TP1 2ci

TP de Microbiologie du sol
1
Plan
Séance 1: Evaluation de la biomasse du sol par la méthode du
dénombrement des bactéries.
Séance 2: Isolement et identification biochimique des bactéries

isolées du sol.
Séance 3: Illustration de certains caractères PGPR microbiens

(AIA, glucanases, cellulases, protéases et sidérophores, etc...).
Séance 4: Interaction entre les microorganismes : cas de

l’antibiose.
Séance 5: Exploitation des microorganismes en agriculture:

Bactérisation des semences.
2
TP de Microbiologie du sol
Séance N°1:
Evaluation de la biomasse du sol
par la méthode du
dénombrement des bactéries.
3
I. Evaluation de la biomasse du sol
 La biomasse : désigne la masse de
l’ensemble des microorganismes du sol
(bactéries, actinomycètes, champignons,
algues, protozoaires).
 C’est un indicateur pertinent et sensible aux

changements d’usage et au mode de gestion
des sols.
4
 Plusieurs méthodes de dénombrement
permettent de quantifier la population
microbienne.
 Ces méthodes ne donnent pas accès aux

mêmes informations mais certaines d’entre
elles sont complémentaires.
5
I.1. Biomasse totale
Dosage du C et N de la biomasse
microbienne par la méthode de
« fumigation-extraction»
Lyse des microorganismes présents dans

l’échantillon du sol par la vapeur de
chloroforme.
Extraction des produits de la lyse des
microorganismes à l’aide d’une solution de
KCl.
La quantité de C et N de la biomasse est
déterminée par la différence entre la quantité de
C et N après et avant fumigation, permettant
ainsi de remonter à la quantité de micro-
organismes présents dans le sol. 6
I.2. Dénombrements
Dénombrements
Biomasse
Microscopie
cultivable
7
I.2. Dénombrements
Biomasse cultivable
Milieu solide Milieu liquide

(en boîtes de Pétri) (en tubes)
Estimer le nombre Estimer le Nombre le Plus

d’Unités Formant Probable (NPP) de
Colonie (UFC) bactéries.
8
I.2. Dénombrements
1. Biomasse cultivable
1.1. Cultures sur milieu gélosé
Consiste à la méthode d’étalement en surface ou en

profondeur, en utilisant divers milieux de cultures et
différentes conditions de cultures.
9
I.2. Dénombrements
1.1. Cultures sur milieu gélosé
Avantages Inconvénients
 Comptage du nombre de  Sous-estimation de la
bactéries viables et actives. taille réelle de la population
(seulement 1 à 10 % des
 Possibilité de sélectionner bactéries sont cultivables).
les microorganismes à
dénombrer à l’aide de
milieux de culture différents.
10
I.2. Dénombrements
1.2. Cultures en milieu liquide
La méthode du Nombre le Plus Probable (NPP) est une

méthode statistique basée sur la théorie des
probabilités et qui pose l’hypothèse que tous les
germes vivants à étudier se trouvent dans les
suspensions utilisées.
Les échantillons sont dilués en série jusqu’à un point

où il n’y a plus de microorganismes vivants qui se
développent dans les tubes. 11
I.2. Dénombrements
Les différentes dilutions sont inoculées dans un

milieu approprié et placé à température et durée bien
déterminée.
Le développement de la biomasse bactérienne est

révélé en général grâce à la présence d’un trouble du
milieu (tube positif).
12
I.2. Dénombrements
Des tables statistiques, dont les bases ont été fixées

en 1918 par Mac Grady, sont ensuite utilisées pour
déterminer la concentration de bactéries dans la
solution mère (NPP).
Plus le nombre de réplicats est grand, plus la

précision de la taille de la population bactérienne est
fiable. 13
I.2. Dénombrements
14
I.2. Dénombrements
- Particulièrement utile dans - Intervalle de confiance

le cas où les bactéries à assez grand donc perte de
dénombrer ne se précision sauf si on
développent pas sur un multiplie le nombre de
milieu solide (c’est le cas répétitions.
par exemple des bactéries
nitrifiantes).
15
I.2. Dénombrements
Le principe de l’épifluorescence directe repose sur la
coloration directe des microorganismes (plus
exactement, de leurs acides nucléiques, ADN ou ARN)
par des fluorochromes.
Les échantillons sont comptés à l’aide d’un microscope

à épifluorescence et le résultat est ensuite converti en
nombre de cellules par unité de masse du sol.
16
I.2. Dénombrements
Les fluorochromes fréquemment rencontrés lors de
dénombrements réalisés sur des sols sont :
 l’acridine orange (AO) qui se fixe sur les acides

nucléiques, indifféremment ADN ou ARN (les bactéries
apparaissent vertes).
 le 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI): les bactéries

apparaissent bleuâtres.
 l’isothiocyanate de fluorécéïne (FITC): les bactéries

apparaissent vertes.
17
I.2. Dénombrements
2. Dénombrements directs
- Donne directement accès au - Aucune donnée sur

nombre de microorganismes l’appartenance phylogénétique.
présents dans le milieu.
- Ne permettent ni de
- Permettant de mieux différencier une population
différencier les cellules vivantes particulière ni de suivre son
des cellules mortes. évolution et son devenir.
18
I.3.Diversité, empreinte génétique
Des techniques assez récentes basées sur l’étude

des acides nucléiques (ADN ou ARN) permettent
d’obtenir une image de la communauté bactérienne.
Ces techniques de biologie moléculaire sont de plus

en plus fréquemment appliquées à l’environnement,
essentiellement sur les sols.
19
Extraction de l’ADN
Amplification de l’ADN par PCR
Gène cible
Méthodes de séparation de l’ADN amplifié Clonage- Séquençage
DGGE et TGGE T-RFLP

20
Les techniques de biologie moléculaire permettent une

détection très sensible et très spécifique.
Mais, elles ne permettent pas de savoir si la séquence

d’acide nucléique mise en évidence provient de cellules
mortes ou vivantes.
21
II. Les enzymes du sol
 Les microorganismes (bactéries et champignons)
sont la principale source d’enzymes dans le sol.
 Ces enzymes sont les catalyseurs de processus

biochimiques importants: la minéralisation et le cycle
des nutriments, la décomposition et la formation de la
matière organique et la décomposition des pesticides.
 Les enzymes sont sensibles aux changements de la

qualité du sol dus à des gestions et des utilisations
différentes des sols.
22
Généralités sur les enzymes
La mesure de certaines activités enzymatiques permet

d’estimer la population microbienne ainsi que son
activité au sein du milieu étudié.
ces enzymes, souvent extracellulaires, peuvent en

s’adsorbant sur des particules solides, rester actives
même après la mort des micro-organismes.
23
Déshydrogénases
Oxydoréductases Catalases
Peroxydases
Enzymes étudiées
Invertases
Protéinases
Hydrolases
phosphatases
Uréases
24
Ces mesures d’activités globales donnent une
information générale sur la communauté microbienne
mais restent néanmoins descriptives et pas toujours
faciles à interpréter.
Les mesures d’activités enzymatiques présentent

l’avantage d’être relativement simples et peu
coûteuses (il existe des kits complets dédiés à ces
mesures).
L’activité enzymatique, un indicateur simple et fiable

pour prévoir l’impact des pratiques culturales sur la
25
qualité des sols.
III. l’activité respiratoire des micro-
organismes
Les paramètres suivis peuvent être par exemple la
consommation en oxygène (O2), en aérobiose, ou
encore la production de gaz tel que le dioxyde de
carbone (CO2) en aérobiose ou anaérobiose et le
méthane (CH4) en anaérobiose.
Ces paramètres doivent être choisis en fonction de leur

pertinence.
26
III. l’activité respiratoire des micro-
organismes
Mesure du CO2:
Connaître la quantité
approximative de
bactéries dans un sol.
27
IV. Conclusion
Dans le cadre de la caractérisation et de l’optimisation
des systèmes de cultures, en vue d’une durabilité des
pratiques agricoles, l’évaluation de la biomasse et la
mesure des activités enzymatiques sont donc des
indicateurs à prendre en compte.
Cet indicateur complète les paramètres physico-

chimiques ( N, P, K, CEC, pH…) couramment utilisés
pour les conseils en matière de gestion des cultures.
28
V. Manipulation
-Réaliser les dilutions de l’échantillon du sol.
- Réaliser un ensemencement en surface des quatre

dernières dilutions sur boîtes de Pétri contenant le
milieu LB.
- Incuber les boîtes à 30°C pendant 24 h.
- Déterminer le nombre de bactéries, le résultat est

exprimé en UFC/g de sol.
29
V. Manipulation
 Dénombrement par étalement en surface
Représentation schématique de comptage par étalement de

30
suspension diluée de sol sur boites de Pétri.
VI. Lecture des résultats
1. Compter les colonies visibles pour le dénombrement des

bactéries telluriques.
2. Calculer le nombre de colonies formants unités de

bactéries par mL de la suspension mère du sol:
N = nombre de colonies comptées × le volume ensemencé ×

le facteur de la dilution qui a servi au dénombrement.
Compter uniquement les boites qui montrent un nombre de

colonie compris entre 30 et 300 colonies.
3. Exprimer le résultat final en UFC par gramme de sol frais.
31
VII. Rédaction du compte rendu
1. Titre de la séance.
2. But de la séance.
3. Principe: méthode utilisée pour réaliser l’expérience :

schématiser la technique utilisée.
4. Résultats de l’expérience
* Présenter les résultats sous forme de tableaux ou
courbes.
* Titrer et légender le ou les tableaux et/ou courbes.
5. Interprétation des résultats.
6. Conclusion.
32

TP1 2ci

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

TP1 2ci

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

TP1 2ci

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

TP de Microbiologie du sol

Séance 2: Isolement et identification biochimique des bactéries

Séance 3: Illustration de certains caractères PGPR microbiens

Séance 4: Interaction entre les microorganismes : cas de

Séance 5: Exploitation des microorganismes en agriculture:

 C’est un indicateur pertinent et sensible aux

 Ces méthodes ne donnent pas accès aux

Lyse des microorganismes présents dans

Milieu solide Milieu liquide

Estimer le nombre Estimer le Nombre le Plus

Consiste à la méthode d’étalement en surface ou en

La méthode du Nombre le Plus Probable (NPP) est une

Les échantillons sont dilués en série jusqu’à un point

Les différentes dilutions sont inoculées dans un

Le développement de la biomasse bactérienne est

Des tables statistiques, dont les bases ont été fixées

Plus le nombre de réplicats est grand, plus la

- Particulièrement utile dans - Intervalle de confiance

Les échantillons sont comptés à l’aide d’un microscope

 l’acridine orange (AO) qui se fixe sur les acides

 le 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI): les bactéries

 l’isothiocyanate de fluorécéïne (FITC): les bactéries

- Donne directement accès au - Aucune donnée sur

Des techniques assez récentes basées sur l’étude

Ces techniques de biologie moléculaire sont de plus

Amplification de l’ADN par PCR

Méthodes de séparation de l’ADN amplifié Clonage- Séquençage

DGGE et TGGE T-RFLP

Les techniques de biologie moléculaire permettent une

Mais, elles ne permettent pas de savoir si la séquence

 Ces enzymes sont les catalyseurs de processus

 Les enzymes sont sensibles aux changements de la

Généralités sur les enzymes

La mesure de certaines activités enzymatiques permet

ces enzymes, souvent extracellulaires, peuvent en

Les mesures d’activités enzymatiques présentent

L’activité enzymatique, un indicateur simple et fiable

méthane (CH4) en anaérobiose.

Ces paramètres doivent être choisis en fonction de leur

Cet indicateur complète les paramètres physico-

- Réaliser un ensemencement en surface des quatre

- Incuber les boîtes à 30°C pendant 24 h.

- Déterminer le nombre de bactéries, le résultat est

Représentation schématique de comptage par étalement de

1. Compter les colonies visibles pour le dénombrement des

2. Calculer le nombre de colonies formants unités de

N = nombre de colonies comptées × le volume ensemencé ×

Compter uniquement les boites qui montrent un nombre de

3. Exprimer le résultat final en UFC par gramme de sol frais.

3. Principe: méthode utilisée pour réaliser l’expérience :

5. Interprétation des résultats.

Vous aimerez peut-être aussi