 Active Motif
PKAca protein 7743-5 Biovision
PKCa protein P61-18G SignalChem
Soonchunhyang University
pcDNA3-hFOXA2 Park et al., PMID: 19628779
Hospital, Korea
pCMX-mFXRa1 Lien F et al. PMID: 24531544
pCMX-mFXRa2 Lien F et al. PMID: 24531544
pCMX-mFXRa3 Lien F et al. PMID: 24531544
pCMX-mFXRa4 Lien F et al. PMID: 24531544
pENTR/U6 K494500 In vitrogen
pET-52 3C/LIC 71571 Novagen
Chonnam National University,
pFOXA(6x)-TATA-Luc Park et al., PMID: 19628779
Korea
pGAL4-DBD Lien F et al. PMID: 24531544

204
 pGAL4-FXR Lien F et al. PMID: 24531544
pGL3 IR1(3x)-tk luc Lien F et al. PMID: 24531544
pGl3-tk Luc E1761 Promega
pGST-FXR Lien F et al. PMID: 24531544
pRL Renilla Luciferase Control
E2231 Promega
Reporter
pUAS(3x)-tk Luc Lien F et al. PMID: 24531544
Creb1 siRNA Sc-35111 Santa-Cruz biotechnology
Ctr siRNA D-001810-10 GE Healthcare-Dharmacon
FOXA2 siRNA Sc-35569 Santa-Cruz biotechnology
Foxa2 siRNA L-043601-00 GE Healthcare-Dharmacon
Foxo1 siRNA Sc-35383 Santa-Cruz biotechnology
Fxr siRNA L-045705-01 GE Healthcare-Dharmacon
Prkaca siRNA L-047080-00 GE Healthcare-Dharmacon
Prkacb siRNA L-042579-00 GE Healthcare-Dharmacon
Shp/Nr0b2 siRNA Sc-44870 Santa-Cruz biotechnology
Adeno-X rapid titer kit 632250 Clontech
BLOCK-iT™ U6 RNAi Entry Vector
K494500 In vitrogen
Kit
Dual-Glo luciferase assay system E2940 Promega
Glucose (GO) assay kit GAGO-20 Sigma-Aldrich
High-capacity cDNA archive kit 4368813 Applied Biosystems
Nucleospin RNA II kit 740955-10 Macherey-Nagel
PCR Clean-up gel extraction kit 740609.250 Macherey-Nagel
Pierce Coomassie-plus assay kit 23238 Thermo Scientific
Pierce crosslink magnetic IP/CoIP 88805 Thermo Scientific
Quickchange II site-directed
200524 Agilent
mutagenesis kit
Re-ChIP-IT kit 53016 Active Motif
TNT-coupled reticulocyte lysate L5020 Promega
A sepharose beads 17-1279-01 GE Heathcare
BL21(DE3)pLys bacteria 69451 Novagen
Extract-All GEXEXT04-0U GeneText
G sepharose beads 17-0618-01 GE Heathcare
Glutathione sepharose beads 17-0756-01 GE Heathcare
His-select nickel affinity gel P6611 Sigma-Aldrich
Hot start DNA polymerase M0493 NEB
INTERFERin 409-50 Polyplus transfection
Jet-PEI 101-40 Polyplus transfection
Lipofectamine 2000 11688-019 In vitrogen
PD-10 columns 17-0851-01 GE Heathcare
Phusion High-Fidelity DNA
M0530S NEB
polymerase
Protein A Agarose 16-156 EMD Millipore
Yeast tRNA R5636 Sigma-Aldrich

205
 Annexe

The Nuclear Bile Acid Receptor FXR is a PKA- and FOXA2-Sensitive

Activator of Fasting Hepatic Gluconeogenesis

Maheul Ploton1,*, Claire Mazuy1,*, Céline Gheeraert1, Vanessa Dubois1, Alexandre Berthier1, Julie
Dubois-Chevalier1, Xavier Maréchal1, Kadiombo Bantubungi-Blum1, Hélène Diemer2, Sarah
Cianférani2, Jean-Marc Strub2, Audrey Helleboid-Chapman1, Jérôme Eeckhoute1, Bart Staels1,$, and
Philippe Lefebvre1,$
1Univ. Lille, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, U1011 - EGID, F-59000 Lille, France, 2

Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique, CNRS UMR7178, Univ Strasbourg, IPHC, F-

67087 Strasbourg, France.
* These authors contributed equally to this study
$
Corresponding authors: BS : INSERM UMR1011-Institut Pasteur de Lille, 1 rue du Pr Calmette,
BP245, 59019 Lille, France, e-mail: bart.staels@pasteur-lille.fr; PL : INSERM UMR1011-Bâtiment
J&K; Faculté de Médecine de Lille, Boulevard du Pr Leclerc, 59045 Lille cedex, France. e-mail:
philippe-claude.lefebvre@inserm.fr

Keywords: liver, gluconeogenesis, glucagon, PKA, transcription, nuclear receptor, bile acid, FXR,
FOXA2
Word count: 6520
Number of figures and tables: 7/0
Conflict of interest: The authors have nothing to declare
Financial support: This work was supported by Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe
labellisée, DEQ20150331724), INSERM, University of Lille, and Agence Nationale pour la Recherche
(ANR-10-LBEX-46 and ANR-10-INBS-08; ProFI project, “Infrastructures Nationales en Biologie et
Santé”; “Investissements d'Avenir” call); FP7-Health Resolve 305707. CM received a PhD fellowship
from the French Ministry of Research. BS is a recipient of an Advanced ERC grant (694717).
Authors’ contribution: Conceptualization: MP, CM, BS, AHC, PL; Methodology: MP, CM, CG, AB,
JE, JCD, HD, SC, JMS; Formal analysis and investigation: MP, CM, CG, XM, JE, JCD, VD, KBB, HD,
SC, JMS; Writing - original draft preparation: MP, CM, BS, PL; Writing - review and editing: BS, PL;
Funding acquisition: BS, PL; Resources: JCD, JE, HD, SC, JMS, BS, PL; Supervision: AHC, JE, BS,
PL.

ABSTRACT
Background & Aims: Embedded into a complex signaling network coordinating glucose uptake,
usage and production, the nuclear bile acid receptor FXR is expressed in several glucose-processing
organs including the liver which synthesizes, stores or mobilizes glucose according to the organism’s
needs. Dysregulated in type 2 diabetes, hepatic gluconeogenesis (GNG) is controlled through
allosteric regulation of gluconeogenic enzymes and by glucagon/cAMP-dependent transcriptional

206
regulatory pathways. Whether FXR positively or negatively regulates fasting hepatic gluconeogenesis
is still debated.
Methods: The role of FXR in hepatic GNG was assessed in vivo and in mouse primary hepatocytes.
Gene expression patterns in response to glucagon and FXR agonists were characterized by RT-
QPCR and microarray analysis. FXR phosphorylation by protein kinase A was determined by mass
spectrometry. The interaction of FOXA2 with FXR was identified by cistromic approaches and in vitro
protein-protein interaction assays. The functional impact of the crosstalk between FXR, the PKA and
FOXA2 signaling pathways was assessed by site-directed mutagenesis, transactivation assays and
FXR expression restoration in FXR-deficient hepatocytes in which gene expression and glucose
production were assessed.
Results: FXR positively regulates hepatic glucose production (HGP) through 2 regulatory arms, the
first one involving protein kinase A-mediated phosphorylation of FXR allowing the synergistic
activation of gluconeogenic genes by glucagon, agonist-activated FXR and CREB. The second arm
consists in the inhibition of FXR’s ability to induce the anti-gluconeogenic nuclear receptor SHP by the
glucagon-activated FOXA2 transcription factor, which physically interacts with FXR.
Conclusions: HGP is thus regulated during physiological fasting by FXR which integrates the
glucagon/cAMP signal upon its post-translational modifications and by engaging protein-protein
interactions with FOXA2.

Lay summary: Activation of the bile acid nuclear receptor FXR regulates gene expression networks
controlling lipid, cholesterol and glucose metabolism which are mostly effective during the post-
prandial phase. Whether FXR exerts critical functions during fasting is unknown. The results of this
study show that FXR transcriptional activity is regulated by the glucagon/PKA and the FOXA2
signaling pathways, which converge on FXR through phosphorylation and protein-protein interaction
respectively, to increase hepatic glucose synthesis.

207
Graphical abstract

Highlights:
 The nuclear bile acid receptor FXR potentiates PKA-induced hepatic gluconeogenesis.
 PKA phosphorylates FXR to increase its transcriptional activity at gluconeogenic
genes.
 The glucagon-regulated FOXA2 transcription factor interacts with FXR.
 The FXR::FOXA2 interaction blunts FXR’s ability to stimulate SHP/NR0B2 expression.

208
 INTRODUCTION

Glucose supply to tissues is maintained through a complex regulatory network mostly driven
by the pancreatic hormones insulin and glucagon which control glucose use, storage and synthesis.
Through glycogenolysis and gluconeogenesis, the liver contributes ~70-80% of glucose production
(GP) during an overnight fast [1], the remaining 30% coming from intestinal and kidney
gluconeogenesis in physiological conditions .
Glucagon-induced gluconeogenesis (GNG) in fasting is the only source of glucose when
glycogen stores are exhausted. Gluconeogenic substrates (lactate, alanine, and pyruvate) are
funneled to mitochondria to generate oxaloacetate (OAA) through biotin-dependent pyruvate
carboxylase (PC). Cytosolic OAA is decarboxylated and phosphorylated to yield phosphoenolpyruvate
(PEP), the primary building block of glucose, through phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPCK), a
rate-limiting enzyme of GNG. Glycerol from triglyceride breakdown also contributes to varying extents
to GNG, feeding into the gluconeogenic pathway as glyceraldehyde-3-phosphate to generate fructose
1,6-biphosphate, the substrate of fructose 1,6-biphosphatase (F1,6biPase) which irreversibly yields
fructose 6-phosphate (F6P) [4]. The regulation of hepatic glucose production (HGP) is achieved
through a sophisticated signaling network involving post-translational protein modifications, allosteric
regulation and transcription factor activation and repression which essentially control the gene
expression of 3 rate-limiting enzymes, glucose-6-phosphatase (G6pc), F1,6biPase (Fbp1) and PEPCK
(Pck1) [7] in a glucagon/cAMP-dependent manner [8-11].
Multiple transcription factors orchestrate hepatic GNG, such as PPARγ co-activator 1α
(PGC1α), Forkhead box protein O1 (FOXO1), Small Heterodimer Partner (SHP) and cAMP Response
Element-Binding protein (CREB), by regulating the expression of gluconeogenic genes [12]. The
nuclear bile acid (BA) receptor farnesoid X receptor (FXR) is a key regulator of essential hepatic
functions [13]. Besides acting on BA homeostasis and lipid metabolism, FXR participates in the
regulation of glucose homeostasis. Sequestration of intestinal BAs decreases plasma glucose in type
2 diabetic patients [14]. This effect correlates with increased GLP-1 expression and secretion which
may be attributed at least in part to FXR-mediated ChREBP inhibition in intestinal L-cells [15], a
mechanism equally operative in the liver where FXR represses glycolysis . Liver FXR controls HGP
through the regulation of Pck1 and G6pc gene expression. Indeed, in vivo administration of natural or
synthetic FXR agonists improves glucose tolerance, decreases Pck1 and G6pc expression and
accordingly diminishes HGP in rodent models of obesity or diabetes [18-22]. Gene deletion studies
mostly support a repressive role of FXR on GNG , consistent with the reported inhibitory action of
SHP, a direct FXR target gene, on gluconeogenic gene expression in vivo [20] and in vitro . However,
whereas FXR activation may improve glucose metabolism by down-regulating HGP in pathological
models of obesity and diabetes, its role in physiological fasting conditions appears different. FXR-/-
mice develop transient hypoglycemia and exhibit a delayed increase in HGP upon fasting [25-28]. In
addition, the induction of hepatic G6pc and Pck1 expression is significantly blunted in fasting FXR -/-
mice . Taken together, these data rather point at pro-gluconeogenic properties of FXR during fasting.

209
Since the molecular mechanisms of FXR action in fasting are unknown, we studied the role of FXR in
the control of HGP and gluconeogenic gene expression in physiological fasting.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Mice strains and experimentation:

Male homozygous Fxr-/- and wild-type littermates (Fxr+/+) mice [30] were bred on the C57BL/6J
genetic background and housed in a SPF-free facility with a 12h light/12h dark cycle with free access
to water and to a standard chow diet (UAR A04, Villemoison/Orge, France) unless mentioned. Mice
were sacrificed by cervical dislocation after a 6h fasting and tissues were removed and immediately
frozen in liquid N2.
Mouse primary hepatocytes (MPHs) were isolated from 8-10 weeks C57Bl6/J male mice from
Charles River (Saint Germain sur l’Arbresle, France) or from homozygous Fxr-/- and wild-type (Fxr+/+)
male mice housed with a 12-h light/12-h dark cycle and with free access to water and to a standard
chow diet unless mentioned otherwise.
Pyruvate test. Overnight fasted mice (5pm-9am) were injected intraperitoneally with sodium
pyruvate (P4562, Sigma) (2 g/kg body mass). Blood glucose levels were measured from the tail vein
at the indicated time points using an automatic glucose monitor (One Touch, Lifescan).
All experimental protocols conform to the ARRIVE guidelines, were approved by the Lille
Pasteur Institute ethical committee (Agreement # 20152152254461) and carried out in agreement with
European Union and French Ethical Guidelines.

Glucose production:
GP assessment: MPHs were maintained overnight (16h) in DMEM medium containing 5.5 mM
glucose (#21885, Gibco-Life Technologies) supplemented with 0.1% BSA, 100 nM dexamethasone,
1% glutamine and 1% penicillin/streptomycin and treated as indicated. MPHs were then cultured in
DMEM without glucose (#11966, Gibco-Life Technologies) supplemented with 100 nM
dexamethasone, 20 mM sodium DL-lactate (L1375, Sigma-Aldrich), 2 mM sodium pyruvate (#11360,
Gibco-Life Technologies) and the indicated treatments for 8h. Glucose secretion was measured using
the Glucose (GO) assay kit (GAGO-20, Sigma-Aldrich).

Statistical analysis:
Raw data were analyzed using Graph Pad Prism 7.0. Results are expressed as mean ± SEM and
groups were compared using either a t-test or a 2-way ANOVA as indicated in figure legends.

210
 RESULTS

FXR enhances cAMP-induced glucose production by mouse primary hepatocytes.

To evaluate the contribution of FXR to fasting HGP, C57Bl6/J FXR +/+ or FXR-/- mice (Fig.S1A)
were fasted to deplete hepatic glycogen stores and an intraperitoneal pyruvate tolerance test was
performed. The glycemic excursion in response to pyruvate was blunted in C57Bl6/J FXR -/- mice when
compared to FXR+/+ mice (Fig.1A), suggesting a positive contribution of FXR to HGP. The ability of
FXR to regulate GP by mouse primary hepatocytes (MPHs) from FXR +/+ or FXR-/- mice was assayed
after an 8h-treatment with the synthetic FXR agonist GW4064 and with or without the protein kinase A
(PKA) activator 8-CPT-cAMP (Fig.1B), experimental conditions defined as optimal to observe GP by
isolated hepatocytes (Fig. S1B,C). GW4064 did not significantly affect GP, whereas 8-CPT-cAMP
increased GP as glucagon (Fig. S2A). Simultaneous activation of PKA and FXR with GW4064 or the
natural FXR agonist CDCA potentiated GP (Fig.1B, S2B). While showing a lower basal GP, FXR -/-
MPHs were sensitive to PKA stimulation similar as FXR+/+ MPHs [fold change (FC)2], but were
insensitive to FXR agonism (Fig.1B), similarly to wild-type MPHs in which Fxr mRNA expression was
knocked down (Fig. S3A,B). The expression of the gluconeogenic FoxO1 transcription factor did not
vary between the 2 genotypes and was mildly induced by glucagon (Fig.S3C,D). FoxO1 knockdown,
while affecting MPH basal GP, did not affect the potentiation of cAMP by the FXR agonist (Fig.S3E,F).
We conclude that FXR activation enhances HGP under conditions mimicking fasting independently of
FOXO1.

The glucagon/PKA pathway differentially regulates FXR-driven gene expression

The crosstalk between the glucagon/cAMP and FXR signaling pathways was investigated at
the gene expression level. Gene expression patterns from naive or glucagon-treated MPHs stimulated
or not with GW4064 were assayed at normal glucose concentrations to avoid interference with the
energy- or glucose-sensitive AMPK or hexosamine pathways, respectively. A significant part of
upregulated genes became refractory to FXR agonism in the presence of glucagon (Fig.1C).
Conversely, a set of 71 transcripts poorly or not modulated by GW4064 became sensitive to FXR
agonism in the presence of glucagon (Fig.1C and Fig.S4A,B), with 45 out of 71 transcripts being
induced in physiological or prolonged fasting conditions in vivo (Table S1). A biological term
enrichment analysis identified transcription- and glucose metabolism-related processes as significantly
represented within these 2 gene clusters (Fig.1C). Further examination using gene and protein assays
pointed to known FXR-regulated genes and gluconeogenic genes, as becoming sensitive (Fbp1,
Pck1, G6pc, Slc51b/Ostβ) or refractory (Shp/Nr0b2, Abcb11/Bsep and Abcc4/Mdr3) to FXR synthetic
or natural agonists in the presence of glucagon in a FXR-dependent manner (Fig.S4B-D, S5, S6A-F).
The expression of catalytic PKA subunits α and β (Prkaca and Prkacb, Fig.S6G) was
necessary for the synergistic induction of Fbp1, Pck1 and G6pc by FXR and cAMP (Fig.1D-F) but did
not alter Shp/Nr0b2 responsiveness to FXR agonism in the presence of a cAMP analogue (Fig.1G).
Importantly, these transcriptional effects translated into an altered biological output since cAMP-
induced and cAMP/FXR-regulated GP were blunted upon PKA knockdown (Fig.1H). Thus the
potentiation of glucagon-stimulated GP by FXR agonism relates to a combinatorial up-regulation of

211
GNG-promoting, glucagon/PKA-regulated genes (Fbp1, Pck1, G6pc) and down-regulation of the
GNG-inhibiting, PKA-independent Shp gene.

Phosphorylation of FXR S325 and S357 by PKA regulates FXR activity.

We next assessed whether FXR is a direct PKA target. Purified mouse FXRα1 or FXRα3 were
used in an in vitro phosphorylation assay, in which an efficient PKA-dependent transfer of radiolabeled
phosphate to both FXR isoforms was observed (Fig.S7A) and of similar magnitude as that observed
with PKCα, a previously identified FXR kinase (Fig. S7B) [33]. Mass spectrometry identified
phosphopeptides (Fig.2A, Fig.S8) corresponded to 3 bioinformatically-predicted and 2 de novo
identified phosphoserines (S132, S151, S357 and S114, S325 respectively, Fig.2A). GSK3β, which is
regulated by PKA [34], was unable to phosphorylate FXR in similar conditions (Fig.S7C).
FXR transcriptional activity in response to PKA activation was tested using a transactivation
assay in which FXR is expressed as a Gal4-DNA binding domain fusion protein (one-hybrid assay,
Fig.2B). While FXR was insensitive to PKA stimulation in the absence of the FXR agonist GW4064
(Fig.2B), activation of PKA by the adenylate cyclase activator forskolin (FSK) increased agonist-
induced FXR activity (Fig.2B). A similar potentiating effect when using an IR1-driven reporter gene
(Fig.2C, mFXRα1). S325 and S357 were necessary and sufficient for PKA-enhanced FXR activity
(Fig.S9A, Fig.2C). As individual mutation of S325 and S357 to alanine affected neither the response to
GW4064 (Fig.2C) nor FXR protein stability (Fig.S9B), we concluded that these mutations did not
introduce major structural changes.
The contribution of FXR phosphorylation by PKA to hepatocyte GP was characterized in FXR -/-
cells, in which wild-type or S325,357A FXR was expressed (Fig.2D). Whereas wild-type FXR restored
the GW4064-induced potentiation of GP triggered by PKA activation, the non-phosphorylatable FXR
mutant did not convey this synergistic response. Importantly, G6pc, Pck1 and Fbp1 gene expression
followed a similar pattern (Fig.S9C-E).

PKA potentiates FXR-induced gene transcription.

How FXR and PKA cooperatively regulate GNG was investigated for the 2 cAMP-regulated
gluconeogenic genes Fbp1 and Pck1. FXR binding site(s) coordinates were identified in the Fbp1 and
Pck1 upstream regulatory regions (URRs) using ChIP-seq data from fasted mouse livers (Fig.3A,
S10A), which overlapped with CREB DNA binding sites [36]. The DNA sequences encompassing both
FXR and CREB co-binding regions (CBRs) were cloned upstream of a luciferase reporter gene to
assess their functionality. Transactivation assays (Fig.3B, S10B,C) showed that the PKA-FXR
cooperativity was maintained on these chimeric constructs when using the wild-type FXR. However,
FXR S325,357 to A mutations ablated this cooperative effect in line with the observed effect on HGP.
Endogenous gene regulation was measured in MPHs (Fig.3C,S10D) in which either Creb1 or Fxr
expression was knocked down (Fig.3D,S3B). In line with our previous results, FXR was required for
the cooperative response with glucagon (Fig.3C,S10D). CREB contributed to the cooperative
induction, in agreement with FXR co-binding with CREB to both the Fbp1 (Fig.3E,F) and Pck1 URRs
(Fig.S10E,F). Strikingly, the FXR density in URRs was highest when MPHs were simultaneously

212
treated with GW4064 and glucagon (Fig.3E,S10E), suggesting that increased transcription may stem
from increased or stabilized binding of FXR to DNA.

Glucagon abrogates FXR-mediated transcription of Shp/Nr0b2 URR through FOXA2.

FXR-induced expression of Nr0b2/Shp is counteracted by glucagon and cAMP analogues in a
PKA-independent manner (Fig.1G). Although many mechanisms may account for the observed
inhibition of FXR transcriptional activity, we hypothesized that it results from a functional interaction
with a glucagon/cAMP-sensitive transcriptional regulator (TR). Since a similar regulation pattern of
Nr0b2/Shp was observed in both hepatoblastoma HepG2 cells and MPHs (Fig.4A, 4C, S11A-C) and
confirmed at the protein level (Fig.4C), we tested this hypothesis by determining which TRs co-localize
closely with FXR in the HepG2 cell genome by comparing the FXR cistrome [31] to that of 51 TRs
generated by the ENCODE Consortium [37] (Fig.S12A).
FXR co-localizing TRs included the FXR obligate heterodimerization partner RXRα [38],
validating this approach to identify direct, functionally relevant protein-protein interactions. Forkhead
Box A2 transcription factor (FOXA2) appeared as a potential candidate (Fig.S12A), as its activity is
inhibited by insulin and enhanced by glucagon in mouse liver. FOXA2 co-occupied FXR genomic
binding sites, with 1,642 FOXA2 binding sites being detected within +/- 100 bp from the center of the
detected 11,574 FXR peaks (Fig.4B). These co-binding regions (CBRs) were enriched in consensus
binding sequences for FXR and FOXA2 as previously reported [41]. Distances between FXR and
FOXA2 binding sites diverged from the ones obtained by a random repartition of the same number of
ATF3 binding regions (Fig.4B). A similar analysis comparing the liver FXR and FOXA2 cistromes in
the mouse fasted liver genome yielded a figure similar to that extracted from HepG2 cell cistromes,
with 1,219 FXR/FOXA2 CBRs out of 7,457 total FXR binding sites (Fig.4D). Interestingly, several
CBR-associated genes are involved in glucose metabolic processes (Fig.4D). The contribution of
FOXA2 to FXR-regulated transcription was then characterized after glucagon or insulin stimulation
(Fig.S12B) by microarray analysis of RNAs from wild-type or FOXA2-depleted MPHs (Fig.4E and
Fig.S12C, D). In control MPHs (Ad-shLacZ), a subset of genes (197) displayed a reduced inducibility
by GW4064 in the presence of glucagon (Fig. 4E, lanes 3 vs 4) when compared to GW4064 treatment
in the presence of insulin (Fig.4E, lanes 1 vs 2). The ability of glucagon to blunt the expression of this
subset of FXR-inducible genes was lost in Foxa2-depleted cells (Ad-shFoxa2)(Fig. 4E, lanes 7 vs 8,
compare to 3 vs 4), thereby identifying FOXA2 as a repressor of a subset of FXR-regulated genes. In
particular, glucagon-mediated repression of Shp/Nr0b2 was FOXA2-dependent (Fig.4F), thereby
identifying FOXA2 as a critical regulator of FXR activity at this locus. Finally, blunting FOXA2
expression in MPHs (Fig.S12E) decreased GP in response to cAMP alone or to cAMP and GW4064 in
a Shp/Nr0b2-dependent manner (Fig.4G,S12E). This suggests that FOXA2 positively contributes to
FXR-independent and FXR-induced GNG by inhibiting Shp expression.

FOXA2 interacts with DNA-bound FXR at the Shp/Nr0b2 locus.

FXR and FOXA2 both bind to the Shp URR in mouse liver (Fig.5A). FOXA2 DNA binding was
dependent on FXR (Fig.5B) and was increased by glucagon and GW4064 (Fig.5C). A ChIP-reChIP

213
analysis confirmed the co-localization of these 2 TRs at this genomic locus (Fig.5D). GST pulldown
and co-immunoprecipitation assays established that FXR specifically interacts with FOXA2 in HepG2
cells (Fig.5E,F) and in mouse liver (Fig.S12F). FOXA2 binding to the Shp URR was also FXR-
dependent in the immortalized mouse hepatocyte cell line AML12 (Fig.6A), which displays
transcriptional regulatory features similar to HepG2 cells and MPHs (Fig.S11A,B;S13). FOXA2
opposed FXR-mediated activation of Shp/Nr0b2 (Fig.6B), however FXR binding was not dependent on
FOXA2 (Fig.6C). FOXA2 inhibited the FXR-mediated induction of an IR1 FXRE-driven reporter gene
by all 4 FXR isoforms (Fig.6D,E). The DNA binding activity of FOXA2 relies on the integrity of a highly
conserved winged-helix DNA-binding domain. Mutation of S237 and W239 within this domain
abolishes DNA binding [43] and FOXA2 transcriptional activity (Fig.6F). Comparing the repressive
activity of wild-type FOXA2 to that of the DNA binding-crippled FOXA2 in the IR1 FXRE- tk Luc
transactivation assay demonstrated that FOXA2 repressive activity is independent of its interaction
with DNA (Fig.6G). FOXA2 thus likely represses FXR transcriptional activity by a tethering
mechanism.

FOXA2 and PKA regulate FXR target genes independently.

Whether PKA-regulated FXR target genes are also sensitive to the insulin-inhibited, glucagon-
activated FOXA2 TF was investigated next. The FOXA2 target gene Igfbp1 was induced by glucagon
in a FOXA2-dependent manner and was insensitive to FXR agonism in both wt and Foxa2-depleted
MPHs (Fig.7A). The FXR target gene Ostβ was induced upon FXR agonism, but not by glucagon
treatment. Simultaneous treatment with glucagon and GW4064 cooperatively induced Ostβ
expression in a FOXA2-independent manner (Fig.7B). Expression of the gluconeogenic genes Fbp1,
Pck1 and G6pc was induced by glucagon and further enhanced by FXR agonist treatment, a response
which was not altered by Foxa2 knockdown (Fig.7C-E). This suggests that the FOXA2 and PKA
signaling pathways regulate distinct subsets of FXR-responsive genes cooperating to enhance HGP
(Fig.7F).

214
 DISCUSSION

Glucose homeostasis is regulated by a complex and intricate signaling network involving

multiple organs. The bile acid nuclear receptor FXR is integrated into this regulatory network and
participates in glucose handling and metabolism. Intestinal FXR favors glucose absorption and
induces FGF15/19 secretion which, through signaling via the hepatic β-Klotho/FGFR4 membrane
receptor, inhibits GSK3β, hence increasing glycogenesis. Liver FXR inhibits ChREBP activity, hence
decreasing glycolysis and pancreatic FXR potentiates glucose-induced insulin secretion. All these
effects contribute to leveraging glucose homeostasis in the post-prandial state [44] and led to the
prediction that FXR activation could favorably impact on glucose metabolism. Prolonged in vivo
activation of FXR by natural or synthetic agonists led to unclear results. Contrasting with cholic acid
treatment of C57BL/6J mice (5 days), GW4064 treatment did not modulate gluconeogenic gene
expression [20]. GW4064 treatment for 7 days of C57Bl6 mice increased the expression of
gluconeogenic genes without detectable increase of plasma glucose [45]. Fasting plasma glucose was
increased in high fat diet-fed C57BL/6J mice treated for 3 months with GW4064 [46] but decreased
after a 6-weeks treatment [22]. Thus long term interference with the FXR signaling pathway by either
whole body gene knockout or prolonged agonist treatment did not provide information on a potential
role of FXR in the highly dynamic physiological fasting response, which we investigated in this study.
In our study, FXR acts positively on the gluconeogenic pathways through 2 arms. The first
positive arm is controlled through the novel glucagon/cAMP/PKA/FXR pathway, which potentiates
gluconeogenic gene transcription. This synergy requires PKA-catalyzed phosphorylation of FXR on
S325 and S357 and CREB, which co-localizes with FXR at the Fbp1 and Pck1 URRs. ChIP-PCR
assays showed that PKA activation correlates with increased FXR DNA binding. Three-dimensional
structures of the FXR LBD bound to natural or synthetic ligands show that S325 is located in helix 7
(H7) which constitutes part of the coactivator LXXLL binding groove and is poorly exposed to solvent
in the agonist-bound, coactivator-FXR complex. S357 localizes on the β-loop connecting H7 and H8
and is more accessible to solvent than S325 in this configuration. How phosphorylation of S325 and
S357 might increase/stabilize DNA binding is thus still unclear in light of these structural data.
Nevertheless, our data add PKA to the growing list of metabolism-sensitive FXR modifiers that
includes O-GlcNAc transferase [OGT, [31]], AMP-activated protein kinase [AMPK, [32]], protein-kinase
C alpha [PKCα, [33]], Sirt1 and p300 . A pending question is how these various post-translational
modifications (PTMs) articulate according to the metabolic status. Prolonged energy shortage could
impose selective activation of AMPK and FXR inhibition, whereas PKA would predominantly specify
FXR activity in normal fasting conditions. These PTMs have been studied independently and Sirt1-
mediated deacetylation and activation of FXR is likely to directly superimpose its regulatory effect on
FXR transcriptional activity. As diurnal variation of protein subcellular localization, phosphorylation and
activities are very likely to top on these metabolically-regulated FXR functional alterations, it becomes
mandatory to decipher the PTM code of FXR during fasting/feeding periods to fully appreciate how this
affects FXR-regulated biological output(s). These outputs might extend beyond metabolic control, as

215
we recently showed that liver FXR may also regulate other specific gene sets and biological pathways
as it collaborates with other transcriptional regulators [51].
The prototypical FXR target gene Shp/Nr0b2 controls bile acid synthesis and lipogenesis [52]
and has been proposed to be a negative regulator of GNG through interaction with the pro-
gluconeogenic glucocorticoid receptor, HNF4α, Foxo-related transcription factors or C/EBPα [53]. This
repressive activity provides a direct link between the observed plasma glucose lowering effect upon
prolonged FXR agonism in mice and gluconeogenic gene transcription. Our data however show that
FoxA2 could serve as a repressor of FXR transcriptional activity on a limited number of genes,
including Shp/Nr0b2, in short-term fasting conditions which represents another example of signal
integration at specific genes. FOXA2-mediated repression of FXR activity proceeds from a DNA
binding-independent mechanism, and affects a limited number of genes with no common function, as
studied by GSEA or GO term enrichment analysis (data not shown). The repression of Shp gene
transcription by FOXA2 is intriguing in light of the ability of SHP to prevent FOXA2 DNA binding in vitro
[54]. The physiological significance of these findings are however unclear, as these investigations
were carried out without including hormonal signals such as glucagon, which triggers FOXA2
acetylation and subsequent activation to control fatty acid oxidation and ketogenesis in a process
involving SIRT1 and p300 [55]. It is important to note here that our mechanistic investigations were
carried out at normal glucose concentrations to avoid any confounding effects related to either energy
depletion, hence activating SIRT1 and/or AMPK, or to glucose overload, hence activating the
hexosamine biosynthetic pathway. A highly integrative approach combining biochemical, proteomic,
epigenomic and transcriptomic approaches is required to fully understand PTM-dependent FXR
activity variations in the physiologically-varying fasting and fed conditions, to which we now add the
glucagon/cAMP pathway as an important regulator of FXR. Whether this physiological mechanism is
dysregulated in T2D remains to be explored. A decreased activity of both hepatic FOXA2 and FXR
through phosphorylation and acetylation, respectively, has been reported in rodent models of T2D
[47,56], and we observed that exposure of MPHs to glucolipotoxic conditions abolished FXR
contribution to GP (data not shown). However, no correlation between FXR expression and that of its
cognate target genes could be established with the diabetic status of human patients (Table S2),
suggesting that this novel regulatory pathway is more likely at play in physiological conditions.

Acknowledgements: We are grateful to Salah-Eddine Amini and Benjamin Deckmyn for technical
help.

216
 FIGURE LEGENDS

Fig.1- FXR is a positive regulator of hepatic glucose production. (A) Pyruvate tolerance test in
wild-type and FXR-deficient mice. Fasted mice were injected with sodium pyruvate. Blood glucose
concentration was assayed at the indicated times. (B) Glucose production in wild-type and FXR-
deficient MPHs. GP by MPHs was assayed after an 8-hour treatment. (C) Gene expression pattern in
MPHs. RNAs were extracted after a 6h treatment and analyzed on Affymetrix MoGene arrays. The
heatmap was generated using Genespring. The most relevant Gene Ontology terms (Biological
process) are shown with the enrichment percentage and p-value. D-G) Protein kinase A is selectively
involved in the regulation of a subset of genes. MPHs transfected with the indicated siRNAs were
treated as indicated and gene expression measured by RT-QPCR. (H) Glucose production in PKA-
depleted MPHs. Conditions and result presentation are as in (B). (A, B) Results are the mean +/-
SEM (n=3) and values were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. (D-G)
Results are the mean +/- SEM (n=5) and are expressed relative to the basal level measured in
untreated cells arbitrarily set to 1. Data were compared using a 2-way ANOVA and a Tukey post hoc
test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005.

Fig.2- Protein kinase A regulates FXR transcriptional activity and ability to regulate hepatic
glucose production. (A) Identification of phosphopeptides by ETD mass spectrometry. Tryptic
(phospho)peptides from in vitro phosphorylated recombinant, purified mFXR1 were identified by LC-
MS/MS. *: indicates phosphopeptides containing a PKA phosphorylation consensus site. (B) PKA
activation potentiates FXR transcriptional activity in a one-hybrid assay. HEK293A cells were
transfected as depicted and treated for 6h. (C) FXR S325 and S357 are required for PKA-mediated
potentiation of FXR transcriptional activity. HEK293A cells were transfected and treated as depicted.
(D) GP in Fxr-/- MPHs overexpressing either the wild-type or S325,357A FXR. MPHs were transfected
with pCMX-based expression vectors. Upper panel: GP was assessed as in Fig.1A 24h after
transfection. Results were expressed and values were compared as in Fig.1A. Lower panel: FXR
protein content in MPHs. pCMX: empty vector (control). (B, C) Results from luciferase assays were
expressed as normalized relative light units relative to basal conditions (vehicle treatment only)
arbitrarily set to 1. Values represent the mean +/- SEM (n=3-6) which were compared using a 2-way
ANOVA and a Tukey post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005.

Fig.3- The FXR and PKA signaling pathways co-activate target genes in a FXR phosphorylation
dependent manner. (A) Identification of potentially active FXR response element in the vicinity of the
Fbp1 gene. FXR and CREB chromatin binding sites were identified from . Consensus and
degenerated DNA binding sequences for FXR and CREB were identified using MatInspector
(Genomatix). Numbers indicate the position of each putative response element relative to the TSS. (B)
Transcriptional activity of the identified response element. The activity of potentially active FXRE was
assayed in a transactivation assay as in Fig.2C (HEK293A cells). Right panel: FXR protein expression

217
in transfected cells. (C) Endogenous gene expression. MPHs were transfected with the indicated
siRNAs and Fbp1 gene expression was monitored by RT-QPCR. (D) CREB1 protein expression
levels, (E-F) Endogenous transcription factor loading at identified chromatin binding sites in MPHs.
The density of FXR (E) or CREB (F) at the Fbp1 composite response element was assayed by ChIP-
qPCR. Data are expressed as the mean +/- SEM (n=5-6) and values were compared using a 2-way
ANOVA followed by a Tukey post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005.

Fig.4- The FXR-mediated induction of the Nr0b2/Shp gene is negatively regulated by Foxa2. (A)
NR0B2/SHP gene expression in HepG2 cells. HepG2 cells were treated for 4h as indicated.
SHP/NR0B2 mRNA levels were assessed by RT-qPCR. mRNA levels in untreated HepG2 cells were
arbitrarily set to 1. (B) Frequency distribution of the distance between FXR binding sites and the
closest FOXA2 binding site, ATF3 binding site or a random distribution of the same amount of sites
than FOXA2. The green box indicates FXR/FOXA2 C(o)B(inding)R(egion)s within 100bp from the
center of the FXR binding sites in the HepG2 cell genome. Inset: Consensus binding site analysis of
FXR/FOXA2 CBRs. (C) Shp/Nr0b2 gene and protein expression in MPH treated with insulin or
glucagon. MPHs were treated as indicated for 4h and Shp/Nr0b2 mRNA levels were assessed by RT-
qPCR. mRNA levels in insulin-treated MPHs were arbitrarily set to 1. Upper panel: protein expression
was assayed by WES analysis. (D) Frequency distribution of the distance between mouse liver FXR
binding sites and the closest FOXA2 binding sites. Right panel: Functional annotation of genes
neighboring FXR-FOXA2 binding sites. Associated genes defined by GREAT were annotated with the
Gene Ontology Biological Process database and the most significantly enriched terms are shown. (E)
Foxa2-dependent repression of FXR-regulated genes. mRNA levels from MPHs were assessed by
DNA microarray analysis. Hierarchical clustering defined ca. 200 transcripts whose expression was
regulated by glucagon and sensitive to FOXA2 expression levels (FC>1.2, p<0.05). Box plots for these
transcripts indicate the median, the 25th and 75th percentile. (F) The glucagon-mediated repression of
Nr0b2 expression is FOXA2-dependent. Gene expression was assayed by RT-QPCR. The Shp/Nr0b2
mRNA level in shLacZ-transduced, insulin-treated MPH was arbitrarily set to 1. (G) Glucose
production by MPHs. MPH were treated as indicated after transfection with the indicated siRNAs. GP
was assessed as above and was normalized to the protein content. (A,C,F,G) Results are the mean
(n=3-6) +/- SEM and values were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *,
p<0.05, **, p<0.01; ***: p<0.001

Fig.5- FOXA2 interacts with FXR. (A) Characterization of the FXR-dependent regulatory region of
the Nr0b2/Shp gene. The mouse liver ChIP-Seq profile of FXR and FOXA2 binding to the Shp/Nr0b2
URR is shown. Numbers indicate the limit of binding motifs for FXR and FOXA2 (lower panel). (B)
FXR-deficient mice display decreased FOXA2 binding to the liver Shp/Nr0b2 promoter. ChIP-qPCR
analysis of FXR and FOXA2 binding to the Shp/Nr0b2 promoter in the liver from FXR-/- and FXR+/+
mice. (C) FOXA2 loading at the Shp/Nr0b2 promoter. MPHs were treated as indicated and processed
for ChIP-qPCR after chromatin immunoprecipitation with an anti-FOXA2 antibody. (D) FOXA2 and
FXR co-binding to the Shp/Nr0b2 promoter. A ChIP re-ChIP/PCR assay was performed with C57Bl6

218
mouse liver chromatin. Amplicons were detected by agarose gel electrophoresis and BET staining. (E)
Interaction between FXR and FOXA2 in solution. A GST-pulldown assay was carried out using GST-
fused full-length FXR and [35]S-labeled FOXA2 in the presence or not of GW4064. C.B.: Coomassie
Blue. (F) FOXA2 co-immunoprecipitates with FXR. Nuclear extract from HepG2 cells treated or not
with GW4064 (24h) were immunoprecipitated with agarose-conjugated control or anti-FXR IgG (IP).
Bead-bound material was analyzed by western blotting as indicated (WB). (B,C) P values were
calculated using a t-test. (n=6 Mean ± SEM, *: p<0.05).

Fig.6- FOXA2 represses FXR transcriptional activity by a tethering mechanism. (A) FXR and
FOXA2 binding to the Shp/Nr0b2 promoter in mouse AML12 cells. Cells were maintained in 5.5mM
glucose medium (16h) and treated as indicated for 4h. FXR and FOXA2 densities at the Shp/Nr0b2
FXR-FOXA2 CBR were assayed by ChIP-qPCR. (B) FOXA2 represses FXR transcriptional activity in
mouse AML12 cells. AML12 cells were transduced with an adenovirus coding for a shRNA targeting
Foxa2 or for a control shRNA. Shp/Nr0b2 gene and FOXA2 protein expression were assessed by RT-
qPCR (left panel) and western blotting (right panel) respectively. (C) FXR and FOXA2 binding at the
Shp/Nr0b2 CBR. AML12 cells were treated as in (B) and processed for ChIP-qPCR. (D) FOXA2
represses FXR-mediated activation. HepG2 cells were transfected with a pGL3 tk-Luc vector
containing 3 FXR IR1 response elements and treated as indicated. The activity in the absence of
transfected FXR or FOXA2 and of any treatment was arbitrarily set to 1. Luciferase assays were
carried out 72h after transfection. (E) FOXA2 represses the activity of all FXR isoforms. HepG2 cells
were transfected as above with expression vectors containing mFXRα1, mFXRα2, mFXRα3 or
mFXRα4. (F) The DNA binding-defective FOXA2 S237A-W239A is transcriptionally inactive. HepG2
cells were transfected as above using a pGL3tk Luc reporter gene driven by 6 FOXA2 response
elements. (G) The FOXA2 S237A-W239A mutant represses FXR transcriptional activity. HepG2 cells
were transfected with expression vectors encoding either wild-type FOXA2 or the FOXA2 mutant
S237A-W239A and a 3x IR1-driven luciferase reporter gene. (A-G) Data are expressed as the mean
(n=4-6) +/- SEM and P values were calculated using a t-test (A) or a 2-way ANOVA with Bonferroni
posthoc test (n=3, ±SEM, *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001).

Fig.7- Specific regulation of FXR target genes. ( A-E) Expression levels of the FOXA2 target gene
Igfbp1, of the FXR target gene Slc51b/Ostb and of the gluconeogenic genes Fbp1, Pck1 and G6pc in
response to GW4064, insulin, glucagon in naive or FOXA2-depleted MPHs. (F) GNG regulation by
FXR. (A-E) Data are expressed as the mean (n=4-6) +/- SEM and P values were calculated using a 2-
way ANOVA with Bonferroni posthoc test (n=3, ±SEM, *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001).

219
220
221
222
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229
 SUPPORTING INFORMATION TO

The Nuclear Bile Acid Receptor FXR is a PKA- and FOXA2-Sensitive Activator of Hepatic
Gluconeogenesis
Maheul Ploton1,*, Claire Mazuy1,*, Céline Gheeraert1, Vanessa Dubois1, Alexandre Berthier1, Julie
Dubois-Chevalier1, Xavier Maréchal1, Kadiombo Bantubungi-Blum1, Hélène Diemer2, Sarah
Cianférani2, Jean-Marc Strub2, Audrey Helleboid-Chapman1, Jérôme Eeckhoute1, Bart Staels1,$, and
Philippe Lefebvre1,$
1Univ. Lille, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, U1011 - EGID, F-59000 Lille, France, 2

Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique (LSMBO), CNRS UMR7178, Univ Strasbourg,

IPHC, F- 67087 Strasbourg, France.

SUPPLEMENTAL FIGURES

230
FIG. S1- Glucose production in MPHs. (A) FXR protein content in wild type and Fxr -/- MPHs.
(Supports Fig.1A). Protein extracts were analyzed by capillary immunodetection (Simple Western,
WES) using the indicated antibodies. (B) Glucose production in MPHs. (Supports Fig.1B). MPHs were
isolated and plated for 6 hours. GP was then assayed either for 8 hours (Day 1, 6+8 hours after
isolation), or 24 hours later (Day 2, 6+24+8 hours after isolation) or 48 hours later (Day 3, 6+24+24+8
hours after isolation). Glucose production was assayed and normalized to protein content. Results are
the mean +/- SEM (n=3) and values were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc
test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005. (C) Gene expression in MPHs. (Supports Fig.1B). RNAs
were extracted and analyzed by RT-QCR. Results are the mean +/- SEM (n=3) and are expressed
relative to the expression level measured at Day 1 arbitrarily set to 100%. Data were compared using
a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005. Isol.: freshly
isolated MPHs just prior to plating.

231
FIG. S2- (A) Glucose production by MPHs. (Supports Fig1B). GP was assayed after treatment with
100 µM 8-CPT-cAMP, 1 nM insulin, 100 nM glucagon and/or 2 µM GW4064 first in 5.5 mM Glc-DMEM
medium for 16 hours then for 8 hours in GP medium. Results are the mean +/- SEM (n=3) and values
were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***,
p<0.005. (B) Glucose production by MPHs after stimulation (8 hours) with 100 µM 8-CPT-cAMP and/or
125 µM chenodeoxycholic acid (CDCA). (Supports Fig.1B). Glucose production was assayed and
normalized to protein content. Results are the mean +/- SEM (n=3) and values were compared using a
2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005.

232
FIG. S3- FXR and FOXO1 in glucose production. (A) Glucose production in FXR-depleted MPHs.
(Supports Fig.1B). MPHs were isolated and transfected for 48 hours with either a scramble siRNA
(control) or a Fxr-targeting siRNA. Glucose production was assayed 8 hours later and normalized to
protein content. Results are the mean +/- SEM (n=3) and values were compared using a 2-way
ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005. (B) Efficiency of the
siRNA-mediated knockdown of FXR protein expression. Whole cell extracts from siRNA-treated MPHs
were characterized by WES analysis in parallel to glucose production for FXR protein expression. (C)
Foxo1 gene expression in MPHs. RNA was extracted from control or FXR-depleted MPHs and
analyzed by RT-QPCR. Results are the mean +/- SEM (n=3) and are expressed relative to the basal

233
expression level arbitrarily set to 1. Data were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post
hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005. (D) Foxo1 gene expression in MPH from FXR+/+ or FXR-/-
mice. Results were analyzed as in (C). (E) Efficiency of the siRNA-mediated knockdown of FOXO1
protein expression. Whole cell extracts from siRNA-treated MPHs were characterized by WES
analysis. (F) Glucose production in FOXO1-depleted MPHs. MPHs were isolated and transfected for
48 hours with either a scramble siRNA (control) or a Foxo1-targeting siRNA. Glucose production was
assayed 8 hours later and normalized to protein content. Results are the mean +/- SEM (n=3) and
values were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01,
***, p<0.005.

234
FIG. S4- Gene and protein expression in MPHs (Supports Fig. 1C) – (A) Extended view of Fig 1C.
Genes displaying an increased expression in the presence of the FXR agonist GW4064 (2 µM) and
glucagon (100 nM) vs GW4064 alone are shown. Official gene symbols are indicated on the right
(Red: upregulated, green: downregulated). (B) RT-QPCR validation of gene expression levels. RNAs
were extracted as described in Fig. 1D and analyzed by RT-qPCR. Results are the mean +/- SEM
(n=5) and are expressed relative to the basal level measured in untreated cells arbitrarily set to 1.
Data were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***,
p<0.005. (C, D) Protein expression levels in MPHs after GW4064 and/or 8-CPT-cAMP treatment.
(Supports Fig.1D-F). PCK1, FBP1, and SHP amounts in MPH extracts were quantified by WES
analysis.

235
Fig. S5- Gene expression in MPHs in response to the natural FXR agonist CDCA. (Supports Fig.1D-
G) (A-D) MPHs were treated for 6 hours as indicated by glucagon (100 nM) and/or CDCA (125µM).
RNAs were extracted and analyzed by RT-QCR. Results are the mean +/- SEM (n=3) and are
expressed relative to the basal expression level arbitrarily set to 1. Data were compared using a 2-way
ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005.

236
FIG. S6- Assessing GW4064 specificity in MPHs. (A-F) Gene expression of gluconeogenic and of
FXR target genes after siRNA-mediated knockdown of FXR. MPHs were isolated and treated as
indicated (2 µM GW4064, 100 nM glucagon). Gene expression was assayed in parallel to glucose
production (see Fig. S1B). FXR knockdown efficiency is shown in Fig. S3B. Results are the mean +/-
SEM (n=3) and values were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *,
p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005. (G) Efficiency of the siRNA-mediated knockdown of PKA catalytic
subunit expression. Whole cell extracts from siRNA-treated MPHs were characterized by western
blotting (upper panel) or WES analysis (lower panel) for protein kinase cAMP-activated catalytic
subunit alpha (PKAca) or protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta (PKAcb) protein
expression.

237
FIG. S7- Identification of phosphorylation sites in the FXRα sequence by PKA. (Supports Fig. 2A).
Identification of phosphorylation sites in the FXRα sequence by PKA. Recombinant, purified mouse
FXRα1 or α3 were used as substrates in in vitro phosphorylation reactions using purified recombinant
PKAca (A), PKCα (B) or GSK3β (C) and radiolabeled ATP. MBP or glycogen synthase (GyS) served
as positive controls. Reaction products were detected after separation by 10% SDS-PAGE and
autoradiography.

238
FIG. S8- Screenshots from the mass spectra of FXRα1 trypsic phosphopeptides. (Supports Fig. 2A)
The mass spectrum for identified phosphopeptides from PKA-modified FXRα1 are shown:
S+80GISDEYITPMFSFYK (A), MAAAS+80AGR (B), GS+80AVEAMFLR (C),
AS+80GYHYNALTCEGCK (D), S+80ITKNAVYK (E).

239
FIG. S9- Ala-scan of PKA-phosphosites in mFXRα1. (Supports Fig. 2C) Identified PKA phosphosites
as well as potential PKA target residues were converted to non-phosphorylatable alanine residues in
the mouse FXRα1 sequence. (A) FXR mutant transcriptional synergy in response to PKA and FXR
activation. The transcriptional activity of each mutant was assessed in a transactivation assay using
an IR1-driven reporter gene, after which luciferase assays were carried out and values normalized as
in Fig. 2C. The Y axis values represent the differential luciferase activity between the FSK+GW4064
and GW4064 conditions. The reference was arbitrarily set to 1 when using wild-type FXRα1. Values
(n=6, mean+/- SEM) were compared using a 2-way ANOVA followed by a Bonferroni post hoc test. *,
p<0.05, ***, p<0.005. Note that T153 is a PKC-phosphorylatable amino acid [15], the T153A mutant
was used here as a negative control. (B) Mutant FXR protein stability. HEK cells were transfected as
above and their content in FXR and derivatives was assessed by western blot analysis. (C-E) Gene
expression in response to wild type and FXR S325, 357A mutants. G6pc, Pck1 and Fbp1 gene

240
expression was assayed in FXR+/+ MPHs (left) or in FXR-/- MPHs after restoration of FXR expression
(wild type, mFXRα1, phosphorylation site mutant, S325,357A) by transient transfection. MPHs were
stimulated by 2 µM GW4064 and/or 100 nM glucagon for 8 hours in DMEM supplemented with 5.5
mM glucose and RNA was extracted and processed for RT-QPCR assays. The expression level in
FXR+/+ MPHs control conditions was arbitrarily set to 1. Results are the mean (n=3) +/- SEM and
values were compared using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01;
***: p<0.001

241
FIG. S10- The FXR and PKA signaling pathways co-activate Pck1 in a FXR phosphorylation-
dependent manner. (Supports Fig. 3) (A) Identification of potentially active FXR response elements in
the vicinity of the Pck1 gene. FXR binding sites were identified on the basis of liver FXR ChIP-seq
data [1, 6]. CREB binding sites were identified on the basis of liver CREB ChIP-seq data [7].

242
Consensus and degenerated DNA binding sites for FXR and CREB were identified using MatInspector
(Genomatix). Numbers indicate the position of each putative response element relative to the
transcriptional start site of the gene. (B, C) Transcriptional activity of the identified response elements.
A region encompassing potential response elements was cloned into a tk Luc reporter vector (pGL3)
and transfected into HEK293A cells together with the indicated FXR expression vectors. Luciferase
activities were recorded after treatment with forskolin and/or GW4064 for 6 hours. Results are
expressed as normalized RLU relative to basal conditions (vehicle treatment only) arbitrarily set to 1.
Values represent the mean +/- SEM (n=3-6 with technical duplicates) which were compared using a 2-
way ANOVA followed by a Bonferroni correction. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005. (D) Endogenous
gene expression. MPHs were transfected with the indicated siRNAs and Pck1 gene expression was
monitored by RT-qPCR. (E, F) Endogenous transcription factor loading at identified chromatin binding
sites in MPHs. The density of FXR (D) or CREB (E) at the Pck1 composite response elements was
assayed by ChIP-qPCR. Data are expressed as the mean +/- SEM (n=5) and values were compared
using a 2-way ANOVA with a Bonferroni post hoc test. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005.

243
FIG. S11- FXR and glucagon signaling in cell lines. (Supports Fig. 4 and 6) (A) Gene expression in
cell lines. Gene expression levels were assayed in HepG2, AML12 and MPHs at the indicated times
by RT-QPCR and fold change values after GW4064 stimulation were calculated, by setting the
expression in untreated conditions to 1. (B) Gene expression was assayed in HepG2, AML12 and
MPHs at the indicated times by RT-QPCR and fold change values after glucagon or FSK stimulation
were calculated, by setting the expression in untreated conditions to 1. All values were significantly
different (p<0.05) as assessed by an 2-tailed t-test. (C) FXR target gene expression in HepG2 cells.
Total RNAs were used in RT-QPCR analysis to assess PCK1, G6PC, OSTβ and SHP gene
expression. Data are expressed as the mean (n=3) +/- SEM and P values were calculated using a 2-
way ANOVA with Bonferroni correction (n=3, ±SEM, *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001).

244
FIG. S12- FOXA2 interaction with FXR. (Supports Fig. 4) (A) FOXA2 co-occurs with FXR in the
HepG2 cell genome. The heatmap represents the overlap between FXR binding sites [4] and 51
transcription factors obtained from Encode Consortium in HepG2 cells [16]. The X-axis indicates each
TF analyzed in this study, the Y-axis represents each FXR genomic binding site. FXR binding sites
which overlap within 100bp with the indicated TFs are colored in yellow whereas FXR binding sites
with no-overlap with the indicated TFs are shown in red. FOXA2 data are highlighted by the black box.
(B) Insulin and glucagon effectively activate signaling pathways in MPHs. MPHs were treated as
indicated and the expression of G6pc or S473 AKT phosphorylation were monitored by RT-qPCR or
by western blotting, to assess the activation of the glucagon or of the insulin signaling pathways
respectively. (C) Knockdown of FOXA2 protein expression. FOXA2 protein expression was measured
in whole cell extracts from MPH transduced with an adenovirus coding for a shRNA targeting Foxa2 or
a shRNA targeting LacZ (control). One hundred µg of proteins were analyzed by western blotting with
the indicated antibodies. HSP90 was used as a loading control. (D) Expression of the FOXA2 target
gene Igfbp1. The expression of Igfbp1 was monitored by RT-qPCR in the indicated conditions. Results
are expressed as in Fig. 5A. (E) FOXA2 and SHP protein expression levels in MPHs after siRNA-
mediated knockdown. (F) Co-immunoprecipitation assays of FXR and FOXA2 in mouse livers. Mouse
whole liver extracts were prepared from fasted (livers collected after a 6-hour fasting at ZT18) or ad-
libitum fed mice (livers collected during the active phase at ZT21) and analyzed for their content in
FXR, FOXA2, and PEPCK (PCK1) proteins using the WES technology (left panel). Extracts were
submitted to an immunoprecipitation procedure (IP) using the indicated antibodies.
Immunoprecipitated material was analyzed by western blotting (WB).

245
FIG. S13- FXR-dependent gene expression in AML12 cells. (A-C) G6pc, Fbp1 and Ost gene
expression was assayed by RT-QPCR in AML12 cells which were depleted either from PKA catalytic
subunits α and β or from FXR by siRNA-mediated knockdown. Gene expression in untreated
conditions was arbitrarily set to 1. Data are expressed as the mean (n=3) +/- SEM and P values were
calculated using a 2-way ANOVA with Bonferroni correction (n=3, ±SEM, *: p<0.05; **: p<0.01; ***:
p<0.001). (D,E) Efficiency of the PKA knockdown in AML12 cells. Whole cell extracts were analyzed
by western blotting or WES for their content in PKA catalytic subunit alpha and/or beta (PKAca,
PKAcb).

246
Gene symbol This paper GSE 51712 GSE 13093 (C57Bl6, E-MTAB-1722 (Liver
(C57Bl6,24 h fast vs ad lib., CT4-8 vs FXR KO mice,
fed) CT12-16) fasting, CT6 vs
FXR+/+)
Ppargc1a
Slc25a15
Pck1
Agxt2l1
Akr1b71
Nr1i2
Ostb
Rasl12
Wfdc3
Il22ra1
Aldh1a7
Alas1
Ppfibp2
Gm5424
Mrps31
D6Wsu116e
Oaf
Mxi1
Gpnmb
Mmp14
Rnf167
Mrap
Rnf125
Efna1
Hbp1
Atp7b
Slco2b1
Golt1a
Aqp11
Pgpep1
Entpd7
Atg4c
Tcea3
Apof
Gnmt
Tram2
Ncapd3
Fam179b
Net1
Reep4
Dnpep

247
 Abcc2
Amdhd1
Npas2
Fbp1
Slc5a6
Tubb2a
Rlf
Myom1
Fmo5
Serpinb6b
Snord71
Impa2
Srrd
Gm16062
Pex19
Gpld1
Wee1
Dag1
Ankrd23
Sik1
Aldh4a1
Mcart1
Gls2
Dlc1
Pbld1
Gm4980
Etnk2
Hal
Mettl7b
Nedd4l

Table S1: Gene expression in mouse fasting livers. Gene expression levels were extracted from
several datasets and upregulated genes are indicated in red and downregulated genes in green.
White cells indicated values <1.2, gray cells indicates genes not found. GSE51712 quantifies gene
expression in fasted vs fed mouse livers (C57Bl/6J background; 3–4-month old) for 24 hours [17].
GSE 13093 quantifies liver gene expression in temporally-restricted fed mice (Male wild-type
C57BL/6J mice (8- to 12-week-old) [18]. Data sets corresponding to the fed (CT12-16) and
physiologically fasted (CT4-8) states were averaged to extract expression values for the
corresponding genes and compared to generate fold change values. E-MTAB-1722 quantifies gene
expression in liver from liver-specific Fxr KO mice vs wild-type littermates (fasting C57BL/6J male mice
for 5-6 hours, corresponding to CT5-6) [19]. Datasets were imported from GEO or ArrayExpress and
processed as described using GeneSpring 14.3.

248
Gene name FPG HbA1c Glycemia, 2h Insulin, 2h LDL-C HDL-C TG
PGC1a 0.0619 0.2123 0.1204 0.2947 0.0189 0.4303 0.4149
FXR 0.2247 0.2262 0.086 0.094 0.4017 0.4687 0.0191
BAAT 0.2708 0.3518 0.3328 0.0713 0.7351 0.1972 0.8324
KININOGEN 0.0985 0.213 0.1255 0.1467 0.4051 0.3361 0.0641
BSEP 0.025 0.0849 0.0035 0.1522 0.3685 0.3369 0.0177
SHP 0.1267 0.2478 0.3659 0.2792 0.1879 0.2417 0.0763
FGF19 0.096 0.4912 0.4296 0.016 0.4912 0.1089 0.0045
SIRT1 0.1122 0.2288 0.0968 0.0944 0.2477 0.3537 0.1119
DRIP205 0.0585 0.136 0.0258 0.4162 0.3539 0.4981 0.0333
NCoR1 0.3205 0.4053 0.1083 0.1616 0.345 0.1762 0.2357
SRC3 0.316 0.2706 0.4024 0.1116 0.4573 0.1382 0.1962
SRC1 0.1782 0.1793 0.4489 0.0956 0.3161 0.1466 0.2517
SMRT 0.4427 0.3165 0.2372 0.123 0.1305 0.3594 0.0588
PCAF 0.2708 0.1684 0.3328 0.0316 0.3676 0.0986 0.4162
BAF60 0.2515 0.3532 0.4562 0.0896 0.446 0.0637 0.3082
BAF250 0.0614 0.1387 0.0276 0.4713 0.3987 0.2606 0.2228

Table S2: Gene expression and blood biochemical parameters in T2D patients. A correlation study
between gene expression values and blood biochemical parameters from lean, obese and obese
diabetic patients was carried out. Normalized gene expression data were plotted as a function of
fasting plasma glucose (FPG), glycated hemoglobin (HbA1c), glycemia and insulin 2 hours after a
glucose bolus (Glycemia, 2 h and Insulin, 2 h), LDL-cholesterol (LDL-C, HDL-cholesterol (HDL-C and
triglycerides (TG). The Pearson correlation p values between the expression value of each indicated
gene and each parameter is indicated. In red: p<0.05.
Cohort description: Biochemical parameters from lean, obese and obese diabetic patients were
obtained from the ABOS cohort (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01129297). Gene expression
data were extracted as previously described [3,20,21]

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